изучение генетического разнообразия генотипов нута

УДК 635.657:575.113
С. Г. Гасанова,
А. Ч. Мамедов,
Д. Оджаги,
Л.А.Амиров
Институт Генетических Ресурсов НАН Азербайджана
Институт Ботаники НАН Азербайджана
seide.hesenova@yahoo.com
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ
ГЕНОТИПОВ НУТА (CICER ARIETINUM L.) С
ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ RAPD МАРКЕРОВ
С использованием
полиморфизм
RAPD маркеров был изучен генетический
62-х генотипов нута (Cicer arietinum L.)
разного
происхождения. В исследовании использовались 30 RAPD праймеров, из них
11 праймеров выявили высокий уровень полиморфизма. В результате ПЦР
реакции,
проведенной с помощью случайных RAPD праймеров, было
синтезировано 77 ампликонов, среди которых 76 фрагментов
оказались
полиморфными. Определяемый уровень полиморфизма изменялся между 80100%. На основе кластерного анализа для выявления генетического
разнообразия генотипы нута были сгруппированы в 12-ти разных кластерах.
It is studied genetic multiformity of 62 peacock genotypes (Cicer Arietinum
L.) of different origin with the use of Rapd markers. In the researches these are
used 30 rapd primers, 11 primers of them reveal a high level of multiformity. In the
result of the reaction made with accidental rapd primers, these are synthesized 77
amplicons, among which 76 fragments are multiformal. The determined level of
multiformity changes between 80-100%. On the basis of claster analysis to reveal
genetic variety all peacock genotypes are grouped into 12 different clasters.
Ключевые слова: Cicer arietinum L., нут, RAPD маркеры, генетическое
разнообразие, кластерный анализ.
Keywords: Cicer Arietium L., peacock, rapd markers, genetic variety,
claster analysis.
Введение.
Нут имеет большое значение как продукт питания и
занимает третье место среди наиболее выращиваемых бобовых культур в
мире. Нут относится к роду Cicer, полусемейству Papilionaceae у семейства
бобовых (Lequminoceae). Диплоидный набор хромосом нута составляет 2n =
16
и размер генома равен 931Mbp [9]. Для определения различных
родительских комбинаций и анализа генетической вариабельности между
генотипами нута
важно точное измерение генетического разнообразия.
Выяснение генетических отношений в определенной степени может быть
полезным при планировании гибридизации, ускорении процесса селекции за
счет отбора ненужных комбинации и надежной классификации генотипов. В
селекционных программах растений, генетическая информация о сходстве
родителей предотвращает использование одинаковых или очень схожих
форм в гибридизации [7]. Целью данной работы является оценка
генетического разнообразия с помощью RAPD маркеров между генотипами
растений нута. Известно, что RAPD маркеры сконструировались на
основании случайно повторяющихся последовательностей генома растений и
состоят из 10 нуклеотидов.
С помощью этих RAPD-праймеров и ПЦР-
реакции амплифицируются случайно повторяющиеся последовательности на
геномной ДНК растений [3]. RAPD- маркеры используются в различных
исследованиях
таких,
как
определение
и
картирование
геномов,
идентификация видов, популяционных различии, в таксономических и
филогенетических
определение
исследованиях,
степени
сродства,
в
анализ
анализе
пробов
родительских
форм,
смешанных геномов,
определении уровня дикого опыления и QTL (локусы количественных
признаков) анализов
[1]. Генетическое разнообразие нута было оценено
между 9 культурными и 8 дикими генотипами нута с применением RAPD
маркеров. С помощью отобранных 8 RAPD- праймеров было синтезировано
115 ампликонов и эти генотипы в дендрограмме сгруппировались в 4 разных
группах. В первой группе – C.retikulatum, C.echinospermum и C.arietinum, во
второй группе – C. chorassanicum и C. yamashitae, в третьей группе-
C.judaicum, C. bijugum и C. pinnatifidum
и в четвертой группе только
C.cuneatum. [5]. Для изучения генетического родства между 19 генотипами
C.arietinum и 5 генотипами их дикого отца C.reticulatum L. был использован
29 RAPD и
праймера
6 ISSR маркеров. В результате с помощью каждого RAPD
синтезировано 6 и
ISSR праймером 11 ампликонов. При
построении дендрограммы дикие и культурные виды собраны в отдельных
группах. Таким образом, с помощью
определена узкая
генетическая
проведенных исследований
была
вариация среди генотипов C.arietinum и
широкая генетическая вариация среди генотипов C.reticulatum [10].
Материалы и методы. В качестве объекта исследования были
использованы 62 генотипа нута различного происхождения (табл. 1).
1.Название и номер по каталогу генотипов нута, используемые в
исследовании
№
Название
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Номер по
каталогу
1
2
03-48
50
04-4
57
42
35
48
Ленкорань 1
Ленкорань 2
Филипп 03-48
Джалилабад 50
Филипп 04-4
Нармин 57
Агстафа 42
Агстафа 35
Филипп 48
№ Номер по
каталогу
32 27
33 30
34 51
35 58
36 33
37 36
38 35
39 22-04
40 23-04
Ярдымлы 27
Масаллы30
Масаллы51
Биласувар 58
Лерик33
Агстафа 36
Апшерон35
Филипп 22-04
Филипп 23-04
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
55
59
47
28
06-8c
06-133c
06-61c
34
06-33c
06-161c
05-169c
39
41
Джалилабад 55
Сабирабад 59
Ордубад 47
Ярдымлы 28
Филипп 06-8c
Филипп 06-133c
Филипп 06-61c
Апшерон 34
Филипп 06-33c
Филипп 06-161c
Филипп 05-169c
Ордубад 39
Ордубад 41
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
Филипп02-88
Филипп 03-93
Филипп 00-19
Филипп 97-32
Султан 98-178
TH 1- 04
Филипп 03-34
Филипп 03-17
Филипп 04-38
Филипп 03-36
Филипп 03-71
Филипп 04-35
Филипп 03-22
23
43
Гусар43
54 06-28c
Филипп 06-28c
24
25
44
97-24
Гусар 44
Филипп97-24
55 03-77
56 03-27
Филипп 03-77
Филипп03-27
02-88
03-93
00-19
97-32
98-178
1-04
03-34
03-017
04-38
03-36
03-71
04-35
03-22
Название
26
27
28
29
30
31
03-22
30
11
18
25
06-18c
Филипп 03-22
Баку30
Джалилабад 11
Агдаш18
Шамахы 25
Филипп 06-18c
57
58
59
60
61
62
04-16
06-7c
06-89c
32-79
05-19c
06-144c
Филипп 04-16
Филипп 06-7c
Филипп 06-89c
Филипп 32-79
Филипп 05-19c
Филипп 06-144c
Геномную ДНК выделяли из свежих листьев согласно общепринятой
методике [2]. После определения количества ДНК каждый полученный
образец ДНК разбавляли до концентрации
20 nq/μl, и таким образом был
приготовлен рабочий раствор ДНК для проведения ПЦР -реакции в обьеме
25 µl (состав ПЦР -реакции состоит из следующих: 1x ПЦР буфер (20 mM
Трис-HCl, 50 mM KCl), 200µm dNTPs, 2mM MgCl2, 0.4 µM праймер, 1.0
единицы Tag-полимераза
факторами,
и 30 nq геномной ДНК). Наиболее важными
определяющими
концентрация Mg2
+
эффективность
ПЦР-реакции
является
и температура отжига праймеров, т.е. температура
связывания праймеров
к комплементарным участкам или сайтам на
геномной ДНК. Эти факторы определяли с помощью градиентной ПЦР [11].
Полимеразная цепная реакция ПЦР была выполнена
в
амплификаторе
Thermocycler 2700 (Applied Biosystems, USA) в следующих условиях:
температура 94°C, 3 минуты, 1 цикл; 94°С 1 мин, 37°С 1 мин, 72°C 1 минуту,
35 цикла; при температуре 72 ° C в течение 10 минут, а затем хранить в 4°C.
Анализ размеров продуктов ПЦР реакции
или
размеров ампликонов,
выполняли с помощью электрофореза, проведенного на 1,8% агарозном геле.
Коэффициент генетического разнообразия (ГР) рассчитывали по следующей
формуле Вейра:
2
ГР = 1 - åi p i
n
Здесь pi, показывает
частоту
встречаемости
аллеля i. После
определения длины фрагментов, синтезированных методом ПЦР и после
определения числа аллелей по каждому локусу была использована бинарная
нумерация аллелей, если какой-нибудь аллель имеется в пробе, это
отмечается как «1», если отсутствует, тогда отмечается
как «0» . С
использованием кластерного анализа генотипы были сгруппированы на
основе
генетического сходства. Результаты кластерного анализа были
отражены в дендрограмме, представленной на рисунке 1.
Результаты. С целью изучения генетического разнообразия генотипов
нута на молекулярном уровне были использованы различные RAPDпраймеры,
которые
повторяющимся
сконструированы
последовательностям
в
соответствии
генома.
с
случайно
Первоначально
была
проверена пригодность ядерной ДНК, выделенной из 62 генотипов нута для
ПЦР.
Эффективность
RAPD
и
других
праймеров
при
выявлении
генетического биоразнообразия уже подтверждена [3, 7, 8, 9, 10]. Высокий
полиморфизм на уровне генома и ясность изображения синтезированных
ампликонов в электрофорезе наблюдались при 2,0 mM концентрации MgCl2
и при температуре отжига 37°С. При анализе генетического разнообразия
нута были отобраны 30 случайных RAPD праймеров. Со многими
используемыми праймерами не был обнаружен полиморфизм или выявлены
нечеткие спектры между генотипами. Из 30 RAPD- праймеров 11, которые
указаны в таблице 2,
показали высокий полиморфизм и считаются
пригодными при изучении генетического разнообразия. Таким образом, с
помощью этих 11 праймеров были синтезированы 77 ампликонов и из них 76
ампликонов оказались полиморфными. Уровень выявленного полиморфизма
варьировал в пределах 80-100%.
2. RAPD-праймеры, число синтезируемых ампликонов и полиморфных
фрагментов
N
Прайме
р
Последовательность
(5’ - 3’)
Число
Число
полиморфн
ампликоых
нов
ампликонов
1
2
3
4
5
OPA19
OPD02
OPD11
OPS09
OPD4
CAA ACG TCG G
GGA CCC AAC C
AGC GCC ATT G
TCCTGGTCCC
TCT GGT GAG G
12
8
8
4
5
12
8
8
4
4
Полиморфизм (%)
100
100
100
100
80.0
Индекс
генетического
разнообразия
0,76
0,905
0,927
0,972
0,94
6
7
8
9
10
11
OPG12
OPG14
OPD10
OPF03
OPC16
OPG4
12
Сумма
CAG CTC ACG A
GGA TGA GAC C
GGT CTA CAC C
CCT GAT CAC C
CACACTCCAG
AGC GTG TCT G
10
3
5
10
8
4
10
3
5
10
8
4
77
76
100
100
100
100
100
100
0,75
0,63
0,72
0,966
0,85
0,90
0,85
13
Тотальная средняя оценка
7,0
6,91
98,7
Судупак и коллеги при исследовании филогенетической взаимосвязи
между видами рода Cicer [7] обнаружили сходный степень полиморфизма,
из 50 RAPD праймеров, только с помощью 7 RAPD праймеров
синтезировалось 95 ампликонов и из них 92 ампликона была полиморфными.
В результате наших исследований было установлено, что праймер OPA 19
на матрице геномной ДНК амплифицируется более интенсивно, а праймер
OPD 4 амплифицируется более слабо. Большое количество полиморфных
ампликонов синтезировались с праймерами OPA 19, OPG 12 и OPF 03,
небольшое
количество выявлялось праймером OPD 4. Среднее число
ампликонов для каждого праймера составляло 7. Это еще раз доказывает
эффективность выбранных праймеров при определении полиморфизма на
уровне ДНК. Богатое генетическое разнообразие среди всех праймеров
обнаружено праймером OPS 09, а низкое было получено с праймером OPG
14. Основываясь на полученные результаты, средняя оценка генетического
разнообразия составляла 0.85.
Высокая оценка среднего генетического
полиморфизма указывает, что выбранные генотипы нута имеют высокое
разнообразие на уровне генома. На основе синтезированных ампликонов на
геномной ДНК генотипов нута
с помощью UPGMA метода определен
индекс генетического сходства Nei и Li [13], проведен кластерный анализ и
построена дендрограмма (см. рисунок). Как уже отмечалось, образцы
сгруппировались в рамках 12-ти
различных кластеров, в пределах 0-1
генетических расстояний. Большинство образцов, входящих в первый
кластер, имеют американское происхождение, а 18 образцов произошли из
Азербайджана.
Минимальное
и
максимальное
значение
индекса
генетического сходства между изученными образцами соответственно
составляло 0,13 и 1. Во втором кластере сгруппированы 6 образцов (57, 58,
59, 60, 61, 62), также происходившие из Америки. Третий
кластер
представлен генотипом Масаллы 51 с номером 34. Минимальное и
максимальное значение индекса сходства этих образцов составляло 0,090,64. В четвертый кластер включены два генотипа (13 и 15). Один из этих
образцов Филипп 06-133 американского происхождения, а другой собран из
Ярдымлинского района с названием Ярдымли 28. Индекс генетического
сходства между этими генотипами равен единице. Остальные кластеры
представлены лишь одним генотипом: пятый кластер Ордубад 47, шестой
кластер Агстафа 35, седьмой кластер Джалилабад 50,
восьмой кластер
Нермин 57, девятый кластер Джалилабад 55, десятый кластер
Сабирабад
59, одиннадцатый кластер Ленкорань 1 и двенадцатый кластер Филипп 48–
генотип нута с американским происхождением. В наших исследованиях мы
наблюдали высокий полиморфизм среди генотипов нута.
С учетом
эффективности RAPD- праймеров при наиболее детальном изучении
генетического разнообразия растений нута, целесообразно использование
этих отборных праймеров при составлении генетических карт
идентификации генотипов C. аrietinum.
и
1. Дендрограмма 62-х генотипов нута на основе RAPD анализа
Выводы
1.
В результате использования 11 RAPD -праймеров было выявлено
77 ДНК – фрагментов. Каждый из праймеров в среднем инициировал синтез
7 ампликонов.
2.
Средний уровень полиморфизма с апробированными праймерами
составил 98.6%. Праймеры OPD 02, OPD 11, OPS 09, OPD 4, OPF 03 и OPG 4
могут быть рекомендованы, как наиболее эффективные, для оценки
генетического разнообразия генотипов нута.
3.
Средняя оценка индекса генетического разнообразия для всех
праймеров составила 0,85%, что подтверждает высокое генетическое
разнообразие среди изученных генотипов нута на геномном уровне.
Литература
1.Lodhi M.A., (1994). Genetic mapping and genome analysis of grape (Vitis sp.).
Ph.D. Thesis, Cornell University, 233 p., New York.
2. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of
fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant. Mol. Biol., 1985, V. 5, p.
69-76
3. Rao L. S. Rani P.U. Deshmukh P.S., Kuma P.A., and Panguluri S.K., 2007
RAPS and İSSR fingerprinting in cultivated chickpea (Cicer arietinum L.) and its
vild progenitor Cicer retikulatum Ladizinsky. Genetik resource and Crop Evolution
54 (6): 1235-1244.
4. Ratnaparkhe M. B., Santra D.K., Tullu A. And Muehlbauer F.J., (1998).
Inheritance of Inter-Simple Sequence Repeat Polymorphism and Linkage with a
Fusarium Wilt Resistance Gene in Chickpea. Theor Appl Genet 96: 348 - 353.
5. Ahmad F., (1999). Random amplified polymorphic DNAanalysis reveals genetic
relationships among the annual Cicer species. Theor Appl Genet 98: 657–663
6. Banerjee H., Pal R. A. and Sharma R. P., (1999). Restriction fragment length
polymorphism and random amplified polymorphic DNA analysis of chickpea
accessions. Biologia Plantarum 42(2): 197–208.
7. Sudupak M. A., Akkaya M. S. and Kence A., (2002). Analysis of genetic
relationships among perennial and annual Cicer species growing in Turkey using
RAPD markers. Theor Appl Genet 105: 1220–1228.
8. Rao L. S. Rani P.U. Deshmukh P.S., Kuma P.A., and Panguluri S.K., (2007).
RAPS and İSSR fingerprinting in cultivated chickpea (Cicer arietinum L.) and its
vild progenitor Cicer retikulatum Ladizinsky. Genetik resource and Crop Evolution
54 (6): 1235-1244.
9.Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J. et al. DNA polymorphisms amplified
by arbitary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acid Res., 1990, V. 18,
p. 6531-6535
10. Moeller DA and Schaal BA (1999) Genetics relationships among native
American maize accessions of the Great Plains assessed by RAPDs. Theoretical
and Applied Genetic 99:1061-1067
11 Nei M., Li W. Mathematical model for studying genetic variation in terms of
restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. USA, 1979, V. 76, p. 5269-5273
12 Hanotte O., Jianlin, H. Genetic characterisation of livestock populations and its
use in conservation decision-making / Proceedings of the International Workshop
on the Role of Biotechnology for the Characterisation and Conservation of Crop,
Forestry, Animal and Fishery Genetic Resources, 2005
13 Barrett B.A., Kidwell K.K. AFLP-based genetic diversity assessment among
wheat cultivars from the Pacific Northwest // Crop Sci., 1998, V.38, p. 1261–1271
14 Weir BS. Genetic-data analysis methods for discrete genetic data. In: Sinauer
Assoc Inc, Sunderland, Massachusetts, USA, 1990, 240 p.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда
Развития Науки при Президенте Азербайджанской Республики - Грант
№ EİF-2011-1(3)-82/51/3