структура и механизм биологического действия некоторых

На правах рукописи
Ермакова Светлана Павловна
СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ
ПОЛИСАХАРИДОВ И ПОЛИФЕНОЛОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
02.00.10 – Биоорганическая химия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора химических наук
ВЛАДИВОСТОК  2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного
отделения Российской академии наук
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор
Звягинцева Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты:
Оводов Юрий Семенович
Академик РАН, доктор химических наук,
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт физиологии Коми научного центра
Уральского отделения Российской академии наук,
директор.
Булгаков Виктор Павлович
Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Биолого-почвенный институт Дальневосточного
отделения Российской академии наук,
главный научный сотрудник.
Новикова Ольга Данииловна
Доктор химических наук,
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Тихоокеанский институт биоорганической химии
им.
Г.Б.
Елякова
Дальневосточного
отделения
Российской академии наук,
ведущий научный сотрудник.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва
Защита состоится «
» декабря 2013 г. в «
» часов на заседании
диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном
учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова
ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159,
ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки
ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru
Автореферат разослан «
Ученый секретарь
диссертационного совета,
к.б.н.
»
2013 г.
Черников
О.В.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Изучение природных соединений  важная научная
область, лежащая на стыке химии, биологии и медицины. Она включает работы по
поиску, выделению, установлению строения, изучению химических превращений и
биологических функций природных веществ. Эти исследования играют важную роль в
углублении химических и биологических знаний, создают научную основу для
разработки новых лекарств и биологически активных добавок к пище.
Исследования механизмов действия веществ привели к открытию новых свойств
природных соединений, входящих в состав пищевого рациона человека. Были
обнаружены противоопухолевые свойства полифенола из зелёного чая 
эпигаллокатехин галлата. Присутствием резвератрола в красном вине был объяснён так
называемый "французский парадокс"  тот факт, что сердечно-сосудистые заболевания
относительно редко встречаются у жителей юга Франции, регулярно употребляющих
красное вино (при местной диете богатой насыщенными жирами). Бурые водоросли,
широко используемые в пищу в странах Юго-Восточной Азии, стали объектом
повышенного интереса в связи с обнаружением у сульфатированных полисахаридов
водорослей  фукоиданов  целого спектра биологических активностей, в том числе и
противоопухолевой. Необходимо отметить, что фукоиданы часто образуют прочные
комплексы с полифенолами, одним из которых является эпигаллокатехин галлат 
известный полифенол зеленого чая. Актуальным представляется изучение механизмов
действия фукоиданов различной структуры и полифенолов в процессах регуляции
развития опухолей.
Онкологические заболевания являются одной из главных причин смертности
людей. Несмотря на усилия ученых и врачей во всем мире, это заболевание уносит
огромное число человеческих жизней и занимает второе место по смертности после
сердечно-сосудистой патологии. Основными методами лечения онкологических
заболеваний являются хирургический, лучевая и химиотерапия. Однако хирургическое
вмешательство не всегда дает желаемый результат вследствие распространения
опухолевых клеток за пределы первичного очага и развития метастазов, а при лучевой
терапии происходит повреждение пограничных здоровых тканей.
Поиск новых противоопухолевых средств ведут во многих направлениях  среди
антиметаболитов, алкилирующих агентов, антибиотиков, гормонов. Препараты
растительного происхождения составляют около 1 % от общего числа исследуемых
противоопухолевых средств. Изучение противоопухолевой профилактической и
терапевтической активностей природных соединений проводят научные коллективы
разных стран. В Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова
Дальневосточного отделения Российской академии наук ведутся работы в области
химии, биохимии, биотехнологии и молекулярной клеточной биологии природных
соединений из наземных и морских организмов. Комплексное изучение новых
природных
соединений
позволяет
обнаружить
вещества,
обладающие
противоопухолевыми свойствами, определить их оптимальные действующие
концентрации и перспективные комбинации.
Таким
образом,
актуальным
направлением
профилактики
и
лечения
онкологических заболеваний является поиск природных соединений, повышающих
устойчивость организма к развитию опухолей, и снижающих возможность рецидива
опухоли после проведенной лучевой или химиотерапии; а также исследование
3
механизмов их действия. Эффективным подходом представляется комбинированная
противоопухолевая химиотерапия, сочетающая в себе препараты с различными
механизмами действия.
Цель работы  определение структуры природных соединений, обладающих
противоопухолевым действием, изучение их влияния на регулирование процессов
клеточной трансформации, пролиферации и апоптоза для установления взаимосвязи
между структурой и функцией.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
В задачи исследования входили:
поиск биологически активных полисахаридов в бурых водорослях, произрастающих в
морях Дальнего Востока России, Японии и Республики Корея (Японское и Охотское
моря), Социалистической Республики Вьетнам (Южно-Китайское море) и Ливанской
республики (Средиземное море);
сравнительное изучение полисахаридных композиций бурых водорослей разных
регионов;
установление структуры выделенных полисахаридов с использованием химических,
ферментативных и спектральных методов, систематизация по структурным типам;
определение взаимосвязи между структурой и функцией полисахаридов с
применением химических и ферментативных методов их модификации;
изучение молекулярных механизмов биологического действия фукоиданов разных
структурных типов и полифенолов растительного происхождения (катехинов
зеленого чая, резвератрола);
определение возможностей комбинации веществ с различными механизмами
действия для лечения онкологических заболеваний;
определение закономерностей, позволяющих прогнозировать свойства новых
веществ;
выбор перспективных природных соединений для создания на их основе
оригинальных отечественных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Содержание и структура водорастворимых полисахаридов бурых водорослей
зависят от видовой принадлежности, среды обитания и стадии развития водоросли.
2. Фукоиданы бурых водорослей относятся к разным структурным группам,
различающимся моносахаридным составом, типом связи между моносахаридными
остатками в цепи полисахарида, степенью сульфатирования и ацетилирования,
местоположением заместителей.
3.
Фукоиданы
бурых
водорослей
обладают
канцерпревентивным
и
противоопухолевым действием. Избирательность биологического действия связана со
структурными характеристиками фукоиданов.
4. Противоопухолевое действие ламинаранов бурых водорослей зависит от
молекулярной массы и степени разветвления полисахарида.
5. Эпигаллокатехин галлат (EGCG)  катехин зеленого чая, влияет на
пролиферацию, трансформацию и индукцию апоптоза раковых клеток. Механизм его
действия обусловлен взаимодействием с белками, участвующими в передаче
внутриклеточных сигналов.
6. Резвератрол – флавоноид красного вина, участвует в процессах пролиферации
раковых клеток. Фукоидан из бурой водоросли Saccharina (=Laminaria) cichorioides
обладает способностью усиливать апоптотическое действие резвератрола.
4
Научная новизна и практическая значимость работы.
Выполнено сравнительное изучение состава полисахаридов 13 видов бурых
водорослей. Выделены и охарактеризованы 32 фракции фукоиданов и 2 фракции
ламинаранов из бурых водорослей, произрастающих в морях различных регионов. Их
структурные
характеристики
были
установлены
физико-химическими
и
ферментативными методами. Впервые выделен высокомолекулярный разветвленный
ламинаран, установлены структурные характеристики полисахарида, определяющие его
противоопухолевое действие. Проведена систематизация структурных типов
исследованных фукоиданов. Обнаружен новый структурный тип фукоидана.
Впервые проведено комплексное исследование противоопухолевой активности и
механизма действия фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens, Saccharina
cichorioides, Saccharina japonica, Undaria pinnatifida, Sargassum mcclurei, относящихся к
разным структурным группам.
Впервые установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов,
обусловленная
их
структурой.
Показано,
что
наличие
1→3-связанных
сульфатированных остатков α-L-фукозы необходимо для ингибирования как
трансформации нормальных клеток, индуцированной эпидермальным фактором роста
(EGF), так и роста колоний раковых клеток кишечника человека. Сульфатированный и
частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 1→3- и 1→4-связанных остатков
α-L-фукозы, ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека.
Для ингибирования роста колоний опухолевых клеток молочной железы человека
необходимо
присутствие
в
молекуле
фукоидана
большого
количества
сульфатированных и частично ацетилированных остатков галактозы и фукозы,
соединенных 1→3- и/или 1→4-О-гликозидными связями.
Получены новые сведения, касающиеся механизмов биологического действия
водорастворимых полисахаридов бурых водорослей и полифенолов растительного
происхождения.
Впервые показано, что взаимодействия эпигаллокатехин галлата (EGCG, катехина
зеленого чая) с белком цитоскелета – виментином; белком, регулируемым глюкозой
(GRP78); а также трансмембранной (IGF-1R) и цитоплазматической (Fyn)
тирозинкиназами являются важными для регулирования процессов пролиферации и
трансформации клеток, а также преодоления резистентности опухолевых клеток к
лекарственным препаратам. Установлено, что галлатная группа является
определяющей в проявлении катехинами биологической активности.
Впервые выявлен синергизм при совместном действии резвератрола и фукоидана
из S. cichorioides: убедительно продемонстрировано, что терапевтическая активность
резвератрола в присутствии фукоидана может быть значительно увеличена.
Показана высокая перспективность использования полисахаридов бурых
водорослей, полифенолов растительного происхождения, а также сочетания этих
веществ как основы для получения агентов с широким спектром биологической
активности.
По результатам данной работы получены 2 патента РФ на изобретения, связанные
с открытием новых перспективных противоопухолевых препаратов профилактической и
терапевтической направленности.
Апробация работы. Результаты работы были представлены автором лично в
виде устных и стендовых сообщений на различных Международных конференциях.
5
Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликованы
49 работ, в том числе 35 научных статей в рецензируемых журналах, рекомендованных
ВАК РФ (из них 21 в зарубежных и 14 статей в российских журналах), и 2 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав:
обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, а также
выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 478 источников, в том числе
414 на английском языке. Работа изложена на 253 страницах машинописного текста,
содержит 71 рисунок и 16 таблиц.
Автор благодарна научному консультанту, профессору Звягинцевой Т.Н. за позитивную
критику и справедливые замечания в ходе выполнения работы. Также благодарит всех
сотрудников лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, а именно: к.х.н. Вищук О.С.,
к.х.н. Меньшову Р.В., к.б.н. Кусайкина М.И., к.х.н. Сову В.В., к.х.н. Шевченко Н.М., к.х.н. Имбс
Т.И., к.х.н. Захаренко А.М., м.н.с. Песенцеву М.С., м.н.с. Сильченко А.С., д.х.н. Бакунину
И.Ю., д.х.н. Елякову Л.А., к.б.н. Дубровскую Ю.В., н.с. Киселеву М.И., вед. инж. Исакову Т.В.
и лаб. Ляхову З.П. за всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения и
обсуждения работы. Автор благодарна также к.х.н. Исакову В.В., к.х.н. Анастюку С.Д. и к.ф.м.н. Глазунову В.П. за получение и помощь в обработке спектральных данных; к.х.н.
Зыковой Т.А., проф. Zigang D., проф. Bode A.M., проф. Zhu F., проф. Choi B.Y., проф. Choi
H.S., проф. Kang B.S., проф. Cho Y.Y. (Hormel Institute, University of Minnesota, Austin, MN,
США)  за помощь в работе и проведении отдельных экспериментов по изучению
биологической активности; к.х.н. Иванчиной Н.В. – за помощь в ходе оформления
диссертации; к.б.н. Горшковой И.А., к.б.н. Бердышеву Е.В.  за комментарии к работе и
моральную поддержку. Отдельную благодарность хочется выразить сотрудникам отдела
научной информации ТИБОХ ДВО РАН Бабко В.А., Зиновой С.М. и Чувилиной О.Е. за
квалифицированную помощь при работе с периодическими изданиями.
Обозначения:
AP-1  ядерный транскрипционный фактор; ATP  аденозинтрифосфат; Cdc2  ген
клеточного цикла 2; c-foc  транскрипционный фактор; c-Jun  белок семейства
транскрипционного фактора Jun; COX-2  циклооксигеназа 2; EC  эпикатехин; ECG 
эпикатехин галлат; EGC  эпигаллокатехин; EGCG  эпигаллокатехин галлат; EGF 
эпидермальный фактор роста; EGFR  рецептор эпидермального фактора роста; ERKs 
киназы, регулирующие внеклеточные сигналы; Fyn  белок Src-семейства тирозинкиназ;
GRP78  белок, регулируемый глюкозой; IC50  концентрация вещества, при которой
происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50 %; IGF-1 
инсулиноподобный фактор роста 1; IGF-1R  рецептор инсулиноподобного фактора роста 1;
JNKs  Jun N-концевые киназы; Kd  константа диссоциации; MAPK  митоген-активируемые
протеинкиназы; MMPs  матриксные металлопротеиназы; MTS  3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2-H-тетразол; p38  белок семейства
МАР киназ; p53  белок-супрессор опухолей; PGE2  простагландин Е2; PKA 
протеинкиназа А; RSV  резвератрол; STAT-1  белок семейства транскрипционных
факторов; TPA  12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат; УФ  ультрафиолетовый.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Несмотря на успехи науки и техники в создании синтетических лечебных
препаратов, лекарства из растений продолжают занимать важное место в народной
медицине. Особенный интерес возник к изучению опыта использования растений,
которые широко применяются в странах Азии. Показано, что в странах, где традиционно
потребляется большое количество овощей, рыбы, водорослей, фруктов и чая (ЮгоВосточная Азия, страны Средиземноморья), уровень заболеваемости раком гораздо
ниже по сравнению с таковым в Европе и Америке. Эта статистика стимулирует
изучение биологических особенностей компонентов пищи, составляющих основу
традиционного питания той или иной страны.
6
1 Морские организмы как источники биологически активных полисахаридов,
полисахаридгидролаз с уникальной специфичностью и их ингибиторов
1.1 Фукоиданы бурых водорослей
Бурые водоросли, запасы которых в мировом океане велики, являются богатым и
легко возобновляемым сырьевым источником биологически активных полисахаридов
(альгиновых кислот, ламинаранов и фукоиданов). Для выделения этих полисахаридов
были выбраны бурые водоросли, распространенные в морях различных регионов:
Дальнего Востока России, Японии и Республики Корея (Японское и Охотское моря),
Социалистической Республики Вьетнам (Южно-Китайское море) и Ливанской
республики (Средиземное море): Saccharina cichorioides (= Laminaria cichorioides),
S. japonica (= Laminaria japonica), Fucus evanescens, Undaria pinnatifida, Costaria costata,
Eisenia bicyclis, Ecklonia cava, Sargassum sp., Sargassum oligocystum, S. horneri,
S. mcclurei, Dictyopteris polypodioides и Padina pavonica.
Для выделения полисахаридов из бурых водорослей нами были использованы с
некоторыми модификациями разработанные в лаборатории химии ферментов ТИБОХ
ДВО РАН методы комплексной переработки водорослей и получения водорастворимых
полисахаридов (рис. 1). Модификации методов выделения полисахаридов связаны с
Сухая водоросль
изменением
условий
экстракция этанолом
предварительной обработки
Обезжиренная водоросль
Экстракт
водоросли: вместо этанола
экстракция кислотой
использовали
чистый
и
модифицированный
(с
Остаток водоросли
Экстракт
добавлением 5 % этанола)
нейтрализация;
экстракция щелочью
сверхкритический
диоксид
диализ;
концентрирование;
углерода.
Было
изучено
лиофильная сушка
влияние различных условий
Водорастворимые
Экстракт
полисахариды (Р)
предварительной обработки
анионобменная хроматография
(Macro-Prep
DEAE);
на выходы и структурные
диализ;
диализ;
осаждение этанолом
характеристики фукоиданов
концентрирование;
лиофильная сушка
из F. evanescens, S. japonica
гидрофобная хроматография
и
S.
oligocystum.
Из
(Полихром-1);
концентирование;
водоросли,
обработанной
лиофильная сушка
модифицированным
Альгинаты (А)
Ламинараны (L)
Фукоиданы (F)
Рисунок 1  Схема выделения полисахаридов (альгинатов, сверхкритическим
диоксидом углерода, были
ламинаранов и фукоиданов) из бурых водорослей
получены
высокосульфатированные гомогенные фракции фукоиданов. Модификация схемы
выделения фукоиданов, связанная с заменой экстракции этанолом экстракцией
сверхкритическим диоксидом углерода с добавлением 5 % этанола, в ряде случаев
позволит исключить стадию анионообменной хроматографии, что может сократить
расходы на промышленное производство фукоиданов и упростить их стандартизацию.
Для фракционирования фукоиданов из бурых водорослей использовали
анионообменный носитель Macro-Prep DEAE, элюирование полисахаридов проводили
линейным градиентом NaCl. В результате разделения на Macro-Prep DEAE
водорастворимых полисахаридов из изучаемых водорослей были получены фукоиданы,
представленные в таблице 1.
7
Таблица 1  Характеристика фукоиданов, полученных из бурых водорослей анионообменной хроматографией на Macro-Prep DEAE1
Водоросль.
Фракция
фукоидана
Элюент
[NaCl], M
1
2
Выход, %2
Содержание, %3
Сульфаты4
3
4
ScF1
ScF2
0.91.1
1.11.6
1.0
2.2
21
39
SjF1
SjF2
0.40.9
1.01.6
0.8
3.0
10
23
UpF1
UpF2
0.40.9
1.01.6
1.1
1.8
14
29
CcF
1.01.4
0.2
18.9
EbF
0.81.4
1.4
13.5
EcF1
EcF2
0.81.3
1.31.4
0.8
0.2
19.1
22.2
FeF1
FeF2
0.81.0
1.01.6
1.4
3.2
15
27
SF1
SF2
SF3
SF4
0.10.2
0.50.8
0.91.0
1.21.4
0.1
0.4
0.3
0.4
6.2
19.6
23.3
28.8
Полифенолы5
Fuc
5
6
Saccharina cichorioides
0
1
0
1
Saccharina japonica
1
0
1
0
Undaria pinnatifida
0
1
0
1
Costaria costata
0
1.0
Eisenia bicyclis
0
1.0
Ecklonia cava
0
1.0
0
1.0
Fucus evanescens
0
1
0
1
Sargassum sp.
1.8
1.0
4.9
1.0
7.6
1.0
6.0
1.0
Моносахаридный состав,
моль/моль Fuc
Gal
Man
Xyl
Rha
7
8
9
Ацетаты6
Glc
10
11
12
0
0
0.2
0
0
0
0.03
0
0
0
н.о.
-
0.6
0.55
0.3
0.02
0.02
0.03
0.03
3.0
0
0
н.о.
+
0.5
0.9
0.15
0.02
0.03
0
0
0.08
0
0
н.о.
+
0.8
0
0.1
0.1
0
+
0.3
0.1
0.1
0
0
-
0.2
0.3
0.1
0
0
0.1
0.2
0
0
0.4
-
0.2
0.02
0.15
0
0.03
0
0.04
0
0
0
н.о.
+
0.4
0.3
0.4
0.3
0.3
0.2
0.1
0.1
0.2
0.2
0.1
0.1
0.2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
+
+
8
Продолжение таблицы 1
1
2
3
4
5
6
Dictyopteris polypodioides
DpF1
DpF2
DpF3
DpF4
00.3
0.40.7
0.70.8
0.91.0
следы
0.1
следы
0.1
5.8
12.7
13.1
13.4
PpF1
0.50.9
0.2
4.4
PpF2
PpF3
0.91.3
1.31.7
0
0
0
0
Padina pavonica
0.3
7
8
9
10
11
12
1.0
1.0
1.0
1.0
0.3
0.1
0.2
0.8
0.3
0.3
0.3
0.1
0.2
0.4
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.3
0.3
0.1
0.1
0.2
-.
+
+
1.0
0.4
0.4
0.1
0.4
0.2
+
+
1.1
1.0
0.6
0.4
0.1
0.4
0.2
+
1.5
1.0
1.4
0.2
0.1
0.3
0.3
Sargassum horneri
ShF1
1.5
14.9
0
1.0
0.1
0
0
0.1
0
0.51.0
ShF2
1.3
0
0
1.0
0
0
0
0.2
0
1.01.3
ShF3
0.3
16.9
0
1.0
0
0
0
0.5
0
1.31.7
Sargassum oligocystum
SoF1
н.о.
1.5
17.4
0
1.0
0.2
0.8
0.1
0.1
0.2
0.51.0
SoF2
н.о.
1.3
24
0
1.0
0.4
0.2
0.1
0
0.2
1.01.3
SoF3
н.о.
0.3
32
0
1.0
0.3
0
0
0
0
1.31.7
Sargassum mcclurei
SmF1
0.23
16.8
0
1
0.7
1.3
0.2
0
0.4
0.70.8
SmF2
0.35
25.7
0
1
0.8
0.1
0.1
0
0.2
0.81.4
SmF3
0.29
35
0
1
0.7
0
0
0
0
1.41.8
1
 вещества белковой природы, определенные по методу Брэдфорд, отсутствовали во всех фракциях;
2
 % от веса обезжиренной водоросли;
3
 % от навески; н.о.  не определяли;
4
 турбидиметрический метод;
5
 метод Фолина-Чокальте;
6
 спектры 13С ЯМР; (-)  сигналы, характерные для ацетатных групп отсутствовали; (+)  присутствовали сигналы 175.9 и 21.7 м.д.
0.1
следы
14.9
17.9
9
1.1.1 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Saccharina cichorioides
Анализ моносахаридного состава образцов, полученных из S. cichorioides, показал,
что фракция ScF1 содержала фукозу и небольшие количества маннозы и рамнозы;
фракция ScF2 содержала только фукозу (табл. 1). Наиболее сульфатированным
оказался фукан ScF2: 39 % сульфатных групп.
В ИК спектре ScF2 наблюдалась характерная полоса поглощения при
12301256 см-1 (S=О колебания). Полосы поглощения при 851 и 830 см-1 (C-O-S
деформационные колебания) для фукана ScF2 показывали, что сульфатные группы в
данном полисахариде находятся в аксиальном положении при C4 и в экваториальном
положении при С2. 13С ЯМР спектры фукоиданов были сложными из-за гетерогенности
моносахаридного состава, разветвленности и высокой степени сульфатирования,
поэтому давали ограниченную информацию о структуре данных полисахаридов.
В 13С ЯМР спектре фукана ScF2 присутствовали сигналы углеродных атомов CH3групп (16.316.5 м.д.), C1 (99.5100.3 м.д.) и интенсивный сигнал С2 (67.7 м.д.)
фукопиранозы; область сигналов С3С5 остатков фукозы была плохо разрешена.
Для интерпретации ЯМР спектров были проведены химические модификации
сульфатированных полисахаридов. После сольволитического десульфатирования
степень сульфатирования фукана ScF2 снизилась на 30 % (остаток  9 % сульфатных
групп). В 13С ЯМР спектре десульфатированного фукоидана в области резонанса
аномерных атомов углерода присутствовали сигналы с химическими сдвигами 96.6.
(С1), 67.9 (С2), 76.3 (С3), 69.7 (С4), 67.8 (С5) и 16.316.5 м.д. (С6), которые характерны
для 1→3-связанных остатков α-L-фукопиранозы. В области слабого поля 1H ЯМР
спектра
десульфатированного
полисахарида
наблюдались
сигналы
разной
интенсивности (4.45.4 м.д.), среди которых выделялся сигнал при 5.11 м.д. (H1 α-Fucp).
В области резонанса протонов при С6 6-дезоксипираноз (1.21.35 м.д.) наиболее
интенсивным был сигнал при 1.24 м.д. (H6 α-Fucp).
Анализ двумерных 1H-1H COSY, TOCSY и NOESY спектров был затруднен из-за
многочисленности кросс-пиков и их перекрывания. Однако серия наиболее интенсивных
сигналов была идентифицирована как принадлежащая протонам остатков α-Lфукопиранозы (H2 при 3.97; H3 при 4.01; H4 при 4.03 м.д; H1 и H6 – как указано выше).
Анализ МАЛДИ ВП масс-спектров олигосахаридов, полученных методом
автогидролиза фукана ScF2, дал следующий состав смеси: моносульфат, дисульфат
фукозы (основные компоненты) и набор олигосахаридов со степенью полимеризации
25 и числом сульфатов на молекулу до 3. Фрагменты полисахарида содержали 2- и
реже 4-сульфатированные 1→3-связанные остатки фукозы в качестве превалирующей
структурной единицы. Расхождения с данными ИК спектроскопии фукоидана ScF2 могут
быть связаны с частичным отщеплением сульфатов при С4 в процессе автогидролиза.
1.1.2 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Saccharina japonica
Полисахарид SjF1, выделенный из S. japonica, оказался гетерогенным по
моносахаридному составу: помимо большого количества фукозы, галактозы и маннозы,
он содержал минорные количества других моносахаридов (табл. 1). Фракция SjF2
отличалась высоким содержанием фукозы, галактозы и незначительным содержанием
ксилозы и рамнозы (табл. 1). Содержание сульфатных групп для SjF1 и SjF2 составляло
10 и 23 % соответственно.
10
В ИК спектре SjF2 (аналогично спектрам фукоиданов из S. cichorioides)
наблюдалось поглощение при 12301256 см-1. Полосы поглощения при 849 и 823 см-1
для SjF2 показывали, что сульфатные группы в данном полисахариде находятся как в
аксиальном положении при C4, так и в экваториальном  при С2.
В 13С ЯМР спектре галактофукана SjF2 имелись сигналы, характерные для остатка
-D-галактопиранозы: С1 (103.7 м.д.) и менее интенсивный сигнал С6 (62.0 м.д.),
указывающий на присутствие свободной CH2OH группы. В спектре присутствовали также
сигналы, характерные для ацетатных групп в полисахариде (21.7 м.д., СН3; 175.9 м.д.,
С=О). Аномерные сигналы С1 (99.5101.7 м.д.) и С6 (16.5 м.д.), область сигналов С2С5
(65.083.0 м.д.) свидетельствовали о наличии 1→3-О-гликозидной связи между
остатками α-L-фукопиранозы.
Согласно полученным данным сульфатированный полисахарид SjF2 являлся
галактофуканом (табл. 1). Галактофуканы, выделенные из бурой водоросли S. japonica,
отличаются от фукоиданов из других видов бурых водорослей семейства
Laminarinaceae, построенных преимущественно из остатков α-L-фукозы. Значительное
содержание галактозы отмечалось у фукоиданов из Eclonia kurome и Saccharina
gurjanovae семейства ламинариевых.
1.1.3 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Undaria pinnatifida
Полисахарид UpF1, выделенный из U. pinnatifida, содержал фукозу, галактозу,
незначительные количества маннозы, ксилозы и глюкозы. Фракция UpF2 содержала
фукозу, галактозу в соотношении 1:0.9 и минорные количества маннозы, следовательно,
представляла собой галактофукан (табл. 1). Содержание сульфатных групп,
определенное турбидиметрическим методом, для UpF1 и UpF2 составляло 14 и 29 %
соответственно.
В ИК спектре высокосульфатированного галактофукана UpF2 (аналогично спектрам
фукоиданов из S. cichorioides и S. japonica) наблюдалось характерное для сульфатов
поглощение при 12301256 см-1. Полосы поглощения при 849 и 829 см-1 для UpF2
показывали, что сульфатные группы в данном полисахариде находятся как в
аксиальном положении при C4, так и в экваториальном при С2 остатков фукозы и/или
галактозы соответственно.
В 13С ЯМР спектре UpF2 имелись сигналы с химическими сдвигами 103.6104.8
м.д. и интенсивный сигнал с химическим сдвигом 62.0 м.д., характерные для С1 остатков
β-D-галактопиранозы и С6 свободной CH2OH группы остатка β-D-галактопиранозы
соответственно. Аномерные сигналы С1 (97.0102.7 м.д.), С6 (16.416.9 м.д.) и
интенсивный сигнал С2 (67.7 м.д.) указывали на присутствие 1→3- и 1→4-связанных
остатков α-L-фуко- и β-D-галактопиранозы. Сигналы с химическими сдвигами 21.7 м.д. и
175.9 м.д. указывали на присутствие ацетатных групп в молекуле полисахарида.
1.1.4 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Costaria costata, Eisenia bicyclis и Ecklonia cava
Бурые водоросли C. costata, E. bicyclis и E. cava были собраны в Японском море
(Восточное побережье Республики Корея). Фукоиданы CcF и EbF (табл. 1), выделенные
из C. costata и E. bicyclis, представляли собой сульфатированные (18.9 и 13.5 %
соответственно)
галактофуканы,
содержащие
минорные
количества
других
11
моносахаридов. По данным 13С ЯМР спектроскопии фукоидан CcF содержал ацетатные
группы (21.0 и 173.7 м.д.).
Фукоиданы EcF1 и EcF2 из E. cava представлены рамногалакто- и
галактоглюкофуканами, содержащими 19.1 и 22.2 % сульфатов соответственно (табл. 1).
К сожалению, 13С ЯМР спектры фукоиданов CcF, EbF, EcF1 и EcF2 оказались сложными
и малоинформативными для анализа структуры, как у многих других фукоиданов
водорослей. Они содержали интенсивные сигналы в аномерной области (96.5102.7
м.д.), а также типичные для α-L-фукопиранозидов сигналы в области высокочастотных
полей (16.516.9 м.д.).
В литературе имеются ограниченные сведения о характеристиках структуры
сульфатированных полисахаридов бурых водорослей C. costata и E. bicyclis.
Информация о структуре фукоиданов из E. cava отсутствует. Согласно литературным
данным, фукоидан из E. bicyclis (Тихоокеанское побережье, Япония) представляет собой
высокосульфатированный (32.3 %) фукан. Из бурой водоросли C. costata (Японское
море, Россия) были выделены сульфатированные галактофуканы, включающие также
остатки маннозы и рамнозы. Различия в характеристиках структуры выделенных нами
фукоиданов и описанных ранее в литературе, вероятно, обусловлены различными
условиями произрастания водорослей, местом и временем их сбора, а также
различиями в методах выделения и фракционирования фукоиданов.
1.1.5 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Fucus evanescens
Фракция FeF1 из F. evanescens имела гетерогенный моносахаридный состав. Она
содержала фукозу, маннозу и незначительные количества рамнозы и ксилозы (табл. 1).
Фракция FeF2 содержала фукозу с минорным количеством галактозы и ксилозы (табл. 1)
следовательно, представляла собой сульфатированный фукан. Содержание
сульфатных групп в FeF1 и FeF2 составляло 15 и 27 % соответственно.
В ИК спектре FeF2 (аналогично спектрам фукоиданов из S. cichorioides, S. japonica
и U. pinnatifida) наблюдалось поглощение при 12301256 см-1 и полоса поглощения при
829 см-1, которые свидетельствовали о наличии сульфатных групп при С2 остатка
фукозы в полисахариде.
В 13С ЯМР спектре фукана FeF2 наблюдали характерные сигналы для C1 (99.9
м.д.) и С6 (около 16.6 м.д.) α-L-фукопиранозы, а также сигналы, указывающие на
присутствие ацетатных групп (21.7 м.д., СН3; 175.9 м.д., С=О) в полисахариде. Показано,
что фукан из F. evanescens содержал помимо фукозы минорные компоненты  ксилозу,
маннозу и галактозу (табл. 1). Положение минорных компонентов в структуре фукоидана
не было установлено.
Для более детального структурного анализа фукана FeF2, полисахарид
деполимеризовали
методом
автогидролиза
и
полученные
олигосахариды
анализировали с помощью МАЛДИ ВП и ИЭР масс-спектрометрии. Смесь состояла из
моносульфатированной фукозы и набора фукоолигосахаридов с четной степенью
полимеризации (n = 26) и числом сульфатных групп до 5. Анализ масс-спектров
олигосахаридов, полученных из фукоидана FeF2, дал следующий состав смеси: [3)-L-Fucp-2-SO3 -(1]n, n = 1-4; -D-Galp-2-SO3 -(14)--D-Galp; -L-Fucp-2-SO3 -(14)--LFucp-2-SO3-; -L-Fucp-(13)-GlcA; -L-Fucp-(14)--L-Fucp-(13)-GlcA; -L-Fucp-(13)-L-Fucp-(14)-GlcA. С помощью ИЭР масс-спектрометрии в FeF2 был установлен тип
12
связи между остатками Fuc и Gal; обнаружены остатки глюкуроновой кислоты и
определен тип ее связей с остатками фукопиранозы.
1.1.6 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Dictyopteris polypodioides, Padina pavonica и Sargassum sp.
Основная часть полисахаридов D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp.
представлена альгинатами. Содержание в них водорастворимых полисахаридов,
представленных практически только одними фукоиданами (ламинараны отсутствовали),
было невелико. Суммарные выходы фукоиданов для водорослей D. polypodioides, P.
pavonica и Sargassum sp. составляли 0.3, 0.2 и 1.2 % соответственно от веса
обезжиренной водоросли (табл. 1). Фукоиданы, выделенные нами из D. polypodioides, P.
pavonica и Sargassum sp., оказались сульфатированными гетерополисахаридами.
Основным моносахаридным остатком практически всех фукоиданов являлась фукоза,
исключение составлял высокосульфатированный гетерогенный полисахарид PpF3 с
высоким содержанием галактозы. Гетерогенная структура фукоиданов, выделенных из
D. polypodioides, P. pavonica и Sargassum sp., подтверждалась данными 13С ЯМР
спектроскопии. Как и у многих других фукоиданов из бурых водорослей, 13С ЯМР
спектры полученных нами фукоиданов являлись сложными и малоинформативными для
анализа структуры. Тем не менее, в них можно было выделить группы сигналов в
аномерной области (96.5102.7 м.д.), а также типичные для α-L-фукопиранозидов
сигналы в области высокочастотных полей (16.516.9 м.д.). Сигналы 21.522.0 м.д. (CH3)
и 175.3176.1 м.д. (C=O) в 13С ЯМР спектрах фракций DpF3, DpF4, PpF1, PpF2, PpF3,
SF1 и SF4 свидетельствовали о наличии ацетатных групп.
Из водорослей Средиземного моря нами были выделены как низко-, так и
высокосульфатированные фукоиданы. Наименьшая степень сульфатирования
(4.46.2 %)
наблюдалась
у
фракций
DpF1,
PpF1
и
SF1.
Наиболее
высокосульфатированными были фракции DpF4, PpF3 и SF4 (13.428.8 %).
Полифенолы отсутствовали во фракциях фукоиданов, выделенных из D. polipodioides,
содержание их в фукоиданах из P. pavonica не превышало 1.5 %, в Sargassum sp. 
7.6 %. Белки отсутствовали во всех фракциях фукоиданов.
1.1.7 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Sargassum horneri
Фукоидан ShF1, выделенный из S. horneri, представлял собой сульфатированный
фукан, содержащий следовые количества галактозы и рамнозы, фукоидан ShF3 
сульфатированный рамнофукан (табл. 1). Степень сульфатирования ShF1 и ShF3
составляла 14.9 и 16.9 % соответственно. В 13С ЯМР спектрах фукоиданов ShF1 и ShF3
присутствовали интенсивные сигналы в аномерной области, характерные для 13связанных остатков фукозы (100.0100.3 м.д.), и сигналы меньшей интенсивности,
соответствующие остаткам 14-связанной фукозы (98.999.7 м.д.). Вызывает интерес
отсутствие сульфатных групп во фракции ShF2, элюируемой соответственно между
фракциями ShF1 и ShF3. Фукоидан ShF2 состоял в основном из фукозы и небольшого
количества рамнозы (табл. 1). 13С ЯМР спектр ShF2 содержал сигналы 99.1 и 94.8 м.д.
приблизительно равной интенсивности, характерные для 13- и 14-связанных
несульфатированных остатков фукозы. Отсутствие сульфатных групп у фукоидана ShF2
подтверждено данными химического анализа. Причины сорбции его на анионообменной
смоле не установлены.
13
1.1.8 Выделение и установление структурных характеристик фукоиданов из
Sargassum mcclurei
Полисахарид SmF1, выделенный из S. mcclurei, оказался гетерогенным по
моносахаридному составу: помимо большого количества фукозы, маннозы и галактозы,
он содержал минорные количества других моносахаридов (табл. 1). Фракция SmF2
отличалась высоким содержанием фукозы, галактозы и незначительным содержанием
маннозы, ксилозы и глюкозы (табл. 1). Фракция SmF3 содержала фукозу и галактозу в
соотношении 1:0.7, следовательно, являлась галактофуканом (табл. 1). Содержание
сульфатных групп для SmF1, SmF2 и SmF3 составило 16.8, 25.7 и 35 % соответственно.
В 13С ЯМР спектре галактофукана SmF3 имелись сигналы С1 (102.7104.1 м.д.),
характерные для β-D-галактопиранозы и менее интенсивный сигнал при С6 (61.7 м.д.),
указывающий на присутствие свободной CH2OH группы в остатке β-D-галактопиранозы,
сигналы, характерные для ацетатных групп, отсутствовали. Интенсивный сигнал в
области 69.7 м.д. соответствовал С6 остатков галактозы, связанных 1→6-Огликозидными связями. Аномерные сигналы С1 (96.0100.4 м.д.) и С6 (15.517.7 м.д.),
область сигналов С2С5 (65.083.0 м.д.) свидетельствовали о наличии 1→3-Огликозидной связи между остатками α-L-фукопиранозы.
Для установления структуры фукоидана SmF3 использовали методы
сольволитического десульфатирования и метилирования. В 13С ЯМР спектре
десульфатированного фукоидана SmF3 присутствовала большая группа сигналов в
области резонанса аномерных атомов (96.5102.7 м.д.). Фукоидан SmF3 содержал
остатки фукозы и галактозы, соединенные различным типом связи. Интенсивность пика
(61.7 м.д.), соответствующего С6 со свободной гидроксильной группой в остатке
галактозы, существенно увеличивалась после десульфатирования, что говорит о
наличии сульфатных групп в положении С6 галактозы.
Характер замещения моносахаридных остатков в полисахариде был установлен
метилированием. Анализ продуктов метилирования показал, что SmF3 содержит 13связанные остатки фукозы, некоторое количество 14-связанных остатков фукозы,
14- и 16-связанных остатков галактозы. При этом фукоза и галактоза находятся на
невосстанавливающем конце молекулы фукоидана, на восстанавливающем конце
содержатся 6-связанные остатки галактозы. Сульфатные группы находятся в свободных
положениях С2, С3 или С4 остатков фукозы и С6 галактозы.
Для более детального структурного анализа фукоидан SmF3 деполимеризовали
автогидролизом, полученную смесь олигосахаридов анализировали с помощью МАЛДИВП и ИЭР масс-спектрометрии. Ниже приведены фрагменты, структуры которых были
установлены масс-спектрометрическими методами:
1. -L-Fucp-2-SO3--(13)--L-Fucp-2-SO32. -L-Fucp-(13)--L-Fucp-2,4-ди-SO33. -L-Fucp-2-SO3--(14)--L-Fucp-2,3-ди-SO34. -L-Fucp-2,4-ди-SO3--(13)--L-Fucp
5. -D-Galp-4,3-ди-SO3--(13)--L-Fucp-2-SO36. -D-Galp-6,3-ди-SO3--(14)--L-Fucp-3-SO37. -L-Fucp-2,4-ди-SO3--(14)--D-Galp-2-SO38. -L-Fucp-(14)--D-Galp-3-SO3--(13)--L-Fucp-2-SO3--(13)--L-Fucp-2-SO39. -L-Fucp-2-SO3--(14)--D-Galp-(13)--L-Fucp-2-SO3--(14)--D-Galp-(13)--L-Fucp
10. -D-Galp-2-SO3--(13)--L-Fucp-2-SO3--(14)--D-Galp-(13)--L-Fucp-(13)--L-Fucp
14
11. [3)--L-Fucp-2-SO3--(1]n, n = 1-4
12. -L-Galp-2-SO3--(14)--L-Galp
13. -L-Fucp-2-SO3--(14)--L-Fucp-2-SO3Показано, что фрагменты полисахарида содержали 1→3- и 1→4-связанные остатки
фукозы 2- и реже 3- и/или 4-сульфатированные и галактозы (структуры 17, 1113).
Следует отметить, что нами впервые показано чередование остатков фукозы и
галактозы в главной цепи полисахарида (структуры 810). Полученные данные
существенно дополняют информацию о структурном многообразии фукоиданов.
1.2 Ламинараны бурых водорослей
В предыдущих разделах показано структурное разнообразие водорастворимых
полисахаридов бурых водорослей  фукоиданов, которые гетерогенны по
моносахаридному составу, степени сульфатирования и ацетилирования. Другие
водорастворимые полисахариды бурых водорослей  ламинараны, низкомолекулярные
13;16--D-глюканы (Mr = 36 кДа), значительно различаются как соотношением, так и
способом включения 13- и 16-связей в цепь -D-глюкана.
1.2.1 Выделение ламинаранов из Eisenia bicyclis
По модифицированной схеме выделения полисахаридов, представленной на рис.
2, с использованием дробного осаждения полисахаридов из экстракта обезжиренной
водоросли 2-мя и 4-мя объемами 96 % этанола были получены водорастворимые
полисахариды 1EbL и 2EbL соответственно (табл. 2). Анализ моносахаридного состава
образцов 1EbL и 2EbL показал, что фракции содержали глюкозу, то есть являлись
ламинаранами. 13C ЯМР спектры ламинаранов 1EbL и 2EbL были практически
идентичны. Они включали сигналы, характерные для остатков глюкопиранозы,
замещенной по положениям 3 и/или 6, и сигнал малой интенсивности с химическим
сдвигом 64.5 м.д., характерный для маннита. Молекулярные массы ламинаранов были
установлены гель-проникающей хроматографией: 1927 кДа (1EbL) и 2.55.5 кДа (2EbL)
и подтверждены МАЛДИ ВП масс-спектрометрией (для 2EbL). Ламинаран (фракция
1EbL), имеющий молекулярную массу, значительно (практически в 5 раз) превышающую
традиционную для ламинаранов (36 кДа), выделен впервые. Соотношение связей
13:16 в ламинаранах 1EbL и 2EbL было рассчитано из сравнения интенсивностей
сигналов аномерных протонов в 1H ЯМР спектрах и составило для обеих фракций 1.5:1
(табл. 2).
Таблица 2  Характеристика ламинаранов из E. bicyclis
Фракция
Выход, %*
Интервал молекулярных
ламинарана
масс, кДа**
Соотношение связей
13:16***
1EbL
0.6
1927
1.5:1
2EbL
1.0
2.55.5
*  % от веса обезжиренной водоросли;
**  гель-проникающая хроматография на колонке Superdex 75 HR;
***  спектры 1H ЯМР.
15
Сухая водоросль
экстракция (70 % C2H5OH, 23 ºC, 10 дн.)
Обезжиренная водоросль
Экстракт
экстракция (0.1 M HCl, pH 2.5, 60 ºC, 2 х 2 ч)
Экстракт
Остаток водоросли
нейтрализация;
концентрирование;
осаждение (96 % C2H5OH, 1:2)
экстракция (2 % Na2CO3, 55 ºC, 2 х 2 ч)
Экстракт
диализ;
осаждение (96 % C2H5OH, 1:3)
1EbL
концентрирование;
осаждение (96 % C2H5OH, 1:4)
анионообменная хроматография
(DEAE-целлюлоза)
EbA
H2O, гидрофобная хроматография
(Полихром-1, 15 % C2H5OH);
анионообменная хроматография
(Macro-Prep DEAE, H2O);
концентрирование, лиофильная сушка
Супернатант
1EbP
0.5 M NaCl, диализ;
концентрирование;
лиофильная сушка
1EbF1
1.0 M NaCl, диализ;
концентрирование;
лиофильная сушка
1EbF2
H2O, гидрофобная хроматография
(Полихром-1, 15 % C2H5OH);
анионообменная хроматография
(Macro-Prep DEAE, H2O);
концентрирование, лиофильная сушка
1.5 M NaCl, диализ;
концентрирование;
лиофильная сушка
анионообменная хроматография
(DEAE-целлюлоза)
1EbF3
0.5 M NaCl, диализ;
концентрирование;
лиофильная сушка
2EbF1
Супернатант
2EbP
1.0 M NaCl, диализ;
концентрирование;
лиофильная сушка
2EbF2
1.5 M NaCl, диализ;
концентрирование;
лиофильная сушка
2EbF3
2EbL
Рисунок 2  Схема выделения полисахаридов (альгинатов, ламинаранов и фукоиданов) из бурой водоросли E. bicyclis
EbA  альгиновые кислоты; EP  водорастворимые полисахариды; EbL  ламинараны, EbF  фукоиданы
16
1.2.2 Структура высокомолекулярного ламинарана из Eisenia bicyclis
1.2.2.1 Исследование структуры ламинарана классическими химическими
методами
Установление характеристик структуры необычного высокомолекулярного
ламинарана 1EbL (далее  EbL) было проведено с использованием химических, физикохимических и ферментативных методов. Характер замещения моносахаридных остатков
в полисахариде был установлен методом метилирования. С помощью ГЖХ-МС в виде
ацетатов частично метилированных полиолов были идентифицированы 2,3,4,6-тетраOMe-Glc; 2,4,6-три-OMe-Glc; 2,3,4-три-OMe-Glc и 2,4-ди-OMe-Glc, соответствующие
концевым невосстанавливающим 13-, 16- и 13;16-связанным остаткам глюкозы,
в
соотношении
1:2.8:1.2:0.8.
Наличие
довольно
большого
количества
невосстанавливающих концов, а также «точек ветвления» говорит о высокой
разветвленности полисахарида. Деградация по Смиту ламинарана EbL приводила к его
деполимеризации. Продукты деградации по Смиту были разделены на три
олигосахаридные фракции EbLdS1, EbLdS2 и EbLdS3 методом гель-проникающей
хроматографии и изучены с помощью ЯМР спектроскопии и МАЛДИ ВП массспектрометрии. Продукты деградации представляли собой смесь олигосахаридов со
степенью полимеризации 59 (EbLdS2) и 718 (EbLdS1), из чего следовало, что остатки
16-связанной глюкозы входят в основную цепь ламинарана. Интересно, что в 1H ЯМР
спектрах фракций EbLdS1 и EbLdS2 помимо сигналов, характерных для С1 13связанной β-D-глюкозы (4.74.8 м.д.), имелись также сигналы малой интенсивности 4.52
(С1) и 4.22 м.д. (С6), свидетельствующие о наличии 16-связанных остатков глюкозы
(соотношение связей 13:16 = 4:1). Возможно, некоторые остатки глюкозы в
ламинаране гликозилированы по положению 6 не единичными остатками глюкозы, а
остатками ламинариолигосахаридов, что обеспечивает недоступность подобной
конструкции для реагента. В 1H ЯМР спектре наиболее низкомолекулярной фракции
EbLdS3 присутствовали только сигналы, характерные для 13-связанных остатков
глюкозы (4.74.8 м.д.), а масс-спектр содержал сигналы, свидетельствующие о наличии
олигосахаридов со степенью полимеризации 24, имеющих на восстанавливающем
конце остаток глицерина. Эти данные позволили предположить, что протяженность
участков, построенных из остатков 13-связанной глюкозы без разветвлений или с
разветвлениями в виде одного остатка глюкозы по положению 6, составляет не более
четырех остатков глюкозы.
1.2.2.2 Ферментативная трансформация ламинарана из Eisenia bicyclis
Было проведено изучение кинетики накопления продуктов гидролиза ламинарана
EbL ферментами различного типа действия: эндо-13-β-D-глюканазой LIV из
Pseudocardium sacchalinensis (смесь олигосахаридов обозначена как EbLendo) и экзо13-β-D-глюканазой из Chaetomium indicum (продукты обозначены как EbLexo’ и
EbLexo). Ламинаран из Saccharina cichorioides (ScL) был использован в качестве
образца сравнения. Его структурные характеристики следующие: соотношение связей
13:16 = 10:1; 16-связанные остатки глюкозы находятся в виде единичных
ответвлений от основной цепи, состоящей из 13-связанных остатков глюкозы,
интервал Мr  36 кДа.
17
Фракции олигосахаридов EbLendo и EbLexo были получены исчерпывающим
ферментолизом (степень гидролиза ламинарана 25.2 и 42.8 % соответственно).
Дополнительно была получена фракция EbLexo’ (степень гидролиза ламинарана
18.7 %). В результате гель-проникающей хроматографии продуктов ферментативного
гидролиза фракций EbLendo и EbLexo были получены препараты глюкоолигосахаридов
EbLendo1, EbLendo2, EbLendo3, EbLendo4 и EbLexo1, EbLexo2, EbLexo3, EbLexo4,
EbLexo5, различающиеся по степени полимеризации и соотношению связей 13:16.
Из фракции EbLexo’ была выделена и охарактеризована наиболее высокомолекулярная
фракция EbLexo’1. Характеристики ламинариолигосахаридов представлены в табл. 3.
Набор олигосахаридов, полученных из EbL после гидролиза экзоглюканазой,
показал структурное разнообразие фрагментов в исходном ламинаране. Можно
предположить, что продукты гидролиза ламинарана EbL экзо-13-β-D-глюканазой из
C. indicum, содержащие только 16-связанные остатки глюкозы: гентиоби-, три- и
тетраозу, образовывались из фрагментов, находящихся в разветвлениях, а продукты,
содержащие 13-связанные остатки глюкозы на невосстанавливающем конце: β-D-Glcp(1→3)-β-D-Glcp-(1→6)-D-Glc;
β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Glcp-(1→6)-D-Glc,
возникали из фрагментов цепи ламинарана.
Таблица 3  Характеристика продуктов ферментативного гидролиза ламинарана
Фракция
Выход, %*
Степень полимеризации
олигосахаридов**
Эндоглюканаза
Glc9-Glc23
Glc4-Glc12
Glc2-Glc3
Glc
Экзоглюканаза
EbLexo’1
Glc9-Glc23
EbLexo1
18.7
Glc4-Glc12
EbLexo2
6.3
Glc4
EbLexo3
4.7
Glc3
EbLexo4
10.3
Glc2
EbLexo5
34.7
Glc
*  % от навески исходного ламинарана EbL;
**  спектры МАЛДИ ВП;
***  спектры 1H ЯМР.
EbLendo1
EbLendo2
EbLendo3
EbLendo4
37.0
14.2
17.8
6.1
Соотношение связей
13:16***
1:1
0.9:1
1:1
1.4:1
0.6:1
0.5:1
0.6:1
0:1
-
Ламинаран EbL  сильноразветвленный высокомолекулярный 13;16-β-Dглюкан, по данным ЯМР спектроскопии включает в себя следующие фрагменты
структуры: →3)-β-D-Glcp-(1→3)- и/или →3,6)-β-D-Glcp-(1→3)-; →6)-β-D-Glcp-(1→3)- и/или
β-D-Glcp-(1→3)-; →3)-β-D-Glcp-(1→6)- или →6)-β-D-Glcp-(1→6)- и →6)-β-D-Glcp-(1→6)и/или β-D-Glcp-(1→6)-.
Ферментативным гидролизом было показано, что ламинаран EbL содержал около
18 % (табл. 3) участков, включающих фрагмент структуры →3)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Glcp(1→3)-β-D-Glcp-(1→, различные варианты которых представлены на рис. 3 (А, Б, В).
Ламинаран EbL отличался высоким содержанием 16-связанных остатков глюкозы
(соотношение связей 13:16 = 1.5:1), которые находились как в ответвлениях, так и в
18
основной цепи ламинарана. Протяженность участков, построенных из остатков 13связанной глюкозы, составляла не более четырех остатков (рис. 3 Г), большинство 13связанных блоков представляли собой дисахаридные звенья. 16-Связанные остатки
глюкозы, предположительно, сосредоточены на невосстанавливающих концах молекул.
Степень полимеризации 16-связанных блоков не превышала трех остатков глюкозы
(рис. 3 Д). Анализ полученных данных показал, что в ответвлениях по положению 6
могут находиться как единичные остатки глюкозы (рис. 3 Б), так и остатки
ламинариолигосахаридов (рис. 3 В), а также гентиобиозы и гентиотриозы (рис. 3 Е).
А
Б
В
Г
Д
Е
Рисунок 3  Фрагменты структуры ламинарана EbL
Таким образом, использование ферментов из Pseudocardium sacchalinensis и
Chaetomium indicum позволило не только установить структурные фрагменты, из
которых построен необычный ламинаран, но и получить стандартные фракции
олигосахаридов для исследования их биологического действия.
1.2.3 Противоопухолевая активность ламинарана из Eisenia bicyclis и
продуктов его ферментативного гидролиза
Изучение биологической активности веществ на первом этапе предполагает
определение их токсичности. Цитотоксичность  это свойство физических воздействий
или химических веществ вызывать патологические изменения в клетках.
Препараты EbL, EbLendo1, EbLendo2, EbLexo’1 и EbLexo1 были не токсичны (до
200 мкг/мл) по отношению к клеткам рака кишечника DLD-1 и меланомы человека SKMEL-28В (MTS метод). Показано, что исследуемые препараты (100 мкг/мл) более
эффективно ингибировали рост колоний клеток DLD-1, чем клеток SK-MEL-28. Общие
закономерности действия сохранялись для обоих типов клеток (рис. 4).
Ингибирование роста колоний клеток SK-MEL-28 и DLD-1 высокомолекулярным
ламинараном EbL составляло 15 и 38 % соответственно. Фракции олигосахаридов
EbLendo1 и EbLexo’1, обогащенные 16-связанными остатками глюкозы и
характеризующиеся интервалом степени полимеризации (СП) 923, в сравнении с EbL
показывали более высокое противоопухолевое действие по отношению к обоим типам
клеток. Уменьшение молекулярной массы олигосахаридов (СП = 413 остатков глюкозы,
фракции EbLendo2 и EbLexo1) приводило к снижению их активности. Сравнение
действия препаратов EbLendo1 и EbLexo’1, а также EbLendo2 и EbLexo1,
характеризующихся сходным интервалом молекулярных масс, но различным
19
соотношением связей 13:16 (табл. 3), показало, что противоопухолевая активность
олигосахаридов возрастала с увеличением количества 16-связанных остатков
глюкозы.
А
Б
100%
600
400
200
SK-MEL-28
85%
74%
*
50%
*
67%
*
71%
1600 100%
1200
800
400
DLD-1
65%
62%
*
28%
**
41%
*
53%
*
0
0
Рисунок 4  Действие фракций EbL, EbLendo1, EbLendo2, EbLexo’1 и EbLexo1 на рост
колоний клеток меланомы SK-MEL-28 (А) и рака кишечника человека DLD-1 (Б). *р <
0.05; **р< 0.005 (достоверное отличие от контроля)
Проведенные
исследования
позволили
выявить
взаимосвязь
между
противоопухолевым действием ламинариолиго- и полисахаридов, выделенных из бурой
водоросли E. bicyclis, и характеристиками их структуры. Уменьшение молекулярной
массы нативного ламинарана, а также увеличение содержания 16-связанных остатков
глюкозы способствовало возрастанию противоопухолевой активности. Самым
перспективным противоопухолевым агентом являлся препарат EbLendo1, полученный
гидролизом ламинарана из E. bicyclis эндоглюканазой. Он представлял смесь
олигосахаридов со степенью полимеризации в интервале 923 и соотношением связей
13:16 = 1:1.
2 Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей
2.1 Цитотоксическая активность фукоиданов
Для изучения взаимосвязи структуры и биологической активности фукоиданов
были выбраны два структурных типа фуканов (13--L-фукан из Saccharina cichorioides
и 13;14--L-фукан из Fucus evanescens) и галактофуканы (из Saccharina japonica и
Undaria pinnatifida), отличающиеся содержанием остатков Gal, степенью замещения С6
остатков Gal, степенью сульфатирования и ацетилирования; а также модифированные
аналоги (дезацетилированные, десульфатированные, деполимеризованные) этих
полисахаридов.
Для определения концентрации фукоиданов из S. cichorioides (ScF2), S. japonica
(SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2), при которой проявляется их действие
на жизнеспособность клеток, был использован МТS метод. Эпидермальные клетки
мыши JB6 Cl41, клетки рака кишечника HCT 116, HT-29 и DLD-1, молочной железы T47D и меланомы SK-MEL-28, SK-MEL-5, RPMI-7951 человека обрабатывали
фукоиданами в концентрациях от 50 до 400 мкг/мл и инкубировали в течение 24 ч.
Фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 не влияли на жизнеспособность нормальных
эпидермальных клеток мыши JB6 Cl41 в концентрациях до 400 мкг/мл. Аналогичные
20
результаты были получены при изучении действия фукоиданов по отношению к клеткам
рака кишечника HT-29, DLD-1 и меланомы человека SK-MEL-28 и SK-MEL-5.
Наблюдался незначительный эффект действия исследуемых фукоиданов по
отношению к клеткам рака кишечника человека HCT 116 (степень ингибирования
составляла менее 15 %). Фукоиданы SjF2, FeF2 и UpF2 ингибировали
жизнедеятельность клеток рака молочной железы T-47D на 36, 30 и 20 %
соответственно. Фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 в концентрациях до 400 мкг/мл
ингибировали рост клеток меланомы человека RPMI-7951 от 20 до 40 %. Однако,
действие ни одного фукоидана (до 400 мкг/мл) не приводило к 50 % гибели
исследованных клеток в течение 24 ч.
Обработка клеток меланомы человека RPMI-7951 высокосульфатированными
фракциями фукоиданов из D. polypodioides (DpF4), P. pavonica (PpF3) и Sargassum sp.
(SF4) в концентрации до 200 мкг/мл не приводила к торможению их роста и не
сопровождалась массовой гибелью клеток. Аналогичное действие отмечено для
фукоиданов из S. horneri (ShF1, ShF2, ShF3), E. cava (EcF1, EcF2), C. costata (CcF) и E.
bicyclis (EbF) по отношению к клеткам меланомы SK-MEL-28 и рака кишечника DLD-1
человека.
Нами впервые проанализирована активность фукоиданов, различающихся по
строению главной цепи, моносахаридному составу, положению сульфатных групп и
степени сульфатирования, на жизнеспособность различных типов клеток. Показано, что
высокосульфатированные 13--L-фукан из S. cichorioides (сульфатные группы в
положениях C2 и C4), 13;14--L-фукан из F. evanescens с незначительным
содержанием галактозы (сульфатные группы преимущественно в положении C2 и
небольшое количество при C4), галактофукан из S. japonica (содержит 13- и 16связанные остатки -L-фукопиранозы и β-D-галактопиранозы, сульфатные группы
преимущественно в положении C2 и небольшое количество при C4) и U. pinnatifida
(содержит 13- и 14-связанные остатки -L-фукопиранозы и β-D-галактопиранозы,
сульфатные группы преимущественно в положении C4 и небольшое количество при C2)
не оказывали или оказывали незначительное влияние на жизнеспособность
исследованных клеток. Отсутствие токсичности делает данные фукоиданы
перспективными для изучения их действия на пролиферацию опухолевых клеток.
2.2 Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток
К основным свойствам злокачественных опухолей относят повышенную
способность к пролиферации, утрату способности к полной дифференцировке и
апоптотической гибели, а также инвазивный рост и метастазирование. Для изучения
действия фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на пролиферацию опухолевых клеток
использовали препараты в концентрации 200 мкг/мл (рис. 5), так как в этой
концентрации они не были токсичны к выбранным типам клеток.
Действие исследуемых фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток
проявлялось в различной степени. Показано, что все фукоиданы в концентрации 200
мкг/мл незначительно влияли на пролиферацию раковых клеток кишечника человека
HCT 116 (рис. 5 А), HT-29 и DLD-1 (данные не приведены).
Фукан ScF2 слабо ингибировал пролиферацию клеток меланомы человека SK-MEL5 (рис. 5 Г): на 20 % по сравнению с контролем. Степень ингибирования роста клеток
меланомы человека SK-MEL-28, RPMI-7951 и клеток рака молочной железы человека T47D составляла 30, 50 и 40 % соответственно (рис. 5 В, Д, Б). Фукан FeF2 обладал
21
более выраженным действием: ингибировал пролиферацию клеток меланомы человека
SK-MEL-28, SK-MEL-5 и RPMI-7951 более чем на 40 % (рис. 5 В, Г, Д), тогда как степень
ингибирования роста клеток рака молочной железы человека T-47D составляла 32 % по
сравнению с контролем (рис. 5 Б). Галактофукан UpF2 проявлял высокую
антипролиферативную активность по отношению к клеткам T-47D (степень
ингибирования пролиферации составляла 60 %) и был менее активен по отношению к
SK-MEL-28, SK-MEL-5 и RPMI-7951 клеткам (степень ингибирования  36, 50 и 41 %
соответственно) (рис. 5). Галактофукан SjF2 в различной степени ингибировал
пролиферацию клеток меланомы человека SK-MEL-28, SK-MEL-5 и RPMI-7951 (степень
ингибирования  45, 55 и 48 % соответственно), ингибирование пролиферации клеток T47D составляло 29 % (рис. 5).
120
120
HCT 116
А
100
80
ScF2
SjF2
FeF2
UpF2
60
40
20
T-47D
80
60
40
20
0
0
0
120
Б
100
24
48
0
72
120
В
SK-MEL-28
100
24
Г
48
SK-MEL-5
100
120
80
80
60
60
60
40
40
40
20
20
20
24
48
72
RPMI-7951
0
0
0
Д
100
80
0
72
0
24
48
72
0
24
48
72
Время обработки, ч
Рисунок 5  Влияние фукоиданов (200 мкг/мл) ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на
жизнеспособность клеток HCT 116 (A), T-47D (Б), SK-MEL-28 (В), SK-MEL-5 (Г) и RPMI-7951
(Д)
Установлено, что исследуемые нами сульфатированные полисахариды проявляли
специфичность действия: все фукоиданы практически не ингибировали рост клеток рака
кишечника человека НСТ 116, НТ-29 и DLD-1, но были эффективны по отношению к
опухолевым клеткам молочной железы и меланомы человека. Необходимо отметить,
что влияние на пролиферацию каждого типа клеток связано с индивидуальными
структурными характеристиками фукоиданов. Наибольшим влиянием на пролиферацию
опухолевых клеток молочной железы обладал высокосульфатированный галактофукан
из Undaria pinnatifida. Он содержит 13- и 14-связанные остатки -L-фукопиранозы и
β-D-галактопиранозы, сульфатные группы преимущественно в положении C4 и
небольшое количество при C2. Для клеток меланомы человека наиболее эффективным
был высокосульфатированный фукан из Fucus evanescens, который содержит 13- и
14-связанные остатки -L-фукопиранозы, сульфатные группы преимущественно в
положении C2 и небольшое количество при C4.
2.3 Влияние фукоиданов на неопластическую трансформацию клеток,
индуцированную эпидермальным фактором роста
Канцерогенез

это
многоступенчатый
процесс,
включающий
стадии
инициирования (трансформации нормальных клеток в опухолевые), развития
22
(формирования колоний) и прогрессии (роста колоний) опухоли. Одной из
перспективных стратегий борьбы с канцерогенезом является поиск веществ, способных
препятствовать начальному этапу  трансформации нормальных клеток в опухолевые
под действием различных стимулирующих факторов (например, эпидермального
фактора роста  EGF, трифорболового эфира  TPA, УФ излучения, гормонов и др.). Для
определения так называемой канцерпревентивной активности веществ in vitro широко
используют метод неопластической трансформации нормальных клеток в мягком агаре.
Для изучения влияния выделенных нами фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на
неопластическую трансформацию эпидермальных клеток мыши JB6 Cl41,
индуцированную эпидермальным фактором роста (EGF), была выбрана концентрация
фукоиданов 50 мкг/мл, при которой различия в их действии проявлялись наиболее
выражено (рис. 6). Клетки JB6 Cl41 (без обработки EGF, контроль) не образовывали
колонии в мягком агаре, тогда как под
2500
действием
EGF
происходила
их
100%
2000
трансформация
и,
как
следствие,
61% 65%
1500
*
образование колоний (рис. 6). Фукан ScF2
*
45%
*
35%
ингибировал
неопластическую
1000
*
трансформацию клеток на 65 % по
500
сравнению с контролем, а обработка
0
+
+
+
+
+
EGF, 1 нг/мл клеток фукоиданами SjF2, FeF2 и UpF2
+
+
+
+
Фукодан, 50 мкг/мл ScF2 SjF2 FeF2 UpF2
приводила
к
снижению
количества
трансформированных клеток на 39, 35 и
Рисунок 6  Влияние фукоиданов ScF2, 55 % соответственно (рис. 6). Фукан из
SjF2, FeF2 и UpF2 на неопластическую
S. cichorioides
ингибировал
трансформацию
эпидермальных
клеток
мыши JB6 Cl41 клеток, индуцированную неопластическую трансформацию JB6 Cl41
индуцированную
другим
EGF. *р < 0.05 (достоверное отличие от клеток,
контроля)
стимулирующим фактором  ТРА, более
чем на 50 %.
Установлено, что фукоиданы в концентрации 50 мкг/мл ингибировали
неопластическую трансформацию JB6 Cl41 клеток, индуцированную EGF (рис. 6).
Необходимо отметить, что данные о канцерпревентивном действии фукоиданов бурых
водорослей в литературе отсутствуют.
2.3.1 Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана из бурой
водоросли Saccharina cichorioides
Исследуемые фукоиданы ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 ингибировали трансформацию
эпидермальных клеток мыши JB6 Cl41, индуцированную EGF, поэтому представляло
интерес исследование влияния фукоиданов на процесс активации рецептора
эпидермального фактора роста (EGFR)  трансмембранного гликопротеина,
обладающего тирозинкиназной активностью.
Для изучения молекулярного механизма действия был выбран фукан ScF2 из
бурой водоросли S. cichorioides. Он ингибировал трансформацию JB6 Cl41 клеток,
индуцированную EGF, в наибольшей степени по сравнению с фукоиданами из S.
japonica, F.evanescens и U. pinnatifida (рис. 6).
Под влиянием EGF происходило фосфорилирование EGFR и протеинкиназы MEK
1/2, которая, в свою очередь, активировала протеинкиназы семейства ERKs и JNKs.
Фукан ScF2 в концентрации 10 мкг/мл эффективно ингибировал фосфорилирование
23
EGFR и MEK 1/2, активированное EGF, а в концентрации 100 мкг/мл практически
полностью блокировал их фосфорилирование (рис. 7). Важно отметить, что обработка
клеток фуканом в сочетании с EGF не приводила к изменению экспрессии белков EGFR
и MEK 1/2.
Фукан ScF2 ингибировал фосфорилирование протеинкиназ ERK 1/2 и JNK 1/2,
вызванное действием EGF, а также следующих за ними в MAPK каскаде p-90RSK и c-jun.
Эффективность ингибирования возрастала с увеличением его концентрации.
Экспрессия анализируемых белков (EGFR, MEK 1/2, ERK 1/2, JNK 1/2, p90RSK, c-jun
(Ser73)) оставалась постоянной (рис. 7).
EGF, 1 нг/мл
ScF2, мкг/мл
-
+
-
+
1
+
10
+
50
+
100
p-EGFR
EGF
BaSO4
ScF2
+
-
+
+
-
+
+
EGFR
p-MEK 1/2
MEK 1/2
p-ERK 1/2
ERK 1/2
p-JNK 1/2
JNK 1/2
p-p90Rsk
p90Rsk
p-c-jun (Ser73)
c-jun (Ser73)
Рисунок 7  Влияние фукана ScF2 на
фосфорилирование EGFR, MEK 1/2,
ERK1/2, p-90RSK, JNK 1/2 и c-jun,
индуцированное EGF
Рисунок 8  Взаимодействие фукана
ScF2 с эпидермальным фактором роста
Для
экспериментального
изучения прямого действия ScF2 по
отношению к EGF и его рецептору был
получен фукоидан в нерастворимой
форме и проведено его связывание с
EGF (рис. 8). Установлено, что фукан
связывался с EGF и, как следствие,
ингибировал
фосфорилирование
EGFR и MAP киназ. Блокирование
активации этих белков фуканом
приводило
к
подавлению
AP-1
активности
и
ингибированию
трансформации
клеток,
индуцированной EGF.
2.4 Действие фукоиданов на самопроизвольное формирование
колоний опухолевых клеток
С помощью метода мягкого агара мы исследовали действие фукоиданов бурых
водорослей на самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника
человека (рис. 9). Фукоиданы (50 мкг/мл) из бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), S.
japonica (SjF2), F. evanescens (FeF2) и U. pinnatifida (UpF2) ингибировали
самопроизвольное формирование и рост колоний раковых клеток кишечника человека в
различной степени (рис. 9). Фукан ScF2 оказался наиболее эффективным при обработке
всех исследуемых линий опухолевых клеток кишечника человека. Он ингибировал
формирование и рост колоний HCT 116, HT-29 и DLD-1 клеток на 29, 44 и 76 %
соответственно (рис. 9 А, Б, В). Наиболее выраженное противоопухолевое действие
ScF2 обнаружено на клетки DLD-1: фукан снижал не только количество колоний
опухолевых клеток, но и значительно уменьшал их размеры (рис. 9 Г).
Фукоиданы SjF2, FeF2 и UpF2 обладали менее выраженным действием на
самопроизвольное формирование колоний клеток кишечника человека. Они
24
незначительно ингибировали рост колоний HCT 116 клеток, степень ингибирования
составляла 3, 12 и 9 % для SjF2, FeF2 и UpF2 соответственно (рис. 9 А). Фукоиданы
SjF2, FeF2 и UpF2 замедляли рост колоний HT-29 клеток в равной степени: на 25, 29 и
28 % соответственно (рис. 9 Б), тогда как обработка DLD-1 клеток данными
полисахаридами приводила к снижению роста колоний на 57, 48 и 39 % соответственно
(рис. 9 В).
Б
А
3000
97%
*
100%
2500
71%
*
2000
HCT 116
88%
**
91%
*
5000
75%
*
4000
3000
1500
HT 29
100%
71%
*
56%
**
72%
**
2000
1000
1000
500
0
0
50 мкг/мл
2500
2000
В
DLD-1
100%
1500
1000
500
0
Г
24%
*
контроль ScF2
43%
*
52%
*
61%
**
SjF2
FeF2
UpF2
контроль
ScF2
SjF2
FeF2
UpF2
Рисунок 9  Влияние фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на формирование и рост колоний
клеток рака кишечника человека HCT 116 (А), HT-29 (Б) и DLD-1 (В, Г). *р < 0.05; **р< 0.005
(достоверное отличие от контроля)
С помощью метода мягкого агара была исследована способность фукоиданов (100
мкг/мл) бурых водорослей ингибировать формирование и рост колоний клеток
меланомы SK-MEL-28 (рис. 10 А), SK-MEL-5 (рис. 10 Б), RPMI-7951 (рис. 10 В) и раковых
клеток молочной железы человека Т-47D (рис. 10 Г).
Галактофуканы UpF2 и SjF2 оказались наиболее эффективными на модели
раковых клеток молочной железы: ингибировали формирование и рост колоний клеток
на 75 и 64 % соответственно, тогда как фуканы ScF2 и FeF2 ингибировали данный
процесс на 18 и 30 % соответственно (рис. 10 Г). Фукан FeF2 обладал сильным
ингибирующим действием по отношению к клеткам меланомы человека, он угнетал рост
колоний SK-MEL-28, SK-MEL-5 и RPMI-7951 на 56, 54 и 51 % соответственно (рис. 10 А,
Б, В). Фукоиданы ScF2, SjF2 и UpF2 в меньшей степени тормозили рост колоний клеток
меланомы человека (рис. 10 А, Б, В). Наиболее сильное ингибирование колоний клеток
SK-MEL-5  71 % показал галактофукан SjF2.
УФ излучение  это основной фактор риска развития меланомы. Главным
источником ультрафиолета, который повреждает генетический материал клеток кожи,
является солнечный свет. Предполагается, что именно фукоиданы выполняют в бурых
водорослях защитные функции от УФ излучения и высыхания. Бурая водоросль F.
evanescens произрастает в сублиторальной зоне и постоянно испытывает воздействие
солнечных лучей. Возможно, поэтому этот вид водоросли синтезирует фукоидан,
который имеет особенности структуры, позволяющие проявлять более высокое
противоопухолевое действие на модели клеток меланомы человека, по сравнению с
25
фукоиданами из водорослей S. cichorioides,
произрастающими на глубине от 10 до 30 м.
5000
4000
3000
А
100%
SK-MEL-28
Б
70%
*
59%
**
65%
*
44%
*
1500
U.
pinnatifida,
SK-MEL-5
71%
*
500
0
0
100% В
R PMI-7951
400
4000
52%
**
59%
*
2000
49%
**
55%
*
300
29%
*
Г
100%
46%
*
70%
**
36%
*
25%
*
100
контроль ScF2
SjF2
FeF2
UpF2
0
54%
*
T-47D
82%
**
200
1000
0
и
100%
1000
1000
3000
japonica
2000
2000
5000
S.
контроль ScF2
SjF2
FeF2
UpF2
Рисунок 10  Влияние фукоиданов ScF2, SjF2, FeF2 и UpF2 на формирование и рост
колоний клеток SK-MEL-28 (А), SK-MEL-5 (Б), RPMI-7951 (В) и T-47D (Г). *р < 0.05; **р< 0.005
(достоверное отличие от контроля)
2.5 Действие полисахаридов из бурых водорослей Fucus evanescens, Costaria
costata и Alaria fistulosa на активацию матриксных металлопротеиназ,
индуцируемую УФ излучением
Степень инвазивного роста и
6
метастазирование
опухолевых
А
5
клеток
определяются
их
4
способностью
расщеплять
3
компоненты
экстраклеточного
41%
2
матрикса (ЭКМ)  базальные
15%
13 %
*
1
*
мембраны и межтканевую строму,
0
состоящие
из
различных
1,5
структурных белков: коллагенов,
Б
эластинов, ламининов и т.д.
1
Многие
протеолитические
ферменты, такие как катепсины,
29 %
0,5
23 %
*
сериновые протеазы, способны
18 %
*
*
лизировать отдельные компоненты
0
+
+
+
+ УФ (100 мДж/см2)
ЭКМ
in vitro, однако разлагать все
1
10
100 FvF, мкг/мл
Рисунок 11  Влияние фукоидана FvF на структуры ЭКМ могут только
металлопротеиназы
экспрессию белка (A) и мРНК MMP-1 (Б), матриксные
индуцируемые УФ излучением. *р < 0.05 (ММР). На клетках фибробластов
(достоверное отличие от контроля)
крайней плоти человека (HS68)
нами показано, что коммерческий
26
фукоидан из Fucus vesiculosus (FvF) ингибировал экспрессию белка MMP-1,
индуцируемую УФ излучением на 85 % (10 мкг/мл) и 87 % (100 мкг/мл) и экспрессию
мРНК MMP-1 на 77 % (10 мкг/мл) и 82 % (100 мкг/мл) (рис. 11).
Известно, что коммерчески доступный фукоидан из F. vesiculosus представляет
собой смесь фукоиданов, поэтому было исследовано действие более гомогенных
фукоиданов из других источников на экспрессию белка и мРНК ММР-1. Фукоидан FeF2
из F. evanescens проявлял выраженное ингибирующее действие на пролиферацию и
формирование колоний клеток меланомы человека, поэтому была изучена его
способность подавлять экспрессию MMP-1, индуцируемую УФ излучением. Показано,
что фукоидан FeF2 (10 и 100 мкг/мл) ингибировал экспрессию белка MMP-1,
индуцируемую УФ излучением в клетках кератиноцитов человека HaCaT (степень
ингибирования составляла 33 и 58 % соответственно, рис. 12 А), и экспрессию мРНК
ММР-1 (степень ингибирования  28 и 59 % соответственно, рис. 12 Б). Под действием
УФ излучения происходило фосфорилирование протеинкиназ ERK 1/2, JNK 1/2, p38,
тогда как обработка клеток фукоиданом (100 мкг/мл) приводила к значительному
снижению активности данных белков (рис. 12 В).
В
-
А
2
+
1
+
10
+
100
УФ (15 мДж/см2)
FeF2, мкг/мл
p-ERK 1/2
67%
*
ERK 1/2
42%
1
+
-
*
p-p38
p38
0
p-JNK 1/2
2
Б
JNK1/2
72%
*
*
1
0
бета-актин
41 %
-
+
-
+
1
+
10
+
100
УФ (15 мДж/см2)
FeF2, мкг/мл
Рисунок 12  Влияние фукоидана
FeF2 на экспрессию белка (A) и мРНК
ММР-1 (Б) и фосфорилирование MAPK
(В), индуцируемые УФ излучением. *р
< 0.05; **р< 0.005 (достоверное
отличие от контроля)
Полисахарид из Costaria costata (CcF) оказывал аналогичное действие при
концентрациях на два порядка ниже. CcF ингибировал экспрессию белка MMP-1,
индуцируемую УФ излучением (15 мДж/см2), в клетках кератиноцитов человека HaCaT
на 42 % (0.01 мкг/мл), 57 % (0.1 мкг/мл) и 70 % (1 мкг/мл). Полисахарид в концентрациях
0.01, 0.1 и 1 мкг/мл также эффективно ингибировал экспрессию мРНК (степень
ингибирования составляла 7, 22 и 59 % соответственно). В отличие от фукоидана FeF2 
сульфатированного фукана (табл. 1), CcF содержал остатки уроновой кислоты (28.2 %)
(табл. 4).
Для подтверждения предположения о возможном влиянии уронанов на активацию
белка и экспрессию мРНК ММР-1 исследовано действие водорастворимого уронана из
Alaria fistulosa (AfU). В 13С ЯМР спектре полисахарида AfU присутствовали интенсивные
сигналы с химическими сдвигами 101.2 (С1), 176.5 (С6), 71.2 (С2), 72.6 (С3), 79.1 (С4) и
77.1 м.д. (С5), характерные для полиманнуроновой кислоты. Соотношение остатков
маннуроновой и гулуроновой кислот в AfU составляло 3:1.
27
AfU (10 мкг/мл) на 47 % ингибировал экспрессию белка MMP-1, индуцируемую УФ
излучением в клетках кератиноцитов человека HaCaT, и экспрессию мРНК (степень
ингибирования составляла 90 %). Возможно, более сильное действие полисахарида CcF
на экспрессию белка и мРНК ММР-1, индуцированную УФ излучением, обусловлено
присутствием в моносахаридном составе его молекулы остатков уроновой кислоты.
Таблица 4  Характеристика полисахаридов, полученных из Costaria costata и Alaria
fistulosa
Моносахаридный состав,
Содержание, %***
Выход**
%***
Мr ,
Фракция*
%
кДа
Уроновые
Fuc Gal
Man Xyl Rha Glc
SO3Naкислоты
CcF
0.3
н.о.
28.2
5.3
23.4 5.1
8.2
2.1 0
4.0
AfU
21.5
0
0
0
0
0
0
0
3040 32
*  CcF  фракция полисахаридов из C. costata
AfU  фракция полисахаридов из A. fistulosa
**  % от веса сухой обезжиренной водоросли
***  % от навески полисахарида
н.о.  не определен
Нами впервые показано, что фукоиданы из Fucus vesiculosus, F. evanescens,
водорастворимые полисахариды из C. costata и A. fistulosa ингибировали в клетках
кератиноцитов человека не только экспрессию белка ММР-1, но и уровень мРНК,
индуцированные УФ излучением. При этом фукоидан из F. evanescens уменьшал
фосфорилирование
белков
митоген-активированных
протеинкиназных
(МАР)
сигнальных каскадов: ERK 1/2, JNK 1/2 и р38, индуцированное УФ излучением.
Следовательно, фукоиданы из Fucus vesiculosus и Fucus evanescens, водорастворимые
полисахариды из Costaria costata и Alaria fistulosa способны предотвращать экспрессию
ММР-1, индуцируемую УФ излучением, на транскрипционном и трансляционном
уровнях, изменяя активность клеточных белков МАРК сигнального каскада.
2.6 Действие фукоиданов на элементы врожденного иммунитета
2.6.1 Действие фукоиданов на созревание дендритных клеток
В качестве агентов, индуцирующих созревание дендритных клеток (DCs),
исследованы три образца фукоиданов:
1. Фукоидан из F. vesiculosus (FvF) производства компании «Sigma», США.
2. Фукоидан из F. evanescens (FeF), полученный в соответствии с известным
способом (Шевченко Н.М., 2004).
3. Композиция, содержащая фукоидан из Saccharina cichorioides (ScF) (Shevchenko
N., 2005).
Препараты FvF и
ScF увеличивали уровень
экспрессии кластеров
дифференциации CD40, CD80, CD83 в дендритных клетках подобно липополисахариду
(LPS). Фукоидан FeF имел незначительный эффект на экспрессию маркеров дендритных
клеток. Наиболее сильное действие на экспрессию кластеров оказывал фукоидан ScF.
Дальнейшее изучение механизма действия фукоиданов на процесс созревания
дендритных клеток продолжали с препаратом ScF. Иммуногистохимический анализ
показал, что иммунореактивность MHC-II и CD86 значительно увеличивалась после двух
дней культивирования с фукоиданом ScF и LPS по сравнению с показателями в
28
контроле (рис. 13). Препарат ScF также индуцировал типичные морфологические
изменения при созревании дендритных клеток (рис. 13).
Контроль Giemsa
DIC
CD86
MHC-CII merge
iDC
ScF-mDC
LPS-mDC
Рисунок 13  Индукция маркеров дендритных клеток с использованием PEконъюгированных CD-80 антител и FITC-конъюгированных MHC-СII антител
Уровень экспрессии иммуносупрессора IL-10 по сравнению с контролем
увеличивался в клетках, обработанных ScF или LPS. Однако экспрессия IL-12p70 в
клетках, обработанных ScF, была ниже, чем при стимуляции липополисахаридом (рис.
14). ScF индуцировал способность DCs экспрессировать фактор некроза опухоли альфа
(TNF-) и уровень экспрессии сопоставим с уровнем, полученным при обработке клеток
LPS. Дендритные клетки поддерживали активацию Т-клеток: они стимулировали
пролиферацию Т-клеток при культивировании в течение 5 дней (рис. 15).
1.0
IL-4
IL-10
IL-12p40
IL-12p70
TNF-alpha
60
*
0.6
40
*
**
0.8
*
*
0.4
*
30
20
10
0.2
0
*
50
0
iDC
ScF-mDC
LPS-mDC
Рисунок 14  Экспрессия цитокинов в
дендритных клетках, обработанных SсF
или LPS. *р < 0.05; **р< 0.005 (достоверное
отличие от контроля)
DC:TC = 25:1
Рисунок 15  Стимуляция роста T-клеток
под
действием
дендритных
клеток,
обработанных SсF или LPS. *р < 0.05
(достоверное отличие от контроля)
Установлено, что фукоиданы являются индукторами созревания дендритных
клеток.
Об
этом
свидетельствовали:
экспрессия
маркера
терминальной
дифференцировки (CD83) дендритных клеток, увеличение экспрессии поверхностных
молекул антигенного представления (MHC II класса), костимулирующих молекул (CD40 и
CD86), молекулы адгезии (CD11с) и активационного маркера (CD38). Данные процессы
способствовали образованию иммунного синапса для обмена информацией между
антигенпрезентирующими
клетками
и
Т-лимфоцитами
и
дифференцировке
активированных Т-клеток в эффекторные.
29
2.6.2 Действие фукоиданов на толл рецепторы
Важной задачей в исследовании механизмов активации толл рецепторов (TLRs),
является идентификация и исследование специфических лигандов для каждого
конкретного рецептора. В работе использовали три клеточные линии эмбрионального
почечного эпителия человека HEK293, содержащие в составе своего генома ген
соответствующего TLR человека (TLR2, гетеродимера ТLR2/ТLR6 или TLR4) а также
репортерный ген фермента β-галактозидазы под контролем транскрипционного
ядерного фактора (NF-kB) зависимого промотера. Установлено, что фукоиданы из бурых
водорослей Saccharina japonica (SjF), Saccharina cichorioides (ScF) и Fucus evanescens
(FeF) в исследуемых концентрациях (до 1 мг/мл) не оказывали влияния на клетки
HEK293-null, не экспрессирующие TLRs (контроль).
При исследовании взаимодействия фукоиданов с толл рецепторами установлено,
что препараты SjF, ScF и FeF в исследуемых концентрациях (от 0.1 мкг/мл до 1.0 мг/мл)
различались по способности специфически связываться с рецепторами. Так, фукоиданы
из S. japonica, S. cichorioides и F. evanescens (1.0 мг/мл) в клетках HEK293-TLR2
вызывали активацию NF-kB: ОП405нм = 1.53; 1.85; 2.43 соответственно по сравнению с
контролем (ОП405нм = 0.4). В качестве положительного контроля, подтверждающего
функциональность TLR2, проводили активацию NF-kB под действием липопептида:
ОП405нм = 2.66.
При исследовании взаимодействия фукоиданов с гетеродимером ТLR2/ТLR6
установлено, что фукоиданы из S. japonica, S. cichorioides и F. evanescens в клетках
HEK293-ТLR2/ТLR6 вызывали активацию NF-kB в концентрации 10 мкг/мл (ОП405нм =
1.72; 1.95; 2.2 соответственно) по сравнению с контролем (ОП405нм = 1.15). При действии
липопептида, подтверждающего функциональность рецептора, ОП405нм = 2.67.
При исследовании взаимодействия фукоиданов с TLR4 установлено, что фукоиданы
из S. japonica и S. cichorioides, взаимодействуя с TLR-4, активировали NF-kB в
интервале концентраций 1001000 мкг/мл, а фукоидан из F. evanescens  от 10 до 1000
мкг/мл по сравнению с интактными клетками в контроле. Наилучший эффект,
сопоставимый с действием липополисахарида (LPS) из E. coli, показал фукоидан из F.
evanescens.
Необходимо было показать, что полученный результат обусловлен действием
фукоидана, и LPS отсутствует в препарате фукоидана. Известно, что 3гидрокситетрадекановая кислота (3-ОНС14) является основным жирнокислотным
компонентом большинства LPS. Для определения содержания эндотоксинов
грамотрицательных бактерий в составе препарата, было проведено исследование на
предмет присутствия в нем метилового эфира гидрокситетрадекановой кислоты.
Установлено, что в масс-спектре стандарта 3-ОНС14 присутствовал основной
фрагментарный ион с массой М+ равной 103 ед., характерный для распада по связи
С3С4. Ни в одном из продуктов гидролиза фукоидана таких ионов не было, что
свидетельствовало об отсутствии 3-ОНС14, а также других 3-гидроксижирных кислот,
которые могут присутствовать в эндотоксинах. Проведенное исследование с
использованием методов ГЖХ и ГЖХ-МС свидетельствовало об отсутствии в составе
фукоидана эндотоксина. Следовательно, фукоиданы являются самостоятельными
лигандами для TLRs.
30
3 Наземные растения как источники биологически активных полифенолов
Фукоиданы могут содержать в качестве примесей полифенолы, вклад которых в
биологическую активность фукоиданов практически не изучен. Для выяснения более
глубокого механизма действия соединений этого класса нами были выбраны
полифенолы растительного происхождения (катехины зеленого чая и резвератрол).
Выбор обусловлен тем, что в литературе содержатся единичные ссылки о присутствии в
водорослях основного полифенола зеленого чая  эпигаллакатехин галлата. Кроме того,
эпигаллакатехин галлат и резвератрол  доступные коммерческие препараты.
3.1 Биологическая активность катехинов зеленого чая
3.1.1 Действие эпигаллокатехин галлата на пролиферацию клеток:
взаимодействие с виментином и регулирование его функций
Для идентификации белков, связывающихся с эпигаллокатехин галлатом (EGCG),
были использованы эпидермальные клетки мыши JB6 Cl41, которые находят
применение как модель для изучения развития опухоли in vitro и аффинная
хроматография на EGCG-Сефарозе 4B (рис. 16 А). Фракции высокоаффинных к EGCG
белков, элюированные с EGCG-Сефарозы 4B Т1-буфером, разделяли 2D
электрофорезом и окрашивали SYPRO Ruby (рис. 16 Б). Виментин (точки, обведенные
кольцом, Mr = 53.7 кДа; рН 5.05)  промежуточный филамент цитоскелета (intermediate
filament, IF), с помощью МАЛДИ ВП масс-спектрометрии был идентифицирован как
белок, связывающийся с EGCG (рис. 16). Константа диссоциации (Kd) комплекса
виментин-EGCG составляла 3.3 нМ, что свидетельствует о высоком сродстве EGCG к
виментину.
А
Б
2,5
5
5.1
6.0
6.5
8 pH
kDa
T буфер
2,0
75
50
1,5
35
1,0
T1 буфер
1
2
25
3
0,5
20
0
10
20
30
40
50
60
V, мл
Рисунок 16  Идентификация in vitro белков супернатанта лизата JB6 Cl41 клеток после
аффинной хроматографии. А. Аффинная хроматография белков JB6 Cl41 клеток. Б. 2D
электрофорез белков, высокоаффинных к EGCG
Согласно литературным данным, фосфорилирование белков IF серин/треонин
протеинкиназами
приводит
к
деструктурированию
филамента.
Виментин
фосфорилируется киназами Cdc2 и PKA: Cdc2 фосфорилирует виментин по Ser50, PKA
 по Ser55. Показано, что EGCG связывался с виментином по участкам, необходимым
для фосфорилирования этого белка киназами PKA и Cdc2 и, как следствие, ингибировал
активность PKA (рис. 17 А, верхняя панель, линии 35) и Cdc2 (рис. 17 А, нижняя
панель, линии 45). Важным структурным фрагментом EGCG при взаимодействии с
виментином являлась галлатная группа, так как среди аналогов EGCG (EC, ECG и EGC
31
 эпикатехин, эпикатехин галлат и эпигаллокатехин соответственно) только эпикатехин
галлат (20 мкМ), содержащий галлатную группу, как и EGCG, ингибировал активность
Cdc2 (рис. 17 Б, линия 4).
А
Исследованы
роль
виментина
в
EGCG, мкM
регуляции клеточной пролиферации и
0
1
5
10
20
влияние EGCG на этот процесс.
р-РКА
Показано, что в контрольных JB6 Cl41
p-Cdc2
клетках,
экспрессирующих
виментин
1
2
3
4
5
(GFP siRNA, рис. 18 А, верхняя панель,
Б
линия 1; рис. 18 Б), пролиферация во
EGCG EC ECG EGC (мкM)
времени была выше (рис. 18 В), чем в
0
20 20 20 20
JB6
Cl41
клетках
с
пониженной
p-Cdc2
экспрессией виментина (виментин siRNA,
1
2
3
4
5
рис. 18 А, верхняя панель, линия 1; рис.
Рисунок
17

Фосфорилирование
18 Б). Пролиферация контрольных JB6
виментина. А. Фосфорилирование РКА
Cl41
клеток снижалась в зависимости от
(верхняя панель) и Cdc2 (нижняя панель).
дозы через 72 ч после обработки клеток
Б. Эффект EGCG и его аналогов на
активность Cdc2
EGCG (IC50 = 16 мкМ, рис. 18 Г). При этом
EGCG не влиял на пролиферацию JB6
Cl41 клеток с пониженной экспрессией
виментина (рис. 18 Г). Впервые показано, что связывание EGCG с виментином является
важным в каскаде регулируемой виментином пролиферации клеток, и этот процесс
происходит через ингибирование фосфорилирования виментина.
А
Б
Виментин
бета актин
1
2
В
Г
7
6
5
80
4
60
3
*
2
**
40
20
1
0
Виментин siRNA
GFP siRNA
100
Виментин siRNA
GFP siRNA
24
48
Время, ч
72
0
IC50 = 16 мкM
5
*
10
15
EGCG, мкM
**
20
Рисунок 18  Влияние EGCG на пролиферацию контрольных JB6 Cl41 клеток (GFP siRNA) и
JB6 Cl41 клеток с пониженной экспрессией виментина (виментин siRNA). А и Б.
Характеристика GFP siRNA и виментин siRNA JB6 Cl41 клеток. В. Зависимость
пролиферации JB6 Cl41 клеток от времени. Г. Зависимость пролиферации JB6 Cl41 клеток
от концентрации EGCG. * р<0.05; ** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)
32
3.1.2 Действие эпигаллокатехин галлата на апоптоз опухолевых клеток:
взаимодействие с белком, регулируемым глюкозой, и влияние на его функции
Для идентификации других белков, взаимодействующих с EGCG, как и в случае с
виментином, использовали лизат эпидермальных клеток мыши JB6 Cl41 и носитель для
аффинной хроматографии EGCG-Сефарозу 4В (рис. 19).
Установлено, что белок, регулируемый глюкозой (GRP78, точки, обведенные
кольцом, Mr = 72.3 кДа; рН 5.07), связывался с EGCG. На рис. 19 приведены
электрофореграммы белков лизата JB6 Cl 41 клеток (рис. 19 А, Б, Г) и рекомбинантного
GRP78 (rGRP78) (рис. 19 В) после аффинной хроматографии (EGCG-Сефароза 4В).
Показано, что EGCG связывается с GRP78 (рис. 19 В и Г, линии 2). Kd составила 0.7
мкМ. Полученные данные подтверждают специфическое взаимодействие между GRP78
и EGCG.
А
Б
5
5.1
6.0 6.5
8
4.7 5.1
3
pH
кДа
75
10
pH
кДа
75
50
50
37
37
В
Г
+
1
+
+
2
+
+
Лизат
EGCG-Сефароза 4B
Сефароза 4B
GRP78 (74 кДа)
3
Рисунок 19  Идентификация in vitro белков супернатанта лизата JB6 Cl41 клеток после
аффинной хроматографии. А и Б. 2D электрофорез белков, высокоаффинных к EGCG. Гели
окрашивали SYPRO Ruby (А) или проводили перенос белков на нитроцеллюлозную
мембрану (Б). В и Г. SDS-PAGE rGRP78 (В) и белков лизата JB6 Cl41 клеток (Г) после
аффинной хроматографии. Гели окрашивали Кумасси (В) или проводили перенос белков на
нитроцеллюлозную мембрану (Г). Линия 1, В и Г  rGRP78 и GRP78 в клеточном лизате
соответственно (контроль). Линия 2, В и Г  белки (rGRP78 и клеточный лизат
соответственно), высокоаффинные к EGCG после проявления антителами против GRP78.
Линия 3, В и Г  связывание rGRP и белков клеточного лизата с носителем Сефароза 4В,
не содержащим EGCG (контроль)
Для идентификации участков связывания GRP78 c EGCG были созданы
конструкции
функциональных
доменов
GRP78.
Установлено,
что
EGCG
взаимодействовал с рекомбинантными белками (GST-GRP78), содержащими участки
связывания с аденозинтрифосфатом (АТР).
АТР и EGCG конкурировали за взаимодействие с GRP78 в дозозависимой манере:
связывание EGCG с GST-GRP78 уменьшалось с ростом концентрации АТР и наоборот,
связывание АТР с GST-GRP78 уменьшалось с ростом концентрации EGCG.
GRP78 осуществляет свои многочисленные функции за счет энергии гидролиза
АТР. EGCG, в концентрациях 5 и 10 мкМ, ингибировал способность GST-GRP78
гидролизовать АТР на 56 и 71 % соответственно. Таким образом, катехин зеленого чая
EGCG конкурировал с АТР за взаимодействие с GST-GRP78 в АТР связывающем
домене и, как следствие, оказывал влияние на функции GRP78 в клетках, поскольку
33
известно, что GRP78 мутанты, не способные гидролизовать АТР, теряют
проапоптотические фукции.
Среди аналогов EGCG только ECG подобно EGCG ингибировал гидролиз АТР (на
64 %), катализируемый GST-GRP78, другие аналоги (эпикатехин (EC) и эпигаллокатехин
(EGC)) проявили более слабое ингибирующее действие (на 38 и 53 % соответственно).
Вероятно, галлатная группа, которая присутствует только в EGCG и ECG, является
важной структурной характеристикой для проявления исследуемой активности.
Особенностью GRP78 является способность существовать во взаимообратимых
олигомерной и мономерной формах. Полученный нами рекомбинантный GST-GRP78
существовал в виде димера и мономера (рис. 20, линия 1). Содержание димера GSTGRP78 уменьшалось с увеличением концентраций АТР (рис. 20 А), из чего следовало,
что при связывании с АТР рекомбинантный GST-GRP78 обладал способностью к
переходу из неактивной олигомерной в активную мономерную форму in vitro (рис. 20 А,
линии 24). В отличие от АТР, при связывании EGCG с GST-GRP78 происходил переход
в неактивную димерную форму (рис. 20 Б, линии 24). Подобное действие (в меньшей
степени) оказывал аналог EGCG  ECG (рис. 20 В, линия 4); EC и EGC (рис. 20 В, линии
3 и 5) не влияли на процесс перехода форм.
А
Б
0
1
ATP
10
30
мкМ
EGCG
1
5
0
10 мкМ
D
D
IB: GRP78
M
1
2
3
IB: GRP78
M
1
4
В
2
3
4
Г
-
0
-
10 мкМ
EGCG EC ECG EGC
0
+
1
+
5
+
10
+
EGCG, мкМ
ATP, 30 мкМ
D
D
IB: GRP78
M
1
2
3
4
5
IB: GRP78
M
1
2
3
4
5
Рисунок 20  Влияние АТР, EGCG и его
аналогов на конформационные изменения
мкМ
GRP78. А. Эффект АТР на конверсию
0
1
5
10
димера GST-GRP78 в мономер. Б. Эффект
O
EGCG на процесс олигомеризации GSTT
GRP78. В. Эффект аналогов EGCG на
процесс олигомеризации GST-GRP78. Г.
IB: GRP78
Эффект EGCG на конформационные
D
изменения GST-GRP78, индуцированные
M
АТР. Д. Эффект EGCG на процесс
1
2
3
4
олигомеризации GRP78 в JB6 Cl41 клетках.
М  мономер; D  димер; Т  тетрамер; О 
олигомер
Следовательно, важным структурным элементом для проявления данной
активности, аналогично связыванию EGCG с виментином, является галлатная группа
EGCG. Установлено, что EGCG (10 мкМ) способен предотвращать процесс перехода
GST-GRP78 в мономерную форму под действием АТР (рис. 20 Г, линия 5). Показано, что
GRP78 присутствует в JB6 Cl41 клетках в мономерной, димерной и олигомерной формах
Д
EGCG
34
(рис. 20 Д, линия 1) и EGCG индуцирует преобразование мономерной формы в
димерную и олигомерную формы в дозозависимой манере (рис. 20 Д, линии 24).GRP78
 трансмембранный белок, который взаимодействует с прокаспазой 7 и проявляет
проапоптотические функции. Для определения участков связывания GRP78 с
рекомбинантной прокаспазой 7 использовали конструкции для экспрессии
рекомбинантных белков, содержащих функциональные домены GRP78. Прокаспаза 7
взаимодействовала со всеми исследуемыми конструкциями белка GRP78, то есть имела
многочисленные участки связывания с GRP78. Однако более выраженное
взаимодействие наблюдалось с конструкциями белка, содержащими АТР связывающий
домен. Прокаспаза 7 и EGCG конкурировали за связывание с GRP78: с увеличением
концентрации EGCG связывание прокаспазы 7 с GST-GRP78 уменьшалось.
Следовательно, АТР связывающий участок GRP78 важен как для взаимодействия этого
белка с прокаспазой 7, так и с EGCG.
Одним из механизмов антиапоптотического действия GRP78 является увеличение
его экспрессии, которое ведет к формированию ингибиторного комплекса, что, в свою
очередь, подавляет активацию прокаспазы 7. В результате происходит усиление роста
опухолевых клеток и развивается их устойчивость к действию противораковых
лекарственных препаратов. Для определения роли EGCG в регуляции апоптоза в Т24/83
клетки рака крови человека был встроен вектор, содержащий ген GRP78. Показано, что
в клетках Т24/83 с повышенной экспрессией GRP78 (рис. 21, панель 1, линии 1 и 5 в
сравнении), активация прокаспазы 7 этопозидом - ингибитором топоизомеразы - была
ниже (рис. 21, панель 2, линии 3 и 7 в сравнении) по сравнению с контрольными
клетками. Обработка клеток Т24/83 EGCG в концентрации 10 мкМ не приводила к
активации прокаспазы 7 (рис. 21 А, панель 2, линии 2 и 6), так как концентрации EGCG,
при которых наблюдаются ингибирование пролиферации и апоптоз для этого типа
клеток составляют 4080 мкМ. После обработки клеток EGCG в сочетании с этопозидом
(рис. 21, панель 2, линии 4 и 8 в сравнении), наблюдалось усиление активации
прокаспазы 7 и, как следствие, уменьшение устойчивости клеток к этопозиду.
А
Рисунок 21  Влияние
T24/83-pcDNA T24/83-GRP78
EGCG
на
апоптоз,
+
+
Этопозид (20 мкМ)
индуцированный
- +
- +
+ + EGCG (10 M)
этопозидом в клетках
Прокаспаза 7
1
рака
крови
человека
Каспаза 7
2
Т24/83. А. Эффект EGCG
GRP78
3
на активацию прокаспазы
4
-актин
7,
индуцированную
1
2
3
4
5
6
7
8
этопозидом, в клетках с
различным
уровнем
Б
В
экспрессии GRP78. Б и В.
Данные
проточной
27 % 29%
30
30
цитометрии
по
**
***
содержанию
20
20
18 %
***
апоптотических
клеток
9%
при
обработке
10
10
этопозидом в отсутствии
0
0
или присутствии EGCG.
Этопозид (20 мкМ) +
+
Этопозид (20 мкМ) +
+
+
+
EGCG
(10
мкМ)
EGCG (10 мкМ)
+
+
** р0.005;
*** р0.0001(достоверное
отличие от контроля)
Согласно результатам проточной цитометрии, после обработки контрольных
клеток Т24/83 этопозидом апоптоз составлял более 20 % (рис. 21 Б). При этом EGCG не
35
усиливал действие этопозида. Обработка этопозидом клеток Т24/83 со встроенным
вектором GRP78 приводила к незначительному апоптозу (9 %), то есть проявлялось
антиапоптотическое действие GRP78. При обработке клеток этопозидом и EGCG
количествоапоптотических клеток увеличивалось в два раза. Следовательно, EGCG
предотвращал устойчивость клеток к действию этопозида.
Для подтверждения результатов о действии EGCG изучено его влияние на апоптоз
клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 и T-47D. Показано, что EGCG
усиливал в исследуемых клетках активацию прокаспазы 7, индуцированную этопозидом,
и предотвращал антиапоптотический эффект GRP78, что играет важную роль для
уменьшения устойчивости клеток к действию лекарственных препаратов.
Опухолевые клетки обладают способностью самопроизвольно образовывать
колонии в системе мягких агаров. Исследовано влияние EGCG на самопроизвольное
формирование и рост колоний клеток MDA-MB-231 и T-47D. При обработке клеток
низкими концентрациями EGCG или этопозида наблюдалось незначительное
ингибирование колоний клеток (рис. 22 А и Б, правые панели, столбцы 2 и 3
соответственно). Однако, при совместной обработке клеток MDA-MB-231 и T-47D
этопозидом и EGCG уменьшались как число (рис. 22 А и Б, правые панели, столбцы 4)
так и размер колоний (рис. 22 А и Б, левые панели, столбцы 4) в сравнении с клетками,
обработанными только этопозидом или EGCG. Таким образом, EGCG предотвращал
устойчивость MDA-MB-231 и T-47D клеток по отношению к препарату этопозид.
А
3
2000
2
**
1000
0
***
1
1
+
2
+
3
0
+ Этопозид, 0,1 мкМ
+ EGCG, 10 мкМ
4
1
+
2
+
3
+
+
4
Б
1500
3
1000
2
**
500
0
1
+
2
+
3
**
1
0
+ Этопозид, 0,1 мкМ
+ EGCG, 10 мкМ
4
1
+
2
+
3
+
+
4
Рисунок 22  Влияние EGCG на формирование колоний клеток рака молочной железы T47D (А) и MDA-MB-231 (Б). ** р0.005; *** р0.001 (достоверное отличие от контроля)
Полученные нами данные позволяют понять ранее неизвестные механизмы
действия полифенолов зеленого чая и обосновать возможные пути использования
данных соединений в профилактике и лечении раковых заболеваний.
36
3.1.3 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток:
взаимодействие с онкогеновыми тирозинкиназами и регулирование их функций
Для поиска белков, являющихся мишенью для EGCG, компанией Upstate
Biotechnology (США) совместно с институтом Хормела (Hormel Institute University of
Minnesota, MN, США) было проведено тестирование взаимодействия EGCG с
коммерчески доступными белками (киназами) (в эксперименте использовали 101
киназу). Согласно полученным данным EGCG значительно ингибировал активность
тирозиновых протеинкиназ: Fyn и рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 (IGFIR).
3.1.3.1 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток,
индуцируемую эпидермальным фактором роста
Коммерческая (рис. 23 А) или иммунопреципитированная из JB6 Cl41 клеток (рис.
23 Б) киназа Fyn фосфорилировала пептид Cdc2. EGCG в концентрациях 5, 10 и 20 мкМ,
ингибировал способность коммерческой (на 31, 90 и 92 % соответственно, рис. 23 А) и
иммунопреципитированной из лизата клеток (на 16, 33 и 90 % соответственно, рис. 23 Б)
киназы Fyn фосфорилировать пептид Cdc2.
А
Б
10
10
69%
*
8
8
6
6
4
4
2
10%
**
8%
**
+
10
+
+ Fyn киназа, 100 нг
20 EGCG, мкМ
+ Пептид (субстрат), 250 мкМ
0
+
+
+
+
5
+
84%
67%
*
2
10%
**
0
-
+
5
+
10
+
20
+
EGCG, мкМ
Пептид (субстрат), 250 мкМ
Рисунок 23  Определение активности Fyn. Активность коммерческой Fyn (А) и
иммунопреципитированной из JB6 Cl41 клеток (Б) после обработки EGCG. * р<0.05;
** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)
Определение непосредственного взаимодействия EGCG с Fyn проводили
аффинной хроматографией на EGCG-Сефарозе 4В. Установлено, что Fyn связывался с
EGCG, но не с Сефарозой 4В (контроль). Константа диссоциации (Kd) комплекса
составляла 0.3 мкМ. Показано, что EGCG связывался с SH2 доменом Fyn. SH2 домен
участвует во взаимодействии с молекулами рецепторов и сигнальных белков, поэтому
было исследовано действие EGCG на фосфорилирование Fyn и белков сигнальных
путей, регулируемых данной киназой.
Фосфорилирование Fyn в активированных макрофагах, а также в нормальных
фибробластах под влиянием ростовых факторов представлено в ряде исследований.
Моделью для изучения трансформации клеток под действием различных факторов,
таких как эпидермальный фактор роста (EGF) и трифорболовый эфир (ТРА), являются
клетки JВ6 Cl41. Мы показали, что до 20 мкМ EGCG не оказывал влияние на
жизнеспособность JВ6 Cl41 клеток (рис. 24 А) и замедление пролиферации клеток
наблюдалось через 72 ч после обработки клеток EGCG (рис. 24 Б).
37
Б
А
0,7
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,6
0,5
0,4
*
0,3
*
0,2
0,1
0
20
40
60
80
EGCG, мкМ
100
0 мкМ EGCG
20 мкМ
*
*
24
48
72
Время, ч
Рисунок 24  Влияние EGCG на жизнеспособность (А) и пролиферацию (Б) JB6 Cl41 клеток.
* р<0.05 (достоверное отличие от контроля)
Согласно литературным данным, EGF индуцирует фосфорилирование ERK.
Исследован процесс функционального перераспределения сигналов, исходящих от Fyn.
Показано, что EGF фосфорилировал Fyn (рис. 25 А, линия 2) и EGCG ингибировал этот
процесс в дозозависимой манере (рис. 25 А, линии 35), однако не оказывал влияние на
фосфорилирование ERK, индуцированное EGF (рис. 25 Б, линии 36). Следовательно,
ERK не участвовал в передаче через Fyn сигнала, активированного EGF.
Известно, что EGF индуцирует клеточную трансформацию, поэтому было
исследовано влияние EGCG на этот процесс. EGF индуцировал трансформацию JВ6
Cl41 клеток (рис. 25 В), но при обработке клеток EGCG количество колоний
уменьшалось в дозозависимой манере (рис. 25 В).
А
В
-
+
5
+
10 20 EGCG, мкМ
+ + EGF, 10 нг/мл
p-Fyn (Thr12)
Fyn
1
2
3
4
8000
7000
100%
6000
93%
5
5000
Б
4000
-
-
1 5 10 20 EGCG, мкМ
+ + + + + EGF (10 нг/мл, 30 мин)
3000
p-ERK
2000
ERK
1
2
3
4
5
55%
*
1000
2%
**
6
0
-
+
-
+
5
+
10
+
20
EGF, 10 нг/мл
EGCG, мкМ
Рисунок 25  Влияние EGCG на фосфорилирование Fyn (А), ERK (Б) и формирование
колоний JB6 Cl41 клеток (В), индуцированные EGF. * р<0.05; ** р<0.005 (достоверное
отличие от контроля)
Показано, что формирование и размер колоний в клетках siRNA-Fyn JВ6 Cl41
(экспрессия Fyn подавлена) были ниже, чем в контрольных JВ6 Cl41 клетках. Впервые
установлено, что уменьшение уровня киназы Fyn подавляло трансформацию клеток,
индуцируемую EGF, и это подтверждало предположение, что Fyn участвует в данном
процессе.
Исследовано участие Fyn в процессах регуляции транскрипционных факторов или
киназ. Впервые показано, что фосфорилирование STAT1, ATF-2 и p38 в клетках siRNAFyn JВ6 Cl41 было ниже, чем в контрольных клетках pcDNA JВ6 Cl41. EGCG
ингибировал фосфорилирование всех перечисленных белков. Установлено, что EGCG
38
блокировал непосредственное участие Fyn в трансформации JB6 Cl41 клеток,
индуцируемой EGF.
3.1.3.2 Действие эпигаллокатехин галлата на трансформацию клеток,
индуцируемую инсулиноподобным фактором роста 1
Роль EGCG в регуляции сигнального пути, проходящего через рецептор
инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-IR), не изучена. Использовали коммерческий
IGF-IR и иммунопреципитированный из R+ клеток (рис. 26 В) с повышенной экспрессией
IGF-IR (рис. 26 А и Б соответственно). Показано, что EGCG ингибировал активность IGFIR (рис. 26 А, нижняя панель и рис. 26 Б) в дозозависимой манере. Следует отметить,
что EGCG ингибировал как фосфорилирование субстрата IGF-IR  IGF-1Rtide (рис. 26 А,
нижняя панель), так и аутофосфорилирование рецептора (рис. 26 А, верхняя панель).
Взаимодействие EGCG и IGF-IR подтверждено аффинной хроматографией (EGCGСефароза
4В).
Следует
отметить,
что
связывание
с
рецептором,
иммунопреципитированным из YF3 клеток, содержащих рецептор с мутациями в
киназном домене IGF-IR (Y1131F, Y1135F и Y1136F), не происходило. Согласно данным
компьютерного моделирования EGCG взаимодействовал с IGF-IR в домене,
связывающем АТР, и аминокислоты Gln 977, Lys1003, Met1052, Thr1053, Asp1123 играли
важную роль во взаимодействии.
А
Б
0
+
-
0
+
0
+
+
2.5 5
+ +
+ +
10 20
+ +
+ +
EGCG (мкМ)
IGF-1Rtide (6.25 нмоль)
IGF-IR (200 нг)
аутофосфорилирование
0
+
-
0
+
0
+
+
2.5 5
+ +
+ +
10 20
+ +
+ +
EGCG (мкМ)
IGF-1Rtide (6.25 нмоль)
IP: IGF-IR (50 мкл)
р-IGF-1Rtide
не связанный 32Р-АТР
р-IGF-1Rtide
В
R+
R-
1
2
не связанный 32Р-АТР
IGF-IR -субъединица
бета-актин
Рисунок 26  Влияние EGCG на активность IGF-IR. (А) Активность коммерческого IGF-IR и
(Б) иммунопреципитированного из R+ клеток (В) после обработки EGCG тестировали
методом киназной активности
Было исследовано влияние EGCG на активацию IGF-IR под действием IGF-1 и
фосфорилирование белков, вызванное этой активацией. В клетках R+, экспрессирующих
высокий уровень IGF-IR (рис. 26 В), EGCG ингибировал фосфорилирование IGF-IR, ERK
(Tyr202/Tyr204) и Akt (Ser473), вызванное активацией IGF-1. В R- клетках, не
содержащих IGF-IR, фосфорилирование указанных белков не наблюдалось.
Показано, что рост R+ клеток происходил быстрее, чем клеток R-, не содержащих
IGF-IR (рис. 27 А). Полученные данные подтверждали, что IGF-IR является важным
звеном в процессе пролиферации клеток. Исследовано влияние EGCG на действие
рецептора в данном процессе. EGCG ингибировал рост R+, но не R- клеток (рис. 27 Б).
Впервые показано, что действие EGCG на процесс регуляции роста опухолевых клеток
происходит с участием IGF-IR.
39
Б
3.0
(R+) клетки
*
120
(R-) клетки
2.0
1.0
0
80
*
*
*
*
40
1
А
2
3
Время, дни
(R-) клетки
4
5
(R+) клетки
0
5
10
15
EGCG, мкМ
20
Рисунок 27  Влияние IGF-IR на пролиферацию (А) и EGCG на жизнеспособность (Б) R+ и
R- клеток. Клетки были не обработаны (А) или обработаны (Б) EGCG, жизнеспособность
клеток оценивали во времени. * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)
R- клетки, в которых отсутствует экспрессия IGF-IR, не способны
трансформироваться под действием IGF-1. R+ клетки образовывали колонии в мягком
агаре под действием IGF-1 и EGCG в дозозависимой манере ингибировал этот процесс
(рис. 28 А). Установлено, что MCF-7 клетки, экспрессирующие высокий уровень IGF-IR,
образовывали колонии в мягком агаре под действием IGF-1 и EGCG в дозозависимой
манере ингибировал этот процесс (рис. 28 Б).
А
Б
4000
4000
3000
3000
2000
2000
*
*
1000
0
IGF-1, (20 нг/мл)
EGCG, (мкМ)
1000
*
+
0
+
5
*
+
10
*
+
20
0
IGF-1, (20 нг/мл)
EGCG, (мкМ)
*
+
0
+
5
+
10
+
20
Рисунок 28  Влияние EGCG на формирование колоний R+ (A) и MCF-7 (Б) клеток
индуцированное IGF-1. * р<0.05 (достоверное отличие от контроля)
Впервые показано, что одним из механизмов блокирования трансформации
опухолевых клеток является ингибирование активности IGF-IR полифенолом чая EGCG,
как результат их взаимодействия.
3.2 Биологическая активность резвератрола
Исследовано взаимодействие резвератрола (RSV), его гидроксилированного
(RSV1) и метоксилированного (RSV2) аналогов с циклооксигеназой 2 (СОХ-2).
Взаимодействие RSV с СОХ-2 изучено нами с использованием аффинной
хроматографии (резвератрол-Сефароза 4В, рис. 29).
Коммерчески доступная СОХ-2 (рис. 29 А, линия 1) и иммунопреципитированная из
клеток рака кишечника человека НТ-29 (рис. 29 Б, линия 1) связывались с
резвератролом (рис. 29 А, линия 3; рис. 29 Б, линия 3 соответственно). Взаимодействие
гидроксилированного, но не метоксилированного аналога резвератрола подтверждено
диагностикой поверхностного плазмонного резонанса (SRS-диагностикой) с СОХ-2 (рис.
40
29 В). Константу диссоциации (Kd) комплекса СОХ-2-RSV определяли с использованием
флуоресцентной спектроскопии. Kd, определенная методом титрования СОХ-2
различными концентрациями RSV, составляла 58 мкМ. Полученные данные
подтверждали непосредственное специфическое взаимодействие между RSV и СОХ-2.
А
Б
+
-
+
+
+
+
-
COX-2
RSV-Сефароза 4В
Сефароза 4В
В
+
-
+
+
+
+
-
300
Лизат
RSV-Сефароза 4В
Сефароза 4В
RSV-1
200
1
2
3
1
2
RSV
3
100
RSV-2
0
100
200
Время, с
300
Рисунок 29  Идентификация белков, высокоаффинных к резвератролу. А и Б.
Электрофореграммы коммерческой СОХ-2 (А) и белков лизата НТ-29 клеток (Б) после
аффинной хроматографии (резвератрол-Сефароза 4В). Линия 1, А и Б  коммерческая
СОХ-2 и СОХ-2 в клеточном лизате соответственно (контроль). Линия 2, А и Б 
взаимодействие СОХ-2 и белков клеточного лизата с носителем Сефароза 4В (контроль).
Линия 3, А и Б  белки (СОХ-2 и клеточный лизат соответственно), высокоаффинные к
резвератролу после проявления антителами против СОХ-2. В. Демонстрация
взаимодействия RSV, RSV1 и RSV2 с СОХ-2 SRS-диагностикой
Кроме
того,
была
определена
активность
коммерческой
и
иммунопреципитированной из лизата клеток НТ-29 СОХ-2 по изменению синтеза
простагландина Е2 (PGE2). Показано, что RSV обладал способностью ингибировать
синтез PGE2 (IC50 = 50 мкМ), индуцированный коммерческой СОХ-2, при этом только
RSV1 обладал более сильным ингибирующим действием (IC50 = 25 мкМ), RSV2 не
ингибировал синтез PGE2. Целекоксиб, известный ингибитор СОХ-2, ингибировал
синтез PGE2 с IC50 = 10 мкМ.
Изучена роль СОХ-2 в клеточной пролиферации с использованием клеток СОХ2+/+ и СОХ-2-/-, экспрессирующих и не содержащих СОХ-2 соответственно (рис. 30 А).
Показано, что клетки СОХ-2+/+ растут быстрее, и RSV и RSV1, но не RSV2
ингибировали рост этих клеток (рис. 30 А). Установлено, что RSV и RSV1, но не RSV2,
А
Б
30
контроль
RSV
RSV-1
20
*
RSV-2
*
10
0
1
2
3
Время, дни
4
*
*
5
Рисунок 30 - Влияние резвератрола и его аналогов на пролиферацию клеток СОХ-2+/+ и
СОХ-2-/- после 6 дней обработки (А) и клеток НТ-29 во времени (Б). * р<0.05 (достоверное
отличие от контроля)
ингибировали рост клеток рака кишечника человека НТ-29, экспрессирующих высокий
уровень СОХ-2 (рис. 30 Б). При этом RSV1 обладал более сильным ингибирующим
41
действием на пролиферацию исследуемых клеток по сравнению с RSV, и его влияние
было сопоставимо с действием целекоксиба (рис. 30 Б).
Изучена роль резвератрола и его аналогов в процессах самопроизвольного
образования и роста колоний клеток НТ-29 (рис. 31). Показано, что RSV и RSV1, но не
RSV2 ингибировали данный процесс (рис. 31).
Рисунок 31  Влияние резвератрола
и его аналогов на формирование
колоний клеток рака кишечника НТ-29.
* р<0.05;
** р<0.005
(достоверное
отличие от контроля)
10
8
*
6
**
4
2
0
Контроль
RSV
RSV-1
RSV-2
Полученные нами данные впервые показали непосредственное взаимодействие
резвератрола с СОХ-2 и, как следствие, ингибирование способности фермента
продуцировать PGE2. Установлено, что ингибирование резвератролом пролиферации и
трансформации раковых клеток происходит с участием циклооксигеназы 2, при этом
гидроксилированный аналог резвератрола оказался более эффективным по отношению
к исследованным процессам.
3.2.1 Синергическое действие резвератрола и фукоидана из бурой водоросли
Saccharina cichorioides
Нами показан синергизм противоопухолевого действия резвератрола (RSV) и
фукоидана из S. cichorioides (ScF2) с целью повышения эффективности лечения
злокачественных новообразований. Резвератрол проявлял цитотоксическую активность
по отношению к клеткам кишечника человека HCT 116: концентрация резвератрола, при
которой погибало 50 % клеток (IC50), составляла 55 мкМ (рис. 32). Фукоидан ScF2 не
обладал цитотоксическим эффектом по отношению к данному типу клеток.
Показано, что резвератрол подавлял пролиферацию HCT 116 клеток на 34, 60 и
71 % после инкубации клеток с веществом в течение 24, 48 и 72 ч соответственно (рис.
33 А). Фукоидан ScF2 незначительно подавлял пролиферацию раковых клеток
кишечника человека (степень ингибирования составляла менее 15 %) (рис. 5 А).
Действие резвератрола (40 мкМ, 24 ч) усиливалось после предварительной обработки
клеток фукоиданом ScF2 (100, 200 и 300 мкг/мл) на 23, 28 и 32 % соответственно (рис.
33 Б). В данном случае имеет место синергизм действия при совместном введении двух
веществ.
42
120
IC50 = 55 Мкм
100
80
*
*
60
*
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Концентрация, мкМ
Рисунок 32  Цитотоксичность резвератрола
по отношению к опухолевым клеткам
кишечника человека HCT 116. * р<0.05
(достоверное отличие от контроля)
Б
А
120
120
100 %
100
80
100
59%
*
*
60
40 %
40
88%
80
66 %
60
100 %
29 %
*
20
36%
40
**
31%
27%
+
100
+
200
+
300
*
*
20
0
0
0
24
48
Время обработки, ч
72
-
+
+
-
RSV, 40 мкм
ScF2, мкг/мл
Рисунок 33  Влияние резвератрола (40 мкМ) (А) и совместное действие резвератрола и
фукоидана ScF2 (Б) на пролиферацию опухолевых клеток кишечника человека HCT 116.
* р<0.05; ** р<0.005 (достоверное отличие от контроля)
Была исследована способность фукоидана модулировать апоптоз HCT 116 клеток,
индуцированный резвератролом. Идентификацию апоптоза опухолевых клеток человека
проводили с помощью метода вестерн-блота, определяя активность каспазы 9
(инициаторная) и каспаз 7, 3 (эффекторные) (рис. 34). Появление фосфатидилсерина на
внешней
стороне
плазматической
RSV, 40 мкм +
+
+
+
мембраны
в
процессе
апоптоза
раковых
300
100 200 300
ScF2, мкг/мл клеток
регистрировали
методом
Прокаспаза 9
проточной цитометрии с окрашиванием
Прокаспаза 7
аннексином-V/PI (рис. 35). Показано, что
Каспаза 7
добавленный отдельно фукоидан ScF2
Прокаспаза 3
не индуцировал активацию каспаз в HCT
Каспаза 3
116
клетках.
Обработка
клеток
-актин
резвератролом
сопровождалась
Рисунок 34  Совместное действие
активаций прокаспазы 3. При совместном
резвератрола и фукоидана ScF2 на
введении
резвератрола
и
фукана
активацию каспаз 9, 7, 3 и расщепление
каспаз 7 и 3
наблюдался
синергический
эффект:
происходила активация каспазы 9 (рис.
34) и, как следствие, активация
каспаз 3 и 7. Важно отметить, что активация каспаз усиливалась с увеличением
концентрации фукоидана ScF2. Полученный результат можно рассматривать как
43
косвенное подтверждение наличия у фукоидана ScF2 апоптоз стимулирующей
активности на данном виде опухоли.
Согласно результатам проточной цитометрии, содержание апоптотических клеток в
культурах, обработанных и не обработанных фукоиданом, не отличалось (6 и 9 %
соответственно). Обработка клеток резвератролом приводила к апоптозу 28 % клеток.
Cущественное повышение числа апоптотических клеток (до 52 %) наблюдалось при
обработке НСТ 116 клеток резвератролом и фукоиданом ScF2 (рис. 35). Таким образом,
фукоидан ScF2 из S. cichorioides усиливал апоптоз HCT 116 клеток, индуцированный
резвератролом.
104
100
100
104
101
102 103
FL1-H
Резвератрол, 40 мкM
Фукоидан, 100 мкг/мл
Резвератрол, 40 мкM
Фукоидан, 0 мкг/мл
Резвератрол, 0 мкM
Фукоидан, 0 мкг/мл
104
Резвератрол, 40 мкM
Фукоидан, 200 мкг/мл
104
100
100
104
101
102 103
FL1-H
104
100
100
Резвератрол, 40 мкM
Фукоидан, 300 мкг/мл
101
102 103
FL1-H
104
52%
60
*
104
43%
*
40
28% 30%
*
*
20
9% 6%
100
100
101
102 103
FL1-H
104
100
100
101
102 103
FL1-H
104
0
-
300
+
-
+
100
+
200
+
300
Резвератрол, 40 мкM
Фукоидан, мкг/мл
Рисунок 35  Совместное действие резвератрола и фукоидана из S. cichorioides на
индукцию апоптоза опухолевых клеток кишечника человека HCT 116. * р<0.05 (достоверное
отличие от контроля)
Впервые обнаружено свойство фукоидана из бурой водоросли S. cichorioides
усиливать антипролиферативное и проапоптотическое действие резвератрола по
отношению к опухолевым клеткам кишечника человека. Установлен молекулярный
механизм реализации апоптоза, связанный с активацией каспаз 9, 7 и 3 в клетках рака
кишечника человека. Полученные результаты подтверждают перспективность
использования фукоиданов для профилактики и лечения онкологических заболеваний.
ВЫВОДЫ:
1. В работе охарактеризованы фукоиданы 13 видов бурых водорослей, собранных
в различных регионах. Фукоиданы 10 видов водорослей изучены впервые. Установлено,
что наибольшее количество фукоиданов продуцируют водоросли порядка Fucales,
среднее  Laminariales, наименьшее  Dictyotales. Содержание фукоиданов
уменьшается, а гетерогенность их моносахаридного состава возрастает с повышением
температуры среды обитания водорослей.
44
2. Показано, что фукоиданы водорослей порядка Dictyotales представляют собой
гетерогенные полисахариды, Laminariales  фуканы и галактофуканы, Fucales 
полисахариды различного строения: от фуканов до гетерогенных полисахаридов.
Установлено, что при использовании предварительной обработки водорослей
сверхкритическим
диоксидом
углерода
происходит
удаление
гетерогенных
низкосульфатированных фракций фукоиданов, что позволяет сократить число стадий
очистки.
3. Проведена систематизация структурных типов исследованных фукоиданов.
Фукоидан из Saccharina cichorioides представляет собой высокосульфатированный 1→3α-L-фукан; 1→3;1→4-α-L-фукан из Fucus evanescens содержит сульфатные (при С2 и С4)
и ацетатные группы. Получены несколько типов галактофуканов. Галактофукан из
Saccharina japonica построен из 1→3-связанных остатков α-L-фукозы и 1→6-связанных
остатков β-D-галактозы, сульфатированных по положениям С2 и менее по С4 и частично
ацетилированных. Галактофукан из Undaria pinnatifida построен из 1→3- и 1→4связанных остатков α-L-фукозы и β-D-галактозы, сульфатированных по положениям С4 и
менее по С2, и частично ацетилированных. В галактофукане из Sargassum mcclurei
впервые обнаружены фрагменты, состоящие из чередующихся остатков α-L-фукозы и βD-галактозы, сульфатированных по положениям С2, С3 и С4. Остатки фукозы
соединены 1→3-, 1→4-связями, галактозы - 1→4- или 1→6- связями.
4. Показано, что фукоиданы незначительно влияют на пролиферацию раковых
клеток человека, но эффективно ингибируют трансформацию нормальных клеток,
индуцированную EGF, и самопроизвольное формирование и рост колоний опухолевых
клеток человека. Впервые установлены избирательность противоопухолевого действия
фукоиданов и взаимосвязь структурных элементов фукоиданов с их противоопухолевым
действием.
5. Фукоиданы из Fucus evanescens и Costaria costata подавляют экспрессию ММР-1,
индуцируемую УФ излучением в клетках керанотиноцитов человека, на
транскрипционном и трансляционном уровнях, изменяя активность клеточных белков
МАРК сигнального каскада. Установлена физиологическая роль взаимодействия
митоген активированной протеинкиназы JNK 1/2 с супрессором опухолевого роста
p16INK4a в ответ на действие ультрафиолетового излучения, заключающаяся в
ингибировании активноcти онкогена H-RasG12V. Это позволяет объяснить механизмы
образования рака кожи, вызванных УФ радиацией.
6. Впервые выделен высокомолекулярный (1927 кДа) сильноразветвленный
ламинаран из Eisenia bicyclis. Основная цепь ламинарана состоит из 13- и 16связанных остатков β-D-глюкозы (13:16 = 1.5:1): протяженность участков,
построенных из 13-связанных остатков глюкозы, составляет не более четырех, а из
16-  не более трех моносахаридов. Показано, что уменьшение молекулярной массы
нативного ламинарана из E. bicyclis до определенного предела (степень полимеризации
9–23) и увеличение содержания 16-связанных остатков β-D-глюкозы (13:16 = 1:1)
приводят к возрастанию противоопухолевой активности.
7. Впервые показано участие эпигаллокатехин галлата в процессах пролиферации
клеток и апоптозе, обусловленных взаимодействием с белком цитоскелета 
виментином и белком, регулируемым глюкозой, соответственно. Установлено, что
галлатная группа эпигаллокатехин галлата является важной для взаимодействия с
виментином, GRP78 и регулирования их функций.
45
8. Впервые установлено, что эпигаллокатехин галлат подавляет трансформацию
клеток через ингибирование активности цитоплазматической (Fyn) и трансмембранной
(IGF-IR) тирозинкиназ. Установлен механизм ингибирования активности Fyn и IGF-1R
эпигаллокатехин галлатом.
9. Впервые показано, что EGCG блокирует непосредственное участие Fyn в EGF
индуцируемой трансформации JB6 Cl41 клеток. Установлено, что эпигаллокатехин
галлат и фукоидан из S. cichorioides ингибируют процесс трансформации клеток,
индуцируемый EGF, через различные сигнальные пути.
10. Показана роль резвератрола, его гидроксилированного и метоксилированного
аналогов в процессах регулирования активности циклооксигеназы 2 и, как следствие,
подавления
пролиферации
опухолевых
клеток.
Установлено,
что
высокосульфатированный
α-L-фукан
из
Saccharina
cichorioides
усиливает
антипролиферативное действие резвератрола и апоптоз опухолевых клеток кишечника
человека, индуцированный резвератролом. Молекулярный механизм реализации
апоптоза связан с активацией инициаторных и эффекторных каспаз при совместном
действии резвератрола и фукоидана.
11. Полученные данные позволяют рассматривать фукоиданы бурых водорослей,
полифенолы растительного происхождения, а также сочетанные композиции
фукоиданов и полифенолов как перспективные препараты для предупреждения и
дополнительной терапии раковых заболеваний.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Звягинцева Т.Н., Сова В.В., Бакунина И.Ю., Сундукова Е.В., Шевченко Н.М., Ермакова
С.П., Елякова Л.С. Морские организмы как источники биологически активных
полисахаридов, полисахарид гидролаз с уникальной специфичностью и их ингибиторов
// Химия в интересах устойчивого развития.  1998.  Т. 6.  С. 417326.
Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Ермакова С.П. Препаративное получение пнитрофенилламинариолигозидов реакцией трансгликозилирования, катализируемой
эндо-1,3-β-D-глюканазой из морского моллюска // Биоорган. химия.  1998.  Т. 23.  С.
219223.
Звягинцева Т.Н., Сова В.В., Ермакова С.П., Скобун А.С., Елякова Л.А. Поиск ингибиторов
и активаторов эндо-1,3-β-D-глюканаз в морских водорослях и травах // Биология моря. 
1998.  Т. 24.  С. 246249.
Ermakova S.P., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. Brown seaweed protein as an inhibitor of
marine mollusk endo-1,3-β-D-glucanases // Carbohyd. Res.  2002.  Vol. 337  P. 229237.
Ermakova S., Choi B.Y., Choi H.S., Kang B.S., Bode A.M., Dong Z. The intermediate filament
protein vimentin is a new target for epigallocatechin gallate // J. Biol. Chem.  2005.  Vol.
280.  P. 1688216890.
Choi B.Y., Choi H.S., Ko K., Cho Y.Y., Zhu F., Kang B.S., Ermakova S.P., Ma W.Y., Bode
A.M., Dong Z. The tumor suppressor p16(INK4a) prevents cell transformation through
inhibition of c-Jun phosphorylation and AP-1 activity // Nat. Struct. Mol. Biol.  2005.  Vol. 12.
 P. 699707.
Ermakova S.P., Kang B.S., Choi B.Y., Choi H.S., Schuster T.F., Ma W.Y., Bode A.M., Dong Z.
(-)-Epigallocatechin gallate overcomes resistance to etoposide-induced cell death by targeting
the molecular chaperone glucose-regulated protein 78 // Cancer Res.  2006.  Vol. 66.  P.
92609269.
Cho Y.Y., Yao K., Bode A.M., Bergen H.R. 3rd, Madden B.J., Oh S.M., Ermakova S., Kang
B.S., Choi H.S., Shim J.H., Dong Z. RSK2 mediates muscle cell differentiation through
regulation of NFAT3 // J. Biol. Chem.  2007.  Vol. 282.  P. 83808392.
Li M., He Z., Ermakova S., Zheng D., Tang F., Cho Y.Y., Zhu F., Ma W.Y., Sham Y., Rogozin
E.A., Bode A.M., Cao Y., Dong Z. Direct inhibition of insulin-like growth factor-I receptor kinase
46
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
activity by (-)-epigallocatechin-3-gallate regulates cell transformation // Cancer Epidem.
Biomar.  2007.  Vol. 16.  P. 598605.
Lee N.Y., Ermakova S.P., Choi H.K., Kusaykin M.I., Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N.,
Choi H.S. Fucoidan from Laminaria cichorioides inhibits AP-1 transactivation and cell
transformation in the mouse epidermal JB6 cells // Mol. Carcinogen.  2008.  Vol. 47.  P.
629637.
Lee N.Y., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N., Kang K.W., Dong Z., Choi H.S. Inhibitory effects
of fucoidan on activation of epidermal growth factor receptor and cell transformation in JB6
Cl41 cells // Food Chem. Toxicol.  2008.  Vol. 46.  P. 17931800.
Zykova T.A., Zhu F., Zhai X., Ma W.Y., Ermakova S.P., Lee K.W., Bode A.M., Dong Z.
Resveratrol directly targets COX-2 to inhibit carcinogenesis // Mol. Carcinogen.  2008.  Vol.
47.  P. 797805.
Kusaykin M., Bakunina I., Sova V., Ermakova S., Kuznetsova T., Besednova N., Zaporozhets
T., Zvyagintseva T. Structure, biological activity, and enzymatic transformation of fucoidans
from the brown seaweeds // Biotechnol. J.  2008.  Vol. 3.  P. 904915.
He Z., Tang F., Ermakova S., Li M., Zhao Q., Cho Y.Y., Ma W.Y., Choi H.S., Bode A.M., Yang
C.S., Dong Z. Fyn is a novel target of (-)-epigallocatechin gallate in the inhibition of JB6 Cl41
cell transformation // Mol. Carcinogen.  2008.  Vol. 47.  P. 172183.
Moon H.J., Lee S.H., Ku M.J., Yu B.C., Jeon M.J., Jeong S.H., Stonik V.A., Zvyagintseva T.N.,
Ermakova S.P., Lee Y. H. Fucoidan inhibits UVB-induced MMP-1 promoter expression and
down regulation of type I procollagen synthesis in human skin fibroblasts // Eur. J. Dermatol. 
2009.  Vol. 19.  P. 129134.
Moon H.J., Park K.S., Ku M.J., Lee M.S., Jeong S.H., Imbs T.I., Zvyagintseva T.N., Ermakova
S.P., Lee, Y. H. Effect of Costaria costata fucoidan on expression of matrix metalloproteinase1 promoter, mRNA, and protein // J. Nat. Prod.  2009.  Vol. 72.  P. 17311734.
Вищук О.С., Ермакова С.П., Тин Ф.Д., Звягинцева Т.Н. Противоопухолевая активность
фукоиданов бурых водорослей // Тихоокеан. мед. журн.  2009.  Т. 3.  С. 9296.
Звягинцева Т.Н., Ермакова С.П., Кусайкин М.И., Шевченко Н.М., Федоров С.Н., Квак Я.Й.
Средство, индуцирующее созревание дендритных клеток // Патент РФ на изобретение
№ 2361598.  20.07.2009.
Имбс Т.И., Красовская Н.П., Ермакова С.П., Макарьева Т.Н., Шевченко Н.М., Звягинцева
Т.Н. Сравнительное исследование химического состава и противоопухолевой
активности водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides,
Costaria costata и Fucus evanescens // Биология моря.  2009  Т. 35.  С. 140146.
Ku M.J., Jung J.W., Lee M.S., Cho B.K., Lee S.R., Lee H.S., Vischuk O.S., Zvyagintseva T.N.,
Ermakova S.P. Effect of Fucus evanescens fucoidan on expression of matrix
metalloproteinase-1 promoter, mRNA, protein and signal pathway // Journal of Life Science. 
2010.  Vol. 20.  P. 16031610.
Федореев С.А., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Средство,
обладающее противоопухолевой активностью // Патент РФ на изобретение № 2414920.
 27.03.2011.
Дрозд Н.Н., Шевченко Н.М., Ермакова С.П., Лапикова Е.С., Макаров В.А., Звягинцева
Т.Н. Влияние структурных характеристик фукоиданов из бурых водорослей на
антикоагулянтную активность и подвижность комплексов с сульфатом протамина при
электрофорезе // Хим.-фарм. журнал.  2011.  Т. 45.  С. 4550.
Меньшова Р.В., Ермакова С.П., Rachidi S.M., Al-Hajje A.Y., Звягинцева Т.Н., Kanaan H.M.
Сезонные изменения состава, структурных характеристик и противоопухолевые
свойства полисахаридов бурой водоросли Padina pavonica (Ливан) в зависимости от
состава // Химия природ. соединений.  2011.  Т. 47.  С. 297301.
Соколова Р.В., Ермакова С.П., Awada S.M., Звягинцева Т.Н., Kanaan H.M. Состав,
структурные характеристики и противоопухолевые свойства полисахаридов бурых
водорослей Dictyopteris polypodioides и Sargassum sp. (Ливан) // Химия природ.
соединений.  2011.  Т. 47.  С. 297301.
Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н.
Сульфатированные полисахариды водорослей  модификаторы функций врожденного
47
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
иммунитета при бактериальных, вирусных и паразитарных инфекциях // Успехи соврем.
биологии.  2011. Т. 131  С. 503517.
Ermakova S., Sokolova R., Kim S. M., Um B. H., Isakov V., Zvyagintseva T. Fucoidans from
brown seaweeds Sargassum horneri, Eclonia cava, Costaria costata: structural characteristics
and anticancer activity // Appl. Biochem. Biotech.  2011.  Vol. 164.  P. 841850.
Vishchuk O.S., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. Sulfated polysaccharides from brown
seaweeds Saccharina japonica and Undaria pinnatifida: isolation, structural characteristics,
and antitumor activity // Carbohyd. Res.  2011.  Vol. 346.  P. 27692776.
Ермакова С.П., Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Михайлов В.В., Звягинцева Т.Н. Влияние
метаболитов бурых водорослей на синтез О-гликозилгидролаз бактериями,
деградирующими таллом Fucus evanescens // Микробиология.  2012  Т. 81.  С.
396402.
Макаренкова И.Д., Семанова И.Б., Ахматова Н.К., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н.,
Ермакова С.П. Влияние сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей на
пролиферативную и цитотоксическую активность спленоцитов мышей // Журн.
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.  2012.  Т. 6.  С. 6875.
Меньшова Р.В., Лепёшкин Ф.Д., Ермакова С.П., Покровский О.И., Звягинцева Т. Н.
Влияние условий предварительной обработки бурых водорослей сверхкритическими
флюидами на выход и структурные характеристики фукоиданов // Химия природ.
соединений.  2012.  Т. 48.  С. 823826.
Макаренкова И.Д., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И., Семенова И.Б., Звягинцева Т.Н.,
Горбач В.И., Ермакова С.П., Беседнова Н.Н. Сульфатированные полисахариды бурых
водорослей – лиганды толл-подобных рецепторов // Биохимия. Серия В:
Биомедицинская химия.  2012.  Т. 58.  № 3.  С. 318325.
Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Ermakova S.P., Vishchuk O.S., Nazarenko E.L., Dmitrenok
P.S., Zvyagintseva T.N. Anticancer activity in vitro of a fucoidan from the brown alga Fucus
evanescens and its low-molecular fragments, structurally characterized by tandem massspectrometry // Carbohyd. Polymer.  2012.  Vol. 87.  P. 186194.
Vishchuk O.S., Tarbeeva D.V., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. The structural
characteristics and biological activity of fucoidans from the brown algae Alaria sp. and
Saccharina japonica of different reproductive status // Chem. Biodivers.  2012.  Vol. 9.  P.
817828.
Ermakova S., Men'shova S., Vishchuk O., Kim C., Um B., Isakov V., Zvyagintseva, T. Watersoluble polysaccharides from the brown alga Eisenia bicyclis: Structural characteristics and
antitumor activity // Algal Res.  2013.  Vol. 2.  P. 5158.
Vishchuk O.S., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. The effect of sulfated 1,3-alpha-L-fucan
from the brown alga Saccharina cichorioides Miyabe on resveratrol-induced apoptosis in colon
carcinoma cells // Mar. Drugs.  2013.  Vol. 11.  P. 194212.
Меньшова Р.В., Ермакова С.П., Ум Б.Х., Звягинцева Т.Н. Состав и структурные
характеристики полисахаридов бурой водоросли Eisenia bicyclis // Биология моря. 
2013.  Т. 39.  № 3.  С. 213218.
Pham D.T., Menshova R.V., Ermakova S.P., Anastyuk S.D., Bui M.L., Zvyagintseva T.N.
Structural characteristics and anticancer activity of fucoidan from the brown alga Sargassum
mcclurei // Mar. Drugs.  2013.  Vol. 11.  P. 14561476.
48