На правах рукописи - Воронежский государственный университет
advertisement
На правах рукописи Парфенова Ирина Владимировна СТРОЕНИЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП БАКТЕРИЙ Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Воронеж – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Попов Василий Николаевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна кандидат биологических наук Семенова Елена Васильевна Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова Защита состоится «23» декабря 2011 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59. Автореферат Минобрнауки диссертации Российской размещен Федерации и на официальном на сайте сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru. С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета. Автореферат разослан «21» ноября 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Грабович М.Ю. 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Малатдегидрогеназный комплекс можно с уверенностью отнести к одной из систем, обеспечивающих жизнедеятельность многих организмов. НАД+-зависимая оксидоредуктазная малатдегидрогеназа (МДГ) (К.Ф.1.1.1.37) имеет универсальное распространение в клетках всех живых организмов – архей, эубактерий, грибов, растений и животных (Gietl, 1992; Епринцев, Игамбердиев, 1995; Musrati et al., 1998; Волвенкин и др., 1999; Minarik et al., 2002; Iannetta et al., 2004) и катализирует взаимопревращение малата в оксалоацетат, используя НАД+ или НАДН в качестве кофермента. Обычно МДГ представлена в клетках различных организмов в виде множественных молекулярных форм, число которых изменяется в зависимости от групповой принадлежности живых существ, их образа жизни и сложности метаболизма. Помимо участия в процессах клеточного дыхания, в цикле трикарбоновых кислот и глиоксилатном цикле, малатдегидрогеназа способна играть важную роль в адаптации эукариот к различным стрессовым воздействиям. Важное место в понимании механизма каталитического действия ферментов занимает исследование структуры активного центра белка. Для каждого фермента характерна определенная конформация активного центра, обеспечивающего специфическое взаимодействие с молекулами субстратов и осуществляющего каталитический акт. Причем для эффективного образования фермент-субстратного комплекса большое значение имеет не только геометрическое соответствие (комплементарность) молекул фермента и субстрата, но и образование водородных связей, электростатические и гидрофобные взаимодействия между атомами активного центра фермента и молекулами субстрата. Структура активного центра изоферментов МДГ из различных источников может отличаться по типу аминокислотных остатков, 4 образующих микроокружение (дополнительные аминокислоты) и каркас (вспомогательные аминокислоты) данного участка белковой молекулы. В то же время структура активного центра МДГ обладает высокой степенью консервативности (Steffan, McAlister-Henn, 1991; Bell et al., 2001; Lehnindger et al., 2004). Малатдегидрогеназа играет важную роль в компенсации различных метаболических стрессов, возникающих в экстремальных условиях жизнедеятельности организма. В литературе встречается много данных о влиянии высоких концентраций соли, высоких и низких температур, недостатка воды, связей, определяющих компактность упаковки белковой молекулы, на состояние малатдегидрогеназной системы (Minarik et al., 2002; Irimia et al., 2004; Madern, Zaccai, 2004). Структурные перестройки молекулы МДГ являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к факторам различной природы (Eisenberg, 1995; Elcock, McCammon, 1998). В связи с этим исследование аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы, а также комплексное изучение свойств фермента из бактериальных объектов различной экологической природы представляет особый интерес. Необходимость исследования продиктована широким распространением бактерий в природе, их способностью адаптироваться к разнообразным условиям существования. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование характеристик физико-химических, малатдегидрогеназы кинетических и бактериального регуляторных происхождения, определение функциональных групп аминокислотных остатков, которые могут принимать участие в катализируемой малатдегидрогеназой ферментативной реакции, изучение строения активного центра МДГ из бактерий различных экологических групп. 5 Для выполнения цели были поставлены следующие задачи: 1. Выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты малатдегидрогеназы из исследуемых бактерий; 2. Изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из бактерий Rhodоvulum steppense А-20s; 3. Исследовать на высокоочищенных ферментных препаратах физикохимические, каталитические и регуляторные характеристики МДГ из Rhodоvulum steppense А-20s; 4. Изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ из бактерий рода Rhodоvulum; 5. Определелить с помощью метода химической модификации аминокислотный состав активного центра малатдегидрогеназы из бактерий Rhodovulum steppense А-20s и Sphaerotilus natans Д-507; 6. Выявить функциональные группы аминокислотных остатков, участвующие в ферментативной реакции, катализируемой МДГ; 7. Произвести расчет количества идентифицированных аминокислотных остатков в активных центрах МДГ из исследуемых бактериальных объектов. Научная новизна. Впервые проведено изучение аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из бактериальных объектов различных экологических групп (Sphaerotilus natans Д-507 и Rhodovulum steppense А-20s). Получение гомогенных препаратов МДГ из исследуемых микроорганизмов позволило изучить кинетические и регуляторные свойства фермента. Выявлена важная структурная особенность димерной формы малатдегидрогеназы из галофильных бактерий Rhodovulum steppense штамм А-20s – бо́льшая по сравнению с МДГ из других объектов молекулярная масса субъединиц (48 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента, необходимую для его функционирования в экстремальных условиях. 6 Практическая значимость. Практическая значимость настоящей работы состоит в расширении и углублении знаний о структуре активных центров малатдегидрогеназы, о роли МДГ в механизмах адаптации бактерий к факторам внешней среды. Полученные гомогенные препараты малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, термодинамических параметров реакций, катализируемых МДГ. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, микробиологии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ. Апробация обсуждались на работы. Материалы международных, диссертации региональных докладывались и и университетских конференциях. Они были представлены на 11-ой и 14-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология – наука 21-ого века» (Пущино, 2007, 2010), международной конференции «Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения)» (Саранск, 2008), четвертом Всероссийском международном конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз, Россия» (Воронеж, 2011), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина “Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов” (Воронеж, 2008, 2009, 2010, 2011), ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2010). Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 14 публикациях – 10 статьях и 4 тезисах. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (203 источника). Иллюстрационный материал включает 39 рисунков и 4 таблицы. Благодарность. Автор выражает особую благодарность д.б.н. Грабович М.Ю., асс. Белоусовой Е.В., а также к.б.н. Компанцевой Е.И. за предоставленные культуры бактерий для исследований. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. В качестве объектов исследования служили фототрофные галоалкалофильные пурпурные несерные бактерии – Rhodоvulum steppense А-20s, выделенные из мелководных степных содовых озер Центральной Азии, а также представители бесцветных нитчатых серобактерий – Sphaerotilus natans штамм Д-507, матообразующие бактерии, выделенные из умеренно термального сульфидного источника Краснодарского края (г. Горячий Ключ). Определение активности фермента. Активность малатдегидрогеназы определяли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, которая определяется скоростью образования или расходования НАДН. За единицу активности (Е) принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 минуту при 250С. Определение количества белка. Измерение общего количества белка, содержащегося в пробах, проводили, используя метод Лоури (Lowry et al., 1951). Выделение и очистка малатдегидрогеназы. Очистку осуществляли по схеме, включающей получение экстракта фермента, гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25, ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой, гель-хроматографию на колонке с сефадексом G-200. 8 Электрофоретические исследования. При проведении аналитического электрофореза использовали метод Дэвиса и Орнстейна (Davis, Ornstein, 1959). Проявление на белок проводили по методике с нитратом серебра (Nesterenko et al., 1994; Shevchenko et al., 1996). Специфическое проявление МДГ осуществляли тетразолиевым методом (Гааль и др., 1982; Fieldes, 1992). Исследование кинетических параметров. Кинетические и регуляторные свойства МДГ изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, расчет термодинамических параметров осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Диксон, Уэбб, 1982). Идентификация аминокислотных остатков. Для определения функциональных групп аминокислотных остатков, которые могут принимать участие в катализируемой малатдегидрогеназой ферментативной реакции, очищенный ферментный препарат инкубировали при 25оС с растворами nхлормеркурибензоата, 2,3-бутандиона, пиридоксаль-5-фосфата (в 50 мМ трис-НCl-буфере, рН 8,5), диэтилпирокарбоната (в 100 мМ натрийфосфатном бефере, рН 8,4). Перед анализом ДЭПК разбавляли этанолом, концентрация спирта в реакционной смеси не превышала 1,5 %. Реакцию начинали внесением модификаторов различной концентрации (ДЭПК, пХМБ, 2,3-бутандиона, пиридоксаль-5-фосфата) в среду инкубации. Через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали аликвоты и определяли активность фермента при 340 нм на СФ-26. Для изучения защитного действия субстрата (оксалоацетата) при инактивации фермента МДГ выдерживали с 2 мМ оксалоацетатом в течение 5 мин при 25оС перед добавлением модификаторов. Для расчета количества остатков гистидина, цистеина, аргинина и лизина, модифицированных специфическими ингибиторами, спектрофотометрически определяли 9 временные кривые остаточной ферментативной активности, константы скоростей инактивации фермента и порядок реакции. Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты проводили в 8-10 биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента (Ллойд, Ледерман, 1989, Лакин, 1990, Чернышев, Стариков, 1998). ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ МДГ ИЗ БАКТЕРИЙ RHODOVULUM STEPPENSE А-20S, SPHAEROTILUS NATANS Д-507 Для изучения строения активного центра, физико-химических, кинетических и регуляторных свойств МДГ из исследуемых бактерий были проведены очистки ферментных препаратов. Результаты типичной очистки приведены в таблице 1. Использование многостадийной очистки позволило получить ферментный препарат малатдегидрогеназы из бактерий Rhodovulum steppense штамм А-20s, культивируемых в фотоорганотрофных условиях, с удельной активностью 3,775±0,113 Е/мг белка (степень очистки 92 раза) и препарат МДГ из Sphaerotilus natans, выращенных хемоорганотрофно, с удельной активностью 4,580±0,137 Е/мг белка и степенью очистки 55 раз. Проведенный электрофоретический анализ очищенного препарата МДГ из Rhodovulum steppense показал, что в полиакриламидном геле при универсальном окрашивании на белки и специфическом проявлении обнаруживалась одна полоса с Rf = 0,53 (рис.1). Электрофоретические исследования очищенного препарата из Sphaerotilus natans штамм Д-570 также свидетельствуют о гомогенности полученных образцов фермента. Значение Rf составило 0,5. 10 Таблица 1. Очистка МДГ из Rhodovulum steppense штамм A-20s, (n = 3, р ≤ 0,05) Общий Общая Белок, объем, активмг мл ность, Е Стадии очистки Гомогенат Супернатант Гельфильтрация через сефадекс Удельная активность, Е/мг Степень Выход, очистки % 6,5 13,91± 0,41 338,4± 9,44 0,041±0,001 1,0 100 5 9,73± 0,26 215,7± 6,47 0,045±0,001 1,1 70 6 8,17± 0,24 78,0± 2,31 0,105±0,003 2,5 58 6,42± 5,13± 0,15 1,251±0,037 30,5 46 0,74± 0,02 3,775±0,113 92,0 20 G-25 Ионообменная хроматография на ДЭАЭцеллюлозе 6 Гельхроматография на сефадексе G-200 1 0,19 2,78± 0,08 Рис. 1. Электрофореграмма МДГ из Rhodovulum steppense штамм A-20s: МДГ а – специфическое проявление; б – окрашивание нитратом серебра; F – фронт красителя бромфенолового синего. F а б 11 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И СУБЪЕДИНИЧНОГО СТРОЕНИЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ С помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 была определена молекулярная масса нативного фермента из Rhodovulum steppense. Элюция МДГ осуществлялась в виде одного пика. Значение молекулярной массы фермента из исследуемых бактерий составило 102±2,4 кДа. Электрофоретическое исследование белка в присутствии додецилсульфата натрия (рис. 2) позволило определить величину молекулярной массы одной субъединицы, которая составила 48±1,9 кДа. Ранее для МДГ из Sphaerotilus natans было установлено значение молекулярной массы нативного фермента (71±1,4 кДа) и размер субъединиц (35±1,7 кДа) (Арабцева, 2009). Рис. 2. Ds-Na-электрофорез МДГ из Rhodovulum steppense штамм A-20s: 1 2 3 4 5 7 6 1-фосфорилаза b; 2-БСА; 3-овальбумин; 4-карбоангидраза; 5-ингибитор трипсина; 6-лизоцим; 7-исследуемый фермент (МДГ). Сравнение результатов гель-хроматографии и Ds-Na-электрофореза показывает, что МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans в условиях фотоорганотрофного и органотрофного роста, соответственно, представлена димером. КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МДГ ИЗ RHODOVULUM STEPPENSE А-20S На гомогенных препаратах фермента исследованы кинетические и регуляторные свойства МДГ (табл.2). 12 Показано более высокое сродство фермента к оксалоацетату и более низкое – к малату, что согласуется с данными других авторов (Wiseman et al., 1991; Wynne et al., 1997, Струмило и др., 2006). Сравнение величин Км по коферментам показало, что сродство МДГ из исследуемых бактерий к НАДН выше, чем к НАД+. Установлено, что оптимальные значения рН находились в щелочном диапазоне. Таблица 2. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ из Rhodovulum steppense Свойства Rhodovulum steppense А-20s Км (ОА), мкМ 40,6 ±1,2 Км (НАДН), мкМ 71,5±2,1 Км (малат), мкМ 200,4±6,8 Км (НАД+), мкМ 125,7 ±3,4 pH-оптимум (ОА) 8,2 pH-оптимум (малат) 10,0 Исследование кинетических характеристик малатдегидрогеназы из бактерий Rhodovulum steppense выявило ингибирование фермента высокими концентрациями оксалоацетата, что согласуется с данными большинства других исследователей (Mahmoud et al., 1995; Kuijk, Stams, 1996; Wise et al., 1997). Величина константы субстратного ингибирования (оксалоацетат) для МДГ из Rhodovulum steppense, культивируемых фотоорганотрофно, составила 2,9±0,08 мМ. При изучении влияния ионов двухвалентных металлов на активность МДГ установлено, что ионы марганца (Мn2+) и кальция (Са2+) в пределах концентраций 4-40 мМ ингибируют малатдегидрогеназу из бактерий Rhodovulum steppense по бесконкурентному типу. При этом ионы кальция в концентрациях до 4 мМ активировали фермент. Ионы бария (Ba2+) являются 13 конкурентными ингибиторами МДГ из исследуемых бактерий. Ионы магния (Mg2+) в концентрациях 2-40 мМ активируют фермент из Rhodovulum steppense по конкурентному типу. При исследовании влияния ряда субстратов ЦТК на активность МДГ из галофильных бактерий Rhodovulum steppense было установлено, что цитрат является конкурентным ингибитором фермента в концентрациях 0,005-0,5 мМ. Сукцинат и изоцитрат в концентрациях 0,005-5 мМ не влияли на активность МДГ из Rhodovulum steppense. Температурный оптимум для малатдегидрогеназы из Rhodovulum steppense при восстановлении оксалоацетата составил 50оС, а при окислении малата – 40оС. На основе полученных данных были построены графики Аррениуса для реакций восстановления оксалоацетата и окисления малата, а также рассчитаны значения энергии активации (Еакт) для переходного состояния фермент-субстратного комплекса, которые составили 4,1 и 3,7 кДж/моль в случаях прямой и обратной реакций, соответственно. При изучении термостабильности малатдегидрогеназы из галоалкалофильных бактерий было показано, что фермент из Rhodovulum steppense стабилен в интервале температур от 0 до 40ºС, а при 60ºС наблюдается резкое снижение активности. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ АКТИВНОГО ЦЕНТРА МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В формировании активного центра фермента принимают участие отдельные аминокислотные остатки, содержащие разнообразные по реакционной способности функциональные группы (гистидина, аргинина, триптофана и др.). При изучении аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из галоалкалофильных бактерий Rhodovulum steppense и 14 бесцветных нитчатых серобактерий Sphaerotilus natans применяли реакции химической модификации функциональных групп белка. Для выяснения функциональной роли гистидиновых остатков использовали модификацию под действием диэтилпирокарбоната (ДЭПК), остатков цистеина (SH-группы) – модификацию n-хлормеркурибензоатом (nХМБ). Для идентификации остатков аргинина в активном центре малатдегидрогеназы из бактериальных объектов использовали химическую модификацию 2,3-бутандионом, для определения остатков лизина фермент инкубировали в присутствии различных концентраций пиридоксаль-5фосфата. Анализ полученных данных позволил установить зависимость скорости инактивации фермента от концентрации модификатора и времени инкубации (рис. 3). V/Vo 1 0,8 0,6 1 0,4 5 0,2 2 3 4 6 0 0 5 10 15 мин Рис. 3. Модификация МДГ диэтилпирокарбонатом из Rhodovulum steppense штамм А-20S. Представлены временные кривые остаточной ферментативной активности. Концентрации ДЕПК: 1 – 0,005 мМ; 2 – 0,01 мМ; 3 – 0,1 мМ; 4 – 0,15 мМ; 5 – 0,3 мМ; 6 – 0,5 мМ Известно, что субстраты могут защищать фермент при химической модификации (Sheflyan et al., 1999; Faridmoayer, Scaman, 2005). В результате проведенного исследования установлено, что оксалоацетат оказывает выраженный защитный эффект при инкубации МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans с используемыми модификаторами (рис. 4). 15 Использование метода химической модификации специфическими ингибиторами (ДЭПК, n-ХМБ, 2,3-бутандион) позволило определить порядок реакции и произвести расчет количества модифицированных остатков гистидина, цистеина и аргинина в активном центре МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans. Рис. 4. Защитное действие оксалоацетата при модификации МДГ из исследуемых объектов диэтилпирокарбонатом: 1 – инкубация в присутствии 2 мМ оксалоацетата; 2 – инкубация без оксалоацетата. V/Vo 1 0,8 0,6 0,4 1 2 0,2 0 0 5 10 15 мин Инкубация МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans в присутствии различных концентраций пиридоксаль-5-фосфата (1–12 мМ) не вызывала инактивацию фермента, что указывает на отсутствие остатков лизина в активном центре фермента из изучаемых бактерий. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Получение препаратов МДГ в электрофоретически гомогенном состоянии позволило исследовать её физико-химические и регуляторные свойства, аминокислотный аминокислотных остатков состав в активного каталитическом центра, выявить механизме роль действия малатдегидрогеназы из бактерий различных экологических групп. Использование культивируемых применение бактерий родов фотоорганотрофно различных методов Rhodovulum и и хемоорганотрофно, (гель-хроматография, Sphaerotilus, а также нативный электрофорез, Ds-Na-электрофорез) дало возможность установить, что в этих условиях функционирует димерная форма малатдегидрогеназы. При этом 16 показано, что МДГ из галофильных бактерий представляет собой димер, характеризующийся бо́льшей (по сравнению с МДГ из других объектов) молекулярной массой субъединиц (48 кДа), что, по-видимому, может обеспечивать адаптацию данных микроорганизмов к существованию в условиях содержания в среде высоких концентраций соли. Сходные данные об особенностях структурной организации молекулы МДГ были получены для малатдегидрогеназы из бактерий Vulcanithermus medioatlanticus, существующих в условиях экстремально высоких температур, а также для фермента из фототрофных пурпурных бактерий Rhodopseudomonas palustris с величиной субъединиц 45 кДа (Епринцев и др., 2008; Епринцев и др., 2005). При изучении кинетических и регуляторных характеристик МДГ из галоалкалофильных бактерий Rhodovulum steppense не выявлено значительных отличий от ферментов из бактерий других экологических групп. Полученные результаты свидетельствуют о высоком сродстве МДГ к оксалоацетату и более низком – к малату, что согласуется с данными других авторов (Wynne et al., 1997, Струмило и др., 2006). Сравнение величин Км по коферментам показало, что сродство МДГ из исследуемых бактерий к НАДН выше, чем к НАД+. Известно, что реакции окисления малата и восстановления оксалоацетата МДГ протекают согласно упорядоченному механизму, когда сначала с ферментом связывается кофермент и лишь потом субстрат. Полученные свидетельствуют об экспериментальные аналогичной данные, вероятно, последовательности также присоединения кофермента и субстрата к ферменту (Пинейру де Корвалью и др., 1991). Для изучения аминокислотного состава активных центров малатдегидрогеназы из галоалкалофильных бактерий Rhodovulum steppense и бесцветных нитчатых серобактерий Sphaerotilus natans применяли реакции химической модификации функциональных групп белка. Модификация диэтилпирокарбонатом позволила выявить наличие в активном центре МДГ из изучаемых бактерий гистидиновых остатков, 17 которые играют важную роль в транспорте протонов между субстратом и коферментом. Наличие остатков цистеина в активном центре МДГ было выявлено при помощи модификации сульфгидрильных групп n- хлормеркурибензоатом. Влияние модификации этих групп на активность малатдегидрогеназы может быть связано с конформационными изменениями четвертичной структуры молекул фермента. Известно, что SH-группы присутствуют в белках эукариот, имеющих митохондриальную локализацию, и не встречаются в активном центре цитоплазматических и глиоксисомальных изоферментов, что свидетельствует о различном генетическом происхождении этих двух групп молекулярных форм малатдегидрогеназной системы (Пинейру де Корвалью и др., 1991). Выявление остатков цистеина в активном центре МДГ из бактерий Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans позволило сделать вывод, что данный фермент по своей значимости приближается к митохондриальным белкам, участвующим в энергетическом обмене эукариот. Для идентификации остатков аргинина в активном центре малатдегидрогеназы из изучаемых бактериальных объектов использовали химическую модификацию 2,3-бутандионом, для выяснения функциональной роли остатков лизина – модификацию под действием пиридоксаль-5-фосфата. Отсутствие инактивации МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans при разных концентрациях пиридоксаль-5фосфата (1–12 мМ) позволило установить, что лизин не вовлечен в каталитический механизм действия фермента. По литературным данным известно, что субстраты могут защищать фермент при химической модификации (Sheflyan et al., 1999; Faridmoayer, Scaman, 2005). модификации Защитное ДЭПК, действие оксалоацетата n-хлормеркурибензоатом, при химической 2,3-бутандионом дает возможность предполагать важную роль гистидиновых, цистеиновых и 18 аргининовых остатков в каталитическом акте, осуществляемом малатдегидрогеназой (Fann et al., 1998; Meiss et al., 2001; Ding et al., 2002; Жеребцов и др., 2003). Так, субстрат МДГ оксалоацетат, вероятно, вызывает конформационные изменения в молекуле фермента, связывая имидазольные группы гистидиновых остатков, что предотвращает его быструю инактивацию диэтилпирокарбонатом. Применение метода химической модификации специфическими ингибиторами (ДЭПК, n-ХМБ, 2,3-бутандион) позволило произвести расчет количества модифицированных остатков гистидина, цистеина и аргинина, что дает представление о структуре активного центра малатдегидрогеназы из изучаемых объектов. Установлен сходный состав активного центра МДГ из Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans и показано наличие в нем одного остатка аргинина и цистеина и двух остатков гистидина. На основании полученных результатов можно предложить следующее строение активного центра малатдегидрогеназы из изученных бактерий Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans и функциональную роль аминокислотных остатков. Связывание оксалоацетата в активном центре малатдегидрогеназы определяется в первую очередь электростатическим взаимодействием между карбоксилатной группой субстрата, гуанидогруппой остатка аргинина и имидазольной фермента, группой участвующие гистидина. в Другие связывании функциональные оксалоацетата, группы одновременно выполняют и собственно каталитическую функцию. При связывании субстрата в активном центре образуются ионные пары между карбоксилатанионом субстрата, гуанидогруппой аргинина и имидазольной группой гистидина. Взаимодействие протонированной имидазольной группы остатка гистидина с С=О группировкой субстрата усиливает поляризацию последней, а образующийся дефицит электронов у углерода кетогруппы компенсируется переносом гидрид-иона Н– от сближенного с субстратом никотинамидного 19 кольца кофермента. В то же время протон пространственно сближенного с субстратом имидазола гистидина переносится на отрицательно заряженный кислород, чем и завершается восстановление карбонильной группы и превращение оксалоацетата в малат. SH-группы цистеина могут непосредственно участвовать в каталитическом акте, т.е. в образовании и распаде фермент-субстратного комплекса или осуществлять связь ферменткофактор. ВЫВОДЫ 1. С помощью многостадийной очистки гомогенные препараты получены электрофоретически малатдегидрогеназы из бактерий разных экологических групп. Установлено, что значения удельной активности исследуемого фермента зависят от источника выделения. При фотоорганотрофном культивировании пурпурных бактерий Rhodovulum steppense штамм А-20s удельная активность составляет 3,775±0,113 Е/мг белка (степень очистки 92 раза). Препарат МДГ из Sphaerotilus natans в условиях хемоорганотрофного роста имеет величину удельной активности 4,580±0,137 Е/мг белка, степень очистки – 55. 2. Малатдегидрогеназа из исследуемых микроорганизмов имеет сложную четвертичную структуру. Выявлено, что МДГ из Rhodovulum steppense в условиях фотоорганотрофного роста и Sphaerotilus natans при хемоорганотрофном культивировании представлена димером. 3. Установлено, что МДГ из галофильных бактерий представляет собой димер, характеризующийся бо́льшей (по сравнению с МДГ из других объектов) молекулярной массой субъединиц, значение которой было определено методом Молекулярная масса Ds-Na-электрофореза нативного и фермента, составило 48 определённая хроматографией на сефадексе G-200, составляет 102 кДа. кДа. гель- 20 4. Выявлено разное сродство фермента к субстратам. Значения Км для МДГ из Rhodovulum steppense свидетельствуют о высоком сродстве фермента к оксалоацетату и более низком – к малату. 5. Показано, что ионы Мn2+ и Са2+ в концентрациях 4-40 мМ ингибируют малатдегидрогеназу из бактерий Rhodovulum steppense по бесконкурентному типу, при этом ионы кальция в концентрациях до 4 мМ активировали фермент. Ионы Ba2+ оказывают ингибирующее действие на фермент по конкурентному типу. Ионы Mg2+ в концентрациях 4-40 мМ активируют МДГ из Rhodovulum steppense по конкурентному типу. 6. Определены значения температурного оптимума полученных препаратов фермента. Величина этого показателя для малатдегидрогеназы из Rhodovulum steppense при восстановлении оксалоацетата составила 50оС, а при окислении малата – 40оС. 7. С помощью метода химической модификации с использованием специфических ингибиторов исследован аминокислотный состав и рассчитано количество аминокислотных остатков в активных центрах МДГ из бактерий Rhodovulum steppense и Sphaerotilus natans. Установлено присутствие двух аминокислотных остатков гистидина, одного остатка цистеина и аргинина. Наличие остатков лизина в активном центре МДГ из изучаемых бактерий не выявлено. 8. Использование оксалоацетата в качестве защитного субстрата позволило установить функциональную роль аминокислотных остатков в каталитическом механизме действия малатдегидрогеназы. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ 1. Арабцева М.А. Исследование морфологических структур димерной формы малатдегидрогеназы из серных бактерий Spharerotilus sp. / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.В. Гречкина // Труды молодых ученых ВГУ. – Воронеж. – 2007. – Вып. 1-2. – С. 69-71. 21 2. Арабцева М.А. Физико-химические и кинетические свойства димерной формы малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans штамм Д-507 / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова // Материалы 11-ой международной молодежной конференции «Биология – наука 21-го века»: Пущино (29 октября – 2 ноября). – 2007. – С.128 3. Арабцева М.А. Применение ионообменной хроматографии для разделения изоформ малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans штамм Д-507, культивируемых в условиях миксотрофного роста / М.А. Арабцева, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, И.В. Парфенова // Сорбционные и хроматографические процессы. – Воронеж. - 2008. – Т.8. – Вып.2. - С.277280. 4. Арабцева М.А. Очистка и регуляторные свойства тетрамерной формы малатдегидрогеназы из бактерий Sphaerotilus natans / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Вестник ВГУ, Серия Химия. Биология. Фармация. – Воронеж. - 2008. - №1. – С.69-73. 5. Арабцева М.А. Регуяторные свойства малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans штамм Д-507 / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, М.В. Гурбик // Организация и регуляция физиолого- биохимических процессов. – Воронеж: межрегион. сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. 2008. – Вып.10. – С. 37-40. 6. Арабцева М.А. Влияние типов питания на трансформацию субъединичного строения малатдегидрогеназной системы из бактерий Sphaerotilus sp./ М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Проблемы биоэкологии и пути их решения (Вторые Ржавитинские чтения): материалы международной конференции – Саранск (15-18 мая). – 2008. – С.206-207. 7. Арабцева М.А. Структурно-функциональная трансформация малатдегидрогеназной системы бактерий Sphaerotilus sp. штамм Д-507 при различных типах питания / М.А. Арабцева, И.В. Парфенова, М.И. 22 Фалалеева, А.Т. Епринцев // Известия РАН: Серия биологическая. – 2009. – С.283-289. 8. Парфенова И.В. Сравнительный анализ спектров поглощения димерной и тетрамерной форм МДГ из бактерий рода Sphaerotilus / И.В. Парфенова, М.А. Арабцева, М.И. Фалалеева, И.А. Лавриненко, Нгуен Тхи Чук Лоан, И.Ю. Кудрявцева, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиологобиохимических процессов: межрегион. сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. – Воронеж, 2009. – Вып.11. – С. 163-167. 9. Парфенова И.В. Генетическая детерминация изоформ МДГ из Sphaerotilus natans штамм Д-507 в разных условиях роста / И.В. Парфенова, Д.Н. Федорин // Материалы 14-ой международной молодежной конференции «Биология – наука 21-го века»: Пущино – 2010. – С. 168-169. 10. Сатар А.Ф. Кинетические малатдегидрогеназы, характеристики полученной с тетрамерной использованием формы ионообменной хроматографии, из животных и бактерий / А.Ф. Сатар, И.В. Парфенова, Е.В. Мальцева, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Сорбционные и хроматографические процессы. – Воронеж. - 2010 – Т.10. – Вып.2. - С.231235. 11. Шихалиева К.Д. Физико-химические свойства малатдегидрогеназной системы микроорганизмов из различных экологических групп при смене типа питания / К.Д. Шихалиева, И.В. Парфенова, Е.В. Шульгина, Т.Л. Ву, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Фарис Сатар Абуд // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион. сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. Воронеж, 2010. – Вып.12 – С. 46-50. 12. Парфенова И.В. Исследование структурной организации и свойств малатдегидрогеназы из солеустойчивых бактерий Rhodovulum steppense штамм А-20s / И.В. Парфенова, Е.В. Шульгина // Материалы IV 23 Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов биологов «Симбиоз, Россия», - Воронеж (23-27 мая). – 2011. C. 30-32. 13. Парфенова И.В. Очистка и каталитические свойства малатдегидрогеназы из Rhodovulum steppense штамм А-20s / И.В. Парфенова, Е.В. Шульгина, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Е.И. Компанцева // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион. сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. Воронеж, 2011. – Вып.13 – С. 128-131. 14. Епринцев А.Т. Механизм формирования изоформ малатдегидрогеназы из Sphaerotilus natans Д-507 в различных условиях культивирования / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, М.А. Арабцева, И.А. Лавриненко, И.В. Парфенова, М.В. Гречкина, Ф.С. Абуд // Известия РАН: Серия биологическая. – 2011. –№4 – С.397-402. Работы № 3, 7, 10, 14 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК.
