1.2. Поток генетической информации у прокариот Организация
advertisement
1.2. Поток генетической информации у прокариот Организация прокариотического гена Транскрипция у прокариот Трансляция у прокариот +/- ДНК и РНК Репарация ДНК Поток генетической информации у прокариот Ранние концепции молекулярной биологии были основаны на представлениях о разграничении функций хранения наследственной информации, выполняемой ДНК, и процессами реализации информации (синтеза полипептидной последовательности), на основе последовательности мРНК. Ярким выражением этой концепции послужила основная догма молекулярной биологии: «Один ген – один фермент», она предусматривала однонаправленный поток генетической информации: ДНК-РНК-белок, а также четкое разделение функций между этими 3 классами молекул [Ленгелер, Древс, Шлегель, 2005]. В наши дни основная догма существенно дополнена. Оказалось, что РНК-продукты экспресии генов также могут регулировать процессы клетки. Несмотря на то, что для большинства микроорганизмов наследственная информация хранится в виде ДНК, у многих вирусов геном представлен молекулами РНК. Изучение жизненного цикла РНКвирусов позволило открыть процесс обратной транскрипции, который представляет собой перенос информации от РНК к ДНК. Кроме того, открыто большое количество регуляторных молекул РНК, способных вырезать участки последовательностей и обладающие другой активностью (малые ядерные РНК, РНК-переключатели и др.). Современная схема (рис. 1.11) отражает поток генетической информации и включает различные направления ее переноса. Процессы передачи генетической информация включают передачу от родительских клеток дочерним (вертикальный путь), а также обмен генами между клетками одного поколения (горизонтальный перенос генов – ГПГ). Процессы ГПГ являются важной чертой все прокариотических организмов, сыгравшей, по-видимому, огромную роль в их эволюции. Дальнейшая реализация информации происходит с помощью механизмов транскрипции и трансляции, которые тесно сопряжены у прокариот. Завершение транскрипции часто зависит от одновременно протекающей трансляции. 1 Рис.1.11. Поток генетической информации [Joanne M. Willey et al., 2008 2008] Организация анизация прокариотического гена Роль ДНК – носителя наследственной информации была доказана в опытах О. Эвери, К. Маклеода и М. Маккарти в 1944 г. (трансформация стрептококка) и в эксперименте А. Херши и М. Чейза в 1952 г. (трансдукция E. сoli фагом). Цистрон = структурный ген (функциональная единица наследственного материала). Ген = Цистрон+регуляторные Цистрон+ре последовательности. Понятие «цистрон» происходит от названия «цис-транс « транс-теста» или теста на комплементацию, с помощью которого выявляются независимые генетические единицы. 2 Изначально «цис-транс-тест» был предложен в работах Э. Льюиса (1951 г.) и С. Бензера (1957 г.) для эукариотичесских организмов. В генетике прокариот используется метод инфицирования бактериальных культур парами различных мутантных фагов, отличающихся по морфологии зон лизиса от фага дикого типа. Анализ потомства фагов позволяет сделать вывод о локализации мутаций. Проявление фенотипа «дикого типа» свидетельствует о комплементации функции 2 дефектных фагов и расположении мутаций в независимо экспрессируемых генах. Ген включает, помимо цистрона, также регуляторные последовательности, которые действуют на гены, расположенные вблизи них (цис-активность). Некоторые цистроны кодируют «транс-белки», меняющие активность удаленных генов. У бактерий несколько цистронов транскрибируются в общую полицистронную мРНК, содержащую информацию о нескольких белковых продуктах. Полицистронная мРНК – оперон. Полярные эффекты – влияние экспрессии или мутации цистрона на расположенные ниже цистроны в общей молекуле мРНК, такие эффекты часто наблюдаются при совместной транскрипции и трансляции. Как правило, в бактериальных и вирусных геномах гены не прерываются (нет структур, подобных интронам в генах эукариот). мРНК у прокариот не подвергается сплайсингу. У многих вирусов и некоторых бактерий обнаруживается явления перекрывания генов, когда один участок кода задействован в синтезе нескольких белковых продуктов (рис. 1.12). Рис. 1.12. У некоторых фагов (на рисунке геном фага φX174) и некоторых бактерий обнаружено перекрывание генетической информации [Joanne M. Willey et al., 2008] 3 Рис. 1.13. Карта генома E. coli. [Barrick J. E., Yu D.S., Yoon S.H. et al., 2009] Гены бактерий на примере E. Сoli (рис. 1.13), в скобках указано количество генов в каждой группе. 1. Транспорт различных соединений и ионов в клетку (92). 2. Реакции, поставляющие энергию, включая катаболизм различных природных соединений (138). 3. Реакции синтеза аминокислот, нуклеотидов, витаминов, компонентов цепей переноса электронов, жирных кислот, фосфолипидов и некоторых других соединений (221). 4. Генерация АТФ при переносе электронов (15). 5. Катаболизм макромолекул (22). 6. Аппарат белкового синтеза (164). 4 7. Синтез нуклеиновых кислот, включая гены, контролирующие рекомбинацию и репарацию (49). 8. Синтез клеточной оболочки (42). 9. Хемотаксис и подвижность (39). 10. Прочие гены, в том числе с неизвестной функцией (110). Первая секвенированная бактериальная хромосома Haemophilus influenzae (1995). Общей длиной 1 830 137 пар оснований, она содержит 1 743 гена. В настоящее время секвенированы геномы всех патогенных бактерий и вирусов. Haemophilus influenza грамотрицательная палочка, (палочка является Афанасьева-Пфейффера Пфейффера) возбудителем – небольшая гемофилюсной инфекции. Присутствуя на слизистых слизисты у 90% взрослых людей, у детей с ослабленны ослабленным иммунитетом может стать причиной менингита, пневмонии и других форм инфекции. Транскрипция у прокариот Транскрипция – процесс синтеза мРНК на матрице ДНК (рис. 1.14) 1.14). Представляет собой процесс синтеза рибонуклеиновой кислоты на на матрице ДНК с использованием рибонуклеозидтрифосфатов ибонуклеозидтрифосфатов. Транскрипционная единица может включать несколько цистронов (оперонная организация). организация Рис. 1.14. Транскрипция прокариотического гена [Joanne M. Willey et al., 2008] 5 Процесс синтеза мРНК включает 3 этапа: инициация, элонгация и терминация (рис. 1.15) Рис. 1.15. Схема процесса транскрипции, отражающая стадии инициации, элонгации и терминации. Показана матричная и кодирующая цепи ДНК [Joanne M. Willey et al. 2008]. Инициация происходит на участке промотора. Сигма-субъединица фермента РНКполимеразы распознает участок ДНК – промотор. РНК полимераза бактерий включает 4 полипептида: 2 α-субъединицы, β-субъединица и β’-субъединица, дополнительную сигма-субъединицу (δ-субъединица). Комплекс а также ααββ’δ получил название холофермент РНК-полимераза (рис. 1.16). После синтеза 12 нуклеотидов, сигма-фактор покидает РНК-полимеразу и начинается элонгация. Процесс терминации управляется стоп-сигналами. Существует множество стоп-сигналов: петли и шпильки РНК, белки, терминирующие транскрипцию. Сигма-фактор придает РНК-полимеразе специфичность к нуклеотидным последовательностям. Например, у E.coli δ70 отвечает за узнавание большинства 6 «вегетативных» генов, важное значение имеют регионы -35 и -10 (выше точки начала транскрипции), содержащие консервативные последовательности TTGACA и TATAAT. Кодирующая цепь ДНК – аналогична мРНК. Матричная – служит для синтеза мРНК (комплиментарна). Это свойство объясняется исходной асимметрией строения ДНК, состоящей из разнонаправленных (от 3’ к 5’ и от 5’ к 3’) цепей. Начало синтеза на 3’ конце матричной цепи, синтез мРНК происходит от 5’ к 3’, при этом промотор распознает РНК полимеразу. Рис. 1.16. Модель строения бактериальной РНК-полимеразы и расположение молекул ДНК и РНК относительно фермента [Joanne M. Willey et al., 2008] Лидерная последовательность транскрибируется, но не транслируется. Она содержит регион Шайн-Дельгарно, необходимый для инициации трансляции, иногда участвует в регуляции транскрипции и трансляции. Обычно началом служит кодон AUG (формилметионин у бактерий). Терминатор вызывает отсоединение РНК-полимеразы. Трансляция у прокариот Трансляция – процесс перевода генетической информации в последовательность аминокислотных остатков в составе белка. Молекула мРНК может содержать одну или несколько открытых рамок считывания, каждая из которых определяет структуру полипептида и содержит сигнальные последовательности для инициации, элонгации и 7 терминации трансляции (рис. 1.17). 1.17) У E. coli скорость синтеза составляет 900 аминокислот в минуту, у эукариот – около 100 аминокислот в минуту. Рис. 1.17. Трансляция полицистронной мРНК [Joanne M. Willey et al al., 2008] Бактериальные 70S S рибосомы состоят из 30S и 50S субъединиц и диссоциируют при низких концентрациях ионов магния Mg2+. 30 S и 50 S субъединицы рибосом находятся в цитоплазме, их сборка часто инициируется м мРНК, которая может формировать полисому (рис. 1.18, 1.18 1.19). Максимальная загрузка м мРНК – рибосома через каждые 80 нуклеотидов (до 20 рибосом в полисоме). Рис. 1.18. 50 S и 30 S субъединицы бактериальной рибосомы в разных проекциях [Joanne M. Willey et al., 2008] 8 Рис. 1.19. Полисома в бактериальной клетке включает несколько рибосом одновременно си тезирующих белковые цепи на одной матрице мРНК [Joanne M.. Willey et al., 2008] Транскрипция и трансляция у бактерий и Архей происходят совместно, когда синтезируется мРНК, РНК, рибосомы уже готовы готовы к прикреплению и началу транскрипции. Связывание рибосомы происходит на RBS участке (последовательность последовательность ШайнаДельгарно). Инициирующий кодон кодирует формилметионин. Терминация трансляции чаще осуществляется UAA кодоном (рис. 1.20, 1.21, 1.22). Рис. 1.20. Строение транспортн ранспортной РНК [Joanne M. Willey et al., 2008 2008] 9 Рис. 1.21. Процесс инициации трансляции. Инициирование трансляции требует наличия 3 белковых регуляторов. IF-2 связывает ГТФ, формилметионин--тРНК и обеспечивает прикрепление формилметио ормилметионин-тРНК к Р-сайту 50S. IF-11 отвечает за связывание 30 и 50 субъединиц. IF-33 обеспечивает связывание мРНК с 30S субъединицей [Joanne M. Willey et al. 2008]. 10 Рис. 1.22. Схема переноса аминокислот на растущую пептидную цепь [Joanne M. Willey et al., 2008] 11 Многие антибиотики подавляют бактериальный синтез белков. Тетрациклины блокируют А-сайт рибосомы, Хлорамфеникол подавляет пептидилтрансферазную активность, стрептомицин нарушает узнавание кодонов. +/- ДНК и РНК Ассиметрия молекулы ДНК приводит к неравноценности двух антипараллельных цепей ДНК. Считывание информации в процессе транскрипции происходит с цепи 3’-5’ (матричная цепь ДНК), молекула мРНК, соответственно, имеет направление 5’-3’. Вторая цепь ДНК называется кодирующей (5’-3’), она является отражением матричной, но не содержит правильной последовательности триплетов для синтеза полипептидной цепи. «Правильная» мРНК, кодирующая «правильный» полипептид, считанная с матричной цепи ДНК, получила название +РНК, соответственно, комплементарная ей последовательность –РНК. Аналогично матричную цепь ДНК можно обозначить как –ДНК цепь, а кодирующую как +ДНК цепь. Все возможные варианты нуклеиновых кислот можно обнаружить в составе вирусных геномов. Строение нуклеиновых кислот лежит в основе современной классификации вирусов (Балтиморская классификация). На схеме (рис. 1.23) представлены молекулы + и – ДНК и РНК (одно- и двухцепочечные последовательности). +РНК является матрицей для синтеза белкового продукта, комплементарная цепь: –РНК или –ДНК, двойная спираль ДНК состоит из +и – цепей. Рис. 1.23. Современная классификация вирусов, основанная на структуре нуклеиновых кислот [International Committee on Taxonomy of Viruses] 12 Репарация ДНК Системы репарации ДНК имеются у всех живых организмов, они контролируют нарушения и модификацию структуры ДНК, предотвращая гибель клеток в условиях интенсивного мутагенеза. «Проверка» нуклеотидной последовательности начинается уже на этапе синтеза новой цепи, фермент ДНК-полимераза ДНК способна удалять «неправильные» основания из синтезируемой цепи («proofreading».) Одним дним из важнейших механизмов репарации является эксцизионная ксцизионная репарация репарация. Данный механизм исправляет повреждения одной из цепей ДНК (пиримидиновые димеры, АР-сайты и т. д.), при этом использует вторую цепь в качестве матрицы для заполнения пробелов. Эксцизионная репарация включает 2 механизма: эксцизионную репарацию оснований (ЭРО) и эксцизионную репарацию нуклеотидов (ЭРН). В ходе ЭРО механизма происходит вырезание дефектного нуклеотида с образованием АР-сайта сайта (апуриновый/апиримидиновый сайт). Затем фермент АР АРэндонуклеаза вырезает АР-сайт АР сайт с образованием пробела, который заполняется ДНК ДНКполимеразой и ДНК-лигазой лигазой (рис. 1.24). Рис. 1.24. Эксцизионная репарация оснований [Joanne M. Willey et al al., 2008] В случае эксцизионной репарации нуклеотидов происходит вырезание небольшой последовательности по краям от повреждения. В результате образуется пробел на одной цепи ДНК, его длина в среднем 12 нуклеотидов. Данный механизм может устранять тиминовые димеры и другие повреждения. Эксцизионная Эксцизионная репарация является наиболее востребованным механизмом репарации, который устраняет большую часть нарушений ДНК. Краткая схема ЭРН представлена на рисунке 1.25. 13 Рис. 1.26. Эксцизионная репарация нуклеотидов [Joanne M. Willey et al., 2008] При воздействии ультрафиолетового излучения отмечено явление фотореактивации в ответ на возникновение повреждений (пиримидиновых димеров). Механизм фотореактивации состоит в том, что фермент фотолиаза поглощает длинноволновой (> 300 нм) свет, далее он узнает пиримидиновые димеры, используя запасенную энергию, расщепляет циклобутановые структуры и восстанавливает нуклеотиды в исходном виде. Еще один важный механизм бактериальной репарации – репарация неспаренных нуклеотидов (mismatch repair). Фермент 14 MutS постоянно сканирует вновь синтезируемую цепь ДНК в поисках неправильно спаренных нуклеотидов. Фермент MutH удаляет нуклеотиды вблизи места ошибки. Затем разрыв заполняется ДНК-полимеразой и сшивается ДНК-лигазой, в целом данный механизм очень схож с эксцизионной репарацией (рис. 1.27). Рис. 1.27. Репарация неспаренных нуклеотидов [Joanne M. Willey et al., 2008] 15 В основе «mismatch mismatch repair»» лежит способность ферментов отличить «старую» и «новую» цепи ДНК. Вновь синтезируемая цепь не содержит метильных групп, в то же время на исходной цепи основания метилированы. Метилирование обеспечивается ферментом ДНК-метилтрансферазой, метилтрансферазой, в результате образуются образуются 3 продукта: N6- метиладенин, 5-метилцитозин, метилцитозин, N4-метилцитозин. Рекомбинационная репарация используется в случае повреждения двух цепей ДНК. В этом случае белок RecA вырезает «матрицу» из состава сестринской молекулы ДНК, которая используется для заполнения разрыва (рис. 1.28, 1.29) 1.29). Данный механизм широко распространен у эукариотических диплоидных организмов, когда в наличии всегда имеется сестринская хромосома. хромосома. У гаплоидных прокариот часто присутствует болеее одной копии хромосомы в клетке, клетке особенно но в условиях быстрого роста бактериальных культур, что делает возможным использование данного механизма. Рис. 1.28. Механизм рекомбинационной репарации [Joanne M. Willey et al., 2008] 16 Рис. 1.29. Механизм рекомбинационной репарации (продолжение) [Joanne M. Willey et al., 2008] SOS-репарация При множественных повреждениях останавливается репликация ДНК. Это вызывает активацию регулона, регулона содержащего до 20 генов, участвующих в процессе репарации. Гены SOS репарации меняют активность комплекса комплекса ДНК-полимеразы, он становится ся более быстрым, но менее точным. Синтез ДНК при SOS SOS-репарации подвержен ошибкам, что приводит к повышению частоту мутаций (непрямой мутагенез). Возможно, это увеличивает частоту положительных, бактериальных клеток. 17 адаптивных мутаций в популяции
