Современные технологии работы с РНК
advertisement
Современные технологии работы с РНК Высококачественная РНК для анализа экспрессии генов Технологии пробоподготовки и анализа Содержание 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Введение........................................................................................................................................3 Сбор образцов и их стабилизация...........................................................................................4 Разрушение образцов и гомогенизация..................................................................................7 Очистка тотальной РНК..............................................................................................................9 Удаление примесей геномной ДНК....................................................................................... 14 Очистка микроРНК................................................................................................................... 16 ДНК, РНК и белок из одного образца.................................................................................. 18 Автоматическая очистка РНК.................................................................................................. 20 Очистка вирусных нуклеиновых кислот................................................................................ 23 Контроль качества РНК............................................................................................................ 24 Информация для заказа.......................................................................................................... 26 Найдите необходимые продукты QIAGEN для Вашего типа образца 2 Тип образца Страница Бактерии 4-6 Кровь 4-6, 13, 17 Костный мозг 4-6 Клетки 4-6, 11,15, 17, 19 Тонкоигольные пунктаты 15, 19 Грибы 13 Зафиксированные в формалине и залитые парафином срезы тканей (FFPE) 12, 17 Срезы замороженных тканей, полученные методом лазерной микродиссекции 15, 19 Плазма 13, 17, 23 Растения 13 Дополнительная очистка РНК 13 Слюна 4-6 Сыворотка 13, 17, 23 Ткани 4 – 6, 11, 12, 15, 17, 19 Дрожжи 11 www.interlabservice.ru 1. Введение Введение Получение достоверных результатов при исследованиях экспрессии генов (таких как ОТ-ПЦР в реальном времени или анализ микрочипов) полностью зависит от качества используемого образца РНК. Для успешного проведения экспериментов QIAGEN предлагает широкий ряд технологических решений для получения высококачественной РНК из биологических образцов. Каждый шаг процесса выделения РНК рационализирован и стандартизован (Рисунок 1). Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка тотальной РНК Анализ экспрессии генов Рисунок 1. Схема процесса подготовки РНК для анализа экспрессии генов. Сбор и стабилизация образцов: соответствующие реагенты стабилизируют РНК сразу же после сбора образцов, предотвращая деградацию РНК. Разрушения и гомогенизация образцов: для высвобождения РНК и снижения вязкости биологические образцы разрушают и гомогенизируют. Очистка РНК: широкая линейка наборов обеспечивает как ручную, так и автоматизированную высококачественную очистку РНК из различных объемов и типов образцов с разной производительностью. QIAGEN предлагает также широкий спектр технологий для анализа экспрессии генов с использованием ПЦР с обратной транскрипцией по конечной точке или в режиме реального времени. Благодаря использованию оптимизированных реакционных смесей и исследований, специфичных для определенных генов и метаболических путей, успешные результаты достигаются с первой попытки. Компания QIAGEN также предлагает специализированный прибор для постановки реакции и детекции ПЦР-продуктов в конечной точке или при проведении ПЦР в реальном времени — Rotor-Gene Q. Дополнительную информацию о технологиях QIAGEN для анализа экспрессии генов можно найти на сайте www.qiagen.com Технологии обработки образцов и проведения исследований 3 2. Сбор и стабилизация образцов Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка тотальной РНК Анализ экспрессии генов Уровень мРНК Сбор и стабилизация образцов Как только биологический образец собран, РНК в нем становится крайне нестабильной. РНК деградируется вследствие действия РНКаз; при этом манипуляции с образцом также способствуют индукции либо отрицательной регуляции экспрессии генов (Рисунок 2). Поэтому быстрая стабилизация клеточной РНК для предотвращения изменения уровня мРНК является критичным моментом для достоверного анализа экспрессии генов. Индукция Энзиматическая деградация и/или отрицательная регуляция Сбор и обработка образца Рисунок 2. Изменения в уровне мРНК, сопровождающие сбор образца. Как только биологический образец собран, РНК в нем становится крайне нестабильной. Манипуляции с образцом могут вызвать индукцию либо снижение экспрессии генов, что приведет к увеличению либо уменьшению уровня мРНК. Уровень мРНК также может снижаться вследствие деградации, в результате действия РНКаз. QIAGEN предлагает широкий спектр соответствующих реагентов для стабилизации РНК в клетках, тканях, крови, костном мозге, бактериях, слюне при комнатной температуре (Таблица 1). Для стабилизации образцов не рекомендуется заморозка в жидком азоте или сухом льду. Образцы просто помещают в реагенты для моментального фиксирования профиля экспрессии генов, и затем их можно использовать в работе и транспортировать. С целью обеспечения еще большего удобства QIAGEN может поставлять реагенты для стабилизации как часть наборов для очистки РНК. Дополнительную информацию о технологиях стабилизации можно найти на сайте www.qiagen.com 4 www.interlabservice.ru 2. Сбор и стабилизация образцов Таблица 1. Предложения для сбора и стабилизации образцов Тип образца Продукты для сбора и стабилизации образцов Ткани* Реагент для тканей Allprotect (для стабилизации ДНК/РНК/белков) Реагент для стабилизации РНК RNAlater® (для стабилизации РНК) Пробирки RNAlater TissueProtect (для сбора тканей и стабилизации РНК) Наборы RNeasy® Protect Mini и Midi (для стабилизации и очистки РНК) Клетки Стабильность образца, подвергнутого стабилизации Образцы, стабилизированные реагентом Allprotect: 7 дней при температуре 15-25°С 12 месяцев при температуре 2-8°С Более 12 месяцев при температуре -20°С либо -80°С Образцы, стабилизированные реагентом RNAlater: 7 дней при температуре 15-25°С 4 недели при температуре 2-8°С Более 4 недель при температуре -20°С либо -80°С Реагент для клеток RNAprotect® (для стабилизации РНК/ДНК) Набор RNeasy Protect Cell Mini (для стабилизации РНК/ДНК и очистки РНК) 7 дней при температуре 15-25°С 4 недели при температуре 2-8°С Более 4 недель при температуре -20°С либо -80°С Реагент для бактерий RNAprotect (для стабилизации РНК) Набор RNeasy Protect Bacteria Mini (для стабилизации и очистки РНК) 3 часа при температуре 15-25°С 2 недели при температуре -20°С 4 недели при температуре -70°С Набор RNeasy Protect Saliva Mini (для стабилизации РНК/ДНК и очистки РНК) 14 дней при температуре 15-25°С 4 недели при температуре 2-8°С Более 4 недель при температуре -20°С либо -80°С Система RNeasy Protect Animal Blood, включающая: Пробирки RNAprotect Animal Blood (для сбора крови и стабилизации РНК) Набор RNeasy Protect Animal Blood (для очистки РНК) Набор miRNeasy Protect Animal Blood (для очистки микроРНК)1,2 48 часов при температуре 15-25°С 2 недели при температуре 2-8°С Минимум 3 месяца при температуре -20°С либо -80°С Система PAXgene® Blood RNA, включающая: Пробирки PAXgene Blood RNA (для сбора крови и стабилизации РНК) Набор PAXgene Blood RNA (для очистки РНК) Система PAXgene Blood miRNA, включающая: Пробирки PAXgene Blood RNA (для сбора крови и стабилизации РНК) Набор PAXgene Blood miRNA (для очистки микроРНК)1 3 дня при температуре 18-25°С Минимум 50 месяцев при температуре -20°С либо -70°С Костный мозг человека Система PAXgene Bone Marrow RNA, включающая: Пробирки PAXgene Bone Marrow RNA (для сбора костного мозга и стабилизации РНК) Набор PAXgene Bone Marrow RNA (для очистки РНК) 3 дня при температуре 18-25°С 5 дней при температуре 2-8°С До 13 месяцев при температуре -20°С Фиксированные ткани PAXgene Tissue Система PAXgene Tissue, включающая: Контейнеры PAXgene Tissue (для сбора тканей и сохранения гистоморфологии и нуклеиновых кислот) Набор PAXgene Tissue RNA (для очистки РНК) Набор PAXgene Tissue miRNA (для очистки микроРНК)1 7 дней при температуре 15-25°С До 4 недель при температуре 2-8°С Бактерии Слюна Кровь животных Кровь человека *Для получения дополнительной информации по совместимости различных тканей со стабилизирующими реагентами QIAGEN посетите сайт в интернете www.qiagen.com. 1 Обеспечивает очистку тотальной РНК, включая микроРНК и другие малые РНК. 2 Для разделения двух фракций, содержащих отдельно малые РНК (включая микроРНК) и большие РНК необходимо использовать набор RNeasy MinElute Cleanup (стр. 13). Технологии обработки образцов и проведения исследований 5 2. Сбор и стабилизация образцов Транскрипт c-fos в легких A Стабилизация РНК, ДНК и белков Уровень мРНК 100 Реагент Allprotect Tissue обеспечивает немедленную стабилизацию РНК, ДНК и белков в свежесобранных тканях, способствуя получению надежных результатов в геномных, транскриптомных и протеомных экспериментах (Рисунок 3, а также рисунки 21-22 на стр. 19). После стабилизации ткани можно транспортировать при температуре 15-25°С в течение 7 дней, хранить при температуре 2-8°С до 12 месяцев, или длительно хранить при температуре от -20°С до -80°С для длительного хранения. Последующую очистку РНК/ДНК или РНК/ДНК/белки можно выполнять с помощью наборов AllPrep® (стр. 18). В ином случае, РНК, микроРНК, ДНК и белки можно выделять по отдельности с помощью наборов RNeasy (стр. 9), miRNeasy (стр. 16), DNeasy®/QIAamp® или Qproteome® соответственно. 80 60 40 20 0 2ч 4ч 24 ч 2ч Реагент Кратное изменение уровня транскрипта B 4ч 24 ч Буфер Транскрипт Madh-7 в кишечнике Стабилизация РНК 2ч Соответствующие реагенты QIAGEN для стабилизации РНК представлены для следующих источников: клетки, бактерии, слюна, а также реагент для стабилизации РНК RNAlater для свежесобранных тканей (Рисунок 23, стр. 20). Все реагенты позволяют немедленно стабилизировать РНК при комнатной температуре и обеспечивают последующее хранение и транспортировку образцов при комнатной температуре. Реагенты также доступны как составная часть наборов RNeasy Protect, обеспечивая универсальное решение для стабилизации РНК с последующей очисткой (Рисунок 4). 10 1 0.1 0.01 0.001 4ч Реагент 24 ч 2ч 4ч 24 ч Буфер Рисунок 3. Эффективная стабилизация РНК. Ткани крысы хранили при температуре 25°С в течение 2-24 часов в реагенте Allprotect или буфере PBS до проведения ОТ-ПЦР в реальном времени. Рассчитывали уровень транскрипта относительно уровня в тканях, стабилизированных в жидком азоте. Реагент Allprotect предотвращает изменение уровня транскрипта. Рисунок 4. Очистка РНК без деградации. Крысиные почки либо немедленно стабилизировали с помощью реагента RNAlater (Стабилизированный образец), либо не подвергали стабилизации (не стабилизированный образец). По прошествии 0-60 минут, проводили очистку РНК из стабилизированных образцов с помощью набора RNeasy Protect и из не стабилизированных образцов с помощью стандартного протокола. Очищенную РНК анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле, и экспрессию GAPDH оценивали с помощью нозерн-блоттинга. М: маркеры. 6 Комбинированный подход к сбору, стабилизации и очистке образцов обеспечивается системой QIAGEN RNeasy Protect Animal Blood (для крови животных); для сохранения гистоморфологии доступны системы PAXgene (для крови и костного мозга человека, зафиксированных тканей). Образцы собираются в пробирки или контейнеры, где профиль РНК немедленно фиксируется (Рисунки 13-14, стр. 13). Затем образцы можно удобно транспортировать или хранить до очистки РНК при комнатной температуре. Для получения более подробной информации о продуктах PAXgene посетите страницу в интернете www.PreAnalytiX.com. Не стабилизированный образец 0 5 10 15 30 60 www.interlabservice.ru Cтабилизированный образец RNAlater 0 5 10 15 30 60 минут ген GAPDH 3. Разрушение и гомогенизация образца Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка тотальной РНК Анализ экспрессии генов Разрушение и гомогенизация образца Эффективное разрушение и гомогенизация биологического образца является абсолютно необходимым условием для всех методик очистки РНК. В процессе разрушения высвобождается содержащаяся в образце РНК, кроме того гомогенизация снижает вязкость образца, улучшая последующую очистку РНК. QIAGEN предлагает спектр технологий для разрушения и гомогенизации, начиная от спин-колонок QIAshredder для быстрой и простой гомогенизации клеточных лизатов и заканчивая системами TissueRuptor® и TissueLyser для механического разрушения и гомогенизации более плотных образцов с разной производительностью (Рисунки 5-7 и рисунок 23, стр. 20). Системы TissueRuptor и TissueLyser обеспечивают быстрое и эффективное разрушение и замещают трудоемкие и длительные ручные методы разрушения, такие как использование ступки и пестика. TissueLyser LT TissueLyser II Выход РНК (нг/мкл) 400 Рисунок 5. Эффективное разрушение тканей. Различные ткани крысы разрушали с помощью систем TissueLyser LT и TissueLyser II. РНК очищали из 20 мг образца в системе QIAcube® с использованием набора для волокнистых соединительных тканей RNeasy Fibrous Tissue Mini (кожа, сердце и легкие), либо набора для жировой ткани RNeasy Lipid Tissue Mini (мозг). РНК элюировали в объеме 50 мкл; концентрацию определяли с помощью спектрофотометра. 300 200 100 0 Кожа Сердце Легкие Мозг Дополнительную информацию о технологиях разрушения образцов можно найти на сайте www.qiagen.com Технологии обработки образцов и проведения исследований 7 3. Разрушение и гомогенизация образца 1 образец за цикл До 12 образцов за цикл До 48 или 192 образцов за цикл TissueRuptor Ручной гомогенизатор с роторно-статорным механизмом для разрушения следующих тканей: • Ткани человека/животных • Растительные ткани TissueLyser LT* Компактная экономичная бисерная мельница для разрушения следующих тканей и клеток: • Ткани человека/животных • Растительные ткани • Бактерии • Дрожжи TissueLyser II Бисерная мельница с производительностью от средней до высокой для разрушения следующих тканей и клеток: • Ткани человека/животных • Растительные ткани • Бактерии • Дрожжи Дополнительные компоненты: • Адаптер TissueLyser LT на 12 пробирок • Одношариковые диспергаторы Tissue Lyser • Шарики из нержавеющей стали • Пробирки для образцов Дополнительные компоненты: • Комплект адаптеров TissueLyser 2 x 24 • Комплект адаптеров TissueLyser 2 x 96 • Одношариковые диспергаторы Tissue Lyser • Диспергаторы TissueLyser, 96-луночный формат • Шарики из нержавеющей стали и карбида вольфрама • Пробирки для образцов Дополнительные компоненты: • Одноразовые насадки TissueRuptor Рисунок 6. Приспособления для механического разрушения и гомогенизации. * Приспособления TissueLyser необходимо использовать совместно с рекомендуемым адаптером (приобретается отдельно). TissueLyser LT A Механическое разрушение единичных образцов Кукуруза Арабидоспис Табак TissueRuptor представляет из себя ручной инструмент, позволяющий проводить одновременное разрушение и гомогенизацию с использованием одноразовых насадок, которые содержат вращающееся с высокой скоростью лезвие. Поскольку насадки одноразовые и не скрыты в корпусе, риск перекрестного загрязнения минимизирован, и процесс разрушения образца можно визуально наблюдать. Использование одноразовых насадок экономит время, поскольку нет необходимости мыть насадку после каждого образца. Механическое разрушение множества образцов TissueLyser II B T A C M R Рисунок 7. Интактная РНК из растительных тканей. Различные растительные ткани разрушали с использованием A TissueLyser LT и B TissueLyser II. Затем РНК очищали с помощью набора RNeasy Plant Mini и анализировали при помощи электрофореза в агарозном геле. Четкие полосы свидетельствуют о наличии интактной РНК. Т – томат, А – арабидопсис, Х – хлопок, К – кукуруза, Р – рапс. 8 TissueLyser представляют собой шаровые мельницы, которые одновременно разрушают и гомогенизируют образец посредством высокоскоростного перемешивания в сочетании с растиранием шариками в пластиковых пробирках. Использование специального адаптера для установки нескольких пробирок дает возможность использовать инструмент для одновременного разрушения нескольких образцов. Вариант исполнения TissueLyser LT позволяет обрабатывать за цикл до 12 образцов. Удобны в использовании и экономят время, в отличие от трудоемких методов ручного разрушения, таких как использование ступки и пестика. Благодаря своей пропускной способности, TissueLyser LT идеально дополняет рабочую станцию QIAcube для параллельной подготовки до 12 образцов. При необходимости более высокой производительности мы предлагаем использование TissueLyser II, который обеспечивает эффективное разрушение одновременно до 192 образцов. www.interlabservice.ru 4. Очистка тотальной РНК Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка тотальной РНК Анализ экспрессии генов Очистка тотальной РНК Для очистки РНК важно использовать метод, который поддерживает целостность РНК и устраняет сопутствующие примеси. Деградация РНК делает невозможным проведение достоверного анализа экспрессии генов, в то время как присутствие загрязнений в очищенной РНК может ингибировать ферменты в дальнейших экспериментах, таких как ОТ-ПЦР в режиме реального времени и анализ с использованием микрочипов. Наборы RNeasy и другие наборы QIAGEN для очистки РНК (Таблицы 2–3) превосходно справляются с поставленной задачей благодаря сочетанию специальных лизирующих растворов и силика-мембран. Биологические образцы сначала растворяют в лизирурующем буфере, содержащем гуанидиновую соль, которая полностью денатурирует РНКазы, тем самым предотвращая распад РНК. Затем РНК связывается с силика-мембраной, либо на спин-колонках RNeasy, либо в лунках планшета RNeasy 96. Оставшиеся клеточные компоненты эффективно отмываются посредством серии промывочных растворов, после чего интактная РНК элюируется с мембраны свободной от РНКаз водой. Процесс RNeasy Образец Лизис, гомогенизация и добавление этанола Связывание тотальной РНК с мембраной RNeasy Промывка Элюция в небольшом объеме Готовая к использованию РНК Дополнительную информацию об очистке РНК можно найти на сайте www.qiagen.com Технологии обработки образцов и проведения исследований 9 4. Очистка тотальной РНК Таблица 2. Наборы для очистки тотальной РНК с применением технологии спин-колонок* Тип образца Набор для очистки РНК Количество образца Клетки1,2 Наборы RNeasy Mini, Midi и Maxi Наборы RNeasy Plus Micro и Mini Micro: < 5 x 105 клеток Mini: 10 – 107 клеток Midi: 5 x 106 – 1 x 108 клеток Maxi: 5 x 107 – 5 x 108 клеток Легколизируемые ткани (например, почки, печень, селезёнка)1,2 Наборы RNeasy Mini, Midi и Maxi Наборы RNeasy Plus Micro и Mini Micro: < 5 мг ткани Mini: 0.5 – 30 мг ткани Midi: 20 – 250 мг ткани Maxi: 150 мг – 1 г ткани Богатые волокнами ткани (например, сердце, мышцы, кожа)1 Наборы для волокнистых тканей RNeasy Fibrous Tissue Mini и Midi Mini: 0.5 – 30 мг ткани Midi: 20 – 250 мг ткани Все типы тканей1 Наборы для жировой ткани RNeasy Lipid Tissue Mini и Midi Mini: 10 – 100 мг ткани Midi: 75 – 500 мг ткани Все типы тканей (для экспериментов, проводимых с использованием микрочипов)1 Набор RNeasy Microarray Tissue Mini 10 – 100 мг ткани Зафиксированные в формалине и залитые парафином срезы тканей Набор для зафиксированных в формалине и залитых парафином срезов тканей RNeasy FFPE Срезы размером до 8 x 10 мкм, с площадью поверхности до 250 мм2 Микрообразцы (например, тонкоигольные пунктаты, срезы замороженных тканей, полученные методом лазерной микродиссекции)1,2 Набор RNeasy Plus Micro < 5 x 105 клеток < 5 мг ткани Кровь животных (стабилизированная)1 Набор для стабилизации крови животных RNeasy Protect Animal Blood < 100 мкл или < 500 мкл крови, собранной в пробирки RNAprotect Animal Blood Кровь человека (стабилизированная)1 Набор для очистки РНК из крови PAXgene Blood RNA 2,5 мл крови, собранной в пробирки PAXgene Blood RNA Кровь человека (свежесобранная) Набор для очистки РНК из крови QIAamp RNA Blood Mini < 1,5 мл крови Плазма, сыворотка, моча и другие не содержащие клеток биологические жидкости3 Набор QIAamp Circulating Nucleic Acid Образцы объемом < 5 мл Дрожжи Наборы RNeasy Mini, Midi и Maxi Mini: ≤ 5 x 107 клеток Midi: 2 x 107 – 5 x 108 клеток Maxi: 2.5 x 108 – 2.5 x 109 клеток Растения и грибы Набор для растений RNeasy Plant Mini 102 – 107 клеток 10 – 100 мг ткани Дополнительная очистка и концентрирование РНК Набор RNeasy MinElute® Cleanup < 45 мкг РНК Дополнительная очистка РНК Наборы RNeasy Mini, Midi и Maxi Mini: < 100 мкг РНК Midi: < 1 мг РНК Maxi: < 6 мг РНК *Все наборы могут быть автоматизированы в системе QIAcube (стр. 21), за исключением наборов RNeasy Plus Micro, QIAamp Circulating Nucleic Acid, и наборов в формате midi и maxi. 1 По продуктам для стабилизации РНК смотри также таблицу 1 (стр. 5). 2 По очистке тотальной РНК смотри также таблицу 4 (стр. 14). 3 Набор miRNeasy Mini также может использоваться для небольших количеств плазмы и сыворотки (не более 200 мкл). Таблица 3. Наборы для высокопроизводительной очистки РНК ручным методом с использованием многолуночных планшетов Тип образца Набор для очистки РНК Емкость Клетки1,2 Наборы RNeasy 96 и Plus 96 Наборы для очистки мРНК TurboCapture® mRNA†† 10 – 2 x 106 клеток 5 x 105 клеток (96-луночный планшет) или 1 x 105 клеток (384-луночный планшет) Ткани1 Набор RNeasy 96 Universal Tissue 25 – 100 мг ткани Кровь человека (стабилизированная)1 Набор PAXgene 96 Blood RNA 2,5 мл крови, собранной в прбирки PAXgene Blood RNA Дополнительная очистка РНК Набор RNeasy 96 Наборы для очистки мРНК TurboCapture mRNA†† < 100 мкг РНК Не применимо По продуктам для стабилизации РНК смотри также таблицу 1 (стр. 5). По очистке тотальной РНК смотри также таблицу 4 (стр. 14). 3 Для очистки мРНК 1 2 10 www.interlabservice.ru 4. Очистка тотальной РНК Очистка РНК из клеток, дрожжей и легколизируемых тканей Наборы RNeasy Mini, Midi и Maxi обеспечивают быструю и удобную очистку высококачественной РНК из культивируемых клеток, дрожжей и легколизируемых тканей (Рисунок 8, рисунок 23 на стр. 20 и рисунок 25 на стр. 21). Поскольку каждый набор поставляется со спин-колонками RNeasy определенной емкости по связыванию РНК (mini: 100 мкгРНК; midi: 1 мг РНК; maxi: 6 мг РНК), с использованием данной технологии можно выделять РНК из образцов различного размера. Для очистки РНК из очень маленьких количеств образца (< 5 x 105 клеток или < 5 мг ткани) можно использовать набор RNeasy Plus Micro (стр. 15). Для приложений, требующих высокой пропускной способности, применяется набор RNeasy 96, обеспечивающий одновременную очистку РНК из 96 образцов с использованием планшетов RNeasy 96. RNeasy A Кислый фенол B 0,7 Поглощение Поглощение 0,6 0 0 220,0 320,0 220,0 Длина волны, нм 320,0 Длина волны, нм Рисунок 8. Воспроизводимые результаты выхода РНК. РНК очищали из 8 образцов клеток HeLa (106 клеток в каждом образце) с использованием набора RNeasy Mini (RNeasy), либо методом экстракции кислым фенолом (Кислый фенол). A Измерение коэффициента поглощения показало, что воспроизводимый выход РНК возможен только с использованием набора RNeasy. B Электрофорез в агарозном геле подтверждает получение более воспроизводимых результатов по выходу РНК в случае использования набора RNeasy (каждый образец РНК наносили в количестве 10 мкг; количество определяли по поглощению образца при длине волны 260 нм). Очистка мРНК из клеток Также QIAGEN предлагает наборы для очистки мРНК TurboCapture mRNA, позволяющие проводить быструю и простую очистку полиаденилированной РНК с высокой производительностью. Клеточные лизаты добавляют в лунки планшетов TurboCapture (96- или 384-луночных), где происходит гибридизация выделяемой мРНК с иммобилизованными олиго-dT. Контаминирующие примеси удаляют на этапе промывки, далее очищенная мРНК может быть либо элюирована, либо использована непосредственно для синтеза кДНК (Рисунок 9). 1-й раунд 2-й раунд ПЦР ПЦР р53 1 bp 1000 — 800 — 600 — 500 — 400 — 300 — 200 — 100 — 2 3-й раунд ПЦР β-актин р21 3 1 2 3 1 2 3 Рисунок 9. Последовательный ПЦР-анализ в масштабе одного планшета. мРНК очищали из клеток HEK 293 с помощью набора TurboCapture 96 mRNA. В ходе исследования выделенную мРНК иммобилизовывали в лунках планшета TurboCapture, с последующим синтезом кДНК. Получаемая иммобилизованная кДНК подвергалась трем раундам ПЦР, как показано на рисунке. Между каждым раундом ПЦР лунки промывали 3 раза буфером Трис-HCl, 10 мМ, рН 7,5. Лунки «2» и «3» являются повторами одного образца. Лунки «1» представляют собой отрицательный контроль, в которых синтез кДНК проводился в отсутствии мРНК. (Схожая картина полос была получена и тогда, когда раунды ПЦР на р53, р21 и β-актин проводили в другом порядке, данные не приводятся). Технологии обработки образцов и проведения исследований 11 Значение СТ 4. Очистка тотальной РНК 30 25 20 15 10 5 0 Очистка мРНК из образцов тканей 0 10 20 30 40 50 Образец Рисунок 10. Получение воспроизводимых результатов ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием РНК из мозга крысы. РНК очищали из 48 образцов мозга (каждый образец массой 50 мг) с использованием набора RNeasy 96 Universal Tissue. Образцы очищенной РНК анализировали по экспрессии гена C-JUN (для каждого эксперимента использовали одинаковый объем элюата, эквивалентный 90 нг РНК). Флуоресценция Очистка РНК образцов из тканей для исследований с помощью микрочипов QIAGEN Поставщик R 30 20 10 0 20 30 40 50 60 70 Время, с Рисунок 11. Выделение пригодной для дальнейших исследований РНК. РНК очищали из печени крысы, хранившейся в формате FFPE в течение 6 месяцев, при помощи набора RNeasy FFPE или набора от поставщика R. РНК анализировали на биоанализаторе Agilent® 2100 Bioanalyzer. Стрелкой обозначены пики малых фрагментов РНК, очищенных только с помощью набора RNeasy FFPE. 1p19q А Б В EGFR Для труднолизируемых образцов тканей QIAGEN предлагает специализированные наборы, в основе которых лежит зарекомендовавшая себя технология RNeasy. Наборы RNeasy Fibrous Tissue Mini и Midi предлагаются для использования с волокнистыми тканями; входящая в их состав протеиназа К удаляет избыточное количество белка до стадии очистки РНК на спин-колонках RNeasy (Рисунок 5, стр. 7). Наборы RNeasy Lipid Tissue Mini и Midi (спин-колонки) и набор RNeasy 96 Universal Tissue (96-луночный формат) предназначены для всех типов тканей и обеспечивают тщательный лизис тканей благодаря специальному лизирующему буферу QIAzol®, содержащего фенол (Рисунок 10).* Набор RNeasy Microarray Tissue Mini обеспечивает оптимальное решение для очистки РНК для целей анализа микрочипов (Рисунок 12). Высокий выход очищенной РНК без примесей фенола достигается комбинированием лизирующего буфера QIAzol и спин-колонок RNeasy. При этом преципитация РНК до стадии дополнительной очистки не требуется, что способствует экономии времени и предотвращению потенциальной потери РНК. Очистка РНК из образцов тканей, зафиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE) Набор RNeasy FFPE обеспечивает максимальный выход пригодной для дальнейшего использования РНК из срезов тканей, зафиксированных в формалине и залитых парафином (Рисунок 11). Совместное использование лизирующего буфера и протеиназы эффективно высвобождает РНК из срезов тканей, предотвращая дальнейшую ее деградацию. Кроме того, использование специального лизирующего буфера и условий инкубирования позволяют предотвратить изменение структуры РНК формальдегидом. Рисунок 12. Надежный анализ с использованием микрочипов. РНК очищали из 13 образцов глиомы (4 с сочетанной делецией 1p19q и 9 с амплификацией EGFR) с использованием технологии QIAzol/RNeasy, после чего анализировали на экспрессионном чипе GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0. Иерархический кластерный анализ проводили с 1366 наборами зондов, экспрессия которых наиболее сильно варьировала между образцами. Значения наибольшей и наименьшей интенсивности обозначены красным и синим цветами соответственно, демонстрируя различия в экспрессии гена между двумя типами глиомы.* *Данные являются выдержкой из Ducray, F. et al. (2008) Anaplastic oligodendrogliomas with 1p19q codeletion have a proneural gene expression profile. Molecular Cancer 7, 41. 12 www.interlabservice.ru 4. Очистка тотальной РНК Очистка мРНК из образцов крови, сыворотки или плазмы Для получения оптимальных результатов очистки РНК из крови QIAGEN предлагает системы RNeasy Protect Animal Blood и PAXgene Blood RNA (смотри стр. 5-6). Обе системы объединяют в себе протоколы сбора крови со стабилизацией и очисткой РНК (Рисунки 13-14). Также имеется набор QIAamp RNA Blood Mini, который используется для очистки РНК из лейкоцитов (после лизиса эритроцитов). Для очистки РНК и ДНК, свободно циркулирующих в плазме и сыворотке, можно использовать набор QIAamp Circulating Nucleic Acid. Очистка РНК из образцов растений и грибов Набор RNeasy Plant Mini содержит альтернативный лизирующий буфер для растений, спин-колонки QIAshredder для гомогенизации и фильтрования вязких лизатов растений и грибов и высокомолекулярных вторичных метаболитов и экстрактов растений, а также спин-колонки RNeasy Mini для выделения высококачественной РНК в количестве до 100 мкг (Рисунок 7, стр. 8). Дополнительная очистка и концентрирование РНК 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0 -0,5 RNA protect EDTA 3 0 inCT inCT Набор RNeasy MinElute Cleanup позволяет дополнительно очищать и концентрировать РНК из грубых препаратов РНК и ферментативных смесей (Рисунок 15). Использование специальных спин-колонок RNeasy MinElute позволяет очищать до 45 мкг РНК и проводить элюцию в минимальном объеме (10 мкл).* -3 -6 -9 0 10 60 180 -12 -13 360 Время (минуты) 2 3 Время хранения (дни) Рисунок 13. Эффективная стабилизация РНК в образцах крови животных. Образцы крови крыс собирали в пробирки RNAprotect Animal Blood или в пробирки с ЭДТА, и хранили при температуре 15-250С (от 0 минут (t = 0) до 6 часов). РНК очищали, используя набор RNeasy Protect Animal Blood. Экспрессию гена FOS анализировали при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени (2 повтора). На оси Y показаны значения СТ, вычтенные из значений СТ при t = 0. Уровень транскрипта FOS остается постоянным только в образцах, стабилизированных RNAprotect. Рисунок 14. Стабильность РНК из образцов крови человека. Образцы крови хранили в пробирках PAXgene Blood RNA в течение 0-3 дней при температуре 18-250С, после чего РНК очищали с помощью набора PAXgene Blood RNA. Уровень транскрипта FOS определяли относительно 18S рРНК дважды при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени. На графике показаны значения для 10 образцов (собраны дважды) с обозначением средних арифметических и стандартного отклонения. Пунктирные линии обозначают ±3 общей точности исследования (2,34 СТ). РНК: 64 нг 16 нг 4 нг 1 нг 256 нг 64 нг 16 нг 4 нг 1 нг Рисунок 15. Концентрация нанограммовых количеств РНК. Обозначенные количества РНК из клеток HeLa концентрировали с использованием набора RNeasy MinElute Cleanup. Анализировали по 5 мкл образца из элюата объемом 12 мкл, проводя ОТ-ПЦР в реальном времени и используя набор QuantiTect® Probe RT-PCR, также проводили анализ экспрессии гена ACTB (β-актин). Rn 10.000 9.000 8.000 7.000 6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 -1.000 1 0 2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 *при увеличении количества образца, наилучшая очистка РНК может достигаться при использовании наборов RNeasy Mini, Midi, и Maxi и набора RNeasy 96 (стр. 11). Технологии обработки образцов и проведения исследований 13 5. Удаление примесей геномной ДНК Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка РНК с удалением ДНК Удаление ДНК и анализ экспрессии генов Удаление примесей геномной ДНК Следовые количества геномной ДНК в образце РНК могут оказывать влияние на точность таких чувствительных методов анализа, как ОТ-ПЦР в реальном времени. Как РНК, так и ДНК молекулы-мишени могут амплифицироваться, что приводит к недостоверной количественной оценке заданной РНК. К сожалению, не всегда возможно предотвратить нежелательную коамплификацию ДНК при помощи тщательного подбора ПЦР-праймеров. Технологии QIAGEN эффективно элиминируют примеси геномной ДНК, либо на стадии очистки РНК, либо непосредственно перед синтезом кДНК (Таблица 4). В любом случае, примеси геномной ДНК удаляются практически полностью, обеспечивая проведение точной количественной оценки мишеней РНК в ходе ОТ-ПЦР в реальном времени. Таблица 4. Технологии удаления примесей геномной ДНК. Технология Описание Наборы RNeasy Plus Наборы для очистки РНК: используются колонки или планшеты для быстрого удаления геномной ДНК. Набор RNase-Free DNase Реагенты для удаления ДНК путем ДНКазного расщепления; используется либо мембраны с предварительно связанной РНК, либо раствор РНК после элюции. Набор FastLane® Cell cDNA Набор для синтеза кДНК непосредственно из клеточных лизатов; включает этап элиминации геномной ДНК Набор QuantiTect Reverse Transcription Набор для приготовления кДНК с использованием тотальной РНК; включает этап элиминации геномной ДНК Дополнительную информацию об элиминации ДНК можно найти на сайте www.qiagen.com 14 www.interlabservice.ru 5. Удаление примесей геномной ДНК Очистка РНК с использованием колонок gDNA Eliminator Ферментативное расщепление ДНКазой Свободная от РНКаз ДНКаза обеспечивает эффективное расщепление ДНК на силика-мембране в процессе очистки РНК с использованием наборов RNeasy или набора QIAamp RNA Blood Mini (стр. 9-13).* Далее ДНКаза эффективно удаляется на этапе промывки. Свободная от РНКаз ДНКаза также может использоваться для удаления ДНК в очищенных или частично очищенных образцах РНК. 3.000 2.500 5 клеток 2.000 1.500 Rn Наборы RNeasy Plus - это быстрая и удобная очистка РНК с удалением примесей геномной ДНК (Рисунок 16). Клетки или ткани лизируют в специальном буфере, который обеспечивает оптимальные условия для удаления ДНК посредством непродолжительного центрифугирования, используя колонки gDNA Eliminator. Затем тотальная РНК очищается на спин-колонках RNeasy. Наборы доступны в форматах микро и мини для очистки до 45 и 100 мкг РНК соответственно. Микроформат хорошо подходит для очень маленьких образцов, таких как тонкоигольные пунктаты и срезы замороженных тканей, полученные методом лазерной микродиссекции. Миниформат может быть опционально автоматизирован в выделительной станции QIAcube (стр. 21). Для очистки РНК от геномной ДНК в 96-луночном формате используются планшеты gDNA Eliminator в составе набора RNeasy Plus 96. График амплификации -ОТ 1.000 0.500 0.000 5 10 15 20 25 30 35 Цикл Рисунок 16. Высокий и воспроизводимый выход РНК и эффективное удаление геномной ДНК. Тотальную РНК очищали из серии десятикратных разведений гомогенатов клеток Jurkat (от (5 x 105 до 5 клеток) с использованием набора RNeasy Plus Micro; из каждого разведения РНК выделяли в четырех повторах. Транскрипт ACTB (β-актин) определяли даже в 5 клетках путем проведения ОТПЦР в реальном времени с использованием набора QuantiTect Probe RT-PCR, получая воспроизводимое значение СТ для каждого разведения. В контрольных реакциях без обратной транскриптазы (-ОТ) ДНК ACTB не обнаруживалась даже после 38 циклов, означая отсутствие примесей геномной ДНК. Амплификация – CF_10.03.05 Набор FastLane cDNA представляет собой быстрый и простой метод для синтеза одноцепочечной кДНК непосредственно из культуры клеток минуя стадию очистки РНК (Рисунок 17). Для удаления примесей геномной ДНК клеточные лизаты кратковременно обрабатываются буфером gDNA Wipeout до начала стадии синтеза кДНК. Совмещение процессов получения кДНК из образцов тотальной РНК и удаления геномной ДНК Набор для обратной транскрипции QuantiTech Reverse Transcription Kit представляет собой быстрый и простой метод синтеза кДНК совмещенный с удалением геномной ДНК. Перед началом обратной транскрипции проводят непродолжительную инкубацию с буфером gDNA Wipeout для удаления контаминирующей геномной ДНК. 3.000 +ОТ 2.500 2.000 -ОТ 1.500 Rn Совмещение процессов получения кДНК и удаления геномной ДНК 1.000 0.500 0.000 -0.500 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Цикл Рисунок 17. Эффективное удаление примесей геномной ДНК. кДНК готовили с использованием набора FastLane Cell cDNA, с (+ОТ) и без (-ОТ) обратной транскриптазы. Количественное определение кДНК проводили посредством оценки экспрессии гена ACTB (β-актин). Характер графика –ОТ означает отсутствие геномной ДНК. *Как правило, обработка ДНКазой при очистке РНК этими наборами не требуется, поскольку технология силика-мембран эффективно удаляет большую часть ДНК и без расщепления ДНКазой. Тем не менее, полное удаление ДНК может понадобиться для некоторых экспериментов с РНК, чувствительных даже к очень незначительным количествам ДНК. Технологии обработки образцов и проведения исследований 15 6. Очистка микроРНК Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка микроРНК Детекция микроРНК Очистка микроРНК Наборы miRNeasy и другие наборы QIAGEN для очистки микроРНК являются специально адаптированной, хорошо зарекомендовавшей себя технологией RNeasy, позволяющей очищать тотальную РНК длиной более 18 нуклеотидов (Таблица 5). В состав очищенной РНК входят большие РНК, такие как мРНК и рРНК, а также малые РНК, такие как микроРНК, РНК, взаимодействующие с белками Piwi (пиРНК), малые ядрышковые РНК (мякРНК) и малые ядерные РНК (мяРНК). Совместная очистка больших и малых РНК позволяет детектировать посредством ОТ-ПЦР в реальном времени как мРНК, так и микроРНК, используя систему miScript PCR. Для определенных протоколов, в которых требуется удаление больших РНК, существуют дополнительные протоколы для очистки фракции РНК, обогащенной малыми РНК. Таблица 5. Наборы для очистки микроРНК* Набор Формат Исходный материал Возможность автоматизировать в системе QIAcube Набор miRNeasy Mini Спин-колонки Клетки и ткани Да Набор miRNeasy 96 96-луночный планшет Клетки и ткани Нет Набор для очистки зафиксированных в формалине и залитых парафином образцов miRNeasy FFPE Спин-колонки Срезы тканей, зафиксированных в формалине и залитых парафином Нет Набор для защиты крови животных miRNeasy Protect Animal Blood1 Спин-колонки Стабилизированные образцы крови животных Да Набор для выделения микроРНК из крови PAXgene Blood miRNA1 Спин-колонки Стабилизированные образцы крови человека Да Набор для выделения микроРНК из тканей PAXgene Tissue miRNA1 Спин-колонки Ткани, фиксированные PAXgene Tissue Нет Набор для выделения свободно циркулирующих нуклеиновых кислот QIAamp Circulating Nucleic Acid Спин-колонки Плазма, сыворотка, моча и другие свободные от клеток жидкости организма Нет *Протокол для очистки тотальной РНК, включая микроРНК (и другие малые РНК) из культивируемых клеток, основанный на технологии RNeasy Plus и не требующий использования фенола (QIAzol), доступен по адресу в интернете www.qiagen.com/miRNA-protocol-OI. 1 Набор является частью интегрированной системы для сбора образцов и стабилизации РНК с последующей очисткой. Более подробно см. стр. 4-6. Дополнительную информацию о технологиях исследования микроРНК можно найти на сайте www.qiagen.com 16 www.interlabservice.ru 6. Очистка микроРНК Наборы miRNeasy Mini и miRNeasy 96 позволяют проводить эффективную очистку микроРНК из всех типов клеток и тканей (Рисунок 18, а также рисунок 26 на стр. 21). Эффективный лизис даже труднолизируемых тканей и удаление примесей экстракцией в органическую фазу достигается применением лизирующего реагента QIAzol. Затем РНК можно очистить на спин-колонках (набор miRNeasy Mini) или в 96-луночном формате (набор miRNeasy 96). A Совместная очистка Фракция, обогащенная микроРНК Количество клеток Очистка микроРНК из тканей, зафиксированных в формалине и залитых парафином Очистка микроРНК из плазмы, сыворотки и крови Набор для выделения свободноциркулирующих нуклеиновых кислот QIAamp Circulating Nucleic Acid позволяет эффективно очищать циркулирующие в плазме или сыворотке человека, а также в других безклеточных жидкостях человека ДНК или РНК. Специальный протокол обеспечивает эффективную очистку малых РНК, таких как микроРНК. A Средний выход, мкг miRNeasy FFPE Поставщик А Легкие Печень Среднее значение СТ для miR-16 Для очистки микроРНК из крови QIAGEN предлагает системы для защиты образцов крови животных RNeasy Protect Animal Blood и для очистки микроРНК из образцов крови PAXgene Blood miRNA (см. стр. 5-6). Обе системы совмещают стабилизацию РНК в образцах крови и очистку РНК. B miRNeasy FFPE Поставщик А Легкие Значение СТ B Набор miRNeasy FFPE обеспечивает максимальный выход готовой для использования микроРНК из срезов тканей, зафиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE) (Рисунок 19). Специальные условия лизиса и инкубирования позволяют предотвратить модификацию РНК формальдегидом. Кроме того, лизирующий буфер в комбинации с протеиназой эффективно высвобождает РНК из тканевых срезов, предотвращая дальнейшую деградацию РНК. Затем можно получать высокоочищенную РНК, используя хорошо зарекомендовавшие себя спин-колонки RNeasy MinElute. Высокопроизводительный вариант Значение СТ Очистка микроРНК из образцов клеток и тканей Низкопроизводительный вариант Совместная очистка Фракция, обогащенная микроРНК Количество ткани Рисунок 18. Эффективная очистка из различного количества исходных образцов. Тотальную РНК очищали из 102-107 клеток Jurkat, используя набор miRNeasy 96 A, либо из серийных разведений гомогенатов ткани легкого крысы в количестве от 20 мг до 200 нг, используя набор miRNeasy Mini B . Фракции, обогащенные микроРНК (<200 нуклеотидов), также были выделены из тех же образцов. Очищенную РНК использовали в качестве матрицы в ОТ-ПЦР в реальном времени в количественном исследовании экспрессии miR-16. Рисунок 19. Превосходный выход и качество. РНК очищали из срезов, зафиксированных в формалине и залитых парафином, указанных тканей крысы с использованием набора miRNeasy FFPE, либо аналогичного набора от поставщика А. A Выход РНК определяли измерением поглощения при длине волны 260 нм. B Очищенную РНК использовали в качестве матрицы для количественного исследования экспрессии miR-16 методом ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием системы miScript PCR. Значения СТ для образцов, очищенных с помощью набора miRNeasy FFPE были ниже, свидетельствует об очистке больших количеств микроРНК по сравнению с набором от поставщика А. Печень Технологии обработки образцов и проведения исследований 17 7. Получение ДНК, РНК и белка из одного образца Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка ДНК, РНК и белка Геномный, транскриптомный и протеомный анализ Получение ДНК, РНК и белка из одного образца В таких областях исследований, как системная биология, где анализируются различные вещества, достоверная корреляция данных возможна, только если исследуемые компоненты очищены из одного и того же образца. Использование единого хорошо отлаженного протокола наборов AllPrep позволяет очищать ДНК/РНК, РНК/белок или ДНК/РНК/белок из одного образца, получая на выходе отдельные фракции биомолекул (Таблица 6). При этом достигается максимальный выход каждой биомолекулы, поскольку нет необходимости делить образец на части для стадий выделения и очистки. Наборы AllPrep можно использовать в комбинации с реагентом для тканей Allprotect Tissue, который используется для стабилизации ДНК, РНК и белка в образцах тканей для обеспечения надежных результатов в экспериментах по геномному, транскриптомному и протеомному анализу. Таблица 6. Наборы для очистки ДНК, РНК и белка Набор Очищаемая биомолекула Формат Емкость Набор AllPrep DNA/RNA Micro* ДНК и РНК Спин-колонки До 5 x 105 клеток или 5 мг ткани Набор AllPrep DNA/RNA Mini* ДНК и РНК Спин-колонки До 1 x 107 клеток или 30 мг ткани Набор AllPrep DNA/RNA 96* ДНК и РНК 96-луночный планшет До 1 x 107 клеток или 30 мг ткани Набор AllPrep RNA/Protein РНК и белок Спин-колонки Не применимо Набор AllPrep DNA/RNA/Protein* ДНК, РНК и белок Спин-колонки До 1 x 107 клеток или 30 мг ткани *Набор можно использовать в комбинации с реагентом для тканей Allprotect Tissue (стр. 6), который используется для стабилизации ДНК, РНК и белка в тканях. Дополнительную информацию об очистке нескольких исследуемых веществ можно найти на сайте www.qiagen.com 18 www.interlabservice.ru 7. Получение ДНК, РНК и белка из одного образца Ген Pgk1 Очистка ДНК и РНК A Наборы для очистки ДНК и РНК AllPrep DNA/RNA позволяют проводить одновременную очистку геномной ДНК и тотальной РНК из одного биологического образца (Рисунок 20). ДНК очищается с применением оптимизированных условий буфера и инновационной спин-колонки AllPrep DNA, в то время как РНК свободно проходит через спин-колонку RNeasy. Наборы доступны в форматах микро и мини, при этом вариант мини может быть автоматизирован в системе QIAcube (стр. 21). Высокопроизводительный вариант очистки ДНК и РНК обеспечивает набор AllPrep DNA/RNA 96 в 96-луночном формате. 1.200 График амплификации 5 мг 500 мкг 50 мкг 5 мкг 500 нг 50 нг 1.000 Rn 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 Очистка РНК и белка 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Цикл Набор для очистки РНК и белка AllPrep RNA/Protein позволяет одновременно очищать тотальную РНК и нативный белок из одного образца культуры клеток.*Очищенный белок содержит все клеточные белки и может быть использован для определения активности ферментов.1 Транскрипт Jun B График амплификации 7.000 5 мг 500 мкг 50 мкг 5 мкг 500 нг 50 нг 6.000 5.000 Rn Очистка ДНК, РНК и белка Набор для очистки ДНК, РНК и белка AllPrep DNA/RNA/Protein Mini позволяет одновременно очищать ДНК, РНК и денатурированный белок из одного образца клеток или ткани (Рисунки 21-22). Набор можно использовать совместно с реагентом Allprotect Tissue, который обеспечивает мгновенную стабилизацию в образцах тканей ДНК, РНК и белка для длительного хранения без заморозки (стр. 6). *Для приложений, в которых требуется только денатурированный белок (например, денатурирующий ПААГ-электрофорез и вестерн-блоттинг), существует дополнительный протокол для наборов RNeasy и AllPrep DNA/RNA, позволяющий проводить одновременную очистку тотальной РНК и денатурированного белка из клеток и тканей (www.qiagen.com/literature/protocols/pdf/RY22.pdf). 1 Перед проведением исследования ферментативной активности необходимо удостовериться в функциональности интересующего белка. Жидкий азот Значение СТ Allprotect 4.000 3.000 2.000 1.000 0.000 0 5 10 15 Кишечник ДНК (c-fos) Легкие Почки Кишечник Легкие РНК (Madh7) Рисунок 22. Достоверные результаты анализа ПЦР в реальном времени и ОТ-ПЦР. Образцы тканей крысы стабилизировали в реагенте Allprotect, после чего очищали ДНК и РНК с помощью набора AllPrep DNA/RNA/Protein Mini. Значения СТ при проведении ПЦР в реальном времени и ОТ-ПЦР были близкими к соответствующим значениям для образцов тканей, стабилизированных в жидком азоте. 25 30 35 40 Рисунок 20. Широкий динамический диапазон. Геномную ДНК и тотальную РНК очищали из десятикратных серийных разведений гомогената почки крысы с использованием набора для выделения ДНК и РНК AllPrep DNA/RNA Micro; из каждого разведения ДНК выделяли в двух повторах, РНК – в четырех повторах. A Анализ экспрессии гена Pgk1 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени и B анализ экспрессии транскрипта Jun с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, демонстрирующие достоверную количественную оценку в широком динамическом диапазоне (от 5 мг до 50 нг) ткани. Селезенка Почки 20 Цикл Печень Рисунок 21. Достоверные результаты вестернблоттинга. Ткани крысы стабилизировали с помощью реагента Allprotect, затем очищали белок при помощи набора AllPrep DNA/RNA/Protein Mini. Полученные образцы прогоняли в денатурирующей ПААГ с последующим вестерн-блоттингом на белок ERK2. Технологии обработки образцов и проведения исследований 19 8. Автоматизированная очистка РНК Сбор и стабилизация Разрушение и гомогенизация Очистка микроРНК Анализ экспрессии генов Автоматизированная очистка РНК Очистка РНК, основанная на рутинных методах, а также очистка РНК из большого количества образцов является весьма трудоемкой, отнимающей много времени задачей. Влияние человеческого фактора может приводить к нестабильности качества и количества получаемой РНК. Для облегчения решения данной проблемы QIAGEN предлагает исследователям широкий выбор автоматизированных систем для очистки РНК с разным уровнем производительности (от небольшой до высокой). Емкость систем варьирует от нескольких до 36 образцов за цикл. Для подтверждения надежного обеспечения качества очищенной ДНК автоматизированные системы QIAGEN были тщательно протестированы с помощью хорошо зарекомендовавшего себя химического анализа QIAGEN. Вся автоматика устройства поддерживается отделом QIAGEN по обслуживанию приборов (QIAGEN Instrument Service) и инженерным отделом ООО «ИнтерЛабСервис», обеспечивающим гибкую систему обслуживания, поддержку специализированных приложений и специально разработанных обучающих программ. Выход РНК [мкг] Система QIAcube Ручное выделение Рисунок 23. Очистка РНК из различных тканей. Ткани крысы (15 мг) стабилизировали в реагенте RNAlater RNA Stabilization Reagent и разрушали с помощью TissueLyser II. РНК очищали при помощи набора RNeasy Mini, либо ручным методом (Ручное выделение), либо в системе QIAcube (Система QIAcube). Селезенка Сердце Почка Легкие Тимус Дополнительную информацию об автоматизированных системах QIAGEN можно найти на сайте www.qiagen.com 20 www.interlabservice.ru 8. Автоматизированная очистка РНК Автоматизированная очистка с использованием наборов спин-колонок QIAGEN В передовой технологии системы QIAcube для автоматизации процесса подготовки проб используются наборы спин-колонок QIAGEN (Таблица 7 и рисунки 23-26). Встроенный сенсорный дисплей облегчает процедуру выбора протокола, а четкие сообщения на экране инструктируют по подготовке рабочего стола прибора. Все этапы процесса очистки полностью автоматизированы, что позволяет одновременно обрабатывать до 12 образцов. До начала процесса очистки для эффективного разрушения образцов можно использовать систему TissueLyser (стр. 7-8). Дополнительную информацию о системе QIAcube можно найти по ссылке в интернете www.qiagen.com/MyQIAcube. A Электрофорез в агарозном геле QIAcube (прогон 1) QIAcube (прогон 2) QIAcube (прогон 3) Ручное выделение Рисунок 24. Система QIAcube. Таблица 7. Наборы для очистки РНК при помощи спин-колонок, совместимые с системой QIAcube Набор Стр. Очистка тотальной РНК Набор для защиты RNeasy Protect Mini 5-6 Набор для защиты клеток RNeasy Protect Cell Mini 5-6 Набор для защиты бактерий RNeasy Protect 5-6 Bacteria Mini B Набор для защиты крови животных RNeasy 5-6 Protect Animal Blood Контроль качества РНК Параметр Система QIAcube Ручное выделение 17,17 мкг 17,23 мкг Коэффициент вариации 2,88 2,91 Соотношение А260/А280 2,06 2,01 Значение RIN 9,7 Соотношение 28S/18S рРНК 1,8 Выход РНК Набор для выделения РНК из крови PAXgene 5-6 Blood RNA Набор RNeasy Mini 11 Набор для выделения РНК из волокнистых тканей RNeasy Fibrous Tissue Mini 12 9,7 Набор для выделения РНК из жировой ткани RNeasy Lipid Tissue 12 1,8 Набор для выделения РНК из тканей для анали12 за на микрочипах RNeasy Microarray Tissue Mini Рисунок 25. Сравнимое качество РНК, очищенной в системе QIAcube либо ручным методом. РНК очищали из шести образцов клеток Jurkat (106 клеток в каждом образце) с помощью набора RNeasy Mini либо в системе QIAcube, либо ручным методом. A Электрофорез РНК в агарозном геле. B Сравнение параметров контроля качества РНК. Система QIAcube Ручной метод Набор для очистки зафиксированных в формалине и залитых парафином образцов 12 RNeasy FFPE Набор для выделения РНК из крови QIAamp RNA Blood Mini 13 Набор для выделения РНК из растений RNeasy Plant Mini 13 Пороговый цикл Набор для дополнительной очистки РНК 13 RNeasy MinElute Cleanup Набор RNeasy Plus Mini Очистка микроРНК Набор для защиты крови животных miRNeasy Protect Animal Blood 15 5-6 Набор для выделения микроРНК из крови 5-6 PAXgene Blood miRNA Набор для выделения микроРНК miRNeasy Mini miR-16 miR-25 Рисунок 26. Достоверная детекция микроРНК. Ткань почки крысы (25 мг) стабилизировали в реагенте RNAlater RNA Stabilization и разрушали в системе TissueLyser II. Тотальную РНК (вместе с микроРНК) очищали с помощью набора miRNeasy Mini, либо вручную (ручной метод), либо в системе QIAcube (Система QIAcube). Затем проводили ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием системы miScript PCR для детекции miR-16 и miR-25. 17 Очистка РНК и ДНК Набор для выделения ДНК и РНК AllPrep DNA / RNA Mini Очистка вирусных нуклеиновых кислот 19 Набор для очистки вирусной РНК QIAamp Viral RNA Mini 23 Набор QIAamp MinElute Virus Spin 23 Технологии обработки образцов и проведения исследований 21 8. Автоматизированная очистка РНК Автоматизированная очистка с использованием других технологий Система BioRobot Universal обеспечивает высокопроизводительную автоматизированную очистку образцов, а также подготовку реакционной смеси для проведения анализа экспрессии генов (Рисунки 27-28). Использование в системе одного или двух 96-луночных планшетов RNeasy 96 позволяет проводить очистку РНК из 96-192 образцов за прогон с высокой степенью воспроизводимости и стандартизации. Дополнительную информацию о системе BioRobot Universal можно найти по ссылке в интернете www.qiagen.com/goto/BioRobotUniversal. Система BioRobot® Universal Очистка в формате 96-луночных планшетов с использованием наборов RNeasy 96 Также возможна подготовка реакций Очистка РНК из клеток, тканей и крови СT BioRobot MDx Очистка в формате 96-луночных планшетов с использованием наборов RNeasy / QIAamp 96 Также возможна подготовка реакций Очистка РНК из крови Очистка вирусных нуклеиновых кислот Рисунок 28. Воспроизводимость результатов очистки РНК. РНК очищали из 80 образцов клеток Jurkat (5 x 105 клеток в каждом образце) с использованием набора RNeasy 96 BioRobot 8000 в системе BioRobot Universal. Очищенную РНК анализировали в одностадийной ОТ-ПЦР в реальном времени на приборе ABI PRISM® 7700 при помощи набора QuantiTect Probe RT-PCR. В эксперименте применяли праймеры и зонд на транскрипт ACTB (β-актин). Усовершенствованные системы EZ1® От 6 до 14 образцов за прогон Очистка с использованием специализированных наборов EZ1 Очистка РНК из клеток и тканей Очистка вирусных нуклеиновых кислот Для лабораторий, в которых необходимо полное документирование процесса, QIAGEN предлагает специализированные приборы EZ1 (очистка с невысокой производительностью), а также системы QIAsymphony SP и AS и BioRobot MDx (для очистки со средней и высокой производительностью) (Рисунок 27). Доступны для заказа специализированные наборы для очистки РНК в системах EZ1 и QIAsymphony. Считывание штрих-кодов позволяет обеспечить полное сопровождение образцов и реагентов в ходе процесса очистки. QIAsymphony® SP и AS До 96 образцов, партиями по 24 образца, за прогон Очистка с использованием специализированных наборов QIAsymphony Также возможна подготовка реакций Очистка РНК из клеток, тканей и крови Очистка вирусных нуклеиновых кислот Детальную информацию об этих и других автоматизированных системах QIAGEN можно найти на сайте www.qiagen.com Рисунок 27. Другие автоматизированные системы для очистки РНК 22 www.interlabservice.ru 9. Очистка вирусных нуклеиновых кислот Очистка вирусной РНК Сбор Детекция вирусной РНК Очистка вирусных нуклеиновых кислот При очистке вирусной РНК или ДНК из плазмы или сыворотки главной задачей является концентрирование нуклеиновых кислот, поскольку они могут быть сильно разведены в большом объеме образца. Наборы QIAamp позволяют проводить очистку вирусных нуклеиновых кислот из образцов большого объема (до 5 мл) (Таблица 8). Вирусную РНК и ДНК можно выделять из образцов объемом 0,14-5 мл с использованием силика-мембранных спинколонок QIAamp. Затем после этапа промывки РНК и ДНК элюируют со спин-колонок. В зависимости от задач эксперимента объем элюирующего буфера можно варьировать. Таблица 8. Наборы для очистки вирусных нуклеиновых кислот Набор Исходный материал Тип очищаемой нуклеиновой кислоты Максимальный объем образца (мл) Объем элюата (мкл) Набор для очистки вирусной РНК QIAamp Viral RNA Mini*1, 2 Плазма, сыворотка и другие не содержащие клеток биологические жидкости Только РНК 0,14 60 Набор QIAamp MinElute Virus Spin*2 Плазма, сыворотка и другие не содержащие клеток биологические жидкости Все нуклеиновые кислоты 0,2 20-150 Набор QIAamp MinElute Virus Vacuum1 Плазма, сыворотка и другие не содержащие клеток биологические жидкости Все нуклеиновые кислоты 0,5 20-150 Набор QIAamp UltraSens Virus* Плазма и сыворотка Все нуклеиновые кислоты 1 60-100 Набор для очистки циркулирующих нуклеиновых кислот QIAamp Circulating Nucleic Acid1 Плазма, сыворотка, моча и другие не содержащие клеток биологические жидкости Либо РНК, либо ДНК 5 20-150 *Очистку можно проводить с использованием микроцентрифуги. 1 Очистку можно проводить с использованием вакуумной системы. 2 Процесс может быть автоматизирован в системе QIAcube. Очистка вирусных нуклеиновых кислот может быть автоматизирована посредством комбинирования наборов QIAamp Viral RNA Mini или QIAamp MinElute Virus Spin и системы QIAcube (стр. 21), которая позволяет обрабатывать до 12 образцов за прогон. Для автоматизации процесса очистки QIAGEN также предлагает рабочие станции EZ1 (невысокая производительность), а также QIAsymphony SP и BioRobot MDx для средней и высокой производительности. Дополнительную информацию о технологиях для изучения вирусов можно найти на сайте www.qiagen.com Технологии обработки образцов и проведения исследований 23 10. Контроль качества РНК Контроль качества РНК Получение достоверных результатов в экспериментах с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени и микрочипов зависят от качества РНК. Традиционно целостность РНК оценивается с помощью денатурирующего электрофореза в агарозном геле, и целостность РНК оценивается по соотношению полос 28S к 18S рРНК (интактная РНК имеет соотношение 2:1). Тем не менее, анализ в агарозном геле является вредным для персонала ввиду необходимости использования этидиум бромида для визуализации РНК и отнимает много времени. Инновационная система QIAxcel® преодолевает данные ограничения благодаря применению готовых к использованию гель-картриджей и автоматизации процессов электрофореза и детекции (Рисунки 29-31). Оптимизированная система позволяет анализировать до 96 образцов за прогон и обеспечивает непревзойденные разрешение, скорость и производительность анализа ДНК и РНК. Также доступен для заказа широкий спектр маркеров и других реактивов и расходных материалов. Рисунок 29. Система QIAxcel. Рисунок 30. Гель-картридж QIAxcel. Дополнительную информацию о системе QIAxcel можно найти на сайте www.qiagen.com 24 www.interlabservice.ru 10. Контроль качества РНК Не требующий усилий анализ и исключительная простота в использовании Высокая чувствительность детекции, обеспечиваемая системой QIAxcel, позволяет получать надежные результаты даже при низких концентрациях РНК. Система QIAxcel ускоряет анализ и рационализирует весь процесс очистки и анализа образца. Программное обеспечение BioCalculator, поставляемое с системой QIAxcel, является мощным и удобным для использования средством, и создано для облегчения обработки данных и анализа. Данные могут быть визуализированы как в виде электрофореграммы, так и в формате изображения геля. A B Система QIAxcel Q Анализатор Agilent 2100 Bioanalyzer M Q M Рисунок 31. Получение данных с высоким разрешением с помощью системы QIAxcel. Тотальную РНК очищали из 15 мг ткани тимуса, стабилизированной реагентом RNAlater RNA Stabilization, с помощью набора RNeasy Mini в системе QIAxcel (Q), либо ручным методом (M). РНК элюировали в 50 мкл воды, свободной от РНКаз, и элюат анализировали либо в системе QIAxcel A , либо с помощью анализатора Agilent 2100 Bioanalyzer B . Технологии обработки образцов и проведения исследований 25 Компания «ИнтерЛабСервис» - официальный дистрибьютор продукции QIAGEN в России Компания «ИнтерЛабСервис» предлагает продукцию для молекулярно-биологических исследований от лидирующего мирового производителя – компании QIAGEN. Ассортимент продукции включает реагенты и оборудование для пробоподготовки и анализа биологических образцов: Наборы реагентов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, оптимизированные для разных типов биологического материала Наборы реагентов для постановки ПЦР Оборудование для разрушения и гомогенизации образцов (гомогенизаторы TissueRuptor®, TissueLyser) Автоматические станции для выделения нуклеиновых кислот и белков (QIAcube®, EZ1® Advanced, EZ1 Advanced XL, QIAsymphony®) Система автоматического дозирования реагентов QIAgility® для постановки ПЦР, ИФА и других протоколов Амплификатор Rotor-Gene® Q для постановки ПЦР в режиме реального времени Система для проведения капиллярного электрофореза QIAxcel® Пиросеквенаторы PyroMark® «ИнтерЛабСервис» обеспечивает: Конкурентные цены Поддержание складских запасов ряда позиций в Москве Поставка «под заказ» в гарантированные сроки, без задержек (при условии наличия продукции на складе производителя) Соблюдение температурного режима при хранении и транспортировке реагентов Бесплатная доставка заказов по всей России (при заказе на сумму от 10 000 р.) Информационная и техническая поддержка, прямые контакты с производителем Работа с рекламациями 26 www.interlabservice.ru Автоматизация лабораторных процессов: от образца к результату Измельчение образцов TissueLyser LT Шаровая мельница на 12 образцов TissueLyser II Шаровая мельница на 48 или на 192 образца TissueRuptor Роторно-статорный гомогенизатор Подготовка образцов к анализу Выделение и очистка QIAsymphony SP и AS Станция для экстракции нуклеиновых кислот и белков, использующая технологию магнитных частиц, с дополнительным модулем для подготовки образцов к анализу EZ1 Advanced EZ1 Advanced XL Станция для выделения нуклеиновых кислот, использующая технологию магнитных частиц QIAcube Станция для выделения ДНК, РНК и белков, использующая наборы с миницентрифужными колонками производства QIAGEN QIAgility Система автоматического дозирования жидкостей для точной подготовки образцов к ПЦР Детекция и анализ Rotor-Gene Q Амплификатор в режиме реального времени и прибор для изучения плавления в высоком разрешении (HRM) LiquiChip 200 Станция для мультиплексной детекции результатов исследования, использующая технологию xMAP QIAxcel Система капиллярного гель–электрофореза PyroMark Q24 Система для количественного анализа мутаций и степени метилирования, использующая технологию пиросеквенирования ПЦР в режиме реального времени Мультиплексная детекция Анализ ПЦР по конечной точке Детекция и количественный анализ на основе секвенирования Технологии обработки образцов и проведения исследований 27 ООО «ИнтерЛабСервис» официальный дистрибьютор продукции QIAGEN в России Россия, 119021, г. Москва, Олсуфьевский пер, д. 8, стр. 1 тел.: (495) 664 2884, факс: (495) 664 2889 e-mail: QIAGEN@interlabservice.ru www.interlabservice.ru
