Изучение ультратонкого строения живых и инактивированных

НТП: ЖИВОТНОВОДСТВО И КОРМОПРОИЗВОДСТВО
УДК 619:616.981.42:615.371:615.372:576.007.4
ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАТОНКОГО СТРОЕНИЯ ЖИВЫХ
И ИНАКТИВИРОВАННЫХ КУЛЬТУР BRUCELLA
MELITENSIS И BRUCELLA ABORTUS
М.М. САЛЬНИКОВА, ведущий инженер
В.Р. САИТОВ, кандидат ветеринарных наук, зав.
сектором
Г.М. САФИНА, кандидат ветеринарных наук, старший
научный сотрудник
И.Ф. РАХМАТУЛЛИН, ведущий инженер
М.А. КОСАРЕВ, кандидат биологических наук, научный
сотрудник
А.М. ФОМИН, доктор ветеринарных наук, ведущий
научный сотрудник
ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
E-mail: vnivi@mail.ru
Резюме. Для электронно-микроскопических исследований
использовали культуры Brucella melitensis штамм Rev-1 и
Brucella abortus штаммы 82, R-1096, как живые, так и термо- или
γ-инактивированные вакцины. Отмечена палочковидная форма
клеток. Клеточная стенка имеет план строения идентичный всем
грамотрицательным бактериям. На внешней поверхности живых
и инактивированных клеток имеются мембраноподобные образования длиной до 0,9 мкм. Гамма-облученные микроорганизмы
отличаются увеличенным периплазматическим пространством,
просветленной цитоплазмой, отсутствием рибосом в области
нуклеоида, наличием плотных включений в цитоплазме и периплазматическом пространстве. В культуре отмечаются сферопласты и протопласты. Клетки бруцелл после тепловой обработки
характеризуются нарушением структуры цитоплазмы. Показано
конденсирование содержимого гиалоплазмы, нарушение белоксинтезинтезирующего комплекса клетки и фрагментирование
структур ДНК. Гамма-облучение можно отнести к более щадящим
режимам инактивации клеток, по сравнению с термообработкой.
В живых и инактивированных культурах отмечены электроннопрозрачные мембраноограниченные везикулы.
Ключевые слова: электронная микроскопия, бруцеллы, живые
противобруцеллезные вакцины, инактивированные вакцины.
Бруцеллез, как антропозоонозное заболевание, до сих
пор остается одной из важнейших проблем современной
медицины и ветеринарии [1, 2]. Более того, установлено
[3], что эпизоотолого-эпидемиологическая обстановка по
бруцеллезу, сложившаяся в ряде Федеральных округов
России, дает основание прогнозировать увеличение
заболеваемости этой инфекцией среди сельскохозяйственных животных и населения.
Поэтому, несмотря на достигнутые успехи в борьбе с этим заболеванием, научно-практический поиск
наиболее эффективных путей оздоровления от бруцеллеза, как отдельных хозяйств, так и целых регионов
по-прежнему остается одной из приоритетных задач
ветеринарной отрасли.
В системе противоэпизоотических мероприятий при
бруцеллезе животных решающую роль всегда играла
специфическая профилактика [4]. В связи с чем разработка γ-инактивированных вакцин и изучение их иммунологической эффективности, по сравнению с живыми
вакцинами штаммов B. abortus 82 и B. melitensis Rev-1,
на морских свинках и овцах – перспективное научное
направление.
Возбудитель заболевания Brucella относится к грамотрицательным, неспорообразующим аэробным бактериям с неясным систематическим положением [5].
Цель наших исследований – изучение влияния термои γ-инактивации на ультратонкую структуру бруцелл.
Условия, материалы и методы. Для электронномикроскопических исследований использовали культуры Brucella abortus штаммов 82 (SR форма колоний),
R-1096 (R-колонии) и Brucella melitensis штамм Rev-1
(S-колонии). Инактивацию проводили на штаммах B.
abortus 82 и B. melitensis Rev-1. Гамма-инактивированную
культуру получали облучением на гаммаустановке «Исследователь», Со60 с мощностью экспозиции 14 кГр/час
в дозе 60 кГр. Тепловую обработку проводили при t 80°С,
30 мин. Культуру выращивали в течение 3 суток на печеночном агаре. Концентрат бактериальной суспензии, полученный центрифугированием (8 тыс. об.), промывали
и заключали в агар Дифко. Кусочки, заключенной в агар
культуры, фиксировали 1 %-ным раствором глутарового альдегида (SERVA, Германия) на 0,1 М фосфатном
буфере рН 7,4 в течение12 часов в холодильнике с последующей фиксацией в 2 %-ной четырехокиси осмия
(Московский химзавод) на том же буфере 2 часа при
комнатной температуре. После дегидратации и пропитки заливочной средой образцы заключали в эпоновые смолы (SERVA, Германия). Ультратонкие срезы
получали на ультрамикротоме LKB-3 и просматривали
на электронном микроскопе JEM 100СХ-2. Полученные
Рис. 1. Клетки живой культуры: а) Brucella abortus штамм 82; б) Brucella abortus штамм R-1096; в) Brucella melitensis штамм
Rev-1; КС – клеточная стенка, ПП – периплазматическое пространство, ЦП – цитоплазма, ПМ – плазматическая мембрана,
ВК – включения.
80
Достижения науки и техники АПК, №3-2012
НТП: ЖИВОТНОВОДСТВО И КОРМОПРОИЗВОДСТВО
Ультраструктура цитоплазмы бактерий Brucella
обладает высокой электронной плотностью и заполнена
рибосомами и полирибосомами. Включений мало,
встречаются округлые мелкие плотные осмиофильные гранулы размером 20…
Рис. 2. Участок клетки живой культуры Brucella melitensis штамма Rev-1: а) на внешней поверх- 50 нм, а также округлые
ности клеток просматривается мембраноподобные образования (указано стрелками); б) рядом с внутрицитоплазматические
клеточной мембраной просматриваются мембраноограниченные сферические везикулы (указаны мембранные структуры в
стрелками); КС – клеточная стенка, ПП – периплазматическое пространство.
непосредственной близости
негативы сканировали на сканере EPSON PERFECTION
к плазматической мембране.
4990 FHOTO с разрешением 600 dpi.
В области нуклеоида некоторых клеток просматриваРезультаты и обсуждение. На ультратонких среются нити ДНК (см. рис. 1) на фоне темной цитоплазмы.
зах клетки живых культур имеют шаровидную или паОни не всегда видны из-за плотности цитоплазмы или
лочковидную форму, размеры 0,3…0,6 × 0,8…2,5 мкм.
плоскости прошедшего среза.
Все исследованные штаммы на субмикроскопическом
Вокруг клеток или в непосредственной близости
уровне практически не отличаются.
с наружной мембраной клеточной стенки были видНа микрофотографиях хорошо просматривается
ны ограниченные мембраной сферические везикулы
извилистая многослойная клеточная стенка и цитоплаз(см. рис. 2) размером 85…250 нм с электронносветлым
матическая мембрана, которые окружают бактериальные
содержимым, которые, вероятно, отшнуровываются от
клетки, характерные для грамотрицательных микроповерхности клеточной стенки. Подобные образования
организмов [6]. Наружная мембрана клеточной стенки
отмечены у бруцелл и другими авторами [7]. Деление
представляет собой волнообразную трехслойную струкклеток проходило путем перетяжки, что типично для
туру сходную с цитоплазматической мембраной (рис. 1).
грамотрицательных бактерий.
С внешней стороны наружной мембраны клеточной стенРазмер бактериальных клеток после инактивации
ки отмечается наличие электронноплотного материала
гамма-излучением не меняется. Клеточная стенка
мелко-глыбчатой или фибриллярной структуры, вероятно
выравнивается, с внешней и внутренней сторон наружсостоящего из олигосахаридных детерминантных групп
ной мембраны наблюдается меньшее количество или
липополисахаридов. Кроме того, на внешней поверхполное отсутствие электронноплотного материала. На
ности клеток просматриваются мембраноподобные обнаружной мембране клеточной стенки выявлены мемразования (рис. 2) длиной до 20…90 нм и шириной 7,5 нм.
браноподобные структуры (рис. 3). При инактивироваПри анализе литературы мы не обнаружили упоминаний о
нии культуры происходит неравномерное увеличение
наличии подобных образований у бруцелл. Под наружной
и просветление периплазматического пространства.
мембраной просматривается пластинчатый мембраноОдновременно отмечается конденсирование глобулярподобный внутренний ригидный слой клеточной стенки,
ных компонентов и появление осмиофильных гранул
образованный пептидогликанами. Общая толщина слоев
в отдельных участках перипласта, особенно много
клеточной стенки составляет 21…24 нм.
их со стороны цитоплазматической мембраны. На
Под клеточной стенкой располагается относительно
некоторых участках можно наблюдать утрату целостровная цитоплазматическая мембрана (7,5…8,5 нм),
ности клеточной стенки. В инактивированной культуре
контуры ее не повторяют извилистости наружной мемвстречаются протопласты и сферопласты. Цитоплазма
браны. У некоторых клеток наблюдается примыкание
гамма-облученных клеток просветляется и уменьшацитоплазматической мембраны к клеточной стенке.
Между цитоплазматической мембраной и клеточной
стенкой имеется периплазматическое пространство,
характерное для грамотрицательных бактерий. У некоторых клеток (возможно, во
время LOG-фазы роста) оно
располагается ровной полосой шириной 32…45 нм с гомогенным веществом средней электронной плотности. У
штамма 82 отмечается более
светлое периплазматическое
пространство. Иногда наблюдается увеличение площади
Рис. 3. Клетки Brucella melitensis культуры штамма Rev-1 после гамма-облучения: а) проперипласта с электронно- сматриваются клетка с ДКС, на внешней поверхности клеток просматривается мембранопопрозрачным содержимым в добные образования (указано стрелками); б) на дистальных участках наблюдается увеличение
дистальных участках бруцелл периплазматического пространства; КС – клеточная стенка, ПП – периплазматическое про(на стационарной фазе ро- странство, ЦП – цитоплазма; ПМ – плазматическая мембрана, ВК – включения, ДКС – дефект
клеточной стенки
ста) до 150 нм.
Достижения науки и техники АПК, №3-2012
81
НТП: ЖИВОТНОВОДСТВО И КОРМОПРОИЗВОДСТВО
включений размером 40…50
нм. Между клетками и в непосредственной близости с
клеточной стенкой на микрофотографиях наблюдаются мембраноограниченные
сферические везикулы.
В среде, окружающей
бактериальные клетки после
облучения и теплового воздействия, обнаруживаются
фрагменты клеточных мембран, которые не наблюдались в живых культурах.
Выводы. Таким образом,
Рис. 4. Клетки после тепловой обработки: а) Brucella melitensis штамм Rev-1. На внешней
поверхности клеток просматривается мембрано-подобные образования (указано стрелками); б) на внешней поверхности клеBrucella abortus штамма 82; КС – клеточная стенка, ПП – периплазматическое пространство, ток бруцелл имеются мемЦП – цитоплазма; ВЗ – везикулы.
браноподобные образования
длиной до 0,9 мкм, которые
сохраняются после инактивации. Гамма-облученные
ется количество свободных рибосом. В клетках четко
микроорганизмы характеризуются увеличенным пепросматриваются нити ДНК. В структуре цитоплазмы
риплазматическим пространством из-за уменьшения
определяются плотные осмиофильные включения
объема цитоплазмы, меньшим количеством рибосом,
размером 40…50 нм в отдельных участках клетки. На
наличием плотных включений в цитоплазме и перимикрофотографиях среди клеток наблюдаются мемплазматическом пространстве. В культуре отмечается
браноограниченные сферические везикулы.
появление сферопластов и протопластов.
Размер клеток бруцелл после тепловой обработки
Клетки бруцелл после тепловой обработки отличаются
практически не меняется, клеточная стенка теряет изот живых нарушением структуры цитоплазмы: конденсивилистость, ее структура повторяет строение клеточной
рование содержимого гиалоплазмы, фрагментирование
стенки гамма-облученных клеток. Отмечаются мембраструктур ДНК. Вероятно, это связано с разрушением
ноподобные структуры на внешней стороне клеточной
белок-синтезинтезирующего комплекса клетки.
стенки (рис. 4). Периплазматическое пространство
Гамма-облучение можно отнести к более щадяпросветляется и уменьшается. Это приводит к тому, что
щим режимам инактивации, по сравнению с термоне всегда можно рассмотреть границу между клеточной
обработкой. В живых и инактивированных культурах
стенкой и плазматической мембраной. Обнаруживаются
отмечаются электронно-прозрачные мембраноограсферопласты. В бактериальных клетках после теплового
ниченные везикулы.
шока нарушается структура цитоплазмы. Ее конденсиАвторы выражают благодарность доктору медицинрованное содержимое в виде гомогенных электронских наук Диденко Любови Васильевне заведующей
ноплотных участков распределено неравномерно. В
лабораторией анатомии микроорганизмов института
цитоплазме просматриваются редкие фибриллярные
эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи
структуры ДНК, полирибосомы и рибосомы не обнаруРАМН за полезные консультации.
живаются. Также отмечается накопление осмиофильных
Литература.
1. Желудков М.М., Цирельсон Л.Е. и др. Состояние заболеваемости бруцеллёзом на территории РФ. // Современные
аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России: Материалы научно- практической конференции, 21-22марта 2007 г., г. Ставрополь. 2.1. – Ставрополь, 2007. – С 142-145.
2. Цирельсон Л.Е. Бруцеллёз в России: профессиональные заболевания и трудовой прогноз. // Эпидемиология и инфекционные болезни. – № 5. – 2011. – С. 43-47.
3. Эпизотолого-эпидемиологическая обстановка по бруцеллёзу в Российской Федерации в 2010 г. и прогноз на 2011 г.
/ Г.И. Лямкин, Н.И. Тихонко, Е.А. Манин, С.В. Виленская, С.И. Головыева, Д.В. Русанова, А.Н. Куличенко // Проблемы особо
опасных инфекции. – № 1. – 2011. – С. 20-23.
4. Аракелян П.К., Димов С.К., Ощепков В.Г., Донченко А.С. Система контроля эпизоотологического процесса бруцеллёза
мелкого рогатого скота. // Ветеринария – № 2. – 2008. – С. 20-22.
5. Золотарев А.Г., Дармов И.В., Пименов Е.В. Возбудители особо опасных инфекционных заболеваний бактериальной
природы: Морфология и ультраструктура. – М.: «Медицина», 2006. – 272 с.
6. Авакян А.А., Кац Л.Н., Павлова И.Б. Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных. – М.: «Медицина»,
1972. – 182 с.
7. Petris S., Karlsbad G., Kessel R.W. Ultrastructure of S and R Variants of Brucella abortus Grown on a Lifeless Medium. // J . gen.
Microbiol. – № 35. – 1963. – P. 373-382.
STUDY OF LIVE AND INACTIVATED BRUCELLA MELITENSIS И BRUCELLA ABORTUS CELL
CULTURES ULTRASTUCTURE
M.M. Salnikova, V.R. Saitov, G.M. Safina, I.F. Rahmatullin, M.A. Kosarev, A.M. Fomin
Summary. Farm animal brucellosis still remains one of the crucial challenges in modern Medicine and Animal Health. Rev-1 Brucella
melitensis and 82, R-1096 Brucella abortus live, thermo- and γ-inactivated vaccine strain cultures were studied under electron microscopy. The cells had a rod-like shape. The cellular walls had the structure peculiar to all the gram-negative bacteria. The outer surface
of both live and inactivated cells has membrane-like formations with length up to 0,9 mkm. The γ-irradiated microorganisms had a
higher periplasmic space, cleared cytoplasm, with no ribosome in nucleoid, but firm inclusions in cytoplasm and periplasmic space.
The cultures had spheroplasts and protoplasts. Heating destroyed brucella cytoplasm structure. The hyaloplasm condensation, the
protein producing apparatus was damaged, and the DNA structure fragmentation was observed. The inactivation involving γ-irradiation
is sparer than heating. The live and inactivated cultures had electronically transparent membrane-confined vesicles.
Key words: electron microscopy, brucella, live vaccine, inactivated vaccine.
82
Достижения науки и техники АПК, №3-2012