Add to collection(s) Add to saved
  1. No category

Исследование генетической предрасположенности к

advertisement 
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт химической биологии и фундаментальной медицины
Сибирского отделения Российской академии наук
На правах рукописи
Соколова Екатерина Алексеевна
Исследование генетической предрасположенности к
рассеянному склерозу у жителей РФ с применением
системного анализа
03.01.03 – молекулярная биология
03.01.07 – молекулярная генетика
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель –
к.б.н. Филипенко Максим Леонидович
Новосибирск – 2015
2
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................... 4
ГЛАВА 1. ГЕНЕТИКА РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) .............................................................14
1.1 ПЕРВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕНЕТИКИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА .......................................................................... 14
1.2 МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНАЯ ПРИРОДА ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАССЕЯННОМУ СКЛЕРОЗУ ................................ 15
1.3 МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ .................................................................. 16
1.4 МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ МАЛЫХ ЭФФЕКТОВ ................................................................................... 18
1.4.1 Формирование выборок и фенотипирование ........................................................................ 18
1.4.2 Методы исследования генетических ассоциаций с мультифакториальными
заболеваниями. .................................................................................................................................. 19
1.4.2.1 Анализ ассоциаций генов-кандидатов.............................................................................................. 20
1.4.2.2 Полногеномный анализ сцеплений .................................................................................................. 23
1.4.2.3 Полногеномное исследование ассоциаций ..................................................................................... 23
1.4.3 Пути увеличения мощности исследований ........................................................................... 28
1.4.3.1 Мета-анализ ........................................................................................................................................ 28
1.4.3.2 Формирование функционально связанных групп генов ................................................................. 32
1.4.3.3 Анализ заболеваний со схожим патогенезом .................................................................................. 34
1.5 ГЕНЫ, ПРЕДРАСПОЛАГАЮЩИЕ К РАЗВИТИЮ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА .............................................................. 35
1.5.1 HLA-DRB1 ..................................................................................................................................... 35
1.5.2 TNFa ............................................................................................................................................. 42
1.5.3 FAS/APO-1/CD95 ......................................................................................................................... 45
1.5.4 KIF1B ............................................................................................................................................ 46
1.5.5 CD40............................................................................................................................................. 48
1.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................................................... 50
ГЛАВА 2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ РАЗВИТИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА У ЖИТЕЛЕЙ РФ
(РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ) ..........................................................................................................................52
2.1 АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНОГО ЛОКУСА RS10492972 ГЕНА KIF1B С РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ ........................ 54
2.1.1 Ассоциация между полиморфным локусом rs10492972 гена KIF1B и РС у жителей РФ .... 54
2.2.2 Мета-анализ ассоциации полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B с развитием РС 55
2.2 ПРИРОДА АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНОГО ЛОКУСА -308G->A ГЕНА TNFA С РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ ............... 60
2.2.1 Ассоциация между полиморфным локусом -308G->A гена TNFa и РС у жителей РФ ........ 60
2.2.2 Мета-анализ ассоциации полиморфного локуса -308G->A гена TNFa с развитием РС .... 62
2.2.3 Ассоциация между HLA-DRB1 и РС у жителей РФ .................................................................. 73
2.2.4 Неравновесие по сцеплению между rs1800629 (TNFa -308G->A) и HLA-DRB1 ...................... 77
2.2.5 Использование полиморфного локуса rs3135388 в качестве маркерного для
ассоциативного анализа РС и HLA-DRB1*15 ................................................................................... 80
2.3 РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНА CD40 В РАЗВИТИИ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА............................................ 83
3
2.3.1 Ассоциация полиморфного локуса rs6074022 гена CD40 с рассеянным склерозом ............ 83
2.3.2 Мета-анализ ассоциации полиморфного локуса rs6074022 и развития РС ....................... 84
2.3.3 Картирование функционального полиморфного локуса в гене CD40 ................................. 86
2.3.4 Анализ сайтов связывания транскрипционных факторов промоторного региона гена
CD40 ..................................................................................................................................................... 93
2.3.5 Аллельный дисбаланс гена CD40............................................................................................ 101
2.3.5.1 Анализ аллельного дисбаланса методом ПЦР-ПДРФ .................................................................... 106
2.3.5.2 Анализ аллельного дисбаланса методом ПЦР в режиме реального времени ............................ 108
2.3.5.3 Анализ аллельного дисбаланса методом цифровой ПЦР (Digital PCR) ........................................ 110
2.4 АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПУТЕЙ (PATHWAYS), ВОВЛЕЧЕННЫХ В ПАТОГЕНЕЗ РС................................................ 112
2.4.1 Аналитический обзор литературы ...................................................................................... 112
2.4.2 Молекулярные пути (pathways), вовлеченные в патогенез РС ......................................... 117
2.5 АНАЛИЗ АССОЦИАТИВНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ................................................................... 125
2.5.1 CD40........................................................................................................................................... 125
2.5.2 FAS ............................................................................................................................................. 131
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..........................................................................................................137
3.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫБОРКИ .................................................................................................................... 137
3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОТИПОВ ..................................................................................................................... 140
3.2.1 Выделение ДНК ........................................................................................................................ 140
3.2.2 Анализ с помощью TaqMan-зондов ....................................................................................... 141
3.2.3 Аллельный дисбаланс с помощью ПЦР-ПДРФ анализа........................................................ 144
3.2.4 Аллельный дисбаланс с помощью Real-Time PCR ................................................................. 145
3.2.5 Аллельный дисбаланс с помощью Digital PCR ....................................................................... 147
3.2.4 Определение аллелей HLA-DRB1 с помощью секвенирования ............................................ 148
3.3 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ...................................................................................................... 149
ВЫВОДЫ ...........................................................................................................................................................157
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ....................................................................................159
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ......................................................................................................................167
ПРИЛОЖЕНИЕ А ................................................................................................................................................203
4
Введение
Актуальность работы
Рассеянный склероз (РС) – тяжелое заболевание нервной системы,
характеризующееся
разрушением
миелиновой
оболочки,
хроническим
воспалением, патологическими изменениями аксонов и олигодендроцитов и
прогрессирующей неврологической дисфункцией. Распространенность РС
неуклонно растет, более того - наблюдается омоложение заболевания. По
данным Научного центра неврологии РАМН в РФ за последние 10 лет число
больных увеличилось в 3 раза и составляет на сегодняшний день более 200
тысяч. Болезнь поражает молодых людей в возрасте от 12 до 35 лет. По
данным ВОЗ, среди неврологических заболеваний рассеянный склероз
является основной причиной стойкой инвалидизации лиц молодого возраста.
Более половины больных к 10 году заболевания испытывают проблемы в
выполнении профессиональных обязанностей, а к 15 году – различные
ограничения жизнедеятельности. Более 70% больных в течение жизни
становятся инвалидами разных групп [1,2].
Исследования наследственной компоненты патогенеза РС были начаты
более века назад, когда в 1896 году Германом Людвигом Эйхорстом
(Eichorst) в работе «Uber infantile und hereditaire multiple Sklerose» была
отмечена семейная кластеризация РС [3]. В 1972 году был идентифицирован
первый генетический фактор риска РС - район
хромосомы 6 (6p21.3),
содержащий гены главного комплекса гистосовместимости (HLA) [4].
Однако
HLA-регион
объясняет
примерно
20-60%
генетической
предрасположенности к РС [5]. Более того факторы окружающей среды,
такие как инфекционные заболевания и географическая широта местности
проживания также способствуют развитию РС. В обзоре Ebers и Sadovniс
1994 года была выдвинута гипотеза, что предрасположенность к РС
формируется путем взаимодействия окружающей среды и нескольких генов
[6].
5
Поиск генетических детерминант предрасположенности к РС, знание
которых необходимо для построения целостной картины патогенеза
заболевания, проводили различными методами, как то метод геновкандидатов, метод полногеномного анализа сцепления и ассоциаций. С
начала XXI стали применять ряд новых методов статистического и системнобиологического анализа: мета-анализ, классификация генов в функционально
связанные
группы,
сравнительный
анализ
заболеваний
со
схожим
патогенезом. Все перечисленные методы в значительной степени пролили
свет на молекулярные механизмы патогенеза РС, и легли в основу разработки
двух таргетных лекарств, успешно применяемых в настоящие дни:
натализумаб (моноклональные антитела к VCAM1 (Vascular cell adhesion
molecule 1, васкулярная молекула клеточной адгезии 1)) и даклизумаб
(антитела к IL2RA (Interleukin-2 receptor subunit alpha,
рецептор
интерлейкина 2, субчастица альфа)). Однако детального знания обо всех
факторах риска и механизмах развития РС до сих пор нет. Знание этиологии
РС увеличит шансы создания таргетной терапии, которая не только облегчит
симптоматику, но и сможет корректировать течение заболевания на
молекулярном уровне, точно воздействуя на «причинные» звенья патогенеза.
Выявление факторов риска развития рассеянного склероза и создание
комплексной модели патогенеза – актуальные задачи неврологии.
К настоящему времени накоплено много информации об ассоциации
генетических полиморфных локусов с РС. Большая часть ее разрозненна и
противоречива. Ассоциация большинства полиморфных локусов требует
верификации путем репликации на репрезентативных выборках разных
этнических групп. В то же время для ряда полиморфных локусов выполнено
много исследований, но на малых выборках, что не позволяет сделать
окончательный вывод о роли полиморфного локуса в патогенезе РС без
проведения мета-анализа. Идентификация новых генетических предикторов,
ранее не выявленных, требует применения методов системно-биологического
анализа путем построения молекулярных сигнальных путей патогенеза РС.
6
Ранее в РФ были проведены исследования, посвященные генетической
предрасположенности к РС [7–14], проведенные на выборке жителей
Московской
области
ограниченного
размера.
Формирование
репрезентативной выборки больных РС, проживающих в разных регионах, до
настоящего исследования не проводилось. Наличие такой выборки позволит
реплицировать ранее выявленные ассоциации полиморфных локусов с РС у
европеоидов Америки и
Европы
с высокой
мощностью, а также
проанализировать наличие различий генетической предрасположенности к
РС у людей, проживающих в различных географических регионах РФ.
Таким
образом,
анализ
генетической
предрасположенности
на
репрезентативной выборке русской этнической группы к рассеянному
склерозу
с
применением
системно-биологического
анализа
является
актуальной задачей.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение роли полиморфизма
отдельных генов в предрасположенности к развитию рассеянного склероза в
репрезентативной выборке русской этнической группы с применением
современных методов анализа (мета-анализа, анализа молекулярных путей,
сетевого анализа).
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие
задачи:
1. Реплицировать ассоциацию с РС полиморфного локуса rs10492972
гена KIF1B в русской этнической группе и провести мета-анализ результатов
нашего исследования с ранее проведенными;
2. Проанализировать ассоциацию полиморфного локуса -308G>A гена
TNFa с РС в русской этнической группе, провести мета-анализ результатов
нашего
исследования
с
ранее
проведенными.
Исследовать
влияние
неравновесия по сцеплению этого полиморфного локуса c HLA-DRB1*15
аллелем на ассоциацию с РС;
7
3. Реплицировать ассоциацию полиморфизма гена CD40 с РС, провести
картирование
потенциального
функционального
аллеля
и
провести
теоретический функциональный анализ района гена CD40, его содержащего;
4. На основании анализа сигнальных путей, включающих продукт гена
CD40, и интегральных данных исследований генетики РС провести выбор
гена
для
проверки
гипотезы
их
ассоциативного
генетического
взаимодействия;
5. Исследовать ассоциацию РС с полиморфным локусом rs2234767 гена
FAS в русской этнической группе; на основании анализа сигнальных путей,
включающих продукт гена FAS и интегральных данных исследований
генетики РС провести выбор гена для проверки гипотезы их ассоциативного
генетического взаимодействия.
Научная новизна
Впервые на выборке пациентов с РС русской этнической группы,
проживающих в разных регионах России, была реплицирована ассоциация
полиморфных локусов генов KIF1B, TNFa, CD40, IL2RA, TRAIL, TRAIL-R2;
для полиморфного локуса rs2234767 гена FAS ассоциация была исследована
впервые в мире. C рассеянным склерозом у жителей РФ ассоциированы
полиморфные локусы rs6074022 и rs1883832 гена CD40, rs12722489 и
rs2104286 гена IL2RA, rs2234767 гена FAS и rs4894559 гена TRAIL.
По результатам мета-анализа аллель rs10492972[C] гена KIF1B является
статистически значимым протективным фактором развития РС, аллель
rs6074022[C] гена CD40 – фактором риска РС, в то время как полиморфный
локус -308G>A гена TNFa по результатам мета-анализа не ассоциирован с
заболеванием.
Впервые на примере русской этнической группы нами было показано,
что ассоциация с РС полиморфного
локуса
-308G>A гена TNFa,
идентифицируемая в выборках малого размера, является наведенной и
обусловлена неравновесием по сцеплению с аллелем HLA-DRB1*15.
8
Показано, что функциональный полиморфный локус гена CD40 лежит
выше старта трансляции гена. Впервые в мире in silico выявлено, что сайты
связывания транскрипционных факторов VDR, STAT3, IRF-4 – важные
регуляторные звенья гена CD40, нарушения в которых, вероятно, будут
приводить к повышенному риску развития РС. Впервые в мире in vitro
показано, что аллельные варианты функционального полиморфного локуса в
промоторном районе гена CD40, который маркируется полиморфным
локусом rs6074022, не приводят к аллельному дисбалансу.
Был проведен комплексный анализ всех статей, посвященных поиску
генетических факторов риска РС, на основании которого был составлен
список генов, ассоциированных с РС, и проведен анализ молекулярных
путей, вовлеченных в патогенез РС.
Теоретическая и практическая значимость
Настоящая работа вносит вклад в понимание молекулярных основ
патогенеза
РС.
Подтверждена
роль
гена
проведен
CD40,
поиск
месторасположения функционального полиморфного локуса и анализ
промоторного региона гена. Полученные данные в будущем могут стать
базисом для разработки таргетной терапии РС. Показана первостепенная
роль
аллеля
HLA-DRB1*15
в
локусе
HLA-TNFa,
что
говорит
о
непереспективности дальнейших ассоциативных исследований гена TNFa с
РС. Проведенный анализ молекулярных путей, вовлеченных в патогенез РС,
выявил
кандидатные
пути,
перспективные
для
дальнейших
экспериментальных исследований как ассоциативных, так и направленных на
поиск мишеней для разработки целевого лечения РС.
Положения, выносимые на защиту
1. Аллель С полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B является
статистически значимым протективным фактором развития РС.
2. Полиморфный локус -308G>A гена TNFa не ассоциирован с РС.
HLA-DRB1*15 аллель является фактором риска развития РС, а HLADRB1*01 и *14 протективными факторами у жителей РФ. Ассоциация
9
полиморфного локуса -308G>A гена TNFa, идентифицируемая в выборках
малого размера, является наведенной от HLA-DRB1*15.
3.
Полиморфные
локусы
rs6074022
и
rs1883832
гена
CD40
ассоциированы с РС у жителей РФ. Функциональный полиморфный локус
гена CD40 лежит выше старта трансляции гена. Сайты связывания
транскрипционных факторов VDR, STAT3, IRF-4 – важные регуляторные
звенья гена CD40, нарушения в которых, вероятно, будут приводить к
повышенному риску развития РС.
4. Четыре группы молекулярных путей, вовлечены в патогенез РС:
пролиферация, дифференциация B и Т клеток; апоптоз; синтез и метаболизм
витамина D3; передача сигналов интерлейкинами.
5.
Полиморфные
локусы
rs12722489
и
rs2104286
гена
IL2RA
ассоциированы с РС у жителей РФ.
6. Полиморфный локус rs2234767 гена FAS ассоциирован с РС у
жителей РФ.
7. Полиморфный локус rs4894559 гена TRAIL ассоциирован с РС у
жителей РФ.
8. Анализ не подтвердил гипотезу взаимодействия генов CD40/IL2RA в
нашей выборке.
9. Анализ не подтвердил гипотезу взаимодействия генов FAS/TRAIL в
нашей выборке.
Апробация результатов
По материалам диссертации опубликовано 11 статей в журналах,
входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов,
рекомендуемых
Высшей
аттестационной
комиссией
для
публикации
основных научных результатов диссертаций:
1) Ханох Е.В., Рождественский А.С., Кудрявцева Е.А., Какуля А.В.,
Делов Р.А., Филипенко М.Л. Исследование наследственных факторов
предрасположенности к рассеянному склерозу и особенностей его течения в
10
русской этнической группе. // Бюллетень СО РАМН - 2011 - Т.31 - №1 С.113-118.
2) Смагина И.В., Ельчанинова С.А., Золовкина А.Г., Игнатова Ю.Н.,
Кудрявцева Е.А. Генетические факторы риска рассеянного склероза в
популяции Алтайского края. // Журнал неврологии и психиатрии им.
Корсакова – 2011 - №5 - С. 42-45.
3) Kudryavtseva Е.А., Rozhdestvenskii A.S., Kakulya A.V., Khanokh E.V.,
Delov R.A., Malkova N.A., Korobko D.S., Platonov F.A., Aref'eva E.G.,
Zagorskaya N.N., Aliferova V.M., Titova M.A., Babenko S.A., Smagina I.V.,
El'chaninova S.A., Zolovkina A.G., Lifshits G.I., Puzyrev V.P., Filipenko M.L.
Polymorphic locus rs10492972 of the KIF1B gene association with multiple
sclerosis in Russia: case control study. // Molecular Genetics and Metabolism 2011 –V.104 - P. 390-394.
4) Ханох Е.В., Рождественский А.С., Кудрявцева Е.А., Какуля А.В.,
Делов Р.А., Филипенко М.Л. Влияние полиморфных локусов rs1800629
(TNFa), rs6074022 (CD40), rs187238 (IL-18), rs10492972 (KIF1B),rs4149584
(TNFRSF1A) на особенности клинических проявлений рассеянного склероза
с учетом гендерной принадлежности в этнической группе русских. //
Бюллетень сибирской медицины– 2011 - №2 - С.50-57.
5) Коробко Д.С., Кудрявцева Е.А., Малкова Н.А., Филипенко М.Л.
Связь полиморфизмов генов цитокинов со скоростью прогрессирования
рассеянного склероза. // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова –
2012 - №2 - Вып.2 - С.9-15.
6) Smagina I.V., Elchaninova S.A., Zolovkina A.G., Ignatova Yu.N.,
Kudryavtseva E.A. Genetic Risk Factors for Multiple Sclerosis in the Population
of the Altai District. // Neuroscience and Behavioral Physiology. –2012 - V. 42 №8 – P. 876-879.
7) Коробко Д.С., Малкова Н.А., Булатова Е.В., Бабенко Л.А., Сазонов
Д.В., Соколова Е.А., Филипенко М.Л. Влияние генетических факторов на
11
фенотипическую экспрессию рассеянного склероза. // Журнал неврологии и
психиатрии им. Корсакова – 2013 - №2 - Вып.2. - С.10-15.
8) Соколова Е.А., Малкова Н.А., Коробко Д.С., Рождественский А.С.,
Какуля А.В., Ханох Е.В., Делов Р.А., Платонов Ф.А., Попова Т.Е., Арефьева
Е.Г., Загорская Н.Н., Алифирова В.М., Титова М.А., Смагина И.В.,
Ельчанинова С.А., Поповцева А.В., Личенко Ю.Н., Дымова М.А., Вайнер
А.С., Пьянкова О.В., Оскорбин И.П., Кечин А.А., Пузырев В.П., Кулакова
О.Г., Царева Е.Ю., Фаворова О.О., Щур С.Г., Лащ Н.Ю., Попова Н.Ф.,
Попова Е.В., Гусев Е.И., Бойко А.Н., Аульченко Ю.С., Филипенко М.Л.
Первые результаты объединенного общероссийского исследования по
клинической генетике РС. // Журнал неврологии и психиатрии им. Корсакова
– 2013 - №2 - Вып.2. - С.6-9.
9) Sokolova Е.А., Malkova N.A., Korobko D.S., Rozhdestvenskii A.S.,
Kakulya A.V., Khanokh E.V., Delov R.A., Platonov F.A., Popova T.Y., Aref′eva
T.G., Zagorskaya N.N., Alifirova V.M., Titova M.A., Smagina I.V., El′chaninova
S.A., Popovtseva A.V., Puzyrev V.P., Kulakova O.G., Tsareva E.Y., Favorova
O.O., Shchur S.G., Lashch N.Y., Popova N.F., Popova E.V., Gusev E.I., Boyko
A.N., Aulchenko Y.S., Filipenko M.L. Association of SNPs of CD40 Gene with
Multiple Sclerosis in Russians. // PLoS ONE - 2013 – V.8 – N.4: e61032.
doi:10.1371/journal.pone.0061032.
10) Делов Р.А., Рождественский А.С., Маркс Е.А., Смяловский В.Э.,
Ханох Е.В., Какуля А.В., Соколова Е.А., Агапова О.Ю. Клиникоэлектрофизиологическая
и
молекулярно-генетическая
характеристика
течения ремиттирующего рассеянного склероза. // Журнал неврологии и
психиатрии им. Корсакова – 2013, №10, С.55-59.
11) Соколова Е.А., Боярских У.А., Аульченко Ю.С., Филипенко М.Л.
Генетика рассеянного склероза сегодня. // Успехи современной биологии.
2015. Т.135. № 4. С. 355-369.
Материалы диссертации также представлены на 1 российской и 3
международных конференциях:
12
1) Кудрявцева Е.А., Рождественский А.С., Какуля А.В., Ханох Е.В.,
Делов Р.А., Малкова Н.А., Коробко Д.С., Платонов Ф.А., Арефьева Е.Г.,
Загорская Н.Н. Алиферова А.М., Бабенко С.А., Смагина И.В., Ельчанинова
С.А., Золовкина А.Г., Пузырев В.П., Филипенко М.Л. Генетика рассеянного
склероза. «Сборник тезисов конференции «Рассеянный склероз: 30 лет
спустя»: Новосибирск, 2011, с.32-33.
2) E.A. Kudryavtseva, A.S. Rozhdestvenskii, A.V. Kakulya, E.V. Khanokh,
N.A. Malkova, D.S. Korobko, F.A Platonov, E.G. Aref′eva, N.N. Zagorskaya,
V.M. Alifirova, M.A. Titova, I.V. Smagina, S.A. El′chaninova, A.G. Zolovkina,
V.P. Puzyrev, E.Y. Tsareva, O.O. Favorova, A.N. Boiko, M.L. Filipenko. «Is the
association between -308G->A TNFA and multiple sclerosis independen to HLADRB1*15?» // Международная конференция «Постгеномные технологии для
биомедицины» (PBT-2012). 25-29 июня 2012 год. Новосибирск.
3) E.A. Kudryavtseva, A.S. Rozhdestvenskii, A.V. Kakulya, E.V. Khanokh,
N.A. Malkova, D.S. Korobko, F.A. Platonov, E.G. Aref’eva, N.N. Zagorskaya,
V.M. Alifirova, M. Titova, V.P. Puzyrev, I.V. Smagina, S.A. El’chaninova, A.G.
Zolovkina, E.Y. Tsareva, O.O. Favorova, A.N. Boiko, M.L. Filipenko. Association
of CD40 gene polymorphisms with the multiple sclerosis in population of Russian
Federation. // Multiple Sclerosis Journal. – 2012 – V. 18 – S.4 - P. 130. ECTRIMS
10-13 October. Lyon. France.
4) Kudryavtseva (Sokolova) E.A., Aulchenko Yu.S. and Filipenko M.L.
Role SNPs of CD40 in predisposition to multiple sclerosis // FEBS Journal. -2013
– V. 280 - I. Suppl. s1 - P.374, P.460. doi: 10.1111/febs.12340
Вклад автора
Основные результаты получены лично автором.
Лично автором была выделена коллекция ДНК пациентов с РС в
количестве 1409 образцов и часть контрольной группы. Лично автором были
разработаны системы определения генотипов полиморфных локусов гена
CD40 и KIF1B. Для полиморфных локусов генов TNFa, TRAIL, TRAIL-R2,
IL2RA, FAS и HLA-DRB1 разработка систем генотипирования была
13
выполнена к.б.н. Филипенко Максимом Леонидовичем и к.б.н. Ворониной
Еленой Николаевной, автор проводил оптимизацию данных тест-систем.
Лично автором был проведено определение генотипов всех полиморфных
локусах в выборках пациентов с РС и контрольной группе, за исключением
секвенирования HLA-DRB1 в выборке г. Москва. Лично автором была
проведена
статистическая
обработка
данных,
как
то:
линейный
и
логистический регрессионный анализ, RPE анализ, выбор наилучшей модели
(LRT и AIC), мета-анализ. Лично автором был проведен анализ аллельного
дисбаланса в гене CD40 и комплексный анализ литературных данных,
посвященных поиску генетических детерминант РС.
Автор
выражает
благодарность
всем
клиницистам-неврологам,
принявшим участие в формировании коллекции образцов: д.м.н. Бойко А.Н.,
д.м.н. Малковой Н.А., д.м.н. Смагиной И.В., д.м.н. Алифировой В.М., д.м.н.
Рождественскому А.С. д.м.н. Платонову Ф.А., к.м.н. Коробко Д.С., к.м.н.
Какуле А.В., к.м.н. Ханох Е.В., к.м.н. Делову Р.А., к.м.н. Личенко Ю.Н.,
к.м.н. Титовой М.А., Поповой Т.Е., Арефьевой Е.Г., Загорской Н.Н.; д.м.н.
Фаворовой и к.б.н. Царевой Е.Ю. за предоставление образцов ДНК из г.
Москва и данных о генотипах HLA-DRB1 в выборке г. Москва, к.б.н.
Боярских У.А. за помощь в культивироании мононуклеаров, выделении
мРНК и получении кДНК из мононуклеаров, Кондрахину Ю.В. за помощь в
проведении анализа транскрипционных факторов промоторного региона,
к.б.н. Келю А.Э. за помощь в проведении сетевого анализа и анализа
молекулярных путей, д.б.н. Аульченко Ю.С. за помощь в процессе
осваивания основ статистического анализа генетических данных человека с
помощью программного приложения R, к.б.н. Ворониной Е.Н. за ценные
советы при оптимизации тест-систем и постоянную поддержку в процессе
написания диссертации.
Автор благодарит научного руководителя к.б.н.
Филипенко Максима Леонидовича за постоянное внимание к работе и к
диссертанту.
14
Глава 1. Генетика рассеянного склероза (обзор
литературы)
1.1 Первые исследования генетики рассеянного склероза
Рассеянный склероз (РС) – тяжелое аутоиммунное заболевание нервной
системы,
характеризующееся
разрушением
миелиновой
оболочки,
хроническим воспалением, патологическими изменениями
аксонов и
олигодендроцитов и прогрессирующей неврологической дисфункцией.
Клинические проявления РС многообразны и включают центральные парезы
и параличи, мозжечковые расстройства, поражения черепных нервов,
эмоционально-когнитивные и поведенческие нарушения, расстройства
функции тазовых органов. Они обусловлены появлением в центральной
нервной
системе
в
результате
аутоиммунного
воспаления
очагов
демиелинизации, затрагивающих проводящие пути на любом участке от
спинного мозга до корковых структур.
Распространенность РС неуклонно растет, более того - наблюдается
омоложение
заболевания.
Для
представителей
европеоидной
расы,
проживающих в умеренном климате, распространенность РС составляет
примерно 1 случай на 1000 человек, при этом 15-20% пациентов имеют
родственников с тем же диагнозом.
Семейная кластеризация рассеянного склероза была отмечена более века
назад в 1896 году Германом Людвигом Эйхорстом (Eichorst) в работе
«Детский и наследуемый рассеянный склероз» («Uberinfantile und hereditaire
multiple Sklerose») [3]. В 30-х годах XX века другой немецкий ученый,
Фридрих Курций, описывает в своих работах влияние наследственности на
предрасположенность к РС [15].
Наличие больного среди кровных родственников повышает риск
развития РС, причем, чем выше степень родства, тем более высокий риск
заболевания [16,17]. У монозиготных близнецов конкордантность достигает
20,1% [18]. В то же время показано, что совместное проживание с человеком,
15
страдающим от РС, не изменяет индивидуальный риск развития заболевания.
Установлено, что у пар, где от РС страдают оба, дети чаще болеют РС, чем
дети у пар, где лишь один из родителей поражен этим заболеванием [19].
Таким образом, генетические особенности человека, безусловно, вносят
вклад в формирование предрасположенности к заболеванию РС.
1.2 Мультифакториальная природа предрасположенности к
рассеянному склерозу
В настоящее время условно выделяют моногенные (менеделирующие)
наследственные заболевания, для которых детерминирующим фактором
являются нарушения в одном гене, с определяющим вкладом дефектов
продукта
этого
гена
в
развитие
заболевания,
и
полигенные
(мультифакториальные, комплексные) заболевания, в этиологии которых
важную роль играет взаимодействие внешних факторов и особенностей
структуры большого количества генов, каждый из которых вносит
незначительный вклад в реализацию заболевания.
Всесторонние эпидемиологические исследования подтверждают, что РС
является мультифакториальным заболеванием, для которого генетическая
вариация обуславливает не только предрасположенность к его развитию, но и
влияет на такие клинические характеристики как возраст манифестации
симптомов заболевания, течение заболевания и ответ на терапию.
Также развитию РС способствуют факторы экзогенной природы, такие
как инфекционные заболевания и климатические условия. Многими
исследователями
отмечается
распространенностью
РС.
связь
Более
географической
высокая
частота
широты
с
встречаемости
соответствует более высоким широтам в северном полушарии. Однако для
южного полушария распространенность меняется незначительно при
движении от экватора к южному полюсу [20]. Возможно, это связано с
отличающейся
популяционной
спецификой
южного
полушария:
представители европеоидной расы более восприимчивы к развитию РС, чем
16
представители других рас. Влияние широты наиболее весомо в первые 15-ть
лет жизни. У индивидуума на всю жизнь сохраняется уровень риска развития
РС, характерный для местности, в которой он прожил первые 15 лет жизни.
Последующая смена постоянного места жительства не влияет на снижение
или повышение риска развития РС [21].
Немаловажным фактом являются и перенесенные инфекционные
заболевания. В частности, это могут быть герпесные инфекции (вирус
Эпштейна-Барра (Epstein–Barr virus), вирус Варицелла-Зостер (Varicella
zoster), вирус простого герпеса 1 типа (HSV1), вирус простого герпеса 2 типа
(HSV2), цитомегаловирус (CMV), вирус простого герпеса 6 типа (HSV6)),
гепатиты (A, B, C), полиомиелит [22,23]. В связи с этим, остается открытым
вопрос
о
влиянии
профилактических
прививок
на
последующую
восприимчивость человека к развитию РС [24].
Таким образом, РС является классическим мультифакториальным
заболеванием.
1.3 Механизмы развития мультифакториальных заболеваний
На
сегодняшний
генетическую
день
существует
две
природу предрасположенности
гипотезы,
к
объясняющие
мультифакториальным
заболеваниям.
Одна из них основывается на общепринятой теории, впервые
сформулированной Эриком Ландером: «частым заболеваниям соответствуют
и частые полиморфизмы» [25]. Согласно этой теории, большая часть
межиндивидуальных различий в геноме обусловлена давно возникшими,
закрепившимися в популяции полиморфными вариантами, которые и
отвечают за наследственную предрасположенность к мультифакториальным
заболеваниям.
Следовательно,
генетическая
предрасположенность
к
мультифакториальным заболеваниям формируется как результат суммарного
действия небольших эффектов большого количества генов, продукты
которых взаимодействуют с внешними факторами риска.
17
В последнее время популярность завоевывает гипотеза о значимой роли
редких, недавно возникших, высокопенетрантных мутаций функционально
значимых генов в наследственной предрасположенности к комплексным
заболеваниям [26], в том числе и к РС.
Обе эти гипотезы не являются взаимоисключающими и, возможно, что
они
обе,
но
в
разной
степени,
описывают
распространенные
мультифакториальные заболевания. При предположении, что каждый локус в
отдельности
обуславливает
число
(OR=1.2-1.5),
лишь
малую
локусов,
долю
вовлеченных
предрасположенности
в
формирование
предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям, оценивается
от 20 до 100 [26].
Первым
идентифицированным
локусом,
влияющим
на
предрасположенность к РС, оказался район хромосомы 6 (6p21.3),
содержащий
гены
главного
комплекса
гистосовместимости
(HLA).
Ассоциация главного комплекса гистосовместимости с развитием РС была
обнаружена
в
1972
году.
Группа
исследователей
с
помощью
лимфоцитотоксического теста выявила, что частота встречаемости аллеля
HLA-A3 значительно выше среди пациентов с РС, чем в контрольной группе
(P=0.0006) [4]. В том же году группа исследователей из Дании во главе с
Каспером Джерсилдом (Casper Jersild) выявила ассоциацию с HLA-B7 [27], и
годом позднее с LD-7a [28]. Почти во всех последующих популяционных
исследованиях была обнаружена ассоциация с аллелем HLA-DRB1*15.
Сложная архитектура HLA-региона и сильное неравновесие по
сцеплению в нем затрудняют определение причинного гена(-ов) [29]. HLAрегион объясняет примерно 20-60% генетической предрасположенности к РС
[5]. Таким образом, идентификация других генов с меньшим эффектом
необходима
для
более
полного
понимания
механизмов
патогенеза
рассеянного склероза. В следующих разделах мы описываем современные
методы, применяемые для идентификации генов малых эффектов, а также
результаты полученные этими методами к настоящему времени.
18
1.4 Методы идентификации генов малых эффектов
1.4.1 Формирование выборок и фенотипирование
Задача выявления факторов риска развития РС, к числу которых
относятся и генетические факторы может быть решена в рамках
эпидемиологических исследований.
Эпидемиологические
исследования
отличаются
по
временному
интервалу, в котором они выполняются (одномоментные и проспективные), и
способу
выбора
группы
обследуемых
людей.
При
одномоментных
исследованиях характеристики исследуемых людей определяются только в
один момент времени, тогда как в проспективных исследованиях собирается
информация о динамике признака в определенном временном интервале.
Основными
типами
эпидемиологических
исследований
являются:
проспективное популяционное исследование, одномоментное популяционное
исследование и одномоментное исследование типа «случай-контроль»
(Таблица 1).
Таблица 1. Способы формирования выборки для основных типов
эпидемиологических исследований при оценке риска развития РС
Тип исследования
Способы формирования выборки
временной
подбор группы
интервал
обследуемых людей
Проспективное
популяционное
проспективный
случайный
Одномоментное
популяционное
одномоментный
случайный
«Случай-контроль»
одномоментный
по исследуемому
признаку
В
проспективном
популяционном
Оценка риска
относительная
опасность
(hazard ratio, HR)
относительный риск
(relative risk, RR)
отношение шансов
(odds ratio, OR)
исследовании
участники
исследования часто объединены некоторым признаком, например, годом или
местом рождения, местом проживания и т.п. Однако они набираются
случайным образом по отношению к исследуемому признаку и наблюдаются
в
течение
некоторого,
как
правило,
достаточно
долгого,
времени.
Популяционное одномоментное исследование отличается от популяционного
проспективного исследования только тем, что анкетирование пациентов и
19
сбор
клинической
информации
производится
единожды,
в
момент
формирования выборки.
При изучении заболеваний, встречающихся в популяции с низкой
частотой, таких как РС, популяционный способ формирования выборки
становится неэффективным, так как исследование должно быть чрезвычайно
большим, чтобы в выборку случайным образом попало достаточное
количество больных. Эта проблема решается с помощью использования
одномоментного дизайна типа «случай-контроль». В таких исследованиях
принимают участие две группы индивидуумов: «случаи», которые обладают
исследуемой характеристикой, например болезнью, и «контроли», т.е.,
например, здоровые люди. Чрезвычайно важным является сбор информации,
позволяющей детально характеризовать клинический фенотип «случаев»,
кроме того, собирается информация об эндогенных и средовых факторах
риска, потенциально имеющих отношение к исследуемой болезни.
Для изучения генетики РС в основном применялся и применяется
последний тип исследований: «случай-контроль», и далее мы будем
рассматривать только его.
Резюмируя, для выявления факторов риска развития РС необходимо:
формирование группы пациентов с верифицированным диагнозом, группы
здоровых индивидуумов и определение выбранных для исследования
факторов в сформированных группах. Для генетических исследований этими
факторами являются полиморфные варианты генов, верный выбор которых
может в существенной степени влиять на результаты исследования.
1.4.2 Методы исследования генетических ассоциаций с мультифакториальными
заболеваниями.
Существует две стратегии поиска генов и генетических маркеров,
вовлеченных в патогенез заболевания: тестирование генов-кандидатов и
поиск по всему геному. Методологически установить связь генетического
маркера с заболеванием можно путем анализа сцепления или анализа
ассоциаций. В настоящее время для идентификации генетических факторов
20
мультифакториальных
заболеваний
широко
используют
три
вида
исследований: анализ ассоциаций генов-кандидатов, полногеномный анализ
сцеплений и полногеномное исследование ассоциаций (GWAS).
1.4.2.1 Анализ ассоциаций генов-кандидатов
Метод основан на выборе генов, имеющих полиморфизм и относящихся
к одной из физиологических или клеточных систем, нарушения работы
которой могут потенциально приводить к развитию заболевания. Данный
подход относительно эффективен в отношении заболеваний с достаточно
детально изученной патофизиологией. Например, гипотеза об аутоиммунной
природе РС позволяет предположить, что полиморфизм генов иммунной
системы может быть связан с предрасположенностью к развитию РС.
Благодаря данной стратегии в 1972 г. была установлена ассоциация генов
главного комплекса гистосовместимости (HLA) с РС [4,27].
В случае дизайна «случай-контроль» распределения частот аллелей или
генотипов исследуемых полиморфных локусов сравниваются между группой
пациентов и группой индивидуумов, не имеющих неврологических и
аутоиммунных
заболеваний.
Статистически
значимые
различия
распределений свидетельствуют о том, что данный полиморфный локус,
участвует в развитии заболевания.
Преимуществом метода генов-кандидатов является высокая мощность
детекции ассоциации в случае ее присутствия благодаря высокому OR.
Однако обязательным условием успешного применения метода является
наличие гипотезы, согласно которой выбираются гены для исследования. Это
затрудняет генетические исследования тех заболеваний, для которых
молекулярные
механизмы
патогенеза
сложны
и/или
исследованы
недостаточно полно.
Анализ различий частот аллелей и генотипов между группами «случай»
и «контроль» проводят с использованием различных статистических
методов.
Наиболее
распространены
метод
построения
таблицы
сопряженности с последующим определением разницы между частотами
21
аллелей
с
помощью
регрессионный
статистики
анализ.
хи-квадрат
Статистическая
(χ2)
обработка
и
логистический
данных
позволяет
рассчитать два параметра - «отношение шансов» (OR) и его уровень
статистической значимости (P). OR показывает, во сколько раз шансы
заболеть в группе риска у индивидуумов с мутацией выше, чем шансы
заболеть в группе без факторов риска у индивидуумов без мутации. Расчет
OR является хорошим инструментом, но поскольку он основан на выборке,
то он является не более чем оценкой истинной величины. Точность этой
оценки зависит от многих параметров, например, размера выборки. По этой
причине кроме расчета OR обычно вычисляют доверительный интервал
(95%C.I.,
confidence
interval)
и
уровень
значимости
(P).
Уровень
статистической значимости является важным параметром, отражающим
статистическую силу ассоциации. Важно также понимать, что для
полиморфных
локусов,
предрасполагающих
к
развитию
мультифакториальных заболеваний, величина OR не может быть слишком
большой,
так
как
гипотеза
о
мультифакториальности
заболевания
предполагает небольшой вклад каждого полиморфного локуса. Отношение
шансов (OR), как правило, варьирует от 1.05 до 2.50.
Если не удается отвергнуть гипотезу об отсутствии ассоциации,
оценивают
мощность.
статистического
Мощность
анализа
исследования, а
результатов
точнее
исследования,
мощность
характеризует
вероятность того, что мы увидим реально существующую ассоциацию в
спланированном нами исследовании. Приемлемым уровнем принято считать
80% и более. Мощность исследования зависит от многих параметров:
распространенность
заболевания
в
популяции,
частота
исследуемого
полиморфного локуса, степень связи полиморфного локуса с заболеванием,
размер исследуемых групп. Чем слабее связь полиморфного локуса с
заболеванием, тем большего размера группы требуются для достижения
приемлемой мощности. Например, если распространенность заболевания
0.001 (1 случай на 1000 человек) и частота аллеля риска полиморфного
22
локуса 0.3, то для того, чтобы с мощностью 80% и уровнем статистической
значимости 0.05, выявить ассоциацию с OR>1.25,необходимо сформировать
группу больных и контрольную размером не менее 900 человек каждая.
Более слабые ассоциации (OR<1.25) по результатам такого исследования,
скорее всего, будут не выявлены. Из вышеприведенного примера с
непреложностью
вытекает,
что
вывод
об
отсутствии
ассоциации
полиморфизма исследуемого гена с заболеванием в специфической
популяционной группе может быть ошибочным, вследствие недостаточной
мощности поисковой работы, что зачастую и случается на практике.
На сегодняшний день в базе данных PubMed опубликовано более 1300
работ по поиску генов, предрасполагающих к развитию РС, из них около
1000 выполнены с помощью метода генов-кандидатов. Однако результаты
этих исследований сильно рознятся, кроме данных по HLA-региону,
изучению которого посвящено около 300 печатных работ. В случае HLAрегиона метод генов-кандидатов сработал максимально успешно – верная
гипотеза
подтвердилась
последующими
исследованиями.
Основные
результаты исследований HLA-региона освещены в обзоре Фаворовой О.О. и
соавт. [30]. Ярким примером неудачного применения метода в истории
изучения генетических детерминант РС является исследование роли
аллельного полиморфизма гена APOE. Предполагалось, что аполипопротеин
Е, играющий ключевую роль в транспорте липидов, вовлечен в процесс
демиелинизации и ремиелинизации. С 1996 года опубликовано 43 работы, из
которых в пользу причастности аллельных вариантов гена APOE к
патогенезу РС говорят результаты 20 исследований [31–50], в то время как 23
работы других исследовательских групп не выявили этой связи [51–73].
Противоречивость результатов связана с небольшим размером исследуемых
групп, различным способом их формирования и возможными методическими
проблемами. В сентябре 2012 г. опубликованы результаты мета-анализа
генотипирования более 29 000 человек, окончательно опровергнувшие
гипотезу об участии гена APOE в патогенезе РС [74].
23
Помимо APOE на предмет участия в патогенезе РС активно
исследовались аллельные варианты генов: IL7RA, VDR, BDNF, IL1B, IL2,
CTLA4,
CCR5,
TNFa,
IL10,
IL6,
IFNG.
Роль
в
наследственной
предрасположенности к РС многих генов, исследованных методом геновкандидатов, на сегодняшний день остается неясной.
В виду вышесказанного, результаты, полученные методом генов
кандидатов, следует подвергать грамотной статистической обработке, а
также проводить репликативные исследования на других популяциях, после
чего уже делать окончательный вывод о роли изучаемого гена в патогенезе.
1.4.2.2 Полногеномный анализ сцеплений
С середины 1990-х годов для исследования генетической компоненты
РС начинают применять метод полногеномного анализа сцеплений. К
настоящему времени с его помощью проведено 19 работ [75–93]. Анализ
сцеплений основан на определении маркеров, распределенных по геному:
однонуклеотидных полиморфизмов и высокополиморфных микросателитных
повторов. Анализ проводится на семьях, в которых, как минимум, два
человека больны РС. Метод оценивает независимость наследования
микросателитных повторов [30]. К сожалению, данный метод не выявил
значимых маркером кроме HLA-региона, вероятно из-за его низкой
чувствительности.
1.4.2.3 Полногеномное исследование ассоциаций
Метод
полногеномного
исследования
ассоциаций
(GWAS)
стал
прорывом в генетических исследованиях мультифакториальных заболеваний.
Появление этого метода было бы невозможным без успешного завершения
двух фундаментальных международных научно-исследовательских проектов:
«Геном человека» (The Human Genome Project) и «Карта гаплотипов
человека» (Hap Map project), – в результате которых определены
нуклеотидные
последовательности
ДНК
человека
и
создан
каталог
полиморфных локусов, наиболее распространенных в геноме человека.
Высокопроизводительные технологии генотипирования с использованием
24
микрочипов позволили определять сотни тысяч полиморфных локусов
одновременно. В работе Даниэля Часмана (D. Chasman) была проведена
оценка минимального количества полиморфных вариантов, необходимого
для анализа ассоциации с заболеванием почти всех районов генома – 300000
[94], именно столько их содержали коммерчески доступные микрочипы
фирм Affimetrix и Illumina несколько лет назад. Схема анализа остается
прежней – определяется частота встречаемости генотипов нескольких сотен
тысяч локусов в группах «случай» и «контроль», затем находятся те
полиморфные варианты, для которых различия являются значимыми.
Важным преимуществом является агностический характер, т.е. патогенез
заболевания может быть не известен. Более того, на основании анализа
функций генов, показавших ассоциацию с заболеванием в GWAS, мы можем
открывать абсолютно новые молекулярные механизмы этого заболевания. С
помощью этой технологии в последние годы были определены новые
локусы,
предрасполагающие
к
развитию
РС,
а
также
другим
распространенным заболеваниям.
Несмотря на то, что GWAS позволяет в короткие сроки анализировать
множество полиморфных локусов на выборках большого размера, в то же
время многие методические и статистические проблемы этого метода
остаются нерешенными. Одним из ключевых моментов является так
называемая «проблема множественных сравнений». В связи с тем, что
анализируется одновременно большое количество полиморфных локусов,
необходимо вводить поправку на множественное тестирование, снижающую
количество
ложноположительных
результатов.
В
настоящее
время
полногеномно значимыми считаются ассоциации с P<10-8 [95]. Однако много
результатов будут попадать в «серую зону» (0.05> P >10-8), и на сегодняшний
день нет единого мнения, как интерпретировать такие «ассоциации». Также,
при GWAS анализируются полиморфные локусы, редкий аллель которых
встречается в популяции, как правило, с частотой ≥ 5%. Используя этот
25
подход, мы не учитываем редкие, возникшие недавно и не закрепившиеся в
популяции, мутации с высокой пенетрантностью [96].
К настоящему времени выполнено 12 GWAS для поиска генетической
компоненты предрасположенности к РС. Полная информация по этим
исследованиям доступна на сайте Multiple Sclerosis Discovery Forum
(msgene.org). В таблице 2 представлены основные результаты, полученные в
них [97–108]. Также подробную информацию о выявленных полиморфных
локусах можно почерпнуть из обзора Goris и соавт. [109]. После
многолетних, увенчавшихся весьма скромными успехами, попыток выявить
не-HLA гены, ассоциированные с РС, методами генов кандидатов и
полногеномного анализа сцеплений, метод GWAS стал новым витком в
развитии представлений ученых о механизмах развития патогенеза РС.
Благодаря агностическому характеру GWAS помимо генов, функциональную
связь которых с РС можно было предположить до исследования, зная, что РС
– это аутоиммунное заболевание (IL2RA, IL7RA) [98], были выявлены гены,
роль которых в патогенезе заранее предположить весьма затруднительно
например, TMEM39A [99]. Более того, GWAS выявили ассоциацию РС с
ранее неописанными регионами генома (GWA_20q11.21, GWA_13q31.3,
GWA_16q24.1, GWA_2p21, GWA_3p24.1, GWA_5p13.1, GWA_6q23.3),
функциональная роль которых еще не известна.
Таблица 2. Гены, полиморфные локусы которых выявлены в результате
полногеномных исследований ассоциаций рассеянного склероза (GWAS)
Источник
Страны
Количество человек в
группе РС
1-й этап
Количество человек в
контрольной группе
2-й этап
1-й этап
2-й этап
Ассоциированные
гены
Gödde et al.,
2005
Германия
(HLA-DR2+)
100
280
100
280
HLA-DRB1
IMSGC, 2007
(Hafler et al.,
2007
США,
Великобрита
ния
931
2931
3362
3596
WTCCC, 2007
Burton et al.,
2007
Великобрита
ния
975
-
1466
-
ALK, CBLB, CD58,
CLEC16A, DBC1,
EVI5, FAM69A, HLADRB1, IL2RA, IL7RA,
KANK1, KLRB1,
PDE4B, RPL5
DLG, GIPR, IL7R,
INPP5A, LRP5,
SLC4A5, TMEM39A,
26
WDYHV1, ZNF45
KIF1B
Aulchenko et
al., 2008
Нидерланды,
Канада,
Швеция
45
2.634
195
2930
Baranzini, et
al., 2009
США,
Нидерланды,
Швейцария
978
974
883
-
Comabella et
al., 2008
The Australia
and New
Zealand
Multiple
Sclerosis
Genetics
Consortium,
2009
Jakkula et al.,
2010
Испания,
США
Австралия,
Новая
Зеландия,
Великобрита
ния, США
242
553
242
1033
1618
2256
3413
2310
Финляндия,
Норвегия, и
другие
Германия
68
4570
136
10139
STAT3
592
-
825
-
Италия
(Сардиния)
Европа,
США,
Австралия,
Новая
Зеландия,
ранее
опубликован
ные
882
1775
872
2005
GWA_20q11.21, VAV2,
ZNF433
CBLB
9772
4218
17376
7296
Великобрита
ния
88
-
178
-
Nischwitz et al.,
2010
Sanna et al.,
2010
IMSGC, 2011
Sawcer et al.,
2011
McWhirter et
al., 2012
C20orf46, GPC5,
PDZRN4, CSMD1,
SLC25A36, SH3GL2,
TBC1D2, EN1, ZIC1,
MGC45800, DDEF2,
TRIB2
C6orf10,
GWA_13q31.3
AGAP2, CD40, CD58,
CDC37, CLEC16A,
CYP27B1, EVI5-RPL5,
HLA-DQA1, IL2RA,
IL7R
AGAP2, BACH2,
BATF, C1orf106,
CBLB, CD5, CD58,
CD86, CDC37,
CLEC16A, CLEC1,
CXCR5, CYP24A1,
DKKL1, EOMES,
EVI5, GPR65,
GWA_16q24.1,
GWA_2p21,
GWA_3p24.1,
GWA_5p13.1,
GWA_6q23.3, HHEX,
IL12A, IL12B,
IL22RA2, IL22RA,
MALT1, MANBA,
MAPK1, MERTK,
MPV12L2, MYB, MYC,
NCOA5, ODF3B,
PITPNM2, PKIA,
PLEK, PTPRK, RGS1,
RPS6KB1, SLC30A7,
SOX8, SP140, STAT3,
TAGAP, TIMMDC1,
TNFRSF1A, TNFSF14,
TTC34, ZBTB46,
ZFP36L1, ZMIZ1,
ZNF767
-
27
Однако при более детальном анализе списка полученных генов можно
понять, что появление ряда из них вполне логично. Например, ген STAT3
кодирует транскрипционный фактор, который регулирует экспрессию
различных
генов,
отвечающих
за
рост
клеток
и
апоптоз.
Иммунопреципитация хроматина и массивное параллельное секвенирование
показали, что Stat3 связывается промоторами многих генов, вовлеченных в
процессы активации, пролиферации и выживания T-клеток [110]. Нарушения
в апоптозе Т клеток могут приводить к массивной аккумуляции лимфоцитов
в лимфоидных органах, а также к нарушению апоптотической элиминации
аутореактивных Т клеток и развитию аутоиммунных заболеваний. Также
были описаны редкие мутации в гене STAT3, приводящие к развитию гиперIgE синдрому [111].
Продукт гена CD40, впервые выявленного именно посредством GWAS
[103], при взаимодействии с CD40L запускает процесс переключения класса
иммуноглобулинов в B клетках. Мутации в гене CD40L приводят к развитию
тяжелого наследственного заболевания – гипер IgM синдрому [112]. Логично
предположить, что менее пенетрантные мутации в генах CD40 и CD40L
могут приводить к развитию заболеваний, в патогенезе которых ключевую
роль играют иммуноглобулины.
Ведущие ученые сходятся во мнении, что результаты, полученные в
GWAS, необходимо верифицировать на различных популяционных группах
[113]. Для ряда локусов, в том числе в генах IL2RA и IL7R [114], CLEC16A
[115], уже проведены такие исследования. Следующим шагом в изучении их
роли в патогенезе РС будет выявление функционального варианта в гене.
Несмотря на то, что причинно-следственная связь многих других генов,
выявленных GWAS, с развитием РС на сегодняшний день до конца не ясна,
дальнейшее их исследование и изучение сигнальных путей, к которым
относятся кодируемые ими белки, должно обогатить наше знание патогенеза
РС.
28
1.4.3 Пути увеличения мощности исследований
Согласно
действующей
концепции
этиологии
РС
как
мультифакториального заболевания наследственный вклад в его развитие
должны вносить десятки или даже сотни генов. Как уже упоминалось, вклад
отдельного полиморфного локуса может быть весьма незначителен, и для его
выявления требуется формирование очень больших экспериментальных
групп для достижения необходимой мощности исследования. Это не всегда
удается достичь в рамках одного клинического или научного учреждения,
что стимулирует поиск дополнительных методов анализа полученных
данных для увеличения мощности и информативности исследований. Такими
методами могут служить мета-анализ, формирование функциональных
клеточных подгрупп и выявление полиморфных локусов, ассоциированных с
различными
заболеваниями
(или
анализ
заболеваний
со
схожим
патогенезом).
1.4.3.1 Мета-анализ
Под мета-анализом понимают статистический метод, который позволяет
объединять
результаты
ряда
исследований,
выполненных
разными
коллективами, иногда с противоречивыми результатами, и выявлять важные
тенденции путем сопоставления результатов независимых исследований.
При выполнении мета-анализа оценивают степень согласованности или
расхождения результатов, полученных в разных исследованиях. Как отметил
Гласс: «Мета-анализ относится к... статистическому анализу большой
совокупности результатов анализа данных из отдельных исследований в
целях объединения этих данных. Он ассоциируется со строгой альтернативой
бессистемным, описательным научным обзорам, которые служат типичным
примером наших попыток осмыслить стремительно увеличивающееся
количество
исследований
научных
должны
публикаций.
быть
в
Современные
большей
мере
обзоры
научных
техническими
и
статистическими, чем описательными... Данные многократных исследований
должны рассматриваться как комплексное множество данных, дающее без
29
статистического анализа ничуть не больше информации, чем результаты
обработки нескольких сотен данных одного единственного исследования»
[116].
Результаты мета-анализа представляются в виде «лесного графика» с
указанием суммарного для всех исследований отношения шансов (OR), 95%ного доверительного интервала (C.I.) и достигнутого уровня значимости (P).
Пример «лесного графика» приведен на рисунке 1 [117]. Согласно Q-тесту
присутствует гетерогенность данных (P<0.001); проведенный мета-анализ
показал статистически значимую ассоциацию аллеля С с развитием РС
(OR=1.14 (95%C.I.=1.11–1.17), P=6×10-22). Кроме того, приводится величина,
характеризующая
гетерогенность
входящих
в
анализ
результатов
исследований (χ2 (P) или I2). Причиной гетерогенности исследований может
быть как различия в формировании групп пациентов и контрольной, так и
этнические различия участников. Если для результатов исследований,
вошедших в мета-анализ, уровень гетерогенности находится за пороговым
уровнем, требуется, по меньшей мере, дополнительная интерпретация.
Например, одним из возможных путей дальнейшего анализа является
стратификационный анализ, подразумевающий деление исследований на
страты. В приведенном примере авторы делили исследования в зависимости
от расовой принадлежности участников: кавказоиды, азиаты, арабы, индусы,
монголоиды и евреи ашкенази.
30
Рисунок 1 – Пример «лесного графика»
Применение этого подхода в 2009 году позволило De Jager PL и соавт.
идентифицировать три гена, ассоциированные с РС, которые по результатам
предыдущих шести GWAS попали в «серую зону» статистической
значимости: CD6, TNFRSF1A, IRF8 [118]. Мета-анализ включал 2624
31
пациента с РС и 7220 лиц контрольной группы. Для подтверждения
полученных мета-анализом результатов в 2011 году Международный
генетический консорциум по проблемам рассеянного склероза провел
исследование ассоциативной связи данных полиморфных локусов на 2215
пациентах с РС и 2116 лицах контрольной группы, проживающих на
территории Великобритании и США [119]. По результатам исследования
были подтверждены ассоциации rs1800693 в гене TNFRSF1A (p = 4.19x10-7,
OR 1.12, 95% CI 1.07–1.18) и rs17445836 около гена IRF8 (p = 5.34x10-10, OR
0.84, 95% CI 0.80–0.89), в то время как для полиморфного локуса rs17824933
в гене CD6 ассоциация не достигла порогового уровня (p = 2.19x10-5, OR
1.11, 95% CI 1.06– 1.17). Примечательно, что ранее были описаны мутации в
гене TNFRSF1A, вызывающие семейный синдром периодической лихорадки
(TRAPS), который как и ремитирующая форма РС характеризуется
периодической аутоиммунной активностью. Интригующие результаты были
получены Kumpfel c соавт. при исследовании пациентов, течение РС у
которых имело черты TRAPS: артрит, миалгия, крапивница и сильная
усталость, предшествующие очередному обострению РС. 6 из 25 таких
пациентов (24%) имели аминокислотную замену Арг121Глн. Более того у 5
из этих пациентов были выявлены родственники, имеющие аналогичную
мутацию и клинические проявления TRAPS [120].
CD6 – поверхностный антиген Tклеток, участвующий в клеточной
адгезии. CD6 играет роль в положительной селекции тимоцитов в тимусе
[121]. IRF8 – интерферончувствительный элемент, связывающийся с
транскрипционным фактором в клетках иммунной системы и отвечающий на
стимулы интерферона. Как CD6, так и IRF8 участвуют в развитии и
созревании лейкоцитов [119].
Также по результатам мета-анализа, проведенного De Jager PL с соавт.,
были выявлены семь полиморфных локусов, номинально ассоциированных с
РС: CXCR4 (rs882300, P=1.37×10–7), IL12A (rs4680534, P=5.58×10–6),
MPHOSPH9/CDK2AP1 (rs1790100, P=7.21×10–7), OLIG3/TNFAIP3 (rs9321619,
32
P=1.71×10–5), PTGER4 (rs6896969, P=2.40×10–7), RGS1 (rs2760524, P=9.77×10–
6
) и ZMIZ1 (rs1250540, P=1.59×10–6). Для данных полиморфных локусов было
проведено аналогичное репликативное исследование, которое подтвердило
связь трех из них с РС: RGS1 (P=3.55×10–9), IL12A (P=3.08×10–8) и
MPHOSPH9/CDK2AP1 (P=3.96×10–8) [122].
Вышеописанное не только косвенно свидетельствует о возможной
вовлеченности данных генов в аутоиммунные процессы, но и подтверждает
важность проведения мета-анализа для исследуемых разными научными
коллективами полиморфных локусов. Необходимость его применения
вытекает из мультифакториальной природы РС, и как следствие малого
вклада каждого конкретного полиморфного локуса в предрасположенность к
заболеванию, что требует формирования выборок большого размера для
выявления связи, а невысокая частота встречаемости РС не позволяет в
рамках одного исследовательского центра набирать группы необходимого
размера.
1.4.3.2 Формирование функционально связанных групп генов
Несмотря
на
мультифакториальных
значительный
заболеваний,
вклад
GWAS
большинство
в
генетику
проведенных
исследований (http://www.genome.gov/gwastudies) позволили обнаружить
лишь небольшое количество статистически значимо ассоциированных
локусов. Значительное число выявленных ассоциаций не достигает уровня
статистической значимости после введения поправки на множественное
тестирование, и дальнейшая экспериментальная валидация существенно
затруднена за счет их большого количества. Несомненно, что среди этих
«слегка незначимых» локусов также есть истинно ассоциированные. Идея
извлечения этой полезной информации, остающейся за бортом стандартных
схем проведения и интерпретации GWAS, стимулировала развитие нового
направления статистического анализа полученных данных. Вполне логично
предположить,
что
аллели
предрасположенности
к
исследуемому
заболеванию не случайно распределены по геному, а напротив, встречаются
33
в генах, принадлежащих определенным функциональным подгруппам
(например, гены, продукты которых участвуют в регуляции воспаления). В
рамках такой гипотезы, при существовании большого числа аллелей,
показывающих слабую ассоциацию с умеренным уровнем статистической
значимости при изолированном анализе (не достигающим необходимого
уровня после поправки на множественное тестирование), можно было бы
ожидать, что статистически большое их количество проявит себя значимо
ассоциированными в функционально связанных группах генов (ФСГГ),
задействованных в патогенезе заболевания. В пользу данной гипотезы
свидетельствуют
также
результаты
исследования
Международного
генетического консорциума по проблемам рассеянного склероза 2010 года, в
котором сравнивались результаты двух GWASов. Все полиморфные локусы
обоих исследований были ранжированы по уровню значимости и разделены
на 12 кластеров. Сравнение кластеров выявило пересечение полиморфных
локусов в количестве, которое не могло быть получено в силу случайных
причин (P = 10-19) [123].
Для выделения ФСГГ, вовлеченных в формирование заболевания, в
настоящее время существует несколько методов, которые основываются на
функциональной аннотации [124], профилях транскрипции генов клетки в
разных состояниях [125], белок-белковых взаимодействиях и так далее
[126,127].
Впервые анализ неравновесной представленности результатов GWAS
между ФСГГ был проведен для болезни Паркинсона [128]. Методически этот
тип анализа состоит из нескольких этапов: определение списка полиморфных
локусов, ассоциированных с некоторым пороговым уровнем статистической
значимости (причем этот уровень меньше принятого уровня полногеномной
значимости); перевод списка полиморфных локусов в список генов;
тестирование перепредставленности генов из полученного списка в ФСГГ.
К настоящему моменту опубликовано 3 исследования, посвященных
формированию
ФСГГ
для
РС
[129–131].
Были
выявлены
ФСГГ,
34
регулирующие клеточную адгезию, сигнальную трансдукцию в клетках
иммунной системы, а также рост аксонов (axon guidance).
В сравнении с однолокусным анализом групповой анализ может дать
гораздо более информативный взгляд на биологию заболевания. Значимо
ассоциированная ФСГГ лучше объясняет тип функциональной связи
ассоциированного генотипа с риском возникновения заболевания, чем один
ген. Сегодня мы все больше слышим о генетической гетерогенности
мультифакториальных заболеваний, которая выражается в том, что любой
функциональный вариант может иметь лишь небольшой эффект на риск
заболевания в полной выборке вследствие того, что разные индивиды могут
иметь разные причинные аллели внутри одного гена или ФСГГ. При
подобной модели традиционные ассоциативные подходы имеют малую
мощность. Переходя на уровень ФСГГ, мы суммируем малые эффекты
разных аллелей внутри группы, тем самым увеличивая вероятность
обнаружить
ассоциацию
этой
группы
с
заболеванием.
Возможно,
ассоциацию заболевания с конкретной ФСГГ легче реплицировать в разных
популяциях и исследованиях, чем ассоциацию с определенным аллелем, так
как ассоциация с ФСГГ отражает молекулярную суть возникновения
заболевания, менее завися от генетической структуры популяции. Однако
важно подчеркнуть, что методология поиска ФСГГ еще в процессе
становления, остается ряд вопросов без ответа, в частности выбор гена в
группе сцепления, которую маркирует полиморфный локус.
1.4.3.3 Анализ заболеваний со схожим патогенезом
В 2009 г опубликована работа Baranzini, в которой предпринимаются
попытки выделить гены, полиморфные локусы которых влияют на развитие
аутоиммунных заболеваний [132]. Идеей, лежащей в основе этого
исследования,
является
выявление
группы
заболеваний,
предрасположенность к которым обуславливают одни и те же гены, с целью
формирования общего молекулярно-генетического механизма, посредством
которого реализуются клинически родственные патологии. Baranzini,
35
используя результаты всех опубликованных к 2009 GWAS аутоиммунных
исследований и GWAS сахарного диабета 2-го типа, выделял гены,
полиморфные локусы которых показали ассоциацию P<0.0001 и строил сеть
пересечений таких генов между заболеваниями. Было показано, что число
общих генов у РС и ревматоидного артрита больше, чем могло быть в силу
случайных
причин
(Наблюдаемое=12,
Ожидаемое=1.49,
P=3.4×10-18).
Согласно данному анализу общий молекулярный механизм с РС могут иметь
также диабет 1-го типа (Наблюдаемое=7, Ожидаемое=0.64; P=1.75×10-15) и
целиакия (Наблюдаемое=3, Ожидаемое=0.2; P=1.75×10-10).
В обзоре 2012 года Goris c соав. также отмечают тот факт, что многие
полиморфные локусы, выявленные посредством агностического метода
GWAS в качестве предрасполагающих к развитию РС, были выявлены в
ассоциативных исследованиях других аутоиммунных заболеваний, таких как
целиакия, болезнь Крона, ревматоидный артрит и диабет 1-го типа [109].
Чаще всего для таких полиморфных локусов аллель риска для РС является
аллелем риска и для других аутоиммунных патологий, что говорит о том, что
полиморфный локус предрасполагает к аутоиммунным заболеваниям в
целом.
Ярчайшим примером
такого
полиморфного
локуса
является
rs12212193 в гене транскрипционного фактора, специфичного для B клеток.
BACH2, который ассоциирован по меньшей мере с пятью аутоиммунными
заболеваниями: РС, диабет 1 типа, болезнь Крона, целиакия, аутоиммунный
тиреоиодит и витилиго [109].
1.5 Гены, предрасполагающие к развитию рассеянного склероза
1.5.1 HLA-DRB1
Локус HLA, содержащий гены главного комплекса гистосовместимости,
был идентифицирован первым, в качестве предрасполагающего к РС.
Номенклатура,
используемая
для
описания
HLA
региона,
является
достаточно сложной и за время исследований претерпела значительные
изменения. Например, аллели, сейчас называемые HLA-A3, HLA-B7 и DR2
36
ранее были известны как HL-A3, HL-A7 и LD-7. Связано это с тем, что ранее
устанавливались ассоциации не с конкретными аллелями, а с группой
аллелей, неравновесными между собой по сцеплению. В дальнейшем в связи
с развитием молекулярно-генетических методов поиск ассоциированных
аллелей был усовершенствован. Начиная с 1984 года, когда Коэн и др.
применили метод анализа длин рестрикционных фрагментов, началось
разделение групп аллелей на подгруппы [15]. В настоящее время с помощью
секвенирования
возможно
определение
субаллеля,
например
HLA-
DRB1*1501.
Почти во всех последующих популяционных исследованиях была
обнаружена ассоциация с гаплотипом HLA-DR2. Сложная архитектура HLAрегиона и сильное неравновесие по сцеплению долгое время не позволяли
выявить причинный аллель в DR2 гаплотипе (HLA-DQB1*0602- DQA1*0102DRB1*1501-DRB5*0101). Лишь в 2004 году по результатам работы на
афроамериканцах было установлено, что причинным аллелем является
DRB1*1501. В популяции афроамериканцев неравновесие по сцеплению
между локусами DRB1/DQB1 слабее, в отличие от европейцев и «белых»
американцев, на которых ранее проводились ассоциативные исследования
[133].
В настоящее время ассоциация РС с DRB1*15 аллелем найдена почти
повсеместно,
и
значимость
этого
аллеля
в
формировании
предрасположенности подтверждена практически в каждой тестируемой
популяции [134,135]. Во многих работах, которые изучали DRB1*15 аллель,
исследователи обнаружили, что частота этого аллеля статистически значимо
выше в группе больных РС, по сравнению с контрольной группой. Согласно
результатам мета-анализа у кавказоидов OR=2.59 (95%C.I.: 2.34-2.87), P=1075
) [134], у латиноамериканцев OR=2.28 (95%C.I.: 1.69-3.08), P=7x10-8) [135].
Данные о влиянии DRB1*15 аллеля на клинические показатели
заболевания противоречивы. Hensiek с соавт. выявили связь DRB1*15 аллеля
37
с ранним дебютом рассеянного склероза (P=0.001, -1.877 (-3.03- (-0.725)) лет)
[136], в то время как Barcellos с соавт. – нет [137].
Сильную связь DRB1*15 аллеля с РС на сегодняшний день объясняют
его структурными особенностями. Важный вклад в восприимчивость
человека
к
РС
вносит
Р4
карман.
Структурные
исследования
продемонстрировали, что полиморфные остатки, которые влияют на форму и
заряд Р4 кармана в пептид-связывающем сайте, являются определяющими
факторами в развитии DRB1-ассоциированных аутоиммунных заболеваний
человека. Было показано, что некоторые аминокислотные замены в
полиморфных участках молекул HLA могут влиять на структурные
изменения, значимые для образования "карманов", в которых связываются
определенные презентируемые пептиды. Эти изменения могут даже
полностью
нарушать
правильное
связывание
конкретного
пептида,
препятствуя его успешной презентации, а также влиять на корректное
физиологическое распознавание комплекса "пептид-молекула HLA" Тклетками. Кристаллическая структура DRβ*1501 отличается от не-DR2
молекул
тем,
гидрофобный
фенилаланин
что
Р4
в
аминокислотного
аминокислотные
карман.
92
позиции,
фрагмента
остатки
Ключевым
выступая
основного
формируют
большой
предположительно
является
в
роли
белка
якоря
миелина,
для
89-99
который
презентируется Т клеткам. Полиморфный локус DRβ в позиции 71, который
есть только у DRB1*1501-1506 и DRB1*1309, также критичен, так как он
создает необходимое стерическое пространство для доступа фрагмента
основного белка миелина к Phe92. Также HLA-DRB1*1501, DRB1*1503 и
DRB1*0301 аллели имеют общий аминокислотный остаток валин в 86
положении - DRbVal86, другие аллели несут в данном положении - Gly.
Считается, что присутствие валина способствует не только улучшению
презентации антигенов, включая основной белок миелина, но и стабильности
DRαβ димера [133]. Интересно, что всего одна замена ароматического
остатка тирозина в позиции 60 на гистидин превращает РС чувствительные
38
аллели DRB1*1501, *1503, *0301, *0401 и *0801/3 в устойчивые к РС аллели
DRB1*14 (DRB1*140101, *140102, *140103, *1404) [137].
Восприимчивость к РС носителей DR2 гаплотипа тесно связана с
внешним фактором риска – витамином D. Гипотеза о взаимосвязи этих двух
факторов была сформулирована в 1960 году Acheson на основании данных о
распространенности РС в зависимости от широты проживания. В Северном
полушарии наблюдался северно-южный градиент, который зеркально
отражался в южно-северный градиент в Южном полушарии [138].
Географическая широта влияет на количество получаемого солнечного света,
а значит и выработку организмом витамина D. В 2006 году были получены
данные, подтверждающие данную гипотезу - пациенты с РС до начала
заболевания имеют более низкий уровень циркулирующего витамина D
(25(OH)D) по сравнению с сопоставимым по возрасту, полу и этнической
принадлежности контролем [139]. Также в пользу данной гипотезы о
важности витамина D свидетельствуют следующие результаты: снижение
риска РС в зависимости от возраста миграции из Великобритании в
солнечную Южную Африку [140], различные показатели конкордантности
для близнецов в зависимости от географической широты места рождения
[141] и влияние месяца, в котором родился человек [142].
Для понимания механизмов взаимосвязи болезни, витамина D и DR2
гаплотипа необходимо понимать, каким образом взаимодействуют HLA и
витамин D. Витамин D – это секостероидный гормон, который синтезируется
у человека в эпидермальном слое кожи, также небольшое его количество
поступает с пищей и всасывается в тонком кишечнике вместе с другими
жирорастворимыми витаминами. Первый этап синтеза витамина D – это
синтез 7-дегидрохолестерола из холестерина в коже (Рисунок 2). Затем под
действием
ультрафиолетового
света
спектра
B
(290–315
нм)
7-
дегидрохолестерол подвергается фотолизу в провитамин D3, который в свою
очередь спонтанно изомеризуется в витамин D3. Витамин D3 биологически
инертен. Далее витамин D3 транспортируется в печень, где подвергается
39
ферментативному
гидроксилированию
с
образованием
25-
гидроксихолекальциферола (25(OH)D). А затем, когда появляется сигнал
опосредованный
паратгормоном,
25-гидроксихолекальциферол
транспортируется в почки, где в проксимальных канальцах под действием D1a-гидроксилазы происходит гидроксилирование по 1 атому углерода и
получается
активный
метаболит
-
1,25-дигидрохолекальцитриол
(1,25(OH)2D). Недавно было установлено, что кроме почек ряд других тканей
организма, таких как мозг, тимус и клетки иммунной системы, также
обладают ферментом 1-гидроксилаза. Таким образом, эти ткани могут
локально синтезировать активную форму витамина D [143].
Рисунок 2 – Синтез 1,25(OH)2D из холестерина
Большинство биологических эффектов 1,25(OH)2D или кальцитриола
опосредуются рецептором витамина D (VDR), который является членом
суперсемейства ядерных рецепторов – рецепторов стероидных гормонов - и
влияет на уровень транскрипции генов, в том числе и HLA-DRB1, путем
связывания с витаминD-зависящим элементом (VDRE), расположенном в
промоторной области
[143]. После связывания с 1,25(OH)2D VDR
подвергается конформационным изменениям, которые способствуют его
гетеродимеризации с ретиноидным Х рецептором (RXR), после чего весь
комплекс транслоцируется в ядро. В ядре комплекс VDR/RXR связывается с
40
VDRE в промоторных регионах генов, тем самым активируя или подавляя
транскрипцию 1,25(OH)2D-зависимых генов [144].
Каноническая
последовательность
VDRE
состоит
из
двух
несовершенных прямых повторов из шести нуклеотидов, разделенных
спейсером длиной в 3 нуклеотида (5’-GGGTGGAGGGGTTCA-3’). VDR
связывается с 3’ половиной сайта, в то время как RXR с 5’. Поиск VDRE
сайтов в HLA регионе in silico был осуществлен в 2009 году. Ramagopalan с
соавт.,
используя
базу
данных
JASPAR
[145],
проанализировали
нуклеотидную последовательность генов HLA-DRB1, HLA-DQA1 и HLADQB1, а также 5 т.п.н. выше старта транскрипции каждого из генов.
Несмотря
на
широкий
последовательностей
сайта
спектр
VDRE
возможных
вследствие
нуклеотидных
многообразия
сайтов
связывания VDR, только один потенциальный локус VDRE был обнаружен –
непосредственно перед стартом транскрипции HLA-DRB1 (Рисунок 3) [143].
Рисунок 3 – Промотор HLA-DRB1. Последовательность приведена для HLADRB1*15 аллеля. Важные регуляторные элементы (S, X и Y Boxes) выделены рамкой (с
модификациями по Ramagopalan с соавт. [143])
Ожидаемо, что полиморфные замены в VDRE могут сказываться на
эффективности связывания рецепторного комплекса VDR/RXR с ним. В
исследованиях Ramagopalan с соавт. и Cocco с соавт. было показано, что у
41
носителей
HLA-DRB1*15
аллеля
VDRE
последовательность
высоко
консервативна – не было обнаружено ни одной замены более чем у 320
носителей HLA-DRB1*15 в гомозиготном состоянии [143,144]. В то время
как примерно у 98% носителей аллелей не предрасполагающих к РС: HLADRB1*04, HLA-DRB1*07 и HLA-DRB1*09 – Ramagopalan с соавт.
обнаружили
измененную
нуклеотидную
последовательность
5’-
GGGTGGAGAGGGGTCA-3’ [143]. В исследовании Cocco с соавт. у
носителей HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*13 и частично у
носителей HLA-DRB1*03 и HLA-DRB1*01 была выявлена альтернативная
измененная
последовательность
характеризующаяся
тремя
заменами
5’-GAGTAGAGGGAGGTCA-3’,
в
последовательностях
сайтов
связывания RXR/VDR и четырехнуклеотиндным спейсером (Рисунок 4).
Рисунок 4 – Нуклеотидные последовательности промоторного региона
DRB1*15∶01, DRB1*16∶01, DRB1*03∶01 и DRB1*04∶0 аллелей.
Цветом выделены регуляторные элементы:S-box, X-box, Y-box, CCAAY-box, TATA-box и
VDRE. На рисунке представлены каноническая и измененная 16-тинуклеотидная
последовательности VDRE. Звездочкой в нижней строке показаны гомологичные участки,
пустые места соответствуют нуклеотидным заменам. В качестве референсной
последовательности взята последовательность из The IMGT/HLA Database (с
модификациями по Cocco с соавт. [144])
42
Примечательно, что носители неканонической последовательности
сайта VDRE имели также измененный сайт TATA-box.
С помощью трансфекции и проточной цитометрии Ramagopalan с
соавт. показали зависимость экспрессии HLA-DRB1*15 аллеля от 1,25(OH)2-D3 вследствие присутствия сайта VDRE [143].
Аутоиммунные
заболевания
характеризуются
нарушениями
механизмов центральной толерантности, а именно негативной селекции
аутореактивных клеток. Согласно этой модели слабое взаимодействие Тклеточного рецептора (TCR) и комплекса MHC/собственный антиген
позволяет уйти от негативной селекции. Таким образом, недостаток
витамина D в детском возрасте может снижать экспрессию HLA-DRB1*15 в
тимусе, позволяя аутореактивным клеткам избегать негативной селекции.
1.5.2 TNFa
Впервые в качестве гена-кадидата, предрасполагающего к развитию РС,
TNFa был исследован в 1995 году He с соавт. [146]. К тому времени была
выявлена лишь ассоциация HLA локуса с РС, а в обзоре Ebers и Sadovniс
1994 года была выдвинута гипотеза, что предрасположенность к РС
формируется путем взаимодействия окружающей среды и нескольких генов,
двух или более [6]. Предпосылом к тому, что полиморфные локусы гена
TNFa могут быть ассоциированы с РС, служили следующие данные. В 1986
году было показано, что во вновь образующихся бляшках в мозге пациентов
РС присутствуют Т лимфоциты и макрофаги [147]. Оба типа клеток
секретируют фактор некроза опухоли альфа (ФНО). Двумя годами позднее, в
1988 году, in vitro с помощью рекомбинантного ФНО человека на культуре
мышиных клеток спинного головного мозга Selmaj KW и Raine CS
обнаружили, что ФНО индуцирует некроз олигодендроцитов и повреждение
миелиновой оболочки через 18-24 часов [148]. В 1991 году при сравнении
уровней ФНО в спинномозговой жидкости пациентов с РС было показано,
что при прогрессирующей форме РС данный уровень повышен в отличие от
пациентов с клинически стабильной формой РС. Более того повышенный
43
уровень
ФНО-альфа
в
спинномозговой
жидкости
коррелировал
с
увеличением показателя EDSS (Expanded Disability Status Scale, расширенная
шкала оценки степени инвалидизации) в течении последующих двух лет
(r2=0.834, P<0.001), и был признан предиктором плохого прогноза развития
заболевания [149]. Хотя EDSS по своей сути является дискретной шкалой, и
изменения между каждыми конкретными показателями не могут быть
одинаково важны во всем диапазоне, среднее ухудшение в баллах,
зарегистрированных в исследовании, клинически важно по любым меркам.
Изменение экспрессии гена TNFa вследствие полиморфных замен в
промоторной области может быть причиной индивидуальной повышенной
чувствительности к нейродегенеративным процессам. К 1995 году был
известен ряд полиморфных локусов в гене TNFa, в том числе и SNP
rs1800629 (-308G>A). Впервые его описали в работе Wilson c соавт. в 1992
году [150]. В те годы в литературе его именовали NcoI рестрикционный
фрагмент, расположенный рядом с TNFa. Область от -328 до -285 п.н. была
определена как отвечающая за связывание транскрипционных факторов. Она
содержит консенсусную последовательность длиной 10 п.н. - сайт
связывания активатора белка 2 (AP-2) [151]. В этой области содержится
полиморфная замена -308G>A. Функциональные исследования этой замены
впервые были проведены в 1995 году. Методом транзиентной трансфекции с
использованием хлорамфеникол-ацетилтрансферазы в качестве репортерного
гена исследовали оценивали экспрессию TNFa в линиях Т клеток Jurkat и B
клеток Raji. Однако количество продуцируемой мРНК TNFa в клетках,
содержащих разные конструкции (TNF(-308G)/CAT и TNF(-308A)/CAT)
было эквивалентно [152]. Другой группой исследователей в 1997 году было
показано, что замена -308G>A влияет на аффинность ядерных факторов к
региону от -323 до -285 п.н. – связывание с последовательностью,
содержащей аллель -308A, в два раза выше по сравнению с -308G. Этими же
исследователями
был
проведен
анализ
уровня
мРНК
с
помощью
транзиентной трансфекции и геном люциферазы в качестве репортерного
44
гена.
При
стимуляции
клеток
(Jurkat
и
U937)
митогеном
PMA
(Phorbolmyristateacetate) уровень мРНК был в два раза выше в случае наличия
-308A [153].
В 1998 году Louis с соавт. оценили продукцию ФНО-альфа в
зависимости от генотипа полиморфного локуса -308G->A. Продукция ФНОальфа
измерялась
в
клетках
крови
после
24
часов
стимуляции
липополисахаридами Salmonella enteritidis (LPS) (Рисунок 5).
Рисунок 5 - Продукция ФНО-альфа у здоровых лиц в зависимости от
генотипа полиморфного локуса -308G->A
Клетки крови стимулировали LPS в количестве 1 нг/мл в течении 24 часов. Шкала ФНОальфа приведена в пг/мл. (с модификациями по Louis [154])
Продукция ФНО была значимо выше в клетках крови носителей
гетерозиготного генотипа по сравнению с носителями генотипа G/G (929
пг/мл (480–1473 пг/мл) против 521 пг/мл (178–1307 пг/мл); P<0.05). После
коррекции на уровень экспрессии CD14, посредством подсчета CD14+ клеток
и средней интенсивности флюоресценции, различия стали еще более
выраженными: 2,8×10-3пг/клетку×единицу флюоресценции (1.6–4.3) против
1.7×10-3 пг/клетку×единицу флюоресценции (0.5–2.6); P<0.01). Исследование
проводили на 62 здоровых добровольцах, генотипы полиморфного локуса
были успешно определены только у 57 человек: 41 – носители G/G, 16 –
носители G/A [154]. Не смотря на малый размер выборки, исследователи
призывали обратить внимание на полученный ими тренд и продолжить
45
изучение
роли
-308G->A
в
предрасположенности
к
повышенной
чувствительности к иммунно-воспалительным процессам.
Суммарно, все полученные к 1995 году данные, говорили о
привлекательности
данного
предрасполагающего
к
РС.
В
гена
на
1995
году
роль
было
гена-кандидата,
проведено
первое
исследование, сравнивающее распространенность аллеля -308A среди
пациентов с РС и здоровых контрольных лиц [146]. He с соавт. не выявили
различий в частоте встречаемости генотипов между страдающими РС и
здоровыми лицами. С 1995 по 2011 годы было проведено 28 независимых
исследований дизайна «случай-контроль», оценивавших ассоциацию SNP
rs1800629 (-308G>A) с РС, однако окончательного ответа о роли данного
полиморфного локуса в патогенезе в литературе не сформулировано
[146,155–181]. Интересно отметить, что уже в первых работах авторы
указывают на сцепление гена TNFa с HLA-локусом и сложностью разделить
их влияние на предрасположенность к РС. Звучат гипотезы о том, что роль
HLA-локуса вторична в РС, и может быть следствием сцепления с SNP
rs1800629
(-308G>A)
[146].
Однако
большинство
более
поздних
исследований концентрируется исключительно на SNP rs1800629 (-380G>A)
без учета его генетического окружения.
1.5.3 FAS/APO-1/CD95
При РС происходит разрушение миелиновой оболочки. В плакулах,
очагах воспаления, в 1996 году Dowling с соавт. были зарегестрированы
глиальные
клетки,
подвергающиеся
клеточной
гибели,
поэтому
молекулярные пути, отвечающие за клеточную гибель, стали рассматривать
как
важное
звено
в
патогенезе
РС
[182].
Один
из
механизмов
запрограммированной клеточной гибели, апоптоза, реализуется через Fas
систему, когда Fas-L индуцирует апоптоз в клетках мишенях, несущих на
поверхности Fas. Fas кодируется геном FAS, который также известен под
названиями APO-1 и CD95. Белок является членом семейства TNFрецепторов и играет центральную роль в физиологической регуляции
46
апоптоза путем образования комплекса FADD/каспаза 8/каспаза 10.
Показано, что в плакулах присутствует ряд клеток, экспрессирующих Fas-L,
как то CD4+ и СD8+ T клетки и макрофаги [183]. D’Souza с соавт. в 1996
году показали in vitro, что взаимодействие Fas и Fas-L вызывает быстрый
лизис мембраны олигодендроцитов и последующую их гибель [183]. В 1998
году два полиморфных локуса (+416 и +836) в гене FAS были исследованы на
предмет ассоциации с рассеянным склерозом у 62 пациентов с РС и 111
здоровых пациентов, однако статистически значимой связи выявлено не
было [184]. В 1999 году было показано, что лечение пациентов с РС
интерфероном-бета приводит к повышенной экспрессии Fas на Т клетках, а
также снижению фракции аутореактивных Т клеток [185]. В 2000 и 2004
годах были проведены ассоциативные исследования полиморфного локуса 670G>A, замена в котором нарушает консенсусную последовательность
транскрипционного
последовательность
элемента
[186].
–
Одно
из
интерферон-гамма-активируемая
исследований,
проведенное
на
австралийцах (РС=124, контроль=183), не выявило ассоциации, в то время
как другое, проведенное на жителях Голландии, выявило пониженную
частоту носителей G аллеля (GG+GA) среди пациентов с РС (OR=0.65,
95%C.I.=0.44-0.96, P=0.03) [187]. Таким образом, на сегодняшний день есть
данные об участии Fas-системы в патогенезе РС, однако убедительные
данные об ассоциации полиморфных локусов гена Fas в литературе
отсутствуют.
1.5.4 KIF1B
Впервые о возможной роли гена KIF1B в патогенезе РС заговорили
после публикации результатов полногеномного исследования Аульченко с
соавт. [100]. Первый этап GWAS был выполнен на 45 пациентах с РС и 195
контрольных людях, проживающих в Дании. Ассоциация с РС (P<0.05) в
1p36.22
регионе,
содержащем
ген
KIF1B,
была
выявлена
для
14
однонуклеотидных полиморфных локусов (SNPs); наименьшее значение P
соответствовало rs10492972 (OR=3.12, 95%C.I.=1.66-5.86). С помощью
47
логистического регрессионного анализа было показано, что ассоциация с РС
данного локуса может быть объяснена только SNP rs10492972. После чего
было проведено репликативное исследование на трех популяционных
группах: датчане (490 РС и 426 контрольных людей), шведы (826 РС и 997
контрольных человек) и канадцы (1318 пациентов с РС и их родители).
Суммарно репликативная фаза включала 2634 пациента с РС и 2930
контрольных человек; мета-аналитическое OR=1.35, 95%С.I.=1.23-1.48,
P=2.5×10-10.
РС
является
воспалительным
демиелинизирующим
заболеванием
центральной нервной системы (ЦНС) и возникает в результате развития
аутоиммунных
реакций
к
белкам
миелина,
характеризуясь
как
демиелинизацией, так и аксональным повреждением ЦНС разной степени.
Принято считать, что именно аксональная дегенерация лежит в основе
прогрессирования
необратимых
нарушений,
приводящих
к
стойкой
инвалидности [188].
Миелиновая оболочка, разрушение которой происходит при РС,
выполняет электроизолирующая функцию, увеличивая скорость проведения
нервного импульса по аксонам, которые он окружает. Помимо передачи
нервного импульса, миелин участвует в питании нервного волокна, а также
выполняет структурную и защитную функции. Одновременно с процессом
демиелинизации идет и ремиелинизация, что особенно заметно на краях
активной бляшки. Чем длительнее течение заболевания (РС), тем менее
выражен процесс ремиелинизации, что может быть связано со значительным
уменьшением
числа
олигодендроцитов.
На
скорость
процессов
ремиелинизации может влиять активность синтеза структурных компонентов
миелина, таких как основной белок миелина (myelin basic protein, MBP).
Lyons с соавт. показали, что белок kif1b, кодируемый геном KIF1B и
являющийся членом семейства кинезинов, вовлеченных в клеточный
транспорт,
необходим
для
правильной
локализации
мРНК
MBP
в
олигодендроцитах рыбы Данио рерио. Авторами обнаружена мутация в гене
48
kif1b, вследствие которой в белке происходит аминокислотная замена (Thr>Pro). Эта замена расположена в альфа петле, на которой предположительно
находится сайт взаимодействия с микротрубочками в кинезиновом моторе.
У рыб Данио рерио, несущих данную мутацию, мРНК, необходимая для
синтеза белков, входящих в состав миелина, находится в теле клетки
олигодендроцита, но не у очагов образования нового миелина. У мутантов по
kif1b, более медленно растут аксоны по сравнению с носителями kif1b дикого
типа. Примечательно, что белок kif1b Данио рерио имеет высокую
гомологию с kif1b человека: изоформы белка kif1ba рыбы Данио рерио и
человека идентичны на 78%, а изоформы kif1bb – на 87%. Транспонируя эти
данные на млекопитающих, можно предположить, как нарушения в
экспрессии гена KIF1B или структурный полиморфизм кодируемого им
белка могут влиять на процессы демиелинизации/ремиелинизации и,
следовательно, на риск развития РС и тип его течения [189,190].
Однако двумя годами позднее, в 2010 году, были опубликованы
результаты двух репликативных исследований. Ни в одном KIF1B из них
ассоциация c РС SNP rs10492972 не подтвердилась [191,192]. Для
верификации ассоциации SNP rs10492972 с РС необходимы дополнительные
репликативные
исследования
на
других
популяционных
группах
с
последующим обобщением результатов посредством мета-анализа.
1.5.5 CD40
Ассоциация полиморфного локуса гена CD40 впервые была выявлена в
2009
году
в
рамках
GWAS
проекта,
направленного
на
изучение
наследственной предрасположенности к РС. По результатам исследования
были подтверждены уже ранее полученные ассоциации, такие как HLA-DR15
(P=7.0x10-184), CD58 (P=9.6x10-8), EVI5-RPL5 (P=2.5x10-6), IL2RA (P=7.4x10-6),
CLEC16A (P=1.1x10-4), IL7R (P=1.3x10-3), TYK2 (P=3.5x10-3), а также
выявлена ассоциация полиморфного локуса, лежащего в 5’ области гена
CD40 на хромосоме 20q13 (rs6074022, P=1.3x10-7) [103]. Ассоциация
полиморфных локусов, маркирующих промоторную область гена CD40,
49
согласуется с гипотезой об аутоиммунной природе РС. Ранее была показана
ассоциация различных маркерных полиморфных локусов гена CD40 с рядом
аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка [193],
ревматоидный артрит [194], болезнь Крона [195], болезнь Грейвса [196].
Участие CD40 в аутоиммунных процессах убедительно показано на
экспериментальных модельных животных. Одна из наиболее исследованных
моделей аутоиммунного диабета - это линия мышей NOD, которая спонтанно
развивает диабет. Нарушение взаимодействия CD40-CD40L с помощью
антагонистических антител к CD40L предотвращает развитие диабета у NOD
мышей, подтверждая важную роль CD40-CD40L в развитии заболевания
[197]. В модельной линии мышей K/BxN ревматоидный артрит развивается
спонтанно с множеством характеристик похожих на клиническое течение
ревматоидного артрита у человека. Ревматоидный артрит не развивается у
мышей, нокаутных по гену CD40 (K/BxN-CD40-/-) [198]. Терапия мышей
антагонистом антител CD40L в период до начала коллаген-индуцированного
артрита приводила к тому, что заболевание либо не развивается [199], либо
протекает более мягко [200]. Хотя, если терапия у мышей начата уже после
развития артрита, то улучшения не наступает [199,200]. Эти данные
подтверждают, что сигнальный путь CD40 важен в инициации заболевания
ревматоидного артрита, но не является необходимым, если заболевание уже
развилось.
CD40
вносит
вклад
в
предрасположенность
к
аутоиммунным
заболеваниям, в которых B и T клеточные пути играют ключевую роль.
Действительно, роль взаимодействия CD40/CD40L выявлена в развитии
сахарного диабета 1 типа. Сигнальный путь CD40 индуцирует продукцию
провоспалительных цитокинов в островковых клетках приматов [201].
Повышенная экспрессия CD40L+ клеток обнаружена в мозге пациентов с
рассеянным склерозом [202]. Также, у пациентов с псориатическим артритом
показана экспрессия CD40 на кератиноцитах и эндотелиальных клетках в
псориатических
плакулах
и
повышенная
экспрессия
CD40L
в
50
периферических
T
клетках
крови
[203].
Повышенный
уровень
циркулирующего CD40L был показан у пациентов с ревматоидным артритом,
системной красной волчанкой, синдромом Сьоргена в период обострения
[204]. Фактически, взаимодействие CD40/CD40L является триггером для
иммунного ответа. Во-первых, сигнальная трансдукция CD40L нарушает
негативную селекцию в тимусе, позволяя высвобождаться T клеткам,
активным против тканей организма. Во-вторых, CD40L-зависимая продукция
провоспалительных цитокинов способствует дифференциации T клеток в
Th17 и активации антиген-презентирующих клеток.
Таким образом, выявленная в ходе GWAS ассоциация SNP rs6074022
[103] косвенно подтверждает теорию об аутоиммунной природе РС, а данные
на модельных животных – о схожести молекулярных механизмов реализации
разных иммунных патологий. Однако учитывая, что исследование ANZgene
(Australia
and
New
Zealand
Multiple
Sclerosis
Genetics
Consortium,
Консорциум по генетике рассеянного склероза Австралии и Новой Зеландии)
впервые выявило ассоциацию данного локуса, то требуется верификация
полученных результатов.
1.5 Заключение
По
истечении
33
лет
исследований
генетической
компоненты
предрасположенности к РС были выявлены около 60 полиморфных локусов,
ассоциированных с заболеванием. Результаты исследований не только
пролили свет на молекулярный механизм патологии, но и легли в основу
разработки двух таргетных лекарств, успешно применяемых в настоящие
дни: натализумаб (моноклональные антитела к VCAM1) и даклизумаб
(антитела к IL2RA). В значительной мере этот успех является следствием
технологических
и
метрологических
исследований
генетической
предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям в последние
годы. Однако даже с помощью их применения до сих пор не удается
51
получить детальное представление молекулярных механизмов развития РС,
вследствие его гетерогенности и мультифакториальной природы.
Более того, в отношении ряда генов до сих пор остается открытым
вопрос об их роли в патогенезе РС, как то гены KIF1B, TNFa, FAS, CD40.
Учитывая тот факт, что подавляющее большинство исследований было
проведено
на
жителях
Европы
и
США,
репликация
ассоциаций
полиморфных локусов данных генов на выборке жителей РФ из разных
регионов позволит получить дополнительную, новую, информацию о вкладе
этих генов в молекулярный механизм патологии, а применение современных
методов анализа данных позволит объединить и систематизировать
разрозненную информацию об их связи с РС.
52
Глава 2. Генетические детерминанты развития рассеянного
склероза у жителей РФ (результаты и обсуждение)
Наше исследование генетических детерминант рассеянного склероза у
жителей РФ состояло из двух блоков: ассоциативный анализ полиморфных
локусов генов KIF1B, TNFa, CD40 и анализ ассоциативного генетического
взаимодействия. Каждый из блоков исследований включал в себя несколько
этапов. На рисунке 6 в виде блок-схемы отображены этапы ассоциативного
анализа полиморфных локусов генов KIF1B, TNFa, CD40.
Исследование ассоциации с РС
маркерного полиморфного локуса гена
Мета-анализ результатов нашего
исследования с ранее проведенными
Получена ассоциация на полногеномно
значимом уровне (P<10-8)
да
нет
Картирование потенциального функционального
аллеля, теоретический и функциональный
анализ района гена, его содержащего
Анализ окружения гена
или прекращение
исследований
Рисунок 6 – Блок-схема ассоциативного анализа полиморфных локусов
генов KIF1B, TNFa, CD40.
Первоначально
мы
проводили
исследование
ассоциации
с
РС
маркерного полиморфного локуса гена, затем проводили мета-анализ наших
результатов
с
опубликованными
результатами
ранее
проведенных
исследований. Если по результатам мета-анализа нами была получена
ассоциация с РС на полногеномно значимом уровне (P<10-8), то мы
проводили картирование потенциального функционального аллеля, а также
теоретический и функциональный анализ района гена, его содержащего.
53
Данная схема исследований была выполнена для гена CD40. В случае если по
результатам мета-анализа не получена ассоциация с РС на полногеномно
значимом уровне, то мы проводили анализ окружения гена (ген TNFa) или
прекращали дальнейшие исследования (ген KIF1B).
На рисунке 7 в виде блок-схемы отображены этапы анализа
ассоциативного генетического взаимодействия.
Выбор первого гена для исследования
Выбор в этом гене маркерного полиморфизма
Исследование ассоциации с РС
маркерного полиморфизма
ассоциирован
нет
Сетевой анализ гена
Прекращение исследований
Выбор второго гена для исследований
Выбор в этом гене маркерного полиморфизма
Исследование ассоциации с РС маркерного
полиморфизма второго гена
ассоциирован
анализ ассоциативного
генетического взаимодействия
нет
Прекращение исследований
Рисунок 7 – Блок-схема анализа ассоциативного генетического
взаимодействия.
54
Анализ ассоциативного генетического взаимодействия был проведен
согласно блок-схеме на рисунке 6. В качестве первых генов были выбраны
CD40 и FAS.
2.1 Ассоциация полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B с
рассеянным склерозом
2.1.1 Ассоциация между полиморфным локусом rs10492972 гена KIF1B и РС у
жителей РФ
В пионерском исследовании Aulchenko et al. [100], выполненном
методом полногеномного анализа ассоциаций, была идентифицирована
ассоциация SNP rs10492972, локализованного в области гена KIF1B, с
развитием РС (OR=1.35, 95% CI: 1.23–1.48, P= 2.5 * 10-10). Несмотря на
высокое
OR,
уровень
статистической
значимости
и
биологическую
значимость, не удалось реплицировать ассоциацию в итальянской популяции
[191], а также на популяциях, входящих в International Multiple Sclerosis
Genetics Consortium (IMSGC) [192]. Учитывая региональный характер
средовых и генетических факторов, вносящих вклад в развитие РС, нами
была исследована ассоциация SNP rs10492972, расположенного в гене KIF1B,
с предрасположенностью и характеристиками течения этого заболевания у
жителей Западно-Сибирского региона РФ [205].
В группу пациентов с РС вошло 833 человека (583 женщины и 250
мужчин, средний возраст ± SD: 36.3±10.9, средний возраст начала
заболевания ± SD: 27.4±9.1). В контрольную группу вошло 689 человек (250
мужчин и 439 женщины, средний возраст ± SD: 32.8±11.8). Нами были
определены генотипы SNP rs10492972 гена KIF1B в группе РС и контрольной
группе (Таблица 3). Доля образцов с определенным генотипом (сall rate)
составила 100%. Размер сформированных нами групп для заболеваний с
распространенностью
0.0036
и
полиморфных
локусов
с
частотой
встречаемости аллеля риска 0.34 позволяет с 80% мощностью на уровне
статистической значимости 0.05 выявлять ассоциации c OR≥1.25.
55
Распределение генотипов rs10492972 соответствовало распределению
Харди-Вайнберга в группе больных РС и группе контроля (p=0.59 и p=0.77,
соответственно). Частота встречаемости аллеля С в группе контроля и группе
больных РС была одинакова и составляла 0.33. Частоты встречаемости
генотипов в контрольной группе статистически значимо не отличались от
таковых в группе пациентов с РС нашего исследования (Таблица 3).
Таблица 3. Ассоциация полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B с РС.
Группа
Все пациенты с РС
Контрольная группа
Количество пациентов с
генотипом, n
T/T
T/C
C/C
381
362
90
308
310
71
OR [C.I.:95%] P
0.99 [0.84-1.16] P =0.88
2.2.2 Мета-анализ ассоциации полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B с
развитием РС
Стратегия
поиска.
Нами
был
проведен
поиск
исследований
опубликованных до февраля 2015 года включительно в базе данных NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) с использованием ключевых слов:
“KIF1B”, “polymorphism” и “multiple sclerosis”, “rs10492972”. Поиск по
ключевым словам осуществлялся как независимо по каждому, так и для
различных комбинаций слов. Для включения в мета-анализ исследования
обязаны были удовлетворять требованиям: 1) дизайн case-control; 2)
оценивать ассоциацию SNP rs10492972 (KIF1B) и РС; 3) опубликованы на
английском языке или иметь резюме на английском языке с достаточной для
анализа информацией; 4) содержать всю необходимую информацию для
подсчета OR. С целью выявления потенциально подходящих публикаций мы
также просматривали библиографический список найденных статей.
Выбор данных. Из каждой публикации, соответствующей критериям
включения, были извлечены следующие данные: фамилия первого автора,
год публикации, страна или место набора участников исследования, размер
групп сравнения, уровень значимости соответствия равновесию ХардиВайнберга в контрольной группе, распределение генотипов/аллелей или OR,
его 95% доверительный интервал и уровень значимости.
56
Характеристики включенных исследований. В ходе поиска мы
обнаружили 5 независимых исследований (Таблица 4).
Таблица 4. Характеристика ассоциативных исследований с РС аллеля С
SNP rs10492972 гена KIF1B. A- группа из исследования Aulchencko с соавт.; Bгруппа из исследования Booth с соавт.; M - группа из исследования Martinelli-Boneschi с
соавт.; K – группа из исследования Koutsis с соавт.
Популяция
Группа
Контрольная
Частота
Частота
РС, n
группа, n
аллеля C
аллеля C в
в группе
контрольной
с РС
группе
OR
P
Россия
833
689
0.33
0.33
0.99 0.88
ИталияM
221
222
0.34
0.33
0.96 0.81
ШвецияA
826
997
0.34
0.27
1.30 0.0003
ГолландияA
490
426
0.34
0.27
1.42 0.0009
КанадаA
1318
1507
0.34
0.27
1.31 0.0012
АвстралияB
159
120
0.31
0.38
0.73 0.09
БельгияB
795
970
0.31
0.31
1.01 0.93
ФинляндияB
793
984
0.34
0.35
0.94 0.39
ИталияB
831
647
0.30
0.33
0.87 0.10
НорвегияB
738
1212
0.31
0.32
0.98 0.75
ШвецияB
1239
736
0.32
0.31
1.01 0.84
ВеликобританияB
1384
1540
0.30
0.33
0.88 0.02
СШАB
2452
1843
0.32
0.33
0.97 0.53
ГрецияK
609
230
0.31
0.31
1.00 0.99
ANZgene
3874
5723
0.32
0.32
1.00 0.99
В мета-анализ были включены: данные настоящего исследования;
исследования Aulchenko с соавт. (популяционные группы Голландии,
Швеции и Канады) [100], исследования Martinelli-Boneschi с соавт. (Италия)
[191], результаты исследования Booth с соавт. (Австралия, Бельгия,
Финляндия, Италия, Норвегия, Швеция, Великобритания, США) [192] и
результаты исследования Koutsis с соавт. [206].
Ассоциация между rs10492972 (KIF1B) и РС. Мы провели объединение
результатов
нашего
исследования
с
ранее
опубликованными
57
[100,103,191,192,206] и выполнили мета-анализ. Все включенные в метаанализ работы, за исключением исследования Martinelli-Boneschi с соавт. и
исследования Booth с соавт. на популяции Австралии, имели мощность более
80% для выявления ассоциации c OR≥1.25. В первом мета-анализе суммарное
для
всех
исследований
OR=1.02
(95%C.I.: 0.97-1.06)
с
уровнем
статистической значимости P=0.46, однако, тест на гетерогенность (Q-test)
выявил значительные различия в группах (P=6.8x10-7) (Рисунок 8А).
Рисунок 8А
Рисунок 8Б
Рисунок 8 - Мета-анализ
A-группа из исследования Aulchencko с соавт.; B-группа из исследования Booth с соавт.;
M - группа из исследования Martinelli-Boneschi с соавт.; K - группа из исследования
Koutsis с соавт.; ANZgene – группа из исследования Booth с соавт. (Австралия, Бельгия,
Финляндия, Италия, Норвегия, Швеция, Великобритания, США)
В связи со статистически значимым уровнем гетерогенности между
исследованиями,
включенными
в
мета-анализ,
мы
провели
оценку
гетерогенности контрольных групп по частоте встречаемости аллеля
rs10492972[С].
Согласно
результатам
теста
контрольные
группы
проведенных исследований значимо отличаются по частоте аллеля С
(P<0.0001). После исключения контрольной группы пилотного исследования
Aulchenko с соавт. достоверных различий по частоте встречаемости аллеля С
между оставшимися контрольными группами согласно Q-test не выявлено
58
(P=0.15). Поэтому, мы провели еще один мета-анализ, но уже исключив из
него результаты полученные Aulchenko с соавт. Тест на гетерогенность (Qtest) значимых различий между исследованиями не выявил (P=0.81). Более
того, по результатам мета-анализа частота аллеля С выше в контрольной
группе, а не в группе с РС, как было показано у Aulchenko с соавт.
(суммарное
OR=0.95
(95%C.I.:0.90-0.99)
с
уровнем
статистической
значимости P=0.02 (Рисунок 8Б)).
Ассоциация SNP rs10492972 гена KIF1B с развитием РС после
опубликования пилотного исследования Aulchenko с соавт. в 2008 году
активно исследовалась на протяжении 4 последующих лет на различных
популяциях, включая популяцию жителей РФ в нашем исследовании
[191,192,205–208]. Несмотря на достаточную мощность проведенных
репликационных исследований и потенциально объяснимую роль кинезина
KIF1B в молекулярных механизмах возникновения заболевания, ассоциация
аллеля С исследуемого локуса осталась неподтвержденной. С целью
объединения опубликованных данных об ассоциации SNP rs10492972 гена
KIF1B с РС, полученных исследователями разных стран для разных
популяций, проводили два мета-анализа. Первый мета-анализ, включающий
результаты
всех
исследований,
показал
значимую
гетерогенность
анализируемых данных, которая была связана с различиями в частоте
встречаемости аллеля С в контрольных группах (P=3.81x10-14). Исключив
результаты, полученные в исследовании Aulchenko с соавт., мы провели
второй мета-анализ. Согласно Q-test гетерогенность данных не превышала
допустимого уровня. Более того, согласно результатам второго мета-анализа
аллель С оказался статистически значимым протективным фактором
развития РС (OR=0.95, 95%C.I.: 0.90-0.99, p=0.02).
Учитывая вовлеченность гена KIF1B в процессы миелинезации [189],
получение столь противоречивых результатов разными исследователями
выглядит интригующе. Hintzen с соавт. выдвинули несколько предположений
[209], чтобы объяснить противоречивые результаты. Одно из них - это
59
ошибка генотипирования, которая очень часто обнаруживается вследствие
отклонения распределения генотипов от закона распределения ХардиВайнберга не только в группе пациентов, но и в контрольной группе. Hintzen
с соавт. отмечают, что в исследовании Booth с соавт. в контрольной группе
популяции Великобритании распределение генотипов не соответствует
закону Харди-Вайнберга (P=0.04), а для контрольной группы популяции
Италии близко к пограничному значению статистической значимости
(p=0.08). Для популяции Италии ассоциации с аллелем С показано не было
(OR=0.87, 95%C.I.: 0.75-1.02, P=0.10), а для популяции Великобритании
аллель С является протективным фактором развития РС (OR=0.88, 95%C.I.:
0.79-0.98, P=0.02), что противоречит результатам исследования Aulchenko с
соавт. В тоже время последнее исследование вносит основной вклад в
проведенный нами второй мета-анализ. Тем не менее, в нашем исследовании
распределение генотипов соответствовало закону Харди-Вайнберга и в
контрольной и в группе пациентов с РС с высоким уровнем статистической
значимости (P=0.77 и P=0.59, соответственно), однако OR было близко к
единице, не показывая ассоциации.
Другое предположение связано с тем, что возможно ген влияет не на
предрасположенность к заболеванию, а на такие характеристики как возраст
манифестации РС. Hintzen с соавт. обнаружили, что у больных РС,
проживающих в Голландии и принимавших участие в их исследовании,
различия в возрасте манифестации заболевания для носителей разных
генотипов близки к статистически значимым (P=0.09). Методом линейного
регрессионного анализа мы исследовали влияние генотипа на возраст начала
заболевания, однако на больных РС, проживающих на территории ЗападноСибирского региона и республики Саха (Якутия) РФ, такой тенденции не
обнаружено (P=0.54).
Gourraud с соавт., анализируя данные Aulchenko с соавт. и результаты,
полученные
в
рамках
исследования
Международного
генетического
консорциума Booth с соавт., пришли к выводу, что ассоциация rs10492972 c
60
РС была ложно-положительной вследствие малого размера групп пилотного
исследования. Полученный нами в результате мета-анализа статистически
значимый протективный эффект аллеля С rs10492972 не позволяет пока
поставить точку и вычеркнуть ген KIF1B из списка кандидатов на роль
генетических предикторов риска РС. Суммарно, рознящиеся результаты
исследований на больших популяционных группах свидетельствуют о
необходимости дальнейшего исследования вовлеченности данного региона
генома
в
патогенез
и
клинические
проявления
РС.
Вероятно,
ресеквенирование этого участка генома прольет свет на причины спорных
результатов, и позволит выявить функциональные структурные варианты
этого гена.
2.2 Природа ассоциации полиморфного локуса -308G->A гена TNFa
с рассеянным склерозом
2.2.1 Ассоциация между полиморфным локусом -308G->A гена TNFa и РС у жителей
РФ
Связь полиморфного локуса -308G->A (rs1800692) гена TNFa с
развитием РС активно исследуется различными научными коллективами на
протяжении
уже
двух
десятилетий,
однако
вследствие
рознящихся
результатов, точка в этих исследованиях не поставлена по сей день. Для
выявления наличия или отсутствия ассоциации SNP -308G->A гена TNFa с
развитием РС у жителей РФ нами были определены генотипы у 1728
пациентов с РС (563 мужчины и 1165 женщин, средний возраст ± SD
36.7 ± 11.2 лет) и 1115 человек (378 мужчин и 737 женщин, средний возраст
± SD: 33.1 ± 10.2 лет), не страдающих неврологическими и аутоиммунными
заболеваниями. Доля образцов с определенным генотипом (сall rate)
составила более 0.99. Распределение генотипов полиморфного локуса -308G>A в группах соответствовало распределению Харди-Вайнберга, P=0.51 для
группы РС и P=1.00 для контрольной группы.
61
Для выявления ассоциации аллельных вариантов SNP -308G->A с РС
выполняли логистический регрессионный анализ с поправкой на пол и
возраст (Таблица 5). В качестве аллеля риска был выбран аллель G, то есть в
качестве нормы выступал алелль А. Согласно результатам анализа
полиморфный локус -308G>A не ассоциирован с РС у жителей РФ.
Таблица 5. Ассоциация -308G->A (rs1800629) гена TNFa с развитием РС
Количество
Генотип
OR (95%C.I.), P
контроль
РС
(всего = 1095) (всего = 1720)
G/G
855
1393
G/A
225
307
1.17 [0.99-1.39]
A/A
15
20
P=0.07
HWE p-value
1.00
0.51
Частота аллеля риска G
0.88
0.90
В ассоциативном исследовании SNP rs10492972 гена KIF1B в
контрольную группу вошли только люди, проживающие на территории
Сибирского федерального округа(СФО), а в группу с РС – 779 человек из
СФО и 54 человека из Дальневосточного федерального округа (ДВФО). В то
время как в ассоциативном исследовании SNP -308G->A (rs1800629) гена
TNFa и в контрольную группу и в группу с РС вошли люди с трех
федеральных округов РФ. В виду потенциальной стратификации группы РС
и контрольная были разбиты на три подгруппы каждая: Центральный
федеральный округ (ЦФО), СФО и ДВФО. Подгруппа ЦФО включала в себя
511 пациентов с РС и 128 человек контрольной группы, проживающих в
Московской области. Подгруппа СФО объединила в себе пациентов с
Томской, Омской, Кемеровской, Новосибирской областей и Алтайского края
(n=1116) и 925 персон из контрольной группы. В подгруппу ДВФО вошли
пациенты и контрольные лица республики Саха (Якутия), 101 и 62 человека
соответственно. Нами был проведен аналогичный регрессионный анализ
(Таблица 6). Ассоциация была выявлена только для жителей СФО.
62
Таблица 6. Ассоциация -308G>A (rs1800629) гена TNFa с развитием РС у
жителей
разных
федеральных
округов
РФ.
Статистически
значимые
ассоциации выделены курсивом.
Федеральный
округ
ЦФО
СФО
ДВФО
G/G
390
923
80
РС
G/A
111
179
17
A/A
5
11
4
Контроль
G/G G/A A/A
94
20
4
717 194
13
54
7
1
OR (95%C.I.), P
1.00 [0.63-1.59] P=0.99
1.36 [1.11-1.66] P=0.003
0.61 [0.29-1.28] P =0.19
Привлекает внимание не только факт возможной стратификации внутри
сформированных групп в зависимости от места проживания участников
исследования, но и то, что аллелем риска вопреки ожиданиям стал не редкий
аллель А, который согласно исследованиям повышает экспрессию гена TNFa
[153], а частый – G. Исходно внимание на ФНО-альфа был обращено в
рамках гипотезы аутоиммунной природы РС. В 1995 году было проведено
первое исследование, сравнивающее распространенность аллеля -308A среди
пациентов с РС и здоровых контрольных лиц [146]. He с соавт. не выявили
различий в частоте встречаемости генотипов между страдающими РС и
здоровыми лицами. Однако это исследование было проведено на очень
маленькой
выборке.
В
последствии
были
проведены
аналогичные
исследованиями на других популяциях. Таким образом, целесообразно
суммировать все полученные результаты, полученные к настоящему времени
различными научными коллективами, включая текущее исследование.
2.2.2 Мета-анализ ассоциации полиморфного локуса -308G->A гена TNFa с развитием
РС
В виду противоречивости результатов ассоциативного исследования на
жителях РФ нами было проведен тщательный литературный анализ с
последующим мета-анализом всех опубликованных исследований касательно
ассоциации между SNP -308G->A гена TNFa и РС.
Стратегия
поиска.
Нами
был
проведен
поиск
исследований,
опубликованных до февраля 2015 года включительно в базе данных NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), с использованием ключевых слов:
“TNFa”, “polymorphism” и “multiple sclerosis”, “-308G->A”, “rs1800629”.
Поиск по ключевым словам осуществлялся как независимо по каждому, так и
63
для различных комбинаций слов. Для включения в мета-анализ исследования
обязаны были удовлетворять требованиям: 1) дизайн case-control; 2)
оценивать ассоциацию SNP rs1800629 (TNFa -308G->A) и РС; 3)
опубликованы на английском языке или иметь резюме на английском языке с
достаточной для анализа информацией; 4) содержать всю необходимую
информацию для подсчета
OR. С целью выявления потенциально
подходящих публикаций мы также просматривали библиографический
список найденных статей. В ходе поиска нами были обнаружены три метаанализа, проведенные раннее разными научными коллективами [210–212].
Исследования, включенные в эти мета-анализы, после проверки соответствия
4 критериям включения также определяли в качестве подходящих для
нашего мета-анализа. Недостающую информацию запрашивали у авторов, и
если ответ не был получен, то исследование не включали в мета-анализ.
Выбор данных. Из каждой публикации, соответствующей критериям
включения, были извлечены следующие данные: фамилия первого автора,
год публикации, страна или место набора участников исследования, размер
групп сравнения, уровень значимости соответствия равновесию ХардиВайнберга в контрольной группе, распределение генотипов/аллелей или OR,
его 95% доверительный интервал и уровень значимости.
Характеристики включенных исследований. В ходе поиска мы
обнаружили 28 независимых исследований (Таблица 7) и 3 мета-анализа
[210–212].
Таблица 7. Характеристика исследований
Аббревиатура: НД – нет данных; РХВ – равновесие Харди-Вайнберга; AS – allelespecific; PCR – polymerase chain reaction (ПЦР); ARMS – amplification refractory mutation
system; SSP – sequence specific primer; ASO – allele-specific oligonucleotid; RFLP - restriction
fragment length polymorphism.
№
Первый автор, год
исследования
Группа РС
Контрольная группа
1
He 1995[146]
93 (Швеция)
95 (Здоровые
доноры крови,
сопоставимые по
национальности)
p(РХВ) в
контрольной
группе
0.42
метод
типиров
ания
AS PCR
Метаанализ
Вкл
64
9 РС
(Германия)
50
(Германия)
2
Zipp 1995[155]
3
Braun 1996 [156]
4
Huizinga 1997 [157]
5
Wingerchuck 1997 [158]
6
Weinshenker 1997[159]
78 (США)
7
Mycko 1998[160]
53 (Польша)
8
9
Fernandez-Arquero 1999
[161]
Maurer 1999 [162]
238
(Испания)
238
(Германия)
10
Sotgiu 1999 [163]
20 РС
(Италия)
11
Lucotte 2000 [164]
74 (Франция)
12
Anlar 2001 [165]
13
14
Fernandes Filho 2002
[166]
De Jong 2002 [167]
24
РС,
манифестаци
я в детстве
(Турция)
133
15
Drulovic 2003[168]
16
Luomala 2003 [169]
17
Duvefelt 2004 [170]
18
19
Wirz 2004 [171]
Mihailova 2005 [172]
НД
55 (Болгария)
20
Dong 2006 [173]
68 (Южный
Китай)
155
(Голландия)
110 (США,
округ
Олмстед,
клиника
Мейо)
159
(Голландия)
143 (Белград,
Сербия)
93
(Финляндия)
238
(Испания)
9 здоровых
пациентов
22 (Германия,
здоровые лица,
сопоставимые по
национальности)
186 (Здоровые
волонтеры)
110 (Пациенты
клиники Мейо с
другими
заболеваниями,
сопоставимые по
возрасту, полу и
национальности)
39 пациентов с
шизофренией
81 (Польша, лица,
сопоставимые по
национальности)
324 (Мадрид,
Испания)
72 пациента с
амиотрофическим
латеральным
склерозом и 66 с
инфарктом
8 (здоровых
контролей)
НД
SSCP
нет
НД
Sequenci
ng
Вкл
0.87
PCR
Вкл
0.85
AS PCR
Вкл
НД
AS PCR
Вкл
0.58
PCR
Вкл
0.51
PCR
Вкл
НД
allelic
discrimin
ation
PCR
Вкл
НД
нет
75 (контрольных
лиц)
93 (здоровых
добровольца,
сопоставимых по
национальности)
148
НД
TNFaspecific
enzymeli
nked
immunos
orbent
assay
НД
НД
PCRRFLP
Нет
0.02
PCR
Нет
273 (контрольных
пациентов)
123 (Белград,
Доноры крови,
сопоставимые по
национальности)
400 (контрольные
лица)
324 (Испания,
здоровые лица,
сопоставимые по
национальности)
НД
86 (Здоровые
доноры крови,
сопоставимые по
национальности)
106 (Южный Китая,
лица, сопоставимые
по национальности)
НД
НД
Нет
0.49
ASPCR
вкл
1.91 x 10-23
PCR
нет
НД
TaqMan
вкл
НД
0.55
НД
PCRSSP
нет
вкл
0.34
PCRRFLP
вкл
Нет
65
220 (Здоровые лица,
сопоставимые по
полу, возрасту и
местности
проживания)
439 (Здоровые
волонтеры,
сопоставимые по
национальности и
полу)
460 (Здоровые
доноры крови,
сопоставимые по
полу, возрасту и
национальности)
140 (здоровые лица)
0.90
ARMSPCR
вкл
0.43
ASOPCR
вкл
0.86
PCR
вкл
0.05
нет
0.99
86 (Турция)
97 (Здоровые
волонтеры)
150 (здоровых лиц)
НД
НД
НД
28
Mirowska-Guzel 2011
[180]
Shahbazi 2011 [181]
PCR SSP
PCRSSP
PCRRFLP
НД
366 (Иран)
НД
Наше исследование
1720 (Россия)
PCRSSP
TaqMan
нет
29
414 (контрольных
лиц, Иран)
1095 (Россия,
здоровые
волонтеры,
сопоставимы по
национальности и
полу)
21
Forte 2006 [174]
91 (Италия,
Западная
Сицилия)
22
Kamali-Sarvestani 2007
[175]
270 (Иран,
Шираз)
23
Ristic 2007 [176]
338
(Хорватия
(175),Словен
ия (163))
24
Sarial 2008 [177]
25
Izad 2010 [178]
100 РРС
(Иран)
98 (Иран)
26
Akcali 2010 [179]
27
0.11
1.00
вкл
нет
нет
вкл
На рисунке 9 изображена блок-схема включения исследований в метаанализ.
Шесть исследований были исключены из-за отсутствия достаточного
количества данных [164,165,167,171,180,181]. Еще три исследования были
исключены
по
причине
несоответствия
распределения
генотипов
в
контрольной группе распределению Харди-Вайнберга: Fernandes-Filho, 2002
(P=0.02) [166]; Luomala, 2003 (P=1.91x10-23) [169]; Sarial, 2008 (P=0.05) [177].
Исследование на турецкой популяции было исключено по причине
несоответствия приведенных в публикации данных о распределении
генотипов ожидаемым частотам встречаемости аллелей, а именно частоты
аллелей разительно отличались от других популяций (GG=3, GA=15, AA=68
в группе РС и GG=2, GA=53, AA=95 в контрольной группе) [179]. Возможно,
у авторов были перепутаны аллели A и G. В итоге в мета-анализ были
включены результаты 16 предыдущих исследований и результаты нашего
исследования (Таблица 8, Рисунок 10).
66
28 независимых исследования
3 мета-анализа
-6 исследований. Недостаточное
количество данных
22 независимых исследований
-3 исследования. Несоответствие
распределению Харди-Вайнберга
19 независимых исследований
-1 исследование. Ошибка в статье
18 независимых исследований
-2 исследования. Размер группы
сравнения <10 человек.
16 независимых исследований
+1 исследование. Результаты
нашего исследования
17 независимых исследований
Рисунок 9 - Блок-схема включения исследований в мета-анализ
Ассоциация между rs1800629 (TNFa -308G->A) и РС. Суммарно 4036
пациентов, страдающих РС, и 3879 здоровых волонтера были включены в
мета-анализ (Таблица 8). Согласно результатам мета-анализа G аллель не
ассоциирован с РС: объединенное OR=1.13 (95%C.I.: 0.95–1.34), P=0.18.
Однако гетерогенность между исследованиями была статистически значимой
(P=0.02) (Рисунок 10).
67
Таблица 8. Мета-анализ ассоциации между аллелем rs1800629[G] и РС
Исследование
He 1995[146]
Braun 1996 [156]
Huizinga 1997[157]
Wingerchuck 1997[158]
Weinshenker 1997[159]
Mycko 1998[160]
Fernandez-Arquero 1999[161]
Maurer 1999 [162]
Drulovic 2003 [168]
Duvefelt 2004 [170]
Mihailova 2005[172]
Forte 2006[174]
Ristic 2007[176]
Наше исследование
Кавказоиды (всего = 14 исследований) Heterogeneity p =
0.11
Dong 2006[173]
Монголоиды (всего = 1 исследование) Heterogeneity p =
1.00
Kamali-Sarvestani 2007[175]
Izad 2010[178]
Ираниды (всего = 2 исследования) Heterogeneity p =
0.19
Суммарно (всего = 17 исследований) Heterogeneity p =
0.02
РС
93
50
155
110
78
53
238
238
143
238
55
91
338
1720
3600
Контроль
95
22
186
110
39
81
324
72
123
324
86
220
460
1095
3237
OR [95%CI]
1.67 [0.93-3.01]
0.51 [0.21-1.28]
1.17 [0.79-1.74]
1.27 [0.76-2.12]
0.48 [0.19-1.23]
0.58 [0.26-1.26]
1.04 [0.73-1.48]
0.89 [0.61-1.32]
1.86 [1.03-3.35]
1.11 [0.74-1.67]
0.65 [0.35-1.22]
0.82 [0.50-1.34]
1.31 [0.96-1.79]
1.16 [0.99-1.39]
1.10 [1.00-1.20]
p
0.09
0.27
0.42
0.36
0.27
0.17
0.82
0.38
0.04
0.40
0.18
0.42
0.09
0.06
0.05
68
68
106
106
0.48 [0.25-0.94]
0.48 [0.25-0.94]
0.03
0.03
270
98
368
439
97
536
1.25 [0.79-1.96]
2.18 [1.10-4.33]
1.48 [1.00-2.17]
0.34
0.03
0.05
4036
3879
1.07 [0.93-1.24]
0.32
Рисунок 10 - «Лесной» график результатов мета-анализа нашего
исследования с ранее опубликованными с учетом деления на три группы:
кавказоиды, монголоиды и ираниды
68
По причине значимой гетерогенности между исследованиями мы
разбили исследования на три группы в соответствии с этнической
принадлежностью участников: кавказоиды [146,156–161,168,172,174,176],
монголоиды [173] и ираниды [175,178]. Затем мы провели мета-анализ для
каждой группы в отдельности. Внутри каждой из групп тест на
гетерогенность не выявил статистически значимых различий (кавказоиды,
P=0.11; монголоиды, P=1.00; ираниды, P=0.19). Согласно результатам метаанализа в подгруппах ассоциация SNP -308G->A с развитием РС достигла
порога статистической значимости, но если для кавказоидов (ORG=1.10,
95%C.I.: 1.00-1.20, P=0.05) и иранидов (ORG=1.48, 95% C.I.: 1.00-2.17, P =
0.04) G аллель предрасполагал к развитию РС, то для монголоидов
(ORG=0.48, 95% C.I.: 0.25-0.94, P=0.03) G аллель являлся протективным
фактором.
Рисунок 11 - «Лесной» график результатов мета-анализа нашего
исследования с ранее опубликованными с учетом деления на две группы:
кавказоиды+ираниды и монголоиды.
69
Учитывая одинаковый тренд для групп кавказоидов и иранидов, мы
объединили 16 исследований этих двух групп в одну и провели третий метаанализ. Объединенное ORG=1.11, 95% C.I.: 0.97-1.26, с уровнем значимости
P=0.12 (Рисунок 11).
Примечательно, что исходно величина ORG для иранидов существенно
выше, чем для кавказоидов (1.48 против 1.10). Причиной этому может быть
то, что действие внешнего фактора, который запускает развитие патологии
РС, через молекулярное звено, маркируемое SNP -308G>A, более сильно
выражено у иранидов, чем у кавказоидов. Однако в рамках этой гипотезы
нельзя объяснить, почему у монголоидов аллель G является протективным
фактором. Можно предположить, что результат, полученный в группе
монголоидов случайный ввиду небольшого размера групп сравнения (68
пациентов против 106 здоровых лиц). Эта гипотеза сама по себе правомочна,
но если посмотреть на «лесной» график, легко увидеть, что похожий
результат был получен и для шести исследований кавказоидов, и более того у
графика нет общего тренда в ту или иную сторону от оси OR=1.
В
основе
ассоциативных
функционального/причинного
исследований
полиморфного
локуса
лежит
поиск
посредством
определения генотипов маркерных локусов. Чем сильнее сцеплен маркерный
локус с функциональным, тем ближе оценка OR для маркерного локуса будет
приближаться к истинной величине OR для причинного локуса. На «лесном»
графике мета-анализа для такого маркера будет хорошо прослеживаться
тренд относительно оси OR=1 в ту или иную сторону. В качестве примера
приводим результаты мета-анализа выполненного нами для SNP rs5219 гена
KCNJ11 c целью выявления ассоциации с сахарным диабетом 2 типа
(Рисунок 1) [213]. На «лесном» графике хорошо виден тренд OR>1, величина
самого OR варьирует в некотором диапазоне в силу случайных событий и
различий между исследованиями, как то национальность, критерии отбора и
прочее.
70
Для «лесного» графика мета-анализа ассоциации SNP -308G>A гена
TNFa с РС выраженного тренда нет. Возможны две причины. Первая – малый
размер групп сравнения входящих в мета-анализ исследований и как
следствие малая статистическая мощность, что привело к широкому разбросу
оценки ORG. Даже с учетом мета-анализа для группы «кавказоиды и
ираниды» и размером групп сравнения 3968 пациента против 3773 контролей
мощность исследования составила всего 22%. Необходимый размер групп
для выявления ассоциации, равно как и подтверждения ее отсутствия,
составляет ориентировочно 19000 контролей и 19000 пациентов с РС.
Исходя из того, что ассоциативные исследования базируются на
неравновесии по сцеплению, то второй причиной этому может быть – слабое
неравновесие по сцеплению с функциональным маркером (Рисунок 12).
Предположим, что изначально функциональная замена возникла на
хромосоме, несущей по второму, маркерному локусу, аллель G. Тогда, все
носители аллеля G маркерного локуса будут обладать функциональной
заменой и, следовательно, будут предрасположены к заболеванию. Если
проводить ассоциативное исследование с помощью маркерного локуса, то
OR будет однонаправлено относительно OR=1 и варьирование величины
будет обусловлено статистическими причинами, а также различиями во
внешних факторах, влияющих на участников разных исследований.
маркер
G
A
G
A
G
A
кроссинговер
Функциональная
замена
Рисунок 12 - Кроссинговер как причина снижения неравновесия по
сцеплению между двумя полиморфными локусами
Если
между
функциональной
заменой
и
маркером
произойдет
кроссинговер, то предрасположены к развитию заболевания будут уже
G
71
носители аллеля A. Имея в популяции уже 4 типа хромосом и проводя
ассоциативное исследование, мы будем получать «заниженную» оценку OR,
причем степень занижения будет зависеть от доли носителей варианта
хромосомы «аллель A – мутация». При определенном соотношении в
исследовании может быть даже получена ассоциация аллеля А маркерного
локуса с заболеванием.
Таким образом, можно предположить, что, не смотря на изначальную
гипотезу о том, что функциональный полиморфный локус находится в
промоторном районе гена TNFa, и ряд исследований указывал на замену 308G>A, данная замена не является функциональной, но является маркерной
для другой замены, находящейся с ней в неравновесии по сцеплению. Тогда в
тех
популяционных
подгруппах,
где
функциональный
маркер
преимущественно расположен на хромосоме, несущей G аллель, будет
выявлена ассоциация G аллеля с РС, например Izad [178], а там где
функциональный маркер преимущественно расположен на хромосоме,
несущей A аллель – ассоцияция А аллеля, например Dong [173]. С точки
зрения статистических закономерностей такой результат является следствием
случайного,
«удачного»,
формирования
подгрупп
сравнения.
При
формировании групп большего размера, последствия кроссинговера между
функциональной и маркерной заменой становятся значимыми, OR стремится
к 1.00, а уровень значимости не достигает пороговых значений.
Ген TNFa расположен на 6 хромосоме человека в области главного
комплекса гистосовместимости. Главный комплекс гистосовместимости
(MHC) так же именуемый как человеческий лейкоцитарный антиген (HLA)–
группа генов, протяженностью 3,6 Mb, которая включает в себя три класса
генов, исторически названные класс I (центромерный), II (теломерный) и III
(Рисунок 13) [214]. Различия этих трех классов генов касаются как структур,
так и функций кодируемых ими белков. Антиген-представляющие молекулы,
кодируемые HLA, относятся к генам классов I и II. Класс III генов кодирует
различные молекулы, как связанные, так и не связанные с иммунной
72
системой, большинство из которых - это гены цитокинов, в том числе и ген
фактора некроза опухоли (TNFa), и компонентов системы комплемента [215].
Рисунок 13 - Схема расположения генов системы HLA на 6 хромосоме.
Рисунок заимствован из статьи Simmonds MJ и Gough SC [216]
Отличительной чертой MHC является сильное неравновесие по
сцеплению между аллелями генов. Исследование, ориентированное оценить
блоки неравновесия по сцеплению выявило, что в МНС регионе самые
протяженные блоки неравновесного сцепления по сравнению с остальными
частями генома. Средняя длина блока равняется 31.1 kb [217]. MHC регион
содержит HLA-DRB1 ген, DRB1*1501 аллель которого был определен как
аллель риска развития РС, и, возможно, ассоциация -308G>A локуса гена
TNFa является наведенной именно этим аллелем.
Идея о наведенной ассоциации справедлива и для других генов,
расположенных в MHC регионе. Так в 2006 году Traherne с соавт. на 928
семьях, в которых есть пациенты с РС, с помощью условного регрессионного
анализа показали, что ассоциация аллельного варианта rs2076530 гена BTNL2
является вторичной по отношению к DRB1*15 алеллю. Ген BTNL2 у человека
расположен в МНС регионе и находится в сильном неравновесии по
73
сцеплению с аллелем DRB1*1501 (D’=0.81). Среди 1012 человек, не
состоящих
в
родственных
связях,
25.3%
были
носителями
аллеля
DRB1*1501, из них 98.8% несли аллель BTNL2-1, в то время как только 1.2%
несли аллель BTNL2-2 [218].
Касательно TNFa, в 1994 году Roth с соавт. исследовали независимость
ассоциации микросателитов в гене TNFa по отношению к HLA-DRB1*1501DQA1*0102-DQB1*0602 гаплотипу. Исследование было проведено на 40
пациентах с РС и их родителях, и ни для одного из полиморфных локусов
гена TNFa не было выявлено ассоциации с РС, которую нельзя было бы
объяснить
в
терминах
ассоциации
с
гаплотипом
HLA-DRB1*1501-
DQA1*0102-DQB1*0602 [219]. Данное исследование включало небольшие
группы сравнения и анализировались другие полиморфные локусы, поэтому
нам
представляется
целесообразным
проанализировать,
является
ли
ассоциация локуса -308G>A наведенной аллелем DRB1*1501.
2.2.3 Ассоциация между HLA-DRB1 и РС у жителей РФ
Для выявления является ли ассоциация -308G>A наведенной от локуса
HLA-DRB1, мы провели репликативное исследование ассоциации с РС
аллелей гена HLA-DRB1. Нами были определены генотипы HLA-DRB1 у 408
жителей СФО (99 РС и 309 контрольных лиц) и 627 жителей ЦФО (507 РС и
120 контрольных лиц). Частоты аллелей для каждого федерального округа
представлены в таблице 9. Далее для выявления наличия ассоциации между
аллелями локуса HLA-DRB1 и РС нами был выполнен ассоциативный анализ
для аддитивной модели методом логистического регрессионного анализа с
поправкой на пол и возраст для каждого федерального округа в отдельности.
Раздельный анализ проводился по причине различных частот встречаемости
аллелей в разных федеральных округах. Для корректного определения
отношения шансов для каждого аллеля в целом по этим двум округам РФ
нами был выполнен мета-анализ с фиксированными эффектами.
В СФО в группе РС наиболее распространен аллель HLA-DRB1*15
(29.3%). Частота HLA-DRB1*15 аллеля статистически значимо выше в
74
группе РС, чем в контрольной (29.3% против 15.2%, OR=2.34 (95%C.I.=1.553.53), P=5x10-5). Частота аллеля HLA-DRB1*01, напротив, была выше в
контрольной группе (6.1% против 14.1%, OR=0.36 (95%C.I.=0.19-0.71),
P=0.003). Частоты остальных аллелей в СФО статистически значимо не
отличались.
Таблица 9. Частоты аллелей HLA-DRB1 и ассоциативный тест с РС
OR для DRB1*12 не может быть оценено для СФО из-за отсутствия такового в группе РС.
Значимая после поправки Бонферони ассоциация выделена жирным шрифтом.
Сибирский
Федеральный
округ
DRB1 аллель
(РС=99, контроль=309)
Центральный федеральный округ
Объединенное
(РС=507, контроль=120)
значение
(РС=606,
контроль=429)
част.
ассоциативный тест
аллеля, %
част.
ассоциативный тест
ассоциативный тест
аллеля, %
РС
К
OR, 95%CI, p
РС
К
OR, 95%CI, p
OR, 95%CI, p
*01
6.1
14.1
0.36 [0.19-0.71], 0.003
8.7
12.5
0.68[0.44-1.04], 0.08
0.56 [0.39-0.81], 0.002
*03
9.6
6.9
1.50 [0.84-2.66], 0.17
11.2
10.0
1.13 [0.72-1.78], 0.59
1.26 [0.88-1.80], 0.20
*04
9.1
5.5
1.70 [0.89-3.28], 0.11
9.7
11.7
0.82 [0.53-1.26], 0.37
1.02 [0.71-1.47], 0.90
*07
9.1
14.1
0.61[0.35-1.06], 0.08
11.3
11.3
1.01 [0.66-1.53], 0.97
0.84 [0.60-1.17], 0.30
*08
5.0
4.4
1.00 [0.69-1.46], 0.99
4.6
2.5
1.94 [0.81-4.65], 0.14
1.32 [0.75-2.33], 0.33
*09
-
-
-
0.3
0.8
0.35 [0.06-2.13], 0.26
0.35 [0.06-2.13], 0.26
*10
-
-
-
1.0
1.3
0.78 [0.21-2.90], 0.72
0.78 [0.21-2.90], 0.72
*11
11.1
16.3
0.71 [0.54-0.93], 0.20
9.5
10.4
0.91 [0.58-1.41], 0.67
0.82 [0.58-1.15], 0.25
*12
0
1.9
NA [-Inf; +Inf], 0.98
2.0
2.9
0.68 [0.29-1.60], 0.38
0.68 [0.29-1.60], 0.38
*13
16.7
13.6
1.17 [0.74-1.84], 0.51
13.2
13.3
0.99 [0.65-1.50], 0.96
1.07 [0.78-1.45], 0.69
*14
0.5
2.1
0.21 [0.03-1.65], 0.14
0.6
1.6
0.35 [0.10-1.25], 0.11
0.30 [0.10-0.90], 0.03
*15
29.3
15.2
2.34 [1.55-3.53], 5x10-5
25.2
17.5
1.65 [1.13-2.40], 0.009
1.93 [1.47-2.55], 3x10-6
*16
3.5
5.9
0.70 [0.29-1.67], 0.42
2.7
4.2
0.62 [0.29-1.32], 0.21
0.65 [0.37-1.15], 0.14
В ЦФО так же наиболее представленным в группе РС был HLADRB1*15 аллель (25.2%). Единственное статистически значимое различие в
частотах аллелей между группами РС и контрольной было выявлено для
HLA-DRB1*15 (25.2% против 17.5%, OR=1.65 (95%C.I.=1.13-2.40), P=0.009).
По результатам мета-анализа в целом по этим двум округам РФ
ассоциированы с РС оказались три аллеля: *01, *14 и *15. Однако если HLADRB1*15 аллель определен как фактор риска развития РС (OR=1.93
(95%C.I.= 1.47-2.55), P=3x10-6, то *01 и *14 были определены как
75
протективные факторы (OR=0.56 (95%C.I.=0.39-0.81), P=0.002 и OR=0.30
(95%C.I.= 0.10-0.90), P =0.03, соответственно).
Мы
также
выполнили
анализ
эффекта
относительной
предрасположенности (RPE) носителей аллелей HLA-DRB1 к РС (Таблицы
10 и 11). Идея анализа заключалась в том, что у мультиаллельного локуса,
каковым является HLA-DRB1, ассоциированы с заболеванием могут быть
ряд аллелей, однако более «сильные» аллели могут маскировать более
«слабую» связь остальных аллелей при вычислении OR методом Woolf [220].
Анализ
эффекта
относительной
предрасположенности
предложенный
Thomson [221] позволяет выявлять более слабую связь остальных аллелей.
Таблица 10. Эффект относительной предрасположенности носителей HLADRB1 аллелей к РС у жителей Сибирского федерального округа.
Раунд 2 сравнения:
DRB1*15 убран
ожидаем
χ2
P
ое
23.24
5.44
Раунд 1 сравнения
DRB1
DRB1*01
наблю
даемое
12
ожидаем
ое
27.86
9.03
DRB1*03
19
13.78
1.98
11.49
4.91
DRB1*04
18
10.89
4.64
9.08
8.75
DRB1*07
18
27.88
3.50
23.24
DRB1*08
10
8.63
0.22
DRB1*11
21
32.35
DRB1*12
0
DRB1*13
DRB1*14
χ2
P
Раунд 3 сравнения:
DRB1*04 убран
ожидае
χ2
P
мое
21.66
4.31
10.71
6.43
-
-
1.18
21.66
0.62
7.21
1.08
6.72
1.60
3.98
26.98
1.33
25.15
0.68
3.84
3.84
3.21
3.21
2.99
2.99
33
26.91
1.38
22.44
4.97
20.91
6.98
1
4.16
2.40
3.47
1.76
3.24
1.55
-
-
-
-
9.89
0.84
9.21
0.53
140
33.46
122
25.68
DRB1*15
58
30.12
25.82
DRB1*16
7
11.86
1.99
Всего
198
198
58.78
4x10
-7
6x10-9
0.003
7x10-9
0,01
0,001
Анализ выполняли для каждого из федеральных округов по отдельности,
порог
уровня
значимости
вводили
с
учетом
поправки
Бонферони
(P=0.05/11=0.005). Как и предыдущим методом метод RPE в качестве самого
сильного фактора риска РС для жителей СФО выявил НLA-DRB1*15 аллель
(наблюдаемое=58, ожидаемое=30.12; P=4x10-7). После удаления HLADRB1*15 аллеля во втором раунде сравнения была зарегистрирована
повышенная частота HLA-DRB1*04 аллеля в группе РС (наблюдаемое=18,
ожидаемое=9.08; P=0.003). После удаления HLA-DRB1*04 статистически
76
значимых результатов с учетом поправки Бонферони не было получено ни
для одного из оставшихся аллелей.
Для жителей ЦФО методом RPE самая сильная ассоциация с РС была
выявлена для HLA-DRB1*15 аллеля, как и для СФО (наблюдаемое=256,
ожидаемое=177.45; P=4x10-9). Во втором раунде сравнения была выявлена
повышенная
частота аллеля
среди пациентов с РС
HLA-DRB1*08
(наблюдаемое=47, ожидаемое=22.97; P=4x10-9)
Таблица 11. Эффект относительной предрасположенности носителей HLADRB1 аллелей к РС у жителей Центрального федерального округа.
Раунд 2 сравнения:
DRB1*15 убран
Exp.
χ2
p
Раунд 1 сравнения
DRB1
Раунд 3 сравнения:
DRB1*08убран
Exp.
χ2
p
Obs.
Exp.
χ2
DRB1*01
88
126.75
11.85
114.85
6.28
111.09
4.80
DRB1*03
114
101.4
1.57
91.88
5.33
88.88
7.10
DRB1*04
98
118.64
3.59
107.19
0.79
103.69
0.31
DRB1*07
115
114.58
0.01
103.36
1.31
99.98
2.26
-
-
p
DRB1*08
47
25.35
18.49
22.97
25.14
DRB1*09
3
8.11
3.22
7.66
2.83
7.41
2.62
DRB1*10
10
13.18
0.77
11.48
0.19
11.11
0.11
DRB1*11
96
105.46
0.85
95.71
0.00
92.58
0.13
DRB1*12
20
29.41
3.01
26.80
1.72
25.92
1.35
DRB1*13
134
134.86
0.01
122.51
1.08
118.5
2.03
DRB1*14
6
16.22
6.44
15.31
5.66
14.8
5.24
-
-
-
-
38.28
3.33
37.03
2.72
711
28.67
DRB1*15
256
177.45
34.78
DRB1*16
27
42.59
5.71
Всего
1014
1014
90.26
4x10
2x10
-9
-21
758
86.46
5x10-
7
1x10
-20
0.01
1x10-8
Таким образом, HLA-DRB1*15 у жителей СФО и ЦФО является
фактором риска РС, статистическая значимость этого подтверждена двумя
методами: логистический регрессионный анализ и RPE. В СФО HLADRB1*01 и HLA-DRB1*04 были определены как протективные факторы
развития РС. Ранее в крупном мета-анализе [134], включающем исследования
с участием кавказоидов, опубликованных до декабря 2010 года, и суммарным
количеством пациентов с РС равным 5464, а контрольных лиц – 7809, был
показан
протективный
эффект
HLA-DRB1*01
аллеля
(OR=0.69,
95%C.I.=0.60-0.79, P=0.00001). Стоит отметить, что уровень гетерогенности
между исследованиями был почти пограничным (P=0.08, I2=40), вероятно
77
отражая то, что не во всех исследованиях была выявлена эта закономерность.
Аллель HLA-DRB1*04 не был значимо ассоциирован с РС после поправки на
сравнение большого количества аллелей (OR=0.82, 95%C.I.=0.70-0.95,
P=0.01), а уровень гетерогенности превышал пороговое значение (P <0.0001,
I2=70). И хотя методом RPE данный аллель был определен как в нашем
исследовании,
так
и
в
мета-аналитическом
исследовании,
как
ассоциированный с РС, его нельзя считать хорошим предиктором.
В ЦФО помимо HLA-DRB1*15 был выявлен HLA-DRB1*08 в качестве
фактора риска развития РС методом RPE. Хотя HLA-DRB1*08 в метаанализе [134] не был ассоциирован с РС (OR=0.99, 95%C.I.=0.86-1.15,
P=0.91), в исследовании Barcellos с соавт. этот аллель в присутствии аллеля
HLA-DRB1*15 (генотип HLA-DRB1*15/08) был значимо ассоциирован с РС
(OR=1.9, 95%C.I.=1.1-3.1, P=0.02) [137]. Аналогичный тренд был выявлен в
исследовании на канадцах [222]. С помощью метода неравновесной передачи
аллелей было показано, что наследование аллеля HLA-DRB1*08 у пациентов
с РС значительно выше при одновременном носительстве HLA-DRB1*15.
Barcellos с соавт. предположили, что аллель HLA-DRB1*08 выступает в
качестве фактора риска только в синергизме с HLA-DRB1*15, путем
расширения
абберантного
иммунного
ответа за счет представления
минорных эпитопов основного белка миелина [223]. Стоит отметить, что в
группе пациентов РС ЦФО носителей HLA-DRB1*08 из 47 человек число
носителей генотипа HLA-DRB1*15/08 составило 17 и было максимальным
среди
остальных
вариантов
генотипов:
HLA-DRB1*08/1=5,
HLA-
DRB1*08/3=4, HLA-DRB1*08/4=4, HLA-DRB1*08/7=5, HLA-DRB1*08/10=1,
HLA-DRB1*08/11=2,
HLA-DRB1*08/12=1,
HLA-DRB1*08/13=6,
HLA-
DRB1*08/16=2.
2.2.4 Неравновесие по сцеплению между rs1800629 (TNFa -308G->A) и HLA-DRB1
Результаты ассоциативного анализа подтверждают связь HLA-DRB1*15
с развитием РС у жителей РФ. Для проверки гипотезы о том, что ассоциация
-308G>A гена TNFa у жителей СФО может быть наведенной от HLA-
78
DRB1*15, мы оценили неравновесие по сцеплению между аллелями локусов
HLA-DRB1 и TNFa (Таблица 12).
Таблица 12. Неравновесие по сцеплению между rs1800629 (TNFa -308G->A)
и HLA-DRB1
DRB1
Сибирский федеральный округ
Центральный федеральный округ
аллель
rs1800629 (TNFa)
rs1800629 (TNFa)
*01
[A]
[G]
D’a
p
[A]
[G]
D’a
0.004
0.117
0.63
0.72
0.005
0.089
0.60
p
0.71
2
*03
0.026
0.047
-0.27
0.28
0.070
0.041
-0.58 (r =0.31)
0.003
*04
0.007
0.056
-0.02
0.95
0.004
0.095
0.68
0.66
*07
0.006
0.123
0.53
0.76
0.003
0.111
0.78
0.59
*08
0.007
0.038
-0.07
0.84
0.005
0.038
0.11
0.97
*09
0
0.001
1.00
0.96
0
0.004
1.00
0.90
*10
-
-
-
-
0
0.009
1.00
0.85
*11
0.021
0.13
-0.06
0.82
0.008
0.090
0.32
0.84
*12
0
0.015
1.00
0.86
0.003
0.019
-0.01
0.99
*13
0.017
0.127
-0.02
0.92
0.005
0.125
0.70
0.60
*14
10-5
0.017
0.99
0.84
0.001
0.008
0.45
0.94
*15
0.002
0.184
0.81(r2=0.02)
0.0002
0.011
0.228
0.41 (r2=0.007)
0.003
*16
0.009
0.045
-0.07
0.81
0.006
0.024
-0.09
0.81
Для
СФО
нами
было
выявлено
статистически
более
частым
носительство гаплотипа HLA-DRB1*15-rs1800629[G] по сравнению с HLADRB1*15-rs1800629[A] (0.184 против 0.002, P=0.0002). Однако показатели,
характеризующие неравновесие по сцеплению между двумя этими аллелями
рознятся: D’=0.81, что соответствует сильному неравновесию по сцеплению,
а r2=0.02, что говорит о его отсутствии. В рассматриваемом нами случае
частоты аллелей в контрольных группах сильно различаются (HLADRB1*15=0.152 и rs1800629[G]=0.88 для СФО), что не позволяет величине r2
достигать значений, интерпретируемых как неравновесное сцепление двух
локусов. Ориентируясь на параметр D’ можно заключить, что в СФО аллели
HLA-DRB1*15-rs1800629[G] находятся в неравновесии по сцеплению, в то
время как в ЦФО – нет (D’=0.41).
В то же время в ЦФО в неравновесии по сцеплению, хотя и не сильном,
находятся аллели HLA-DRB1*03-rs1800629[A] (D’=0.58, r2=0.31). В нашем
79
исследовании мы не выявили ассоциации HLA-DRB1*03 аллеля с РС, хотя
по литературным данным он является аллелем риска. Можно предположить,
что в субпопуляциях, где аллель HLA-DRB1*03 показывает ассоциацию с РС
и находится в сильном неравновесии по сцеплению с аллелем rs1800629[A],
можно наблюдать наведенную ассоциацию с РС аллеля rs1800629[A]. Сила
ассоциации с РС аллеля rs1800629[A] будет зависеть еще и от того, с каким
аллелем будет сцеплен в данной субпопуляции HLA-DRB1*15. Если HLADRB1*15 и *03 будут сцеплены с одним аллелем, например rs1800629[A], то
исследователи могут получить положительную ассоциацию с РС для данного
аллеля rs1800629. Если HLA-DRB1*15 и *03 будут сцеплены с разными
аллелями rs1800629, то наведенная ассоциация будет разнонаправленной, и
полиморфный локус rs1800629 по результатам исследования не будет
ассоциирован с РС. Это может быть причиной отсутствия ассоциации
rs1800629 с РС в ЦФО.
Дополнительным аргументом в пользу того, что ассоциация c РС
полиморфного локуса -308G>A гена TNFa у жителей СФО может быть
наведенной от HLA-DRB1*15 могут быть следующие рассуждения. Сила
наведенной ассоциации должна быть пропорциональна коэффициенту
корреляции неравновесия по сцеплению r2 [224]. В СФО HLA-DRB1*15
ассоциирован с РС с уровнем значимости 5x10-5 (χ2=16.45). Мы вычислили,
какая «доля» из полученной ассоциации приходится на каждого участника
групп сравнения. Так как группы сравнения, РС и контрольная, разного
объема, то эффективный размер выборки мы вычисляли по формуле 1:
Neff=
4
,
1
1
+
case control
(1)
где case – размер группы РС, а control – контрольной группы. Для СФО
Neff=
4
=299.91. «Долю» из полученной ассоциации вычисляли по
1
1
+
99 309
формуле 2:
2
∆𝜒15
=
χ215
Neff
,
(2)
80
Таким образом, Δχ215=
16.45
=0.0548. Аналогичным образом вычисляли
299.91
Δχ2TNFa.
Neff=
Δχ2TNFa 0.0044
Δχ215
=
0.0548
4
=2019.46,
1
1
+
1113 924
χ2=8.81,
Δχ2TNFa=0.0044.
Отношение
=0.08. Полученная величина 0.08 одного порядка с величиной
r2=0.02 между HLA-DRB1*15 и rs1800629[G] для СФО. Таким образом, это
согласуется
Δχ2TNFa 0.0044
Δχ215
=
0.0548
с
предположением,
=0.08,
что
пропорциональна
сила
наведенной
коэффициенту
ассоциации,
корреляции
неравновесия по сцеплению r2=0.02 [224].
2.2.5 Использование полиморфного локуса rs3135388 в качестве маркерного для
ассоциативного анализа РС и HLA-DRB1*15
В 2006 году в качестве маркерного локуса для определения HLADRB1*15 аллеля был предложен SNP rs3135388 (r2=0.97) [225]. Определение
генотипа SNP rs3135388 - менее дорогостоящая и значительно более быстрая
методика по сравнению с прямым определением наличия HLA-DRB1*15
аллеля. Позднее данный метод был опробован на предмет исследования
ассоциации HLA-DRB1*15 аллеля с рассеянным склерозом [226]. И по сей
день, данный метод активно используется исследователями разных стран для
установления ассоциации HLA-DRB1*15 с изучаемым параметром, не только
с РС [227–230].
Нами было проведено определение генотипов SNP rs3135388 методом
Real-time PCR у пациентов с определенным ранее в ходе исследования
генотипом HLA-DRB1. Мы определили частоты встречаемости гаплотипов
rs3135388-HLA-DRB1 и оценили неравновесие по сцеплению между
rs3135388 и HLA-DRB1 (Таблица 13).
Нами было выявлено неравновесие по сцеплению между HLA-DRB1*15
аллелем и rs3135388[T] аллелем как для СФО (D’=0.74, r2=0.46, P=10-42), так
и для ЦФО (D’=0.82, r2=0.57, P=10-42). Также нами было выявлено
неравновесие по сцеплению между HLA-DRB1*03 аллелем и rs3135388[С]
аллелем (D’=0.77, r2=0.02, P =0.006). Однако для того, чтобы полиморфный
81
локус можно было использовать в качестве маркерного локуса, необходимым
условием является не только высокий показатель неравновесия по сцеплению
D’, но и высокий показатель r2. Оптимальным считается значение >0.80 для
обоих показателей. Таким образом, несмотря на неравновесие по сцеплению
между HLA-DRB1*03 аллелем и rs3135388[С] аллелем, полиморфный локус
rs3135388 не может быть использован в качестве маркерного. Для HLADRB1*15 нами получены высокие показатели неравновесия по сцеплению
как для D’, так и для r2. Нам не удалось выявить столь высоких значений
r2=0.97, как указано в литературе, вероятно в силу этнических различий
между
исследуемыми
популяциями.
Однако
rs3135388[T]
можно
использовать в качестве маркерного SNP для HLA-DRB1*15 аллелем с целью
уменьшения затрат на исследование.
Таблица 13. Неравновесие по сцеплению между rs3135388 и HLA-DRB1.
DRB1
аллель
*01
*03
*04
*07
*08
*09
*10
*11
*12
*13
*14
*15
*16
Сибирский федеральный округ
rs3135388[Т]
[C]
[T]
D’
p
0.12
0.005
-0.73
0.60
0.074
0
-1.00
0.58
0.064
0
-1.00
0.61
0.126
0.003
-0.86
0.52
0.045
10-6
-0.99
0.67
0.001
0
-1.00
0.95
0.142
0.009
-0.62
0.61
0.015
0
-1.00
0.81
0.132
0.011
-0.51
0.68
0.016
0.001
-0.56
0.88
0.060
0.128
0.74 (r2=0.46)
10-42
0.050
0.004
-0.54
0.80
Центральный федеральный округ
rs3135388[T]
[C]
[T]
D’
p
0.090
0.001
-0.93
0.42
0.106
0.006
-0.77 (r2=0.02)
0.0006
0.098
0.002
-0.90
0.41
0.111
0
-1.00
0.33
0.041
0.002
-0.73
0.67
0.004
0
-1.00
0.86
0.011
0
-1.00
0.77
0.092
0.006
-0.73
0.51
0.022
0
-1.00
0.68
0.123
0.009
-0.69
0.46
0.008
0.001
-0.83
0.84
0.057
0.182
0.82 (r2=0.57)
10-76
0.023
0.005
-0.12
0.95
Мы дополнительно оценили ассоциацию SNP rs3135388 с развитием РС
у жителей разных федеральных округов РФ (Таблица 14). Нами была
выявлена
статистически
значимая
ассоциация
для
ЦФО
(OR=3.32,
95%C.I.=2.03-5.44, P=10-6) и СФО (OR=2.58, 95%C.I.=2.16-3.09, P=10-25).
Суммарно для всех пациентов с РС была установлена ассоциация: OR=2.58,
95%C.I.=2.20-3.03, P=10-31. Видно, что размер OR ассоциации HLA-DRB1*15
с РС, полученный с помощью типирования маркерного полиморфного локуса
близок к таковому при классическом типировании HLA-DRB1 гена с
помощью секвенирования.
82
Таблица 14. Ассоциация rs3135388 с развитием РС у жителей разных
федеральных округов РФ. Статистически значимые ассоциации выделены
курсивом.
Федеральный округ
ЦФО
СФО
ДВФО
Всего
РС
C/C
292
632
70
994
C/T
194
378
21
593
T/T
23
77
4
104
Контроль
C/C C/T
94
18
734 168
52
8
880 194
T/T
1
14
2
17
OR (95% CI) P
3.32 [2.03-5.44] P=10-6
2.58 [2.16-3.09] P=10-25
1.56 [0.80-3.03] P=0.19
2.58 [2.20-3.03] P=2 x 10-31
Более того, для СФО имея данные о распределении генотипов SNP
rs1800629 (-308G>A, TNFa) и rs3135388 (маркерный полиморфный локус
HLA-DRB1*15) можно с помощью теста отношения правдоподобия
(likelihood ratio test, LRT) определить, какой из двух данных полиморфных
локусов сильнее ассоциирован с РС. Для этого мы сравнивали три модели,
описывающих ассоциацию SNPs rs1800629 и rs3135388 с РС: общую, в
которой оценивается эффект генотипов обоих SNPs и две вложенных, в
каждой из которых оценивается эффект только одного SNP. Согласно LRT
вложенная модель, включающая только rs3135388, статистически значимо не
отличается от общей модели, включающей оба полиморфных локуса
rs3135388 и rs1800629 (P=0.19), в то время как вложенная модель,
включающая только rs1800629 значительно хуже общей модели (P=3x10-27).
Критерий Акаике (AIC) достиг наименьшего значения для вложенной
модели, включающей только rs3135388 (AIC=2854.4); для общей модели
AIC=2854.7 и для вложенной модели, включающей rs1800629, AIC=2969.4.
Таким образом, полиморфный локус rs3135388 является более хорошим
маркером ассоциации между РС и локусом rs3135388-rs1800629, чем локус
rs1800629. Другими словами, ассоциация локуса rs3135388-rs1800629 с РС
может быть объяснена только в терминах наличия локуса rs3135388. Беря во
внимание тот факт, что SNP rs3135388 является маркерным полиморфным
локусом HLA-DRB1*15, можно считать, что ассоциация локуса HLADRB1*15(rs3135388)-rs1800629 с РС в данном регионе генома может быть
объяснена в терминах присутствия аллеля HLA-DRB1*15.
83
Суммарно, нами не было получено убедительных данных того, что
ассоциация SNP -308G>A гена TNFa (rs1800629) может быть независимой от
локуса HLA-DRB1*15.
2.3 Роль полиморфных локусов гена CD40 в развитии рассеянного
склероза
С целью изучения наследственной предрасположенности к РС в 2009
году группой The Australia and New Zealand Multiple Sclerosis Genetics
Consortium
(Генетическим
консорциумом
по
рассеянному
склерозу
Австралии и Новой Зеландии) было проведено полногеномное исследование
ассоциаций (GWAS), по результатам которого была выявлена ассоциация
полиморфного локуса, лежащего выше гена CD40 на хромосоме 20q13
(rs6074022, P=1.3 10-7) [103]. Выявленная в ходе GWAS ассоциация [103]
косвенно подтверждает теорию об аутоиммунной природе РС, а данные на
модельных животных – о схожести молекулярных механизмов реализации
разных иммунных патологий. Выявление причинного полиморфного(-ых)
локуса(-ов) в гене CD40 позволит лучше понять механизм участия в развитии
аутоиммунных патологий. Для этого мы исследовали ассоциацию ряда
полиморфных локусов в гене CD40 с РС [231].
2.3.1 Ассоциация полиморфного локуса rs6074022 гена CD40 с рассеянным склерозом
Нами была реплицирована ассоциация с РС rs6074022 на выборке
жителей РФ. В группу пациентов с РС вошло 1679 человек (1121 женщин и
558 мужчин, средний возраст ± SD: 36.7±11.2 лет). В контрольную группу
были включены 879 человек, не имеющих неврологических и аутоиммунных
заболеваний (346 мужчин и 533 женщины, средний возраст ± SD: 33.0±12.0
лет). Частоты встречаемости генотипов соответствовали распределению
Харди-Вайнберга в обеих группах (Таблица 15). Аллель С SNP rs6074022
ассоциирован с РС (OR=1.27, 95%C.I.=[1.12-1.45] P=0.0003).
84
Таблица 15. Ассоциация rs6074022 гена CD40 с развитием РС
Генотип
T/T
T/C
C/C
HWE p-value
Частота аллеля риска C
Количество
контроль
РС
(всего = 879)
(всего = 1679)
517
865
307
671
55
143
0.30
0.43
0.24
0.28
OR (95%C.I.), P
1.27 [1.12-1.45]
P=0.0003
2.3.2 Мета-анализ ассоциации полиморфного локуса rs6074022 и развития РС
Ранее Nikolaos Patsopoulos и соавт. опубликовали в своей работе метаанализ ассоциации SNP rs6074022 [232]. Согласно полученным ими
результатам, которые приведены на рисунке 14, SNP rs6074022 ассоциирован
с РС (OR=1.15, 95%C.I.=1.07–1.25), однако уровень статистической
значимости (P=1.3x10-5) не достигает полногеномно значимого (P<10-7).
Рисунок 14 - Результаты мета-анализа, опубликованного в 2011 году в
журнале Annals of neurology (с модификациями по [232])
Мы также провели мета-анализ ассоциации SNP rs6074022 и развития
РС,
включающий
результаты
нашего
исследования
и
всех
ранее
опубликованных исследований: GenMSA (NL) [101], GenMSA (US) [101],
GenMSA (CH) [101], IMSGC (UK) [233], IMSGC (US) [233], BWH/TT [118], и
ANZgene [103]. В таблице 16 суммированы результаты всех предыдущих
исследований, которые были использованы нами для мета-анализа.
85
Таблица 16. Мета-анализ ассоциации между аллелем С SNP rs6074022 и РС.
Исследование: IMSGC (UK) – International Multiple Sclerosis Genetics Consortium United
Kingdom (Интернациональный генетический консорциум по рассеянному склерозу
Великобритании); IMSGC (US) – International Multiple Sclerosis Genetics Consortium United
States
(Интернациональный
генетический
консорциум
по
рассеянному
склерозу
Соединенных Штатов Америки); GenMSA (CH) – Switzerland, Basel (популяция,
собранная в городе Базель Швейцарии); GenMSA (NL) – The Netherlands, Amsterdam
(популяция, собранная в городе Амстердам Нидерландов); GenMSA (US) – United States,
San Francisco (популяция, собранная в городе Сан-Франциско Соединенных Штатов
Америки); ANZgene – Australia and New Zealand Multiple Sclerosis Genetics Consortium
(Генетический консорциум по рассеянному склерозу Австралии и Новой Зеландии);
BWH/TT – Brigham&Woman’s Hospital, Therapeutic Trials (участники терапевтического
исследования, проводимого на базе клиники «Brigham&Woman’s Hospital» г. Бостон
Соединенных Штатов Америки). Ж – женщина, M – мужчина.
Исследование
IMSGC (UK)
IMSGC (US)
GenMSA (CH)
GenMSA (NL)
GenMSA (US)
ANZgene
BWH/TT
Россия
Результат
мета-анализа
OR
1.32
1.16
1.17
0.90
1.26
1.20
1.06
1.27
1.16
95% C.I.
[1.12-1.55]
[0.96-1.42]
[0.87-1.58]
[0.66-1.22]
[1.01-1.56]
[1.12-1.28]
[0.97-1.17]
[1.12-1.45]
[1.12-1.23]
p-value
1 × 10-3
0.12
0.30
0.51
0.04
1.3 × 10-7
0.20
0.0003
2.2 × 10-12
РС*
449
341
251
225
477
1616
2186
1679
7224
Контроль*
2928
1679
208
228
425
1987
4689
879
Ж:М
3.0:1.0
3.2:1.0
2.8:1.0
2.9:1.0
3.1:1.0
2.6:1.0
2.6:1.0
2.0:1.5
13023
Согласно результатам мета-анализа, которые приведены в виде лесного
графика на рисунке 15, суммарный OR для всех исследований составил 1.17
(95%C.I.=1.10–1.23) с уровнем статистической значимости P=2.24×10-12. Тест
на гетерогенность не выявил значимых различий между исследованиями (χ2
(df=7)=12.16, P=0.10).
Существенно отметить, что полученные нами результаты подтверждают
ассоциацию маркерного локуса rs6074022 с развитием РС на полногеномном
уровне статистической значимости (P=2.24x10-12). Также очень важно, что во
всех исследованиях виден тренд того, что именно аллель С SNP rs6074022
является аллелем риска. Это также является показателем того, что
функциональный полиморфный локус находится в сильном неравновесии по
86
сцеплению с rs6074022 либо сам маркерный SNP rs6074022 и является
функциональным.
Рисунок 15 - Мета-анализ ассоциации между аллелем С SNP rs6074022 и РС
2.3.3 Картирование функционального полиморфного локуса в гене CD40
Выбор SNPs. На основании литературных данных нами были выбраны
еще три SNPs с целью картирования функционального полиморфного локуса,
отвечающего за ассоциацию с РС, и построения карты неравновесия по
сцеплению в районе гена CD40: rs1883832, rs1535045, rs11086996. Так как
rs6074022 расположен значительно выше старта транскрипции гена CD40, то
для подтверждения гипотезы о том, что rs6074022 маркирует связь CD40 с
РС необходимо было исследовать ассоциацию с РС полиморфных локусов
внутри гена. SNP rs1883832 C->T находится в положении -1 по отношению к
гену CD40.SNP rs1883832 ассоциирован с рядом заболеваний: лимфома
[234], не-Ходжскинская лимфома [235], остепороз [236], рассеянный склероз
[195], болезнь Крона [195], спорадический рак молочной железы [237],
синдром Бехчета [238], ревматоидный артрит [239]. Обращает на себя
внимание повышенный риск ряда аутоиммунных заболеваний, вследствие
чего данный SNP был включен в наш список. Два других SNPs выбирались
так, чтобы они лежали в разных блоках сцепления, определенных по
87
результатам проекта HapMap Project 3 в соответсвии с рисунком 16. В
качестве таковых были выбраны rs1535045 (интронная область гена) и
rs11086996 (ведет к замене Pro227Ala).
Рисунок 16 - Неравновесие по сцеплению между SNPs гена CD40.
Рисунок заимствован из программы HapMap Project (v.3). Неравновесие по сцеплению
оценено для выборок CEU и TSI. SNPs, выбранные для нашего исследования, выделены
красной рамкой.
Ассоциативное исследование. Мы определили генотипы SNPs
rs1883832, rs1535045, rs11086996 у 1679 пациентов с РС и 879 человек
контрольной группы (Таблица 17). Частоты встречаемости генотипов
соответствовали распределению Харди-Вайнберга для всех исследованных
SNPs в группе РС и контрольной.
88
Таблица 17. Частоты встречаемости генотипов и аллелей SNPs гена CD40
Pрхв
контроль
Pрхв
РС
Аллель риска
Частота аллеля риска
в контрольной группе
Частота аллеля риска
в группе РС
у жителей РФ.
0.48
0.50
T
0.22
0.26
0.64
0.11
T
0.26
0.25
0.64
0.63
G
0.02
0.01
rs1535045
rs11086996
РС
(всего = 1679)
rs1883832
контроль
(всего = 879)
SNP (rs)
Генотип
Количество
C/C
C/T
T/T
C/C
C/T
T/T
C/C
C/G
G/G
532
299
48
481
342
56
852
27
0
927
634
118
957
605
117
1640
39
0
Один SNP из трех, rs1883832, статистически значимо ассоциирован с
развитием РС (T аллель риска, OR=1.20, 95%C.I.=1.05-1.38, P=7×10-3).
Ассоциации двух других SNPs, rs1535045 и rs 11086998, с развитием РС не
выявлено (Таблица 18).
Таблица 18. Результаты логистического регрессионного анализа ассоциации
SNPs гена CD40 с развитием РС. Статистически значимые результаты выделены
курсивом.
SNP
Аллель риска
OR [95% CI] P
rs1883832
T
1.20 [1.05-1.38] P=0.007
rs1535045
T
0.96 [0.84-1.09] P=0.52
rs11086996
G
0.75 [0.46-1.23] P=0.26
Стратифицированный
анализ.
стратифицированный
анализ,
чтобы
Дополнительно
исключить
мы
провели
потенциальную
генетическую стратификацию внутри выборки. Стратифицированный анализ
проводили для четырех SNPs: rs1883832, rs1535045, rs11086996 и rs6074022.
В качестве страт были выбраны города; города Томск и Кемерово были
исключены из анализа, так как от этих городов в наше исследование были
включены только больные РС, контрольной группы не было. Суммарные OR,
89
их доверительные интервалы, уровни значимости приведены в таблице 19 в
соответствии с рисунком 17. Размер выборки после исключения городов
Томск и Кемерово составил 1303 пациента с РС и 879 человек в контрольной
группе.
Таблица 19. Результаты стратифицированного анализа ассоциаций между
РС и SNPs гена CD40. Статистически значимые результаты выделены, уровень
гетерогенности p-value оценен с помощью теста Кохрана (Q-test).
SNP
Аллель OR [95% CI] P
Уровень гетерогенности, P
rs6074022
C
1.14 [1.02-1.29]P=0.02
0.09
rs1883832
T
1.20 [1.06-1.36]P=0.004
0.83
rs1535045
T
0.94 [0.82-1.09] P=0.33
0.73
rs11086998
G
0.82 [NA], NA
0.50
Рисунок 17 - Стратифицированный анализ. А - rs6074022; Б - rs1883832; В –
rs1535045; Г – rs11086998.
Не смотря на то, что размер выборки РС уменьшился, в связи с
исключением страдающих РС из г. Кемерово и г. Томск, ассоциация SNPs
90
rs6074022 (P=0.02) и rs1883832 (P=4×10-3) с развитием РС сохранилась. Более
того, аллель риска сохраняется внутри каждой страты. Это дополнительно
свидетельствует о гомогенности выборки в целом и об отсутствии
стратификации внутри нее.
Анализ неравновесия по сцеплению между SNPs гена CD40. Нами
было оценено неравновесие по сцеплению между исследуемыми SNPs гена
CD40. Все исследованные SNPs находятся в неравновесии по сцеплению
(Рисунок 18).
Рисунок 18 - Неравновесие по сцеплению между исследуемыми SNPs гена
CD40.
Однако, если SNPs rs1883232, rs1535045 и rs11086996, находятся в
сильном неравновесии между собой, то сила неравновесия по сцеплению
SNP rs6074022 c остальными падает с увеличением расстояния между ним и
каждым из исследованных локусов (D’=0.81, D’=0.72, D’=0.49 для rs1883832,
rs1535045 и rs11086996, соответственно). Таким образом, из ассоциативного
анализа следует, что SNPs rs6074022 и rs1883832 ассоциированы с развитием
РС, в то время как rs1545045 и rs11086998 – нет. Более того, rs6074022 и
rs1883832 находятся друг с другом в сильном неравновесии по сцеплению.
Следовательно
оба
полиморфных
локуса
вероятнее
всего
являются
маркерами одного и того же функционального полиморфного локуса, в
случае если он один, или нескольких, если их два и более. Сцепленное
наследование приводит к тому, что все полиморфные локусы, лежащие в
91
одном блоке сцепления с «причинной» заменой при ассоциативном анализе
будут определены как факторы риска. С одной стороны, данный факт
затрудняет поиск функциональной замены, однако логично предположить,
что полиморфные локусы, находящиеся в большем неравновесии по
сцеплению с функциональным, будут ассоциированы с заболеванием с
большей силой.
Выявление наилучшего маркерного локуса гена CD40. Существует
математический подход, позволяющий выбрать какой из полиморфных
локусов, находящихся в одном блоке сцепления, лучше описывает связь с
заболеванием. Применительно к нашему случаю – необходимо понять, какой
SNP лучше описывает связь с развитием РС: rs1883832 или rs6074022. Для
этого с помощью теста отношения правдоподобия (Likelihood-ratio test, LRT)
необходимо сравнить три модели: общую (знание генотипов обоих SNPs,
rs1883832, rs6074022, необходимо для прогнозирования заболевания) и две
вложенных (знание генотипа лишь одного SNP необходимо).
Согласно результатам теста отношения правдоподобия частная модель 2
не отличается от общей модели (P=0.99), в то время как частная модель 1
значимо отличается от общей (P=0.01). Это означает, что если мы уберем из
модели зависимости развития РС от генотипов полиморфных локусов гена
CD40 SNP rs1883832 и оставим только rs6074022 – модель хуже не станет.
Таким образом, rs1883832 менее важный маркер, чем rs6074022.
Более того, информационный критерий Акаике позволяет выбрать
между двумя моделями, общая модель и вложенная модель (rs6074022),
наиболее лучшую. AIC для общей модели равен 3284.4, для вложенной
модели
(rs6074022)
AIC=3282.4.
Таким образом,
вложенная
модель
(rs6074022) из всех составленных моделей лучше всего описывает
зависимость развития РС от генотипов полиморфных локусов гена CD40.
Можно заключить, что ассоциация может быть описана в терминах
вовлеченности только rs6074022.
92
Это означает, что маркер rs6074022 находится в большем неравновесии
по сцеплению с «функциональным» полиморфным локусом или им является.
Ассоциация же rs1883832 c развитием РС является наведенной, она и слабее
по результатам ассоциативного анализа. Скорее всего, функциональный
полиморфный локус расположен в промоторе гена CD40 и находится в
большем неравновесии по сцеплению с rs6074022 большем, чем с rs1883832.
То есть он лежит либо выше rs6074022, либо между rs6074022 и rs1883832.
Анализ ассоциации с РС гаплотипов полиморфных локусов rs6074022
и rs1883832. Еще одним методом поиска функционального полиморфного
локуса является анализ ассоциации гаплотипов с заболеванием. Мы
выполнили анализ ассоциации гаплотипов SNPs rs6074022 и rs1883832.
Частоты гаплотипов, OR, его 95% доверительный интервал и уровень
статистической значимости приведены в таблице 20.
Таблица 20. Анализ ассоциации между РС и гаплотипами SNPs rs6074022 и
rs1883832.* - отмечены аллели риска для каждого SNP, согласно ассоциативному
анализу.
rs6074022
rs1883832
Частота в
группе РС
T
C*
T
C*
C
T*
T*
C
0.672391
0.216465
0.042618
0.068526
Два
гаплотипа
Частота
в
контрольной
группе
0.746405
0.208293
0.016394
0.028908
ассоциированы
Частота в
обеих
группах
0.698116
0.213949
0.033314
0.054620
с
РС:
OR [95% C.I.], эмпирическое P
референсный гаплотип
1.19 [1.03-1.38] P=0.02
2.68 [1.79-4.02] P=1.7x10-6
2.38 [1.76-3.22] P=1.8x10-8
rs6074022[C]-rs1883832[C]
(OR=2.38, 95%C.I.=1.76–3.22, эмпирическое P=1.8×10-8) и rs6074022[T]rs1883832[T]
Каждый
(OR=2.68,
гаплотип
идентифицированный
95%C.I.=1.79–4.02,
содержит
нами
один
при
эмпирическое
аллель
ассоциативном
P=1.7×10-6).
«риска»,
анализе
ранее
каждого
полиморфного локуса по отдельности. Интересно, что гаплотип, содержащий
оба аллеля риска не ассоциирован с развитием РС. На основании этого мы
можем предположить, что рядом с исследуемыми нами маркерными
полиморфными локусами могут быть расположены два функциональных
полиморфных локуса, один из которых повышает риск развития РС, в то
время
как
другой,
наоборот,
понижает.
Учитывая
тот
факт,
что
93
функциональный(-ые) полиморфный(-ые) локус(-ы) лежит(-ат) выше старта
транскрипции гена, вероятнее всего, он(-и) влияет(-ют) на связывание с
регуляторной областью какого-либо транскрипционного фактора, что в свою
очередь может приводить к изменению экспрессии гена или аллельному
дисбалансу.
2.3.4 Анализ сайтов связывания транскрипционных факторов промоторного региона
гена CD40
Промотор – регион геномной последовательности, находящийся выше
старта транскрипции гена, участвующий в процессах регулирования
инициации транскрипции гена. Промоторная область генов характеризуется
наличием сайтов связывания транскрипционных факторов (ТФ), которые
регулируют его экспрессию. Эффективный размер промотора для каждого
конкретного гена может быть выявлен экспериментально. Как правило,
анализируют фрагмент 5’-области около 5000 пар нуклеотидов. Тем не
менее, выявлены гены, длина промоторов которых превышает 10 000 пар
нуклеотидов.
Совместно с Юрием Васильевичем Кондрахиным (КТИ ВТ СО РАН)
нами был исследован участок 20 хромосомы человека с началом в положении
chr20:44730763
и
концом
в
положении
chr20:44747346,
согласно
GRCh37/hg19 от февраля 2009 года. Данный участок содержит всего16583
пар нуклеотидов, в том числе 16219 п.н. до старта гена CD40 и 363 п.н. от
начала гена. Регион был умышленно взят больше средней длины промотора
человека, чтобы увеличить вероятность анализа полного промотора.
Анализ антител к ТФ, связывающихся с промотором гена CD40. Мы
исследовали,
какие
антитела,
специфичные
к
ТФ,
связываются
с
промоторным регионом гена CD40. Такое исследование стало возможным
благодаря появлению в 2007 году метода ChIPSeq, включающего в себя
имунопреципетацию хроматина с последущим секвенированием ДНК
технологией NGS секвенирования [240]. Этот метод по настоящее время
остается самой мощной экспериментальной методикой полногеномного
94
исследования взаимодействия между ТФ и ДНК. Результатом эксперимента
являются
последовательности
ДНК,
соответсвующие
антителу,
связывающему конкретный домен ТФ.
Информация о результатах ChIPSeq была взята нами из базы данных
ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements, https://www.encodeproject.org/) и
перенесена в базу данных GTRD (Gene Transcription Regulation Database) для
последующей
обработки.
Описание
GTRD
доступно
по
ссылке
http://wiki.biouml.org/index.php/GTRD, а сама база данных доступна он-лайн
(http://gtrd.biouml.org/bioumlweb/#anonymous=true&perspective=GTRD).
Исходные данные подвергали следущим этапам обработки:
-выравнивали на референсный геном с помощью алгоритма Bowtie
[241];
-идентифицировали «пики» с использованием алгоритмов MACS и
SISSR [242].
Основная идея выявления «пиков» заключается в выявлении областей в
геноме, где мы наблюдаем большее количество специфичных к ДНКсвязывающим белкам (в частности ТФ) антител, чем можно было бы ожидать
в силу случайных процессов. Существуют потенциальные трудности с
интерпретацией «пиков»:
- «пики» могут включать в себя от сотен до тысяч нуклеотидов, тогда
как ТФ обычно накрывают до нескольких десятков нуклеотидов;
- много «пиков» не имеют отношения к
сиквенс-специфическому
связыванию в силу непрямого (опосредованного) связывания, связывания
через сиквенс-неспецифический домен, и присутствие ложнопозитивных
«пиков».
Для преодоления этих трудностей нами были применены два подхода:
- моделирование сиквенс-специфичности и предсказание специфичного
связывания в точных геномных позициях;
-
пересечение
между
собой
множества
ChIP-seq
результатов,
полученных для одного и того же ТФ, но на разных наборах данных.
95
Для
моделирования
сиквенс-специфичности
связывания
ТФ
мы
использовали алгоритм весовых матриц (position weight matrices (PWM)),
подробно описанный в работе Кондрахина Ю. с соавт. [242] и реализованный
в GTRD.
В ходе анализа «пиков» нами было выявлено три региона в промоторе
гена CD40, в которых находится максимальное количество «пиков» для ТФ:
34, 46 и 72 антитела к ТФ, соответственно в первом, втором и третьем
регионе. На рисунке 19 в виде графика представлено количество ТФ, чьи
«пики» были идентифицированы в ходе анализа промотора гена CD40.
Рисунок 19 - Анализ промоторного региона гена CD40 на наличие антител к
ТФ. По горизонтали на графике указано положение на 20 хромосоме человека. По
вертикали указано количество антител к транскрипционным факторам.
Вероятнее всего, что первые два региона соответствуют энхансерам,
третий регион совпадает со стартом транскрипции гена. Выявленные «пики»
к антителам к ТФ были сопоставлены с таблицей полиморфных локусов
данного региона. Полиморфные локусы, «накрываемые» антителами, были
сведены в таблицу А1.
96
Анализ трех регионов в промоторе гена CD40 на наличие сайтов
связывания
ТФ.
Затем
выявленные
три
региона
были
нами
проанализированы на наличие сайтов связывания ТФ in silico.
Анализ проводили следующим образом. Для каждого ТФ вычисляли
весовую матрицу (ВМ). Весовая матрица имеет вид:
𝑥𝐴𝑗
𝐴 𝑥𝐴1 𝑥𝐴2
𝑥𝐶𝑗
𝐶 𝑥𝐶1 𝑥𝐶2
𝑥𝐺𝑗 ,
𝐺 𝑥𝐺1 𝑥𝐺2
𝑥𝑇𝑗
𝑇 𝑥𝑇1 𝑥𝑇2
(3)
Где количество столбцов соответствует длине сконструированного сайта
связывания данного ТФ. Строки соответствуют конкретному нуклеотиду в
последовательности: A, C, G, T. Пересечение строки и столбца – это
вероятность
встретить
данный
нуклеотид
на
данной
позиции
в
сконструированном сайте для конкретного ТФ. Очевидно, что сумма в
столбце всегда равна 1.
𝑥𝐴𝑗 + 𝑥𝐶𝑗 + 𝑥𝐺𝑗 + 𝑥𝑇𝑗 = 1,
(4)
Для предсказания in silico места связывания ТФ, последовательность
исследуемого региона анализировали на соответствие ВМ данного ТФ.
Матрицу сопоставляли с референсной последовательностью и с помощью
алгоритма IPS для каждой позиции матрицы относительно референсной
последовательности вычисляли скор (IPSscore) [243]. В случае если скор
превышал некий критический порог, то считали данное место сайтом
связывания этого ТФ. Критический порог для каждой ВМ определялся
индивидуально, но чаще всего он варьировал в пределах от 3.0 до 3.8.
Анализ сайтов связывания in silico нами умышленно проводился только
для трех выявленных регионов в промоторе гена CD40, так как, как правило,
в регуляции генов участвуют не самостоятельные ТФ, а их комплексы. Из
экспериментальных данных ChIPSeq проекта нами выявлено только эти три
региона в качестве мест локализации комплексов ТФ.
Для каждого сайта вычисляли IPSscore до замены в SNP (на основе
референсной последовательности). В случае если IPSscor превышал
97
критический порог, то считали данный локус местом связывания и
дополнительно вычисляли IPSscore после замены. Также мы вычисляли
изменение скора – Δ IPSscore. Однако при таком подходе мы можем
предсказать только ухудшение сайтов связывания ТФ. Случаи, когда сайт
связывания возникал после замены в полиморфном локусе, при таком
анализе упускаются. Поэтому мы дополнительно провели вычисление
IPSscore для всех ВМ, но не для референсной последовательности, а с учетом
замен в полиморфных локусах. Если для какой-нибудь ВМ IPSscore
превышал критическое значение, то информацию о таком ТФ также сводили
в таблицу. Таким способом были получены ТФ, для которых IPSscore для
референсной последовательности не превышал критический порог, зато для
последовательности с заменой превышал.
Помимо базы данных GTRD нами были использованы ВМ для ТФ из баз
данных
factorbook
(factorbook.org)
(http://thebrain.bwh.harvard.edu/uniprobe/)
и
[244]
[245,246].
Это
UniProbe
позволило
нам
использовать ВМ для ТФ, которых не было в базе GTRD. Для баз данных
factorbook и UniProbe были проведены аналогичные расчеты.
Следующим нашим шагом был отбор ТФ, чьи сайты связывания
значимо менялись при замене в SNP. Для этого все результаты, полученные
для
трех
БД
(GTRD,
factorbook
и
UniProbe)
были
персонально
проанализированы. В таблицу 21 были отобраны только те ТФ, сайт
связывания которых до замены и после преодолевал критический порог.
Другими словами IPSscore при отсутствии замены в SNP превышал
критический порог, а после замены – нет, это означало, что сайт связывания
почти полностью нарушается заменой в SNP. И наоборот, до замены IPSscorе
был меньше критического значения, а после замены больше, значит после
замены появлялся сайт, которого ранее не было. Дополнительно отобранные
ТФ сопоставлялись с таблицей А1. Мы отслеживали, чтобы позиция сайта
ТФ, предсказанного in silico, соответствовала сайту связывания АТ к
данному ТФ. Таким образом, нами было проведено и экспериментальное
98
подтверждение того, что сайт связывания существует. В таблице 21 указаны
номер SNP, его позиция на хромосоме, транскрипционный фактор, IPSscore
предсказанного сайта до и после замены в локусе, а также дельта IPSscore
при отсутствии замены и при ее наличии.
Таблица 21. Перечень SNP, замена в которых значимо изменяет IPSscore.
* - матрицы сайтов посадки ТФ, имя которых указано в формате «имя.1», взяты из базы
данных GTRD, все остальные матрицы взяты из базы данных factorbook. ** - В случае,
когда SNP имеет несколько вариантов замены, то в скобках указано, для какого именно
варианта
посчитан
IPSscor.
Жирным
шрифтом
нами
отмечены
ТФ
наиболее
Δ IPSscor
перспективные для экспериментальной валидации.
Условный
номер
региона в
промоторе
1
SNP
rs35388620
rs35388620
rs11698938
rs6032666
44734190
(AGAG)
44734190
(AGAAAAACG)
44737212
44737212
44737630
44745945
rs13037724
44746565
rs13041789
44746720
rs13041789
44746720
rs752118
44746738
rs11569298
44746853
rs11569299
44746858
rs11569300
44746914
rs34556692
3
Стартовая
позиция на
хромосоме**
rs11569302
44747104
Транскрипционный
фактор*
IPSscor
при
отсутствии
замены
IPSscor
при
наличии
замены
TBR-2.1
3.644
1.893
TBR-2.1
3.644
2.042
GATA-2.1
IRF-4.1
SMAD3.1
3.388
5.552
3.753
1.633
3.887
2.560
-1.755
-1.665
-1.193
EGR1.1
STAT3.1
STAT1
PU1
GATA-1
TAL1
VDR.1
GATA-1.1
Tal-1.1
GATA1
Sp1.1
RXRalpha.1
ERG.1
STAT3.1
STAT5A.1
STAT4.1
STAT1.1
STAT2.1, STAT1.1,
IRF-9.1
SIX5.1
Elk-1
Elk-4.1
ELK4
Elk-1.1
Fli-1.1
c-Ets-1.1
Elf-1
GABPalpha.1
GABP
7.125
3.724
3.399
4.256
2.557
3.105
3.363
3.546
3.546
3.690
4.424
4.941
4.412
6.350
4.707
5.206
4.893
5.910
5.222
4.931
2.947
3.673
4.634
4.091
1.926
1.926
5.163
2.313
3.100
2.833
4.775
3.137
3.677
3.527
4.547
3.254
-1.215
1.498
1.532
-1.309
1.117
+1.529
+0.728
-1.62
-1.62
+1.473
-2.111
-1.841
-1.579
-1.575
-1.57
-1.529
-1.366
-1.293
4.215
3.969
4.077
4.852
3.969
4.182
3.544
4.852
3.577
4.852
2.833
2.713
2.777
3.187
2.713
2.899
2.248
3.187
2.418
3.187
-1.750
-1.602
-1.382
-1.256
-1.3
-1.665
-1.255
-1.283
-1.296
-1.665
-1.159
-1.665
99
Для первого региона было выявлено три SNPs: rs34556692, rs35388620 и
rs11698938. Второй регион, не смотря на большое количество сайтов ТФ, не
содержит
полиморфных
локусов,
значимо
изменяющих
IPSscore.
Примечательно, что SNP, который был выявлен в полногеномном
исследовании и определен нашим исследованием в качестве лучшего
маркера (rs6074022), попадает во второй регион. В то время как третий
регион содержит восемь SNPs: rs6032666, rs13037724, rs13041789, rs752118,
rs11569298, rs11569299, rs11569300, rs11569302.
С целью приоретизации ТФ из таблицы 21 для потенциальной
экспериментальной валидации, все ТФ из списка были проанализированы на
уже установленную связь с РС. Нами был произведен поиск публикаций в
базе
данных
PubMed.
Запрос
осуществляли
по
ключевым
словам:
«наименование ТФ» и «multiple sclerosis». Транскрипционные факторы, связь
с РС для которых была показана ранее, были отобраны в качестве наиболее
перспективных
для
дальнейшего
изучения
их
влияния
на
предрасположенность к РС, реализуемую через изменения в промоторном
регионе гена CD40. Всего было отобрано три ТФ: VDR и STAT3, IRF-4.
VDR
–
ген,
кодирующий
рецептор
к
витамину
D.
VDR–
транскрипционный фактор, регулирующий экспрессию многих генов, в том
числе и HLA-DRB1. Показано, что экспрессия аллеля HLA-DRB1*15,
носительство которого многократно повышает риск развития РС и по
настоящее время являющего единственным общепризнанным генетическим
фактором риска развития РС, регулируется VDR [247]. Более того данная
схема позволяет объяснить влияние широко известного внешнего фактора
риска развития РС, как географическая широта. Таким образом, нехватка
витамина D, сказывается на эффективности работы транскрипционного
фактора VDR, в свою очередь влияющего на уровень экспрессии HLA-DRB1
и возможно ряда других генов. Дополнительные нарушения в регулируемым
им генах, приводят к еще большему повышению риска развития РС.
100
Учитывая вышесказанное, можно заключить, что сайт посадки VDR в
промоторной области гена CD40 является важным регуляторным звеном.
Ген STAT3 кодирует транскрипционный фактор, который регулирует
экспрессию различных генов, отвечающих за рост клетки и апоптоз.
Иммунопреципитация хроматина и массивное параллельное секвенирование
показали, что Stat3 связывается с промоторами многих генов, вовлеченных в
процессы активации, пролиферации и выживания T-клеток [110]. Нарушения
в апоптозе Т клеток могут приводить к массивной аккумуляции лимфоцитов
в лимфоидных органах, а также к нарушению апоптотической элиминации
аутореактивных Т клеток и развитию аутоиммунных заболеваний.
IRF-4. В экспериментальных моделях на мышах было показано, что
именно Th-17 играют ключевую роль в развитии экспериментального
аутоиммунного энцефаломиелита [248]. IRF-4, как было показано in vitro,
является ключевым фактором для дифференциации Th-17. Brustle с соавт.
продемонстрирвоали, что очищенные CD4+CD62L+ T хелперы, нокаутные
по гену IRF4 (Irf4–/–), даже при добавлении в среду так называемого «Th-17
цитокинового коктейля», включающего TGF-b, IL-6, IL-1b, TNF и IL-23, не
дифференцировались в Th-17. Более того, Irf4–/– мыши устойчивы к
развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [249]. T
хелперы таких мышей не могут продуцировать RORgT в ответ на TGF-b и IL6. У человека Th клетки, нокаутные по IRF4, не способны индуцирвоать
эксперссию
RORC
под
действием
Th17
цитокинового
коктейля,
подтвверждая, что IRF4 может быть выше в сигнальном пути, чем RORgT
[250]. Связывание IRF4 и BATF с хроматином необходимо для дальнейшей
регуляции RORgT в процессе дифференциации Th17 клеток [251].
Суммарно, сайты связывания транскрипционных факторов VDR,
STAT3, IRF-4 – важные регуляторные звенья гена CD40, нарушения в
которых вероятно будут приводить к повышенному риску развития РС. В
таблице 22 указаны консенсусные последовательности, сконструированных
нами сайтов посадки транскрипционных факторов.
101
Таблица 22. Сайты посадки VDR, STAT3, IRF-4.
ТФ
Сайт посадки ТФ
SNP
VDR
GGGTCANNGGGTTCA
rs752118
STAT3
CTTCCGGGAAG
rs11569302
IRF-4
AGGA(С/G)TGAAA(C/G)TGAA(C/G)
rs35388620
2.3.5 Аллельный дисбаланс гена CD40
Аллельным дисбалансом называют различие в экспрессии двух аллелей
одного гена. Человек – диплоидный организм, соответственно является
носителем
двух
копий
каждого
гена.
Как
правило,
две
копии
экспрессируются на одном и том же уровне. Это означает, что количество
мРНК, синтезированной с копии матери, будет равно количеству мРНК
синтезированной с копии отца данного гена. Когда соотношение отклоняется
от 1:1, принято говорить о наличии аллельного дисбаланса. Существуют
различные причины изменения соотношения уровней экспрессии. Например,
генетический импринтинг, когда внешние факторы выключают работу
одного из аллелей. Когда работа одного из аллеля выключена полностью, мы
имеем дело с крайним случаем аллельного дисбаланса. Другие причины
могут увеличивать или уменьшать экспрессию одного из аллелей лишь
незначительно, тем самым приводить к аллельному дисбалансу в меньшей
степени. Например, 5’-мутации могут изменять промотор лишь одного из
аллелей за счет изменения силы связывания с ТФ, в то время как 3’UTRмутации могут влиять на стабильность мРНК или на ее связывание с
микроРНК [252]. На рисунке 20 схематически изображен случай, когда
замена в цис-регуляторном элементе (5’-мутация) приводит к снижению
уровня
экспрессии
и,
гетерозиготных носителей.
как
следствие,
аллельному
дисбалансу
у
102
Рисунок 20 – Замена в цис-регуляторном элементе, приводящая к снижению
уровня экспрессии гена и, как следствие, аллельном дисбалансу у
гетерозиготных носителей
Так как по результатам нашего исследования функциональный
полиморфный локус расположен в промоторной области гена и вероятно
приводит к замене в цис-регуляторном элементе, поэтому экспериментальное
исследование аллельного дисбаланса включало несколько этапов:
1) выбор SNP в промоторной области гена, который предположительно
маркирует
функциональный
полиморфный
локус,
изменяющий
силу
связывания с ТФ, вследствие чего изменяется экспрессия сцепленного с ним
аллеля гена;
2) выбор SNP в начале гена, по которому будет оценено количество
нарабатываемой мРНК;
103
3) измерение уровня экспрессии мРНК, нарабатываемой с разных копий
гена, в модельных лабораторных образцах (культурах клеток);
4) анализ различий количества мРНК разных аллельных вариантов гена.
В качестве SNP в промоторной области нами был выбран rs6074022, так
как нами было убедительно показано, что он маркирует функциональный
локус.
Для выбора SNP, по которому впоследствии измеряли количество
мРНК, нами были проанализированы полиморфные локусы гена CD40.
Поиск полиморфных локусов гена CD40 осуществляли в базе данных NCBI
посредством запроса «CD40» в каталоге Gene, с последующим запросом «See
SNP Geneview Report». В результате нами был получен список из 286 SNPs.
В таблице 22 приведены первые 10. Критерием выбора SNP для
исследования служили:
- как можно более близкое расположение к старту транскрипции, чтобы
снизить вероятность того, что между локусами низкое неравновесие по
сцеплению;
- высокая частота встречаемости минорного аллеля.
Таблица 22. SNPs гена CD40 согласно базе данных NCBI. Аббревиатура: НТО –
нетранслируемая область
№
SNP
частота
функция
встречаемости
минорного
аллеля
1
rs11569300
0.138
2
rs372855582
3
rs11569301
4
аллели Аминокислотная
замена
5' НТО
-/T
5' НТО
C/G
5' НТО
C/T
rs373167365
5' НТО
C/G
5
rs377285521
5' НТО
C/T
6
rs371166508
5' НТО
C/G
7
rs200981957
5' НТО
G/T
8
rs140399416
0.0005
5' НТО
A/G
9
rs1883832
0.2429
5' НТО
C/T
10
rs113207193
0.0009
миссенс-мутация
G
Gly [G]
исходная
последовательность
T
Cys [C]
0.230
104
В качестве SNP, по которому мы оценивали уровень экспрессии мРНК с
разных аллельных вариантов, был выбран rs1883832. Частота его минорного
аллеля 24%, расположен он в первом экзоне, ближе всех других к началу
транскрипции гена, 77 позиция в мРНК.
В качестве модельных лабораторных образцов для измерения уровня
экспрессии нами были выбраны мононуклеары крови, полученной от
пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями (n=23), а также
пациентов контрольной группы (n=16). Далее мононуклеары каждого
пациента делились на 5 аликвот:
1) из первой аликвоты сразу после осаждения из крови выделяли мРНК
и ДНК;
2) вторую аликвоту культивировали в течение 24 часов без добавления
митогенов с последующим выделением мРНК и ДНК;
3) третью аликвоту культивировали в течение 24 часов с добавлением
митогена – коноковалина A (conA) с последующим выделением мРНК и
ДНК;
4) четвертую аликвоту культивировали в течение 48 часов без
добавления митогенов с последующим выделением мРНК и ДНК;
5) пятую аликвоту культивировали в течение 48 часов с добавлением
митогена – коноковалина A (conA) с последующим выделением мРНК и
ДНК;
Таким образом, на каждого пациента нами было получено 5 вариантов
суммарной клеточной мРНК. После чего каждый образец мРНК подвергался
ревертированию для получения кДНК.
Следующим шагом нашего исследования было выявление лиц,
являющихся гетерозиготами по обоим выбранным SNPs: rs6074022 и
rs1883832. Нами было проведено генотипирование SNPs rs6074022 и
rs1883832 у всех пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями
(n=23), а также пациентов контрольной группы (n=16). Результаты
генотипирования представлены в таблице 23.
105
Таблица
23.
заболеваниями
Генотипы
и
лиц
пациентов,
контрольной
страдающих
группы.
аутоиммунными
Аббревиатура:
АИЗ
–
генотип
rs1883832
АИЗ 1
T/T
C/C
К1
АИЗ 2
T/T
C/C
К2
АИЗ 3
T/T
C/C
К3
АИЗ 4
T/T
C/C
К4
АИЗ 5
C/T
C/T
К5
АИЗ 6
C/T
C/T
К6
АИЗ 7
T/T
C/C
К7
АИЗ 8
C/T
C/T
К8
АИЗ 9
C/T
C/T
К9
АИЗ 10 T/T
C/C
К 10
АИЗ 11 C/T
C/T
К 11
АИЗ 12 C/T
C/T
К 12
АИЗ 13 T/T
C/C
К 13
АИЗ 14 C/T
C/T
К 14
АИЗ 15 T/T
C/C
К 15
АИЗ 16 C/T
C/T
К 16
АИЗ 17 C/T
C/T
АИЗ 18 C/T
C/T
АИЗ 19 C/C
T/T
АИЗ 20 T/T
C/C
АИЗ 21 C/T
C/T
АИЗ 22 C/C
T/T
АИЗ 23 T/T
C/C
Для исследования аллельного дисбаланса
генотип
rs6074022
наименование
пробы
генотип
rs1883832
генотип
rs6074022
наименование
пробы
аутоиммунное заболевание, К – контроль.
T/T
T/T
T/T
C/T
C/C
C/T
C/T
T/T
T/T
T/T
C/T
C/T
T/T
C/T
C/T
C/T
C/C
C/C
C/C
C/T
T/T
C/T
C/T
C/C
C/C
C/C
C/T
C/T
C/C
C/T
C/T
C/T
необходимо, чтобы образец
был гетерозиготой по обоим изучаемым SNPs. Таким образом, для
дальнейшего исследования нами были отобраны кДНК следующих образцов:
АИЗ 5, АИЗ 6, АИЗ 8, АИЗ 9, АИЗ 11, АИЗ 12, АИЗ 14, АИЗ 16, АИЗ 17, АИЗ
18, АИЗ 21, К 4, К 6, К 7, К 11, К 12, К 14, К 15, К 16. Для исследования
аллельного дисбаланса нами были использованы три метода: ПЦР-ПДРФ,
ПЦР в режиме реального времени, цифровая ПЦР (Digital PCR).
106
2.3.5.1 Анализ аллельного дисбаланса методом ПЦР-ПДРФ
Последовательность вокруг SNP rs1883832 (C->T) в случае отсутствия
замены соответствует сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Bsp19I:
СCATG. Это позволяет оценить соотношение аллелей в кДНК исследуемых
образцов, посредством ее амплификации с праймерами, фланкирующими
SNP rs1883832, с последующей обработкой эндонуклеазой рестрикции
Bsp19I
и
визуализацией
продуктов
с
помощью
электрофореза
в
акриламидном геле. На рисунке 21 схематически изображены продукты
ПЦР-ПДРФ анализа с указанием длин получаемых фрагментов в п.н.
Рисунок 21 - Продукты ПЦР-ПДРФ анализа с указанием длин получаемых
фрагментов
Таким образом, в случае аллеля Т на электрофореграмме мы наблюдали
полосу,
соответсвующую
длине
фрагмента
60п.н.
(31п.н.+4п.н.+25п.н.=60п.н.), в случае аллеля С полосу длиной 31п.н. Более
короткие
фрагменты
(14
и
4
п.н.)
на
электрофореграмме
не
визуализирвались. Нами были проанализированы все образцы кДНК. Пример
электрофореграммы приведен на рисунке 22.
107
Рисунок 22 - Электрофореграмма продуктов ПЦР-ПДРФ анализа аллельного
дисбаланса. М – маркер длин фрагментов, 1-7 – результаты ПЦР-ПДРФ
анализаразличных образцов.
Далее уровень свечения каждого фрагмента гидролиза был оценен с
помощью программы GelDoc (BioRad, США) с поправкой на свечение фона.
Уровень свечения был поделен на расчетное количество пар нуклеотидов во
фрагменте, после чего условные единицы свечения аллеля Т и аллеля С были
сравнены для каждого исследованного образца (формула 4).
условная единица свечения аллеля =
уровень свечения фрагмента−уровень свечения фона
расчетная длина фрагмента
,
(5)
В качестве контроля несимметричности амплификации нами так же
были проанализированы образцы геномной ДНК носителей гетерозиготного
варианта полиморфного локуса rs1883832. По результатам ПЦР-ПДРФ
анализа геномной ДНК нами было выявлено наличие несимметричности
ПЦР – соотношение условных единиц свечения на п.н. для аллеля Т и С
колебалось в пределах 0.56-0.59, среднее значение равнялось 0.57.
Соответственно при выявлении аллельного дисбаланса мы дополнительно
вводили поправку на несимметричность ПЦР и вычисляли его по формуле
13:
аллельный дисбаланс =
условная единица свечения аллеля Т
условная единица свечения аллеля С
÷ 0.57,
Для каждой из 5-ти групп аликвот:
1) сразу после осаждения из крови выделяли мРНК и ДНК;
(6)
108
2) культивировали в течение 24 часов без добавления митогенов с
последующим выделением мРНК и ДНК;
3) культивировали в течение 24 часов с добавлением митогена –
коноковалина A (conA) с последующим выделением мРНК и ДНК;
4) культивировали в течение 48 часов без добавления митогенов с
последующим выделением мРНК и ДНК;
5) культивировали в течение 48 часов с добавлением митогена –
коноковалина A (conA) с последующим выделением мРНК и ДНК;
вычисляли среднюю величину аллельного дисбаланса, рассчитанную по
формуле 5. Для всех пяти групп данная величина равнялась 1.3. Однако
данное отличие в экспрессии аллелей вряд ли имеет биологический эффект.
2.3.5.2 Анализ аллельного дисбаланса методом ПЦР в режиме реального времени
Уровень свечения флюорофора при выходе образца на плато при ПЦР в
режиме
реального
времени
коррелирует
с
исходным
количеством
детектируемого им аллеля в образце. Следовательно, разница в уровнях
свечения может свидетельствовать о различном соотношении аллелей Т и С в
образцах кДНК.
Для количественной оценки соотношения аллелей в образцах кДНК
нами
были
смоделированы
образцы
ДНК
с
заведомо
известным
соотношением аллелей Т и С SNP rs1883832. Для этого нами были взяты два
образца геномной ДНК одинаковой концентрации: один образец –
гомозигота СС полиморфного локуса rs1883832, второй – гомозигота ТТ.
Далее образцы были смешаны в разных соотношениях так, чтобы в конечных
образцах количество аллеля Т равнялось: 0%, 12,5%, 25%, 37,5%, 50%,
62,5%, 75%, 87,5%, 100%. Полученные образцы были использованы в
качестве стандарта при измерении количества аллеля Т в исследуемых
образцах
кДНК.
Кривые
накопления
флюоресцентного
сигнала
флюорофору FAM стандартных образов приведены на рисунке 20.
по
109
Рисунок 23 - Кривые накопления флуоресцентного сигнала стандартных
образцов
На основании конечных значений кривых накопления флуоресцентного
сигнала и информации о изначальном процентном количестве аллеля Т в
стандартном образце нами был проведен линейный регрессионный анализ
как изображено на рисунке 24.
Рисунок 24 - Зависимость конечных значений кривых накопления
флуоресцентного сигнала от изначального процентного количества аллеля Т
в стандартном образце
На основании построенного уравнения зависимости был определен
коэффициент корреляции между изначальным процентным количеством
аллеля Т в образце и конечным значением накопленного флуоресцентного
сигнала (R2=0.9716). Коэффициент корреляции больше 0.8 говорит о сильной
110
связи между оцениваемыми параметрами, то есть смоделированные нами
образцы можно использовать в качестве стандарта, а построенное
регрессионное уравнение использовать для оценки исходного количества
аллеля Т в исследуемом образце (формула 6).
𝑅𝐹𝑈 = 61.7 + 9.3 × (кол − во аллеля Т, %),
(7)
Нами были проанализированы все образцы кДНК. Пример кривой
накопления
флюоресцентного
исследуемого
образца
кДНК
сигнала
по
флюорофору
относительно
кривых
FAM
для
накопления
флуоресцентного сигнала для стандартных образцов приведен на рисунке 25.
В качестве контроля нами так же были проанализированы образцы геномной
ДНК носителей гетерозиготного варианта SNP rs1883832. Согласно
полученным измерениям в исследованных нами образцах доля аллеля Т была
равна 52.6%, и, следовательно, аллельного дисбаланса нет.
Рисунок 25 - Пример кривой накопления флюоресцентного сигнала по
флюорофору FAM для исследуемого образца кДНК
2.3.5.3 Анализ аллельного дисбаланса методом цифровой ПЦР (Digital PCR)
Третьим методом оценки аллельного дисбаланса была цифровая ПЦР.
Принцип метода заключается в том, что исходная ПЦР смесь разбивается на
большое количество капель, таким образом, чтобы в каждую каплю попала
максимум одна копия исходного образца ДНК. После этого в каждой капле
проводится ПЦР, с последующим съемом флюоресцентного сигнала с
каждой капли. Далее с помощью программного обеспечения производится
подсчет капель с разными флюоресцентными сигналами.
111
Применительно к нашей задаче – оценке аллельного дисбаланса в
образце кДНК – соотношение капель с флуоресцентным сигналом с аллеля Т
SNP rs1883832 и аллеля С SNP rs1883832 будет отражать исходное
соотношение аллелей в образце кДНК.
Нами были проанализированы все образцы кДНК. В качестве контроля,
как и в предыдущих двух методах, нами были проанализированы образцы
геномной ДНК носителей гетерозиготного варианта SNP rs1883832. Пример
соотношения капель с флюоресцентным сигналом от аллелей С и Т приведен
на рисунке 25. Согласно полученным измерениям в исследованных нами
образцах аллельного дисбаланса нет.
Рисунок 25 - Пример соотношения аллелей в анализируемом образце кДНК
Суммируя результаты всех трех использованных нами методов: ПЦРПДРФ, ПЦР в режиме реального времени и цифровой ПЦР – можно
заключить, что аллельные варианты функционального полиморфного локуса
в промоторном районе гена CD40, который маркируется SNP rs6074022, либо
не приводят к аллельному дисбалансу, либо аллельный дисбаланс
реализуется в узкоспециализированных линиях клеток.
112
2.4 Анализ молекулярных путей (pathways), вовлеченных в
патогенез РС
Системный подход к изучению генетической предрасположенности к
мультифакториальных заболеваниям – самый популярный метод в настоящее
время. На него возлагаются большие надежды. Считается, что с его помощью
будет больше шансов выявить молекулярные механизмы патогенеза
заболевания, так как он направлен не на изучение ассоциации конкретного
локуса в геноме с заболеванием, а на ассоциацию молекулярного пути
(сигнального пути, pathway) с заболеванием. С точки зрения целого
организма системный подход может давать более точное представление о
патогенезе заболевания, так как анализируется сигнальный путь с заведомо
определенной функцией, в то время как ассоциированный локус генома (ген,
группа генов) потенциально может выполнять множество ролей в организме
за счет участия в разных сигнальных путях.
Очевидно, что сигнальный путь должен содержать продукты генов,
ассоциированных с заболеванием (в нашем случае с рассеянным склерозом).
С целью создания списка генов, ассоциированных с РС, нами был проведен
комплексный анализ литературных данных.
2.4.1 Аналитический обзор литературы
Комплексный анализ литературных данных был выполнен на выборке
литературных источников, в которых описаны результаты исследований
генетической составляющей РС до мая 2012 года включительно. Поиск
литературных данных осуществлялся в базе PubMed по ключевым словам:
“multiple sclerosis AND SNP”, “multiple sclerosis AND genetics OR genetic”,
“multiple sclerosis AND polymorphism” and “multiple sclerosis AND allele(s)”.
После
персональной
аннотации
было
посвященные генетике РС (Рисунок 26).
отобрано
1304
публикации,
113
Рисунок 26 - Публикации посвященные исследованиям генетической
составляющей РС, патогенезу РС и внешним факторам риска развития РС.
На рисунке схематически представлены группы исследований. Вирусы - исследования
вирусов, как факторов риска РС; фармакогеномика - фармакогенетические исследования;
животные и др. - модели патогенеза на животных, исследования клеточных линий,
биохимические исследования; исследования HLA генов, исследования не-HLA генов,
семейные – семейные исследования; GWAS - полногеномные исследования ассоциаций;
мета-анализы; * - обзоры. Числа соответствуют количеству публикаций, попавших в
каждый из сегментов схемы. Если публикация попадала более, чем в одну групп, то она
учтена в пересечении элементов схемы.
Все данные литературных источников были проанализированы и
систематизированы в зависимости от тематики исследования. Всего было
сформировано 9 групп статей:
- исследования HLA генов (292 публикации),
- семейные исследования (40 публикаций),
114
- исследования не-HLA генов (740 публикаций),
- полногеномные исследования ассоциаций, GWAS (39 публикаций),
- исследования вирусов, как факторов риска РС (10 публикаций),
- модели патогенеза на животных, исследования клеточных линий,
биохимические исследования (24 публикации),
- фармакогенетические исследования (29 публикаций),
- мета-анализы (25 публикаций),
- обзоры (157 публикаций).
Схематически распределение публикаций по группам изображено на
рисунке 27.
Рисунок 27 - Распределение публикаций по годам
Публикации четырех групп: исследования HLA генов, исследования неHLA генов, полногеномные исследования ассоциаций и мета-анализы – были
115
распределены в зависимости от года публикации (Рисунок 27). Из рисунка
видно, что исследования генетической составляющей РС в первые десять лет,
с 1974 года по 1985 год включительно, в основном были направлены на
исследование связи генов HLA c РС. После того как в 1972 г. была впервые
установлена ассоциация генов главного комплекса гистосовместимости
(HLA) с РС [4,27], в последующие годы эта связь верифицировалась на
различных
популяциях.
Довольно
быстро
было
установлено,
что
генетическая предрасположенность к РС не может быть объяснена только в
терминах вовлеченности генов HLA. HLA-регион объясняет примерно 2060%
генетической
предрасположенности
к
РС.
Таким
образом,
идентификация других генов с меньшим эффектом необходима для более
полного понимания механизмов патогенеза РС. Это дало предпосылки для
поиска других, часто именуемых в литературе не-HLA, генов. Количество
публикаций с 1986 по 2000 годы увеличивалось каждые три года примерно в
2 раза. Однако новых генов, ассоциированных с РС было выявлено немного.
По существу история с HLA была результатом удачно сработавшей генкандидатной стратегии поиска ассоциаций. Большинство других генов,
несмотря на свою кажущуюся привлекательность в отношении патогенеза
РС, как то APOE и TNFa, давали крайне противоречивые результаты, не
позволяющие сделать однозначных выводов об их роли в патогенезе. Стало
понятно, что стратегия ген-кандидат не является подходящей без удачной
гипотезы, и влекла в большей степени расходы, чем приносила результатов.
Для исследований ассоциаций с генами малого эффекта требовались группы
гораздо больших размеров тех, что исследовались ранее, чтобы не то что
выявить ассоциацию, но хотя бы уверенно отрицать связь полиморфного
локуса с РС по результатам исследования. Аналогичные проблемы возникали
не
только
у
исследователей
мультифакториальных
РС,
но
и
у
исследователей
заболеваний.
На
помощь
пришла
других
прорывная
технология полногеномного исследования ассоциаций, которая позволила
установить связь с заболеванием полиморфных локусов генов, которые было
116
сложно
учесть,
используя
транскрипционных
факторов,
стратегию
а
также
ген-кандидат,
полиморфных
например
локусов
ранее
неописанных регионов генома. С 1999 по 2012 было проведено 12 GWAS, а
описанию их результатов посвящено 39 публикаций. Это в свою очередь
вдохнуло новую жизнь в идею исследований дизайна ген-кандидат.
Полиморфные
локусы,
выявленные
с
помощью
GWAS,
требовали
верификации на различных популяциях, и метод ген-кандидат явился
наиболее эффективным как с экономической точки зрения, так и трудозатрат.
Этим в большей степени обусловлен дальнейший рост публикаций в группе
не-HLA генов. Также с начала 2000 годов для систематизации и обобщения
уже полученных результатов стал широко использоваться статистический
подход, именуемый мета-анализ. Он позволил суммировать разрозненные
результаты как исследований на разных популяциях, так и исследований,
каждое из которых было выполнено на маленькой выборке. В частности
такой метод позволил поставить окончательную точку в вопросе ассоциации
с РС гена APOE [74]. Также этот метод полезен для исследования так
называемой
«серой
зоны» результатов полногеномных
исследований
ассоциаций. Он позволил выявить ряд новых генов малого эффекта [118].
Результаты всех публикаций после персональной аннотации были
распределены на публикации со статистически значимыми результатами и
незначимыми. К источникам со статистически значимыми результатами
были отнесены топовые SNPs GWAS, а также результаты исследований
случай-контроль, в которых показана ассоциация полиморфных локусов с
эффективностью терапии с p-value<0.05. Полиморфные локусы были
соотнесены с генами, которые они маркируют.
Дополнительно нами были проанализирована информация с двух онлайн
ресурсов,
но
которых
выложены
исследований ассоциаций:
- MSGene (http://www.msgene.org/)
результаты
полногеномных
117
-
A
Catalog
of
Published
Genome-Wide
Association
Studies
(www.genome.gov/gwastudies/index.cfm?pageid=26525384#searchForm)
С этих двух ресурсов нами была взята информация о полиморфных
локусах, ассоциированных с РС по результатам GWAS. Эти полиморфные
локусы были также соотнесены с генами, которые они маркируют.
Все гены (254 гена) были сведены в один список, в котором указано
название гена и соответствующий номер в базе Ensembl database, а также его
расположение в геноме (Таблица А2). Полученный список генов мы
использовали для выявления молекулярных путей (pathways), вовлеченных в
патогенез РС.
2.4.2 Молекулярные пути (pathways), вовлеченные в патогенез РС
Выявление молекулярных путей (МП), вовлеченных в патогенез РС,
проводили совместно с к.б.н. Келем Александром Эдуардовичем с помощью
программной
platform-1).
платформы
Для
geneXplain
получения
(http://genexplain.com/genexplain-
максимально
полной
информации
мы
использовали несколько баз данных (БД):
-Генная онтология (Gene Ontology)[253]
1. Биологические процессы (GO biological process);
2. Клеточные компоненты (GO cellular component);
3. Молекулярные функции (GO molecular function);
-Энциклопедия генов человека и метаболизма (HumanCyc pathways
(http://humancyc.org/));
-Reactome (www.reactome.org);
-TF classification (http://www.edgar-wingender.de/huTF_classification.html);
-TRANSPATH® (http://genexplain.com/transpath-1).
С помощью платформы geneXplain нами было проанализировано, какое
количество генов из составленного нами списка попадает в каждый
аннотированный
теоретически
статистической
МП.
Полученное
ожидаемым
значимости
количество
количеством
по
генов
генов
и
сравнивали
вычисляли
гипергеометрическому
с
уровень
распределению.
118
Теоретически ожидаемое количество генов вычисляли, исходя из случайно
ожидаемого распределения генов по молекулярным путям на основе
относительного размера МП по отношению ко всему количеству генов в
геноме.
GT =
Gpathway
Ggenome
× Glist , (8)
Где GT – теоретически ожидаемое количество генов, Gpathway –
количество генов в МП, Ggenome – количество генов в геноме, аннотированное
в БД, Glist – количество генов в нашем списке.
Информацию о молекулярных путях (наименование МП, число генов из
составленного нами списка, общее число генов в МП, наименование генов, P)
с уровнем статистической значимости меньше порогового (P<0.01) сводили в
таблицы. В базах данных «Энциклопедия генов человека и метаболизма» и
«TF classification» нами не было выявлено МП с уровнем значимости P<0.01.
В базе данных Reactome нами было выявлено 2 МП (Таблица 28), для
которых количество генов из нашего списка статистически значимо
(Padj<0.01) превышало теоретически ожидаемое количество генов:
- Extrinsic Pathway for Apoptosis (внешний путь для апоптоза),
- Signaling by Interleukins (передача сигналов интерлейкинами).
Таблица 28. Кандидатные молекулярные пути из базы данных Reactome.
№
Наименование МП
Кол-во
генов из
нашего
списка
Общее число
генов в МП
Теоретически
ожидаемое
количество
генов
Padj
1
REACT_1059: Extrinsic
Pathway for Apoptosis
5
12
0.49
0.003
2
REACT_22232: Signaling
by Interleukins
9
54
2.20
0.006
Наименование генов
CASP8, FAS,
TNFRSF10B,
TNFRSF1A, TNFSF10
IL1RN, IL2, IL2RA,
IL6, IL6ST, IL7R,
MAPK1, SYK, VAV1
В базе данных TRANSPATH® Padj был ниже порогового значения для 7
молекулярных путей (Таблица 29). Четыре молекулярных пути отвечают за
синтез и метаболизм витамина D3, два пути – за передачу сигнала IL-6 и
один за передачу сигнала интерферонами IFNalpha, IFNbeta -> STAT3.
119
Таблица
29.
Кандидатные
молекулярные
пути
из
базы
данных
TRANSPATH®.
№
Наименование
молекулярного пути
Кол-во
генов из
нашего
списка
Общее число
генов в МП
Теоретически
ожидаемое
количество
генов
1
IFNalpha, IFNbeta ->
STAT3
4
8
0.28
2
IL-6 signaling
4
8
0.28
3
5
0.17
3
5
0.17
3
5
0.17
6
Apo2L ->Caspase-8->
Caspase-3
7-dehydrocholesterol ->
calcitriol
formation of vitamin D3
and 1alpha,25dihydroxycholecalciferol
IL-6 -> SOCS3, FOS
7
Vitamin D metabolism
3
4
5
3
5
0.17
3
5
0.17
Наименование генов
Padj
0.006
0.006
0.007
0.007
0.007
0.007
0.007
IFNAR1,
IFNAR2,
STAT3, TYK2
IL6, IL6ST, NFKBIZ,
STAT3
CASP8, TNFRSF10B,
TNFSF10
CYP24A1, CYP27B1,
CYP2R1
CYP24A1, CYP27B1,
CYP2R1
IL6, IL6ST, STAT3
CYP24A1, CYP27B1,
CYP2R1
В базе данных Генная онтология поиск осуществлялся в трех словарях:
биологические процессы, клеточные компоненты и молекулярные функции.
Для каждого словаря пороговое значение Padj превысило довольно большое
количество МП. Был выявлен 1221 МП в словаре биологические процессы,
30 МП в словаре клеточные компоненты и 50 МП в словаре молекулярные
функции.
В словаре биологические процессы из пяти МП с минимальным Padj
вошли четыре, описывающих процессы иммунной системы, и один,
описывающий ответ на биотические стимулы (Таблица 30).
Таблица 30. Пять МП с минимальным Padj из словаря биологические
процессы БД Генная онтология.
Уровень
№
Наименование молекулярного пути
1
2
immune system process (GO:0002376)
response to biotic stimulus (GO:0009607)
regulation of immune system process
(GO:0002682)
immune response (GO:0006955)
positive regulation of immune system
process (GO:0002684)
3
4
5
2
3
Кол-во
генов из
нашего
списка
102
70
Общее
число
генов в
МП
1942
832
Теоретически
ожидаемое
количество
генов
23.92
10.24
4
3
81
78
1306
1254
16.09
15.45
5х10-33
9х10-32
5
62
811
9.99
2х10-29
Padj
10-36
5х10-36
В базе данных Генная онтология каждому МП присвоен уровень,
характеризующий его положение в иерархии молекулярных путей. МП
высокого уровня (2 или 3) обобщают более узкоспециализированные МП
120
уровней 5, 6 и т.д. Таким образом, дополнительно фильтруя по номеру
уровня, можно выявить МП, описывающие специализированные процессы в
организме. Всего в словаре биологические процессы нами было выявлено 13
МП второго уровня, 46 – третьего, 135 – четвертого, 206 – пятого, 316 –
шестого, 266 – седьмого, 140 – восьмого, 66 – девятого, 27 – десятого и 6
одиннадцатого уровня. В узкоспециализированные МП уровней 10 и 11
вошли
преимущественно
дифференциацию
и
пути,
апоптоз
B
и
описывающие
Т
клеток,
а
пролиферацию,
также
регуляцию
транскрипционными факторами STAT1, STAT4, STAT5, MAPK, JAK2 и JUN,
и регуляцию метилирования гистонов и активация апоптоза (Таблица 31).
Таблица 31. Кандидатные молекулярные пути из словаря биологические
процессы БД Генная онтология уровня 10 и 11.
Уровень
№
1
2
3
4
5
6
7
8
Наименование
молекулярного пути
positive regulation of
peptidyl-tyrosine
phosphorylation
(GO:0050731)
positive regulation of
activated
T
cell
proliferation
(GO:0042104)
positive regulation of
tyrosine phosphorylation
of
Stat4
protein
(GO:0042520)
positive regulation of
tyrosine phosphorylation
of
Stat5
protein
(GO:0042523)
positive regulation of
peptidyl-serine
phosphorylation
(GO:0033138)
positive regulation of NK
T
cell
activation
(GO:0051135)
positive regulation of
activation
of
JAK2
kinase
activity
(GO:0010535)
positive regulation of
10
Кол-во
генов из
нашего
списка
Общее
число
генов в
МП
18
140
Теорети
чески
ожидаем
ое колво генов
1.72
Наименование
генов
Padj
2х10-12
CCL5,
CD40,
ICAM1,
IFNG,
IL12A, IL12B, IL2,
IL23A, IL23R, IL4,
IL6, IL6ST, MIF,
PECAM1, RELN,
SYK, TNFRSF14,
TNFRSF1A
10
7
20
0.25
2х10-8
CD86, IL12B, IL2,
IL23A,
IL23R,
IL2RA, IL4
10
4
4
0.05
1х10-7
IL12A,
IL12B,
IL23A, IL23R
10
6
17
0.21
2х10-7
10
9
63
0.78
5х10-7
IL12B, IL2, IL23A,
IL23R,
IL4,
PECAM1
BCL2,
CAV1,
GSK3B, IFNG, IL6,
MET, MIF, TGFB1,
TNF
10
4
5
0.06
7х10-7
IL12A,
IL12B,
IL23A, IL23R
10
10
4
5
7
16
0.09
0.20
4х10-6
5х10-6
CCL5,
IL12B,
IL23A, IL23R
CCR2,
IL12B,
121
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
alpha-beta
T
cell
proliferation
(GO:0046641)
positive regulation of
tyrosine phosphorylation
of
Stat1
protein
(GO:0042511)
positive regulation of
CD4-positive, alpha-beta
T cell differentiation
(GO:0043372)
positive regulation of
CD4-positive, alpha-beta
T
cell
activation
(GO:2000516)
positive regulation of
tyrosine phosphorylation
of
Stat3
protein
(GO:0042517)
T-helper
cell
differentiation
(GO:0042093)
positive regulation of
peptidyl-threonine
phosphorylation
(GO:0010800)
activation of cysteinetype
endopeptidase
activity involved in
apoptotic
process
(GO:0006919)
activation of cysteinetype
endopeptidase
activity (GO:0097202)
cytosolic calcium ion
homeostasis
(GO:0051480)
regulation of B cell
apoptotic
process
(GO:0002902)
positive regulation of
smooth
muscle
cell
apoptotic
process
(GO:0034393)
regulation of NK T cell
proliferation
(GO:0051140)
positive regulation of NK
T
cell
proliferation
(GO:0051142)
elevation of cytosolic
calcium
ion
concentration
(GO:0007204)
positive regulation of
lymphocyte
apoptotic
process (GO:0070230)
positive regulation of B
IL23A,
SYK
PTPRC,
10
4
9
0.11
10-5
CD40,
IFNG,
IL6ST, TNFRSF1A
10
5
23
0.28
3х10-5
CCR2, CD86, IL4R,
IL6, MYB
10
5
25
0.31
5х10-5
CCR2, CD86, IL4R,
IL6, MYB
10
5
27
0.33
7х10-5
IL12B,
IL23A,
IL23R, IL6, IL6ST
10
4
14
0.17
7х10-5
BATF, IL12B, IL4,
PTGER4
10
4
16
0.20
10-4
10
8
102
1.26
10-4
10
8
107
1.32
2х10-4
10
11
213
2.62
3х10-4
GSK3B, MAPK1,
MET, TGFB1
CASP8,
CASP9,
FAS, MYC, TNF,
TNFRSF10A,
TNFRSF10B,
TNFSF10
CASP8,
CASP9,
FAS, MYC, TNF,
TNFRSF10A,
TNFRSF10B,
TNFSF10
CAV1,
CCR2,
CCR5,
CXCR4,
CXCR5, IL1B, IL2,
IL6ST,
PRKCE,
PTPRC, TAC1
10
4
19
0.23
3х10-4
IL10,
MYC
10
3
8
0.10
3х10-4
IFNG,
IL12B
10
2
3
0.04
0.001
IL12B, IL23A
11
2
3
0.04
0.001
11
9
187
2.30
0.001
IL12B, IL23A
CCR2,
CCR5,
CXCR4,
CXCR5,
IL1B, IL2, PRKCE,
PTPRC, TAC1
10
11
3
2
14
4
0.17
0.05
0.002
0.002
CCL5, IL10, MYC
IL10, MYC
IL2,
MIF,
IL12A,
122
25
26
27
28
29
30
31
32
33
cell apoptotic process
(GO:0002904)
T-helper
2
cell
differentiation
(GO:0045064)
negative regulation of
alpha-beta
T
cell
proliferation
(GO:0046642)
positive regulation of
histone
H3-K9
methylation
(GO:0051574)
negative regulation of
macrophage
apoptotic
process (GO:2000110)
negative regulation of
peptidyl-tyrosine
phosphorylation
(GO:0050732)
activation-induced cell
death
of
T
cells
(GO:0006924)
negative regulation of
lymphocyte
apoptotic
process (GO:0070229)
positive regulation of
JUN kinase activity
(GO:0043507)
activation of MAPK
activity (GO:0000187)
11
2
4
0.05
0.002
BATF, IL4
10
2
5
0.06
0.004
CBLB, TNFRSF14
11
2
5
0.06
0.004
JARID2, MYB
10
2
5
0.06
0.004
CCL5, CCR5
10
4
42
0.52
0.004
CAV1, PECAM1,
PTPRC , SOCS1
11
2
7
0.09
0.007
FAS, IL2RA
10
3
24
0.30
0.007
CCL5, IL2, MIF
10
5
80
0.99
0.007
10
7
155
1.91
0.007
IL1B, IL1RN, SYK,
TLR9, TNF
CXCR4,
IL1B,
MAPK1,
MET,
PTPRC, SYK, TNF
В словаре клеточные компоненты БД Генная онтология пороговое
значение Padj преодолело 30 МП, из них 4 относятся ко второму уровню, 11
– к третьему, 9 – к четвертому, 5 – к пятому и один к восьмому уровню. В
МП пятого и восьмого уровня в частности вошли МП: аксон (Axon
(GO:0030424)) и (CD95 death-inducing signaling complex (GO:0031265))
(Таблица 32).
Таблица 32. Кандидатные молекулярные пути из словаря клеточные
компоненты БД Генная онтология уровня 10 и 11.
Уровень
№
Наименование
молекулярного пути
Кол-во
генов
из
нашего
списка
Общее
число
генов в
мол-ом
пути
Теорети
чески
ожидаем
ое колво генов
Наименование генов
Padj
1
integral
to
membrane
(GO:0005887)
plasma
5
42
1314
15.79
10-7
AGER, CAV1, CCR2,
CCR5, CD1A, CD1E,
CD226, CD40, CD46,
CD58, CD6, CNR1,
CTLA4,
CXCR5,
GPC5, GPR65, HFE,
HLA-B, HLA-DQA1,
HLA-DRA,
HLA-
123
perinuclear region of
cytoplasm (GO:0048471)
5
25
613
7.37
2х10-6
Cytosol (GO:0005829)
5
56
2788
33.51
7х10-4
Axon (GO:0030424)
early
phagosome
(GO:0032009)
CD95
death-inducing
signaling
complex
(GO:0031265)
5
11
270
3.25
0.004
DRB1,
ICAM1,
IFNAR1,
IFNAR2,
IGF2R, IL23R, IL4R,
KIR2DL3,
MC1R,
MERTK,
MET,
MLANA,
NOTCH4,
PTAFR,
PTPRC,
PTPRK,
SGCD,
SLC15A2,
TNF,
TNFRSF14,
TNFRSF1A, TNFSF10
BDNF, BICD1, CAV1,
CCR2, CTLA4, FAS,
GC, GSK3B, HFE,
IGF2R,
KIF5A,
MALT1,
MX1,
NDFIP1,
NOS2,
PRKCA,
PRKCE,
PTK2,
PTPN22,
RPS6KB1, SLC30A7,
SPP1,
TNFRSF1B,
TYR, USP2
ACP5, BCL2, BICD1,
CASP8, CASP9, CAV1,
CBLB,
CCR2,
CENPC1,
CRYAB,
ERAP1, FAS, FOXO3,
GC, GSK3B, GSTM1,
GSTP1, IFIH1, IL1B,
IL22RA2,
ILDR1,
IRF5, IRF8, KIF5A,
KLC1,
MALT1,
MAPK1,
MTHFR,
MX1,
NADSYN1,
NOS2,
NOTCH4,
NQO1, OAS1, PLEK,
PNMT,
PRKCA,
PRKCE,
PTK2,
RAB38, RFK, RGS7,
RPL5,
RPS6KB1,
SH2B3,
SH3GL2,
SOCS1, STAT3, SYK,
TAGAP, TYK2, VAV1,
VAV2, VDR, YWHAG,
ZFP36L1
AGER, GC, KLC1,
MYC, PNMT, PTPRK,
RELN, TAC1, TGFB1,
TNFRSF1A,
TNFRSF1B
8
2
4
0.05
0.006
SYK, TLR9
5
2
5
0.06
0.009
CASP8, FAS
2
3
4
5
6
В третьем словаре БД Генная онтология, молекулярные функции,
критическое значение Padj было преодолено для 50 МП. В них вошли 4 МП
второго уровня, 6 МП третьего уровня, 8 МП – четвертого, 12 терминов –
пятого, 13 терминов – шестого, 5 терминов седьмого и 2 восьмого уровней. В
124
них вошли три МП, описывающих связывание хемокинового рецептора, один
связывание интерлейкина 1, один, описывающий активность интерферона
первого типа, и один, характеризующий связывание рецептора ФНО.
Таблица 33. Кандидатные молекулярные пути из словаря молекулярные
функции базы данных Генная онтология уровня 10 и 11.
Уровень
№
1
2
3
4
5
6
Кол-во
генов
из
нашего
списка
Общее
число
генов в
МП
Теорети
чески
ожидаем
ое колво генов
Padj
7
6
20
0.24
2х10-6
CCL17, CCL2, CCL5,
CCL7, CCR2, STAT3
8
3
4
0.05
10-4
CCL2, CCL7, CCR2
7
2
2
0.02
0.001
IFNAR1, IFNAR2
7
2
2
0.02
0.001
8
5
51
0.62
0.003
ERAP1, IL1RN
CASP8, ERAP1, TNF,
TNFSF10, TNFSF14
7
2
3
0.04
0.003
CCL17, CCL5
Наименование
молекулярного пути
CCR chemokine receptor
binding
CCR2
chemokine
receptor binding
type I interferon receptor
activity
interleukin-1, Type II
receptor binding
tumor necrosis factor
receptor binding
CCR4
chemokine
receptor binding
Наименование генов
Суммарно, по результатам анализа подавляющее количество МП,
которые были выявлены, можно разделить на четыре группы:
- пролиферация, дифференциация B и Т клеток;
- апоптоз;
- синтез и метаболизм витамина D3;
- передача сигналов интерлейкинами.
Выявление данных типов МП согласуется с современной концепцией
патогенеза РС, в которой важная роль отводится клеткам иммунной системы,
В и Т клеткам, так как заболевание аутоиммунной природы. Участие в
патогенезе путей, ответственных за синтез и метаболизм витамина D3
согласуется
с
зависимостью
распространенности
заболевания
от
географической широты, а также с регуляцией экспрессии HLA-DRB1*15
аллеля, главного фактора риска РС. Нарушения в апоптозе Т клеток могут
приводить к аккумуляции лимфоцитов в органах лимфоидной системы, а
также к нарушению апоптотической элиминации аутореактивных Т клеток,
приводящей к развитию аутоиммунных заболеваний. Передача сигналов
интерлейкинами является важным звеном работы иммунной системы. Таким
125
образом, выявленные МП дополнительно подтверждают, что РС - это
аутоиммунное заболевание, имеющее воспалительный характер. Более того,
детальное исследование генов обнаруженных МП может выявить новые
гены, предрасполагающие к развитию РС, что, в свою очередь, может быть
одним из методов решения проблемы «потерянной наследственности»
(«missing heritability») [254]. Также, в случае верификации участия данных
МП в патогенезе РС другими исследовательскими группами, белки и
кодирующие их гены могут быть рассмотрены в качестве терапевтических
мишеней для таргетной терапии при разработке новых лекарственных
препаратов.
2.5 Анализ ассоциативного генетического взаимодействия
2.5.1 CD40
В нашем исследовании ранее была реплицирована ассоциация SNPs гена
CD40 (rs6074022 и rs1883832). Так как РС – мультифакториальное
заболевание, и его развитие обусловлено взаимодействием факторов
окружающей среды и множества генов «малых эффектов», то актуальной
задачей является выявление, взаимодействие каких именно генов приводит к
развитию патологии. Очевидно, что гены, взаимодействие которых, приводит
к развитию патогенетических процессов, скорее всего, ассоциированы с РС.
В связи с этим целесообразно искать взаимодействие продукта гена CD40 с
продуктами генов, ранее выявленных как ассоциированные с РС.
Сетевой анализ. Нами совместно с к.б.н. Келем Александром
Эдуардовичем был проведен сетевой анализ (Analyze networks) для гена
CD40 с помощью программной платформы geneXplain. Эта программная
платформа для анализа использует информацию из БД TRANSPATH®.
Используя модуль программы geneXplain «Find master regulators with
TRANSPATH®», мы провели анализ для гена CD40. Поиск взаимодействия
осуществляли, используя ранее полученный нами список генов на основе
комплексного анализа литературных данных (Таблица А2).
126
Рисунок 28 - Сетевой анализ гена CD40.
127
Поиск ограничили 4 шагами вниз (downstream) от целевого гена, CD40.
Под шагом подразумевали одно взаимодействие между продуктами генов.
Результат анализа представлен в виде рисунка 28.
Выбор второго гена для исследования. Так как по результатам анализа
был получен довольно широкий список белков, взаимодействие которых
может играть роль в патогенезе РС, выбор гена для анализа мы осуществляли
из генов, продукты которых расположены в одном шаге от CD40. В список
этих белков вошли: iNOS-isoform1, CKR-5, p70S6K1-Alpha1, TNFalpha, il2Ralpha, Fas-isoform1, Syk-isoform1, proCaspase-8d, Caspase-8a, CTLA-4isoform1, IL-10, IL-4-isoform1, IL-12p40, ERK2-isoform1, icam1, proCaspase9alpha, Apo2L-isoform1, gelatinaseB, c-Met-isoform1, MDC, Bcl-2-alpa, c-Mycisoform1, RANTES, STAT3-isoform1, IL-6, TARC, MBP-Isoform1, TNFR1isoform1, cxcr4-isoform1, stromelysin1. Из этого списка в качестве гена,
перспективного для исследования взаимодействия с CD40 нами был выбран
ген IL2RA.
Выбор маркерных SNPs в гене IL2RA. Впервые IL2RA стали
рассматривать в качестве гена-кандидата, предрасполагающего к РС после
полногеномного анализа сцеплений, проведенного в 2003 году на 449 семьях,
которое выявило связь региона 10p15 с заболеванием [255]. Этот регион
содержит следующие гены: NET1, PRKCT, ITIH2, IL2RA, IL15RA, IT1H2,
hGATA3, KIAA0019. Учитывая, что продукт гена IL2RA стабилизирует
комплекс IL2R, включающий IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ(CD122) и IL-2Rγ
(CD132), и повышает его аффинность к IL2, Matesanz с соавт. предположили,
что именно IL2RA ассоциирован с РС. Однако в своем исследовании,
проведенном в 2006 году на 346 пациентах с РС и 413 контрольных людях,
им удалось выявить лишь слабую связь одного из четырех исследованных
полиморфных локусов (rs1570538, OR=1.23 (95%CI= 1.01–1.49, P = 0.04,
аллель риска T) [256]. Также на возможную ассоциацию IL2RA с РС указывал
факт успешного применения гуманизированных моноклональных антител к
IL-2Rα (daclizumab) против РС, опубликованный в 2006 году [257]. В 2007
128
году GWAS выявило связь c РС алелля С SNP rs12722489 гена IL2RA
(OR=1.25, 95%CI=1.11-1.36, P=3x10-8) [98]. В 2009 году еще два GWAS
выявили ассоциацию другого SNP гена IL2RA – rs2104286: OR=1.15,
95%CI=1.04-1.27, P=9x10-8 [118] и OR=1.16, P=7x10-6 [103]. Еще через два
года в GWAS была снова подтверждена связь IL2RA с РС: rs3118470[G]
(OR=1.12,
95%CI=1.10-1.13,
и
P=3x10-11)
rs7090512[G]
(OR=1.19,
95%CI=1.17-1.21, P=5x10-20) [258]. Также мета-анализ 7 ранее проведенных
GWAS выявил ассоциацию с РС rs12722489[C] (OR=1.23, P=4x10-8) [232].
Таким образом, к 2011 году была подтверждена роль IL2RA в патогенезе РС
на жителях Европы. Для исследования возможного взаимодействия генов
CD40 и IL2RA, мы выбрали два SNPs гена IL2RA: rs12722489 и rs2104286.
Исследование ассоциации с РС SNPs rs12722489 и rs2104286 гена
IL2RA. Нами были определены генотипы этих двух SNPs у пациентов с РС и
контрольной
группы.
Распределение
генотипов
соответствовало
распределению Харди-Вайнберга (Таблица 34). Мы провели логистический
регрессионный анализ с поправкой на пол и возраст. Оба SNPs
ассоциированы с РС у жителей РФ. Для обоих локусов аллель риска – частый
аллель. Для обоих SNPs полученные нами данные согласуются с
литературными, получена ассоциация для аллелей, ранее выявленных в
GWAS
для
rs12722489[G]
жителей
OR
Европы.
равнялся
Согласно
1.40,
нашим
результатам
95%CI=1.18-1.68,
P=2x10-4,
для
для
rs2104286[T] – OR=1.32, 95%CI=1.14-1.53, P=2x10-4.
Таблица 34. Результаты ассоциативного анализа с РС SNPs гена IL2RA
(rs12722489 и rs2104286) с развитием РС. Статистически значимые результаты
выделены курсивом.
SNP
rs12722489
rs2104286
Группа
РС
Кон-ль
РС
Кон-ль
G/G
1030
934
41
53
Генотип
G/A
226
282
320
335
A/A
10
21
874
682
HWE,
P
Аллель
0.63
1.00
0.09
0.16
G
1.40 [1.18-1.68]
P=0.0002
А
1.32 [1.14-1.53]
P=0.0002
OR [95% CI] P
129
Дополнительно мы оценили неравновесие по сцеплению между SNPs
rs12722489 и rs2104286. Данные SNPs находятся в неравновесии по
сцеплению в исследуемой нами популяционной группе: D’=0.937, R2=0.502,
χ2=976.05. Частоты гаплотипов составили: rs12722489[G]-rs2104286[A] 0.8121, rs12722489[G]-rs2104286[G] – 0.0058, rs12722489[A]-rs2104286[A] –
0.0748, rs12722489[A]-rs2104286[G] – 0.1072. Согласно данным HapMap для
европеоидов (панель CEU+TSI) был получен несколько более низкий
показатель R2=0.238, однако D’ был высоким и равнялся 1.0 (Рисунок 29).
Так как SNPs находятся в неравновесии по сцеплению, то для исследования
ассоциативного взаимодействия генов IL2RA и CD40, проводимого с
помощью метода логистической регрессии необходимо выбрать один SNP из
rs12722489 и rs2104286.
Рисунок 29 – Карта неравновесия по сцеплению между SNPs гена IL2RA
согласно данным проекта HapMap для европеоидов (панель CEU+TSI)
130
Для этого нами было построено три модели: общая модель (rs12722489 и
rs2104286) и две вложенных (учитывает только один SNP). Сравнение
проводили с помощью теста отношения правдоподобия.
Согласно результатам вложенная модель (rs12722489) не отличается от
общей модели (P=0.12), также как и вложенная модель (rs2104286) значимо
не отличается от общей (P=0.17). Это означает, что добавление любого
второго SNP в модель, не улучшает ее. Согласно критерию Акаике, общая
модель (AIC=2681.8) также уступает любой из вложенных моделей:
AIC=2681.6 (rs2104286) и AIC=2682.2 (rs12722489). Таким образом, для
исследования взаимосвязи можно выбрать любой из SNPs: rs12722489 и
rs2104286. Мы выбрали rs12722489, так как его генотип был определен у
большего числа пациентов с РС и контрольных пациентов.
Анализ ассоциативного генетического взаимодействия гена CD40
(rs6074022) и гена IL2RA (rs12722489). Исследование взаимодействия
полиморфных
локусов
мы
проводили
с
помощью
логистического
регрессионного анализа путем построения четырех моделей. Первая модель
включала только SNP rs6074022 гена CD40. Вторая модель включала только
SNP rs12722489 гена IL2RA. Третья модель включала оба SNPs. Четвертая
модель включала оба SNPs, а также учитывала их взаимодействие.
С помощью теста отношения правдоподобия мы сравнили третью
модель с двумя вложенными: первой (P=0.01) и второй (P=0.008). Согласно
полученным результатам можно заключить, что третья модель лучше любой
из вложенных, и исключение любого из SNPs статистически значимо
ухудшает ее. Однако сравнение тестом отношения правдоподобия третей
модели и четвертой модели, учитывающей взаимодействие полиморфных
локусов, не выявило различий (P=0.31). Дополнительно для всех четырех
моделей нами был вычислен коэффициент согласно критерию Акаике:
AIC(4)=2559.6, AIC(3)=2558.6, AIC(2)=2563.8, AIC(1)=2563.1. Из полученных
результатов видно, что наилучшей из четырех построенных моделей является
модель под номером три. Другими словами, знание генотипов SNPs обоих
131
генов, CD40 и IL2RA, помогает лучше описать ассоциацию с РС, однако
выявить взаимодействие этих двух генов в нашем исследовании не удалось.
2.5.2 FAS
Выбор первого гена для исследования. Согласно литературным
данным Fas система участвует в патогенезе РС. Еще 1996 году Dowling с
соавт. были зарегистрированы глиальные клетки, подвергающиеся клеточной
гибели [182], а в 1996 году D’Souza с соавт. показали in vitro, что
взаимодействие
Fas
и
Fas-L
вызывает
быстрый
лизис
мембраны
олигодендроцитов и последующую их гибель [183]. Апоптозный МП был
выявлен нами в ходе анализа молекулярных путей в базе данных
TRANSPATH® (Apo2L ->Caspase-8-> Caspase-3, Таблица 29), а также среди
МП в БД Генная онтология словаре биологические процессы (activation of
cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process (GO:0006919)
и activation of cysteine-type endopeptidase activity (GO:0097202), Таблица 31) и
словаре клеточные компоненты (Cytosol (GO:0005829) и CD95 death-inducing
signaling complex (GO:0031265), Таблица 32). Помимо непосредственной
гибели
олигодендроцитов
в
очаге
воспаления
(бляшке,
плакуле),
предполагают, что нарушения в апоптотическом пути может играть роль при
апоптотической элиминации аутореактивных Т клеток, отклонения в которой
приводят к развитию аутоиммунных заболеваний.
Выбор маркерного SNP гена FAS. Ассоциативных исследований
полиморфных локусов гена FAS с предрасположенностью к РС было
проведено немного [184,186,187], и полученные данные рознятся. Участие
гена FAS активно исследовалось в онкологических процессах. Недавно был
проведен крупный мета-анализ ассоциаций полиморфного локуса FAS-1377
G->A (rs2234767), по результатам которого была выявлена его ассоциация с
развитием рака [259]. Так как связь гена FAS с развитием рака
предположительно реализуется за счет нарушения апоптоза, как и для РС, и
для rs2234767 получены более однородные результаты в ассоциативных
132
анализах, то целесообразно исследовать ассоциацию SNP rs2234767 гена FAS
с РС.
Исследование ассоциации SNP rs2234767 гена FAS c РС у жителей
РФ. Исследование ассоциации SNP rs2234767 гена FAS с РС мы провели
на выборке общей численностью 2354 человека, из них 1341 пациент с РС
и 1013 человек контрольной группы (Таблица 35). Распределение
генотипов в обеих группах удовлетворяло равновесию Харди-Вайнберга
(P=0.89 и P=0.60, соответственно). Частота встречаемости минорного
аллеля А в контрольной группе составила 0.14, в группе пациентов с РС –
0.12. SNP rs2234767 гена FAS ассоциирован с РС: ORA=0.81, 95%C.I.=0.680.96, P=0.02. Так как нами была выявлена ассоциация SNP rs2234767 гена
FAS с РС у жителей РФ, то целесообразно провести сетевой анализ для
данного
гена
с
целью
выбора
генов-кандидатов
для
анализа
ассоциативного генетического взаимодействия гена FAS.
Таблица 35. Ассоциация rs2234767 гена FAS c развитием РС.
Генотип
Количество
контроль (всего = 1013)
РС (всего = 1341)
G/G
750
1046
G/A
241
276
A/A
22
19
HWE, P
ЧАР (аллель
риска = A)
0.60
0.89
0.14
0.12
OR (95% CI) p-value
0.81[0.68-0.96] P=0.02
Сетевой анализ гена FAS. Сетевой анализ гена FAS проводили
аналогичным образом, как и для гена CD40, с помощью модуля программы
geneXplain «Find master regulators with TRANSPATH®». Мы выявляли белки,
продукты генов из таблицы А2, расстояние до которых не превышает 4-х
шагов вниз (downstream) от белка целевого гена FAS. Результаты анализа
представлены на рисунке 30.
133
Рисунок 30 - Сетевой анализ гена FAS.
Выбор второго гена для исследования. Сетевой анализ выявил
широкий спектр белков, с которыми взаимодействует Fas. Среди белков,
134
расстояние до которых не превышает 4 шага от Fas, есть Apo2L-isoform1 и
DR5-L. Белок Apo2L кодируется геном TNFSF10, также известным как
TRAIL. Белок DR5-L кодируется геном TNFRSF10B, альтернативные
названия гена СD262 и TRAIL-R2. Как и Fas система, сигнальный путь
TRAIL/TRAIL-R2 запускает внешний путь апоптоза посредством активации
каспазы 8 и каспазы 10. Более того ряд исследований выявил, что
взаимодействия Fas/Fas-L и TRAIL/TRAIL-R2 могут запускать продукцию
провоспалительных цитокинов и хемокинов, как то IL-6, IL-8, CXCL1,
RANTES, IL-1β, TNFα, MCP-1. Известно, что IL-8 и MCP-1 привлекают
нейтрофилы и моноциты в очаг воспаления, тем самым усиливая иммунные
сигналы
[260].
Все
вышеизложенное
позволяет
предположить,
что
одновременное нарушение взаимодействия Fas/Fas-L и TRAIL/TRAIL-R2
может приводить к изменениям в воспалительных процессах и тем самым
влиять на предрасположенность к таким аутоиммунным заболеваниям, как
РС.
Выбор маркерных SNPs в генах TRAIL и TRAIL-R2. В 2011 году
было проведено исследование 59 полиморфных локусов в генах TRAIL,
TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4. Исследование проводили на
жителях двух городов Испании: Малага (РС=628 и контроль=660) и Мадрид
(РС=236
и
контроль=233).
Формально,
при
применении
поправки
Бонферрони, ни один из локусов данного исследования не ассоциирован с
РС, однако для трех полиморфных локусов была выявлена номинальная
ассоциация: rs4894559 (TRAIL; OR=1.34, 95%C.I.=[1.12-1.59], P=9.8x10-4,
аддитивная модель, аллель риска А), rs4872077 (TRAIL-R1; OR=1.72,
95%C.I.=[1.17-2.54], P=0.005, рецессивная модель, аллель риска С) и
rs1001793 (TRAIL-R2; OR=0.84, 95%C.I.=[0.73-0.96], P=0.012, аддитивная
модель, протективный аллель А) [261]. Для исследования взаимодействия
нами были выбраны два SNPs: rs4894559 (TRAIL) и rs1001793 (TRAIL-R2).
135
Исследование ассоциации с РС SNPs rs4894559 (TRAIL) и rs1001793
(TRAIL-R2). Нами были определены генотипы SNPs rs4894559 (TRAIL) и
rs1001793 (TRAIL-R2) у пациентов с РС и в контрольной группе (Таблица 36).
Таблица 36. Результаты ассоциативного анализа с РС SNPs rs4894559
(TRAIL) и rs1001793 (TRAIL-R2) с развитием РС. Статистически значимые
результаты выделены курсивом.
SNP
Группа
Генотип
HWE,
G/G
G/A
A/A
P
rs4894559
РС
497
283
53
0.15
(TRAIL)
Кон-ль
675
478
81
0.82
rs1001793
РС
1046
276
19
0.89
(TRAIL-R2)
Кон-ль
750
241
22
0.60
Аллель
OR [95% CI] P
A
0.87 [0.75-1.01]
P=0.06
А
0.92 [0.80-1.06]
P=0.25
Распределение генотипов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга
во обеих группах для каждого SNP. Частота редкого аллеля А SNP rs4894559
(TRAIL) в нашем исследовании составила 0.16 и совпадала с таковой в
исследовании
Lopez-Gomez
c
соавт.
[261].
Ассоциация
данного
полиморфного локуса с РС была близка к пограничному уровню
статистической значимости: OR=0.87, 95%C.I.=[0.75-1.01], P=0.06. Более
того в исследовании Lopez-Gomez c соавт. аллель А был выявлен как аллель
риска, в то время как в нашем исследовании данный аллель являлся
протективным аллелем.
Частота встречаемости редкого аллеля А SNP rs1001793 (TRAIL-R2) в
группе контроля составила 0.14. В исследовании Lopez-Gomez c соавт.
частота данного аллеля составляла 0.35 в контрольной группе. По данным
NCBI частота этого аллеля варьирует между популяциями в широких
пределах – от 0.20 до 0.84. Также в нашем исследовании в отличие от
исследования Lopez-Gomez c соавт. не было выявлено ассоциации SNP
rs1001793 (TRAIL-R2) с РС.
Таким образом, исследование взаимодействия SNP rs2234767 гена FAS
на наших данных мы можем провести только для SNP rs4894559 гена TRAIL.
136
Анализ ассоциативного генетического взаимодействия гена TRAIL
и гена FAS. Нами была выявлена ассоциация двух SNPs генов, участвующих
в каспазном сигнальном пути: rs4894559(TRAIL) и гена rs2234767(FAS). Для
анализа их взаимодействия нами были построены четыре модели и сравнены
с помощью теста отношения правдоподобий (Таблица 37).
Таблица 37. Результаты теста отношения правдоподобия при сравнении
разных моделей предрасположенности к РС в зависимости от SNPs
rs4894559(TRAIL) и rs2234767(FAS)
Модель
Модель
модель 1:
rs2234767(FAS)
модель 3:
rs4894559(TRAIL) и
rs2234767(FAS)
модель 2:
rs4894559(TRAIL)
P
0.33
0.004
модель 4:
взаимодействие
rs2234767(FAS) и
0.16
rs4894559(TRAIL)
Из полученных результатов можно сделать следующие выводы.
Добавление в модель 1, где учтен только один генетический предиктор rs2234767(FAS), дополнительного генетического предиктора не улучшает ее
(P=0.33). Более того, если из модели 3, учитывающей оба признака убрать
предиктор rs2234767(FAS), то модель становится статистически значимо
хуже (P=0.004). Таким образом, согласно нашим результатам rs2234767(FAS)
является более значимым предиктором развития РС, чем rs4894559(TRAIL).
Добавление в модель 3 в качестве предиктора взаимодействие этих двух
SNPs, модель 4, не улучшало ее прогностических характеристик (P=0.16).
Суммарно, нам не удалось выявить ассоциативного взаимодействия
генов каспазного сигнального пути, TRAIL и FAS, в формировании
предрасположенности к развитию РС.
137
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Характеристика выборки
В группу пациентов с РС вошло 1914 человек: 1315 женщин (68.7%) и
599 мужчин (31.3%). Средний возраст пациентов ± SD: 36.7±11.1 лет, самый
молодой пациент – 10 лет, самый пожилой – 85 лет, медиана – 35, нижний
(25%) и верхний (75%) квартили – 28 и 45 лет, соответственно. Средний
возраст манифестации заболевания – 27.6±9.3 лет (min=9 лет, max=65 лет),
нижний (25%) и верхний (75%) квартили – 20 и 34 лет. Средняя длительность
заболевания – 9.1±7.7 лет (min = менее года, max = 44 лет), медиана – 7 лет,
нижний (25%) и верхний (75%) квартили – 3 и 13 лет. У 1313 человек
ремитирующий тип течения (РРС), у 88 первично-прогрессирующий тип
течения (ППРС), у 471 вторично-прогрессирующий тип течения заболевания
(ВПРС) и у 42 пациентов был диагностирован дебют заболевания или
клинический изолированный синдром (КИС).
Пациенты были приглашены к участию в исследовании на базе
следующих организаций:
-Московский центр рассеянного склероза на базе Городской больницы
№11 (г. Москва), n=511;
- Центр рассеянного склероза на базе Государственной новосибирской
областной клинической больницы (г. Новосибирск), n=341;
-Омская областная клиническая больница (г. Омск), n=305;
-ГУЗ «Краевая клиническая больница» (г. Барнаул), n=246;
-Кемеровская областная клиническая больница (г. Кемерово), n=243;
- кафедра неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г.
Томск), n=167;
-Республиканская
больница
№2
Министерства
Республики Саха (Якутия) (г. Якутск), n=101.
Информация о пациентах с РС сведена в таблицу 38.
Здравоохранения
138
Таблица 38. Характеристики пациентов с РС и лиц, вошедших в группу
контроля.
Группа РС
Контрольная группа
Общее количество пациентов
1914
1792
Возраст (лет) (mean ± SD)
36.7±11.1
43.0±15.8
Возраст (лет) (медиана, верхний и нижний 35 (28; 45)
41 (30; 55)
квартили)
Возраст (лет) (минимальное и максимальное 10, 85
18, 84
значения)
Пол мужчины:женщины
599:1315
591:1201
ППРС/ВПРС/РРС/дебют и КИС
88/471/1313/42
-
Возраст манифестации (лет) (mean ± SD)
27.6±9.3
-
Возраст манифестации (лет) (медиана и 26.0
верхний и нижний квартили)
-
(20-34)
Возраст манифестации (лет) (минимальное и 9, 65
-
максимальное значения)
EDSS
(медиана
и
верхний
и
нижний 3.5 (2.0-4.5)
-
квартили)
Длительность заболевания (лет) (mean ± SD)
9.1±7.7
-
Длительность заболевания (лет) (медиана и 7.0 (3.0-13.0)
-
верхний и нижний квартили)
Длительность
заболевания
(лет) <1, 44
-
(минимальное и максимальное значения)
Скорость
прогрессирования
заболевания 0.45 (0.22-1.00)
-
(медиана и верхний и нижний квартили)
Наличие родственников с РС (%)
61 (3.2%)
Курение да/нет
194/1720
-
Диагноз РС выставлялся пациентам согласно критериям МакДональда
[262]. Все пациенты проходили стандартное обследование в клинике,
включающее
медицинскую
историю,
физическое
и
неврологическое
обследование, общую лабораторную диагностику и магнитно-резонансную
томографию мозга. Все пациенты проходили анкетирование для сбора
информации
о
демографическом
(возраст,
пол,
место
рождения,
139
национальность),
медицинском
(возраст
начала
РС,
тип
течения,
длительность заболевания балл по расширенной шкале оценки степени
инвалидизации (EDSS) [263]) и наследственном статусах пациентов (наличие
родственников, страдающих от РС).
В качестве контрольной группы выступали лица (n=1792) без
воспалительных заболеваний центральной нервной системы, проживающие в
г. Новосибирске (n=1462), г. Москве (n=128), г. Барнауле (n=118), г. Якутске
(n=62) и г. Омске (n=22). Всего в группу вошло 1201 женщина (67%) и 591
мужчин (33%). Средний возраст участников ± SD: 43.0±15.8 лет, самый
молодой – 18 лет, самый пожилой – 84 года, медиана – 41, нижний (25%) и
верхний (75%) квартили – 30 и 55 лет, соответственно (Таблица 38).
Все
участники
исследования
принадлежали
кавказоидной
расе.
Исследование одобрено локальными этическими комитетами. Все пациенты
и лица, вошедшие в контрольную группу, подписывали информированное
согласие на участие в эксперименте.
В таблице 39 указаны размеры выборок и количество человек по
регионам РФ в наших ассоциативных исследованиях.
Таблица 39. Размеры выборок и количество человек по регионам РФ в
наших ассоциативных исследованиях.
Омская область
Алтайский край
Томская область
Якутия
-
100
265
107
191
116
54
833
(rs10492972)
К
-
572
-
117
-
-
-
689
TNFa
РС
511
270
305
142
240
159
101
1728
(rs1800629)
К
128
785
22
118
-
-
62
1115
РС
507
-
-
100
-
-
-
606
К
120
209
-
100
-
-
-
429
РС
509
266
304
141
224
152
95
1691
HLA-DRB1
rs3135388
область
область
Всего
Московская область
РС
Кемеровская
Группа
KIF1B
Новосибирская
Ген (SNP)
Регион РФ
140
К
113
776
22
118
-
-
62
1091
РС
506
248
305
145
224
152
99
1679
К
112
567
22
118
-
-
60
879
IL2RA
РС
418
262
190
146
102
70
78
1266
(rs12722489)
К
78
970
17
113
-
-
59
1237
IL2RA
РС
349
247
216
165
98
95
65
1235
(2104286)
K
48
941
7
48
-
-
26
1070
FAS
РС
434
250
244
150
86
104
73
1341
(rs2234767)
K
31
833
11
118
-
-
20
1013
TRAIL
РС
98
171
206
136
79
94
49
833
(rs4894559)
К
72
987
14
105
-
-
56
1234
TRAIL-R2
РС
353
189
151
131
86
69
19
998
(rs1001793)
К
-
721
-
-
-
-
-
721
РС
511
341
305
246
243
167
101
1914
К
128
1462
22
118
-
-
62
1792
CD40
(rs6074022,
rs1883832,
rs1535045,
rs11086996)
Всего
3.2. Определение генотипов
3.2.1 Выделение ДНК
ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной
процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков
протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и
осаждение ДНК этанолом, как описано [264].
К 450 мкл, отобранным из клинического образца (5мл венозной крови),
добавляли 1 мл буфера, лизирующего клеточные стенки (10 мМ Tris HCl pH
= 8.0; 5 мМ MgCl2; 10 мМ NaCl), перемешивали и центрифугировали 15 мин
со скоростью 1 т.о./мин на центрифуге Eppendorf 5415C. Осадок
ресуспендировали в 300 мкл раствора №1 (100 мМ Tris HCl pH = 8.0; 10 мМ
ЭДТА, 100мМ NaCl). Добавляли 50 мкл раствора №2 (10% додецилсульфат
натрия (SDS)) и 10 мкл протеиназы К (10 мг/мл). Хорошо перемешивали и
инкубировали 1 час при 55°С. Добавляли 200 мкл фенола, уравновешенного
ТЕ, и 200 мкл хлороформа. Интенсивно перемешивали и центрифугировали
10 мин на максимальной скорости (14 т.о./мин) на центрифуге Eppendorf
141
5415C. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, не трогая нижнюю и
интерфазу.
Добавляли
400
мкл
хлороформа.
Перемешивали
и
центрифугировали 5 мин на максимальной скорости (14 т.о./мин) на
центрифуге Eppendorf 5415C. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку.
Добавляли 10 мкл ЛПААГ, 40 мкл 3М AcNa pH5.4, 800 мкл EtOH, тщательно
перемешивали. Инкубировали ночь на –20°С. Центрифугировали 15 мин на
максимальной скорости (14 т.о./мин) на центрифуге Eppendorf 5415C.
Супернатант удаляли, к осадку добавляли 400 мкл 75% EtOH. Инкубировали
10 мин при комнатной температуре. Отбирали супернатант, следя за тем,
чтобы осадок остался в пробирке. Сушили пробирки с открытыми крышками
в термостате при 37°С в течение 15 мин. К осадку добавляли 1 мл
дистиллированной воды и прогревали при 65°С 10 минут. Образцы ДНК
хранили в морозильной камере при температуре -18 − -20°С.
3.2.2 Анализ с помощью TaqMan-зондов
Генотипирование однонуклеотидных замен в генах TNFα (rs1800629),
KIF1B (rs10492972), CD40 (rs6074022, rs1883832, rs 1535045, rs11086996),
FAS (rs2234767), TRAIL (rs4894559), TRAIL-R2 (rs1001793), IL2RA (rs12722489
и rs2104286) и полиморфном локусе rs3135388 проводили с помощью ПЦР в
режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqManзондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Зонды отличаются
по структуре на один нуклеотид, соответствующий SNP (находится в центре
олигонуклеотидного
зонда).
Каждый
образец
амплифицировался
с
использованием пары праймеров и двух зондов, несущих «гаситель» на 3’конце и разные флюоресцентные красители (FAM либо R6G) на 5’-конце.
Структуры праймеров и зондов приведены в таблице 40. Общий объем
реакционной смеси при постановке на амплификаторе CFX96 составлял 25
мкл, смесь содержала 40-100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100-200
нМ Taqman-зондов, коньюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ-ные dNTP,
амплификационный буфер (65 мМ Tris-HCl (рН 8,9), 24 мМ сульфат
аммония; 3,5 мМ MgCl2; 0,05%-ный Tween-20), термостабильную Taq-
142
полимеразу – 0,5 ед.акт./реакц. Общий объем реакционной смеси при
постановке на амплификаторе CFX384 составлял 5 мкл, смесь содержала 40100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100-200 нМ Taqman-зондов,
коньюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ-ные dNTP, амплификационный
буфер (65 мМ Tris-HCl (рН 8,9), 24 мМ сульфат аммония; 3,5 мМ MgCl2;
0,05%-ный Tween-20), термостабильную Taq-полимеразу – 0,5 ед.акт./реакц.
Таблица 40. Структуры праймеров и зондов, используемых для
генотипирования в режиме реального времени методом конкурирующих
TaqMan-зондов.
Локус
Праймеры
Зонды
KIF1B
(rs10492972)
5’-GGTGGTGAGTTTTGAATTGGTAC-3’
5’-FAM- CGCTACAATTCTTCTGGTCAGG-3’
5’-AAAAAGTTATGTGGCCAGGATAG-3’
5’-R6G-CGCTACAATTCTCCTGGTCAGG-3’
TNFα
(rs1800629)
5’-TTCCGAGGGGGGTCTTCTG-3’
5’-FAM-CCCGTCCTCATGCCC-BHQ-3’
5’-GTTCTATCTTTTTCCTGCATCCTGT-3’
5’-R6G-CCCGTCCCCATGCCC-BHQ-3’
CD40
(rs6074022)
5’-ATACGGACTTCTCCATAGGCTG-3’
5’-FAM-CTGCCATGTCATGAGGACAC-BHQ-3’
5’-CCCTGCACTGTCTCCAGG-3’
5’-R6G-CTGCCATGTCGTGAGGACAC-BHQ-3’
5’- CCAGTGGTCCTGCCGCCT-3’
5’-FAM-CGAACCATAGCGAGGTGA-BHQ-3’
(rs1883832)
5’- TCAGCAAGCAGCCTCAGAG-3’
5’-R6G-CGAACCATGGCGAGGTGA-BHQ-3’
CD40
(rs1535045)
5’-AATGGCTCTTAGGGAACAGG-3’
5'-FAM-CCAGCTCCACCCTCCCC-BHQ-3'
5’-CTTTCTCCACTCCTACCACAAG-3’
5'-R6G-CCAGCTCCGCCCTCCCC-BHQ-3'
CD40
(rs11086996)
5'-ATCGTCGGGAAAATTGATCTC-3'
5'-FAM-CCAGGCCCCCCACCCC-BHQ-3'
5'-GGTGACCTCACACCTTGCC-3'
5'- R6G-CCAGGCCGCCCACCCC-BHQ-3'
FAS
(rs2234767)
5’-CCACCTTTCAGTAGACTGTTAGTG-3’
5’-FAM-CTGGCACACCCAGGGTC-3’
5’-TGTGTCTATTAGATGCTCAGAGTG-3’
5’-R6G-CTGGCACGCCCAGGGTC-3’
TRAIL
(rs4894559)
5’-GATTCTAGTTACTGATCTGATTTCTACTC3’
5’-FAM-CCATGTTGCCACTAGA-BHQ1-3’
5’-GTGTTTAAGGTCTCTACCAATAAATC-3’
5’-BHQ1ATCTGAATGCTGTCTCATTAAATGTTTACACPO4-3’
5’-FAM-AGTTTTGCAAGTGTATGT-BHQ1-3’
CD40
TRAIL-R2
(rs1001793)
5’-CCCACATTTTCTGGAATGAAC-3’
5’-R6G-AGTTTTGCAGGTGTATGT-BHQ1-3’
5’-CACCTCTCAAACATCCTTTAGTG-3’
IL2RA
(rs12722489)
5’-CAAGTAAACTCGTGTTATTTCTAGC-3’
5’-GAGGAGGAGAAAGGCATAGATA-3’
5’-BHQ1-CTTGGAGGGAGCAGGGGAACTAGPO4-3’
5’-FAM-CACAAGTCATATGTGGTA-BHQ1-3’
5’-R6G-CACAAGTCGTATGTGGTA-BHQ1-3’
5’-CTTTCCATGTCACCCTCATG-3’
rs3135388
5’-BHQ1-ACTTGGCCTTCCCTGAAATATGAAGPO4-3’
5’-FAM-CCAAGGATCTGAGTGG-BHQ1-3’
5’-R6G-CCAAGGGTCTGAGTGG-BHQ1-3’
5’-GAGAATGGCGTGAAGGAGTC-3’
IL2RA
(rs2104286)
5’-R6G-CCATGTTGCCGCTAGA-BHQ1-3’
5'-GCATTCTGAGATCCATACCTTG-3'
5’-BHQ1GATCTACTGAGCATGGGGCTATCAGAG-PO4-3’
5'-R6G-CAAACCAACCCCACTTTAG-BHQ-3'
5'-GTTGTGGTCTAGTCCTCATCAG-3'
5'-FAM-CAAACCAATCCCACTTTAG-BHQ-3'
143
Амплификацию проводили с помощью амплификатора CFX96 (Bio-Rad,
США) в следующих условиях: начальная денатурация 3’ при 96 °С; затем 40
циклов, включающих денатурацию при 96°С-10 сек, отжиг праймеров и
последующую элонгацию при 60°С- 40 сек (каждый шаг сопровождался
регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующим
интервалам
флюоресценции
флюорофоров
FAM
и
R6G).
Также
амплификацию проводили с помощью амплификатора и CFX384 (Bio-Rad,
США) в следующих условиях: начальная денатурация 3’ при 96 °С; затем 40
циклов, включающих денатурацию при 96°С-10 сек, отжиг праймеров и
последующую элонгацию при 60°С- 40 сек (каждый шаг сопровождался
регистрацией флюоресцентного сигнала в диапазонах, соответствующим
интервалам флюоресценции флюорофоров FAM и R6G).
Рисунок 30 - Кривые накопления флюоресценции для трех генотипов локуса
rs12722489 (IL2RA) и результаты кластеризации образцов в группы на
основании интенсивности флюоресценции. А) генотип G/G, Б) генотип A/A,
В) генотип G/A, Г) кластеризация образцов.
144
На рисунке 30 в качестве примера представлены кривые накопления
флюоресценции и кластеризация образцов на основе интенсивности
флюоресценции для полиморфного локуса rs12722489 (IL2RA).
3.2.3 Аллельный дисбаланс с помощью ПЦР-ПДРФ анализа
Определение генотипа полиморфного локуса rs1883832 гена CD40 для
выявления аллельного дисбаланса проводили методом ПЦР-ПДРФ анализа.
Нами были разработаны фланкирующие праймеры (Таблица 41). Для
контроля полноты прохождения рестрикции в структуры используемых
праймеров были введены дополнительные неполиморфные сайты узнавания
эндонуклеаз рестрикции.
ПЦР проводили в конечном объеме 15 мкл, содержащем 65 мМ Tris-HCl
(рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 3,5 мМ MgCl2; 0,05%-ный Tween-20; 0,2
мM dNTP; 0,2 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 20-100 нг кДНК
и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Каждая реакционная смесь была покрыта
40 мкл минерального масла. ПЦР проводилась на амплификаторе “BioRad” с
начальной денатурацией при 95оС 2 мин, далее в течение 33 циклов при
следующих режимах: денатурация-95оС 20 сек; отжиг праймеров – 20 сек при
60 оС, элонгация – 20 сек при 72оС. Финальная элонгация проводилась при
72оС.
Таблица 41. Структуры олигонуклеотидных праймеров и температура
их отжига, длина амплификационного фрагмента и длины получаемых
rs1883832
5’-CCAGTGGTCCTGCCGCCT-3’
78
5’-TCAGCAAGCAGCCCCATGGGA 3’
Для
проведения
фрагментов,
ПДРФ-анализа
рестрикцию
C
T
полученных
осуществляли
60
Длины
реестрикционных
фрагментов, п.
н.
Аллели
Структура
олигонуклеотидных
праймеров
Длина
амплификационного
фрагмента,
п. н.
Локус
Тотж праймеров, оС
фрагментов
31+25+14+4+4
60+14+4
амплификационных
следующим
образом.
К
амплификационной смеси добавляли 2 мкл 10х буфера для рестрикции
(White, СибЭнзим), 3 мкл дистиллированной воды и эндонуклеазу
145
рестрикции Bsp19I (1-3 ед. акт. фермента) и инкубировали 2 часа при 37˚С.
Буфер для рестрикции использовали с учетом рекомендаций производителя
эндонуклеазы рестрикции.
Анализ продуктов гидролиза проводили в 10% неденатурирующем
полиакриламидном
геле,
гель
окрашивали
бромистым
этидием
с
визуализацией ДНК УФ-светом, затем фотографировали с помощью
цифровой фотокамеры.
3.2.4 Аллельный дисбаланс с помощью Real-Time PCR
Для моделирования образцов с заведомо известным соотношением
аллелей Т и С полиморфного локуса rs1883832 нами были отобраны две
ДНК, гомозиготных по локусу rs1883832: С/С и T/T. Далее концентрации
двух этих ДНК были выравнены с помощь ПЦР в режиме реального времени.
Определение концентрации ДНК в образцах
Концентрация
ДНК
в
образцах
была
определена
методом
количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием
TaqMan-зонда.
Для
этого
была
использована
тест-система,
ранее
разработанная в Лаборатории фармакогеноми ИХБФМ СО РАН. ПЦР
проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 65 мМ Трис-HCl (рН 8.9),
24 мМ сульфат аммония; 3.5 мМ MgCl2; 0.01%-ный Tween 20; 0.2 мМ dNTP;
0.3 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров: 5’-tgtagccctggtcagactg-3’,
5’-cttgatgctctcgctctttcg-3,
0.1
мкМ
раствор
TaqMan-зонда:
5’-R6G-
ctgccgctgctcctcctcg-BHQ-3’, 0.06-44 нг ДНК и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы,
на ДНК-амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США). Олигонуклеотидные
праймеры, TaqMan-зонды, dNTP и Taq-ДНК-полимераза были синтезированы
в ИХБФМ СО РАН. Протокол ПЦР: 96°С - 3 мин, далее в течение 50 циклов:
96°С - 10 с, 60°С - 40 с. Каждый исследуемый образец предварительно
разводили в 30 и в 60 раз (чтобы минимизировать влияние возможных
ингибиторов ПЦР) и анализировали в трех повторах для каждой
концентрации.
В
качестве
референтого
образца
для
построения
калибровочной кривой (Рисунок 31) использовали один из образцов выборки,
146
концентрация которого была предварительно измерена на приборе NanoDrop
ND-2000 («Thermo Fisher Scientific», США) после обработки рибонуклеазой
крупного рогатого скота («Реахим», Россия).
Рисунок 31 - Калибровочная кривая для определения концентрации ДНК в
образцах методом количественной ПЦР в режиме реального времени.
Последовательные разведения референтого образца в 3 раза. E –
эффективность ПЦР, R*2 – коэффициент корреляции, RFU – относительные
единицы флюоресценции.
Выравнивание концентрации ДНК в образцах
После определения концентрации ДНК в каждом образце, путем серии
последовательных разведений концентрации были выровнены (Рисунок 32).
Рисунок 32 – Выравнивание концентрации ДНК образцов, гомозиготных по
локусу rs1883832: С/С и T/T. E – эффективность ПЦР, R*2 – коэффициент
корреляции, RFU – относительные единицы флюоресценции.
Приготовление образцов ДНК с заведомо известным соотношением
аллелей Т и С SNP rs1883832 проводили путем смешивания двух образцов,
гомозиготных по локусу rs1883832 (С/С и T/T) согласно схеме:
- 0% аллеля T (50 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
- 12,5% аллеля T (6.25 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (T/T)
и 43.75 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
147
- 25% аллеля T (12.5 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (T/T) и
37.5 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
- 37.5% аллеля T (18.75 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 и
(T/T) 31.25 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
- 50% аллеля T (25 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (T/T) 25
и мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
- 62.5% аллеля T (31.25 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 и
(T/T) 18.75 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
- 75% аллеля T (37.5 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (T/T) и
12.5 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
- 87.5% аллеля T (43.75 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 и
(T/T) 6.25 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (C/C));
- 100% аллеля T (50 мкл ДНК гомозиготной по локусу rs1883832 (T/T)).
Полученные образцы были использованы в качестве стандарта при
измерении количества аллеля Т в исследуекмых образца кДНК.
3.2.5 Аллельный дисбаланс с помощью Digital PCR
Выявление аллельного дисбаланса с помощью цифровой ПЦР (Digital
PCR) проводили на платформе QX100™ Droplet Digital™ PCR System (BioRad, США) согласно инструкциям фирмы-производителя. Для этого
готовили 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей исследуемую ДНК (<66 нг на 20
мкл), 1X ПЦР-смесь (Bio-Rad), 300 нМ олигонуклеотидные праймеры (5’CCAGTGGTCCTGCCGCCT-3’, 5’- TCAGCAAGCAGCCTCAGAG-3’) и 100
нМ Taq-man зонды (5’-FAM-CGAACCATAGCGAGGTGA-BHQ-3’, 5’-R6GCGAACCATGGCGAGGTGA-BHQ-3’). Для получения микрокапель 20 мкл
приготовленной ПЦР-смеси и 70 мкл масла для генерации капель помещали
в соответствующие лунки картриджа DG8. 40 мкл полученных микрокаплей
переносили в 96-луночную ПЦР плашку, запечатывали фольгой и помещали
в амплификатор. Программа амплификации: 96оС – 10 мин и далее 50 циклов
96оС – 15 сек, 60оС – 40 сек с финальным прогревом в течение 10 мин при
98оС. После это микрокапли подвергали считыванию с помощью прибора
148
Droplet Reader, полученные данные обрабатывали в программе QuantaSoft
(Bio-Rad, США).
3.2.4 Определение аллелей HLA-DRB1 с помощью секвенирования
Первым этапом секвенирования HLA-DRB1 была аллель-специфичная
амплификация, которая выявляла группы аллелей локуса (группа A: HLADRB1*03, HLA-DRB1*08, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*13, HLA-DRB1*14,
HLA-DRB1*12 аллели; группа B: HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*04, HLADRB1*09,
HLA-DRB1*07,
Амплификация
для
использованием
HLA-DRB1*15,
определения
прямых
группы
HLA-DRB1*16
аллелей
праймеров
аллели).
проводилась
(Group-A
с
(5’-
AGCACGTTTCTTGGAGTAC-3’) и Group-B (5’-CACGTTTCTTGTGGCAG3’)), различных по структуре для каждой группы аллелей, и общим обратным
праймером
(DRB-3i
(5’-CTCGCCICTGCACIGTIAAGC-3’)).
осуществляли
в реакционной
смеси объемом
ПЦР
25 мкл, содержащей
амплификационный буфер (C25), 0.2 мM dNTP, 300 нМ каждого праймера,
40-100 нг ДНК и 0.5 ед.акт./реакц. Taq-ДНК-полимеразы. Каждую
реакционную смесь покрывали 40 мкл минерального масла. ПЦР проводили
на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология). Амплификация была
выполнена при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин. при
96°С; затем 45 циклов, включающих денатурацию при 96°С-10 сек, отжиг
праймеров при 62°С – 10 сек и последующую элонгацию при 60°С- 40 сек.
Детекция амплификационных фрагментов проводилась в 7% ПААГ. Для
визуализации ДНК гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали
в УФ - свете с помощью цифровой фотокамеры.
Очистка амплификационных фрагментов
Очистка амплификационных фрагментов проводилась с помощью
колонки, заполненной акрилексом П10. Предварительно колонку промывали
водой - три раза по 40 мкл, каждый раз центрифугируя в течение 15 секунд
при 5 000 оборотов в мин (Eppendorf 5415C). После чего, на колонку
наносили амплифицированный фрагмент и центрифугировали в течение 15
149
секунд при 5 000 оборотов в мин. Очищенный амлификационный фрагмент
собирали в новые пробирки.
Амплификация по Сенгеру
Амплификация по Сенгеру проводилась в конечном объеме 10 мкл.
Реакционная смесь содержала 1-1.5 пмоль ДНК, 1 пмоль праймера и 4 мкл
смеси из набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit.
Реакцию Сэнгера осуществляли на амплификаторе Eppendorf в следующем
температурном режиме:
а) 1 цикл - 960С 20 сек;
б) 2 цикла - 960С 10 сек, 640С 4 мин;
в) 4 цикла - 960С 10 сек, 600С 4 мин;
г) 12 циклов - 960С 10 сек, 500С 7 сек, 600С 4 мин.
Объем смеси после прохождения реакции доводили водой до 40 мкл,
затем добавляли 45 мкл изопропанола. Смесь оставляли на 10-15 минут при
комнатной температуре, после чего центрифугировали 12 минут при 14000
об./мин (Eppendorf 5415C). Затем отбирали супернатант, к осадку добавляли
180 мкл этанола и центрифугировали 3 минуты при 14000 об./мин (Eppendorf
5415C).
После
центрифугирования
супернатант
отбирали,
осадок
высушивали при 37°С. Подготовленные образцы сдавали для анализа в
Межинститутский
центр
секвенирования
ДНК.
Полученная
последовательность для определения аллеля сравнивалась с референсной из
базы
BLAST
Assembled
RefSeq
Genomes
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
3.3 Статистическая обработка данных
Описательная статистика, как то вычисление среднего, стандартного
отклонения (SD), максимального и минимального значения выборки,
медианы, нижнего (25%) и верхнего (75%) квартилей была выполнена с
помощью программы STATISTICA 8.0 (StatSoft, Inc.).
Равновесие Харди-Вайнберга
150
Для контроля результатов генотипирования случайной выборки особей
из
популяции
использовали
тест
на
равновесие
Харди-Вайнберга.
Отклонение от равновесия Харди-Вайнберга (P<0.05) сигнализирует о том,
что исследуемая выборка смещена или метод определения генотипов
ненадежен. Когда методы анализа генетического полиморфизма были менее
совершенными, чем сегодня, «Ошибка генотипирования» являлась серьезной
проблемой. Точный тест Фишера на соблюдение распределения генотипов
равновесию Харди-Вайнберга проводили с помощью он-лайн доступной
программы на сайте Института генетики человека (http://ihg2.helmholtzmuenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl).
Ассоциативный анализ с заболеванием
Анализ ассоциации генотипов с заболеванием проводили методом
логистического регрессионного анализа с поправкой на пол и возраст
обследования с помощью функции “glm” программы R (www.r-project.org).
Логистический
регрессионный
анализ
устанавливает
связь
между
несколькими независимыми переменными, предикторами, и зависимой
бинарной переменной, которая в ассоциативных исследований дизайна
«случай-контроль» равна 1 для пациентов с заболеванием и 0 для людей из
контрольной группы.
𝑃̂(𝑦𝑖 = 1)
̂
(𝑦
𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡 (𝑃 𝑖 = 1)) = 𝑙𝑜𝑔𝑒 (
)=
1 − 𝑃̂(𝑦𝑖 = 1)
̂1 пол + β
̂2 возраст + β
̂3 xi (SNP1),
µ̂ + β
(9)
Нахождение коэффициентов логистической регрессии, µ, β1, β2, β3,
осуществляли методом максимального правдоподобия. В качестве базовой
модели исследовали аддитивную модель наследования признака, при
которой гомозигота по аллелю риска закодирована «2», гетерозигота – «1»,
гомозигота по референсному аллелю – «0». Отношение шансов (OR) и его
доверительный интервал (95%C.I.) вычисляли по формулам:
̂
𝑂𝑅 = 𝑒 𝛽3 ,
(10)
̂
95%𝐶. 𝐼. = 𝑒 (𝛽3±𝑆𝐸𝛽3) ,
(11)
151
Ассоциативный анализ с возрастом начала заболевания
Для SNP rs10492972 гена KIF1B нами был выполнен ассоциативный
анализ с возрастом начала заболевания. Анализ проводили методом
линейной регрессии с помощью функции “glm” программы R (www.rproject.org).
̂1 пол + β
̂2 xi (SNP1),
𝑦 = µ̂ + β
(12)
Где у – возраст начала заболевания в годах. Модель наследования
принака аддитивная. Нахождение коэффициентов регрессии, µ, β1, β2,
осуществляли методом максимального правдоподобия.
Тест отношения правдоподобия (LRT) был использован для сравнения
построенных моделей: общей и частных, с целью выбора маркерного SNP,
наиболее значимо ассоциированного с заболеванием. Общая модель:
𝑃̂(𝑦𝑖 = 1)
̂
𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡 (𝑃(𝑦𝑖 = 1)) = 𝑙𝑜𝑔𝑒 (
)=
1 − 𝑃̂(𝑦𝑖 = 1)
̂1 пол + β
̂2 возраст + β
̂3 xi (SNP1) + β
̂4 xi (SNP2),
µ̂ + β
Частные
модели
для
каждого
из
SNP
определяли
(13)
фиксацией
соответствующего коэффициента регрессии: β4=0 для модели, учитывающей
только SNP1, и β3=0 для модели, учитывающей только SNP2. Для проведения
теста вычисляли статитстику
𝐿𝑅 = 2(𝑙𝐿 − 𝑙𝑆 ),
(14)
где lL и lS - значения логарифмической функции правдоподобия общей и
частной моделей, соответственно. Статистика LR при нулевой гипотезе
имеет распределение χ2(q) c q степенями свободы. В нашем исследовании
q=1.
Информационный критерий Акаике (AIC) был использован для
выбора наилучшей модели. AIC применятся для выбора наилучшей из
нескольких конкурирующих моделей, при условии, что модели настраивали
методом максимального правдоподобия [265]. AIC вычисляется по формуле
Х:
𝐴𝐼𝐶 = −(2) log(𝐿) + 2 (𝑘),
(15)
152
где L – максимизированное значение функции правдоподобия модели, k
– число параметров в статистической модели. В качестве наилучшей модели
следует выбирать модель с наименьшим значением AIC.
Мета-анализ и оценка гетерогенности контрольных групп по
частоте встречаемости аллеля были проведены с помощью функции
meta.summaries
пакета
«rmeta»
программы
R
(http://cran.r-
project.org/web/packages/rmeta/rmeta.pdf) методом обратной дисперсии. Для
каждого из N исследований учитывали оценку эффекта βi (ln(OR) для метаанализа; pi - частоту аллеля для Q-теста) и стандартную ошибку оценки SEi
(SEβi для мета-анализа; SE(pi) для расчета гетерогенности популяций). SE(pi)
вычисляли по формуле:
SE(pi ) = √
𝑝𝑖 (1−𝑝𝑖 )
,
2𝑛𝑖
(16)
где pi - частота аллеля в группе i, а ni – количество людей в группе i.
Вес исследования определяли как
1
ωi =
SEi
,
(17)
Совместную оценку эффекта
𝛽=
∑N
i=1 ωi β
∑N
i=1 ωi
,
(18)
,
(19)
Совместную стандартную ошибку
𝑠 2 = ∑N
1
i=1 ωi
Значение Z-теста
β
∑N
i=1 ωi β
𝑠
√∑N
i=1 ωi
𝑍= =
Анализ
гетерогенности
данных,
,
включенных
(20)
в
мета-анализ,
выполняли с помощью теста Кохрана (Q-тест), реализованного в функции
meta.summaries пакета «rmeta» программы R.
Реконструкция гаплотипов была выполнена методом максимального
правдоподобия, оценку частот гаплотипов выполняли с помощью EMалгоритма (Expectation-maximization algorithm). Для диаллельных маркеров
153
расчеты проводили с помощью функции haplo.cc пакета «haplo.stats»
программы R (http://cran.r-project.org/web/packages/haplo.stats/haplo.stats.pdf);
для полиалллельных с помощью функции gc.em пакета «gap» программы R
(https://cran.r-project.org/web/packages/gap/gap.pdf).
Тестирование ассоциации гаплотипов с бинарным признаком
осуществляли
функции
построением
haplo.glm
регрессионной
пакета
модели
с
использованием
‘haplo.stats’ программы R
(http://cran.r-
project.org/web/packages/haplo.stats/haplo.stats.pdf). Данный метод выполняет
итеративный
двухступенчатый
где
EM-алгоритм,
апостериорные
вероятности гаплотипов используются в качестве весов для обновления
коэффициентов регрессии, а коэффициенты регрессии используются для
обновления
апостериорных
вероятностей.
Алгоритм
выполняется
до
сходимости.
Неравновесие по сцеплению
Параметры неравновесия по сцеплению (r2, D и D’) нами были
посчитаны с помощью функций LDlk и LD22, реализованных в библиотеке
«gap» программы R (https://cran.r-project.org/web/packages/gap/gap.pdf).
Величину D, измеряющую гаметическое неравновесие, вычисляли по
формуле:
DAB=pAB-pApB [266],
(21)
Коэффициент r2 по формуле [267]:
r2 =
DAB 2
,
pA (1−pA )pB (1−pB )
(22)
Величина D’ была предложена в 1964 Lewontin как альтернативная D и
представляет собой нормализованную величину D, она варьирует от -1 до 1,
интерпретируется аналогично коэффициенту корреляции, но главным ее
преимуществом является то, что она подходит для измерения неравновесия
по сцеплению между локусами с большой разницей в частоте встречаемости
редкого аллеля. Величину D’ вычисляли по формуле:
𝐷′𝐴𝐵 =
𝐷𝐴𝐵
𝐷𝑚𝑎𝑥
,
(23),
154
где Dmax=min[pApB, (1-pA)(1-pB)], если DAB<0 и Dmax=min[pA(1-pB), pB( 1pA)], DAB>0 [268]. Строго говоря, D’ и r2 будут давать схожие результаты для
локусов, частоты редких аллелей которых примерно похожи. Величина r2= 1
может быть получена только для локусов с одинаковой частотой редких
аллелей.
Стратифицированный анализ
Нами был выполнен стратифицированный анализ для SNPs гена CD40:
rs1883832, rs1535045, rs11086996 и rs6074022. В качестве страт выступали
города. Анализ выполняли путем мета-анализа методом обратной дисперсии
с помощью функции meta.summaries пакета «rmeta» программы R.
Мощность исследования оценивали с помощью он-лайн доступной
программы
на
сайте
Genetic
Power
Calculator
(http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/gpc/).
Анализ
эффекта
относительной
предрасположенности
(RPE)
выполняли согласно описанию автора Thomson [221]. При анализе эффекта
относительной
предрасположенности
последовательно
сравниваются
частоты аллелей полиаллельного локуса у пациентов и в контрольной группе,
чтобы определить их предрасполагающий или протективный эффект
относительно
друг
друга.
Процедура
анализа
следующая.
Частота
встречаемости аллелей в группе пациентов сравнивается с таковой в
контрольной группе с помощью теста χ2 для выявления статистически
значимых отклонений. Для определения аллеля, имеющего наибольший
эффект, анализируется вклад каждого индивидуального аллеля в общую
величину χ2 по формуле 20.
𝜒 2 = ∑N
𝑖=1
(наблюдаемое−ожидаемое)2
ожидаемое
,
(24)
В качестве величины наблюдаемое берется количество аллеля в группе
пациентов; всего аллелей 2N, где N – число пациентов. В качестве
ожидаемого берется расчетная величина аллелей в группе контроля,
вычисленная по формуле 21. Расчет выполняется исходя из предположения,
155
что количество людей в группе контроля равно N, а частота аллеля
соответствует экспериментально измеренной частоте.
ожидаемое = частота × 2 × 𝑁 = 0.1407 × 2 × 99 = 27.86,
(25)
Процедура повторяется для выявления следующего аллеля с двумя
условиями: 1) аллель, выявленный в предыдущем раунде удаляется из
группы контроля и пациентов, 2) ожидаемая частота распределения аллелей в
контрольной группе нормализуется в соответсвии с новой величиной размера
группы. Процедура повторяется до тех пор, пока общая величина χ2 станет
статистически незначимой.
Линейная регрессия была использована для построения уравнения
зависимости конечных значений кривых накопления флуоресцентного
сигнала от начального процентного количества аллеля Т в стандартном
образце. Анализ проводили методом линейной регрессии с помощью
функции “glm” программы R (www.r-project.org).
̂1 𝑋,
𝑅𝐹𝑈 = µ̂ + β
(26)
Где Х – это % аллеля Т в стандартном образце. Нахождение
коэффициентов регрессии, µ, β1, β2, осуществляли методом максимального
правдоподобия.
Анализ ТФ промоторного района гена CD40 проводили с помощью
базы
данных
GTRD,
доступной
он-лайн
(http://gtrd.biouml.org/bioumlweb/#anonymous=true&perspective=GTRD).
Выявление молекулярных путей и сетевой анализ вовлеченных в
патогенез РС, проводили с помощью программной платформы geneXplain
(http://genexplain.com/genexplain-platform-1).
Результаты считали статистически значимыми, если P < 0.05. Выбор
молекулярных путей проводили на основании порога значимости Padj< 0.01.
Анализ взаимодействия генов. Исследование взаимодействия генов
мы проводили с помощью логистического регрессионного анализа с
поправкой на пол и возраст обследования путем построения четырех
156
моделей: общей и трех частных. Общая модель включала оба полиморфных
локуса, а также учитывала их взаимодействие:
𝑃̂(𝑦𝑖 = 1)
𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡 (𝑃̂(𝑦𝑖 = 1)) = 𝑙𝑜𝑔𝑒 (
)=
1 − 𝑃̂(𝑦𝑖 = 1)
̂1 пол + β
̂2 возраст + β
̂3 xi (SNP1) + β
̂4 xi (SNP2) + β
̂5 xi (SNP1) ×
µ̂ + β
xi (SNP2),
(27)
Частную модель, учитывающую только влияние SNP1, определяли
фиксацией β4= β5=0; влияние SNP2 – фиксацией β3= β5=0; влияние двух SNP1
и SNP2 без учета их взаимодействия – фиксацией β5=0. В каждой модели
генотипы полиморфного локуса закодированы в соответствии с тем, какая
ассоциативная модель данного локуса с РС была признана наилучшей с
помощью AIC: генотипическая, аддитивная, доминантная или рецессивная. С
помощью теста отношения правдоподобия (LRT) мы сравнили общую
модель с частными. В случае если общая модель признавалась по
результатам
теста
более
хорошей,
то
взаимодействия, в противном – об отсутствии.
делали
вывод
о
наличии
157
Выводы
1. Исследование, проведенное на выборках ДНК от пациентов и условно
здоровых
контролей
русской
этнической
группы, проживающих
на
территории Западной Сибири и Якутии не выявило ассоциации с РС
полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B, в то время как по результатам
мета-анализа, включающего 10054 пациентов с РС и 9193 участника
контрольной группы, показано, что аллель С полиморфного локуса
rs10492972 гена KIF1B является статистически значимым протективным
фактором развития РС.
2. Для полиморфного локуса -308G>A гена TNFa не реплицирована
ассоциация с РС; HLA-DRB1*15 аллель - фактор риска развития РС, HLADRB1*01 и *14 - протективные факторы в русской этнической группе. На
примере
русской
этнической
группы
показано,
что
ассоциация
полиморфного локуса -308G>A гена TNFa, ранее идентифицированная при
исследовании выборок малого размера, является наведенной
от HLA-
DRB1*15.
3. Подтверждена ассоциация РС с полиморфными локусами rs6074022 и
rs1883832
гена
CD40
в
исследуемой
популяции.
Показано,
что
функциональный локус гена CD40 лежит выше старта трансляции гена. In
silico показано, что сайты связывания транскрипционных факторов VDR,
STAT3, IRF-4 – могут быть вовлечены в регуляцию экспрессии гена CD40,
изменения которых в силу полиморфизма гена, вероятно, будут приводить к
повышенному риску развития РС. In vitro показано, отсутствие аллельного
дисбаланса для гена CD40 в качестве потенциального молекулярного
механизма реализации ассоциированных аллельных вариантов гена.
4. В результате интегрального анализа опубликованных к настоящему
моменту данных о генетике РС выявлено четыре группы молекулярных
путей, вовлеченных в патогенез РС: пролиферация, дифференциация B и Т
клеток; апоптоз; синтез и метаболизм витамина D3; передача сигналов
интерлейкинами.
158
5. На основании анализа сигнальных путей, включающих продукт гена
CD40, и сформированного в процессе исследования списка ассоциированных
с РС генов выбран наиболее перспективный ген (IL2RA) для анализа
взаимодействия ассоциаций; верифицирована ассоциация с РС полиморфных
локусов
rs12722489
и
rs2104286
на
русской
этнической
группе.
Взаимодействия генов CD40 и IL2RA в нашем исследовании не выявлено.
6. Впервые выявлена ассоциация полиморфного локуса rs2234767 с РС
в русской этнической группе и проведен анализ сигнальных путей для гена
FAS, на основании которого для исследования взаимодействия выбраны гены
TRAIL и TRAIL-R2. Впервые выявлена ассоциация полиморфного локуса
TRAIL (rs4894559) с РС в русской этнической группе. Взаимодействия двух
генов, FAS и TRAIL, в нашем исследовании не выявлено.
159
Список сокращений и условных обозначений
АИЗ – аутоиммунное заболевание
ВМ – весовая матрица
ВПРС – вторично-прогрессирующий рассеянный склероз
ГОУ
ВПО
СибГМУ
учреждение
высшего
Росздрава
–
Государственное
профессионального
образовательное
образования
Сибирский
государственный медицинский университет Российского здравоохранения
ГУЗ – государственное учреждение здравоохранения
ДВФО – Дальневосточный федеральный округ
К - контроль
КТИ
ВТ
СО
РАН
-
Конструкторско-технологический
институт
вычислительной техники Сибирского отделения Российской академии наук
МП – молекулярный путь
НД – нет данных
ППРС – первично-прогрессирующий рассеянный склероз
РРС – ремитирующий рассеянный склероз
РС – рассеянный склероз
РХВ – равновесие Харди-Вайнберга
СФО – Сибирский федеральный окрг
США – Соединенные Штаты Америки
ТФ – транскрипционный фактор
ФНО-альфа – фактор некроза опухоли альфа
ФСГГ – функционально связанная группа генов
ЦНС – центральная нервная система
ЦФО – Центральный федеральный округ
ЧАР – частота аллеля риска
AIC (Akaike information criterion) – информационный критерий Акаике
ANZgene (Australia and New Zealand Multiple Sclerosis Genetics Consortium) –
консорциум по генетике рассеянного склероза Австралии и Новой Зеландии
AP-2 (Activating protein 2) – активатор белка 2
160
APOE (Apolipoprotein E) – аполипопротеин E
ARMS (amplification refractory mutation system) - амплификационная система
для идентификации мутаций
AS (allele specific) – аллель-специфичная ПЦР
ASO (allele-specific oligonucleotid) – аллель-специфичный олигонуклеотид
BACH2 (BTB and CNC Homology 1, Basic Leucine Zipper Transcription Factor
2) - транскрипционный фактор 2 с доменом лейциновая застежка
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) - нейротрофический фактор мозга
BWH/TT (Brigham&Woman’s Hospital, Therapeutic Trials) - участники
терапевтического
исследования,
проводимого
на
базе
клиники
«Brigham&Woman’s Hospital» г. Бостон Соединенных Штатов Америки
BTNL2 (Butyrophilin-Like 2) - бутирофилин-подобный 2
CCR5 (C-C chemokine receptor type 5) - C-C рецептор хемокина 5 типа
CD6 (cluster of differentiation 6) - антиген дифференцировки T-лимфоцитов
CD14 (cluster of differentiation 14) - антиген дифференцировки T-лимфоцитов
CD40 (cluster of differentiation 40 или TNFRSF5, tumor necrosis factor receptor
superfamily member 5) – рецептор 5 из надсемейства факторов некроза
опухоли
CD40L (CD40 ligand) – лиганд к CD40
CD58 (cluster of differentiation 58 или LFA-3, lymphocyte function-associated
antigen 3) – антиген 3, ассоциированный с функцией лимфоцитов
CDK2AP1 (cyclin-dependent kinase 2 associated protein 1) – белок 1,
ассоциированный с циклически-зависимой киназой 2
CEU (Utah residents with Northern and Western European ancestry) – выборка
пациентов в проекте HapMap
ChIPSeq (Chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput DNA
sequencing) – метод исследования ДНК-связывающих белков, включающий
иммунопреципитацию хроматина и высокоэффективное секвенирование
ДНК
C.I. (confidence interval) – доверительный интервал
161
CLEC16A (C-Type Lectin Domain Family 16, Member A) – лектиновый домен
С-типа семейства 16, член А
CTLA4
(cytotoxic
T-lymphocyte-associated
protein
4)
–
белок,
ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами, 4
CXCR4 (Chemokine (C-X-C Motif) Receptor 4) – рецептор 4 хемокина с
мотивом С-Х-С
D – коэффициент гаметического неравновесия
Digital PCR – цифровая ПЦР
EDSS (Expanded Disability Status Scale) — расширенная шкала оценки
степени инвалидизации
ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements) – энциклопедия ДНК элементов
EVI5 (Ecotropic Viral Integration Site 5) – сайт 5 эктропной вирусной
интеграции
FADD (Fas-Associated protein with Death Domain) – белок с доменом смерти,
ассоциированный с Fas
FAS (Fas cell surface death receptor, CD95, Apo-1) – поверхностный рецептор
клеточной гиебли FAS
Gene Ontology (GO) – генная онтология, база данных, унифицирующая
терминологию для аннотации генов и генных продуктов всех биологических
видов
GenMSA (CH) (Switzerland, Basel) - популяция, собранная в городе Базель
Швейцарии GenMSA (NL) (The Netherlands, Amsterdam) - популяция,
собранная в городе Амстердам Нидерландов
GenMSA (US) (United States, San Francisco) - популяция, собранная в городе
Сан-Франциско Соединенных Штатов Америки
GTRD (Gene Transcription Regulation Database) – база данных генов
регуляции транскрипции
GWAS (genome wide association study) – полногеномное исследование
ассоциаций
HLA (Human Leucocyte Antigens) – человеческие лейкоцитарные антигены
162
HLA-A3 (Human Leucocyte Antigens A3) - человеческий лейкоцитарный
антиген A3
HLA-B7 (Human Leucocyte Antigens B7) - человеческий лейкоцитарный
антиген B7
HLA-DRB1 (Human Leucocyte Antigens DR beta 1) - человеческий
лейкоцитарный антиген DR бета 1
HLA-DQA1 (Human Leucocyte Antigens DQ alpha 1) - человеческий
лейкоцитарный антиген DQ альфа 1
HLA-DQB1 (Human Leucocyte Antigens DQ beta 1) - человеческий
лейкоцитарный антиген DQ бета 1
HR (hazard ratio) – относительная опасность
HumanCyc pathways - Энциклопедия генов человека и метаболизма
IFNalpha (Interferon alpha) – интерферон альфа
IFNbeta (Interferon beta) – интерферон бета
IFNG (Interferon gamma) – интерферон гамма
IL1B (Interleukin 1, Beta) – интерлейкин 1, субчастица бета
IL12A (Interleukin 1, alpha) – интерлейкин 12, субчастица альфа
IL2 (Interleukin 2) – интерлейкин 2
IL23 (Interleukin 23) – интерлейкин 23
IL2RA (Interleukin-2 receptor subunit alpha) – рецептор интерлейкина 2,
субчастица альфа
IL6 (Interleukin 6) – интерлейкин 6
IL7RA (Interleukin-7 receptor subunit alpha) – рецептор интерлейкина 7,
субчастица альфа
IL10 (Interleukin 10) – интерлейкин 10
IMSGC
(International
Multiple
Sclerosis
Genetics
Consortium)
–
интернациональный консорциум по генетике рассеянного склероза
IMSGC (UK) (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium United
Kingdom) - Интернациональный генетический консорциум по рассеянному
склерозу Великобритании
163
IMSGC (US) (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium United States)
- Интернациональный генетический консорциум по рассеянному склерозу
Соединенных Штатов Америки
IPS – алгоритм вычисления скора для весовой матрицы
IRF4 (Interferon regulatory factor 4) – регуляторный фактор интерферона 4
IRF8 (Interferon regulatory factor 8) – регуляторный фактор интерферона 8
JAK2 (Janus kinase 2) – киназа 2 януса
JUN (Jun Proto-Oncogene) – протоонкоген JUN
Jurkat – клеточная линия человека, полученная из периферической крови
K/BxN – линия мышей, у которой спонтанно развивается ревматоидный
артрит
KCNJ11 (Potassium Channel, Inwardly Rectifying Subfamily J, Member 11) –
субъединица АТФ-зависимого калиевого канала
KIF1B (Kinesin Family Member 1B) – член 1В семейства кинезиновых белков
LPS (lipopolysaccharide) – липополисахарид
LRT (Likelihood-ratio test) – тест отношения правдоподобия
MACS
(Model-based
Analysis
of
ChIP-Seq
data)
–
алгоритм
для
идентификации пиков в ChIP-seq данных
MAPK
(mitogen-activated
protein
kinase)
-
митоген-активируемая
протеинкиназа
MBP (myelin basic protein) – основной белок миелина
MHC
(major
histocompatibility
complex)
–
главный
комплекс
гистосовместимости
MPHOSPH9 (M-Phase Phosphoprotein 9) – фосфопротеин 9 М фазы
NA (not available) – невозможно определить
NGS (next generation sequencing) – секвенирование нового поколения
NOD (Non-obese diabetic) – линия мышей с диабетом без ожирения
OLIG3 (Oligodendrocyte Transcription Factor 3) – трнаскрипционный фактор 3
олигодендроцитов
OR (odds ratio) – отношение шансов
164
P (p-value) – уровень статистической значимости
Padj (p-value adjusted) - уровень статистической значимости с поправкой
PCR (polymerase chain reaction) – полимеразная цепная реакция
PMA (Phorbol myristate acetate) - форболмиристатацетат
PTEGR4 (Prostaglandin E Receptor 4 (Subtype EP4)) – рецептор 4
простагландина E, подтип EP4
PWM (position weight matrices) – алгоритм весовых матриц
r2 – коэффициент корреляции
Raji - линия гемопоэтических клеток человека
Reactome - база данных о регуляторных сетях
RFLP (restriction fragment length polymorphism) – полиморфизм длин
рестрикционных фрагмемнтов
RGS1 (Regulator Of G-Protein Signaling 1) – ругулятор 1 сигналов G-белка
RORgT (RORC, Retinoid-Related Orphan Receptor Gamma) – рцептор гамма
семейства, родственного ретиноидному
RPL5 (Ribosomal Protein L5) – рибосомальный белок L5
RPE (relative predisposition effect) - анализ эффекта относительной
предрасположенности
RR (relative risk) относительный риск
RXR (retinoid X receptor) - ретиноидным Х рецептором
SD (standard deviation) – стандартное отклонение
SISSRs (Site Identification from Short Sequence Reads) – алгоритм для
идентификации пиков в ChIP-seq данных
SNP (single nucleotide polymorphism) – однонклеотидный полиморфный локус
SSP (sequence specific primer) – последовательность-специфичные праймемры
STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1) - сигнальный белок и
активатор транскрипции 1
STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) - сигнальный белок и
активатор транскрипции 3
165
STAT4 (signal transducer and activator of transcription 4) - сигнальный белок и
активатор транскрипции 4
STAT5 (signal transducer and activator of transcription 5) - сигнальный белок и
активатор транскрипции 5
TATA-box - TATA-бокс, последовательность ДНК
TCR (T cell receptor) – Т клеточный рецептор
TF classification - база данных о, которая содержит энциклопедическую
информацию о транскрипционных факторах.
TGF-b (transforming growth factor beta) – трансформирующий ростовой
фактор бета
TMEM39A (Transmembrane Protein 39A) – трансмембранный белок 39А
TNFa (tumor necrosis factor alpha) – фактор некроза опухоли альфа
TNFAIP3 (Tumor Necrosis Factor, Alpha-Induced Protein 3) – белок 3,
индуцируемый фактором некроза опухолей альфа
TNFRSF1A (Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, Member 1A) –
рецептор из надсемейства факторов некроза опухоли, член 1А
TRANSPATH® – база данных о регуляторных сетях, которая содержит
энциклопедическую информацию о сигнальной трансдукции и программный
инструментарий для визуализации и анализа.
TRAPS (Tumor necrosis factor Receptor superfamily 1A — Assotiated Periodic
Syndrome) – семейный синдром периодической лихорадки
TSI (Toscani in Italia) – выборка пациентов в проекте HapMap
TYK2 (Tyrosine Kinase 2) – тирозиновая киназа 2
VCAM1 (Vascular cell adhesion molecule 1) – васкулярная молекула клеточной
адгезии 1
VDR (vitamin D receptor) – рецептор витамина D3
VDRE (Vitamin D response element) – элемент, чувствительный к витамину
D3
U937 – клеточная линия человека
166
ZMIZ1 (Zinc Finger, MIZ-Type Containing 1) – цинковые пальцы, содержащие
MIZ-типа домен 1
167
Библиографический список
1.
Власов Я.В. Перспективы развития организованных сообществ
граждан по проблеме рассеянного склероза на примере Общероссийской
Общественной Организации инвалидов – больных рассеянным склерозом
(ОООИ-БРС) // Нейроиммунология. 2007. - Т. 5. - № 1. - С. 56–64.
2.
Яхно Н.Н., Завалишин И.А., Котов С.В., Шмидт Т.Е., Иванов
Р.А., Дубчак Л.В., Кротенкова М.В., Байдина Е.В., Пар В.И. Брюхов В.В.
Результаты
сравнительного
клинического
исследования
безопасности,
переносимости и эффективности препаратов Ронбетал И Бетаферон // Cons.
medicum. 2010. - Т. 2. - С. 28–38.
3.
Sawcer S., Ban M., Maranian M., Yeo T.W., Compston A., Kirby A.,
Daly M.J., De Jager P.L., Walsh E., Lander E.S., Rioux J.D., Hafler D.A., Ivinson
A., Rimmler J., Gregory S.G., Schmidt S., Pericak-Vance M.A., Akesson E.,
Hillert J., Datta P., Oturai A., Ryder L.P., Harbo H.F., Spurkland A., Myhr K.M.,
Laaksonen M., Booth D., Heard R., Stewart G., Lincoln R., Barcellos L.F., Hauser
S.L., Oksenberg J.R., Kenealy S.J., Haines J.L.; International Multiple Sclerosis
Genetics Consortium. A high-density screen for linkage in multiple sclerosis. //
Am. J. Hum. Genet. 2005. - Vol. 77. - № 3. - P. 454–467.
4.
Natio S., Namerow N., Mickey M.R., Terasaki P.I. Multiple Sclerosis:
Association with HL-A3 // Tissue Antigens. - 1972. - Vol. 2. - № 1. - P. 1–4.
5.
Oksenberg J.R. Baranzini S.E, Sawcer S., Hauser S.L. The genetics of
multiple sclerosis: SNPs to pathways to pathogenesis. // Nat. Rev. Genet. - 2008. Vol. 9. - № 7. - P. 516–526.
6.
Ebers G.C., Sadovnick A.D. The role of genetic factors in multiple
sclerosis susceptibility. // J. Neuroimmunol. - 1994. - Vol. 54. - № 1-2. - P. 1–17.
7.
Boiko A.N., Gusev E.I., Sudomoina M.A., Alekseenkov A.D.,
Kulakova O.G., Bikova O.V., Maslova O.I., Guseva M.R., Boiko S.Y., Guseva
M.E., Favorova O.O. Association and linkage of juvenile MS with HLA-DR2(15)
in Russians. // Neurology. - 2002. - Vol. 58. - № 4. - P. 658–660.
168
8.
Андреевский Т.В., Судомоина М.А., Гусев Е.И., Бойко А.Н.,
Алексеенков А.Д., Фаворова О.О. Полиморфизм A/G в положении +49
первого экзона гена CTLA4 при рассеяном склерозе у русских // Мол.биол. 2002. – Т.36. – №.4. – С. 643-648.
9.
Favorova O.O., Andreewski T.V., Boiko A.N., Sudomoina M.A.,
Alekseenkov A.D., Kulakova O.G., Slanova A.V., Gusev E.I. The chemokine
receptor CCR5 deletion mutation is associated with MS in HLA-DR4-positive
Russians. // Neurology. - 2002. - Vol. 59. - № 10. - P. 1652–1655.
10.
Guerini F.R., Ferrante P., Losciale L., Caputo D., Lombardi M.L.,
Pirozzi G., Luongo V., Sudomoina M.A., Andreewski T.V., Alekseenkov A.D.,
Boiko A.N., Gusev E.I., Favorova O.O. Myelin basic protein gene is associated
with MS in DR4- and DR5-positive Italians and Russians. // Neurology. - 2003. Vol. 61. - № 4. - P. 520–526.
11.
Favorova O.O., Favorov A.V., Boiko A.N., Andreewski T.V.,
Sudomoina M.A., Alekseenkov A.D., Kulakova O.G., Gusev E.I., Parmigiani G.,
Ochs M.F. Three allele combinations associated with multiple sclerosis. // BMC
Med. Genet. - 2006. - Vol. 7. - № 2. - P. 63.
12.
Макарычева О.И., Царева Е.Ю., Судомонина М.А., Кулакова
О.Г., Быкова О.В., Гольтцова Н.В., Кузенкова Л.М., Бойко А.Н., Фаворова
О.О. Анализ неравновесия и ассоциации аллелей провоспалительных
цитокинов генов IL-6, IFNg и TNF с рассеянным склерозомс использованием
TDT. // Мол.биол. - Т. 44. - № 5. - С. 824–830.
13.
Makarycheva O.Y., Tsareva E.Y., Sudomoina M.A., Kulakova O.G.,
Titov B.V., Bykova O.V., Gol'tsova N.V., Kuzenkova L.M., Boiko A.N., Favorova
O.O. Family Analysis of Linkage and Association of HLA-DRB1, CTLA4,
TGFB1, IL4, CCR5, RANTES, MMP9 and TIMP1 Gene Polymorphisms with
Multiple Sclerosis. // Acta Naturae. - 2011. - Vol. 3. - № 1. - P. 85–92.
14.
Bashinskaya V.V., Kulakova O.G., Kiselev I.S., Baulina N.M.,
Favorov A.V., Boyko A.N., Tsareva E.Y., Favorova O.O. GWAS-identified
169
multiple sclerosis risk loci involved in immune response: validation in Russians. //
J. Neuroimmunol. - 2015. - Vol. 282. - P. 85–91.
15.
Friedrich C. Multiple Sklerose und Erbanlage. Leipzig: Georg
Thieme, 1933.
16.
Sawcer S. A new era in the genetic analysis of multiple sclerosis. //
Curr. Opin. Neurol. - 2006. - Vol. 19. - № 3. - P. 237–241.
17.
Dyment D.A. Yee I.M., Ebers G.C., Sadovnick A.D.; Canadian
Collaborative Study Group. Multiple sclerosis in stepsiblings: recurrence risk and
ascertainment. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. - 2006. - Vol. 77. - № 2. - P.
258–259.
18.
Willer C.J., Dyment D.A., Risch N.J., Sadovnick A.D., Ebers G.C.
Canadian Collaborative Study Group.Twin concordance and sibling recurrence
rates in multiple sclerosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2003. - Vol. 100. №22. - P. 12877–12882.
19.
Ebers G.C., Sadovnick A.D., Risch N.J. A genetic basis for familial
aggregation in multiple sclerosis. Canadian Collaborative Study Group. // Nature. 1995. - Vol. 377. - №6545. - P. 150–151.
20.
Sawcer S. The genetic aspects of multiple sclerosis. // Ann. Indian
Acad. Neurol. - 2009. - Vol. 12. - № 4. - P. 206–214.
21.
Бойко
А.Н., Смирнова
Н.Ф., Золотова
С.Н. Гусев Е.И.
Эпидемиология и этиология рассеянного склероза // Cons. Medicum. - 2008. Vol. 10. - № 7.
22.
Brahic M. Multiple sclerosis and viruses. // Ann. Neurol. - 2010. -
Vol. 68. - № 1. - P. 6–8.
23.
Lünemann J.D., Kamradt T., Martin R., Münz C. Epstein-barr virus:
environmental trigger of multiple sclerosis? // J. Virol. 2007. - Vol. 81. - № 13. P. 6777–6784.
24.
Gold M.S., McIntyre P. Human papillomavirus vaccine safety in
Australia: experience to date and issues for surveillance. // Sex. Health. - 2010. Vol. 7. - № 3. - P. 320–324.
170
25.
Altshuler D., Daly M.J., Lander E.S. Genetic mapping in human
disease. // Science. - 2008. - Vol. 322. - № 5903. - P. 881–888.
26.
Yang Q., Khoury M.J., Friedman J., Little J., Flanders W.D. How
many genes underlie the occurrence of common complex diseases in the
population? // Int. J. Epidemiol. - 2005. - Vol. 34. - № 5. - P. 1129–1137.
27.
Jersild C., Svejgaard A., Fog T. HL-A antigens and multiple sclerosis.
// Lancet. - 1972. - Vol. 1. - № 7762. - P. 1240–1241.
28.
Jersild C., Fog T., Hansen G.S., Thomsen M., Svejgaard A., Dupont
B. Histocompatibility detrminants in multiple sclerosis, with special reference to
clinical course // Lancet. - 1973. - Vol. 302. - № 7840. - P. 1221–1225.
29.
Compston A. Making progress on the natural history of multiple
sclerosis. // Brain. - 2006. - Vol. 129. - № Pt 3. - P. 561–563.
30.
Фаворова O.O., Кулакова O.Г., Бойко A.Н. Рассеянный склероз
как полигенное заболевание: современное состояние проблемы // Генетика. 2010. - Vol. 46. - № 3. - P. 302–313.
31.
Barcellos L.F., Thomson G., Carrington M., Schafer J., Begovich
A.B., Lin P., Xu X.H., Min B.Q., Marti D., Klitz W. Chromosome 19 single-locus
and multilocus haplotype associations with multiple sclerosis. Evidence of a new
susceptibility locus in Caucasian and Chinese patients. // JAMA. - 1997. - Vol.
278. - № 15. - P. 1256–1261.
32.
Evangelou N., Jackson M., Beeson D., Palace J. Association of the
APOE epsilon4 allele with disease activity in multiple sclerosis. // J. Neurol.
Neurosurg. Psychiatry. - 1999. - Vol. 67. - № 2. - P. 203–205.
33.
Fazekas F. Strasser-Fuchs S., Schmidt H., Enzinger C., Ropele S.,
Lechner A., Flooh E., Schmidt R., Hartung H.P. Apolipoprotein E genotype related
differences in brain lesions of multiple sclerosis. // J. Neurol. Neurosurg.
Psychiatry. - 2000. - Vol. 69. - № 1. - P. 25–28.
34.
Carlin C., Murray L., Graham D., Doyle D., Nicoll J. Involvement of
apolipoprotein E in multiple sclerosis: absence of remyelination associated with
171
possession of the APOE epsilon2 allele. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. - 2000. Vol. 59. - № 5. - P. 361–367.
35.
Fazekas F., Strasser-Fuchs S., Kollegger H., Berger T., Kristoferitsch
W., Schmidt H., Enzinger C., Schiefermeier M., Schwarz C., Kornek B., Reindl
M., Huber K., Grass R., Wimmer G., Vass K., Pfeiffer K.H., Hartung H.P.,
Schmidt R. Apolipoprotein E epsilon 4 is associated with rapid progression of
multiple sclerosis. // Neurology. - 2001. - Vol. 57. - № 5. - P. 853–857.
36.
Chapman J. Vinokurov S., Achiron A., Karussis D.M., Mitosek-
Szewczyk K., Birnbaum M., Michaelson D.M., Korczyn A.D. APOE genotype is a
major predictor of long-term progression of disability in MS. // Neurology. - 2001.
- Vol. 56. - № 3. - P. 312–316.
37.
Schmidt S., Barcellos L.F., DeSombre K., Rimmler J.B., Lincoln
R.R., Bucher P., Saunders A.M., Lai E., Martin E.R., Vance J.M., Oksenberg J.R.,
Hauser S.L., Pericak-Vance M.A., Haines J.L.; Multiple Sclerosis Genetics Group.
Association of polymorphisms in the apolipoprotein E region with susceptibility to
and progression of multiple sclerosis. // Am. J. Hum. Genet. - 2002. - Vol. 70. - №
3. - P. 708–717.
38.
Enzinger C. Ropele S., Strasser-Fuchs S., Kapeller P., Schmidt H.,
Poltrum B., Schmidt R., Hartung H.P., Fazekas F. Lower levels of Nacetylaspartate in multiple sclerosis patients with the apolipoprotein E epsilon4
allele. // Arch. Neurol. - 2003. - Vol. 60. - № 1. - P. 65–70.
39.
Kantarci O.H., Hebrink D.D., Achenbach S.J., Pittock S.J., Altintas
A., Schaefer-Klein J.L., Atkinson E.J., De Andrade M., McMurray C.T.,
Rodriguez M., Weinshenker B.G. Association of APOE polymorphisms with
disease severity in MS is limited to women. // Neurology. - 2004. - Vol. 62. - № 5.
- P. 811–814.
40.
De Stefano N., Bartolozzi M.L., Nacmias B., Zipoli V., Mortilla M.,
Guidi L., Siracusa G., Sorbi S., Federico A., Amato M.P. Influence of
apolipoprotein E epsilon4 genotype on brain tissue integrity in relapsing-remitting
multiple sclerosis. // Arch. Neurol. - 2004. - Vol. 61. - № 4. - P. 536–540.
172
41.
Parmenter B.A., Denney D.R., Lynch S.G., Middleton L.S., Harlan
L.M. Cognitive impairment in patients with multiple sclerosis: association with the
APOE gene and promoter polymorphisms. // Mult. Scler. - 2007. - Vol. 13. - № 1.
- P. 25–32.
42.
Shi J., Zhao C.B., Vollmer T.L., Tyry T.M., Kuniyoshi S.M. APOE
epsilon 4 allele is associated with cognitive impairment in patients with multiple
sclerosis. // Neurology. - 2008. - Vol. 70. - № 3. - P. 185–190.
43.
Мустафина O.E., Царева Е.Ю., Фаворова О.О.
Анализ
ассоциации аллельных вариантов генов аполипопротеина Е и интерлейкина 1
бета с рассеянным склерозом у этнических татар. // Genetika. - 2008. - Vol.
44. - № 3. - P. 407–413.
44.
Sena A., Couderc R., Ferret-Sena V., Pedrosa R., Andrade M.L.,
Araujo C., Roque R., Cascais M.J., Morais M.G. Apolipoprotein E polymorphism
interacts with cigarette smoking in progression of multiple sclerosis. // Eur. J.
Neurol. - 2009. - Vol. 16. - № 7. - P. 832–837.
45.
Julian L.J., Vella L., Frankel D., Minden S.L., Oksenberg J.R., Mohr
D.C. ApoE alleles, depression and positive affect in multiple sclerosis. // Mult.
Scler. - 2009. - Vol. 15. - № 3. - P. 311–315.
46.
Losonczi E., Bencsik K., Fricska Nagy Z., Honti V., Szalczer E.,
Rajda C., Illés Z., Mátyás K., Rózsa C., Csépány T., Füvesi J., Vécsei L. APOE
epsilon status in Hungarian patients with primary progressive multiple sclerosis. //
Swiss Med. Wkly. - 2010. - Vol. 140. - P. w13119.
47.
Tamam Y., Tasdemir N., Yalman M., Tamam B. Association of
apolipoprotein E genotypes with prognosis in multiple sclerosis. // Eur. Rev. Med.
Pharmacol. Sci. - 2011. - Vol. 15. - № 10. - P. 1122–1130.
48.
Shi J., Tu J.L., Gale S.D., Baxter L., Vollmer T.L., Campagnolo D.I.,
Tyry T.M., Zhuang Y., Kuniyoshi S.M. APOE ε4 is associated with exacerbation
of cognitive decline in patients with multiple sclerosis. // Cogn. Behav. Neurol. 2011. - Vol. 24. - № 3. - P. 128–133.
173
49.
Rafiei M., Zarif Yeganeh M., Sheikholeslami S., Gozalpour E.,
Ghaffarpour M., Hedayati M. Apolipoprotein E polymorphisms status in Iranian
patients with multiple sclerosis. // J. Neurol. Sci. - 2012. - Vol. 320. - № 1-2. - P.
22–25.
50.
Qiu W., Pham K., James I., Nolan D., Castley A., Christiansen F.T.,
Czarniak P., Luo Y., Wu J., Garlepp M., Wilton S., Carroll W.M., Mastaglia F.L.,
Kermode A.G.The influence of non-HLA gene polymorphisms and interactions on
disease risk in a Western Australian multiple sclerosis cohort. // J. Neuroimmunol.
- 2013. - Vol. 261. - № 1-2. - P. 92–97.
51.
Oliveri R.L., Cittadella R., Sibilia G., Manna I., Valentino P.,
Gambardella A., Aguglia U., Zappia M., Romeo N., Andreoli V., Bono F.,
Caracciolo M., Quattrone A. APOE and risk of cognitive impairment in multiple
sclerosis. // Acta Neurol. Scand. - 1999. - Vol. 100. - № 5. - P. 290–295.
52.
Ferri C., Sciacca F.L., Veglia F., Martinelli F., Comi G., Canal N.,
Grimaldi L.M. APOE epsilon2-4 and -491 polymorphisms are not associated with
MS. // Neurology. - 1999. - Vol. 53. - № 4. - P. 888–889.
53.
Chapman J., Sylantiev C., Nisipeanu P., Korczyn A.D. Preliminary
observations on APOE epsilon4 allele and progression of disability in multiple
sclerosis. // Arch. Neurol. - 1999. - Vol. 56. - № 12. - P. 1484–1487.
54.
Weatherby S.J., Mann C.L., Fryer A.A., Strange R.C., Hawkins C.P.,
Stevenson V.L., Leary S.M., Thompson AJ. No association between the APOE
epsilon4 allele and outcome and susceptibility in primary progressive multiple
sclerosis. // J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. - 2000. - Vol. 68. - № 4. - P. 532.
55.
Weatherby S.J., Mann C.L., Davies M.B., Carthy D., Fryer A.A.,
Boggild M.D., Young C., Strange R.C., Ollier W., Hawkins C.P. Polymorphisms
of apolipoprotein E; outcome and susceptibility in multiple sclerosis. // Mult. Scler.
- 2000. - Vol. 6. - № 1. - P. 32–36.
56.
Pirttilä T., Haanpää M., Mehta P.D., Lehtimäki T. Apolipoprotein E
(APOE) phenotype and APOE concentrations in multiple sclerosis and acute
herpes zoster. // Acta Neurol. Scand. - 2000. - Vol. 102. - № 2. - P. 94–98.
174
57.
Masterman T., Zhang Z., Hellgren D., Salter H., Anvret M., Lilius L.,
Lannfelt L., Hillert J. APOE genotypes and disease severity in multiple sclerosis. //
Mult. Scler. - 2002. - Vol. 8. - № 2. - P. 98–103.
58.
Savettieri G., Andreoli V., Bonavita S., Cittadella R., Caltagirone C.,
Fazio M.C., Girlanda P., Le Pira F., Liguori M., Logroscino G., Lugaresi A.,
Nocentini U., Reggio A., Salemi G., Serra P., Tedeschi G., Toma L., Trojano M.,
Valentino P., Quattrone A. Apolipoprotein E genotype does not influence the
progression of multiple sclerosis. // J. Neurol. 2003. - Vol. 250. - № 9. - P. 1094–
1098.
59.
Niino M., Kikuchi S., Fukazawa T., Yabe I., Tashiro K.
Polymorphisms of apolipoprotein E and Japanese patients with multiple sclerosis.
// Mult. Scler. - 2003. - Vol. 9. - № 4. - P. 382–386.
60.
Guerrero A.L., Bueno V., Hernández M.T., Martín-Serradilla J.I.,
Carrasco E., Cuadrado I. [Apolipoprotein E polymorphism as a predictor of
progression of multiple sclerosis]. [Article in Spanish] // Neurologia. - 2003. - Vol.
18. - № 3. - P. 146–148.
61.
Zwemmer J.N., van Veen T., van Winsen L., van Kamp G.J., Barkhof
F., Polman C.H., Uitdehaag B.M. No major association of ApoE genotype with
disease characteristics and MRI findings in multiple sclerosis. // Mult. Scler. 2004. - Vol. 10. - № 3. - P. 272–277.
62.
Zakrzewska-Pniewska B., Styczynska M,. Podlecka A., Samocka R.,
Peplonska B., Barcikowska M., Kwiecinski H. Association of apolipoprotein E and
myeloperoxidase genotypes to clinical course of familial and sporadic multiple
sclerosis. // Mult. Scler. - 2004. - Vol. 10. - № 3. - P. 266–271.
63.
Santos M., Costa M.C., Edite Rio M., José Sá M., Monteiro M.,
Valença A., Sá A., Dinis J., Figueiredo J., Bigotte de Almeida L., Valongueiro A.,
Coelho I., Matamá M.T., Pinto-Basto J., Sequeiros J., Maciel P. Genotypes at the
APOE and SCA2 loci do not predict the course of multiple sclerosis in patients of
Portuguese origin. // Mult. Scler. - 2004. - Vol. 10. - № 2. - P. 153–157.
175
64.
Al-Shammri S., Fatania H., Al-Radwan R., Akanji A.O. The
relationship of APOE genetic polymorphism with susceptibility to multiple
sclerosis and its clinical phenotypes in Kuwaiti Arab subjects. // Clin. Chim. Acta.
- 2005. - Vol. 351. - № 1-2. - P. 203–207.
65.
Sedano M.I., Calmarza P., Perez L., Trejo J.M. No association of
apolipoprotein E epsilon4 genotype with faster progression or less recovery of
relapses in a Spanish cohort of multiple sclerosis. // Mult. Scler. - 2006. - Vol. 12. № 1. - P. 13–18.
66.
Lanzillo R., Prinster A., Scarano V., Liuzzi R., Coppola G., Florio C.,
Salvatore E., Schiavone V., Brunetti A., Muto M., Orefice G., Alfano B., Bonavita
V., Brescia Morra V. Neuropsychological assessment, quantitative MRI and ApoE
gene polymorphisms in a series of MS patients treated with IFN beta-1b. // J.
Neurol. Sci. - 2006. - Vol. 245. - № 1-2. - P. 141–145.
67.
Мустафина О.Е., Михайлова А.М., Бахтиярова К.З., Насибулин
Т.Р., Туктарова И.А., Макарычева О.Ю., Фаворова О.О. Полиморфизм гена
APOE и риск
развития рассеянного склероза у этнических русских. //
Мол.биол. - 2008. - Т. 42. - № 6. - С. 957–964.
68.
Guerrero A.L., Laherrán E., Gutiérrez F., Martín-Polo J., Iglesias F.,
Alcázar C., Peralta J., Rostami P. Apolipoprotein E genotype does not associate
with disease severity measured by Multiple Sclerosis Severity Score. // Acta
Neurol. Scand. - 2008. - Vol. 117. - № 1. - P. 21–25.
69.
Portaccio E., Zipoli V., Goretti B., Hakiki B., Nacmias B., Siracusa
G., Sorbi S., Amato M.P. ApolipoproteinE epsilon 4 allele is not associated with
disease course and severity in multiple sclerosis. // Acta Neurol. Scand. - 2009. Vol. 120. - № 6. - P. 439–441.
70.
Bonetti A., Koivisto K., Pirttilä T., Elovaara I., Reunanen M.,
Laaksonen M., Ruutiainen J., Peltonen L., Rantamäki T., Tienari P.J. A follow-up
study of chromosome 19q13 in multiple sclerosis susceptibility. // J.
Neuroimmunol. - 2009. - Vol. 208. - № 1-2. - P. 119–124.
176
71.
Ghaffar O., Reis M., Pennell N., O'Connor P., Feinstein A. APOE
epsilon4 and the cognitive genetics of multiple sclerosis. // Neurology. - 2010. Vol. 74. - № 20. - P. 1611–1618.
72.
Corona T., Guerrero-Camacho J.L., Alonso-Vilatela M.E., Flores-
Rivera J. de J. [The absence of a relation between apolipoprotein E genotypes and
the severity of multiple sclerosis in Mexican patients]. [Article in Spanish] // Rev.
Neurol. - 2010. - Vol. 50. - № 1. - P. 19–22.
73.
Bettencourt A., Martins da Silva A., Pinho E Costa P., Martins Silva
B. Molecular genetic studies of multiple sclerosis in the portuguese population. //
Acta Med. Port. - 2012. - Vol. 25. - № 4. - P. 224–230.
74.
Lill C.M., Liu T., Schjeide B.M., Roehr J.T., Akkad D.A., Damotte
V., Alcina A., Ortiz M.A., Arroyo R., Lopez de Lapuente A., Blaschke P.,
Winkelmann A., Gerdes L.A., Luessi F., Fernadez O., Izquierdo G., Antigüedad
A., Hoffjan S., Cournu-Rebeix I., Gromöller S., Faber H., Liebsch M., Meissner
E., Chanvillard C., Touze E., Pico F., Corcia P; ANZgene Consortium, Dörner T.,
Steinhagen-Thiessen E., Baeckman L., Heekeren H.R., Li S.C., Lindenberger U.,
Chan A., Hartung H.P., Aktas O., Lohse P., Kümpfel T., Kubisch C., Epplen J.T.,
Zettl U.K., Fontaine B., Vandenbroeck K., Matesanz F., Urcelay E., Bertram L.,
Zipp F. Closing the case of APOE in multiple sclerosis: no association with disease
risk in over 29 000 subjects. // J. Med. Genet. - 2012. - Vol. 49. - № 9. - P. 558–
562.
75.
Ebers G.C., Kukay K., Bulman D.E., Sadovnick A.D., Rice G.,
Anderson C., Armstrong H., Cousin K., Bell R.B., Hader W., Paty D.W.,
Hashimoto S., Oger J., Duquette P., Warren S., Gray T., O'Connor P., Nath A.,
Auty A., Metz L., Francis G., Paulseth J.E., Murray T.J., Pryse-Phillips W., Nelson
R., Freedman M., Brunet D., Bouchard J.P., Hinds D., Risch N. A full genome
search in multiple sclerosis. // Nat. Genet. - 1996. - Vol. 13. - № 4. - P. 472–476.
76.
Haines
J.L.,
Ter-Minassian
M., Bazyk
A., Gusella
J.F., Kim
D.J., Terwedow H., Pericak-Vance M.A., Rimmler J.B., Haynes C.S., Roses
A.D., Lee A., Shaner B., Menold M., Seboun E., Fitoussi R.P., Gartioux C., Reyes
177
C., Ribierre F., Gyapay G., Weissenbach J., Hauser S.L., Goodkin D.E., Lincoln
R., Usuku K., Oksenberg J.R. A complete genomic screen for multiple sclerosis
underscores a role for the major histocompatability complex. The Multiple
Sclerosis Genetics Group. // Nat. Genet. - 1996. - Vol. 13. - № 4. - P. 469–471.
77.
Sawcer S., Jones H.B., Feakes R., Gray J., Smaldon N., Chataway J.,
Robertson N., Clayton D., Goodfellow P.N., Compston A. A genome screen in
multiple sclerosis reveals susceptibility loci on chromosome 6p21 and 17q22. //
Nat. Genet. - 1996. - Vol. 13. - № 4. - P. 464–468.
78.
Kuokkanen S., Gschwend M., Rioux J.D., Daly M.J., Terwilliger J.D.,
Tienari P.J., Wikström J., Palo J., Stein L.D., Hudson T.J., Lander E.S., Peltonen
L. Genomewide scan of multiple sclerosis in Finnish multiplex families. // Am. J.
Hum. Genet. - 1997. - Vol. 61. - № 6. - P. 1379–1387.
79.
Broadley S., Sawcer S., D'Alfonso S., Hensiek A., Coraddu F., Gray
J., Roxburgh R., Clayton D., Buttinelli C., Quattrone A., Trojano M., Massacesi L.,
Compston A. A genome screen for multiple sclerosis in Italian families. // Genes
Immun. - 2001. - Vol. 2. - № 4. - P. 205–210.
80.
Coraddu F., Sawcer S., D'Alfonso S., Lai M., Hensiek A., Solla E.,
Broadley S., Mancosu C., Pugliatti M., Marrosu M.G., Compston A. A genome
screen for multiple sclerosis in Sardinian multiplex families. // Eur. J. Hum. Genet.
- 2001. - Vol. 9. - № 8. - P. 621–626.
81.
Akesson E., Oturai A., Berg J., Fredrikson S., Andersen O., Harbo
H.F., Laaksonen M., Myhr K.M., Nyland H.I., Ryder L.P., Sandberg-Wollheim
M., Sorensen P.S., Spurkland A., Svejgaard A., Holmans P., Compston A., Hillert
J., Sawcer S. A genome-wide screen for linkage in Nordic sib-pairs with multiple
sclerosis. // Genes Immun. - 2002. - Vol. 3. - № 5. - P. 279–285.
82.
Ban M., Stewart G.J., Bennetts B.H., Heard R., Simmons R.,
Maranian M., Compston A., Sawcer S.J. A genome screen for linkage in
Australian sibling-pairs with multiple sclerosis. // Genes Immun. - 2002. - Vol. 3. № 8. - P. 464–469.
178
83.
Hensiek A.E., Roxburgh R., Smilie B., Coraddu F., Akesson E.,
Holmans P., Sawcer S.J., Compston D.A. Updated results of the United Kingdom
linkage-based genome screen in multiple sclerosis. // J. Neuroimmunol. - 2003. Vol. 143. - № 1-2. - P. 25–30.
84.
Kenealy S.J., Babron M.C., Bradford Y., Schnetz-Boutaud N., Haines
J.L., Rimmler J.B., Schmidt S., Pericak-Vance M.A., Barcellos L.F., Lincoln R.R.,
Oksenberg J.R., Hauser S.L., Clanet M., Brassat D., Edan G., Yaouanq J., Semana
G., Cournu-Rebeix I., Lyon-Caen O., Fontaine B.; American-French Multiple
Sclerosis Genetics Group. A second-generation genomic screen for multiple
sclerosis. // Am. J. Hum. Genet. - 2004. - Vol. 75. - № 6. - P. 1070–1078.
85.
Eraksoy M., Kurtuncu M., Akman-Demir G., Kilinc M., Gedizlioglu
M., Mirza M., Anlar O., Kutlu C., Demirkiran M., Idrisoglu H.A., Compston A.,
Sawcer S.; Turkish Multiple Sclerosis Genetics Study Group. A whole genome
screen for linkage in Turkish multiple sclerosis. // J. Neuroimmunol. - 2003. - Vol.
143. - № 1-2. - P. 17–24.
86.
Goris A., Sawcer S., Vandenbroeck K., Carton H., Billiau A., Setakis
E., Compston A., Dubois B. New candidate loci for multiple sclerosis
susceptibility revealed by a whole genome association screen in a Belgian
population. // J. Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 143. - № 1-2. - P. 65–69.
87.
Yeo T.W., Roxburgh R., Maranian M., Singlehurst S., Gray J.,
Hensiek A., Setakis E., Compston A., Sawcer S. Refining the analysis of a whole
genome linkage disequilibrium association map: the United Kingdom results. // J.
Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 143. - № 1-2. - P. 53–59.
88.
Bielecki B., Mycko M.P., Tronczyńska E., Bieniek M., Sawcer S.,
Setakis E., Benediktsson K., Compston A., Selmaj K.W. A whole genome screen
for association in Polish multiple sclerosis patients. // J. Neuroimmunol. - 2003. Vol. 143. - № 1-2. - P. 107–111.
89.
Liguori M., Sawcer S., Setakis E., Compston A., Giordano M.,
D'Alfonso S., Mellai M., Malferrari G., Trojano M., Livrea P., De Robertis F.,
Massacesi L., Repice A., Ballerini C., Biagioli T., Bomprezzi R., Cannoni S.,
179
Ristori G., Salvetti M., Grimaldi L.M., Biunno I., Comi G., Leone M., Ferro I.,
Naldi P., Milanese C., Gellera C., Loredana L.M., Savettieri G., Salemi G., Aridon
P., Caputo D., Rosa Guerini F., Ferrante P., Momigliano-Richiardi P. A whole
genome screen for linkage disequilibrium in multiple sclerosis performed in a
continental Italian population. // J. Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 143. - № 1-2. - P.
97–100.
90.
Santos M., Pinto-Basto J., Rio M.E., Sá M.J., Valença A., Sá A., Dinis
J., Figueiredo J., Bigotte de Almeida L., Coelho I., Sawcer S., Setakis E.,
Compston A., Sequeiros J., Maciel P. A whole genome screen for association with
multiple sclerosis in Portuguese patients. // J. Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 143. № 1-2. - P. 112–115.
91.
Abdeen H., Heggarty S., Hawkins S.A., Hutchinson M., McDonnell
G.V., Graham C.A. Mapping candidate non-MHC susceptibility regions to
multiple sclerosis. // Genes Immun. - 2006. - Vol. 7. - № 6. - P. 494–502.
92.
Coraddu F., Lai M., Mancosu C., Cocco E., Sawcer S., Setakis E.,
Compston A., Marrosu M.G.A genome-wide screen for linkage disequilibrium in
Sardinian multiple sclerosis. // J. Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 143. - № 1-2. - P.
120–123.
93.
Gödde R., Nigmatova V., Jagiello P., Sindern E., Haupts M.,
Schimrigk S., Epplen J.T. Refining the results of a whole-genome screen based on
4666 microsatellite markers for defining predisposition factors for multiple
sclerosis. // Electrophoresis. - 2004. - Vol. 25. - № 14. - P. 2212–2218.
94.
Chasman D.I., Paré G., Ridker P.M. Population-based genomewide
genetic analysis of common clinical chemistry analytes. // Clin. Chem. - 2009. Vol. 55. - № 1. - P. 39–51.
95.
Pe’er I., Yelensky R., Altshuler D., Daly M.J. Estimation of the
multiple testing burden for genomewide association studies of nearly all common
variants. // Genet. Epidemiol. - 2008. - Vol. 32. - № 4. - P. 381–385.
96.
Hoffjan S., Akkad D.A. The genetics of multiple sclerosis: an update
2010. // Mol. Cell. Probes. - 2010. - Vol. 24. - № 5. - P. 237–243.
180
97.
Gödde R., Rohde K., Becker C., Toliat M.R., Entz P., Suk A., Müller
N., Sindern E., Haupts M., Schimrigk S., Nürnberg P., Epplen J.T. Association of
the HLA region with multiple sclerosis as confirmed by a genome screen using
>10,000 SNPs on DNA chips. // J. Mol. Med. (Berl). - 2005. - Vol. 83. - № 6. - P.
486–494.
98.
Hafler D.A., Compston A., Sawcer S., Lander E.S., Daly M.J., De
Jager P.L., de Bakker P.I., Gabriel S.B., Mirel D.B., Ivinson A.J., Pericak-Vance
M.A., Gregory S.G., Rioux J.D., McCauley J.L., Haines J.L., Barcellos L.F., Cree
B., Oksenberg J.R., Hauser S.L. Risk alleles for multiple sclerosis identified by a
genomewide study. // N. Engl. J. Med. - 2007. - Vol. 357. - № 9. - P. 851–862.
99.
Burton P.R., Clayton D.G., Cardon L.R., Craddock N., Deloukas P.,
Duncanson A., Kwiatkowski D.P., McCarthy M.I., Ouwehand W.H., Samani N.J.,
Todd J.A., Donnelly P., Barrett J.C., Davison D., Easton D., Evans D.M., Leung
H.T., Marchini J.L., Morris A.P., Spencer C.C., Tobin M.D., Attwood A.P.,
Boorman J.P., Taylor J., Doan T., Davis J.C., Savage L., Ward M.M., Learch T.L.,
Weisman M.H., Brown M. Association scan of 14,500 nonsynonymous SNPs in
four diseases identifies autoimmunity variants. // Nat. Genet. - 2007. - Vol. 39. - №
11. - P. 1329–1337.
100. Aulchenko Y.S., Hoppenbrouwers I.A., Ramagopalan S.V., Broer L.,
Jafari N., Hillert J., Link J., Lundström W., Greiner E., Dessa Sadovnick A.,
Goossens D., Van Broeckhoven C., Del-Favero J., Ebers G.C., Oostra B.A., van
Duijn C.M., Hintzen R.Q. Genetic variation in the KIF1B locus influences
susceptibility to multiple sclerosis. // Nat. Genet. - 2008. - Vol. 40. - № 12. - P.
1402–1403.
101. Baranzini S.E., Wang J., Gibson R.A,. Galwey N., Naegelin Y.,
Barkhof F., Radue E.W., Lindberg R.L., Uitdehaag B.M., Johnson M.R.,
Angelakopoulou A., Pelletier D., Matthews P.M, Hauser S.L., Kappos L., Polman
C.H., Oksenberg J.R. Genome-wide association analysis of susceptibility and
clinical phenotype in multiple sclerosis. // Hum. Mol. Genet. Oxford Univ Press. 2009. - Vol. 18. - № 4. - P. 767–778.
181
102. Comabella M., Craig D.W., Camiña-Tato M., Morcillo C., Lopez C.,
Navarro A., Rio J., BiomarkerMS Study Group, Montalban X., Martin R.
Identification of a novel risk locus for multiple sclerosis at 13q31.3 by a pooled
genome-wide scan of 500,000 single nucleotide polymorphisms. // PLoS One / ed.
Gwinn K. Public Library of Science. - 2008. - Vol. 3. - № 10. - P. e3490.
103. The Australia and New Zealand Multiple Sclerosis Genetics
Consortium. Genome-wide association study identifies new multiple sclerosis
susceptibility loci on chromosomes 12 and 20. // Nat. Genet. Nature Publishing
Group. - 2009. - Vol. 41. - № 7. - P. 824–828.
104. Jakkula E., Leppä V., Sulonen A.M., Varilo T., Kallio S., Kemppinen
A., Purcell S., Koivisto K., Tienari P., Sumelahti M.L., Elovaara I., Pirttilä T.,
Reunanen M., Hafler D.A., Daly M.J., Palotie A., Saarela J., Peltonen L. Genomewide association study in a high-risk isolate for multiple sclerosis reveals
associated variants in STAT3 gene. // Am. J. Hum. Genet. - 2010. - Vol. 86. - № 2.
- P. 285–291.
105. Nischwitz S., Cepok S., Kroner A., Wolf C., Knop M., MüllerSarnowski F., Pfister H., Roeske D., Rieckmann P., Hemmer B., Ising M., Uhr M.,
Bettecken T., Holsboer F., Müller-Myhsok B., Weber F. Evidence for VAV2 and
ZNF433 as susceptibility genes for multiple sclerosis. // J. Neuroimmunol. - 2010.
- Vol. 227. - № 1-2. - P. 162–166.
106. Sanna S., Pitzalis M., Zoledziewska M., Zara I., Sidore C., Murru R.,
Whalen M.B., Busonero F., Maschio A., Costa G., Melis M.C., Deidda F., Poddie
F., Sotgiu S., Pugliatti M., Traccis S., Angius A., Melis M., Rosati G., Abecasis
G.R., Uda M., Marrosu M.G., Schlessinger D., Cucca F. Variants within the
immunoregulatory CBLB gene are associated with multiple sclerosis. // Nat.
Genet. - 2010. - Vol. 42. - № 6. - P. 495–497.
107. Sawcer S., International Multiple Sclerosis Genetics Consortium;
Wellcome Trust Case Control Consortium 2. Genetic risk and a primary role for
cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. // Nature. - 2011. - Vol.
476. - № 7359. - P. 214–219.
182
108. McWhirter R.E., McQuillan R., Visser E., Counsell C., Wilson J.F.
Genome-wide homozygosity and multiple sclerosis in Orkney and Shetland
Islanders. // Eur. J. Hum. Genet. - 2012. - Vol. 20. - № 2. - P. 198–202.
109. Goris A., Pauwels I., Dubois B. Progress in multiple sclerosis
genetics. // Curr. Genomics. - 2012. - Vol. 13. - № 8. - P. 646–663.
110. Durant L., Watford W.T., Ramos H.L., Laurence A., Vahedi G., Wei
L., Takahashi H., Sun H.W., Kanno Y., Powrie F., O'Shea J.J. Diverse targets of
the transcription factor STAT3 contribute to T cell pathogenicity and homeostasis.
// Immunity. - 2010. - Vol. 32. - № 5. - P. 605–615.
111. Minegishi Y., Saito M., Tsuchiya S., Tsuge I., Takada H., Hara T.,
Kawamura N., Ariga T., Pasic S., Stojkovic O., Metin A., Karasuyama H.
Dominant-negative mutations in the DNA-binding domain of STAT3 cause hyperIgE syndrome. // Nature. - 2007. - Vol. 448. - № 7157. - P. 1058–1062.
112. Qamar N., Fuleihan R.L. The Hyper IgM Syndromes // Clin. Rev.
Allergy Immunol. 2014 – Vol. 46. - № 2. - P. 120-30.
113. König I.R. Validation in genetic association studies // Brief.
Bioinform. - 2011. - Vol. 12. - № 3. - P. 253–258.
114. Booth D., Heard R., Stewart G., Goris A., Dobosi R., Dubois B.,
Oturai A., Soendergaard H.B., Sellebjerg F., Saarela J., Leppä V., Palotie A.,
Peltonen L., Fontaine B., Cournu-Rebeix I., Clerget-Darpoux F., Babron M.C.,
Weber F., Holsboer F., Müller-Myhsok B., Rieckmann P., Kro H.J. Refining
genetic associations in multiple sclerosis. // Lancet. Neurol. - 2008. - Vol. 7. - № 7.
- P. 567–569.
115. McCauley J.L., Zuvich R.L., Beecham A.L., De Jager P.L., Konidari
I., Whitehead P.L., Aubin C., Ban M., Pobywajlo S., Briskin R., Romano S.,
Aggarwal N.T., Piccio L., McArdle W.L., Strachan D.P., Evans D., Cross A.H.,
Cree B., Rioux J.D., Barcellos L.F., Ivinson A.J., Compston A., Hafler H.J.
Comprehensive follow-up of the first genome-wide association study of multiple
sclerosis identifies KIF21B and TMEM39A as susceptibility loci. // Hum. Mol.
Genet. - 2010. - Vol. 19. - № 5. - P. 953–962.
183
116. Glass G.V., McGaw B. Meta-analysis in social research. Beverly
Hills, CA: Sage, 1981. 279 p.
117. Sokolova E.A., Bondar I.A., Shabelnikova O.Y., Pyankova O.V.,
Filipenko ML. Replication of KCNJ11 (p.E23K) and ABCC8 (p.S1369A)
Association in Russian Diabetes Mellitus 2 Type Cohort and Meta-Analysis. //
PLoS One. - 2015. - Vol. 10. - № 5. - P. e0124662.
118. De Jager P.L., Jia X., Wang J., de Bakker P.I., Ottoboni L., Aggarwal
N.T., Piccio L., Raychaudhuri S., Tran D., Aubin C., Briskin R., Romano S.;
International MS Genetics Consortium, Hafler DA, Oksenberg JR. Meta-analysis
of genome scans and replication identify CD6, IRF8 and TNFRSF1A as new
multiple sclerosis susceptibility loci. // Nat. Genet. Nature Publishing Group 2009. - Vol. 41. - № 7. - P. 776–782.
119. Leppä V., Surakka I., Tienari P.J., Elovaara I., Compston A., Sawcer
S., Robertson N., De Jager P.L., Aubin C., Hafler D.A., Oturai A.B, Søndergaard
H.B., Sellebjerg F. The genetic association of variants in CD6, TNFRSF1A and
IRF8 to multiple sclerosis: a multicenter case-control study. // PLoS One. - 2011. Vol. 6. - № 4. - P. e18813.
120. Kümpfel T., Hoffmann L.A., Rübsamen H., Pöllmann W., Feneberg
W., Hohlfeld R., Lohse P. Late-onset tumor necrosis factor receptor-associated
periodic syndrome in multiple sclerosis patients carrying the TNFRSF1A R92Q
mutation. // Arthritis Rheum. - 2007. - Vol. 56. - № 8. - P. 2774–2783.
121. Singer N.G., Fox D.A., Haqqi T.M., Beretta L., Endres J.S., Prohaska
S., Parnes J.R., Bromberg J., Sramkoski R.M. CD6: expression during
development, apoptosis and selection of human and mouse thymocytes. // Int.
Immunol. - 2002. - Vol. 14. - № 6. - P. 585–597.
122. Esposito F., Patsopoulos N.A., Cepok S., Kockum I., Leppä V., Booth
D.R., Heard R.N., Stewart G.J., Cox M., Scott R.J., Lechner-Scott J., Goris A.,
Dobosi R., Dubois B., Rioux J.D., Oturai A.B., Søndergaard H.B., Sellebjerg F.,
Sørensen
P.S.,
Reunanen
M.,
Koivisto
K.,
Cournu-Rebeix
I.
IL12A,
184
MPHOSPH9/CDK2AP1 and RGS1 are novel multiple sclerosis susceptibility loci.
// Genes Immun. - 2010. - Vol. 11. - № 5. - P. 397–405.
123. Bush W.S., Sawcer S.J., de Jager P.L., Oksenberg J.R., McCauley
J.L., Pericak-Vance M.A., Haines J.L. Evidence for polygenic susceptibility to
multiple sclerosis--the shape of things to come. // Am. J. Hum. Genet. The
American Society of Human Genetics. - 2010. - Vol. 86. - № 4. - P. 621–625.
124. Tiffin N., Kelso J.F., Powell A.R., Pan H., Bajic V.B., Hide W.A.
Integration of text- and data-mining using ontologies successfully selects disease
gene candidates. // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33. - № 5. - P. 1544–1552.
125. Curtis R.K., Oresic M., Vidal-Puig A. Pathways to the analysis of
microarray data. // Trends Biotechnol. - 2005. - Vol. 23. - № 8. - P. 429–435.
126. Köhler S., Bauer S., Horn D., Robinson P.N. Walking the interactome
for prioritization of candidate disease genes. // Am. J. Hum. Genet. - 2008. - Vol.
82. - № 4. - P. 949–958.
127. Franke L., van Bakel H., Fokkens L., de Jong E.D., Egmont-Petersen
M., Wijmenga C. Reconstruction of a functional human gene network, with an
application for prioritizing positional candidate genes. // Am. J. Hum. Genet. 2006. - Vol. 78. - № 6. - P. 1011–1025.
128. Wang K., Li M., Bucan M. Pathway-based approaches for analysis of
genomewide association studies. // Am. J. Hum. Genet. - 2007. - Vol. 81. - № 6. P. 1278–1283.
129. Baranzini S.E., Galwey N.W., Wang J., Khankhanian P., Lindberg R.,
Pelletier D., Wu W., Uitdehaag B.M., Kappos L.; GeneMSA Consortium, Polman
C.H., Matthews P.M., Hauser S.L., Gibson R.A., Oksenberg J.R., Barnes M.R.
Pathway and network-based analysis of genome-wide association studies in
multiple sclerosis. // Hum. Mol. Genet. - 2009. - Vol. 18. - № 11. - P. 2078–2090.
130. International Multiple Sclerosis Genetics Consortium. Network-based
multiple sclerosis pathway analysis with GWAS data from 15,000 cases and
30,000 controls. // Am. J. Hum. Genet. - 2013. - Vol. 92. - № 6. - P. 854–865.
185
131. Song G.G., Choi S.J., Ji J.D., Lee Y.H. Genome-wide pathway
analysis of a genome-wide association study on multiple sclerosis. // Mol. Biol.
Rep. - 2013. - Vol. 40. - № 3. - P. 2557–2564.
132. Baranzini S.E. The genetics of autoimmune diseases: a networked
perspective. // Curr. Opin. Immunol. - 2009. - Vol. 21. - № 6. - P. 596–605.
133. Oksenberg J.R., Barcellos L.F., Cree B.A., Baranzini S.E., Bugawan
T.L., Khan O., Lincoln R.R., Swerdlin A., Mignot E., Lin L., Goodin D., Erlich
H.A., Schmidt S., Thomson G., Reich D.E., Pericak-Vance M.A., Haines J.L.,
Hauser S.L.Mapping multiple sclerosis susceptibility to the HLA-DR locus in
African Americans. // Am. J. Hum. Genet. - 2004. - Vol. 74. - № 1. - P. 160–167.
134. Zhang Q., Lin C.Y., Dong Q., Wang J., Wang W. Relationship
between HLA-DRB1 polymorphism and susceptibility or resistance to multiple
sclerosis in Caucasians: a meta-analysis of non-family-based studies. //
Autoimmun. Rev. Elsevier B.V. - 2011. - Vol. 10. - № 8. - P. 474–481.
135. Rojas O.-L., Rojas-Villarraga A., Cruz-Tapias P., Sánchez J.L.,
Suárez-Escudero J.C., Patarroyo M.A., Anaya J.M. HLA class II polymorphism in
Latin American patients with multiple sclerosis. // Autoimmun. Rev. Elsevier B.V.
- 2010. - Vol. 9. - № 6. - P. 407–413.
136. Hensiek A.E., Sawcer S.J., Feakes R., Deans J., Mander A., Akesson
E., Roxburgh R., Coraddu F., Smith S., Compston D.A. HLA-DR 15 is associated
with female sex and younger age at diagnosis in multiple sclerosis. // J. Neurol.
Neurosurg. Psychiatry. - 2002. - Vol. 72. - № 2. - P. 184–187.
137. Barcellos L.F., Sawcer S., Ramsay P.P., Baranzini S.E., Thomson G.,
Briggs F., Cree B.C., Begovich A.B., Villoslada P., Montalban X., Uccelli A.,
Savettieri G., Lincoln R.R., DeLoa C., Haines J.L., Pericak-Vance M.A.,
Compston A., Hauser S.L., Oksenberg J.R. Heterogeneity at the HLA-DRB1 locus
and risk for multiple sclerosis. // Hum. Mol. Genet. - 2006. - Vol. 15. - № 18. - P.
2813–2824.
138. Acheson E.D., Bachrach C.A., Wright F.M. Some comments on the
relationship of the distribution of multiple sclerosis to latitude, solar radiation, and
186
other variables. // Acta Psychiatr. Scand. Suppl. - 1960. - Vol. 35. - № 147. - P.
132–147.
139. Munger K.L., Levin L.I., Hollis B.W., Howard N.S., Ascherio A.
Serum 25-hydroxyvitamin D levels and risk of multiple sclerosis. // JAMA. - 2006.
- Vol. 296. - № 23. - P. 2832–2838.
140. Dean G. Multiple sclerosis in migrants to South Africa. // Isr. J. Med.
Sci. - 1971. - Vol. 7. - № 12. - P. 1568.
141. Islam T., Gauderman W.J., Cozen W., Hamilton A.S., Burnett M.E.,
Mack T.M. Differential twin concordance for multiple sclerosis by latitude of
birthplace. // Ann. Neurol. - 2006. - Vol. 60. - № 1. - P. 56–64.
142. Willer C.J., Dyment D.A., Sadovnick A.D., Rothwell P.M., Murray
T.J., Ebers G.C.; Canadian Collaborative Study Group. Timing of birth and risk of
multiple sclerosis: population based study. // BMJ. - 2005. - Vol. 330. - № 7483. P. 120.
143. Ramagopalan S.V., Maugeri N.J., Handunnetthi L., Lincoln M.R.,
Orton S.M., Dyment D.A., Deluca G.C., Herrera B.M., Chao M.J., Sadovnick
A.D., Ebers G.C., Knight J.C. Expression of the multiple sclerosis-associated
MHC class II Allele HLA-DRB1*1501 is regulated by vitamin D. // PLoS Genet. 2009. - Vol. 5. - № 2. - P. e1000369.
144. Cocco E., Meloni A., Murru M.R., Corongiu D., Tranquilli S., Fadda
E., Murru R., Schirru L., Secci M.A., Costa G., Asunis I., Cuccu S., Fenu G.,
Lorefice L., Carboni N., Mura G., Rosatelli M.C., Marrosu M.G. Vitamin D
responsive elements within the HLA-DRB1 promoter region in Sardinian multiple
sclerosis associated alleles. // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - № 7. - P. e41678.
145. Sandelin A. JASPAR: an open-access database for eukaryotic
transcription factor binding profiles // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32. - №
90001. - P. 91D – 94.
146. He B., Navikas V., Lundahl J., Söderström M., Hillert J. Tumor
necrosis factor α-308 alleles in multiple sclerosis and optic neuritis // J.
Neuroimmunol. - 1995. - Vol. 63. - № 2. - P. 143–147.
187
147. Hauser S.L., Bhan A.K., Gilles F., Kemp M., Kerr C., Weiner H.L.
Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis
lesions. // Ann. Neurol. - 1986. - Vol. 19. - № 6. - P. 578–587.
148. Selmaj K.W., Raine C.S. Tumor necrosis factor mediates myelin and
oligodendrocyte damage in vitro. // Ann. Neurol. - 1988. - Vol. 23. - № 4. - P.
339–346.
149. Sharief M.K., Hentges R. Association between tumor necrosis factoralpha and disease progression in patients with multiple sclerosis. // N. Engl. J.
Med. - 1991. - Vol. 325. - № 7. - P. 467–472.
150. Wilson A.G., di Giovine F.S., Blakemore A.I., Duff G.W. Single base
polymorphism in the human tumour necrosis factor alpha (TNF alpha) gene
detectable by NcoI restriction of PCR product. // Hum. Mol. Genet. - 1992. - Vol.
1. - № 5. - P. 353.
151. Kroeger K.M., Abraham L.J. Identification of an AP-2 element in the
-323 to -285 region of the TNF-alpha gene. // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1996. Vol. 40. - № 1. - P. 43–51.
152. Brinkman B.M., Zuijdeest D., Kaijzel E.L., Breedveld F.C., Verweij
C.L. Relevance of the tumor necrosis factor alpha (TNF alpha) -308 promoter
polymorphism in TNF alpha gene regulation. // J. Inflamm. - Vol. 46. - № 1. - P.
32–41.
153. Kroeger K.M., Carville K.S., Abraham L.J. The -308 tumor necrosis
factor-alpha promoter polymorphism effects transcription. // Mol. Immunol. 1997. - Vol. 34. - № 5. - P. 391–399.
154. Louis E., Franchimont D., Piron A., Gevaert Y., Schaaf-Lafontaine
N., Roland S., Mahieu P., Malaise M., De Groote D., Louis R., Belaiche J. Tumour
necrosis factor (TNF) gene polymorphism influences TNF-alpha production in
lipopolysaccharide (LPS)-stimulated whole blood cell culture in healthy humans. //
Clin. Exp. Immunol. - 1998. - Vol. 113. - № 3. - P. 401–406.
155. Zipp F., Weber F., Huber S., Sotgiu S., Czlonkowska A., Holler E.,
Albert E., Weiss E.H., Wekerle H., Hohlfeld R. Genetic control of multiple
188
sclerosis: increased production of lymphotoxin and tumor necrosis factor-alpha by
HLA-DR2+ T cells. // Ann. Neurol. - 1995. - Vol. 38. - № 5. - P. 723–730.
156. Braun N., Michel U., Ernst B.P., Metzner R., Bitsch A., Weber F.,
Rieckmann P. Gene polymorphism at position -308 of the tumor-necrosis-factoralpha (TNF-alpha) in multiple sclerosis and it’s influence on the regulation of
TNF-alpha production. // Neurosci. Lett. - 1996. - Vol. 215. - № 2. - P. 75–78.
157. Huizinga T.W., Westendorp R.G., Bollen E.L., Keijsers V., Brinkman
B.M., Langermans J.A., Breedveld F.C., Verweij C.L., van de Gaer L., Dams L.,
Crusius J.B., García-Gonzalez A., van Oosten B.W., Polman C.H., Peña A.S. TNFalpha promoter polymorphisms, production and susceptibility to multiple sclerosis
in different groups of patients. // J. Neuroimmunol. Elsevier. - 1997. - Vol. 72. - №
2. - P. 149–153.
158. Wingerchuk D., Liu Q., Sobell J., Sommer S., Weinshenker B.G. A
population-based case-control study of the tumor necrosis factor alpha-308
polymorphism in multiple sclerosis // Neurology. - 1997. - Vol. 49. - № 2. - P.
626–628.
159. Weinshenker B.G., Wingerchuk D.M., Liu Q., Bissonet A.S., Schaid
D.J., Sommer S.S. Genetic variation in the tumor necrosis factor alpha gene and
the outcome of multiple sclerosis. // Neurology. - 1997. - Vol. 49. - № 2. - P. 378–
385.
160. Mycko M., Kowalski W., Kwinkowski M., Buenafe A.C., Szymanska
B., Tronczynska E., Plucienniczak A., Selmaj K. Multiple sclerosis: the frequency
of allelic forms of tumor necrosis factor and lymphotoxin-alpha. // J.
Neuroimmunol. - 1998. - Vol. 84. - № 2. - P. 198–206.
161. Fernandez-Arquero M., Arroyo R., Rubio A., Martin C., Vigil P.,
Conejero L., Figueredo M.A., de la Concha E.G. Primary association of a TNF
gene polymorphism with susceptibility to multiple sclerosis. // Neurology. - 1999. Vol. 53. - № 6. - P. 1361–1363.
162. Mäurer M., Kruse N., Giess R., Kyriallis K., Toyka K.V., Rieckmann
P. Gene polymorphism at position -308 of the tumor necrosis factor alpha
189
promotor is not associated with disease progression in multiple sclerosis patients. //
J. Neurol. - 1999. - Vol. 246. - № 10. - P. 949–954.
163. Sotgiu S., Pugliatti M., Serra C., Rosati G., Dolei A., Marrosu M.G.
Tumor necrosis factor 2 allele does not contribute to increased tumor necrosis
factor-alpha production in Sardinian multiple sclerosis. // Ann. Neurol. - 1999. Vol. 46. - № 5. - P. 799–800.
164. Lucotte G., Bathelier C., Mercier G. TNF-alpha polymorphisms in
multiple sclerosis: no association with -238 and -308 promoter alleles, but the
microsatellite allele a11 is associated with the disease in French patients. // Mult.
Scler. - 2000. - Vol. 6. - № 2. - P. 78–80.
165. Anlar B., Alikaşifoglu M., Köse G., Güven A., Gürer Y., Yakut A.
Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphisms in children with multiple
sclerosis. // Neuropediatrics. - 2001. - Vol. 32. - № 4. - P. 214–216.
166. Fernandes Filho J.A., Vedeler C.A., Myhr K.M., Nyland H., Pandey
J.P. TNF-alpha and -beta gene polymorphisms in multiple sclerosis: a highly
significant role for determinants in the first intron of the TNF-beta gene. //
Autoimmunity. - 2002. - Vol. 35. - № 6. - P. 377–380.
167. Huizinga T.W., Zanelli E., Giphart M.J., Bollen E.L., Uitdehaag B.M.,
Polman C.H., Westendorp R.G. Evidence for additional genetic risk indicators of
relapse-onset MS within the HLA region. // Neurology. - 2002. - Vol. 59. - № 4. P. 549–555.
168. Drulović J., Popadić D., Mesaros S., Dujmović I., Cvetković I.,
Miljković D., Stojsavljević N., Pravica V., Pekmezović T., Bogdanović G.,
Jarebinski M., Mostarica Stojković M. Decreased frequency of the tumor necrosis
factor alpha -308 allele in Serbian patients with multiple sclerosis. // Eur. Neurol. –
2003. - Vol. 50. - № 1. - P. 25–29.
169. Luomala M., Lehtimäki T., Huhtala H., Ukkonen M., Koivula T.,
Hurme M., Elovaara I. Promoter polymorphism of IL-10 and severity of multiple
sclerosis. // Acta Neurol. Scand. - 2003. - Vol. 108. - № 6. - P. 396–400.
190
170. Duvefelt K., Anderson M., Fogdell-Hahn A., Hillert J. A NOTCH4
association with multiple sclerosis is secondary to HLA-DR*1501. // Tissue
Antigens. - 2004. - Vol. 63. - № 1. - P. 13–20.
171. Wirz S.A., Morale M.C., Marchetti B., Barr A.M., Sotgiu S., Rosati
G., Pugliatti M., Sanna M.V., Giliberto O., Bartfai T., Conti B. High frequency of
TNF alleles -238A and -376A in individuals from northern Sardinia. // Cytokine. 2004. - Vol. 26. - № 4. - P. 149–154.
172. Mihailova S., Ivanova M., Mihaylova A., Quin L., Mikova O.,
Naumova E. Pro- and anti-inflammatory cytokine gene polymorphism profiles in
Bulgarian multiple sclerosis patients. // J. Neuroimmunol. - 2005. - Vol. 168. - №
1-2. - P. 138–143.
173. Dong Y., Xu Z., Lin P. [Association among serous and cerebrospinal
fluid TNF-alpha level, gene polymorphisms of TNF-alpha and multiple sclerosis in
Han nationality of southern China]. // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2006. - Vol. 23. - № 6. - P. 677–679.
174. Forte G.I., Ragonese P., Salemi G., Scola L., Candore G., D'Amelio
M., Crivello A., Di Benedetto N., Nuzzo D., Giacalone A., Lio D., Caruso C.
Search for genetic factors associated with susceptibility to multiple sclerosis. //
Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2006. - Vol. - 1067. - P. 264–269.
175. Kamali-Sarvestani E., Nikseresht A., Aflaki E., Sarvari J., GharesiFard B. TNF-alpha, TNF-beta and IL-4 gene polymorphisms in Iranian patients
with multiple sclerosis. // Acta Neurol. Scand. - 2007. - Vol. 115. - № 3. - P. 161–
166.
176. Ristić S., Lovrecić L., Starcević-Cizmarević N., Brajenović-Milić B.,
Sega Jazbec S., Sepcić J., Kapović M., Peterlin B. Tumor necrosis factor-alpha308 gene polymorphism in Croatian and Slovenian multiple sclerosis patients. //
Eur. Neurol. - 2007. - Vol. 57. - № 4. - P. 203–207.
177. Sarial S., Shokrgozar M.A., Amirzargar A., Shokri F., Radfar J.,
Zohrevand P., Arjang Z., Sahraian M.A., Lotfi J. IL-1, IL-1R and TNFα Gene
191
Polymorphisms in Iranian Patients with Multiple Sclerosis // Iranian Journal of
Allergy, Asthma and Immunology. - 2008. - Vol. 7. - № 1. - P. 37–40.
178. Izad M., Vodjgani M., Niknam M.H., Amirzargar A., Shahbeigi S.,
Heidari A.B., Keramatipour M. Cytokines genes polymorphisms and risk of
multiple sclerosis. // Am. J. Med. Sci. - 2010. - Vol. 339. - № 4. - P. 327–331.
179. Akcali A., Pehlivan S., Pehlivan M., Sever T., Akgul P., Neyal M.
TNF-alpha promoter polymorphisms in multiple sclerosis: no association with 308 and -238 alleles, but the -857 alleles in associated with the disease in Turkish
patients. // Int. J. Immunogenet. - 2010. - Vol. 37. - № 2. - P. 91–95.
180. Mirowska-Guzel D., Gromadzka G., Mach A., Czlonkowski A.,
Czlonkowska A. Association of IL1A, IL1B, ILRN, IL6, IL10 and TNF-α
polymorphisms with risk and clinical course of multiple sclerosis in a Polish
population. // J. Neuroimmunol. Elsevier. - 2011. - Vol. 236. - № 1-2. - P. 87–92.
181. Shahbazi M., Roshandel D., Omidnyia E., Rshaidbaghan A.
Interaction of HLA-DRB1*1501 allele and TNF-alpha -308 G/A single nucleotide
polymorphism in the susceptibility to multiple sclerosis. // Clin. Immunol. - 2011. Vol. 139. - № 3. - P. 277–281.
182. Dowling P., Shang G., Raval S., Menonna J., Cook S., Husar W.
Involvement of the CD95 (APO-1/Fas) receptor/ligand system in multiple sclerosis
brain. // J. Exp. Med. - 1996. - Vol. – 184. - № 4. - P. 1513–1518.
183. D’Souza S.D., Bonetti B., Balasingam V., Cashman N.R., Barker
P.A., Troutt A.B., Raine C.S., Antel J.P. Multiple sclerosis: Fas signaling in
oligodendrocyte cell death. // J. Exp. Med. - 1996. - Vol. 184. - № 6. - P. 2361–
2370.
184. Cascino I., Ballerini C., Audino S., Rombolà G., Massacesi L.,
Colombo G., Scorza Smeraldi R., d'Alfonso S., Momigliano Richiardi P., Tosi R.,
Ruberti G. Fas gene polymorphisms are not associated with systemic lupus
erythematosus, multiple sclerosis and HIV infection. // Dis. Markers. - 1998. - Vol.
13. - № 4. - P. 221–225.
192
185. Rep M.H., Schrijver H.M., van Lopik T., Hintzen R.Q., Roos M.T.,
Adèr H.J., Polman C.H., van Lier R.A. Interferon (IFN)-beta treatment enhances
CD95 and interleukin 10 expression but reduces interferon-gamma producing T
cells in MS patients. // J. Neuroimmunol. - 1999. - Vol. 96. - № 1. - P. 92–100.
186. Huang
Q.R.,
Morris
D.,
Manolios
N.
Identification
and
characterization of polymorphisms in the promoter region of the human Apo-1/Fas
(CD95) gene. // Mol. Immunol. - 1997. - Vol. 34. - № 8-9. - P. 577–582.
187. Van Veen T., Kalkers N.F., Crusius J.B., van Winsen L., Barkhof F.,
Jongen P.J., Peña A.S., Polman C.H., Uitdehaag B.M. The FAS-670
polymorphism influences susceptibility to multiple sclerosis // J. Neuroimmunol. 2002. - Vol. 128. - № 1-2. - P. 95–100.
188. Su K.G., Banker G., Bourdette D., Forte M. Axonal degeneration in
multiple sclerosis: the mitochondrial hypothesis. // Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 2009. - Vol. 9. - № 5. - P. 411–417.
189. Monk K.R., Talbot W.S. Genetic dissection of myelinated axons in
zebrafish. // Curr. Opin. Neurobiol. - 2009. - Vol. 19. - № 5. - P. 486–490.
190. Lyons D.A., Naylor S.G., Scholze A., Talbot W.S. Kif1b is essential
for mRNA localization in oligodendrocytes and development of myelinated axons.
// Nat. Genet. - 2009. - Vol. 41. - № 7. - P. 854–858.
191. Martinelli-Boneschi F., Esposito F., Scalabrini D., Fenoglio C.,
Rodegher M.E., Brambilla P., Colombo B., Ghezzi A., Capra R., Collimedaglia L.,
Coniglio G., De Riz M., Serpente M., Cantoni C., Scarpini E., Martinelli V.,
Galimberti D., Comi G. Lack of replication of KIF1B gene in an Italian primary
progressive multiple sclerosis cohort. // Eur. J. Neurol. - 2010. - Vol. 17. - № 5. P. 740–745.
192. Booth D.R., Heard R.N., Stewart G.J., Cox M., Scott R.J., LechnerScott J., Goris A., Dobosi R., Dubois B., Saarela J., Leppä V., Peltonen L., Pirttila
T., Ban M., Baker A., De Jager P.L., Hafler D.A., Barcellos L.F., Ivinson A.J.,
McCauley J.L., Pericak-Vance M.A., Oksenberg J.R,. Hauser S.L., Sexton D.,
Haines J. Lack of support for association between the KIF1B rs10492972[C]
193
variant and multiple sclerosis. // Nat. Genet. - 2010. - Vol. 42. - № 6. - P. 469–470;
author reply 470–471.
193. Vazgiourakis V.M., Zervou M.I., Choulaki C., Bertsias G.,
Melissourgaki M., Yilmaz N., Sidiropoulos P., Plant D., Trouw L.A., Toes R.E.,
Kardassis D., Yavuz S., Boumpas D.T., Goulielmos G.N. A common SNP in the
CD40 region is associated with systemic lupus erythematosus and correlates with
altered CD40 expression: implications for the pathogenesis. // Ann. Rheum. Dis. 2011. - Vol. 70. - № 12. - P. 2184–2190.
194. Orozco G., Eyre S., Hinks A., Ke X.; Wellcome Trust Case Control
consortium YEAR Consortium. Association of CD40 with rheumatoid arthritis
confirmed in a large UK case-control study. // Ann. Rheum. Dis. - 2010. - Vol. 69.
- № 5. - P. 813–816.
195. Blanco-Kelly F., Matesanz F., Alcina A., Teruel M., Díaz-Gallo L.M.,
Gómez-García M., López-Nevot M.A., Rodrigo L., Nieto A., Cardeña C., Alcain
G., Díaz-Rubio M., de la Concha E.G., Fernandez O., Arroyo R., Martín J.,
Urcelay E. CD40: novel association with Crohn’s disease and replication in
multiple sclerosis susceptibility. // PLoS One. - 2010. - Vol. 5. - № 7. - P. e11520.
196. Jacobson E.M., Concepcion E., Oashi T., Tomer Y. A Graves’
disease-associated Kozak sequence single-nucleotide polymorphism enhances the
efficiency of CD40 gene translation: a case for translational pathophysiology. //
Endocrinology. - 2005. - Vol. 146. - № 6. - P. 2684–2691.
197. Balasa B., Krahl T., Patstone G., Lee J., Tisch R., McDevitt H.O.,
Sarvetnick N. CD40 ligand-CD40 interactions are necessary for the initiation of
insulitis and diabetes in nonobese diabetic mice. // J. Immunol. - 1997. - Vol. 159.
- № 9. - P. 4620–4627.
198. Grammer A.C., Slota R., Fischer R., Gur H., Girschick H., Yarboro
C., Illei G.G., Lipsky P.E. Abnormal germinal center reactions in systemic lupus
erythematosus demonstrated by blockade of CD154-CD40 interactions. // J. Clin.
Invest. - 2003. - Vol. 112. - № 10. - P. 1506–1520.
194
199. Durie F.H., Fava R.A., Foy T.M., Aruffo A., Ledbetter J.A., Noelle
R.J. Prevention of collagen-induced arthritis with an antibody to gp39, the ligand
for CD40. // Science. - 1993. - Vol. 261. - № 5126. - P. 1328–1330.
200. Kyburz D., Carson D.A., Corr M. The role of CD40 ligand and tumor
necrosis factor alpha signaling in the transgenic K/BxN mouse model of
rheumatoid arthritis. // Arthritis Rheum. - 2000. - Vol. 43. - № 11. - P. 2571–2577.
201. Barbé-Tuana F.M., Klein D., Ichii H., Berman D.M., Coffey L.,
Kenyon N.S., Ricordi C., Pastori R.L. CD40-CD40 ligand interaction activates
proinflammatory pathways in pancreatic islets. // Diabetes. - 2006. - Vol. 55. - №
9. - P. 2437–2445.
202. Gerritse K., Laman J.D., Noelle R.J., Aruffo A., Ledbetter J.A.,
Boersma W.J., Claassen E. CD40-CD40 ligand interactions in experimental
allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
- 1996. - Vol. 93. - № 6. - P. 2499–2504.
203. Denfeld R.W., Hollenbaugh D., Fehrenbach A., Weiss J.M., von
Leoprechting A., Mai B., Voith U., Schöpf E., Aruffo A., Simon J.C. CD40 is
functionally expressed on human keratinocytes. // Eur. J. Immunol. - 1996. - Vol.
26. - № 10. - P. 2329–2334.
204. Toubi E., Shoenfeld Y. The role of CD40-CD154 interactions in
autoimmunity and the benefit of disrupting this pathway. // Autoimmunity. - 2004.
Vol. 37. - № 6-7. - P. 457–464.
205. Kudryavtseva E.A., Rozhdestvenskii A.S., Kakulya A.V., Khanokh
E.V., Delov R.A., Malkova N.A., Korobko D.S., Platonov F.A., Aref’eva E.G.,
Zagorskaya N.N., Aliferova V.M., Titova M.A., Babenko S.A., Smagina I.V.,
El’сhaninova S.A., Zolovkina A.G., Lifshits G.I., Puzyrev V.P., Filipenko
M.L.Polymorphic locus rs10492972 of the KIF1B gene association with multiple
sclerosis in Russia: case control study. // Mol. Genet. Metab. - 2011. - Vol. 104. № 3. - P. 390–394.
206. Koutsis G., Karadima G., Floroskufi P., Sfagos C., Vassilopoulos D.,
Panas M. The rs10492972 KIF1B polymorphism and disease progression in Greek
195
patients with multiple sclerosis. // J. Neurol. 2011. - Vol. 258. - № 9. - P. 1726–
1728.
207. Gourraud P.A. When is the absence of evidence, evidence of absence?
Use of equivalence-based analyses in genetic epidemiology and a conclusion for
the KIF1B rs10492972*C allelic association in multiple sclerosis. // Genet.
Epidemiol. - 2011. - Vol. 35. - № 6. - P. 568–571.
208. Ханох Е.В., Рождественский А.С., Кудрявцева Е.А., Какуля А.В.,
Делов Р.А., Филипенко М.Л. Влияние полиморфных локусов rs1800629
(TNFa), rs6074022 (CD40), rs187238 (IL-18), rs10492972 (KIF1B), rs4149584
(TNFRSF1A) на особенности клинических проявлений рассеянного склероза
с учетом гендерной принадлежности в этнической группе русских clinical fe
// Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - Vol. 2. - P. 50–57.
209. Hintzen R.Q. Reply to “Lack of support for association between the
KIF1B rs10492972[C] variant and multiple sclerosis” // Nat. Genet. - 2010. - Vol.
42. - № 6. - P. 470–471.
210. Xu L., Yuan W., Sun H., Zhang X., Jia X., Shen C., Zhao Y., Sun D.,
Yu Y., Jin Y., Fu S. The polymorphisms of the TNF-α gene in multiple sclerosis?-a meta-analysis. // Mol. Biol. Rep. - 2011. - Vol. 38. - № 6. - P. 4137–4144.
211. Tolide-Ie H., Tabatabaee H.R., Kamali-Sarvestani E. Association
between Tumor Necrosis Factor- α-308 G/A Polymorphism and Multiple
Sclerosis: A Systematic Review and Meta-Analysis. // Iran. J. Med. Sci. - 2014.
Vol. 39. - № 1. - P. 2–10.
212. Yang Y., Sun R., Yang H., Zheng F., Gong F. -308 G > A of TNF-α
gene promoter decreases the risk of multiple sclerosis: a meta-analysis. // Mult.
Scler. - 2011. - Vol. 17. - № 6. - P. 658–665.
213. Sokolova E.A., Bondar I.A., Shabelnikova O.Y., Pyankova O.V.,
Filipenko M.L. Replication of KCNJ11 (p.E23K) and ABCC8 (p.S1369A)
Association in Russian Diabetes Mellitus 2 Type Cohort and Meta-Analysis //
PLoS One. - 2015. - Vol. 10. - № 5. - P. e0124662.
196
214. The MHC sequencing consortium. Complete sequence and gene map
of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium.
// Nature. - 1999. - Vol. 401. - № 6756. - P. 921–923.
215. Belov K., Deakin J.E., Papenfuss A.T., Baker M.L., Melman S.D.,
Siddle H.V., Gouin N., Goode D.L., Sargeant T.J., Robinson M.D., Wakefield
M.J., Mahony S., Cross J.G., Benos P.V., Samollow P.B., Speed T.P., Graves J.A.,
Miller R.D. Reconstructing an ancestral mammalian immune supercomplex from a
marsupial major histocompatibility complex. // PLoS Biol. - 2006. - Vol. 4. - № 3.
- P. e46.
216. Simmonds M.J., Gough. Genetic insights into disease mechanisms of
autoimmunity. // Br. Med. Bull. - 2004. - Vol. 71. - P. 93–113.
217. Walsh E.C., Mather K.A., Schaffner S.F., Farwell L., Daly M.J.,
Patterson N., Cullen M., Carrington M., Bugawan T.L., Erlich H., Campbell J.,
Barrett J., Miller K., Thomson G., Lander E.S., Rioux J.D. An integrated haplotype
map of the human major histocompatibility complex. // Am. J. Hum. Genet. 2003. - Vol. 73. - № 3. - P. 580–590.
218. Traherne J.А., Barcellos L.F., Sawcer S.J., Compston A., Ramsay
P.P., Hauser S.L., Oksenberg J.R., Trowsdale J.Association of the truncating splice
site mutation in BTNL2 with multiple sclerosis is secondary to HLA-DRB1*15 //
Hum. Mol. Genet. - 2006. - Vol. 15. - № 1. - P. 155–161.
219. Roth M.P., Nogueira L., Coppin H., Clanet M., Clayton J., CambonThomsen A. Tumor necrosis factor polymorphism in multiple sclerosis: no
additional association independent of HLA. // J. Neuroimmunol. - 1994. - Vol. 51.
- № 1. - P. 93–99.
220. Woolf B. On estimating the relation between blood group and disease.
// Ann. Hum. Genet. - 1955. - Vol. 19. - № 4. - P. 251–253.
221. Payami H., Joe S., Farid N.R., Stenszky V., Chan S.H,. Yeo P.P.,
Cheah J.S., Thomson G. Relative predispositional effects (RPEs) of marker alleles
with disease: HLA-DR alleles and Graves disease. // Am. J. Hum. Genet. - 1989. Vol. 45. - № 4. - P. 541–546.
197
222. Dyment D.A., Herrera B.M., Cader M.Z., Willer C.J., Lincoln M.R.,
Sadovnick A.D., Risch N., Ebers G.C. Complex interactions among MHC
haplotypes in multiple sclerosis: susceptibility and resistance. // Hum. Mol. Genet.
- 2005. - Vol. 14. - № 14. - P. 2019–2026.
223. Lehmann P.V., Forsthuber T., Miller A., Sercarz E.E. Spreading of Tcell autoimmunity to cryptic determinants of an autoantigen. // Nature. - 1992. Vol. 358. - № 6382. - P. 155–157.
224. Pritchard J.K., Przeworski M. Linkage disequilibrium in humans:
models and data. // Am. J. Hum. Genet. - 2001. - Vol. 69. - № 1. - P. 1–14.
225. De Bakker P.I., McVean G., Sabeti P.C., Miretti M.M., Green T.,
Marchini J., Ke X., Monsuur A.J., Whittaker P., Delgado M., Morrison J.,
Richardson A., Walsh E.C., Gao X., Galver L., Hart J., Hafler D.A., Pericak-Vance
M., Rioux J.D. A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease
association studies in the extended human MHC. // Nat. Genet. - 2006. - Vol. 38. № 10. - P. 1166–1172.
226. Zivković M., Stanković A., Dincić E., Popović M., Popović S.,
Raicević R., Alavantić D. The tag SNP for HLA-DRB1*1501, rs3135388, is
significantly associated with multiple sclerosis susceptibility: cost-effective highthroughput detection by real-time PCR. // Clin. Chim. Acta. - 2009. - Vol. 406. - №
1-2. - P. 27–30.
227. Hebbring S.J., Schrodi S.J., Ye Z., Zhou Z., Page D., Brilliant M.H. A
PheWAS approach in studying HLA-DRB1*1501. // Genes Immun. - 2013. - Vol.
14. - № 3. - P. 187–191.
228. Benešová Y., Vašků A., Stourač P., Hladíková M., Fiala A., Bednařík
J. Association of HLA-DRB1*1501 tagging rs3135388 gene polymorphism with
multiple sclerosis. // J. Neuroimmunol. - 2013. - Vol. 255. - № 1-2. - P. 92–96.
229. Csuka D., Simon D., Hóbor R., Uray K., Prohászka Z., Bánlaki Z.,
Jani P.K., Szilágyi Á., Hudecz F., Rajczy K., Beke G., Boros Major A., Tordai A.,
Illés Z., Berki T., Czirják L., Füst G. Serum concentration of immunoglobulin Gtype antibodies against the whole Epstein-Barr nuclear antigen 1 and its aa35-58 or
198
aa398-404 fragments in the sera of patients with systemic lupus erythematosus and
multiple sclerosis. // Clin. Exp. Immunol. - 2013. - Vol. 171. - № 3. - P. 255–262.
230. Schmied M.C., Zehetmayer S., Reindl M., Ehling R., Bajer-Kornek
B., Leutmezer F., Zebenholzer K., Hotzy C., Lichtner P., Meitinger T., Wichmann
H.E., Illig T., Gieger C., Huber K., Khalil M., Fuchs S., Schmidt H., Auff E.,
Kristoferitsch W., Fazekas F., Berger T., Vass K., Zimprich A. Replication study
of multiple sclerosis (MS) susceptibility alleles and correlation of DNA-variants
with disease features in a cohort of Austrian MS patients. // Neurogenetics. - 2012.
- Vol. 13. - № 2. - P. 181–187.
231. Sokolova E.A., Malkova N.A., Korobko D.S., Rozhdestvenskii A.S.,
Kakulya A.V., Khanokh E.V., Delov R.A., Platonov F.A., Popova T.Y., Aref'eva
E.G., Zagorskaya N.N., Alifirova V.M., Titova M.A., Smagina I.V., El'chaninova
S.A., Popovtseva A.V., Puzyrev V.P., Kulakova O.G., Tsareva E.Y., Favorova
O.O., Shchur S.G., Lashch N.Y., Popova N.F., Popova E.V., Gusev E.I., Boyko
A.N., Aulchenko Y.S., Filipenko M.L. Association of SNPs of CD40 Gene with
Multiple Sclerosis in Russians. // PLoS One. - 2013. - Vol. 8. - № 4. - P. e61032.
232. Patsopoulos N.A., Bayer Pharma MS Genetics Working Group;
Steering Committees of Studies Evaluating IFNβ-1b and a CCR1-Antagonist.
Genome-wide meta-analysis identifies novel multiple sclerosis susceptibility loci.
// Ann. Neurol. - 2011. - Vol. 70. - № 6. - P. 897–912.
233. Hafler D.A., International Multiple Sclerosis Genetics Consortium.
Risk alleles for multiple sclerosis identified by a genomewide study. // N. Engl. J.
Med. International Multiple Sclerosis Genetics Consortium. - 2007. - Vol. 357. № 9. - P. 851–862.
234. Skibola C.F., Nieters A., Bracci P.M., Curry J.D., Agana L., Skibola
D.R., Hubbard A., Becker N., Smith M.T., Holly E.A. A functional TNFRSF5
gene variant is associated with risk of lymphoma. // Blood. - 2008. - Vol. 111. - №
8. - P. 4348–4354.
235. Nieters A., Bracci P.M., de Sanjosé S., Becker N., Maynadié M.,
Benavente Y., Foretova L., Cocco P., Staines A., Holly E.A., Boffetta P., Brennan
199
P., Skibola C.F. A functional TNFRSF5 polymorphism and risk of non-Hodgkin
lymphoma, a pooled analysis. // Int. J. Cancer. - 2011. - Vol. 128. - № 6. - P. 1481–
1485.
236. Pineda B., Tarín J.J., Hermenegildo C., Laporta P., Cano A., GarcíaPérez M.Á. Gene-gene interaction between CD40 and CD40L reduces bone
mineral density and increases osteoporosis risk in women. // Osteoporos. Int. 2011. - Vol. 22. - № 5. - P. 1451–1458.
237. Shuang C., Dalin L., Weiguang Y., Zhenkun F., Fengyan X., Da P., Li
D. Association of CD40 gene polymorphisms with sporadic breast cancer in
Chinese Han women of Northeast China. // PLoS One. - 2011. - Vol. 6. - № 8. - P.
e23762.
238. Chen F., Hou S., Jiang Z., Chen Y., Kijlstra A., Rosenbaum J.T.,
Yang P. CD40 gene polymorphisms confer risk of Behcet’s disease but not of
Vogt-Koyanagi-Harada syndrome in a Han Chinese population. // Rheumatology
(Oxford). - 2012. - Vol. 51. - № 1. - P. 47–51.
239. Liu R., Xu N., Wang X., Shen L., Zhao G., Zhang H., Fan W.
Influence of MIF, CD40, and CD226 polymorphisms on risk of rheumatoid
arthritis. // Mol. Biol. Rep. - 2012. - Vol. 39. - № 6. - P. 6915–6922.
240. Johnson D.S., Mortazavi A., Myers R.M., Wold B. Genome-wide
mapping of in vivo protein-DNA interactions. // Science. - 2007. - Vol. 316. - №
5830. - P. 1497–1502.
241. Langmead B., Trapnell C., Pop M., Salzberg S.L. Ultrafast and
memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. //
Genome Biol. - 2009. - Vol. 10. - № 3. - P. R25.
242. Kondrakhin Y. Toolkit for ChIP-Seq based comparative analysis of
the PWM methods for prediction of transcription factor binding sites // Virtual
Biol. - 2014. - Vol. 1. - № 2. - P. 19.
243. Yevshin I., Yu. Kondrakhin Yu.S. IPSscan: the extended matrix
method for prediction of transcription factor binding sites. Novosibirsk:
Proceedings of BGRS/SB-2012. - 2012. - P. 335.
200
244. Wang J., Zhuang J., Iyer S., Lin X., Whitfield T.W., Greven M.C.,
Pierce B.G., Dong X., Kundaje A., Cheng Y., Rando O.J., Birney E., Myers R.M.,
Noble W.S., Snyder M., Weng Z. Sequence features and chromatin structure
around the genomic regions bound by 119 human transcription factors. // Genome
Res. - 2012. - Vol. 22. - № 9. - P. 1798–1812.
245. Newburger D.E., Bulyk M.L. UniPROBE: an online database of
protein binding microarray data on protein-DNA interactions. // Nucleic Acids
Res. - 2009. - Vol. 37. - № Database issue. - P. D77–D82.
246. Robasky K., Bulyk M.L. UniPROBE, update 2011: expanded content
and search tools in the online database of protein-binding microarray data on
protein-DNA interactions. // Nucleic Acids Res. - 2011. - Vol. 39. - № Database
issue. - P. D124–D128.
247. Agliardi C., Guerini F.R., Saresella M., Caputo D., Leone M.A.,
Zanzottera M., Bolognesi E., Marventano I., Barizzone N., Fasano M.E., AlDaghri N., Clerici M. Vitamin D receptor (VDR) gene SNPs influence VDR
expression and modulate protection from multiple sclerosis in HLA-DRB1*15positive individuals. // Brain. Behav. Immun. - 2011. - Vol. 25. - № 7. - P. 1460–
1467.
248. Langrish C.L., Chen Y., Blumenschein W.M., Mattson J., Basham B.,
Sedgwick J.D., McClanahan T., Kastelein R.A., Cua D.J. IL-23 drives a
pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. // J. Exp.
Med. - 2005. - Vol. 201. - № 2. - P. 233–240.
249. Brüstle A., Heink S., Huber M., Rosenplänter C., Stadelmann C., Yu
P., Arpaia E., Mak T.W., Kamradt T., Lohoff M. The development of
inflammatory T(H)-17 cells requires interferon-regulatory factor 4. // Nat.
Immunol. - 2007. - Vol. 8. - № 9. - P. 958–966.
250. Zhang X., Tao Y., Troiani L., Markovic-Plese S. Simvastatin Inhibits
IFN Regulatory Factor 4 Expression and Th17 Cell Differentiation in CD4+ T
Cells Derived from Patients with Multiple Sclerosis. // J. Immunol. - 2011. - Vol.
187. - № 6. - P. 3431–3437.
201
251. Ciofani M., Madar A., Galan C., Sellars M., Mace K., Pauli F.,
Agarwal A., Yang Y., Jain P., Kirigin F.K., Birchmeier C., Wagner E.F., Murphy
K.M., Myers R.M., Bonneau R., Littman D.R. A validated regulatory network for
Th17 cell specification. // Cell. - 2012. - Vol. – 151. - № 2. - P. 289–303.
252. Campbell C.D., Kirby A., Nemesh J., Daly M.J., Hirschhorn J.N. A
survey of allelic imbalance in F1 mice. // Genome Res. - 2008. - Vol. 18. - № 4. P. 555–563.
253. Ashburner M., Ball C.A., Blake J.A., Botstein D., Butler H., Cherry
J.M., Sherlock G. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene
Ontology Consortium. // Nat. Genet. - 2000. - Vol. 25. - № 1. - P. 25–29.
254. Maher B. Personal genomes: The case of the missing heritability. //
Nature. - 2008. - Vol. 456. - № 7218. - P. 18–21.
255. Akesson E., Coraddu F., Marrosu M.G., Massacesi L., Hensiek A.,
Harbo H.F., Oturai A., Trojano M., Momigliano-Richiardi P., Cocco E., Murru R.,
Hillert J., Compston A., Sawcer S. Refining the linkage analysis on chromosome
10 in 449 sib-pairs with multiple sclerosis. // J. Neuroimmunol. - 2003. - Vol. 143.
- № 1-2. - P. 31–38.
256. Matesanz F., Caro-Maldonado A., Fedetz M., Fernández O., Milne
R.L., Guerrero M., Delgado C., Alcina A. IL2RA/CD25 polymorphisms contribute
to multiple sclerosis susceptibility. // J. Neurol. - 2007. - Vol. 254. - № 5. - P. 682–
684.
257. Bielekova B., Catalfamo M., Reichert-Scrivner S., Packer A., Cerna
M., Waldmann T.A., McFarland H., Henkart P.A., Martin R. Regulatory
CD56(bright) natural killer cells mediate immunomodulatory effects of IL2Ralpha-targeted therapy (daclizumab) in multiple sclerosis. // Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. - 2006. - Vol. 103. - № 15. - P. 5941–5946.
258. Sawcer S. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune
mechanisms in multiple sclerosis. // Nature. - 2011. - Vol. 476. - № 7359. - P. 214–
219.
202
259. Zhong-Xing Z., Yuan-Yuan M., Hai Zhen M., Jian-Gang Z., Li-Feng
Z. FAS-1377 G/A (rs2234767) Polymorphism and Cancer Susceptibility: A MetaAnalysis of 17,858 Cases and 24,311 Controls // PLoS One. - 2013. - Vol. 8. - №
8. - P. 1–9.
260. Cullen S.P., Martin S.J. Fas and TRAIL “death receptors” as initiators
of inflammation: Implications for cancer // Semin. Cell Dev. Biol. Elsevier Ltd. 2015. - P. 1–9.
261. López-Gómez C., Fernández O., García-León J.A., Pinto-Medel M.J.,
Oliver-Martos B., Ortega-Pinazo J., Suardíaz M., García-Trujillo L., GuijarroCastro C., Benito-León J., Prat I., Varadé J., Álvarez-Lafuente R., Urcelay E.,
Leyva L. TRAIL/TRAIL receptor system and susceptibility to multiple sclerosis. //
PLoS One. - 2011. - Vol. 6. - № 7. - P. e21766.
262. McDonald W.I. Recommended diagnostic criteria for multiple
sclerosis: Guidelines from the international panel on the diagnosis of multiple
sclerosis // Ann. Neurol. - 2001. - Vol. 50. - № 1. - P. 121–127.
263. Kurtzke J.F. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an
expanded disability status scale (EDSS). // Neurology. - 1983. - Vol. 33. - № 11. P. 1444–1452.
264. Маниатис Т., Фрич Э. С.Д. Молекулярное клонирование. 1984.
480 p.
265. Akaike H. A new look at the statistical model identification // IEEE
Trans. Automat. Contr. - 1974. - Vol. 19. - № 6. - P. 716–723.
266. Lewontin R.C. The Interaction of Selection and Linkage. I. General
Considerations; Heterotic Models. // Genetics. - 1964. - Vol. 49. - № 1. - P. 49–67.
267. Slatkin M. Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary
past and mapping the medical future. // Nat. Rev. Genet. - 2008. - Vol. 9. - № 6. P. 477–485.
268. Hedrick P.W. Gametic disequilibrium measures: proceed with caution.
// Genetics. - 1987. - Vol. 117. - № 2. - P. 331–341.
Приложение А
Таблица А1. Перечень полиморфных локусов, расположенных в исследуемом регионе chr20:44730763-
1
rs6065924
44730763
G
A
2
«1.1.1.1.1», «1.1.1.1.3»
«JunD», «c-Jun»
2
rs11698347
44731309
G
A
1
«USF-1»
3
rs6104462
44731938
C
T
4
4
rs2024568
44732089
T
C
3
«1.2.6.2.1»
«1.1.1.1.1», «1.1.1.1.3», «1.2.6.5.1»,
«2.3.3.50.1»
«1.2.6.5.1», «2.3.3.50.1», «3.1.1.8.2»
5
rs6104463
44732451
G
A
2
«2.2.1.1.3», «3.3.1.1.1»
«FOXA1(HNF-3alpha)», «GATA-3»
6
rs11477903
44732708
T
-
7
rs5841619
44732716
T
-
8
rs6104464
44732734
G
A
9
rs1358719
44732746
A
G
10
rs6094252
44732762
A
G
11
rs6104465
44732787
C
T
1
«2.3.3.9.1»
«YY1»
12
rs6104466
44733314
G
A
1
«2.3.3.9.1»
«YY1»
13
rs6032661
44733811
A
G
14
rs7265701
44733840
A
G
15
rs11086997
44733890: 44733891
GG
G/-
16
rs61129795
44733891: 44733892
-
G
17
rs60636745
44733891
G
-
18
rs33956803
44733892: 44733893
-
G
19
rs6104467
44733908
G
A
20
rs6104468
44734060
C
T
Замена
rs
Позиция
Косенсус
Класс ТФ
№
Количество
ТФ*
chr20:44747346. * - Количество антител к ТФ, которые накрывают данный полиморфный локус.
Наименование ТФ согласно классификации
Вингендера
«JunD», «c-Jun», «c-Myc», «CTCF[11]»
«c-Myc», «CTCF[11]», «Hox-B9(HOX2E)»
204
21
rs6104469
44734088
C
T
22
rs55658673
44734146
G
C
23
rs11473298
44734180: 44734181
GA
GAGAAAAC
1
«6.5.2.0.2»
«TBR-2 (EOMES)»
24
rs60289553
44734189: 44734190
-
1
«6.5.2.0.2»
«TBR-2 (EOMES)»
25
rs34556692
44734190: 44734191
СС
1
«6.5.2.0.2»
«TBR-2 (EOMES)»
26
rs6065925
44734296
G
AGAAAAACG
AGAG/
AGAAAAACG
A
1
«6.5.2.0.2»
«TBR-2 (EOMES)»
27
rs6032662
44734310
C
A/G/T
1
«6.5.2.0.2»
«TBR-2 (EOMES)»
28
rs17380117
44734371
A
G
1
«6.5.2.0.2»
«TBR-2 (EOMES)»
29
rs6017736
44734420
A
G
1
«6.5.2.0.2»
«TBR-2 (EOMES)»
30
rs6074020
44734676
A
T
31
rs2024569
44734805
G
A
2
«2.3.3.9.1», «5.1.1.1.1»
«MEF-2A»,»YY1»
32
rs58539546
44735183
C
T
1
«5.1.1.1.1»
«MEF-2A»
33
rs6032663
44735263
T
G
1
«5.1.1.1.1»
«MEF-2A»
34
rs11481038
44735401: 44735402
-
A
2
«3.1.8.3.2», «5.1.1.1.1»
«MEF-2A», «ZEB2 (SMADIP1)»
35
rs35136738
44735402: 44735403
-
A
2
«3.1.8.3.2», «5.1.1.1.1»
«MEF-2A», «ZEB2 (SMADIP1)»
36
44735409: 44735410
-
A
2
«3.1.8.3.2», «5.1.1.1.1»
«MEF-2A», «ZEB2 (SMADIP1)»
44735854
A
G
38
rs11483182
rs60264097,
rs6065926
rs5841620
44736372
A
-
39
rs5841621
44736373
A
-
40
rs5841622
44736381
A
T/-
41
rs35979491
44736750: 44736751
-
G
6
«2.3.1.1.1», «2.3.4.8.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.5.1», «5.1.1.1.1», «6.1.1.2.1»
42
rs6074021
44736796
C
G
9
«2.1.2.4.1», «2.3.1.1.1», «2.3.4.8.1»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4»,
«5.1.1.1.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»
«MAZ[1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «NF-kappaB
p65 (RelA)», «PU.1(Spi-1)», «RCoR1», «Sp1»
«BCL-3», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)»,
«MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «NF-kappaB
p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «RCoR1», «Sp1», «VDR
(NR1I1)»
10
«1.1.1.2.7», «2.1.2.4.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.4.8.1», «3.5.1.2.3», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.4», «5.1.1.1.1», «6.1.1.2.1»,
«6.1.2.1.8»
«1.1.1.2.7», «BCL-3», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «NFkappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «RCoR1», «Sp1»,
«VDR (NR1I1)»
37
43
rs6104470
44736825
G
A
205
44
45
rs35388620
rs6131014
44737212: 44737213
44737383
-
T
C
C
34
34
46
rs57421274
44737393
A
C
34
47
rs11698938
44737630
C
T
21
«1.1.1.1.3», «1.1.1.2.7», «1.2.1.0.1»,
«1.2.1.0.3», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.2.1.1.2»,
«2.3.1.1.1», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1»,
«3.1.8.3.2», «3.2.2.2.2», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.1», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «8.1.1.0.1»
«1.1.1.1.3», «1.1.1.2.7», «1.2.1.0.1»,
«1.2.1.0.3», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.1.3.5.2»,
«2.3.1.1.1», «2.3.1.1.2»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.8.1»,
«3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2»,
«3.2.2.2.2», «3.5.1.2.3», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.4», «4.1.3.0.5», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «8.1.1.0.1»
«1.1.1.1.3», «1.1.1.2.7», «1.2.1.0.1»,
«1.2.1.0.3», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.1.3.5.2»,
«2.3.1.1.1», «2.3.1.1.2»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.8.1»,
«3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2»,
«3.2.2.2.2», «3.5.1.2.3», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.4», «4.1.3.0.5», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «8.1.1.0.1»
«1.1.1.2.7», «1.2.1.0.3», «1.2.6.5.5»,
«1.1.1.2.7», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9,
ZNF856)», «CTCF [11]», «DEC1 (STRA-13)», «E2A
(TCF-3, ITF-1)», «EBF1 (COE1)», «GATA-2», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF2A», «Max», «Meis2», «Mxi-1», «NF-YA (CP1A, CBFB)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «Pax-5»,
«RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST [1+7+1] (NRSF,
XBR)», «RXRalpha (NR2B1)», «SIX4», «SRF», «Sp1»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR
(NR1I1)», «YY1», «ZEB2 (SMADIP1)», «ZNF143 [7]
(SBF, STAF)», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9,
ZNF856)», «COUP-TFII (NR2F2)», «CTCF [11]»,
«DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)», «EBF1
(COE1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)»,»IRF-4 (LSIRF, NFEM5, MUM1, Pip)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87,
ZNF801)», «MEF-2A»,»Max», «Meis2», «Mxi-1», «NFkappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBPJkappa», «RCoR1», «REST [1+7+1] (NRSF, XBR)»,
«RXRalpha (NR2B1)», «SIX4», «SRF», «Sp1», «Sp2»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR
(NR1I1)», «YY1», «ZEB2 (SMADIP1)», «ZNF143 [7]
(SBF, STAF)», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9,
ZNF856)», «COUP-TFII (NR2F2)», «CTCF [11]»,
«DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)», «EBF1
(COE1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IRF-4 (LSIRF, NFEM5, MUM1, Pip)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87,
ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi-1», «NFkappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBPJkappa», «RCoR1», «REST [1+7+1] (NRSF, XBR)»,
«RXRalpha (NR2B1)», «SIX4», «SRF», «Sp1», «Sp2»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR
(NR1I1)», «YY1», «ZEB2 (SMADIP1)», «ZNF143 [7]
(SBF, STAF)», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9,
206
48
rs6131015
44737650
G
A
49
rs12480946
44737784
C
T
50
rs4812995
44737813
T
C
20
11
«2.1.2.4.1», «2.1.3.5.2», «2.3.1.1.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.15.1», «3.1.4.2.2»,
«3.1.6.3.1», «3.2.2.2.2», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.5.0.1», «7.1.1.1.1»
«1.1.1.2.7», «1.2.1.0.3», «1.2.6.5.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.5.2», «2.3.1.1.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.9.1»,
«3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1», «3.2.2.2.2»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4»,
«5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1»,
«6.1.2.1.8», «6.1.5.0.1», «7.1.1.1.1»
«2.1.3.5.2», «2.3.3.50.1»,
«2.3.3.50.2», «2.3.3.9.1»,
«3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4», «6.1.1.2.1»,
«6.1.2.1.8»
«1.2.6.5.1», «2.3.3.50.2»,
«3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1», «3.5.2.5.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»
51
rs4812996
44737941
C
T
7
52
rs7353523
44737981
C
T
6
53
rs58298647
44738008
C
T
6
54
rs11476023
44738971
A
-
1
«1.2.6.5.1», «3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1»,
«3.5.2.5.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»
«1.2.6.5.1», «3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1»,
«3.5.2.5.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»
«4.2.1.0.2»
55
rs6104471
44738993
C
T
56
rs1535044
44739156
G
A
3
«2.1.3.1.1», «6.1.1.2.1», «6.2.1.0.3»
57
rs6032664
44739419
A
T
5
«2.2.1.1.1», «3.1.8.3.2», «3.5.1.2.3»,
«6.1.1.2.1», «6.2.1.0.3»
58
rs58917883
44739502
G
A
9
«2.2.1.1.1», «2.3.1.3.1», «3.1.4.2.2»,
«3.1.8.3.2», «3.5.1.2.3», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.4», «6.1.1.2.1», «6.2.1.0.3»
ZNF856)», «COUP-TFII (NR2F2)», «CTCF [11]»,
«EBF1 (COE1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IRF-4
(LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «MEF-2A», «Max»,
«Meis2», «NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)»,
«Pax-5», «RCoR1», «SIX4», «SMAD1», «SRF», «Sp2»,
«VDR (NR1I1)», «YY1»
«1.1.1.2.7», «BCL-3», «COUP-TFII (NR2F2)»,
«CTCF[11]», «EBF1 (COE1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «MEF-2A»,
«Max», «Meis2», «NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi1)», «Pax-5», «RCoR1», «SIX4», «SMAD1», «SRF»,
«Sp2», «VDR (NR1I1)», «YY1»
«BCL-3», «COUP-TFII (NR2F2)», «CTCF [11]»,
«CTCFL [11] (CTCF-T, BORIS)», «Meis2», «NF-kappaB
p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «SIX4»
«BCL-3», «CTCFL [11] (CTCF-T, BORIS)», «Meis2»,
«NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «SIX4», «cMyc»
«BCL-3», «Meis2», «NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1
(Spi-1)», «SIX4», «c-Myc»
«BCL-3», «Meis2», «NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1
(Spi-1)», «SIX4», «c-Myc»
«NF-YB (CP1B, CBF-A)»
«NF-kappaB p65 (RelA)», «RXRalpha (NR2B1)»,
«STAT3»
«GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «NF-kappaB p65
(RelA)», «RCoR1», «STAT3», «ZEB2 (SMADIP1)»
«EGR1 (Krox-24)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «Meis2», «NFkappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «RCoR1»,
«STAT3», «ZEB2 (SMADIP1)»
207
59
60
61
rs6074022
rs13043048
rs56274410
44740196
44740247
44740277: 44740278
C
T
-
T
G
AG
46
42
39
«1.1.1.1.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.2»,
«1.1.1.2.6», «1.1.1.2.7», «1.1.7.1.2»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.2.1»,
«1.2.6.2.2», «1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5»,
«2.1.1.1.4», «2.1.1.2.1», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.3.1», «2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.8.1»,
«3.1.3.4.3», «3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1»,
«3.1.8.3.2», «3.2.2.2.2», «3.5.1.1.1»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4»,
«5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1»,
«6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1»,
«6.2.1.0.3», «6.4.1.0.2», «7.1.1.1.1»,
«8.1.1.0.1»
«1.1.1.1.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.2»,
«1.1.1.2.6», «1.1.1.2.7», «1.1.7.1.2»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.2.1»,
«1.2.6.2.2», «1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5»,
«2.1.1.1.4», «2.1.1.2.1», «2.1.2.4.1»,
«2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1», «2.3.1.3.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.3.4.3», «3.1.4.2.2»,
«3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2», «3.2.2.2.2»,
«3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1»,
«3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1»,
«3.5.3.0.4», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «7.1.1.1.1»
«1.1.1.1.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.2»,
«1.1.1.2.6», «1.1.7.1.2», «1.2.1.0.1»,
«1.2.1.0.3», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.2.2», «1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5»,
«2.1.1.1.4», «2.1.1.2.1», «2.1.2.4.1»,
«2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1», «2.3.1.3.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.8.1», «3.1.3.4.3»,
«3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2»,
«1.1.1.2.7», «3.1.3.4.3», «ATF-1», «Androgen receptor
(AR) (NR3C4)», «BACH2», «BCL-3», «BCL11A
[1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)», «DEC1 (STRA-13)»,
«E2A (TCF-3, ITF-1)», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox24)», «Elf-1», «Estrogen receptor alpha (ERalpha)
(NR3A1)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5,
MUM1, Pip)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)»,
«MEF-2A», «Max», «Meis2», «NF-E2L1 (NRF1)», «NFkappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBPJkappa», «RCoR1», «RXRalpha (NR2B1)», «Runx1
(PEBP2alphaB, CBF-alpha2, AML-1)», «SIX4»,
«SMAD1», «SRF», «STAT3», «Sp1», «TBP», «USF-1»,
«USF-2», «VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB7A», «ZEB2
(SMADIP1)», «c-Ets-1», «c-Jun», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «3.1.3.4.3», «ATF-1», «Androgen receptor
(AR) (NR3C4)», «BACH2», «BCL-3», «BCL11A
[1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)», «DEC1 (STRA-13)»,
«E2A (TCF-3, ITF-1)», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox24)», «Elf-1», «Estrogen receptor alpha (ERalpha)
(NR3A1)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5,
MUM1, Pip)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)»,
«MEF-2A», «Max», «Meis2», «NF-E2L1 (NRF1)», «NFkappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBPJkappa», «RCoR1», «SIX4», «SMAD1», «SRF»,
«STAT3», «Sp1», «USF-1», «USF-2», «VDR (NR1I1)»,
«YY1», «ZEB2 (SMADIP1)», «c-Ets-1», «c-Jun», «cMyb», «c-Myc»
«3.1.3.4.3», «ATF-1», «Androgen receptor (AR)
(NR3C4)», «BACH2», «BCL-3», «DEC1 (STRA-13)»,
«E2A (TCF-3, ITF-1)», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox24)», «Elf-1», «Estrogen receptor alpha (ERalpha)
(NR3A1)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5,
MUM1, Pip)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)»,
«MEF-2A», «Max», «Meis2», «NF-E2L1 (NRF1)», «NF-
208
«3.2.2.2.2», «3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3»,
«7.1.1.1.1»
«1.2.6.5.5», «2.2.1.1.2», «2.2.1.1.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.5.1», «6.1.5.0.1»
kappaB p65 (RelA)», «PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBPJkappa», «RCoR1», «SIX4», «SMAD1», «SRF»,
«STAT3», «Sp1», «USF-2», «VDR (NR1I1)», «YY1»,
«ZEB2 (SMADIP1)», «c-Ets-1», «c-Jun», «c-Myb», «cMyc»
«EBF1 (COE1)», «GATA-2», «GATA-3», «Max», «PU.1
(Spi-1)», «c-Ets-1»
«CTCF-like factors», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«GABPalpha (E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-2»,
«GATA-3», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «SIX4»,
«SMAD1»
«E2A (TCF-3, ITF-1)», «GATA-2», «GATA-3», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «SIX4», «SMAD1»
62
rs34501462
44741029
C
T
6
63
rs57662610,
rs12479871
44741453
G
A
8
64
rs4812997
44741498
A
G
6
65
rs1009373
44742001
G
T
4
66
rs1569723
44742064
C
A
3
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3», «2.2.1.1.2»,
«2.2.1.1.3», «3.1.6.3.1», «7.1.1.1.1»
«2.2.1.1.2», «2.2.1.1.3», «3.5.1.1.1»,
«5.1.2.0.1»
«1.2.6.5.1», «3.5.1.1.1», «5.1.2.0.1»
67
rs34058553
44742108: 44742109
-
G
3
«1.2.6.5.1», «3.5.1.1.1», «5.1.2.0.1»
«SRF», «c-Myb», «c-Myc»
68
rs6074023
44742450
G
A
1
«2.3.3.50.1»
«CTCF [11]»
69
rs13040307
44742647
C
T
70
rs6074024
44743310
A
G
71
rs6017737
44743311
T
C
72
rs11476127
44743834
G
-
2
«2.1.1.2.1», «6.5.2.0.2»
«Estrogen receptor alpha (ERalpha) (NR3A1)», «TBR-2
(EOMES)»
73
44744125
G
T
44744722
T
C
75
rs6074025
rs58976195,
rs17841916
rs4812998
44745896
A
G
2
«2.3.3.9.1», «3.5.2.3.1»
«Elf-1», «YY1»
76
rs6032666
44745945
C
T
3
«2.3.1.3.1», «2.3.3.9.1», «3.5.2.3.1»
«1.2.1.0.3», «2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.3.50.2», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.4.1», «3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1»,
«3.3.1.16.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «4.1.3.0.5», «6.1.1.2.1»,
«6.2.1.0.3»
«EGR1 (Krox-24)», «Elf-1», «YY1»
74
77
rs6032667
44746099
C
T
17
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3», «2.2.1.1.2»,
«2.2.1.1.3», «2.3.3.50», «3.1.6.3.1»,
«3.5.2.1.4», «7.1.1.1.1»
«GATA-2», «GATA-3», «SRF», «c-Myb»
«SRF», «c-Myb», «c-Myc»
«CTCFL [11] (CTCF-T, BORIS)», «EGR1 (Krox-24)»,
«Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «Fli-1», «HTF-4 (TCF-12,
HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1,
ZNFN1A1)», «Meis2», «NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1
(Spi-1)», «RCoR1», «SIX4», «STAT3», «Sp4», «TAF-1
(TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «YY1»
209
78
79
80
rs6074026
rs1800686
rs34475065
44746103
44746403
44746563
G
G
G
T
A
T
17
49
60
«1.2.1.0.3», «2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.3.50.2», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.4.1», «3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1»,
«3.3.1.16.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «4.1.3.0.5», «6.1.1.2.1»,
«6.2.1.0.3»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.5»,
«1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1»,
«2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1», «2.3.1.1.4»,
«2.3.1.3.1», «2.3.3.0.79»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50.1»,
«2.3.3.50.2», «2.3.3.8.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.4.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.4.2.2», «3.1.6.3.1»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.3.0.5», «3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1»,
«3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6»,
«3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1», «6.1.1.2.1»,
«6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1»,
«6.2.1.0.3», «7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.5»,
«1.1.1.2.7», «1.1.1.3.1», «1.2.1.0.1»,
«1.2.1.0.3», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1»,
«2.3.1.1.1», «2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«CTCFL [11] (CTCF-T, BORIS)», «EGR1 (Krox-24)»,
«Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «Fli-1», «HTF-4 (TCF-12,
HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1,
ZNFN1A1)», «Meis2», «NF-kappaB p65 (RelA)», «PU.1
(Spi-1)», «RCoR1», «SIX4», «STAT3», «Sp4», «TAF-1
(TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «YY1»
«1.1.1.2.7», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3», «BCL11A
[1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)», «CTCF [11]»,
«CTCFL [11] (CTCF-T, BORIS)», «DEC1 (STRA-13)»,
«EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1»,
«Elk-1», «FOXP1», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60,
NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)»,
«HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS,
Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «MAZ
[1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2»,
«Mxi-1», «NF-1C», «NF-YB (CP1B, CBF-A)», «NFkappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alpha-pal)», «PU.1 (Spi1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST [1+7+1]
(NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «STAT3», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR (NR1I1)», «YY1»,
«ZBTB7A», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1»
«1.1.1.2.7», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3», «BCL11A
[1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)», «CTCF [11]»,
«CTCFL [11] (CTCF-T, BORIS)», «DEC1 (STRA-13)»,
«E2A (TCF-3, ITF-1)», «E2F-4», «E2F-6», «EBF1
(COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1», «Elk-1»,
«FOXP1», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60, NRSF2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1,
ZNFN1A1)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD»,
«MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max»,
«Meis2», «Mxi-1», «NANOG», «NF-1C», «NF-YB
(CP1B, CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]»,
210
81
82
rs13037724
rs13041789
44746565
44746720
T
G
A
A
60
67
«3.3.2.1.4», «3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1»,
«3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1»,
«3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «7.1.2.0.3»,
«8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.5»,
«1.1.1.2.7», «1.1.1.3.1», «1.2.1.0.1»,
«1.2.1.0.3», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1»,
«2.3.1.1.1», «2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.2.1.4», «3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1»,
«3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1»,
«3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «7.1.2.0.3»,
«8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1»,
«REST [1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha
(NR2B1)», «SIX4», «SRF», «STAT3», «Sp1», «Sp4»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR
(NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
«ZBTB7A», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3», «BCL11A
[1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)», «CTCF [11]»,
«CTCFL [11] (CTCF-T, BORIS)», «DEC1 (STRA-13)»,
«E2A (TCF-3, ITF-1)», «E2F-4», «E2F-6», «EBF1
(COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1», «Elk-1»,
«FOXP1», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60, NRSF2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1,
ZNFN1A1)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD»,
«MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max»,
«Meis2», «Mxi-1», «NANOG», «NF-1C», «NF-YB
(CP1B, CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]»,
«PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1»,
«REST [1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha
(NR2B1)», «SIX4», «SRF», «STAT3», «Sp1», «Sp4»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR
(NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
«ZBTB7A», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «CTCFL [11] (CTCF-T,
BORIS)», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«E2F-4», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG»,
«Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1»,
«GABPalpha (E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
211
83
rs752118
44746738
C
T
69
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.1.16.2», «3.3.2.1.4»,
«3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5»,
«3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4»,
«3.7.1.6.2», «4.1.3.0.3», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.1», «4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3»,
«7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.1.16.2», «3.3.2.1.4»,
«3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5»,
«3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4»,
«3.7.1.6.2», «4.1.3.0.3», «4.1.3.0.5»,
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B
(KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5]
(Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45», «NF-E2L3
(NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB (CP1B,
CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alphapal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]», «PU.1
(Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST
[1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SRF», «STAT3», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «TCF-7L2 (TCF-4) [1]»,
«VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
«ZBTB7A», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «CTCFL [11] (CTCF-T,
BORIS)», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«E2F-4», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG»,
«Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1»,
«GABPalpha (E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B
(KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5]
(Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45», «NF-E2L3
(NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB (CP1B,
CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alphapal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]», «PU.1
(Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST
[1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD2», «SRF», «STAT3», «STAT5B»,
«Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]»,
«TBP», «TCF-7L2 (TCF-4) [1]», «VDR (NR1I1)»,
«YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)», «ZBTB7A»,
212
84
85
rs5841623
rs41417647
44746803
44746835
A
C
-
T
71
72
«4.2.1.0.1», «4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3»,
«6.2.1.0.6», «7.1.1.1.2», «7.1.2.0.3»,
«8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.1.16.2», «3.3.2.1.4»,
«3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1»,
«3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1»,
«3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2», «4.1.3.0.3»,
«4.1.3.0.5», «4.2.1.0.1», «4.2.1.0.2»,
«5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1»,
«6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1»,
«6.2.1.0.3», «6.2.1.0.6», «7.1.1.1.2»,
«7.1.1.1.3», «7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9] (FPM315,
ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «CTCFL [11] (CTCF-T,
BORIS)», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«E2F-4», «E2F-6», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)»,
«ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1»,
«GABPalpha (E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B
(KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5]
(Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45», «NF-E2L3
(NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB (CP1B,
CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alphapal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]», «PU.1
(Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST
[1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD2», «SMAD3», «SRF», «STAT3»,
«STAT5B», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «TCF-7L2 (TCF-4) [1]»,
«VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
«ZBTB7A», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «CTCFL [11] (CTCF-T,
BORIS)», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«E2F-4», «E2F-6», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)»,
«ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1»,
«GABPalpha (E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
213
86
rs11569298
44746853: 44746854
-
C
72
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.1.8.3.2», «3.2.2.2.2»,
«3.3.1.16.1», «3.3.1.16.2»,
«3.3.2.1.4», «3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5»,
«3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1»,
«3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6»,
«3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2»,
«4.1.3.0.3», «4.1.3.0.5», «4.2.1.0.1»,
«4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «6.2.1.0.6»,
«7.1.1.1.2», «7.1.1.1.3», «7.1.2.0.3»,
«8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.1.8.3.2», «3.2.2.2.2»,
«3.3.1.16.1», «3.3.1.16.2»,
«3.3.2.1.4», «3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5»,
«3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1»,
«3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6»,
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B
(KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5]
(Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45», «NF-E2L3
(NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB (CP1B,
CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alphapal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]», «PU.1
(Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST
[1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD2», «SMAD3», «SRF», «STAT3»,
«STAT5B», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «TCF-7L2 (TCF-4) [1]»,
«VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
«ZBTB7A», «ZEB2 (SMADIP1)», «ZNF143 [7] (SBF,
STAF)», «ZNF263 [9] (FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «CTCFL [11] (CTCF-T,
BORIS)», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«E2F-4», «E2F-6», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)»,
«ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1»,
«GABPalpha (E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B
(KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5]
(Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45», «NF-E2L3
(NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB (CP1B,
CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alphapal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]», «PU.1
(Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST
[1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD2», «SMAD3», «SRF», «STAT3»,
«STAT5B», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
214
87
88
rs11569299
rs11569300
44746858
44746914
G
T
A/С
-
70
«3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2»,
«4.1.3.0.3», «4.1.3.0.5», «4.2.1.0.1»,
«4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «6.2.1.0.6»,
«7.1.1.1.2», «7.1.1.1.3», «7.1.2.0.3»,
«8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.50.2»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.2.12»,
«3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1»,
«3.1.8.3.2», «3.2.2.2.2»,
«3.3.1.16.1», «3.3.1.16.2»,
«3.3.2.1.4», «3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5»,
«3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1»,
«3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6»,
«3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2»,
«4.1.3.0.3», «4.1.3.0.5», «4.2.1.0.1»,
«4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «6.2.1.0.6»,
«7.1.1.1.2», «7.1.1.1.3», «7.1.2.0.3»,
«8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «TCF-7L2 (TCF-4) [1]»,
«VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
«ZBTB7A», «ZEB2 (SMADIP1)», «ZNF143 [7] (SBF,
STAF)», «ZNF263 [9] (FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «CTCFL [11] (CTCF-T,
BORIS)», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«E2F-4», «E2F-6», «EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)»,
«ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1»,
«GABPalpha (E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1»,
«IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B
(KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5]
(Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45», «NF-E2L3
(NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB (CP1B,
CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alphapal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]», «PU.1
(Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST
[1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD2», «SMAD3», «SRF», «STAT3»,
«STAT5B», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «TCF-7L2 (TCF-4) [1]»,
«VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
«ZBTB7A», «ZEB2 (SMADIP1)», «ZNF143 [7] (SBF,
STAF)», «ZNF263 [9] (FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «DEC1 (STRA-13)», «E2A
(TCF-3, ITF-1)», «E2F-4», «E2F-6», «EBF1 (COE1)»,
215
89
rs11569301
44746942
C
T
70
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.8.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.4.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.2.12», «3.1.4.2.2»,
«3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.1.16.2», «3.3.2.1.4»,
«3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1»,
«3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1»,
«3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.1», «4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3»,
«6.2.1.0.6», «7.1.1.1.2», «7.1.1.1.3»,
«7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.8.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.4.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.2.12», «3.1.4.2.2»,
«3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.1.16.2», «3.3.2.1.4»,
«EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1»,
«FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60, NRSF2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1,
ZNFN1A1)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD»,
«MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max»,
«Meis2», «Mxi-1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45»,
«NF-E2L3 (NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB
(CP1B, CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]»,
«PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1»,
«REST [1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha
(NR2B1)», «SIX4», «SMAD2», «SMAD3», «SRF»,
«STAT3», «STAT5B», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR (NR1I1)», «YY1»,
«ZBTB33 (KAISO, ZNF348)», «ZBTB7A», «ZEB2
(SMADIP1)», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «DEC1 (STRA-13)», «E2A
(TCF-3, ITF-1)», «E2F-4», «E2F-6», «EBF1 (COE1)»,
«EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1»,
«FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60, NRSF2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1,
ZNFN1A1)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD»,
«MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max»,
«Meis2», «Mxi-1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45»,
«NF-E2L3 (NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB
(CP1B, CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]»,
«PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1»,
«REST [1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha
216
90
rs1883832
44746982
T
A/C/G
70
91
rs745307
44747086
G
A
62
«3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1»,
«3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1»,
«3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.1», «4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3»,
«6.2.1.0.6», «7.1.1.1.2», «7.1.1.1.3»,
«7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.1»,
«1.1.1.2.4», «1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7»,
«1.1.1.3.1», «1.1.4.1.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.0.79», «2.3.3.28.2»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.8.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.4.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.2.12», «3.1.4.2.2»,
«3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.1.16.2», «3.3.2.1.4»,
«3.3.2.1.6», «3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1»,
«3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4»,
«3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1»,
«3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1»,
«3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2», «4.1.3.0.5»,
«4.2.1.0.1», «4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3»,
«6.2.1.0.6», «7.1.1.1.2», «7.1.1.1.3»,
«7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.4»,
«1.1.1.2.5», «1.1.1.2.7», «1.1.1.3.1»,
«1.1.8.1.4», «1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
(NR2B1)», «SIX4», «SMAD2», «SMAD3», «SRF»,
«STAT3», «STAT5B», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR (NR1I1)», «YY1»,
«ZBTB33 (KAISO, ZNF348)», «ZBTB7A», «ZEB2
(SMADIP1)», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «1.1.4.1.1», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3»,
«BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)»,
«C/EBPdelta», «CTCF [11]», «DEC1 (STRA-13)», «E2A
(TCF-3, ITF-1)», «E2F-4», «E2F-6», «EBF1 (COE1)»,
«EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1»,
«FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60, NRSF2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «HTF-4
(TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1,
ZNFN1A1)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD»,
«MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max»,
«Meis2», «Mxi-1», «NANOG», «NF-1C», «NF-E2 p45»,
«NF-E2L3 (NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB
(CP1B, CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]»,
«PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1»,
«REST [1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha
(NR2B1)», «SIX4», «SMAD2», «SMAD3», «SRF»,
«STAT3», «STAT5B», «Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A,
TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR (NR1I1)», «YY1»,
«ZBTB33 (KAISO, ZNF348)», «ZBTB7A», «ZEB2
(SMADIP1)», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «ZNF263 [9]
(FPM315, ZKSCAN12)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«1.1.1.2.7», «ATF-2», «BACH1», «BCL-3», «BCL11A
[1+2+3] (CTIP1, EVI9, ZNF856)», «C/EBPdelta», «CTCF
[11]», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
217
92
rs11569302
44747104
C
T
60
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50.1»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.4.2.2»,
«3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1», «3.1.8.3.2»,
«3.2.2.2.2», «3.3.1.16.1»,
«3.3.1.16.2», «3.3.3.0.5»,
«3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3», «3.5.2.1.1»,
«3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5», «3.5.2.1.6»,
«3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1», «3.5.2.5.1»,
«3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2»,
«4.1.3.0.5», «4.2.1.0.1», «4.2.1.0.2»,
«5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1»,
«6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1»,
«6.2.1.0.3», «7.1.1.1.3», «7.1.2.0.3»,
«8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.4»,
«1.1.1.2.7», «1.1.1.3.1», «1.1.8.1.4»,
«1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.4.1.12», «1.2.6.5.1»,
«1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5», «2.1.2.4.1»,
«2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1», «2.3.1.1.1»,
«2.3.1.1.4», «2.3.1.3.1»,
«2.3.2.1.12», «2.3.3.0.35»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50.1»,
«2.3.3.8.1», «2.3.3.9.1»,
«2.3.4.0.27», «2.3.4.15.1»,
«2.3.4.4.1», «2.3.4.8.1», «3.1.4.2.2»,
«3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1», «3.2.2.2.2»,
«3.3.1.16.1», «3.3.1.16.2»,
«3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5»,
«3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.1», «3.5.3.0.4»,
«3.7.1.6.2», «4.1.3.0.5», «4.2.1.0.1»,
«EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1»,
«Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha
(E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1,
NF-E1)», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1,
IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF,
NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1,
RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)»,
«MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi-1», «NF-1C», «NFE2L3 (NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB
(CP1B, CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]»,
«PU.1 (Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1»,
«REST [1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha
(NR2B1)», «SIX4», «SMAD3», «SRF», «STAT3»,
«Sp1», «Sp4», «TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]»,
«TBP», «VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO,
ZNF348)», «ZBTB7A», «ZEB2 (SMADIP1)»,
«ZNF143[7] (SBF, STAF)», «c-Ets-1», «c-Myb», «cMyc»
«1.1.1.2.7», «ATF-2», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3]
(CTIP1, EVI9, ZNF856)», «C/EBPdelta», «CTCF [11]»,
«DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)», «EBF1
(COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1», «Elk-1»,
«FOXP1», «FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60,
NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)»,
«HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS,
Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-1», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5,
MUM1, Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)»,
«JunD», «MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A»,
«Max», «Meis2», «Mxi-1», «NF-1C», «NF-E2L3
(NRF3)», «NF-YA (CP1A, CBF-B)», «NF-YB (CP1B,
CBF-A)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1 (alphapal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PRDM14 [6]», «PU.1
(Spi-1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST
[1+7+1] (NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD3», «SRF», «STAT3», «Sp1», «Sp4»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «VDR
(NR1I1)», «YY1», «ZBTB33 (KAISO, ZNF348)»,
218
93
94
rs11569303
rs11569304
44747215
44747310
G
C
A
A
58
58
«4.2.1.0.2», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «7.1.1.1.3»,
«7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.4»,
«1.1.1.3.1», «1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.3.1.1», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1»,
«2.2.1.1.2», «2.3.1.1.1», «2.3.1.1.4»,
«2.3.1.3.1», «2.3.2.1.12»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.8.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.4.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.4.2.2», «3.1.4.5.1»,
«3.1.6.3.1», «3.2.2.2.2»,
«3.3.1.16.1», «3.3.1.16.2»,
«3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5»,
«3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2»,
«4.1.3.0.5», «4.2.1.0.1», «5.1.1.1.1»,
«5.1.2.0.1», «6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8»,
«6.1.4.1.1», «6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3»,
«7.1.1.1.3», «7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.4»,
«1.1.1.3.1», «1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.3.1.1», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1»,
«2.2.1.1.2», «2.3.1.1.1», «2.3.1.1.4»,
«2.3.1.3.1», «2.3.2.1.12»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.8.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.4.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.3.4.3», «3.1.4.2.2»,
«3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1», «3.2.2.2.2»,
«3.3.1.16.1», «3.3.1.16.2»,
«ZBTB7A», «ZNF143 [7] (SBF, STAF)», «c-Ets-1», «cMyb», «c-Myc»
«ATF-2», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3] (CTIP1, EVI9,
ZNF856)», «CTCF [11]», «CTCF-like factors», «DEC1
(STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)», «EBF1 (COE1)»,
«EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1», «Elk-1», «FOXP1»,
«FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha (E4TF1-60, NRSF2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1, NF-E1)», «GATA-2»,
«HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1 [4+2] (IK1, IKAROS,
Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-4 (LSIRF, NF-EM5, MUM1,
Pip)», «JARID1B (KDM5B, PLU1, RBBP2H1)», «JunD»,
«MAZ [1+5] (Zif87, ZNF801)», «MEF-2A», «Max»,
«Meis2», «Mxi-1», «NF-1C», «NF-E2L3 (NRF3)», «NFYA (CP1A, CBF-B)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PU.1 (Spi-1)»,
«Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST [1+7+1]
(NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD3», «SRF», «STAT3», «Sp1», «Sp4»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «Tal-1
(SCL, TCL-5)», «VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33
(KAISO, ZNF348)», «ZBTB7A», «ZNF143[7] (SBF,
STAF)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«3.1.3.4.3», «ATF-2», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3]
(CTIP1, EVI9, ZNF856)», «CTCF [11]», «CTCF-like
factors», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1»,
«Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha
(E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1,
NF-E1)», «GATA-2», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-4
(LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B (KDM5B,
PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87,
ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi-1», «NF1C», «NF-E2L3 (NRF3)», «NF-kappaB p65 (RelA)»,
«NRF-1 (alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PU.1 (Spi1)», «Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST [1+7+1]
219
95
rs34070768
44747346
G
A
57
«3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5»,
«3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2»,
«4.1.3.0.5», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «7.1.1.1.3»,
«7.1.2.0.3», «8.1.1.0.1»
«0.0.6.0.1», «1.1.1.1.3», «1.1.1.2.4»,
«1.1.1.3.1», «1.2.1.0.1», «1.2.1.0.3»,
«1.2.3.1.1», «1.2.4.1.12»,
«1.2.6.5.1», «1.2.6.5.5», «1.2.6.7.5»,
«2.1.2.4.1», «2.1.3.1.1», «2.2.1.1.1»,
«2.2.1.1.2», «2.3.1.1.1», «2.3.1.1.4»,
«2.3.1.3.1», «2.3.2.1.12»,
«2.3.3.28.2», «2.3.3.50»,
«2.3.3.50.1», «2.3.3.8.1»,
«2.3.3.9.1», «2.3.4.0.27»,
«2.3.4.15.1», «2.3.4.4.1»,
«2.3.4.8.1», «3.1.3.4.3», «3.1.4.2.2»,
«3.1.4.5.1», «3.1.6.3.1», «3.2.2.2.2»,
«3.3.1.16.1», «3.3.1.16.2»,
«3.3.3.0.5», «3.5.1.1.1», «3.5.1.2.3»,
«3.5.2.1.1», «3.5.2.1.4», «3.5.2.1.5»,
«3.5.2.1.6», «3.5.2.2.1», «3.5.2.3.1»,
«3.5.2.5.1», «3.5.3.0.4», «3.7.1.6.2»,
«4.1.3.0.5», «5.1.1.1.1», «5.1.2.0.1»,
«6.1.1.2.1», «6.1.2.1.8», «6.1.4.1.1»,
«6.1.5.0.1», «6.2.1.0.3», «7.1.1.1.3»,
«8.1.1.0.1»
(NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD3», «SRF», «STAT3», «Sp1», «Sp4»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «Tal-1
(SCL, TCL-5)», «VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33
(KAISO, ZNF348)», «ZBTB7A», «ZNF143[7] (SBF,
STAF)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
«3.1.3.4.3», «ATF-2», «BCL-3», «BCL11A [1+2+3]
(CTIP1, EVI9, ZNF856)», «CTCF [11]», «CTCF-like
factors», «DEC1 (STRA-13)», «E2A (TCF-3, ITF-1)»,
«EBF1 (COE1)», «EGR1 (Krox-24)», «ERG», «Elf-1»,
«Elk-1», «FOXP1», «FOXP2», «Fli-1», «GABPalpha
(E4TF1-60, NRSF-2alpha)», «GATA-1 (GF-1, EryF1,
NF-E1)», «GATA-2», «HTF-4 (TCF-12, HEB)», «IKZF1
[4+2] (IK1, IKAROS, Lyf-1, ZNFN1A1)», «IRF-4
(LSIRF, NF-EM5, MUM1, Pip)», «JARID1B (KDM5B,
PLU1, RBBP2H1)», «JunD», «MAZ [1+5] (Zif87,
ZNF801)», «MEF-2A», «Max», «Meis2», «Mxi-1», «NFE2L3 (NRF3)», «NF-kappaB p65 (RelA)», «NRF-1
(alpha-pal)», «PKNOX-1 (PREP-1)», «PU.1 (Spi-1)»,
«Pax-5», «RBP-Jkappa», «RCoR1», «REST [1+7+1]
(NRSF, XBR)», «RFX5», «RXRalpha (NR2B1)»,
«SIX4», «SMAD3», «SRF», «STAT3», «Sp1», «Sp4»,
«TAF-1 (TAF-2A, TAF(II)250) [1]», «TBP», «Tal-1
(SCL, TCL-5)», «VDR (NR1I1)», «YY1», «ZBTB33
(KAISO, ZNF348)», «ZBTB7A», «ZNF143 [7] (SBF,
STAF)», «c-Ets-1», «c-Myb», «c-Myc»
Таблица А2. Список генов, связанных с развитием рассеянного склероза
согласно литературным источникам
№
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
Наименование гена
ACE
ACP5
AGER
AHI1
ANG
ANKRD55
APOE
ASAP1,DDEF1
ASAP2
AXDND1
BACH2
BATF
BCL2
BDNF
BICD1
BTG1
BTNL2
BUD13
C16orf47
C1GALT1
C4orf19
C6orf10
CASP8
CASP9
CAV1
CBLB
CBLN2
CCL11
CCL13
CCL17
CCL2
CCL22
CCL5
CCL7
CCL8
CCR2
CCR5
CD1A
CD1E
CD226
CD24
CD40
Номер гена в базе Ensembl
ENSG00000159640
ENSG00000102575
ENSG00000204305
ENSG00000135541
ENSG00000214274
ENSG00000164512
ENSG00000130203
ENSG00000153317
ENSG00000151693
ENSG00000162779
ENSG00000112182
ENSG00000156127
ENSG00000171791
ENSG00000176697
ENSG00000151746
ENSG00000133639
ENSG00000204290
ENSG00000137656
ENSG00000197445
ENSG00000106392
ENSG00000154274
ENSG00000204296
ENSG00000064012
ENSG00000132906
ENSG00000105974
ENSG00000114423
ENSG00000141668
ENSG00000172156
ENSG00000181374
ENSG00000102970
ENSG00000108691
ENSG00000102962
ENSG00000161570
ENSG00000108688
ENSG00000108700
ENSG00000121807
ENSG00000160791
ENSG00000158477
ENSG00000158488
ENSG00000150637
ENSG00000272398
ENSG00000101017
221
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
CD46
CD58
CD6
CD86
CENPC1
CHRND
CIITA
CLEC16A
CLECL1
CNR1
CPAMD8
CRYAB
CSMD1
CTLA4
CUEDC1
CXCL12
CXCR4
CXCR5
CYP24A1
CYP27B1
CYP2R1
CYP7A1
DBC1
DDAH1
DENND3
DEXI
DHCR7
DKKL1
DLEU1
EBF1
EN1
EOMES
EPS15L1
ERAP1
EVI5
EXTL2
FAS
FCRL3
FOXG1
FOXO3
FUT8
GC
GPC5
GPR65
GSK3B
GSTM1
ENSG00000117335
ENSG00000116815
ENSG00000013725
ENSG00000114013
ENSG00000145241
ENSG00000135902
ENSG00000179583
ENSG00000038532
ENSG00000184293
ENSG00000118432
ENSG00000160111
ENSG00000109846
ENSG00000183117
ENSG00000163599
ENSG00000180891
ENSG00000107562
ENSG00000121966
ENSG00000160683
ENSG00000019186
ENSG00000111012
ENSG00000186104
ENSG00000167910
ENSG00000078725
ENSG00000153904
ENSG00000105339
ENSG00000182108
ENSG00000172893
ENSG00000104901
ENSG00000176124
ENSG00000164330
ENSG00000163064
ENSG00000163508
ENSG00000127527
ENSG00000164307
ENSG00000067208
ENSG00000162694
ENSG00000026103
ENSG00000160856
ENSG00000176165
ENSG00000118689
ENSG00000033170
ENSG00000145321
ENSG00000179399
ENSG00000140030
ENSG00000082701
ENSG00000134184
222
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
GSTP1
H6PD
HFE
HHEX
HLA-B
HLA-DQA1
HLA-DRA
HLA-DRB1
ICAM-1
IFIH1
IFNAR1
IFNAR2
IFNG
IGF2R
IGHG3
IL10
IL12A
IL12B
IL-17F
IL1B
IL1RN
IL2
IL22RA2
IL23A
IL23R
IL2RA
IL4
IL4R
IL6
IL6ST
IL7R,IL7RA
IL8
ILDR1
IRF5
IRF8
ITGA4
JARID2
KCNB2
KCNIP1
KIF1B
KIF21B
KIF5A
KIR2DL3
KLC1
KLRB1
LAG3
ENSG00000084207
ENSG00000049239
ENSG00000010704
ENSG00000152804
ENSG00000234745
ENSG00000196735
ENSG00000204287
ENSG00000196126
ENSG00000090339
ENSG00000115267
ENSG00000142166
ENSG00000159110
ENSG00000111537
ENSG00000197081
ENSG00000211897
ENSG00000136634
ENSG00000168811
ENSG00000113302
ENSG00000112116
ENSG00000125538
ENSG00000136689
ENSG00000109471
ENSG00000164485
ENSG00000110944
ENSG00000162594
ENSG00000134460
ENSG00000113520
ENSG00000077238
ENSG00000136244
ENSG00000134352
ENSG00000168685
ENSG00000169429
ENSG00000145103
ENSG00000128604
ENSG00000140968
ENSG00000115232
ENSG00000008083
ENSG00000182674
ENSG00000182132
ENSG00000054523
ENSG00000116852
ENSG00000155980
ENSG00000243772
ENSG00000126214
ENSG00000111796
ENSG00000089692
223
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
176
177
178
179
180
LEKR1
LOC132321
MALT1
MAMSTR
MANBA
MAPK1
MBP
MC1R
MERTK
MET
METTL1
MGAT5
MIF
MLANA
MMEL1
MMP12
MMP3
MMP9
MOG
MPHOSPH9
MPO
MPV17L2
MTHFR
MX1
MXI1
MYB
MYC
MYNN
NADSYN1
NCKAP5
NDFIP1
NFKBIZ
NGF
NLRP11
NOS2
NOTCH4
NQO1
NUBPL
OAS1
ODF3B
PDZRN4
PECAM1
PLEK
PNMT
POPDC3
PRF1
ENSG00000197980
ENSG00000151470
ENSG00000172175
ENSG00000176909
ENSG00000109323
ENSG00000100030
ENSG00000197971
ENSG00000258839
ENSG00000153208
ENSG00000105976
ENSG00000037897
ENSG00000152127
ENSG00000240972
ENSG00000120215
ENSG00000142606
ENSG00000110347
ENSG00000149968
ENSG00000100985
ENSG00000204655
ENSG00000051825
ENSG00000005381
ENSG00000254858
ENSG00000177000
ENSG00000157601
ENSG00000119950
ENSG00000118513
ENSG00000136997
ENSG00000085274
ENSG00000172890
ENSG00000176771
ENSG00000131507
ENSG00000144802
ENSG00000134259
ENSG00000179873
ENSG00000007171
ENSG00000204301
ENSG00000181019
ENSG00000151413
ENSG00000089127
ENSG00000177989
ENSG00000165966
ENSG00000261371
ENSG00000115956
ENSG00000141744
ENSG00000132429
ENSG00000180644
224
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
226
PRKCA
PRKCE
PRNP
PTAFR
PTGER4
PTK2
PTPN22
PTPRC
PTPRK
PVR
RAB38
RELN
RFK
RGS1
RGS14
RGS7
RPL5
RPS6KB1
SAE1
SGCD
SH2B3
SH2D2A
SH3GL2
SLC15A2
SLC25A36
SLC30A7
SOCS1
SOX8
SP140
SPP1
ST8SIA1
STAT3
SUMF1
SVIL
SYK
SYN3
TAC1
TAGAP
TBC1D2
TBX21
TCF7
TGFB1
THADA
TLR9
TMEM39A
TMEM74B
ENSG00000154229
ENSG00000171132
ENSG00000171867
ENSG00000169403
ENSG00000171522
ENSG00000169398
ENSG00000134242
ENSG00000081237
ENSG00000152894
ENSG00000073008
ENSG00000123892
ENSG00000189056
ENSG00000135002
ENSG00000090104
ENSG00000169220
ENSG00000182901
ENSG00000122406
ENSG00000108443
ENSG00000142230
ENSG00000170624
ENSG00000111252
ENSG00000027869
ENSG00000107295
ENSG00000163406
ENSG00000114120
ENSG00000162695
ENSG00000185338
ENSG00000005513
ENSG00000079263
ENSG00000118785
ENSG00000111728
ENSG00000168610
ENSG00000144455
ENSG00000197321
ENSG00000165025
ENSG00000185666
ENSG00000006128
ENSG00000164691
ENSG00000095383
ENSG00000073861
ENSG00000081059
ENSG00000105329
ENSG00000115970
ENSG00000239732
ENSG00000176142
ENSG00000125895
225
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
248
249
250
251
252
253
254
TNF
TNFRSF10A
TNFRSF14
TNFRSF1A
TNFRSF1B
TNFRSF6B
TNFSF10
TNFSF10B
TNFSF14
TNP2
TRAF1
TRBV20-1
TRIM2
TYK2
TYR
USP2
VAV1
VAV2
VDR
WDR7
YWHAG
ZBTB46
ZC3HAV1
ZFP36L1
ZIC1
ZMIZ1
ZNF433
ZNF767
ENSG00000232810
ENSG00000104689
ENSG00000157873
ENSG00000067182
ENSG00000028137
ENSG00000243509
ENSG00000121858
ENSG00000120889
ENSG00000125735
ENSG00000178279
ENSG00000056558
ENSG00000211747
ENSG00000109654
ENSG00000105397
ENSG00000077498
ENSG00000036672
ENSG00000141968
ENSG00000160293
ENSG00000111424
ENSG00000091157
ENSG00000170027
ENSG00000130584
ENSG00000105939
ENSG00000185650
ENSG00000152977
ENSG00000108175
ENSG00000197647
ENSG00000133624
Related documents
УДК 577.21 НОВЫЙ АЛЛЕЛЬ ГЕНА VRN
УДК 577.21 НОВЫЙ АЛЛЕЛЬ ГЕНА VRN
Download
advertisement