Изучение генов биосинтеза флавоноидов пшеницы и ее

Экспрессия генов защитной реакции
у гибридных форм пшеницы
Хлёсткина Е.К., Терещенко О.Ю., Салина Е.А.
Институт цитологии и генетики СО РАН
Новосибирск
устойчивость растений к стрессовому воздействию
специфическая
гены специфической
устойчивости (R-genes,
R=resistance)
неспецифическая
гены защитной реакции
организма (DR-genes,
DR=defense response)
защитная роль флавоноидов для растений
В условиях абиотического стресса:
защита клеток от избыточного белого света и УФ,
взаимодействие с высокоактивными свободными
радикалами,
образование устойчивых комплексов с ионами
тяжёлых металлов.
В условиях биотического стресса:
антибактериальная и фунгицидная активность,
образование физического барьера против инфекций.
гены биосинтеза флавоноидов
структурные
кодируют ферменты,
непосредственно
участвующие в синтезе
флавоноидов
регуляторные
контролируют
транскрипцию
структурных генов
биосинтеза
схема биосинтеза флавоноидов
пигментация различных органов у пшеницы
Основной структурный
элемент
флавоноидных
соединений
основные этапы работы
определение геномной локализации регуляторных и
структурных генов биосинтеза флавоноидов пшеницы и
ее сородичей
клонирование
структурных
генов
биосинтеза
флавоноидов и разработка ДНК-маркеров для анализа
экспрессии данных генов
изучение экспрессии структурных генов на различном
генетическом фоне; отбор генетических моделей и ДНКмаркеров и подбор условий для дальнейшего анализа
экспрессии структурных генов биосинтеза флавоноидов
в стрессовых условиях
сравнительное картирование генов окраски колоса
1A
1A
Xgwm1223
0.0
0.0
4.7
Rg-A1b
Hg
Xgwm0136
1B
Xgwm1223
0.0
0.0
1.5
4.3
5.8
15.5
3.7
4.6
Rg-A1c
Hg
Xgwm0136
Xgwm0033
Xgwm1104
2.0
4.1
2.3
1D
Xgwm1130
Xgwm1078
Rg-B1b
4.6
1.5 1.5
1.5 1.5
Xtaglgap
Xgwm0550
Xgwm0033
Xgwm0911
1D
Xbarc149
Xgdm0033
Xgwm1223
Rg-D1c
2A
Xgwm1223
3.9
Rg-D1b
5.7
32.3
Xgwm0275
Xgwm0328
22.6
13.1
c
9.9
6.0
10.7
Xgwm0691
Xgwm0752
Xgwm0691
6.7
15.3
4.8
1.7
0.0
6.4
0.0
4.9
Xgwm0164
Xgwm0791
Xgwm0357
Xgwm0778
Xgwm0135
1.1
1.7
Xgwm0164
Xgwm0791
2.5
0.0
19.1
Xbarc152
Xgwm0018
Xgwm0413
Xgwm0264
Xgwm1050
Xgwm0762
Xgwm0498
Xgwm0106
7.2
2.7
0.0
0.7
Xgwm0337
Xgwm0789
Xgwm1291
Xgwm0848
12.6
12.5
Xgwm0337
Xgwm1291
Pg
6.5
4.1
Xgwm0817
Xgwm0445
6.0
Xgwm0458
Xgwm0642
15.7
Xgwm0642
Xgwm0778
Xgwm0135
Жница х TRI 542 i:S29BgHg x TRI 546 Federation x TRI 546
re
14.9
Xgwm1100
Xgwm1028
me
4.8
ro
Xgwm1097
nt
14.3
ce
Xgwm1097
Голубка x Н 67
Synthetic x Ульяновка
красная (1А) черная (1А) красная (1В) серо-дымчатая (1D) красная (1D)
TRI 15744 x TRI 2719
пурпурная (2А)
картирование генов, контролирующих окраску
Ген (аллель)
Хромосома
Признак (или кодируемый фермент)
Растительный материал,
исп. для картирования
Rg-A1b
Rg-A1c
Rg-B1b
Rg-D1b
Rg-D1c
Pg*
Pp2
Rc-A1b
Pc-A1b*
Pls-A1b*
Plb-A1b*
Rc-B1b
Pc-B1b
Pls-B1b*
Plb-B1b*
Pp1
Pan-D1b
Rc-D1b
Pc-D1b
Pls-D1b*
Plb-D1*
Rc-R1
Rc-S1
Rc-Sl1
Rc-Ss1
1A
1A
1B
1D
1D
2A
2A
7A
7A
7A
7A
7B
7B
7B
7B
7B
7D
7D
7D
7D
7D
4R
7S
7Sl
7Ss
красная окраска чешуй колоса
черная окраска чешуй колоса
красная окраска чешуй колоса
красная окраска чешуй колоса
серо-дымчатая окраска чешуй колоса
антоциановая окраска чешуй колоса
антоциановая окраска перикарпа зерна
антоциановая окраска колеоптиле
антоциановая окраска стебля
антоциановая окраска листовой оболочки стебля
антоциановая окраска листовой пластины
антоциановая окраска колеоптиле
антоциановая окраска стебля
антоциановая окраска листовой оболочки стебля
антоциановая окраска листовой пластины
антоциановая окраска перикарпа зерна
антоциановая окраска пыльников
антоциановая окраска колеоптиле
антоциановая окраска стебля
антоциановая окраска листовой оболочки стебля
антоциановая окраска листовой пластины
антоциановая окраска колеоптиле
антоциановая окраска колеоптиле
антоциановая окраска колеоптиле
антоциановая окраска колеоптиле
F2
F2
F2
RILs, F2
F2
F2
F2
DH-lines
DH-lines
DH-lines
DH-lines
F2
F2
F2
F2
F2
F2
F2, интрогресс. линии
F2
F2
F2
дополненные линии
дополненные линии
дополненные линии
дополненные линии
схема биосинтеза флавоноидов
CHI
CHI
F3H
3RT
ANS
3RT
сходство последовательностей гена F3H разных видов растений
красным цветом обозначены копии F3H выделенные и охарактеризованные в настоящей работе
92
99
29
Triticum aestivum (F3H-A1)
Triticum timopheevii (F3H-A1)
Triticum urartu
Triticum aestivum (F3H-D1)
Aegilops tauschii
71
72
69
99
Triticum timopheevii (F3H-G1)
Triticum aestivum (F3H-B2)
99
Zea mays
Oryza sativa
O An
ry d
z e ro
a e po
go
ne
Hordeum vulgare
ae
Secale cereale
36
47
Aegilops speltoides
Triticeae
100
Poaceae
Triticum aestivum (F3H-B1)
51
Anthurium andraeanum
38
100
Brassica napus
Araceae
Arabidopsis thaliana
Brassicaceae
Malus domestica
73
49
Glycine max
Rosaceae
Vitis vinifera
Fabaceae
Vitaceae
0.15
0.10
0.05
0.00
выравнивание и локализация копий гена F3H
CCTACTTCTC
..........
..........
..........
GTACCCGGTG
..........
C.........
..........
AAGGCGAGGG
..A..AC...
.....AC...
......C...
ACTACGGGCG
..........
..........
........A.
GTGGCCGGAG
..........
T.........
..........
AAGCCGGCGG
..........
..........
..A.......
GGTGGCGCGC
..........
..........
..........
GGTGGTGGAG
T.........
...A......
C.........
F3H_2A
F3H_2B1
F3H_2B2
F3H_2D
CGATACAGCG
..........
..G.......
..........
AGCGACTCAT
..........
....G..G..
..........
GGGACTGTCG
...G......
..AG......
...G......
TGCAAGCTGC
..........
..........
..........
TGGGCGTGCT
..........
..........
..........
GTCGGAGGCG
...C......
C.........
..........
ATGGGCCTGG
C.........
..........
..........
AATCGGAGGC
.G........
.GA.....T.
.G........
F3H_2A
F3H_2B1
F3H_2B2
F3H_2D
GCTCGCCAAG
..........
C..G......
...G......
GCGTGCGTTG
........G.
........G.
........G.
ACATGGACCA
..........
..........
..........
GAAGGTGGTG
..........
..........
......T...
GTCAACTTCT
..........
..........
..........
ACCCGCGCTG
.......G..
.......G..
.......G..
CCCCCAGCCG
..........
T........C
...G......
GACCTCACCC
..........
..G.......
..........
F3H_2A
F3H_2B1
F3H_2B2
F3H_2D
TGGGCCTCAA
....T.....
.....G....
..........
GCGCCACACC
...T......
..........
..........
GACCCCGGCA
..........
..........
..........
CCATCACCCT
..........
..........
..........
CCTCCTGCAG
......C...
......C...
......C...
GACCTCGTCG
..........
.....A....
..........
GCGGCCTTCA
.......C..
.......G..
..........
GGCCACCCGC
..........
..........
..........
Разработка специфичных праймеров,
ПЦР на нуллитетрасомных линиях пшеницы и
пшенично-ржаных дополненных линиях
1A 1B 1D 2A 2B 2D 3A 3B 3D 4A 4B 4D 5A 5B 5D 6A 6B 6D 7A 7B 7D
T.
ur
A artu
e.s
A pelt
e.s oi
qu d e
ar s
ro
sa
F3H_2A
F3H_2B1
F3H_2B2
F3H_2D
F3H-A1
703 пн
F3H-B1
333 пн
F3H-B2
255 пн
F3H-D1
225 пн
клонированные последовательности структурных генов
биосинтеза флавоноидов
Ген
F3H-A1
F3H-B1
F3H-D1
F3H-B2
F3H-R1
F3H-A1
F3H-G1
F3H
F3H
F3H
CHI-B1
CHI-R1
3RT
3RT
ANS
Вид
T.aestivum
T.aestivum
T.aestivum
T.aestivum
S.cereale
T.timopheevii
T.timopheevii
T.urartu
Ae.speltoides
Ae.tauschii
T.aestivum
S.cereale
T.aestivum
S.cereale
S.cereale
Длина
отсеквенир.
участка (п.н.)
Хромосомная
локализация
1852
1626
1374
562
823
542
539
542
542
1326
325
218
844
848
542
2A
2B
2D
2B
2R
2A
2G
2A*
2S*
2D*
5B
5R
5 группа*
5R
6R
(*предположительно)
сравнительное картирование генов F3H пшеницы и ржи
2A
2B
Xgwm1052
2D
Xgwm1128
Xgwm0810
Xgwm1054
Xgwm0731
Xgwm1067
F3H-A1
2G
2R
Xgwm1128
Xgwm0988
Xgwm0429
Xgwm0972
Xgwm0501
Xgwm0429
Xgwm0148
Xpsr388
Xgwm0132
Xgwm0791
Xgwm0388
Xgwm0501
Xgwm0047
Xgwm0877
Xgwm1067
Xgwm1204
Xgwm0790
Xgwm0877
Xgwm1264
F3H-B1
F3H-D1
Xgwm0877
F3H-G1
Xgwm1070
Xgwm1070
F3H-R1
Xgwm0526
Xgwm1256
Xgwm0526
Xgwm0311
Xgwm0846
Xgwm1136
Xpsr900
Xgwm0301
Xgwm0320
Xgwm0311
Xgwm0526
Xgwm0619
Xgwm0382
Xgwm1027
F3H-B2
Xgwm1027
Xgwm0739
Xgwm0739
Генетические модели, используемые для анализа экспрессии
структурных генов биосинтеза флавоноидов
Структурный ген
Растительный материал
Регуляторный
ген
ОТ-ПЦР1 или
ОТ-ПЦР2 в
реальном
времени
F3H
CHI
CHI
F3H
ANS
3RT
F3H
изогенная линия i:S29BgHg (Arbuzova et al.
1998), интрогрессивная линия CS Ae.tauschii 1D-4 (Pestsova et al. 2006)
Rg-A1c, -D1b
Rg-A1c, -D1b
Rc-R1
Rc-R1
Rc-R1
Rc-R1
Rc-B1, -D1
1
1
1
1
1
1
1
Rc-A1, -B1, -D1
Rc-A1
Rc-D1
Rc-A1, -B1
Rc
Rc
Rc
Rc
Rc
1, 2
1, 2
1
1, 2
1, 2
1, 2
1, 2
1, 2
1, 2
F3H-A1, -B1, -D1, -B2
F3H-A1, -B1, -D1
СHI-B1
СHI-B1
F3H-A1, -B1, -R1
F3H
F3H
F3H
F3H
пшенично-ржаные
дополненные линии
Chinse spring / Imperial
(Driscoll and Sears 1971
Рекомбинантные линии СS(Hope7B)/2732
(Khlestkina et al. 2002), интрогр.линии CS Ae.tauschii 7D (Pestsova et al. 2006)
CS, СS(Hope7А), CS(Hope7B), Мироновск.808
СS(Hope7А), Саратовская 29
интрогр.линии CS -Ae.tauschii 7D (Pestsova
et al. 2006)
CS, СS(Hope7А), CS(Hope7B)
Пшенично-ржаная линия с замещением
хромосом 2R(2D) (Силкова с соавт. 2006)
пшенично-эгилопсные дополненные линии
CS / Ae.speltoides 7S, CS / Ae.longissima 7S,
CS / Ae.searsii 7S
Пшенично-ячменная линия с замещением
хромосом 7Hm(7D) (Першина Л.А.)
Rc – гены пшеницы Rc – гены ржи Rc – гены эгилопсов Rc – гены ячменя
пшеница
7A
7B
пшеница
7D
7A
7B
7D
Rc
Регуляция
экспрессии?
?
Rc
?
F3H
2A
2B
пшеница
2D
F3H
2R
рожь
CS-Ae.t. 1D-4
CS
i:S29BgHg
S29
CS-Ae.t. 1D-4
CS
i:S29BgHg
S29
экспрессия структурных генов биосинтеза флавоноидов
в окрашенных (Rg) и неокрашенных чешуях колоса
F3H
CHI
Xgwm1223
i:S29BgHg
Chinese Spring
Xgdm0033
Rg-A1c
Rg-D1b
Hg
Xgwm0136
Xgwm0033
Xgwm1104
Xgwm0106
Xgwm1097
Xgwm0337
Xgwm0691
Xgwm1291
Xgwm0752
Xgwm0164
Xgwm0791
Xgwm0458
Xgwm0357
Xgwm0135
Саратовская 29
1A
1D
CS-Ae.t. 1D-4
ветвь биосинтеза флавоноидов, приводящая к образованию
пигмента в чешуях колоса (Rg)
ветвь биосинтеза флавоноидов, приводящая к образованию
пигмента в колеоптиле (Rс)
CHI
F3H
ANS
3RT
экспрессия F3H, CHI, ANS и 3RT в колеоптиле
пшенично-ржаных дополненных линий
Imp
CS
1R
2R
3R
4R
5R
6R
7R
CHI
F3H
ANS
3RT
CHI, ANS и 3RT экспрессируются и в окрашенных, и в неокрашенных
колеоптиле, тогда как для активации транскрипции F3H требуется наличие
доминантного аллеля в локусе Rc
экспрессия CHI в колеоптиле пшеницы
CS интрогрессивные линии
данные ОТ-ПЦР
в реальном времени
CHI
CS CS(Hope 7A) CS(Hope 7B)
F3H
2.5
Xgwm1187
2
Xgdm0130
1.5
1
Xgwm1672
0.5
Xgwm1002
Xgwm0044
Rc-D1
Xgwm0111
0
day 2
day 3
day 4
day 5
day 6
Xgwm0437
Xgwm1242
Xgdm0046
Xgwm1168
Xgdm0067
Xgwm1335
Xgwm0428
Под действием Rc
происходят количественные
изменения уровня
экспрессии CHI
изучение экспрессии гомеологичных генов F3H в
генотипах пшеницы, несущих различные аллели Rc
0.3
данные ОТ-ПЦР
в реальном времени
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
день по
сл 0 2
3 4 5 6
прораст е
2 3 4
ания
5 62
3 4 5 6
2 3 4
5 6
rc
Rc-A1
Rc-B1
Rc-D1
F3H-D1
F3H-B1
F3H-A1
F3H-B2
изучение экспрессии генов F3H в генотипах пшеницы,
несущих различные аллели Rc-A1 (7AS)
F3H-A1
день после
прорастания
3
4
5
F3H-B1
6
3
4
5
F3H-D1
6
3
4
5
6
CS (Hope 7A)
Rc-A1
Саратовская 29
1
0.9
1.2
1.2
1
1
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.8
0.7
данные ОТ-ПЦР
в реальном времени
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0
d3
d4
d5
d6
d3
d4
d5
d6
d3
d4
d5
d6
Пиротрикс 28 7Hm(7D))
Пиротрикс 28
CS / Ae.searsii 7S
CS / Ae.searsii 6S
CS / Ae.longissima 7S
CS / Ae.longissima 4S
CS / Ae.speltoides 7S
CS / Ae.speltoides 1S
изучение экспрессии гена F3H в гибридах пшеницы
F3H
пшеницы
Rc эгилопсов и ячменя активируют экспрессию генов F3H пшеницы
Экспрессия флавонон-3-гидроксилазы является
критической стадией биосинтеза флавоноидов при
формировании такого признака, как антоциановая окраска
колеоптиле у пшеницы (Rc).
Наблюдается разнообразие среди генов Rc в отношении
их влияния на динамику экспрессии F3H в колеоптиле:
различия выявлены среди Rc, принадлежащих разным
видам злаков, между гомеологичными копиями Rc
пшеницы, а также между морфологически схожими
аллелями одного и того же локуса в разных сортах
пшеницы.
Не выявлено геном-специфичного взаимодействия между
регуляторными (Rc) и структурными генами (F3H), а также
супрессии отдельных гомеологов структурных генов.
В ходе образования отдаленных гибридов на основе
пшеницы наблюдается успешная интеграция систем
биосинтеза флавоноидов пшеницы и ее сородичей.
перспектива использования полученных моделей
пониженная t
Rc
rc
ионы тяжелых
металлов
засоление
анализ
экспрессии
F3H, CHI
с помощью
ОТ-ПЦР
в реальном
времени
нормальные
условия
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
d3
d4
d5
d6
исследование влияния различных экологических факторов
на изменение экспрессии структурных генов биосинтеза
флавоноидов, и взаимосвязи уровня экспрессии последних
с устойчивостью растений
к факторам абиотического стресса
F3H, CHI и др. – маркеры для оценки степени стрессового воздействия и реакции на него?
Спасибо за внимание!
“100bp”
5BS-6
5BS-8
5BS-2
5BS-9
5BS-3
5BL-6
5BL-11
5BL-9
5BL-13
СHI
‘CS’ ‘N5A5B’ ‘N5B5A’ ‘N5D5B’