017398 B1 017398 B1 (11) 017398

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
017398
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2012.12.28
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. C12N 15/65 (2006.01)
C12N 15/67 (2006.01)
C12N 15/79 (2006.01)
201070152
(22)
Дата подачи заявки
2008.07.16
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ,
ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ВЫСОКИЕ УРОВНИ ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕГО ИНТЕРЕС
БЕЛКА
B1
017398
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Это изобретение относится к промышленному получению белков. Конкретнее, изобретение
относится к способу получения клеток, которые стабильно экспрессируют представляющий
интерес белок, даже при культивировании в отсутствие давления отбора. DHFR используется
в качестве суррогатного маркера. Трансфицированные клетки отбираются не на основании
устойчивости к токсическим соединениям, а на основании флуоресценции, измеренной на FACS с
использованием флуоресцентного МТХ.
Кроуфорд Мак Фадд Тара Кристен,
Янг Мейджия (US)
Медведев В.Н. (RU)
B1
(56) US-A1-2004/148647
VAN TENDELOO VIGGO F. I. ET AL.:
"Efficient generation of stably electrotransfected
human hematopoietic cell lines without drug selection
by consecutive FACsorting", CYTOMETRY, vol. 41,
no. 1, 1 September 2000 (2000-09-01), pages 31-35,
XP002499299, ISSN: 0196-4763, page 32, left-hand
column, paragraph 3; fig. 2, 3
JOHNSTON R. N. ET AL.: "RAPID
SPONTANEOUS
DI
HYDRO
FOLATE
REDUCTASE EC-1.5.1.3 GENE AMPLIFICATION
SHOWN BY FLUORESCENCE ACTIVATED CELL
SORTING", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL
ACADEMY OF SCIENCFS OF THE UNITED
STATES OF AMERICA, vol. 80, no. 12, 1983, pages
3711-3715, XP002499300, ISSN: 0027-8424, page
3711, right-hand column, paragraph 2 - page 3712,
left-hand column, paragraph 2; table 2
017398
(31) 60/961,038
(32) 2007.07.17
(33) US
(43) 2010.06.30
(86) PCT/EP2008/059313
(87) WO 2009/010534 2009.01.22
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
МЕРК СЕРОНО С.А. (CH)
017398
Область техники, к которой относится изобретение
Это изобретение относится к промышленному получению белков. Конкретнее, изобретение относится к способу получения клеток, которые стабильно экспрессируют представляющий интерес белок,
даже при культивировании в отсутствие давления отбора. DHFR используется в качестве суррогатного
маркера. Трансфицированные клетки отбираются не на основании устойчивости к токсическим соединениям, а на основании флуоресценции, измеренной на FACS с использованием флуоресцентного МТХ.
Уровень техники
Введение гетерологичных генов в клетки-хозяева животных и скрининг на экспрессию добавленных генов является длительным и сложным процессом. Обычно некоторое количество затруднений долно быть преодолено: (i) конструированим больших экспрессионных векторов; (ii) трансфекцией и селекцией клонов со стабильной долговременной экспрессией и (iii) скринингом на высокий уровень экспрессии гетерологичного, представляющего интерес белка.
1. Отбор клонов, экспрессирующих гетерологичный ген
1.1. Скрининг трансформантов
Отбор клонов, имеющих интегрированный представляющий интерес ген, проводится с использованием маркера селекции, придающего устойчивость к давлению отбора. Большинство селектируемых
маркеров придают устойчивость к антибиотикам, таким как, например, неомицин, канамицин, гигромицин, гентамицин, хлорамфеникол, пуромицин, зеоцин или блеомицин. При создании клеточных клонов,
экспрессирующих представляющий интерес ген из экспрессионных ректоров, клетки-хозяева обычно
трансфицируют плазмидным ДНК-вектором, кодирующим как представляющий интерес белок, так и
маркер отбора на одном и том же векторе. Весьма часто емкость плазмид ограничена, и маркер отбора
вынужден экспрессироваться со второй плазмиды, которую ко-трансфицируют с плазмидой, содержащей
представляющий интерес ген.
Стабильная трансфекция традиционными способами приводит к случайной интеграции экспрессионного вектора в геном клетки-хозяина. Использование давления отбора, например, посредством введения в питательную среду антибиотика, будет устранять все клетки, которые не интегрировали вектор,
содержащий маркер отбора, обеспечивающий устойчивость к соответствующему антибиотику или давлению отбора. Если этот маркер отбора находится на одном и том же векторе с представляющим интерес
геном, или, если маркер отбора находится на втором векторе и вектор, содержащий представляющий
интерес ген, был ко-интегрирован с ним, клетки будут экспрессировать как маркер отбора, так и представляющий интерес ген.
1.2. Скрининг суперпродуцентов
После получения трансформантов клетки повторно клонируют и отбирают суперпродуценты.
Одной из возможностей для отбора суперпродуцентов является прямое количественное определение экспресии представляющего интерес белка, с использованием, например, иммуноферментного анализа (ELISA). Однако клетки суперпродуцентов обычно сначала скринируют на высокую экспрессию
суррогатного маркера, которая может быть легко измерена. Когда используют суррогатный маркер,
представляющий интерес белок и суррогатный маркер обычно располагают на одном и том же векторе, и
уровни экспрессии этих двух белков коррелируют.
Клеточная сортировка с активацией флуоресценции (Fluorescence-actxvated cell sorting, FACS) является легким и удобным методом для повторного клонирования клеток и количественного определения
уровня экспрессии флуоресцентного суррогатного маркера, такого как, например, Зеленого Флуоресцентного Белка A. victoria или R. reniformis (GFP).
Так, способы отбора с использованием FACS-скрининга вместе с давлением отбора широко используются в области техники для отбора клеток суперпродуцентов (см., например, Gubin et al., 1999; Yoshikawa et al., 2001; DeMarxa et al., 2007).
Например, Yoshikawa et al. (2001) сообщает об улучшенном способе отбора высокопродуктивных
ген-амплифиированных клеток СНО с помощью FACS. Клетки отбирают по устойчивости к МТХ и амплифицируют перед скринингом клеток суперпродуцентов с помощью FACS с использованием системы
f-MTX/DHFR.
Давление отбора обычно убирают после отбора трансформантов, в которых нуклеиновая кислота,
кодирующая POI и селектируемый маркер, была интегрирована в геном.
Суперпродуценты затем отбирают с помощью FACS в отсутствие какого-либо давления отбора
(см., например, Gubin et al., 1997).
В любом случае, трансформанты сначала отбирают при наличии давления отбора. Действительно,
предложенные попытки отбирать трансфицированные клетки в отсутствие давления отбора оказались
неудачными (см., например, Migliaccio et al. 2000).
Otto et al. (2005) раскрывает способ реклонирования клеток, в котором давление отбора не применяется. Однако, этот метод предназначается для реклонирования ранее трансфицированных клеток. В дополнение, клетки отбирают с помощью FACS, на основании уровней экспрессии Зеленого Белка ZS. Поскольку ген, кодирующий этот белок, был клонирован из гриба Zoanthus, это может приводить к проблемам токсичности и/или безопасности во время производства.
-1-
017398
2. Ограничения, связанные с давлением отбора
Несмотря на широкое применение для скрининга клеток суперпродуцентов использование давления
отбора связано с рядом проблем.
При снятии давления отбора экспрессия становится весьма часто нестабильной или даже угасает.
Лишь небольшое количество первоначальных трансформантов являются таковыми, что обеспечивают
высокую и стабильную долговременную экспрессию, и идентификация этих клонов в большой популяции кандидатов занимает много времени. Обычно кандидаты с высокой экспрессией выделяют и затем
культивируют в отсутствие давления отбора. При этих условиях большая часть первоначально отобранных кандидатов элиминируется после снятия давления отбора из-за утраты экспрессии представляющего
интерес гена. Имело бы преимущество культивировать кандидатов после начального периода отбора на
стабильную трансфекцию в отсутствие давления отбора и только потом проводить скрининг на экспрессию представляющего интерес гена.
Также, давление отбора путем добавления лекарственного средства связано с явлениями многократного копирования гена как из-за случайной интеграции, так и из-за амплификации. Явления многократного копирования связаны с нестабильностью экспрессии гена, вероятно из-за потери количества
копий в течение периода времени в среде без давления отбора. Результатом является низкий титр биопродуктивной ферментации.
Таким образом, обнаружение новых и эффективных способов для выделения клеток суперпродуцентов, в которых гетерологичный представляющий интерес белок стабильно экспрессируется, было бы
очень полезно в области промышленного получения терапевтических белков.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение связано с установлением способа получения клеточных линий, стабильно
экспрессирующих высокие уровни представляющего интерес белка. Этот способ, основанный на использовании DHFR в качестве суррогатного маркера, характеризуется тем, что не требует, чтобы клетки были
отобраны на устойчивость к лекарственному средству. Пример 1 раскрывает такой способ по изобретению. Этот способ включает отбор клеток на основании экспрессии DHFR, которая определяется путем
флуоресцентного мечения и FACS-анализа, без предварительного отбора трансфицированных клеток с
использованием токсического соединения. Как показано в примерах 2 и 3, этот способ приводит к отбору
клеточных линий, стабильно экспрессирующих высокие уровни представляющего интерес белка.
Таким образом, первый аспект изобретения относится к способу скрининга клеток на экспрессию
представляющего интерес белка (POI), включающему стадии:
а) трансфецирования клетки:
(i) нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный POI; и
(ii) нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный DHFR;
в) измерения экспрессии DHFR с использованием флуоресцентного соединения, связывающегося с
DHFR; и
с) отбора примерно 0,001-25% клеток, тестированных на стадии в) на основании высокой относительной экспрессии DHFR;
где указанные клетки не отбирали на устойчивость к токсическому соединению между стадиями (а)
и (в).
Второй аспект изобретения относится к способу скрининга клеток на экспрессию POI, включающему стадии:
а) трансфицирования клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный POI;
в) измерения экспрессии POI, с использованием флуоресцентных антител, связывающихся с ним; и
с) отбора примерно 0,001-25% клеток, тестированных на стадии в) на основании высокой относительной экспрессии POI;
где указанные клетки не отбирали на устойчивость к токсическому соединению между стадиями (а)
и (в).
Третий аспект изобретения относится к способу получения клеточной линии, экспрессирующей
POI, включающему стадии:
а) скрининга клеток в соответствии с любым из вышеуказанных способов по изобретению и
в) получения клеточной линий, основываясь как минимум на одной из указанных клеток.
Четвертый аспект изобретения относится к способу получения POI, включающему стадии:
а) культивирования клеточной линии, полученной в соответствии со способом по п.14 при условиях, обеспечивающих экспрессию указанного POI; и
в) сбора указанного POI.
Пятый аспект изобретения относится к применению DHFR как для скрининга клеток на экспрессию
POI, так и для получения клеточной линии, экспрессирующей POI, отличающемуся тем, что указанные
клетки или клеточная линия никогда не отбирали на устойчивость ни к МТХ, ни на метаболическое преимущество при культивировании в отсутствии гипоксантина или тимидина (НТ).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 сравнивает продуктивность клеточной линии, полученной способом по настоящему изобре-2-
017398
тению и клеточной линии, полученной путем традиционного медикаментозного отбора. Средняя интенсивность флуоресценции (Mean Fluorescent Intensity, MFI) является результатом флоресценции флуоресцентых МТХ, образовавших комплекс с DHFR. Эти стабильные клетки были получены и проанализированы как описано в примерах 1 и 2. Прераунд 1 относится к клеткам перед первым FACS-сортингом.
Прераунд 2 относится к клеткам перед вторым FACS-сортингом. Постраунд 2 относится к клеткам после
второго FACS-сортинга.
Фиг. 2 показывает результаты исследований стабильности клеток, отобранных с использованием
способа по изобретению. Исследованный представляющий интерес белок является вариантом хорионического гонадотропина человека (hCG). Специфическая продуктивность представлена в пикограммах на
клетку в день (пг/клетка/день, pcd). Уровень удвоения популяции (population doubling level, PDL) относится к совокупному количеству митозов. Время удвоения популяции (population doubling time) является
мерой роста,
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение связано с поисками способов получения клеточных линий. Удивительно то,
что этот способ не использует устойчивость к лекарственным средствам для отбора стабильных клеток
(пример 1). Этот способ позволяет выделение клеток, которые экспрессируют сходные уровни представляющего интерес белка, как и традиционный способ, основанный на устойчивости к лекарственным
средствам (пример 2). Поскольку растительная среда для рекомбинантных стабильных клеток, полученных мотодом FACS, не содержит лекарственного средства, не существует причин, вызывающих множественную интеграцию или экспрессию представляющего интерес гена. Таким образом, не может быть
нестабильности в отсутствии лекарственного давления. Полная стабильная специфическая продуктивность наблюдалась в течение более чем 50 удвоений размера популяции (пример 3). Соответственно,
настоящее изобретение предоставляет способ с широкими возможностями для получения клеточных линий, стабильно экспрессирующих представляющий интерес белок.
Способы по настоящему изобретению
Первый аспект изобретения относится к способу скрининга клеток на экспрессию представляющего
интерес белка (POI), включающему стадии:
а) трансфицирования клетки:
(i) нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный POI; и
(ii) нуклеиновой кислотой, кодирующей DHFR;
в) измерения экспрессии DHFR с использованием флуоресцентного соединения, связывающегося с
DHFR; и
с) отбора примерно 0,001-25% клеток, тестированных на стадии в) на основании высокой относительной экспрессии DHFR;
где указанные клетки не отбирали на устойчивость к токсическому соединению между стадиями (а)
и (в).
Термин DHFR относится к полипептиду, который является членом семейства дигирофолатредуктаз (ЕС 1.5.1.3) и который может катализировать следующую ферментную реакцию:
5,6,7,8-тетрагидрофолат + NADP+ = 7,8-дигидрофолат + NADPH
Указанная нуклеиновая кислота, кодирующая DHFR, может иметь любое происхождение, например, из Escherichia coli (Miller et al., 2005). Предпочтителен DHFR эукариотического происхождения.
Более предпочтительно из млекопитающих. Наиболее предпочтительно из мыши (Subramani et al., 1981).
В одном варианте осуществления ген DHFR был клонирован из того же вида, что и трансфицированные
клетки.
DHFR может соответствовать DHFR-полипептиду дикого типа или его мутанту, пока указанный
мутант сохраняет способность катализировать указанную выше реакцию. Мутантный DHFR-полипептид,
демонстрирующий модифицированные кинетические параметры, хорошо известен в области техники.
Термин трансфицирование клеток должен пониматься как введение рекомбинантной нуклеиновой
кислоты, такой как, например, вектор в клетку.
Популяция клеток, клетки, демонстрирующие высокую относительную экспрессию DHFR, - это
клетки, которые демонстрируют более высокую экспрессию DHFR, чем другие клетки.
Например, клетка № 1 экспрессирует 10 мг/л DHFR и клетка № 2 экспрессирует 1 мг/л DHFR. В
этом примере клетка № 1 демонстрирует высокую относительную экспрессию DHFR.
В настоящем документе термин скрининг относится к тестированию или проверке большого количества клеток на определенную особенность. В настоящем документе термин отбор относится к выбору некоторых определенных клеток из группы клеток.
Термин токсическое соединение относится к любому соединению, при наличии которого нетрансфицированные клетки не могут быть культивированы, поскольку указанное токсическое соединение либо уничтожает нетрансфицированные клетки, либо ингибирует их рост. Примеры таких соединений включают, например, МТХ, пуромицин, неомицин, канамицин, гигромицин, гентамицин, хлорамфеникол, зеоцин и блеомицин.
-3-
017398
В предпочтительном варианте осуществления по настоящему изобретению клетки как не отбирают
на устойчивость к токсическому соединению, так и не отбирают на метаболическое преимущество между стадиями (а) и (в).
Термин метаболическое преимущество относится к способности трансфицированных клеток расти в отсутствие соединения, где указанное соединение является обязательным для роста нетрансфицированных клеток. Например, клетки СНО, содержащие ген, кодирующий глутаминсинтетазу (GS), могут
расти в отсутствие глутамина, и клетки СНО, содержащие ген, кодирующий DHFR, могут расти в отсутствие тимидина и/или гипоксантина (НТ). Если трансфицированная клетка не содержит (или содержит
неактивный) GS или DHFR ген, трансфицированная клетка получает метаболическое преимущество, которое может быть отобрано при культивировании клеток в отсутствие глутамина или НТ соответственно.
Флуоресцентные соединения, связывающиеся с DHFR, известны в области техники и включают соединения, такие как, например, флуоресцентно-меченые аналоги фолата, которые ковалентно связываются с DHFR. Такие флуоресцентно-меченые аналоги фолата включают флуоресцентный метотрексат (fMTX) и флуоресцентный триметоприм (f-TMP) (Miller et al., 2005).
Экспрессия DHFR может быть измерена любым традиционным средством для измерения флуоресценции, таким как, например, флуоресцентная микроскопия, клеточная сортировка с активацией флуоресценции (FACS) или подобные. Чрезвычайно предпочтительно, чтобы экспрессия DHFR измерялась с
помощью FACS.
Для измерения экспрессии DHFR на стадии (в) способа по изобретению клетки были инкубированы
в присутствии флуоресцентных соединений, связывающихся с DHFR. Несмотря на то, что такие флуоресцентные соединения, связывающиеся с DHFR, могут быть токсичны для клеток, продолжительность
такой инкубации является слишком короткой для уничтожения любой клетки. Собственно говоря,
DHFR-дефицитные клетки должны культивироваться в присутствии МТХ или f-MTX более чем 24 ч для
достижения какого-либо отбора. Таким образом, стадия инкубации не является стадией, в которой клетки отбирают на устойчивость к флуоресцентному соединению, связывающемуся с DHFR.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки инкубируют в присутствии флуоресцентных соединений, связывающихся с DHFR, менее чем 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8,
6, 4 или 2 ч. Более предпочтительно клетки инкубируют в присутствии флуоресцентных соединений,
связывающихся с DHFR, примерно 20 или примерно 4 ч.
Любая клетка является подходящей для применения способов по настоящему изобретению. Клетка
может быть первичной клеткой или постоянной клеточной линией из широкого спектра эукариот, включая растительные и животные клетки. Предпочтительно, чтобы указанная клетка являлась эукариотической клеткой. Более предпочтительно, чтобы указанная клетка являлась клеткой млекопитающего. Более
предпочтительно, чтобы указанная клетка являлась клеткой СНО, клеткой человека, клеткой мыши или
гибридомой. Наиболее предпочтительно, чтобы указанная клетка являлась клеткой CHO-DUKX (Urlaub
and Chasm, 1980).
В первом варианте осуществления клетка является DHFR-дефицитной (например, CHO-DUKX или
CHO-DG44). В контексте этого варианта осуществления любая первоначально DHFR+ клетка может
быть сконструирована так, чтобы стать DHFR-дефицитной.
Во втором варианте осуществления клетка является DHFR+ (то есть, она содержит в своем геноме
функциональный эндогенный DHFR ген). Фактически, стабильная интеграция дополнительных копий
DHFR гена может быть измерена в клетке, даже если клетка является DHFR+ (см., например, Connors et
al. 1988).
В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая POI, и нуклеиновая кислота, кодирующая DHFR, расположены на одном и том же векторе, который трансфицирует в
указанную клетку на стадии (а). В качестве альтернативы, указанная нуклеиновая кислота, кодирующая
POI, и нуклеиновая кислота, кодирующая DHFR, могут быть расположены на разных векторах, которые
ко-трансфицируют в указанную клетку на стадии (а).
Когда нуклеиновая кислота, кодирующая POI, и нуклеиновая кислота, кодирующая DHFR, расположены на одном и том же векторе, указанный вектор может содержать по крайней мере два промотора:
один регулирующий экспрессию указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей POI, и другой, регулирующий экспрессию указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей DHFR. Альтернативно, указанная
нуклеиновая кислота, кодирующая POI, может регулироваться тем же промотором, что и нуклеиновая
кислота, кодирующая DHFR, и указанный вектор содержит либо внутренний сайт связывания рибосомы
(IRES), либо 2А последовательность между указанными нуклеиновыми кислотами (de Felipe et al., 2006).
Термин промотор, используемый в настоящем документе, относится к области ДНК, которая выполняет функции регуляции транскрипции одной или нескольких последовательностей ДНК и которая
структурно идентифицируется наличием сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы и других ДНК последовательностей, которые взаимодействуют для регуляции функции промотора. Функциональный фрагмент промотора, регулирующий экспрессию, является укороченной или усеченной последовательностью промотора, сохраняющей активность в качестве промотора. Активность промотора мо-4-
017398
жет быть измерена в любом анализе, известном в области техники, например, в анализе по генурепортеру с использованием DHFR в качестве репортерного гена (Seliger and McElroy, 1960; Wood et al.,
1984; de Wet et al., 1985) или в коммерчески доступном от Promega. Энхансерная область относится к
области ДНК, которая выполняет функции усиления транскрипции одного или нескольких генов. Более
конкретно, термин энхансер, используемый в настоящем документе, является ДНК-регуляторным элементом, который усиливает, увеличивает, улучшает или совершенствует экспрессию гена, независимо от
его расположения и ориентации относительно гена, который экспрессируется и может усиливать, увеличивать, улучшать или совершенствать экспрессию одного или нескольких промоторов.
В предпочтительном варианте осуществления вектор по изобретению содержит по крайней мере
один промотор предранней области мышиного CMV. Промотор может, например, быть промотором гена
mCMV IE1 (IE1 промотор), который известен из, например, WO 87/03905. Промотор может также быть
промотором гена mCMV IE2 (IE2 промотор), сам ген mCMV IE2 известен из, например, Messerle et al.
(1991). IE2 промотор и IE2 энхансерные области подробно описаны в WO 2004/081167. Преимущественно, вектор по изобретению содержит по крайней мере два промотора предранней области мышиного
CMV. Более предпочтительно два промотора являются промоторами IE1 и IE2.
В предпочтительном варианте осуществления вектор по изобретению содержит по крайней мере
два промотора предранней области мышиного CMV, где один из них управляет экпрессией полипептида
по изобретению и другой управляет экпрессией POI. В соответствии с настоящим изобретением POI может быть любым полипептидом, продукция которого желательна. POI может находить применение в области фармацевтики, агропромышленном комплексе или в качестве материала для исследовательских
лабораторий. Предпочтительные белки, представляющие интерес, находят применение в области фармацевтики.
Например, POI может быть, например, природным секретируемым белком, обычно цитоплазматическим белком, обычно трансмембранным белком, или человеческим, или гуманизированным антителом.
Когда POI является обычно цитоплазматическим или обычно трансмембранным белком, белок преимущественно подвергается конструированию с целью приобретения растворимости. Полипептид, представляющий интерес, может иметь любое происхождение. Предпочтительные полипептиды, представляющие интерес, имеют человеческое происхождение.
В предпочтительных вариантах осуществления POI выбран из группы, включающей хорионический
гонадотропин, фолликулостимулирующий гормон, лютропин-хориогонадотропический гормон, тиреотропный гормон, человеческий гормон роста, интерфероны (например, интерферон бета-1a, интерферон
бета-1b), интерфероновые рецепторы (например, интерферон гамма-рецептор), рецепторы фактора некроза опухолей (TNF) р55 и р75, интерлейкины (например, интерлейкин-2, интерлейкин-11), интерлейкинсвязывающий белки (например, интерлейкин 18 связывающий белки), анти-CD11 антитела, эритропоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор, гипофизарные пептидные гормоны, гонадотропин метопаузы, инсулинподобные ростовые факторы (например, соматомедин-С), фактор роста кератиноцитов, нейротрофический фактор,
происходящий из глиальной клеточной линии, тромбомодулин, основной фактор роста фибробластов,
инсулин, Фактор VIII, соматотропин, костный морфогенетический белок-2, тормоцитарный фактор роста, гирудин, эпоэтин, рекомбинантный LFA-3/IgG1 гибридный белок, глюкоцереброзидаза, моноклональные антитела и белки, появляющиеся в результате мутаций, фрагменты, растворимые формы, функциональные производные и их слитые белки.
Преимущественно, указанные моноклональные антитела 1 направлены против белков, выбранных
из группы, включающей CD3 (например, ОКТ3 N1-0401), CD11a (например, эфализумаб), CD4 (например, занолимумаб, TNX-355), CD20 (например, ибритумомаб, тиуксетан, ритуксимаб, тозитумомаб, окрелизумаб, офатумумаб, IMMU-106, TRU-015, АМЕ-133, GA-101), CD23 (например, люмиликсимаб),
CD22 (например, эпратузумаб), CD25 (например, базиликсимаб, даклизумаб), рецептор эпидермального
фактора роста (EGFR) (например, панитумумаб, цетуксимаб, залутумумаб, MDX-214), CD30 (например,
MDX-060), гликопротеин клеточной поверхности CD52 (например, алемтузумаб), CD80 (например, галиксимаб), тромбоцитарный рецептор GPIIb/IIIa (например, абциксимаб), TNF альфа (например, инфликсимаб, адалимумаб, голимумаб), рецептор интерлейкина-6 (например, тоцилизумаб), эмбриональный опухолевый антиген (СЕА) (например, 99mTc-бесилесомаб), альфа-4/бета-1 интегрин (VLA4) (например, натализумаб), альфа-5/бета1 интегрин (VLA5) (например, волоциксимаб), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (например, бевацизумаб, ранибизумаб), иммуноглобулин Е (IgE) (например, омализумаб), HER-2/neu (например, трастузумаб), специфический мембранный антиген простаты (PSMA) (например, 1111n-капромаб пендетид, MDX-070), CD33 (например, гемтузумаб, озогамицин), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) (например, КВ002, МТ203), рецептор
гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (e.g. CAM-3001), ЕрСАМ (e.g. adecatumumab), IFN-gamma (например, NI-0501), IFN-альфа (e.g. MEDI-545/MDX-1 103), RANKL (например,
деносумаб), фактор роста гепатоцитов (например, AMG 102), IL-15 (например, AMG 714), TRAIL (например, AMG 655), рецептор инсулинподобного ростового фактора (например, AMG 479, R1507), IL-4 и
-5-
017398
IL-13 (например, AMG 317), BAFF/BLyS рецептор 3 (BR3) (например, CB1), CTLA-4 (например, ипилимумаб).
Любое количество клеток может быть подвергнуто скринингу в соответствии с изобретением. Например, флуоресценция по крайней мере 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000, 5000000, 10000000,
20000000, 30000000, 40000000, 50000000, 60000000, 70000000, 80000000, 90000000, 100000000 клеток
может быть скринирована.
Стадии (в) (то есть, измерение экспрессии DHFR флуоресценцией) и (с) (то есть, отбор клеток с
наибольшей флуоресценцией) могут быть итерационно повторены на популяции, отобранной в конце
стадии (с). Например, по крайней мере 2, 3, 4, 5 или 10 повторов могут быть проведены. Это может быть
проведено как с изменением, так и без изменения условий между стадиями отбора. Изменяемые условия
могут включать, например, изменение условий культивирования, таких как компоненты среды или физико-химические параметры. В предпочтительном варианте осуществления клетка, отобранная после последнего повтора стадии (с) демонстрирует стабильную экспрессию POI, в отсутствие какого-либо лекарственного отбора для как минимум 10, 20, 30, 45 или 50 уровней удвоения популяции (PDL).
В предпочтительном варианте осуществления, клетка, отобранная после последнего повтора стадии
(с), не теряет более чем 20, 15, 10, 5 или 1% ее специфической продуктивности (пг/клетка/день, pcd) после 15 PDL. Предпочтительно указанная клетка не теряет более чем 20, 15, 10, 5 или 1% ее специфической продуктивности (пг/клетка/день, pcd) после 50 PDL. Более предпочтительно указанная клетка не
теряет более чем 10% ее специфической продуктивности (пг/клетка/день, pcd) после 50 PDL. Наиболее
предпочтительно указанная клетка совсем не теряет ее специфической продуктивности (пг/клетка/день,
pcd) после 50 PDL.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения клетки, отобранные в конце стадии (с),
подвергаются дальнейшему скринингу, включающему стадии: (i) трансфицирования клетки нуклеиновой
кислотой, кодирующей указанный POI; (ii) измерения экспрессии POI, с использованием связывания
флуоресцентных антител с указанным POI и (iii) отбор примерно 0,001-25% клеток, протестированных
на стадии (в) на основании высокой относительной экспрессии POI.
После последнего отбора, основанного на флуоресценции (последний повтор стадии (с), уровень
экспрессии POI в указанных отобранных клетках может быть дополнительно измерен (стадия d). Уровень экспрессии POI может быть измерен любым способом, известным в области техники, таким как иммуно-ферментный анализ (ELISA), клеточная сортировка с активацией флуоресценции (FACS), нозернблот (Northern blot) или ОТ-ПЦР (RT-PCR).
Так, примерно 0,001-25% клеток, протестированных на стадии (d), могут быть отобраны на основании высокой относительной экспрессии POI (стадия е). Например, примерно 0,001, 0,005, 0,01, 0,5, 1, 1,5,
2, 3, 4, 5% до 15, 18, 20 или 25% клеток, демонстрирующие высокую относительную экспрессию POI,
могут быть отобраны.
Еще один аспект изобретения относится к способу получения клеточной линии, экспрессирующей
POI, включающему стадии:
а) скрининга клеток в соответствии с любым из предшествующих способов и
б) получения клеточной линии из указанных клеток.
В настоящем документе клеточная линия относится к определенному типу клеток, которые могут
расти в лаборатории. Клеточная линия обычно может выращиваться в постоянной устойчивой клеточной
культуре и будет пролиферировать неопределенно долго в условиях наличия подходящей свежей среды
и пространства. Способы получения клеточных линий из отдельных клеток хорошо известны специалисту в данной области техники. В предпочтительном варианте осуществления указанная клеточная линия
является стабильной клеточной линией, то есть клеточной линией, которая не теряет более чем 20, 15, 10,
5 или 1% ее специфической продуктивности (пг/клетка/день, pcd) в отсутствие какого-либо лекарственного отбора для по крайней мере 10, 20, 30, 45 или 50 уровней удвоения популяции (PDL). Предпочтительно указанная клеточная линия не теряет более чем 10% ее специфической продуктивности
(пг/клетка/день, pcd) после 50 PDL. Наиболее предпочтительно указанная клеточная линия совсем не
теряет ее специфической продуктивности (пг/клетка/день, pcd) после 50 PDL.
Другой аспект относится к способу получения POI, включающему стадии:
а) культивирования клеточной линии, полученной, как описано выше, при условиях, обеспечивающих экспрессию указанного POI; и
б) сбора указанного POI.
Условия, обеспечивающие экспрессию POI, могут быть легко установлены специалистом в области
техники с применением стандартных способов. Например, могут быть использованы условия, описанные
в примере 3.
В предпочтительном варианте осуществления вышеописанный способ получения POI дополнительно содержит стадию очистки указанного POI. Очистка может быть произведена любым методом,
хорошо известным специалистам в области техники. В случае POI для использования в области фармацевтики POI предпочтительно включается в состав фармацевтической композиции.
Дополнительная особенность изобретения относится к использованию DHFR для скрининга клеток
-6-
017398
на экспрессию представляющего интерес белка (POI), отличающегося тем, что указанные клетки никогда
не отбирали на устойчивость ни к МТХ, ни на метаболическое преимущество при культивировании в
отсутствие гипоксантина или тимидина (НТ).
Еще один аспект изобретения относится к использованию DHFR для получения клеточной линии,
экспрессирующей белок, представляющий интерес (POI), отличающийся тем, что указанные клетки никогда не отбирали на устойчивость ни к МТХ, ни на метаболическое преимущество при культивировании в отсутствие гипоксантина или тимидина (НТ). Предпочтительно указанная клеточная линия стабильно экспрессирует POI.
В качестве альтернативы, флуоресценция трансфицированных клеток может быть измерена с использованием флуоресцентных антител, связывающихся с POI, вместо измерения с использованием
флуоресцентного соединения, связывающегося с DHFR. Обычно такой способ скрининга клеток на экспрессию представляющего интерес белка (POI) включает стадии:
а) трансфицирования клетки нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный POI;
в) измерения экспрессии POI с использованием антител связывающихся с указанным POI; и
с) отбора примерно 0,001-25% клеток, протестированных на стадии (в) на основании высокой относительной экспрессии POI;
где указанные клетки не отобраны на устойчивость к токсическому соединению между стадиями (а)
и (в).
Все остальные стадии идентичны стадиям вышеописанного способа, где используется DHFR.
Преимущества настоящего изобретения относительно предшествующего уровня техники
Этот способ обеспечивает процесс отбора, основанный на FACS, для получения стабильных клеток,
который полностью устраняет необходимость отбора на устойчивость к лекарственным средствам.
В этом способе процесс FACS-скрининга на клетки суперпродуценты объединен с процессом отбора стабильных клеток. Этот способ скрининга имеет, таким образом, преимущество в виде содержания
уменьшенного количества стадий. Этот процесс дополнительно позволяет отбор стабильных клеточных
линий в отсутствие давления отбора для более, чем пятидесяти удвоений популяции. Это является крайне выигрышным при промышленном получении белка.
Также клетки никогда не находятся в присутствии лекарственного средства для поддержания стабильности генной экспрессии и не нуждаются в этом для производственного процесса.
В заключение, DHFR является природным белком, который в природе встречается в эукариотических клетках, таких как, например, СНО клетки. Другими словами, клеточная линия, полученная с применением способов по настоящему изобретению, экспрессирует только два рекомбинантных белка: рекомбинантный POI и рекомбинантный DHFR белок, ген которого в любом случае естественным образом
имеется в наличии в указанной клетке. Это является основным отличием от клеточной линии, которая
содержит маркеры бактерий и/или цианобактерий, такие как, например, GFP или ZS-Green. В частности,
экспрессия DHFR в клеточной линии для производства белка, представляющего интерес, не приводит к
проблемам токсичности, как в случае использования, например, GFP или ZS-Green в качестве суррогатного маркера. Клеточная линия, полученная с использованием способов по настоящему изобретению,
является, таким образом, более безопасной для производственных целей.
Теперь после полного описания изобретения для специалиста в данной области техники будет понятно в полной мере, что то же самое может быть осуществлено в широких пределах эквивалентных параметров, концентраций и условий, без выхода за пределы сущности и объема изобретения и без излишнего экспериментирования.
Поскольку настоящее изобретение было описано в сочетании с конкретными вариантами его осуществления, должно быть понятно, что оно допускает дальнейшие модификации. Эта заявка подразумевается покрывающей любые вариации, применения или адаптации изобретения, следующие, в общем,
основным положениям изобретения и включающие такие отличия от настоящего описания, которые возникают в известной или привычной практике в области техники, к которой относится изобретение, и которые могут касаться существенных особенностей, изложенных выше, входящих в объем приложенной
формулы изобретения. Все приведенные здесь ссылки, включая статьи в журналах, опубликованные или
неопубликованные США или других стран патентные заявки, выданные США или других стран патенты
или любые другие ссылки, являются полностью включенными сюда посредством ссылки, включая все
данные, таблицы, чертежи и текст, представленные в приведенных ссылках. Дополнительно, полное содержание приведенных ссылок внутри приведенных здесь ссылок также являются полностью включенными сюда посредством ссылки. Ссылки на известные методические стадии, общепринятые методические стадии, известные способы или общепринятые способы не являются никаким образом допущением,
что какая-либо особенность, описание или вариант осуществления настоящего изобретения описан, преподан или предложен в соответствующей области техники.
Нижеследующее описание конкретных вариантов осуществления так полно раскрывает общий характер изобретения, что другие могут, применяя знания и компетентность в данной области техники
(включая содержание ссылок, приведенных здесь), легко модифицировать и/или адаптировать эти конкретные варианты осуществления для различных прикладных задач, без чрезмерного проведения опы-7-
017398
тов, без отклонения от общего замысла настоящего изобретения. Таким образом, предполагается, что
такие адаптации и модификации находятся в пределах смысла и объема аналогов описанных вариантов
осуществления и основаны на идее и руководстве, представленном здесь. Должно быть понятно, что
фразеология или терминология здесь для целей описания и не для ограничения, так что фразеология или
терминология настоящей спецификации должна интерпретироваться специалистом в области техники в
свете идей и руководства, представленных здесь, в сочетании со знаниями специалиста в данной области
техники.
Примеры
Пример 1. Протокол
1.1. Клетки, среды и плазмиды
Клеточная линия яичника китайского хомячка, полученная из CHO-DUKX-B11, была использована
для стабильной экспрессии белка, представляющего интерес. Перед трансфекцией клетки-хозяева были
адаптированы к бессывороточному росту в суспензии высокой плотности в среде с определенным химическим составом (далее упоминаемой как ростовая среда), которая была получена из среды PROCHO-5
media (Bio-Whittaker/Cambrex, East Rutherford, NJ) и которая была дополнена 2% гипоксантином натрия и
тимидином (НТ). Все реагенты были предоставлены Invitrogen Corp., Carlsbad, CA., если не указано иначе. Клетки для трансфекции были культивированы в одноразовых встряхиваемых колбах, содержащих
ранее указанную ростовую среду, при встряхивании 125 об/мин, при 37°С, в 5% СО2 инкубаторе.
Трансфекция состояла из применяемой комбинации линеаризованной плазмидной ДНК, кодирующей альфа- и бета-субъединицы инактивированной версии гетородимерного гормона, хорионического
гонадотропина человека (hCG). Экспрессионный вектор (упоминаемый как D-альфа) содержал представляющий интерес ген, соединенный на N-конце с сигнальной последовательностью гормона роста человека и под контролем металлотиониен 1 промотора (МТТ-1). Он дополнительно содержал мышиный DHFR
ген дикого типа под контролем SV-40 раннего промотора и ген устойчивости к ампициллину. D-альфа
вектор был описан более детально Kelton et. al. (1992).
1.2. Трансфекция
90 мкл Lipofectamine реагента (DMRIE-C) и ДНК (15 мкг общей, 1:1 объемное соотношение субъединиц) были отдельно друг от друга смешаны с 1,5 мл ростовой среды, и смеси инкубировали в течение
10 мин при комнатной температуре, затем смешивали для формирования ДНК-липидного комплекса в
течение дополнительной инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре. 20 млн клеток-хозяев
были собраны для трансфекции центрифугированием 5 мин при 800 об/мин, и клеточные осадки были
расуспендированы в 3 мл ростовой среды в 25-мл Т-флаконах. Смесь липид/ДНК была добавлена к клеткам и инкубировалась неподвижно при 37°С с 5% СО2. После 4 ч инкубации была добавлена ростовая
среда до культурального объема 40 мл, и клетки былы перемещены в 250-мл встряхиваемую колбу. Клеточные культуры содержали при встряхивании, 37°С, 5% СО2 окружении.
1.3. Первый FACS-сортинг
Спустя 48 ч после трансфекции клетки были подсчитаны, и 20 млн клеток были отобраны и центрифугированы, как описано ранее. Клеточные осадки были ресуспендированы в 20 мл PROCHO-5+,
дополненной 4 мМ L-глутамином и 5 мкМ флуоресцеин-МТХ (f-MTX), и инкубированы в течение ночи
при встряхивании в темноте при 125 об/мин, 37°С, 5% СО2 окружении.
На следующий день меченые клетки, были осаждены центрифугированием и подверглись двум раундам отмывки с 5 мл холодного фосфатно-буферного солевого раствора (Phosphate Buffered Saline, PBS)
+ 0,5% плюроновая кислота (Pluronic Acid) + 25 мкМ HEPES буфера. Потом клетки были ресуспендированы в 2 мл отмывочного буфера и хранились на льду до определения флуоресценции методом проточной цитофлориметрии на FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA), установленной на возбуждение флуоресцеин-изотиоцианат (FITC) 488 нм линии аргонового лазера. Давление (sheath pressure) было установлено на низкое при 25 фунт на кв. дюйм (0,172 Мпа) и размер сопла был 100 мкм.
Процесс определения гейта при клеточном сортере с активацией флуоресценции (FACS gating process) состоял из первого гейта (выделение популяции один, упоминаемой как Р1), основанного на явлениях рассеяния света (light scatter events), представляющих физические параметры клетки; прямое (forward)
и боковое светорассеяние (side sgatter) (FSC-H/SSC-H точечная диаграмма). Параметры были установлены в соответствии с руководством производителя (BD FACS Aria Operators Manual, edition 336951 Rev
A., Aug 2003). P1 был далее разделен на гейты-квадранты на FSC-H/SSC-H точечной диаграмме. Квадрант один (Q1) содержал положительные флуоресцентные клетки (что означает экспрессию DHFR
вследствие вставки вектора) с низким FSC-W (что означает определение единичных клеток).
Клетки-хозяева были загружены в FACSAria и установки напряжения были оптимизированы: Scatter Events- 100000 и средняя интенсивность флуоресценции 200. Точка образования капель (Drop delay)
была определена с использованием Accudrop technology (BD FACS Aria Operators Manual). Клеткихозяева проходили гейт единичных клеток (single cell gate, P1), и популяция была последовательно показана в гейтах-квадрантах (Q1-Q4). Минимальный порог (threshold) для х-осевого гейта-квадранта был
установлен на базовой линии флуоресценции. В Q1 не наблюдалось фоновых явлений, что соответствует
-8-
017398
желательному гейту для сортинга. Для отбора клеток, экспрессирующий ген, представляющий интерес,
трансфицированный пул клеток был загружен в FACSAria и поставлен гейт, как описано выше. Анализ
желаемой популяции, Q1, соответствовал разделению средних (FITC) в 19,1 раза (при сравнении с Р1),
что составило 3,1% общего количества клеток. Единичные клетки из гейта Q1 были отсортированы и
объединены в пробирке для сбора образцов, содержащей 2 мл ростовой среды, дополненной 1% диализованной эмбриональной телячьей сывороткой (fetal bovine serum) и 2Х пенициллин-стрептомицином
для предотвращения бактериальной контаминации (пост-сортинг среда, Post-Sort Media). Клетки были осаждены путем центрифугирования и ресуспендированы в 5 мл пост-сортинг среды в закрепленном
Т25 флаконе для конфлюентности. Культура далее была трипсинизирована и перенесена во встряхиваемые колбы, и культивировалась в суспензии, как описано выше.
Отсортированная популяция Q1 была культивирована в пост-сортинг среде (Post-Sort Media) в течение 14 дней. Перед вторым раундом сортинга был проведен анализ экспрессии. Для характеристики
экспрессии отобранного пула была получена кондиционная среда путем высева 1 млн клеток/мл в 10 мл
селекционной среды и культивирования в одноразовых встряхиваемых колбах в течение 24 ч при 37°С.
Кондиционная среда была очищена путем центрифугирования 5 мин при 800 об/мин, и супернатант хранился при 4°С для аналитической характеристики. Экспрессия белка была определена с использованием
DSL hCG ELISA и следуя протоколу изготовителя со стандартами из набора (Diagnostic Systems Laboratories, Webster, TX). Специфическая продуктивность была вычислена следуя следующему уравнению:
Qsp (пг/клетка/день, pcd) = (P2-P1)ln(Nt/N0)/(T2-T1) (Nt-N0)
P1: Первоначальный титр (в пикограммах)
Р2: Финальный титр (в пикограммах)
Nt: Финальный размер популяции (количество клеток)
N0 : Первоначальный размер популяции (количество клеток)
T1: Время инициации (день)
Т2: Время сбора (день)
Средняя специфическая продуктивность клеток перед вторым сортингом составила 0,2
пг/клетка/день (pcd).
1.4. Второй FACS-сортинг
Для отделения клеток с наиболее высокой экспрессией популяция клеток, полученная в первом
сортинге (Q1), была собрана, помечена f-MTX в течение 4 ч и проведена через дополнительный раунд
определения и сортинга, как описано выше. Анализ отсортированной популяции Q1-Q1 соответствовал
разделению средних (FITC) в 8,4 раза (при сравнении с Р1), что составило 1,3% общего количества клеток. Клетки были отсортированы закрепленный в Т25 флакон с 5 мл постсортировочной среды минус НТ
(Post-Sort Media minus HT) и последовательно собраны во встряхиваемую колбу и культивировались, как
описано выше. Анализ экспрессии проводился на пуле клеток вслед за финальным сортингом, результатом чего была средняя специфическая клеточная продуктивность 3,2 пг/клетка/день (pcd).
Пример 2. Сравнение средней интенсивности флуоресценции (MFI) FACS-отобранных и отобранных с помощью лекарственного средства клеток
В качестве контроля клеточная линия, отобранная с помощью лекарственного средства, была создана следующим образом: спустя 48 ч после трансцекции, клетки были перемещены в селекционную
среду (0,5 мкМ метотрексат в PROCHO-5 среде, дополненой 4 мМ L-глютамином). Каждые два или три
дня клетки были пассажированы путем центрифугирования и ресуспендирования в свежей селекционной
среде до достижения финальной плотности 5105 клеток/мл. После примерно трех недель клетки показали признаки восстановления роста. Пул СНО признавался стабильным, когда коэффициент роста был
постоянным и выживаемость была 90%. Клетки были помечены и была оценена флуоресценция методом FACS в различных пунктах обработки (пред-сортинг один, пред-сортинг два и после-сортинг два для
клеточной линии, отобранной на FACS), как описано ранее.
Гейт единичных клеток (single, cell gate, P1) был выведен на гистограмму FITC-A.
Отчетливый сдвиг в MFI наблюдался, когда трансфицированные клетки проходили через многократные раунды FACS-отбора (1а-1в).
Стабильные СНО клетки, полученные FACS-отбором (1в), и выращиваемые в среде без давления
отбора на устойчивость к лекарственному средству, показали сходный профиль с клеточной линией (1 г),
которая была отобрана на устойчивость к лекарственному средству и выращивалась в присутствии 0,5
мкМ МТХ. Результат на фиг. 1 показывает, что способ по изобретению позволяет получение высокопродуцирующих рекомбинантных клеточных линий.
Пример 3. Оценка стабильности
Клетки культивировали в течение 50 периодов удвоения популяции в пост-сортинг среде (без отбора на устойчивость к лекарственному средству) для оценки стабильности генной экспрессии для стабильной клеточной линии, отобранной методом FACS. Еженедельный анализ экспрессии проводился для
определения специфической клеточной продуктивности. Результат показан на фиг. 2.
Клетки стабильно экспрессировали без какой-либо потери в средней специфической продуктивности, бе-9-
017398
лок ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) после 50 периодов удвоения популяции от последнего сортинга. Клетки сохраняли постоянный коэффициент роста со средним временем удвоения 27 ч.
В заключение, способ по изобретению приводит к отбору стабильной, высокопродуцирующей рекомбинантной клеточной линии, которая может быть использована в научных исследованиях или производстве белков.
Список литературы
Connors, R.W., Sweet, R.W., Noveral, J.P., Pfarr, D.S., TrNI1JJ., Shebuski, R.J., Berkowitz, В.A., Williams,D., Franklin, S., Reff, M.E. (1988) DHFR coamplification of t-PA in DHFR+ bovine endothelial cells: In
vitro characterization of the purified serine protease. DNA 7, 651-661.
de Felipe, P., Luke G.A., Hughes, L.E., Gani,D., Halpin. C and Ryan, M.D. (2006). E unum pluribus: multiple proteins from a self-processing polyprotein. Trends Biotechnol. 24, 68-75.
de Wet, J.R., Wood, K.V., Helinski, D.R. and Del_uca, M. (1985). Cloning of firefly luciferase cDNA and
the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 82, 7870-7873.
DeMaria,C.T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S. and Karey, K.P. (2007).
Accelerated clone selection for recombinant CHO CELLS using a FACS-based high-throughput screen. Biotechnol. Prog. 23, 465-472.
Gubin, A.N., Kodurui, S., Njoroge, J.M., Bhatnagar, R. and Miller J.L. (1999). Stable expression of green
fluorescent protein after liposomal transfection of K562 cells without selective growth conditions. Biotechniques
27, 1 162-1170.
Gubin, A.N., Reddy, B., Njoroge, J.M. and Miller. J.L. (1997). Long-term, stable expression of green fluorescent protein in mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 347-350.
Kelton. C.A., Cheng, S.V.Y., Nugent, N.P., Schweickhardt, R.L., Rosenthal. J.L., Overton, S.A., Wands,
G., Kuzeja, J.B., Luchette, C.A. and Chappel.S.C. (1992) The cloning of the human follicle stimulating hormone
receptor and its expression in COS-7, CHO, and Y-l cells. Molecular and Cellular Endocrinology, 89, 141-151.
Messerle M., KeN, G.M. and Koszinowski, U.H. (1991). Structure and expression of murine cytomegalovirus immediate-early gene 2. J. Virol. 65, 1638-1643.
Migliaccio, A.,R., Bengra. C, Ling, J., PilW., Li, C1 Zeng, S., Keskintepe, M., Whitney, В., Sanchez, M.,
Migliaccio, G. and Tuan, D. (2000). Stable and unstable transgene integration sites in the human genome: extinction of the Green Fluorescent Protein transgene in K562 cells. Gene. 256, 197-214.
Miller L.W., Cai Y., Sheetz, M.P. and Cornish, V.W. (2005). In vivo protein labeling with trimethoprim
conjugates: a flexible chemical tag. Nat. Methods 2, 255-257.
Otto, R., Enenkel, B., Fieder, J. and Krieg, T. (2005) Method for recloning production cells. US
2005/0059146 A1.
Seliger, H.H. and McElroy, W,D. (1960). Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence.
Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141.
Subramani, S., Mulligan, R. and Berg, P. (1981) Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40 Vectors. Mol. Cell Biol. 1, 854-864.
Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980). Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate
reductase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A77, 4216-4220.
Wood, K.V., de Wet, J.R., Dewji, N. and DeLuca, M. (1984). Synthesis of active firefly luciferase by in vitro translation of RNA obtained from adult lanterns. Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596.
Yoshikawa, T., Nakanishi, F., Ogura, Y., Oi, D., Omasa, Т., Katakura, Y., Kishimoto, M. and Suga, K.I.
(2001). Flow cytometry: an improved method for the selection of highly productive gene-amplified CHO cells
using flow cytometry. Biotechnol. Bioeng. 74, 435-442.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ скрининга клеток на экспрессию представляющего интерес белка (POI), включающий
стадии:
a) трансфицирования клетки:
(i) нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный POI, и
(ii) нуклеиновой кислотой, кодирующей дигидрофолатредуктазу (DHFR);
b) измерения экспрессии DHFR с использованием связывания флуоресцентно меченого соединения
с DHFR и
c) отбора примерно 0,001-25% клеток, протестированных на стадии (b) на основании высокой относительной экспрессии DHFR,
где указанные клетки не отобраны на устойчивость к токсическому соединению между стадиями (а)
и (b).
2. Способ по п.1, где указанную экспрессию DHFR измеряют на клеточном сортере с активацией
флуоресценции (FACS).
3. Способ по п.1 или 2, где указанное флуоресцентное соединение, связывающееся с DHFR, является флуоресцентным метотрексатом (f-MTX) или флуоресцентным триметопримом (f-TMP).
- 10 -
017398
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная клетка выбрана из группы, состоящей из клетки человека, клетки СНО, клетки мыши и гибридомы.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная клетка является DHFRдефицитной клеткой.
6. Способ по п.5, где указанная клетка является клеткой CHO-DUKX.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая POI, и ген нуклеиновой кислоты, кодирующий DHFR, находятся в одном и том же векторе, трансфицированном в указанную клетку на стадии (а).
8. Способ по п.7, где указанный вектор содержит по крайней мере два промотора: один, управляющий экспрессией указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей POI, и другой, управляющий экспрессией указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей DHFR.
9. Способ по п.7, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая POI, управляется тем же промотором, что и нуклеиновая кислота, кодирующая DHFR, и где указанный вектор содержит или внутренний сайт связывания рибосомы (IRES), или 2А последовательность, расположенные между указанными
нуклеиновыми кислотами.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадии (b) и (с) повторяют по крайней мере
2, 3, 4 или 5 раз.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию d) измерения уровня экспрессии POI в клетках, отобранных в конце последней стадии (с).
12. Способ по п.11, дополнительно включающий стадию e) отбора примерно 0,001-25% клеток, тестированных на стадии (d), на основании высокой относительной экспрессии POI.
13. Способ получения клеточной линии, экспрессирующей POI, включающий стадии:
a) скрининга клеток в соответствии со способом по любому из предшествующих пунктов и
b) получения клеточной линии по крайней мере из одной из указанных клеток.
14. Способ получения POI, включающий стадии:
a) культивирования клеточной линии, полученной в соответствии со способом по п.13 при условиях, обеспечивающих экспрессию указанного POI; и
b) сбора указанного POI.
15. Способ по п.14, дополнительно включающий стадию очистки указанного POI.
16. Применение DHFR для:
(i) скрининга клеток на экспрессию POI или
(ii) получения клеточной линии, экспрессирующей POI;
отличающееся тем, что указанные клетки или клеточная линия никогда не отбирались на устойчивость ни к МТХ, ни на метаболическое преимущество при культивировании в отсутствие гипоксантина
или тимидина (НТ).
Фиг. 1
- 11 -
017398
Фиг. 2
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 12 -