Современные проблемы и методы биотехнологии
advertisement
УДК 60(075) ББК 30.16я73 С56 Авторы: Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова, С. В. Маркова, Л. А. Франк Электронный учебно-методический комплекс по дисциплине «Современные проблемы и методы биотехнологии» подготовлен в рамках реализации Программы развития федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет» (СФУ) на 2007– 2010 гг. Рецензенты: Красноярский краевой фонд науки; Экспертная комиссия СФУ по подготовке учебно-методических комплексов дисциплин С56 Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс] : лаб. практикум / Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова и др. – Электрон. дан. (3 Мб). – Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – (Современные проблемы и методы биотехнологии : УМКД № 1323-2008 / рук. творч. коллектива Т. Г. Волова). – 1 электрон. опт. диск (DVD). – Систем. требования : Intel Pentium (или аналогичный процессор других производителей) 1 ГГц ; 512 Мб оперативной памяти ; 50 Мб свободного дискового пространства ; привод DVD ; операционная система Microsoft Windows XP SP 2 / Vista (32 бит) ; Adobe Reader 7.0 (или аналогичный продукт для чтения файлов формата pdf). ISBN 978-5-7638-1662-4 (комплекса) ISBN 978-5-7638-1770-6 (лабораторного практикума) Номер гос. регистрации в ФГУП НТЦ «Информрегистр» 0320902481 (комплекса) Настоящее издание является частью электронного учебно-методического комплекса по дисциплине «Современные проблемы и методы биотехнологии», включающего учебную программу дисциплины, учебное пособие, методические указания по самостоятельной работе, контрольно-измерительные материалы «Современные проблемы и методы биотехнологии. Банк тестовых заданий», наглядное пособие «Современные проблемы и методы биотехнологии. Презентационные материалы». Приведены теоретические сведения и изложены подробные рекомендации к ведению лабораторных занятий по курсу «Современные проблемы и методы биотехнологии». Предназначен для студентов направления подготовки магистров 020200.68 «Биология» укрупненной группы 020000 «Естественные науки». © Сибирский федеральный университет, 2009 Рекомендовано к изданию Инновационно-методическим управлением СФУ Редактор Н. Ф. Ткачук Разработка и оформление электронного образовательного ресурса: Центр технологий электронного обучения Информационно-телекоммуникационного комплекса СФУ; лаборатория по разработке мультимедийных электронных образовательных ресурсов при КрЦНИТ Содержимое ресурса охраняется законом об авторском праве. Несанкционированное копирование и использование данного продукта запрещается. Встречающиеся названия программного обеспечения, изделий, устройств или систем могут являться зарегистрированными товарными знаками тех или иных фирм. Подп. к использованию 30.11.2009 Объем 3 Мб Красноярск: СФУ, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 Оглавление ВВЕДЕНИЕ................................................................... 6 МОДУЛЬ 1 .................................................................... 7 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ .................................... 8 Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ......................................................................... 8 Материалы и оборудование:................................................................................. 10 Задача 2.1.1. Выделение плазмидной ДНК ......................................................... 17 Задача 2.1.2. Анализ полученных препаратов плазмидных ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле ......................................................................... 17 Задача 2.1.3. Рестрикционный анализ полученного препарата плазмидной ДНК .................................................................................. 19 Вопросы.................................................................................................................... 20 Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий ..................................................................................................... 21 Материалы и оборудование:................................................................................. 22 Задача 2.2.1. Химическая трансформация клеток E. сoli .................................... 26 Задача 2.2.2. Трансформация клеток E. сoli электропорацией .......................... 26 Вопросы.................................................................................................................... 27 Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР ....................................................... 27 Материалы и оборудование:................................................................................. 29 Занятие 1. Экстракция ДНК из образцов и постановка ПЦР............................. 33 Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза ............. 35 Вопросы.................................................................................................................... 36 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ........................... 37 Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ............................................................. 38 Задача 1 .................................................................................................................... 38 Вопросы.................................................................................................................... 40 Задача 2. Определение модельной эпидемической вспышки с помощью ELIZA.......................................................................................................................... 40 Вопросы.................................................................................................................... 44 Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ................................................................................... 45 Материалы и оборудование:................................................................................. 47 Занятие 1. Постановка и проведение ПЦР с данными образцами ДНК ......... 47 Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза ............. 48 Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 3 ОГЛАВЛЕНИЕ Вопросы.................................................................................................................... 49 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ .................................... 50 Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений ............................................ 51 Условия культивирования..................................................................................... 54 Способы клонального микроразмножения ........................................................ 54 Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПО ГОРМОНАЛЬНОМУ И МИНЕРАЛЬНОМУ СОСТАВУ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ ..................................................................................................... 55 Вопросы.................................................................................................................... 58 Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА ................................... 58 Вопросы.................................................................................................................... 60 Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ ................................................... 61 Задание 1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля ........................................................................ 62 Задание 2. Микроразмножение картофеля черенкованием побегов.............. 65 Вопросы.................................................................................................................... 67 МОДУЛЬ 5 .................................................................. 68 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ .............. 69 Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА.................................................... 72 Вопросы.................................................................................................................... 82 Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ ............................... 82 Вопросы.................................................................................................................... 86 Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОМАССЫ RALSTONIA EUTROPHA B-5786, МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. ..................... 86 Вопросы.................................................................................................................... 94 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ .................................................... 96 Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ ....................................................... 98 Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 4 ОГЛАВЛЕНИЕ Вопросы.................................................................................................................. 100 Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ................................................................................................... 100 Вопросы.................................................................................................................. 104 Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ ................................................ 105 Вопросы.................................................................................................................. 107 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ........................ 108 Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 5 ВВЕДЕНИЕ Цель лабораторного практикума, сопровождающего лекционный курс «Современные проблемы и методы биотехнологии», – обучить приемам и методам по ключевым направлениям современной биотехнологии: геномике и протемике, технике ведения клеточных культур, новейшим аналитическим приемам, ключевым задачам биоинженерии. Цикл лабораторных работ направлен на формирование у студентов представлений о возможностях и уровне современной биотехнологии и ее методологии; включает следующие разделы: – Трансгенные организмы; – Современные методы молекулярной диагностики; – Культура растительных клеток и тканей; – Современные методы исследования целевых продуктов биотехнологии; – Инженерные основы биотехнологии. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 6 МОДУЛЬ 1 Работы не предусмотрены. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 7 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Цель: дать представление об основных методах конструирования трансгенных организмов, о многообразии генетически модифицированных организмов (ГМО), методах их идентификации и контроля. Задачи: – знакомство с основными методами конструирования трансгенных организмов; – обучение приемам и методам, используемым при создании трансгенных организмов и их тестировании. Объект: бактериальные клетки E. coli, дрожжевые клетки, экспрессионные плазмидные векторы, растительные трансгенные продукты. Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Цель работы: знакомство с методами выделения и рестрикционного анализа ДНК, получение экспериментальных навыков для конструирования и анализа рекомбинантных ДНК. Задачи: выделение плазмидной ДНК из кишечной палочки E. coli на примере плазмиды pUC18, содержащего вставку чужеродного гена, оценка качества полученного препарата с помощью электрофореза в геле агарозы, рестрикционный анализ плазмиды, определение размеров рестрикционных фрагментов ДНК. Клонирование рекомбинантной ДНК в общепринятом объекте генноинженерных исследований – бактерии E. coli практически всегда является составной частью процесса получения трансгенного организма. Как правило, E. coli используют для сборки и проверки корректности генетической конструкции, а также для получения препаративных количеств рекомбинаниной ДНК для последующей трансформации целевого организма в трансгенный. При этом плазмидные векторы являются наиболее популярными для клонирования рекомбинантной ДНК. Плазмиды – внехромосомные автономно реплицирующиеся генетические элементы клетки, представляющие собой преимущественно кольцевые замкнутые молекулы ДНК. Методы выделения плазмидной ДНК основаны на том, что бактериальные плазмиды находятся в кольцевой замкнутой форме и имеют небольшие размеры по сравнению с геномной ДНК. Первый этап многих методов состоит в разрушении жесткой бактериальной клеточной стенки путем их обра Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 8 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ботки ЭДТА и лизоцимом (для грамотрицательных бактерий) с образованием сферопластов. ЭДТА, хелатируя ионы металлов, также защищает ДНК от действия катион-зависимых нуклеаз. Реакцию проводят в изотоническом растворе (при достаточно высокой концентрации сахарозы или другого вещества) для предотвращения немедленного лизиса получаемых сферопластов. Затем сферопласты лизируют, например, путем добавления детергента. Клеточный дебрис и фрагменты бактериальной хромосомы, связанные с клеточной оболочкой, можно удалить центрифугированием или фильтрованием. Из различных методов выделения плазмид наиболее широко используется метод щелочного лизиса бактерий (метод Бирнбойма – Доли) и его модификации, как для получения мини-препаратов, так для крупномасштабного выделения ДНК. Метод основан на том, что в щелочных условиях (~рН 12,0–12,5) происходит денатурация линейных молекул ДНК (расплетение двойной спирали), в то время как кольцевые замкнутые молекулы не денатурируют или денатурируют незначительно и обратимо. Когда клеточный экстракт нейтрализуют при высокой концентрации соли, белки, геномная ДНК и клеточная РНК осаждаются. Происходит это, по-видимому, потому, что длинные одноцепочечные молекулы ДНК и РНК реассоциируют в высокой соли после денатурации случайным и беспорядочным образом, образуя нерастворимую массу. Большая часть клеточной РНК осаждается вместе с белками, поскольку реакцию проводят в присутствии додецилсульфата Na (SDS). Оставшуюся клеточную РНК в препарате удаляют обработкой РНКазой А (в основном это транспортная РНК, которая, видимо, вследствие легкости образования внутримолекулярных двухцепочечных участков, сравнительно легко ренатурирует и растворяется в высокой соли). После удаления осадка центрифугированием плазмидную ДНК осаждают из осветленного клеточного лизата этанолом или изопропанолом. Такой препарат ДНК можно использовать для многих целей, например, для рестрикционного анализа. Для многих других приложений часто необходимы более чистые препараты ДНК, например, для подготовки фрагментов к клонированию или для трансфекции – в таком случае ДНК подвергают дальнейшей очистке. Для получения высокочистых препаратов небольших по размерам ДНК, пригодных для практически всех молекулярно-биологических приложений, очень популярен метод очистки ДНК на колонках с фильтрами из стекла (glass), кварца (silica slurries) или силикагеля (silica-gel membrane). DNA обратимо сорбируется на поверхность стеклянной мембраны в растворе с высокой концентрацией хаотропной соли, примеси отмываются хаотропной солью и 70 % этанолом. Затем очищенная DNA элюируется в буфере с низкой ионной силой. Для очистки небольших количеств плазмидной ДНК или фрагментов часто используют центрифужные мини-колонки с такими силикатными фильтрами. Подобные наборы выпускаются многими фирмами. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 9 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Материалы и оборудование: термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24, «New Brunswick»(США) для выращивания клеточных культур; система видеодокументирования гелей «Molecular Imager Gel Doc XR» производства «Bio-Rad» (США) с трансиллюминатором; микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R (США) c ротором для микропробирок 1,5–2,0 мл; оборудование для горизонтального ДНК гель-электрофореза фирмы «Bio-Rad» (США): источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» и «Sub-Cell GT» камеры с заливочными столиками; лабораторный шейкер-вортекс V-1 фирмы «BioSan»; охлаждаемый термостат, модель КВ53 фирмы «Binder» (Германия); наборы из трех автоматических пипеток на 2–20 мкл, на 20–200 мкл и на 100–1000 мкл «Gilson»; мерные стаканы и колбы, одноразовые пластиковые пробирки и наконечники для пипеток; стационарная культура E. coli, содержащая рекомбинантную плазмиду; буферы и реагенты для выделения плазмидной ДНК; буферы и реагенты для рестрикционного анализа ДНК; буферы и реагенты для проведения агарозного электрофореза. Характеристика оборудования Рис. 2.1. Внешний вид термостатируемого шейкера-инкубатора Exella E-24 фирмы «New Brunswick» Термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24 «New Brunswick» (рис. 2.1) позволяет выращивать клеточные культуры в широком диапазоне температур и в различных объемах от микробиологических пробирок Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 10 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК на 2–5 мл до крупных колб 2,8 л. Ростовая камера плотно закрывается прозрачной акриловой крышкой, что позволяет непосредственно наблюдать за выращиваемыми образцами. Технические характеристики Диапазон температур инкубации от 7 °С выше окружающей до 60 °С. Диапазон частот качания 50–400 раз/мин, ± 2. Орбитальное качание 1,9 см в диаметре. Универсальный температурный контроль обеспечивается самокорректирующимся микропроцессорным контролем обратной связи и герметично сконструированной ростовой камерой. Высокоскоростной вентилятор обеспечивает быстрое восстановление температуры при перегреве. Установка температуры и скорости осуществляется через контрольную панель. Прозрачная крышка ростовой камеры позволяет непосредственно наблюдать за образцами и минимизировать количество открываний шейкера. Крышка легко поднимается, открывая удобный доступ к образцам. RS-232 обеспечивает регистрацию и хранение данных о состоянии прибора. Качание шейкера автоматически отключается при открывании крышки для защиты оператора. Система безопасности термостата выключает нагрев при превышении установленного температурного лимита для защиты растущей культуры. Система видеодокументации «Molecular Imager Gel Doc XR» (рис. 2.2) производства «Bio-Rad» с трансиллюминатором позволяет осуществлять ряд работ по получению цифровых изображений результатов экспериментов: от рутинной документации гелей до высокочувствительной хемилюминесцентной детекции и регистрации с высоким разрешением двумерных гелей. Система имеет широкий ряд применений, в их числе детекция нуклеиновых кислот, иммуноблоттинг, двумерный гель-электрофорез, дот-блоттинг, денситометрия, подсчет количества колоний. Система «Molecular Imager Gel Doc XR» включает в себя темный кабинет с переключаемым держателем фильтров на 5 штук (один желтый встроен по умолчанию), CCD видеокамеру, источники УФ и белого света, принтер, управляющий компьютер с программным обеспечением «Quantity One» для захвата и обработки изображений. Конверсионный экран «XcitaBlue» для ДНК-имиджинга в комплекте предотвращает образцы ДНК и пользователя от УФ-облучения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 11 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Рис. 2.2. Внешний вид системы видеодокументирования «Molecular Imager Gel Doc XR» производства «Bio-Rad» Технические характеристики Черно-белая 12-битная (4096 оттенков серого) CCD видеокамера с 1360х1024 мкм матрицей и разрешением 1,4 мегапиксела. Размер пиксела 4,6х4,6 мкм. Широкий динамический ряд видеодетекции, покрывающий более трех порядков. Видеокамера с автоматическим моторизованным увеличением 8,5–51 мм и цифровой обратной связью для воспроизводимости условий документирования. Отображение на экране в реальном времени для быстрого позиционирования и фокусирования образца. Для освещения используется проходящий УФ-свет, проходящий и отраженный белый свет. Встроенный трансиллюминатор с переключаемым 254, 302, и 365 нм УФ-излучением. Зона трансиллюминации 25х26 см. Пяти позиционный держатель эмиссионных фильтров с одним встроенным (желтый), возможно встраивание дополнительных четырех эмиссионных фильтров в зависимости от потребностей. Программное управление источниками освещения. Программное обеспечение совместимо с Windows и MAC OS. Размеры системы 60х36х96 см, масса 32 кг. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 12 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Рис. 2.3. Охлаждаемая микроцентрифуга 5417R c ротором для микропробирок фирмы «Eppendorf» Микроцентрифуга «Eppendorf» 5417R c ротором для микропробирок (рис. 2.3), укомплектованная аэрозолезащищенным угловым 30-позиционным ротором для микропробирок, позволяет центрифугировать любые образцы в микропробирках 0,2–2,0 мл на разнообразных режимах с переменным ускорением до 20 800 g. Характеризуется большой мощностью, малым временем разгона и остановки, большим центростремительным ускорением. Имеет режимы медленного и быстрого замораживания, работает в диапазоне температур от –9 °С до 40 °С. Функция охлаждения позволяет быстро охлаждать образцы до 4 °С примерно за 15 мин и постоянно поддерживать эту температуру в течение времени центрифугирования при максимальной скорости вращения. Возможна доукомплектация другими роторами, например, бакетротором или ротором для стрипов. Технические характеристики Удобная мембранная клавиатура для установки режимов центрифугирования (параметры можно менять в процессе работы центрифуги). Максимальная скорость вращения 16 400 об/мин (от 500 об/мин до максимального значения, с инкрементом 100 об/мин). Установление показаний вращения в единицах об/мин или в единицах g. Максимальное ускорение (rcf) около 25 000 g (в соответствии с DIN 58970), для 30-позиционного углового ротора 14 000 об/мин (20 800 g). Быстрый разгон и торможение даже при полностью заполненном роторе. Время разгона до максимальной скорости около 10 с, время торможения с максимальной скорости около 11 с (с 30-позиционным угловым ротором). Режим "Soft" для более мягкого разгона и торможения. Встроенный таймер до 99 мин с возможностью непрерывного центрифугирования. Функция кратковременного центрифугирования с выбранной скоростью вращения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 13 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Все съемные элементы – роторы, крышки, адаптеры могут автоклавироваться в течение 20 мин при 121 °С. Габариты: 31х60х25 см, масса (без ротора) 35 кг. Потребляемая мощность 700 W, питание 230V/50-60 Hz. Оборудование для горизонтального гель-электрофореза (рис. 2.4): источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» и «Sub-Cell GT» камеры с заливочными столиками фирмы «Bio-Rad» предназначено для проведения горизонтального электрофореза в гелях агарозы различного размера при анализе нуклеиновых кислот. Включает в себя удобный столик для заливки гелей, УФ-прозрачные подложки для гелей, гребенки различных форматов для формирования лунок. Программируемый источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» способен поддерживать ток до 5000 В, 500 мА и 400 Вт, что позволяет использовать его для всех высоковольтных методов, включая низкотоковые в микроамперном диапазоне. Кроме горизонтального ДНК-электрофореза может быть использован также в ряде других методов, включая SDS-электрофорез белков, изоэлектрическое фокусирование, ДНК-секвенирование. Рис. 2.4. Внешний вид оборудования для гель-электрофореза ДНК фирмы «Bio-Rad»: источник питания, заливочный столик и камеры Технические характеристики э/ф камер Размеры подложки для гелей 7х10 см для камеры «Mini-Sub Cell GT» позволяют внедрять два ряда гребенок в гель для увеличения количества анализируемых образцов – от 1 до 30. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 14 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Размеры подложки для гелей 15х25 для камеры «Sub-Cell GT» позволяют внедрять четыре ряда гребенок в гель для увеличения количества анализируемых образцов – от 1 до 120. Объем электрофорезного буфера ~270 мл для камеры «Mini-Sub Cell GT» и ~1 л для камеры «Sub-Cell GT». Технические характеристики источника питания для электрофореза «PowerPac HV Power Supply»: Способен поддерживать постоянный ток в диапазонах 20–5000 В, 0,01–500 мА, 1–400 Вт. Возможно подключение до четырех камер одновременно. Программируемый источник питания позволяет осуществлять многоступенчатые методы, процессы с изменяемыми параметрами, при постоянном токе, при постоянном напряжении, при постоянной мощности или при постоянной температуре. Лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы «BioSan» (Латвия) предназначен для перемешивания растворов и суспензий клеток в любых пробирках. Имеет два режима работы – непрерывный и импульсный. Импульсный режим включается при касании пробиркой головки вортекса. Рис. 2.5. Внешний вид шейкера-вортекса фирмы «Биосан» Технические характеристики Диапазон регулирования скорости 250–3000 об./мин. Предназначен для пробирок объемом 1,5–50 мл. Максимальный объём перемешивания 30 мл. Питание от внешнего блока DC 12 В, 500 мA. Масса не более 1,1 кг. Размеры 90x150x80 мм. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 15 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Охлаждаемый термостат КВ53 фирмы «Binder» (Германия) объемом 53 л (рис. 2.6), предназначен для инкубации разнообразных образцов при различных температурах от -10 °C до 100 °C с высокой точностью. Рис. 2.6. Термостат КВ53 фирмы «Binder» (Германия) Технические характеристики Регулируемый диапазон температур от –10 °C до 100 °C с точностью ±0,3 °С. Микропроцессорный контроль многочисленных временных и температурных функций осуществляется с ЖК-дисплея с визуальной и акустической сигнализацией. Интерфейс RS 422 для принтера или компьютера. Мощная запатентованная система охлаждения DCT® обеспечивает надежность поддержания температур без образования конденсата. Не наносящий вреда окружающей среде охладитель R134a. Абсолютная воспроизводимость условий инкубации и размножения. Программируемая (от 0 до 100 %) принудительная конвекция (вентилятор). Вытяжное устройство с заслонкой для сушки. Вспененная изоляция, не содержащая хлорфторуглеродов. Внутренняя стеклянная дверь, две полки с возможностью установки четырех. Многофункциональный таймер от 0 до 99 ч 59 мин. Размеры камеры Ш x В x Г см: 40 x 40 x 33, объем 53 л. Габариты Ш x В x Г см: 64 x 84 x 58, масса 72 кг. Мощность 460 Вт. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 16 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Задача 2.1.1. Выделение плазмидной ДНК Ход работы: 1. Культуру E. coli, содержащую рекомбинантную плазмиду pUC18, центрифугировать 2 мин в 2 мл пробирках при 8 об/мин. Культуральную среду вылить, осадок осушить. 2. Ресуспендировать осадок в 100 мкл раствора 1 (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM глюкозы, РНКаза А) с лизоцимом (на кончике шпателя на 10 мл), инкубировать 5 мин при комнатной температуре. 3. Добавить 200 мкл раствора 2 (0,2 M NaOH, 1 10% SDS). Инкубировать с мягким перемешиванием с перевертыванием пробирки до полной прозрачности, но не более 5 мин. 4. Добавить 200 мкл 3 M NaOAc pH 4,75, смешать переворачиванием и инкубировать 5 мин, периодически помешивая. 5. Центрифугировать на максимальных оборотах 10 мин (~16 тыс. об/мин). 6. Супернатант осторожно, не разрушая осадок, прилить к 1 мл этанола, перемешать и центрифугировать 2 мин на максимальных оборотах. 7. Осадок промыть 1 мл 70 % этанола перемешиванием на вортексе, затем центрифугировать 2 мин на максимальных оборотах. 8. Супернатант удалить, осадок подсушить на воздухе 10 мин и растворить в 80 мкл ТЕ (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA). Задача 2.1.2. Анализ полученных препаратов плазмидных ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле Для оценки количества и качества ДНК, а также размеров молекул ДНК используют электрофорез в гелях агарозы (горизонтальный) или полиакриламидных гелях (вертикальный электрофорез). Молекулы ДНК визуализируются интеркалирующими флуоресцентными красителями, например, бромистым этидием. Двуцепочечная ДНК эффективно связывает бромистый этидий и начинает ярко флуоресцировать при облучении ультрафиолетом (УФ). Результаты электрофореза документируют в проходящем УФ-свете с помощью цифровой фотокамеры или специальной системы для документирования гелей. Плазмидная интактная ДНК из клетки выделяется обычно в нескольких формах, которые разделяются в процессе электрофореза (рис. 2.7). В хорошем препарате ДНК доминирует суперскрученная мономерная и димерная формы (суперспиральная плазмида), при некотором повреждении ДНК появляются релаксированная форма (расплетенное кольцо, к чему приводит наличие разрыва в одной из цепей), редко бывает линейная форма, образующаяся при двуцепочечных разрывах плазмидного кольца. В препарате плазмидной ДНК возможна небольшая примесь денатурированной ДНК, а также фракция РНК. Денатурированная форма образуется при необратимых сдви- Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 17 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК гах цепей плазмидного кольца относительно друг друга в процессе денатурации. Рестриктазы не опознают сайты на такой ДНК с нарушенной двуцепочечной структурой и, соответственно, не расщепляют данную фракцию ДНК (рис. 2.7). Подвижность полос с формами кольцевой плазмиды зависит от условий электрофореза и концентрации бромистого этидия, так как внедрение интеркалирующих красителей расплетает ДНК, изменяя ее конформацию. Суммарное количество плазмидной ДНК во внесенной в гель пробе оценивают путем сопоставления интенсивности свечения полос со стандартной ДНК маркеров. Рис. 2.7. Пример электрофореза в 1 % геле агарозы, окрашен бромистым этидием. 1 – интектная плазмида, 2 – линейная плазмида после расщепления уникальной рестриктазой (один сайт на молекулу), 3 – маркеры молекулярного веса, длины в тысячах нуклеотидных пар. Формы интактной плазмиды: Ден – денатурированная, Сс-М – суперскрученная мономерная, Сс-Д – суперскрученная димерная, Рел – релаксированная, линейная форма в данном препарате отсутствует Ход работы: 1. Приготовить буфер ТАЕ (40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0) для электрофореза разведением стокового раствора ТАЕх50. 2. Приготовить 1 % гель агарозы на ТАЕ-буфере путем расплавления навески агарозы в микроволновой печи. После остывания до умеренно горячего состояния добавить бромистый этидий до 0,25 мкг/мл и залить гель в форму. 3. Нанести 1 и 2 мкл полученного препарата рядом с 1 мкл маркерной ДНК в лунки приготовленного 1 % геля агарозы. Образцы перед нанесением Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 18 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК смешивают с 1 мкл буфера для нанесения и электрофорезным буфером так, чтобы наносимый объем составил 10–15 мкл, для равномерного распределения ДНК по толщине геля. 4. Провести электрофорез в течение 30 мин при напряжении 100 В. 5. С помощью системы видеодокументации получить фотографию геля в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм. 6. Идентифицировать полосы плазмидной ДНК в препарате. Оценить суммарное количество плазмидной ДНК во внесенной в гель пробе путем сопоставления интенсивности свечения полос полученного препарата с интенсивностью свечения стандартной ДНК. После этого пересчитать количество полученной ДНК на общий объем препарата. 7. Записать вывод о качестве и количестве полученного препарата плазмидной ДНК. Задача 2.1.3. Рестрикционный анализ полученного препарата плазмидной ДНК Рестриктазы, или, более корректно, рестрикционные эндонуклеазы, являются важнейшими инструментами создания рекомбинантных ДНК и физического картирования ДНК-молекул. Рестриктазы расщепляют двухцепочечную ДНК внутри молекулы. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов (сайт узнавания) и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его (сайт расщепления). Наиболее широкое применение в генной инженерии нашли высокоспецифичные рестриктазы, узнающие палиндромные последовательности ДНК и расщепляющие ДНК-молекулу внутри сайта узнавания. При этом могут образовываться концы цепей трех структурных типов. Если разрыв происходит посередине сайта рестрикции, то образуются фрагменты с полностью спаренными ("тупыми") концами. Когда расщепление ДНК происходит в стороне от середины сайта, образуются выступающие однонитевые концы, получившие название "липких", т. е. способных "слипаться" с комплементарным концом, образующимся в противоположной цепи в результате ее разрыва. Число нуклеотидов в однонитевом концевом участке может варьировать от одного до пяти. Молекулы ДНК из разных источников, обработанные одной и той же высокоспецифичной рестриктазой, расщепляющей палиндромные последовательности, будут иметь одинаковые гибридизующиеся между собой липкие концы. Наличие таких липких концов у фрагментов ДНК существенно облегчает их ковалентное сшивание специальным ферментом ДНК-лигазой (лигирование) в рекомбинантную молекулу. Поскольку рестриктазы узнают специфические последовательности в молекуле ДНК, становится возможным физически определить местораспо Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 19 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ложение таких последовательностей, обрабатывая ДНК соответствующими рестриктазами. Физическую карту молекулы ДНК по рестрикционным сайтам можно составить, анализируя длины фрагментов ДНК после расщепления различными рестриктазами. Ход работы: 1. На основании физической карты плазмиды выбрать три рестриктазы для проведения расщепления полученного препарата плазмидной ДНК в двух вариантах реакции гидролиза двумя рестриктазами одновременно. 2. Для каждого из вариантов из каталога фирмы-поставщика (Сибэнзим) выбрать состав реакционной смеси, в которой одновременно активны обе из используемых рестриктаз. 3. По данным определения содержания ДНК в полученном препарате выбрать объемы пробы для рестрикционного анализа. Определить необходимое количество единиц активности рестриктазы для полного гидролиза полученного препарата за 30 мин и в соответствии с этим добавляемый объем фермента. Записать состав реакционной смеси. 4. Собрать реакции в двух вариантах и инкубировать 30 мин при оптимальной температуре расщепления для конкретных ферментов. В качестве отрицательного контроля ставится проба ДНК без добавления ферментов – всего 3 микропробирки. 5. Провести электрофорез гидролизованных образцов в 1 % геле агарозы вместе с маркерными ДНК. 6. Оценить полноту расщепления пробы и размер полученных рестрикционных фрагментов. Сопоставить полученный размер с ожидаемым согласно физической карте плазмиды. Записать выводы. Вопросы 1. Что представляют собой плазмиды? 2. На чем основаны методы разделения хромосомной и плазмидной ДНК в клетке? 3. Каков принцип щелочного метода выделения плазмидной ДНК? 4. На чем основано разделение макромолекул ДНК при агарозном гельэлектрофорезе? 5. Как можно определить размер молекул ДНК? 6. Какие формы плазмидной ДНК можно увидеть после электрофореза полученного препарата в агарозном геле? 7. Каково происхождение рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз)? 8. Каково значение открытия рестриктаз для развития методов клонирования и физического картирования ДНК? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 20 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий Цель работы: дать представление о различных методах введения чужеродной ДНК в клетки-мишени. Получение экспериментальных навыков по созданию генетически модифицированных организмов на примере клеток E. сoli и дрожжей. Задача работы: провести эксперимент по трансформации клеток E. сoli и дрожжей рекомбинантным челночным вектором pPZA двумя различными способами – химической трансформацией и электропорацией, продемонстрировать связи ДНК→РНК→белок→свойство организма. Трансформация – применительно к доставке чужеродной ДНК в клетку в самом общем значении термин обозначает процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении, как метод доставки ДНК, термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдерживают с ледяным раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, при этом составляет примерно 105–107. Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать нужные клоны. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Доля компетентных клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно повысить, используя специальную питательную среду, условия культивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило, эмпирически). Часто этапом подготовки компетентных клеток идет получение сферопластов – клеток, частично или полностью (протопласты) лишенных наружной ригидной клеточной стенки. Например, только таким способом была осуществлена эффективная трансформация многих грамположительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК. Одним из популярных методов введения нуклеиновых кислот в клеткимишени является электропорация – временное создание пор в бислойной Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 21 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий липидной мембране под кратким воздействием электрического поля. Это универсальный физический метод трансформации, методика которого разработана практически для всех типов клеток. Для многих типов клеток служит единственным способом высокоэффективной трансформации. При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока длительностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации повышается до 109–1011 для малых плазмид (~3–6 тпн) и до 106 для больших (~135 тпн). Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора ВАС. Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (12–18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см. Электропорация – наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального прибора электропоратора. Материалы и оборудование: термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24, «New Brunswick» (СА) для выращивания клеточных культур (см. работу 2.1); бокс-ламинар БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,2 производства «Ламинарные системы» (Россия) , I класс защиты (рис. 2.8); микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R (США) c ротором для микропробирок 1,5–2,0 мл (см. работу 2.1); лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы «BioSan» (см. работу 2.1); термостат модель КВ53, «Binder» (Германия) (см. работу 2.1); универсальный электропоратор «GenePulser Xсell» фирмы «Bio-Rad» (США) с одноразовыми кюветами для электропорации (рис. 2.9); водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan» (рис. 2.10); замороженные химически компетентные клетки E. coli XL1-Blue; химически компетентные клетки метилотрофных дрожжей Pichia pastoris; электрокомпетентные клетки дрожжей Pichia pastoris; раствор плазмидной рекомбинантной ДНК челночного экспрессионного вектора pPZA с блеомициновй устойчивостью, несущего вставку чужеродного гена; реагенты для химической трансформации дрожжей Pichia pastoris c LiCl; агар на LB среде; антибиотик блеомицин 100 мг/мл; Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 22 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий чашки Петри; стерильная одноразовая пластиковая посуда (наконечники, микропробирки), шпатели для растирания культур; пластиковые пробирки Eppendorf; контейнер со льдом, водяная баня (42 °С), термостат (37 °С). Характеристика оборудования Бокс-ламинар «БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,2» производства «Ламинарные системы» (Россия), I класс защиты, предназначен для создания беспылевой абактериальной воздушной среды. Используется при работе с препаратами и бактериальными культурами, не представляющими угрозы для здоровья оператора, когда необходима защита рабочего материала от окружающей среды или работа с объектом требует стерильной рабочей зоны. Технические характеристики Габариты рабочей камеры ламинарного бокса (ШхГхВ) 1105х620х670 мм, внешние габариты 1170х685х1115 мм, масса 145 кг. Две встроенные розетки. Плоская несъемная столешница из полированной нержавеющей стали. Шильд-панель с ЖК-экраном, индицирующим включение систем изделия. Таймер работы УФО рабочей камеры, счетчик наработки УФО, часы, технологический таймер. Двухступенчатая система фильтрации (классы фильтров G4 (предварительная очистка), НЕРА Н14), класс чистоты воздуха рабочей зоны ламинарного бокса по ГОСТ Р ИСО 14644-1-2002 (по частицам 0,5 мкм) 5ИСО. Система автоматического поддержания потока воздуха со скорость воздушного потока 0,45±10 % м/с. Производительность ламинарного бокса 800 м3/ч. Освещенность рабочей зоны ламинарного бокса 1000 Лк. Универсальный электропоратор «GenePulser Xсell Total System» фирмы «Bio-Rad» с одноразовыми кюветами для электропорации (рис. 2.9) является эффективной альтернативой другим способам доставки экзогенных молекул в клетку-хозяина. Универсальная система электропорации «GenePulser Xсell Total System» фирмы «Bio-Rad» с электропорационной ячейкой предназначена для эффективного внедрения нуклеиновых кислот, белков, углеводов, красителей, вирусных частиц и других молекул как в прокариотические, так и в эукариотические клетки. Здесь электропорация осуществляется либо экспоненциальным, либо квадратноволновым пульсом для подбора максимальной трансформационной эффективности. Система включает три модуля (главный, CE модуль для эукариот и РС-модуль для прокариот) и электропорационную ячейку «Shockpod». В комплекте ряд предустановленных оптимизированных протоколов для большинства широко используемых типов клеток. Установленные протоколы разработаны с возможностью их оптимизации и Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 23 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий создания новых протоколов для повышения эффективности трансфекции и увеличения жизнеспособности любых типов клеток. Рис. 2.8. Внешний вид ламинара «БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,2» производства «Ламинарные системы» (Россия), I класс защиты Рис. 2.9. Внешний вид универсального электропоратора «GenePulser Xсell Total System»фирмы «Bio-Rad» с электропорационной ячейкой «Shockpod» Технические характеристики Электропорация проводится в одноразовых кюветах 0,1 мм, 0,2 мм и 0,4 мм. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 24 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий Форма пульсовой волны – экпоненциальная или квадратная с изменяемым напряжением 10–3000 В. Электрическая емкость в диапазоне 10–500 В – 25–3275 мкФ с 25 мкФ инкрементом, в диапазоне 500–3000 В – 10, 25 и 50 мкФ. Длительность квадратно-волнового пульса: в диапазоне 10–500 В – продолжительность 0,05–10 мс с 0,05 мс инкрементом, продолжительность 10–100 мс с 1 мс инкрементом, 1–10 пульсов с 0,1–10 с интервалом. В диапазоне 500–3000 В – продолжительность 0,05–5 мс с 0,05 мс инкрементом, 1–2 пульса с интервалом минимум 5 с. Сопротивление образца – 20 Ω минимум при 10–2500 В, 600 Ω минимум при 2500–3000 В. Удобный цифровой интерфейс с интуитивно программируемым контролем всех параметров. Встроенные оптимизированные протоколы и создаваемые заново модифицируемые протоколы для специфических задач для получения лучшей доставки молекул в клетки. Хранение и вызов параметров пульса для последних 100 экспериментов. Водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan» предназначена для проведения химических, фармацевтических, медицинских и биологических исследований. Модель WB-4MS обеспечивает повышенную стабилизацию температуры (до 0,1 °С) за счет работы встроенной магнитной мешалки. Рис.. 2.10. Водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan» Технические характеристики Диапазон регулировки температуры +25–100 °C с 0,1 °C точностью, цифровая установка, ЖК-дисплей. Регулировка оборотов магнитной мешалки в диапазоне 300–1000 об/мин. Емкость ванны из нержавеющей стали 4 л, габариты 350x175x250 мм, масса не более 3,6 кг. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 25 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий Потребляемая мощность не более 600 Вт. Задача 2.2.1. Химическая трансформация клеток E. сoli Ход работы: 1. Подписать две пластиковые пробирки +ДНК и –ДНК. 2. В ламинарном боксе стерильно отобрать по 50 мкл суспензии компетентных клеток в трансформационном буфере в каждую пробирку. Поместить пробирки в ледяную баню. 3. В пробирку +ДНК внести 1 мкл раствора плазмидной ДНК. В пробирку –ДНК внести такое же количество буфера без ДНК. Выдержать обе смеси на льду 20 мин. 4. Расплавить агар в микроволновой печи и залить чашки с антибиотиком и без него. Конечная концентрация блеомицина для клеток E. сoli 25 мкг/мл, для дрожжевых клеток 100 мкг/мл. 5. Высушить залитые агаром чашки под UV-облучением в ламинарном боксе. 6. Провести процедуру теплового шока. Для этого обе пробирки поместить в водяную баню (42 °С) на 25 с (строго!), после чего быстро перенести их опять на лед. Выдержать 2–3 мин. 7. Пробирки вынуть изо льда, добавить по 250 мкл свежей LB-среды (стерильно!) и инкубировать при 37 °С в течение 30 мин. 8. Высеять полученные клетки на соответствующие чашки с агаром. Для этого отобрать по 100 мкл клеточной суспензии и перенести ее на поверхность агара. Растереть стерильной стеклянной петлей досуха, закрыть чашки, перевернуть и поместить в термостат (37 °С) на ночь. 9. Проанализировать полученные результаты. Сравните количество выросших колоний на чашках с антибиотиком и без. 10. Определите эффективность трансформации по формуле. Эфф. трансф. = число колоний на чашке / кол-во ДНК на чашку (мкг). Задача 2.2.2. Трансформация клеток E. сoli электропорацией Ход работы: 1. Подписать две пластиковые пробирки +ДНК и –ДНК. 2. В ламинарном боксе стерильно отобрать по 80 мкл суспензии электрокомпетентных клеток в воде в каждую пробирку. Поместить пробирки в ледяную баню. 3. В пробирку +ДНК внести 1 мкл раствора плазмидной ДНК в воде. В пробирку –ДНК внести такое же количество буфера без ДНК. Перемешать. 4. Перенести смесь клеток с ДНК в электропорационную кювету 0,1 мм. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 26 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.2. Введение чужеродной ДНК в клетки дрожжей и бактерий 5. Провести процедуру электропорации при 1800 кВ пульсе согласно инструкции к прибору. 6. Сразу же добавить к клеткам SOC-среду и поместить их в термостат на 30 мин при 37 °С, лучше с перемешиванием. 7. Высеять полученные клетки на соответствующие чашки с агаром. Для этого отобрать по 100 мкл клеточной суспензии и перенести ее на поверхность агара. Растереть стерильной стеклянной петлей досуха, закрыть чашки, перевернуть и поместить в термостат (37 °С) на ночь. 9. Проанализировать полученные результаты. Сравнить количество выросших колоний на чашках с антибиотиком и без. 10. Определить эффективность трансформации аналогично п. 10 задачи 2.1.1 и сравнить ее с полученной для химически компетентных клеток. Вопросы 1. Что такое генетическая трансформация? 2. Что такое компетентные клетки? Как вы себе представляете процесс проникновения плазмидной ДНК внутрь клеток в момент температурного шока? 3. Каков процесс проникновения молекул рекомбинантной ДНК внутрь клеток в процессе электропорации? 4. Почему для проведения генетических модификаций чаще всего используют клетки E. coli? Какие еще организмы используются в биотехнологии? 5. Какова эффективность проведенной вами трансформации? От чего она зависит? Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Цель работы: знакомство с постановкой определения генетически модифицированных ороганизмов (ГМО), процедурами выделения ДНК из пищевых продуктов, проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза. Задачи: определить присутствие генетически модифицированного растительного сырья в образцах пищевых продуктов. Достижения современной биотехнологии позволили вывеcти новые сорта сельскохозяйственных культур с полезными свойствами: устойчивостью к вредителям и грибковым заражениям, повышенной пищевой ценностью, повышенной урожайностью, засухоустойчивостью и пр. – с помощью генетических манипуляций, т. е. введением в геном растения генов, обеспе- Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 27 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР чивающих соответствующий признак или модификацией существующих. В обществе существуют как сторонники, так и противники генномодифицированных культур. Первые указывают на полезные свойства, которые позволяют интенсифицировать сельское хозяйство, избежать использования гербицидов, получать более высокие урожаи и т. п. Вторые опасаются проявлений аллергических реакций на такие продукты, снижения природного биоразнообразия, утечки трансгенов в дикую природу и других неопределенных отдаленных во времени последствий. В настоящее время не обнаружено однозначных доказательств, что генетически модифицированные продукты способны принести вред человеку. Хотя выгода от применения ГМ-растений очевидна, существует много противников трансгенных растений, убежденных в их опасности и использующих в своих аргументах невозможность ученых дать полную гарантию безопасности подобных продуктов. В каждой стране мира вопрос об использовании трансгенных растений решается по-разному местными законодателями. Примерно в 30 странах мира действует правило, согласно которому упаковка продуктов, при изготовлении которых использовались достижения генной инженерии, должна содержать информацию об этом, чтобы потребители самостоятельно делали свой выбор. Однако во многих случаях, например, когда соя используется при производстве мясных полуфабрикатов, производители не сообщают об этом покупателям. С 1 июня 2004 г. в Российской Федерации установлен новый допустимый порог наличия таких примесей – 0,9 %, который требуется количественно точно детектировать и указывать на упаковке. Генетически модифицированные продукты абсолютно ничем не отличаются по внешнему виду от своих природных аналогов. Установить генетическую модификацию проще всего методами генетического анализа, а именно методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Если просто наличие ГМ-примесей (принцип да-нет) можно установить обычной ПЦР, то для количественной оценки примесей требуется более сложный метод ПЦР в реальном времени (real time PCR). Последний получает все более широкое распространение, поскольку законодательство требует количественной маркировки присуствия ГМ-примесей в пищевых продуктах. ПЦР-анализ основан на поиске последовательностей, общих для большинства генно-модифированных организмов. На рис. 2.11 схематически показано, как с помощью ПЦР проводится определение ГМО. При этом используют специфические праймеры, которые комплементарны характерным участкам в геноме ГМО. Дело в том, что генетики используют практически одни и те же регуляторные участки (промотор и терминатор транскрипции) для контроля экспрессии вставленного гена. Для получения ГМ-растений используют, как правило, 35S промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV), который присутствует во всех известных и выращиваемых в промышленных масштабах ГМО и ДНК NOS терминатора T1 плазмиды почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, который также присутствует во многих промышленно выращиваемых Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 28 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР ГМ-растениях. В данной работе используются праймеры, комплементарные именно этим последовательностям. Размеры ДНК, которые при этом синтезируются, – 200 тыс. п.о. Чтобы проконтролировать, что экстрагированная из тестового образца ДНК содержит гены растительных белков, в работе предусмотрена контрольная ПЦР с «растительным» праймером к гену хлоропласта PSII. Размер синтезируемого при этом фрагмента – 455 тыс. п.о. Рис. 2.11. Определение наличия ГМО в продуктах с помощью ПЦР: М – маркеры молекулярных весов Материалы и оборудование: набор реагентов для проведения анализа GMO-Investiator kit #1662500EDU (BioRad), включающий сертифицированный контрольный ГМОотрицательный образец; контрольный ГМО-положительный образец; смесь для проведения ПЦР – Master mix; смесь ГМО праймеров; смесь Plant PSII праймеров;набор маркерных ДНК; краситель для гелей Orange G; сорбент, хелатирующий ионы Mg2+ (InstaGene™ matrix); образец продукта для исследования; набор пластиковой посуды: микропробирки 1,5 мл, пробирки для ПЦР 0.2 мл, наконечники для набора растворов, наконечники с фильтрами; комплект автоматических пипеток, штативы; ПЦР-бокс для стерильных работ с УФ-рециркулятором производства «BioSan»; Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 29 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R c ротором для микропробирок 1,5–2,0 мл (см. работу 2.1); лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы BioSan (см. работу 2.1); градиентный термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот «MJ Mini» фирмы "Био-Рад" (США); градиентная реал-тайм ПЦР система «Chromo4» фирмы "Био-Рад" (США) для проведения ПЦР в реальном времени; оборудование для горизонтального гель-электорфореза ДНК: источник постоянного тока «PowerPac HV Power Supply» и «Sub-Cell GT» камеры с заливочными столиками «Bio-Rad» (США) (см. работу 2.1); водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan» (см. работу 2.2); система видеодокументирования гелей «Molecular Imager Gel Doc XR» производства «Bio-Rad» (США) с трансиллюминатором (см. работу 2.1). Характеристика оборудования ПЦР-бокс для стерильных работ с УФ-рециркулятором UVC/T-AR «Biosan» (рис. 2.12), оборудованный открытой УФ-лампой и УФ-проточным рециркулятором, предназначен для стерильных работ, а также работ, чувствительных к РНК- и ДНК-контаминациям, напрмер, постановка реакций амплификации. Закрытый проточный УФ-рециркулятор позволяет осуществлять не только прямую УФ-обработку рабочей поверхности бокса, но также постоянную УФ-обработку воздушного пространства бокса, что рекомендуется при работе с опасными инфекционными и вирусными материалами. Рис. 2.12. Внешний вид ПЦР-бокса для стерильных работ с УФ-рециркулятором фирмы «BioSan» Технические характеристики Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 30 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Освещение и обеззараживание: 1 лампа дневного света 15Вт и УФлампа 25 Вт без озона, УФ-рециркулятор, состоящий из УФ-лампы 25 Вт, вентилятора и антипылевого фильтра, заключенных в специальный корпус для защиты рабочей поверхности во время работы. Длительный срок службы УФ ламп до 8000 часов. Автоматическое выключение УФ-ламп в случае открытия передней дверцы. Цифровой таймер на 1 мин – 24 часа/постоянно. Масса не более 26 кг, внешние размеры 690x515x555 мм. Низкий уровень шума и энергопотребления. Градиентный термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот «MJ MiniCycler» фирмы "Био-Рад" (рис. 2.13) является компактным персональным 48-луночным прибором для амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР). Технология температурного градиента позволяет одновременно инкубировать образцы при 8 различных температурах, что делает возможным оптимизацию условий ПЦР за одну реакцию для достижения максимальной эффективности реакции и точности количественного определения. Блок для образцов размером 6х8 может вмещать до 48 0,2 мл пробирок, стрипы, 48-луночные планшеты и до 12 0,5 мл пробирок: Рис. 2.13. Внешний вид градиентного термоциклера «MJ Mini» фирмы "Био-Рад" Технические характеристики Вмещаемое количество образцов: 48х0,2 мл пробирки, 0,2 мл 48-луночные планшеты, 6х8 0,2 мл стрипы или 12х0,5 мл пробирки. Диапазон инкубационных температур 0–99 °С, точность ±0,2 °С при достижении программируемой температуры в 90 °С. Скорость изменения температуры до 2,5 °С в секунду. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 31 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Равномерность поддерживаемых температур не более ±0,4 °С между лунками в пределах 10 с при программируемом достижении 90 °С. Диапазон температурного градиента 35–99 °С с возможными пределами изменений 1–16 °С. Точность поддержания температурного градиента ±0,4 °С между лунками одного ряда при достижении программируемой цели в конце ряда температур. Равномерность поддерживаемых градиентных температур не более ±0,4 °С между лунками одного ряда пределах 30 с при достижении целевой температуры. ЖК-дисплей 64х128, 2 USB входа. Память на 400 типовых программ. Градиентная реал-тайм ПЦР система «Chromo4» фирмы "Био-Рад" (рис. 2.14) предназначена для амплификации ДНК с оценкой результатов в реальном времени для количественного определения матриц с возможностью детекции до четырех мишеней в одном образце. Оптический детектор флюоресцентных проб «Chromo4» установлен на базе градиентного термоциклера «DNA Engine PTC-200» с встроенным 96-луночным модулем для образцов. Система укомплектована управляющим настольным компьютером с интегрированным программным обеспечением для анализа результатов и принтером. Рис. 2.14. Внешний вид градиентной реал-тайм ПЦР системы «Chromo4» фирмы "Био-Рад" для количественного определения молекул нуклеиновых кислот в образцах Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 32 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Технические характеристики Вмещаемое количество образцов: 96 штук 0,2 мл пробирок, один 0,2 мл 96-луночный планшет или 12 штук 0,2 мл 8-пробирочных стрипов с объемом одного образца 10–100 мкл (20 мкл рекомендуется). Диапазон инкубационных температур 0–105 °С, точность ±0,3 °С при достижении программируемой температуры в 90 °С. Скорость изменения температуры до 3 °С в секунду. Равномерность поддерживаемых температур не более ±0,4 °С между лунками в пределах 30 с при программируемом достижении 90 °С. Диапазон температурного градиента 30–105 °С с возможными пределами изменений 1–24 °С. Точность поддержания температурного градиента ±0,4 °С между лунками одного ряда при достижении программируемой цели в конце ряда температур. Равномерность поддерживаемых градиентных температур не более ±0,4 °С между лунками одного ряда в пределах 30 с при программируемом достижении 90 °С. Диапазон возбуждения флюоресценции: канал 1 – 450–490 нм, канал 2 – 500–535 нм, канал 3 – 555–585 нм, канал 4 – 620-6500 нм. Диапазон детекции флюоресценции: канал 1 – 515–530 нм, канал 2 – 560–580 нм, канал 3 – 610–650 нм, канал 4 – 675–730 нм. Память на 400 типовых программ. Масса 12,6 кг. Занятие 1. Экстракция ДНК из образцов и постановка ПЦР Внимание! Работы с генетическим материалом и при постановке ПЦР требуют специальных условий: 1. Все работы проводятся в перчатках, спецодежде (лабораторные халаты). 2. В лаборатории нельзя есть, пить, курить, разговаривать над открытыми пробирками. 3. До и после проведения работ необходимо тщательно вымыть руки. 4. Обо всех нестандартных ситуациях необходимо немедленно уведомить преподавателя. Ход работы: 1. Подписать две 1,5 мл микропробирки «non-ГМО» и «тест». 2. Отобрать 0,5–2,0 г «non-ГМО» образца, перенести в ступку, добавить по 5 мл дистиллированной воды на каждый грамм образца. 3. Растереть образец пестиком в течение 2 мин до получения однородной массы. 4. Добавить еще 5 объемов воды и снова растереть массу пестиком. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 33 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР 5. В пробирку«non-ГМО» внести 500 мкл InstaGene™ matrix и 50 мкл полученной после растирания массы, закрыть пробирку. 6. Повторить п. 2–4 для приготовления тестового образца. 7. В пробирку «тест» внести 500 мкл InstaGene™ matrix и 50 мкл полученной после растирания тестового образца массы, закрыть пробирку. 8. Тщательно перемешать пробирки на шейкере и поместить в водяную баню на 95 °С на 5 мин. 9. Поместить пробирки в центрифугу и центрифугировать в течение 5 мин на максимальной скорости. Супернатант содержит ДНК-экстракт. 10. Пронумеровать пробирки для ПЦР 1–6. Содержимое каждой пробирки указано в табл. 2.1. Таблица 2.1 № 1 2 3 4 5 6 Смесь реагентов для ПЦР Master mix 20 мкл растительной Мм (зеленая) 20 мкл ГМО Мм (красная) 20 мкл растительной Мм (зеленая) 20 мкл ГМО Мм (красная) 20 мкл растительной Мм (зеленая) 20 мкл ГМО Мм (красная) ДНК 20 мкл, «non-ГМО» образец 20 мкл, «non-ГМО» образец 20 мкл, «тест» образец 20 мкл, «тест» образец 20 мкл, «+ГМО» образец 20 мкл, «+ГМО» образец 11. Поместить все пробирки на лед. 12. В каждую пробирку поместить по 20 мкл соответствующей смеси Master mix, каждый раз используя свежий наконечник. 13. Соответственно надписи внести в пробирки образцы ДНК из п. 9 (Осторожно! Нас интересует только супернатант!) и перемешать тщательно пипетированием. 14. Включить термоциклер по заданной программе (табл. 2.2), после нагрева термоблока до температуры денатурации поставить прибор на паузу и быстро поместить в него пробирки. Таблица 2.2 Шаг Функция Начальная дена- Денатурация турация Денатурация Амплификация Отжиг Синтез Завершающий Синтез синтез (элогация цепи) * Хранение Хранение Температура Число циклов Длительность 94 °С 2 мин 94 °С 59 °С 72 °С 72 °С 1мин 1мин 2 мин 10 мин 4 °С неопределенное 1 40 1 Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 34 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза Ход работы: 1. Приготовить 1 % гель агарозы и аппарат для гель-электрофореза согласно протоколу из работы 2.1, задача 2.1.1. Гель приготовить без бромистого этидия. 2. Пробирки после ПЦР отцентрифугировать (пульс-режим). 3. В каждую пробирку внести по 10 мкл раствора красителя Orange G, тщательно перемешать на вортексе. 4. В лунки геля поместить по 20 мкл образцов в следующем порядке (табл. 2.3): Таблица 2.3 Номер лунки 1 2 3 4 5 6 7 Образец «non-ГМО» образец, растительный праймер «non-ГМО» образец, ГМО праймер «тест» образец, растительный праймер «тест» образец, ГМО праймер «+ГМО» образец, растительный праймер «+ГМО» образец ГМО праймер набор стандартов мол. массы 100 bp 5. Провести электрофорез на агарозном геле в течение 30 мин при напряжении 100 В. 6. Зафиксировать результат на системе видеодокументации и проанализировать полученные результаты. Заполнить табл. 2.4. Таблица 2.4 Номер полосы 1 2 3 4 5 6 7 Нанесенный образец Наличие полос Размер фрагментов «non-ГМО» образец, растительный праймер «non-ГМО» образец, ГМО праймер «тест» образец, растительный праймер тест» образец, ГМО праймер «+ГМО» образец, растительный праймер «+ГМО» образец ГМО праймер стандарты мол. массы Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 35 МОДУЛЬ 2. СОВРЕМЕННЫЕ УСПЕХИ ГЕНОМИКИ: ТРАНСГЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ Работа 2.3. Количественное определение присутствия ГМО в продуктах питания методом ПЦР Вопросы 1. Какие из молекул, содержащихся клетке, могут повлиять на выделение ДНК? 2. На каких принципах основан метод ПЦР? 3. Зачем нужны праймеры и как выбрать их последовательность? 4. Что такое ГМО? Как вы относитесь к проблеме их распространения? 5. Возможно ли создание единой методики ПЦР с одинаковыми праймерами для определения всех видов ГМО? 5. Какие экспериментальные условия надо соблюдать при постановке ПЦР? С чем это связано? 6. Что такое Tаg-полимераза? Что должно находиться в реакционной смеси для ее эффективной работы? 7. Как происходит разделение ДНК-фрагментов во время электрофореза? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 36 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Цель: освоение методов современной молекулярной диагностики – иммуноанализа и гибридизационного анализа, изучение возможностей и ограничений каждого метода, соблюдение технологических требований к условиям проведения анализа. Задачи: – ознакомить с технологическими требованиями к условиям проведения анализа биологических образцов; – обучение технике экстракции генетического материала из биологических образцов; – обучение технике постановки полимеразной цепной реакции; – освоение метода анализа продуктов ПЦР с помощью гельэлектрофореза; – обучение технике постановки иммуноанализа (на примере ELIZA); – освоение колориметрического и биолюминесцентного вариантов иммуноферментного анализа. Развитие и достижения геномики человека обеспечили новые возможности для развития целого ряда других научных направлений. К настоящему времени в мире идентифицировано множество генов, ответственных за болезни человека, в том числе болезнь Альцгеймера, болезнь Гоше, атаксию, муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна, дистонию, гемофилию А и В, фенилкетонурию, серповидно-клеточную анемию, талассемию, синдром хрупкости Х-хромосомы, наследуемый рак молочных желез и яичников и др. Структуры этих генов расшифрованы и сами они клонированы. Это позволяет проводить эффективную раннюю и даже пренатальную диагностику и лечение. Тестирование будущих родителей на высокий риск генетического заболевания теперь может проводиться для постоянно растущего числа генов. При этом типичным подходом является использование исследований при помощи гибридизации или ПЦР-анализа. Можно протестировать здорового человека из семьи, где встречался, например, кистозный фиброз, и определить, есть ли у него копия дефектного гена или нет. Если неблагополучного сочетания генов избежать не удалось и оба потенциальных родителя являются носителями рецессивного дефекта, они должны сами решать, рисковать ли им, чтобы иметь детей. В любом случае раннее начало профилактического лечения ребенка позволит предотвратить начало заболевания или отодвинуть начало его проявления. Сегодня в практику медикогенетического консультирования введены десятки систем для генодиагностики наиболее распространенных наследственных заболеваний. Установленная последовательность генома поможет идентифицировать новые гены и Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 37 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ выявить среди них те, что обусловливают предрасположенность к тем или иным заболеваниям. Успехи современной медицины в огромной мере зависят от того, удастся ли вовремя обнаружить специфические инфекционные агенты (вирусы, бактерии, паразитические микроорганизмы) или изменения в содержании важных биологически активных белков или низкомолекулярных соединений в организме. Надо ли говорить, что профилактику и лечение любого заболевания существенно облегчает ранняя и точная диагностика. Современные методы молекулярной диагностики обладают высокой специфичностью и чувствительностью и при этом являются достаточно продуктивными, эффективными и недорогими для рутинного применения. Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Задача 1 Цель работы: знакомство с процедурой проведения твердофазного иммуноферментного анализа, демонстрация использования в качестве метки генетически слитого бифункционального химерного белка, обладающего биолюминесцентной активностью Са2+-активируемого фотопротеина обелина и иммуноглобулин-связывающей способностью белка А из Staphylococcus aureus. Материалы и оборудование: 0,1М фосфатный буфер, содержащий 0,9 % NaCl (PBS); 1% р-р бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS; растворы иммуноглобулинов класса G кролика, мыши и человека (RIgG, MIgG, HIgG), в PBS, 10 мкг/мл; раствор для помывки планшетов (PBS, содержащий 0, 05 % Tween-20 и 5мМ ЭДТА); непрозрачные планшеты для иммунологического микроанализа; раствор химерного белка с активностью 500 мV/мл; планшетный люминометр Luminoscan v1.30; набор автоматических пипеток и наконечники к ним. Микропланшетный люминометр Luminoscan v1.30 (ThermoElectron, Финляндия) (рис. 3.1). Прибор предназначен для измерения люминесцентного сигнала от растворов в лунках микропланшет для иммуноферментного анализа. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 38 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Рис. 3.1. Внешний вид микропланшетного люминометра Luminoscan v1.30 (ThermoElectron, Финляндия) Технические характеристики Диапазон измерений – 270–670 нм. Люминометрический диапазон – до 5000 относительных световых единиц. Чувствительность – 1 фмол АТФ. Люминометрический динамический диапазон – 9 порядков. Прибор оснащен орбитальным шейкером, что позволяет проводить инкубирование планшет при перешивании, скорость вращения 60–1200 rpm, диаметр – 50 мм. Прибор позволяет производить измерения при термостатировании в температурном режиме от 25 до 37 ºС. Он оснащен системой впрыска реагентов – диспенсером с объемом от 1 до 1000 мкл с разрешением 1 мкл. Имеется возможность производить измерения как в стандартном 96луночном микропланшете, так и других, от 6 до 384-луночных планшетах. Для коммуникации через PC прибор укомплектован соответствующим программным обеспечением. Наличие шейкера – орбитальный, скорость 60–1200 rpm. Температурный режим – 25–37 ºС. Наличие диспенсера – 1, 1–1000мкл, с разрешением 1 мкл. Ход работы: 1. В лунки с координатами А2-F12 (всего 66 лунок) планшета для иммуноферментного анализа внести по 100 мкл PBS. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 39 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ 2. В лунки А1,В1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов кролика; в лунки С1,D1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов мыши; в лунки E1,F1 внести по 200 мкл раствора иммуноглобулинов человека (концентрации растворов иммуноглобулинов – 5 мкг/мл). 3. В каждом ряду раститровать растворы иммуноглобулинов с шагом 2. Последние две лунки каждого ряда оставить с PBS для контроля. 4. Для эффективной сорбции планшет выдержать при 37 °С в течение часа либо при 4 °С в течение ночи. 5. Удалить содержимое лунок и промыть их раствором для промывки трижды. 6. В каждую лунку внести по 120 мкл раствора БСА и проинкубировать планшет при 37 °С в течение часа. 7. Промыть планшет так, как описано в п. 5. 8. В каждую лунку внести по 100 мкл раствора химерного белка и проинкубировать планшет при комнатной температуре в течение часа. 9. Промыть планшет так, как описано в п. 5. 10. Провести измерения биолюминесценции сорбированного химерного белка с помощью планшетного люминометра Luminoscan v1.30. 11. Построить зависимость люминесцентного сигнала от концентрации каждого из иммуноглобулинов, усредняя соответствующие сигналы и вычитая сигнал в контрольной лунке. Вопросы 1. На чем основан иммуноферментный анализ? 2. За счет чего происходит сорбция иммуноглобулинов? Как еще можно проводить первичную сорбцию? 3. Для чего проводится обработка поверхности лунок раствором БСА (п.6)? 4. За счет чего происходит сорбция химерного белка? Обоснуйте ответ. 5. Как меняется величина биолюминесцентного ответа от происхождения иммуноглобулинов? За счет чего? Задача 2. Определение модельной эпидемической вспышки с помощью ELIZA Цель работы: знакомство с построением и процедурой твердофазного иммуноферментного анализа, получение экспериментальных навыков для проведения аналитического исследования на базе взаимодействия антигенантитело. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 40 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Анализ биологических образцов, построенный на базе взаимодействия антиген-антитело, называется иммуноанализом. На сегодня иммуноаналитические системы являются наиболее широко распространенными диагностическими инструментами. Одна из разновидностей иммуноанализа – так называемая ELIZA, система названная по первым буквам английского обозначения: enzyme-linked immunosorbent assay (фермент-связанный твердофазный иммуноанализ). Специфичность этого анализа обусловлена высокой аффинностью взаимодействия антиген-антитело. Наличие этого взаимодействия определяют с помощью фермента, который присоединяется к иммуноглобулину. При добавлении к этому комплексу субстрата данного фермента развивается реакция, продукт которой обладает определенной визуальной характеристикой – например, окраской или свечением. По количеству продукта (интенсивности окраски или свечения) судят о количестве антигена. На рис. 3.2 показана последовательность операций, проводимых при иммуноферментном анализе: на поверхности иммунологической лунки иммобилизуется искомый антиген и другие белки (шаг 1), затем вносится раствор первичного антитела к данному антигену (шаг 2), после инкубирования и промывок вносится вторичное антитело, помеченное ферментом (шаг 3), после инкубирования и промывок в лунки вносят субстрат фермента, который при взаимодействии с ферментом дает окрашенный продукт (шаг 4). Окрашивание раствора происходит только в тех лунках, куда вносили образцы, содержащие искомый антиген (рис. 3.2–3.3). Рис. 3.2. Последовательность операций при проведении ELIZA Рис. 3.3. Так выглядит результат ELIZA Современный рынок предлагает иммунодиагностикумы для определения чрезвычайно широкого спектра молекул – от инфекционных агентов до токсинов, гормонов и т. п. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 41 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Для выполнения работы используется микропланшетный денситометр Model 680 ("BioRad", США) (рис. 3.4). Прибор предназначен для измерения оптической плотности растворов в лунках микропланшет для иммуноферментного анализа. Рис. 3.4. Внешний вид микропланшетного денситометра Model 680 ("BioRad", США) Технические характеристики Диапазон измерений – 400–750 нм. Фотометрический диапазон – 0,000–3,5 ОД. Линейность – ± 1 % в диапазоне 0,000–2,000; ± 2 % в диапазоне 2,000–3,000. Погрешность – ± 1 % или 0,01 ОД в диапазоне 0,000–3,000 на 490 нм. К прибору прилагаются 8 оптических фильтров. Время считывания – 6 с на одной длине волны, 10 с на двух длинах волн. Прибор оснащен жидкокристаллическим дисплеем, имеются опции встроенного хранения стандартных кривых и графиков и интерфейс к другому принтеру. Результаты измерений выдаются с помощью встроенного принтера на термической ленте. В рамках данной работы предлагается провести иммуноанализ на присутствие модельного антигена в данных биологических образцах с помощью ELIZA. Образцам будут присвоены имена, и часть из них будет смешана с другими. Таким образом будет смоделировано распространение модельной контактной инфекции среди близкой группы людей. Это распространение Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 42 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ должно быть обнаружено по результатам проведенного анализа ELIZA. Репортерным ферментом, используемым в работе, является пероксидаза хрена. Материалы и оборудование: набор реагентов для проведения анализа ELIZA Immuno Explorer Kit # 166-2400EDU (BioRad), включающий: образец антигена («положительный контроль»); образец первичных антител (ПА); образец вторичных антител, меченых пероксидазой хрена (HRP) (ВА); раствор субстрата пероксидазы (тетраметилбензидина, TMB); 10-кратный раствор фосфатного буфера и NaCl (PBS); 10 % раствор Tween20; набор пластиковой посуды: пробирки Eppendorf (1,5 мл), наконечники для набора растворов, резервуары для промывочных растворов; комплект автоматических пипеток, штативы; иммунологические планшеты стандартного или стрипового типа (12-луночные); бумажные полотенца; микропланшетный денситометр Model 680 («BioRad»). Ход работы: 1. Каждый студент получает образец «своей биологической жидкости». Таблица 3.1 Образцы для проведения анализа ELIZA Immuno Explorer Kit # 166-2400EDU (BioRad) Пробирка Фиолетовая Синяя Зеленая Оранжевая Коричневая Желтая «Желтая» Описание Положительный контоль Отрицательный контроль Первичные антитела Вторичные антитела Субстрат для HRP «инфицированный» субъект Не «инфицированный» субъект Обозначение + _ ПА ВА Суб Х Х Содержание 0,5 мл 0,5 мл 1,5 мл 1,5 мл 1,5 мл 0,75 мл 0,75 мл 2. Часть студентов по указанию преподавателя смешивают свой Х-образец с другим студентом – получается образец Х1. Образцы хранить при 4 °С. 3. Подписать лунки стрипа, как показано на рис. 3.5. 4. В каждую лунку внести по 50 мкл соответствующего раствора. (Используйте только свежие носики!) Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 43 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ 5. Инкубировать 5 мин при комнатной температуре, затем промыть трижды. Рис. 3.5 6. Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ПА инкубировать 5 мин при комнатной температуре. 7. Промыть трижды. 8. Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ВА инкубировать 5 мин при комнатной температуре. 9. Промыть трижды. 10. Свежими носиками внести в каждую лунку по 50 мкл раствора ВА инкубировать 5 мин при комнатной температуре. 11. Наблюдать полученный результат и, заполнив таблицу, проследить распространение условной инфекции при контактах внутри замкнутой популяции. Таблица 3.2 Результаты работы Имя студента Полученный образец (+) или (-) Наличие контактов Вопросы 1. Как иммунная система защищает организм от инфекций? 2. Почему при пересадке органов необходимо принимать иммуносупрессанты? 3. Для чего служит ELIZA? 4. Почему и как работают репортерные ферменты? 5. Зачем необходимы «положительный» и «отрицательный» контроли? 6. Зачем проводят тщательные промывки лунок после каждой стадии? 7. Если получен негативный ответ по результатам иммуноанализа, означает ли это на 100 % отсутствие заболевания? 8. Какой иммунотест можно купить в любой аптеке? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 44 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.1. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Цель работы: знакомство с постановкой процедуры генотипирования на основе вариабельности длины участков коротких тандемных повторов – STR, овладение навыками постановки и проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза. На сегодня наиболее надежным методом идентификации человека является метод отпечатка ДНК (DNA profil) – молекулярно-биологический метод, определяющий генотип данного образца ДНК и однозначно устанавливающий его принадлежность (или её отсутствие) данному индивидууму. Этот подход используется в судебной экспертизе, при поиске людей, массовых катастрофах, установление родителей и пр. Какого типа ДНК последовательности можно использовать для этих целей? Известно, что ДНК человека содержит 3 миллиарда п.о., 99,5 % из которых являются общими для всех людей. Оставшиеся 0,5 % содержат различия, и именно эти полиморфные участки используются для идентификации (генотипирования), в том числе в судебной экспертизе. По всеобщему соглашению используются некодирующие последовательности ДНК, расположенные в разных участках хромосом (локусы). Для судебной экспертизы используются некодирующие последовательности ДНК, содержащие так называемые участки коротких тандемных повторов – STR, от английского словосочетания short tandem repeats. STR представляют собой короткие последовательности ДНК (2, 3, 4, иногда 6, 8 нуклеотидов), которые многократно повторяются в 5’→3’ направлении. На рис. 3.6 показан локус, известный как ТН01, реально использующийся для генотипирования. Его ДНК содержит 4 повтора [ТСАТ]: Рис. 3.6. Нуклеотидная последовательность ТН01 локуса Для этого ТН01 STR локуса существуют более 20 альтернативных форм (аллелей), найденных у людей по всему миру, которые различаются количеством повторов [ТСАТ]. Однако у каждого человека имеется только два аллеля – один унаследован от отца, другой от матери. Для получения ДНКотпечатка исследуемый образец ДНК амплифицируют с помощью ПЦР, с использованием специфических праймеров, последовательность которых комплементарна последовательностям с обеих сторон локусов, и получают миллионы копий двух оригинальных аллелей. Эти копии содержат то же са Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 45 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ мое число STR повторов, что и исходный образец ДНК, и разделяются по размеру с помощью гель-электрофореза. Полученный набор полос является индивидуальной характеристикой индивидуума. Для дискриминации (исключения персоны из числа подозреваемых, например) одного локуса недостаточно. Он может определить разницу между 1000 людьми, два локуса – между 10 000, в обычной практике пользуются результатами генотипирования по трем-пяти локусам. На рис. 3.7 показано, как, используя генотипирование сразу по трем локусам (TH01 gt6-3, D3S1358 gt16-17 и FGA gt21-23), из 13 возможных лиц (обозначены звездочками) можно идентифицировать только одно. В настоящее время существует несколько баз данных по ДНКтипированию. Одной из наиболее обширных является база данных американского федерального бюро расследований (организована в 1998 г.), в которой собраны данные о проходящих по криминальным делам и осужденных лиц, так называемая база CODIS (COmbined DNA Index System). В ней хранятся данные, полученные по генотипированию с использованием 13 локусов. Рис. 3.7. Увеличение количества локусов, использованных при генотипировании, повышает вероятность идентификации индивидуума: 1 – TH01 генотип 6-3; 2 – D3S135 8 генотип 16–17; 3 – FG генотип 21-23 В рамках работы планируется следующий порядок операций: 1) проведение ПЦР предложенных образцов ДНК (один из них принадлежит неизвестному Х и получен с условного места преступления, остальные принадлежат условным подозреваемым лицам А-Г) с определенными парами праймеров; 2) разделение полученных ДНК по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза; 3) определение размеров полученных ДНК с помощью набора стандартных ДНК и сопоставление состава ДНК-фрагментов в полученных образцах для идентификации неизвестной ДНК. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 46 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Материалы и оборудование: набор реагентов для проведения анализа Crime Scene Investigator PCR Basics™ Kit Catalog #166-2600EDU (BioRad), включающий: 5 образцов ДНК; смесь для проведения ПЦР – Master mix; набор праймеров для генотипирования по локусу BXP007; набор маркерных аллельных ДНК; краситель для гелей Orange G; набор пластиковой посуды: пробирки Eppendorf (1,5 мл), пробирки для ПЦР, наконечники для набора растворов, наконечники с фильтрами; комплект автоматических пипеток, штативы; водяная баня; микроцентрифуга, модель 5417R (Eppendorf, США); термоциклер MJ MiniCycler («Био-Рад») ("Био-Рад", США); реактивы и оборудование для проведения гель-электрофореза: горизонтальная камера с подносом для заливки геля и гребенки, генератор постоянного тока, агароза, ТАЕ-буфер; персональный термоциклер MJ MiniCycler ("Био-Рад", США); центрифуга, модель 5417R (Eppendorf, США); комплект, состоящий из горизонтальной камеры с подносом для заливки геля Mini-Sub cell GT (Bio Rad, США) и гребенки, генератора постоянного тока PowerPac (Bio Rad, США). Занятие 1. Постановка и проведение ПЦР с данными образцами ДНК Внимание! Работы с генетическим материалом и при постановке ПЦР требуют специальных условий: 1. Все работы проводятся в перчатках, спецодежде (лабораторные халаты) и очках. 2. В лаборатории нельзя есть, пить, курить, наносить косметику. 3. До и после проведения работ необходимо тщательно вымыть руки. 4. Обо всех нестандартных ситуациях необходимо немедленно уведомить преподавателя. Ход работы: 1. Подписать 5 пробирок для ПЦР: Х, А, Б, В, Г 2. Внести в пробирки ДНК и смесь Master mix + прамеры по табл. 3.1, при этом каждый забор производить свежим носиком с фильтром и сразу закрывать пробирки. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 47 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Таблица 3.1 Обозначение ДНК-матрица Master mix + прамеры Х + имя студента 20 мкл, Х-ДНК 20 мкл А + имя студента 20 мкл, А-ДНК 20 мкл Б + имя студента 20 мкл, Б-ДНК 20 мкл В + имя студента 20 мкл, В-ДНК 20 мкл Г + имя студента 20 мкл, Г-ДНК 20 мкл 3. Поместить пробирки в термоциклер и включить прибор по заданной программе (табл. 3.2). Таблица 3.2 Шаг Начальная денатурация Амплификация Финальное удлинение Хранение* Функция Температура Число циклов Длительность Денатурация 94 °С 2 мин 1 Денатурация 94 °С 30 сек 35 Отжиг 52 °С 30 сек Удлинение 72 °С 1 мин Удлинение 72 °С 10 мин Хранение 4 °С неопределенное 1 Занятие 2. Анализ продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза бору. Ход работы: 1. Приготовить аппарат для гель-электрофореза по инструкции к при- 2. Пробирки после ПЦР отцентрифугировать (пульс-режим). 3. В каждую пробирку внести по 10 мкл раствора красителя Orange G, пользуясь каждый раз свежим носиком и тщательно перемешивая. 4. В лунки геля поместить по 20 мкл образцов в следующем порядке (табл. 3.3). Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 48 МОДУЛЬ 3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Работа 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИНДИВИДУУМА С ПОМОЩЬЮ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ Таблица 3.3 Номер лунки Образец 1 Набор стандартов мол. массы 2 Х 3 А 4 Б 5 В 6 Г 5. Провести электрофорез на агарозном геле в течение 30 мин при напряжении 100 V. 6. Окрасить гель и проанализировать полученные результаты. Вопросы 1. Какие образцы пригодны для проведения ДНК-анализа? 2. Зачем мы использовали ПЦР? 3. Какая разница между аллелем и локусом? 4. Почему для ДНК-типирования ( в частности, в судебной экспертизе) используют ДНК некодирующих участков генома? 5. Что такое Master mix и для чего нужен каждый из её компонентов? 6. Какие стадии включает ПЦР и что происходит на каждой из них? 7. Как происходит визуализация материала после проведения гельэлектрофореза? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 49 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ Цель раздела: ознакомить с микроклональным размножением растений и направлениями его использования, объяснить механизмы процессов, протекающих при размножении в культуре тканей растений. Задачи раздела: – ознакомление с видами и способами выделения эксплантов для проведения микроклонального размножения; – освоение техники этапов и способов микроклонального размножения; – определение роли фитогормонов в процессе микроразмножения на разных его этапах; – управление возможностями увеличения коэффициента размножения растений. Объект: декоративные и сельскохозяйственные растения Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения растений – клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro, неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность (свойство соматических клеток растений полностью реализовать свой генетический потенциал развития с образованием целого организма), то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Процесс клонального микроразмножения состоит из четырех этапов: 1 – выбор растения-донора, изолирование эксплантов (ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания ее жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры; 2 – собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов (или мериклонов – клон1, полученный из меристемной культуры); 3 – укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости – депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (2–10 оС); 4 – выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле. Клон – популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза, или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки. 1 Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 50 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды. На 1-м этапе (введение в культуру) необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры, что осуществляется путем стерилизации растительных тканей, их тщательной промывки в стерильной дистиллированной воде и перенесения на приготовленную стерильную питательную среду. На этом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасиге и Скуга (MS) (табл. 4.1), а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста: ауксины (производные индола, образующиеся в апикальных меристемах и стимулирующие клеточное растяжение) и цитокинины (производные 6-аминопурина, индуцирующие в присутствии ауксина деление клеток и дифференцировку стеблевых почек у каллусов, активирующие рост клеток листа) – в различных сочетаниях в зависимости от объекта (работа 4.1). Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 мес., в результате которого наблюдаются рост меристематических тканей и формирование первичных побегов. На 2-м этапе (собственно размножение, субкультивирование) необходимо получить максимальное количество микропобегов. Как и на 1-м этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасиге и Скуга. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов – ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л. Наиболее трудоемкими являются 3-й и 4-й этапы, от которых зависит успех клонального микроразмножения. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 51 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений Составы наиболее употребляемых питательных сред Составные компоненты Уайта Таблица 4.1 Концентрация компонентов в среде, мг/л MS B5 Нича N6 (Chu) Неорганические вещества NH4N03 - 1650 - 720 - 80 1900 2500 950 2830 СаС12х2Н20 - 440 150 - 166 СаС12 - - - 166 - 750 370 250 185 185 КН2РО4 - 170 - 68 400 (NH4)2SO4 - - 134 - 463 Ca(NO3)2х4 H20 300 - - - - Na2 SO4 200 - - - - NaH2PO4хH20 KC1 KI 19 65 0,75 0,83 150 0,75 - 0,8 H3BO3 1,5 6,2 3 10 1,6 MnSO4х4 H20 5 22,3 - 25 - MnSO4х H20 - - 10 - 3,3 ZnSO4х7 H20 3 8,6 2 10 1,5 NaMoO4х2 H20 - 0,25 0,25 0,25 - MoO3 0,001 - - - CuS04х5H20 0,01 0,025 0,025 0,025 - CoCl2х6H20 - 0,025 0,025 - - 2,5 - - - - - 27,8 27,8 27,8 27,8 - 37,3 37,3 37,3 37,3 0,5 0,5 0,1 100 2 30000 5,8 1 1 10 100 20000 5,5 KNO3 MgSO4х7 H20 Fe(SO4)3 FeSO4х7 H20 Nа2ЭДТАх2 H20 Органические вещества Никотиновая кислота Пиридоксин гидрохлорид Тиамин гидрохлорид Биотин Инозит Глицин Фолиевая кислота Сахароза pH 0,5 0,01 0,01 3 20000 - - 5 0,5 0,5 0,05 100 2 0,5 20000 - Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 0,5 0,5 1 50000 5,8 52 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений На 3-м этапе (укоренение), как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в 2, а иногда и в 4 раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасиге и Скуга или заменяют ее средой Уайта (табл. 4.1), уменьшают количество сахара до 0,5–1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), α -нафтил-уксусную кислоту (НУК) и чащеβ -индолил-уксусную ИУК. В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений – в условиях гидропоники (выращивание растений без почвы на искусственных средах с использованием питательного раствора). Он позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствуют укоренению микропобегов. 4-й этап (адаптация к грунту). Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений – весна или начало лета. Растения с 2–5 листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85–90 °С в течение 1–2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1), торф, дерновую почву, перлит (измельченная горная порода вулканического происхождения) (1:1:1), торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют орхидные, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1). Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20–22 °С), освещенностью (не более 5 тыс. лк) и влажностью (65–90 %). Через 20–30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасиге и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 53 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений Условия культивирования Культивирование изолированных тканей растений на всех этапах происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты, где культивирование проводится в пробирках или других сосудах, должна составлять в зависимости от культуры 1000–10 000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта. Влажность в световой комнате должна быть 60–70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, особенно если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а значит, и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой. Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей – 25–26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29–30 °С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 °С. Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер. Способы клонального микроразмножения Существует несколько способов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, привело к созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения. Исходя из предложенных в литературе путей микроразмножения растений, этот процесс можно осуществлять следующими четырьмя методами: • активацией развития уже существующих в растении меристем (образовательная ткань растений, долго сохраняющая способность к делению и возникновению новых клеток, отличается высокой метаболической активностью) (см. работы 4.1. и 4.3); • индукцией возникновения адвентивных почек (развитие почек из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот) непосредственно на тканях экспланта (см. работу 4.2); • индукцией соматического эмбриогенеза (образование эмбриоидов – зародышеподобных структур, возникающих путем соматического эмбриогенеза в культурах клеток и тканей, напоминающего нормальный зиготический эмбриогенез); Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 54 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Техника культивирования и задачи разных этапов микроклонального размножения растений • дифференциацией адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (неорганизованная, пролиферирующая масса дедифференцированных растительных клеток). Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, поскольку посадочный материал, полученный таким методом, может быть генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Основное отличие образования зародышей in vitro (в стекле) от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем (недифференцированная ткань, локализованная в пределах верхушки побега или кончика корня, представляющая собой куполоподобную структуру) стебля и корня. Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональные клетки. Для формирования эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать из состава питательной среды. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией. Этот метод микроразмножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения (требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений), потому что соматические зародыши представляют собой полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена. Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПО ГОРМОНАЛЬНОМУ И МИНЕРАЛЬНОМУ СОСТАВУ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ Цель работы: освоение приемов проведения 1-го этапа микроразмножения в культуре изолированных тканей. Определение условий, необходимых для проведения следующих этапов микроразмножения (формирования проростков или каллуса в культуре изолированных зародышей). Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 55 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ Культура изолированных зародышей используется в экспериментах для доращивания зародышей, обреченных на гибель в естественных условиях: при проращивании недозрелых семян, для снятия периода их покоя, в исследованиях по отдаленной гибридизации; для проращивания гаплоидных (имеющих один набор хромосом) зародышей культурного ячменя и т. п. Во многих комбинациях межвидовых и межродовых скрещиваний гибридные зародыши гибнут на ранних стадиях развития, поэтому их необходимо своевременно вычленять из семян и проращивать на искусственной питательной среде для сохранения ценных генотипов. Зародыши эффективнее проращивать на агаризованной, а не на жидкой среде. В качестве питательных сред для зародышей используют среды MS, B5, N6 (табл. 4.1) и другие. Наиболее подходящий энергетический источник – сахароза. Для зародышей злаков и их гибридов берут концентрацию сахарозы не менее 30 г/л. В зависимости от степени дифференцированности зародышей используют фитогормональные и другие добавки, в качестве которых применяют цитокинины, ауксины, витамины и аминокислоты. Материалы и оборудование: зрелые колосья или зерна ячменя или пшеницы, замоченные в воде за 1 стуки до выполнения работы; пробирки со стерильной питательной средой, приготовленные в результате выполнения предыдущей работы 1.2; стерильные пинцеты, скальпели; чашки Петри; стаканы со стерильной водой. Ход работы: 1. Зерновки ячменя или пшеницы в обычных условиях предварительно стерилизуют спиртом в течение 2–3 мин, с зародыша снимают защитную пленку, покрывающую зерно. Необходимое для эксперимента количество зерновок одного образца помещают в марлевые упаковки, куда кладут небольшие листки (1 см2) с указанием генотипа донорного растения, и скрепляют их шпагатом. 2. В условиях бокса стерилизуют упаковки в растворе диацида (токсическое вещество) 10 мин, потом трехкратно промывают в стаканах со стерильной водой и переносят в чашки Петри. 3. Пинцетом и скальпелем раскрывают упаковку и раскладывают зерновки на марлю, перевернув их бороздкой вниз и, придерживая пинцетом, скальпелем рассекают (если она не удалена) оболочку и выделяют зародыш, стараясь его не повредить. 4. Зародыш переносят в пробирку с питательной средой, располагая его щитком вниз. 5. Используют три варианта среды: Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 56 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ – MS; – MS + 2,4-Д (1 мг/л) и ИУК (2 мг/л ); – B5 или N6; 6. Культуральные пробирки закрывают фольгой. На каждой пробирке отмечают дату введения и шифр вводимого в культуру генотипа. Культивирование осуществляют при 22–25 оС, 16-часовом световом дне и освещенности 1000 лк. 7. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована записью в журнале после введения экспланта донорного растения в культуру, а затем при проведении наблюдений и пассажах (перенос или пересадка клеток из одной культуральной емкости в другую) на свежие питательные среды должны быть отражены все изменения. 8. Оформить табл. 4.2 и заполнить эту таблицу после окончания манипуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы). Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам. 9. В табл. 4.2. после учета характеристик (заражение, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза (процесс дифференциации в каллусных клетках, сопровождающийся образованием органов: корней, побегов, de novo), в процессе последующего их наблюдения внести изменения в остальные две графы. 7 дн. 14 дн 21 дн. 28 дн Изменения 7 дн. 14 дн. 21 дн. Результат 28 дн. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум вариант Наличие заражения дата Кол-во введенных эксплантов, шт. Вариант среды Номер пробирки Вид экспланта, культуры, генотип Таблица 4.2 Наблюдение параметров роста культур изолированных тканей растений 57 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ Обработка полученных результатов Разноплановость и разнообразие растительного материала, вводимого в культуру, наличие нескольких этапов культивирования и длительность наблюдений диктуют необходимость строго учета параметров культивируемых объектов. Поскольку каждый эксплант вводится в отдельную пробирку (сосуд), то эта проба (пробирка) должна быть маркирована после введения экспланта в культуру, а его параметры зафиксированы в учетной записи. Затем при проведении наблюдений и при пассажах должны быть отражены все изменения объектов, произошедшие в период культивирования. Длительность наблюдений каждой пробы до следующей пересадки составляет не более четырех недель. При проведении экспериментальных работ по введению тканей растений в культуру и следующих этапов необходимо для каждого задания оформить табл. 4.2 и заполнить эту таблицу после окончания манипуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы) и после учета характеристик в процессе последующего их наблюдения (остальные две графы). В графе «результат» указываются дата и вариант окончания данного этапа культивирования (следующий пассаж или удаление в связи с заражением, высадка в грунт и т. п.). Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам. Вопросы 1. Что показывает анализ полученных результатов? 2. Какие можно сделать выводы по влиянию гормонального состава среды на процессы регенерации в культуре зрелых зародышей? 3. Какие условия лучше использовать для проведения дальнейшего микроразмножения? Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА Т К АНЯХ Э К СПЛ АНТ А Цель работы: дать представление о возможностях второго способа микроразмножения растений и роли фитогормонов в этом процессе. Получить растения-регенеранты путем прямого органогенеза у бегонии и сенполии – комнатной фиалки. Метод микроклонального размножения основан на способности изолированных частей растения восстанавливать недостающие органы при благоприятных условиях питательной среды и таким образом регенерировать целые растения. Практически каждая клетка может стать источником целого растения, и это можно наблюдать в культуре изолированных тканей. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 58 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют βиндолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или α-нафтилуксусную кислоту (НУК). Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений. Им были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичной чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) – из сегментов гипокотиля (участок стебля проростка семенного растения ниже семядольного узла), котиледона (первый лист зародыша растения в семени), листьев; лук, чеснок – из ткани донца луковиц; салат цикорный – из сегментов листовых пластинок; петуния – из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрепто-карпус, эшинапсус – из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений – из изолированных зрелых и незрелых зародышей. НУК; Материалы и оборудование: листья бегонии и сенполии; гипохлорит натрия 5%; пробирки со стерильной питательной средой – MS; – MS с добавлением: а) 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л; б) 6-БАП – 2 мг/л и НУК – 0,05 мг/л: – MS + витамины по прописи Нича (табл. 4.1) + 6-БАП – 0,4 мг/л + – 0,1 мг/л; стерильные пинцеты, скальпели, чашки Петри; стаканы со стерильной водой. Ход работы: 1. Срезают молодые, полностью развернувшиеся листья с черешками с растения, выращенного в комнатных условиях. 2. Листья дезинфицируют с помощью раствора гипохлорита натрия 5,25 % в течение 10 мин. 3. Трижды ополаскивают стерильной водой и переносят в стерильные чашки Петри. 4. Листья разрезают на фрагменты площадью 5 мм2 и пинцетом помещают их в пробирки проксимальной (расположенной ближе к центру тела Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 59 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА или к его медианной плоскости) стороной вниз на поверхность агаризованной среды. 5. Листья бегонии высаживают на среду MS и MS, содержащую добавки витаминов по прописи Нича, и фитогормоны – 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л. 6. Листья сенполии на среду MS с добавлением: а) 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л; б) 6-БАП – 2 мг/л и НУК – 0,05 мг/л. Культивирование осуществляют при 22–25 оС, 16-часовом световом дне и освещенности 1000 лк. Придаточные побеги образуются без формирования каллуса прямо из экспланта примерно через 4 недели. По окончании 4–6 недель делят каждую культуру, где образовались добавочные побеги, и ее фрагменты (отдельные побеги) переносят на среду того же состава. Эту процедуру повторяют до получения необходимого числа побегов. Укореняют побеги, пересаживая их каждый по отдельности на агаризованную среду MS, содержащую НУК – 0,1 мг/л. Укоренившиеся побеги пересаживают в почву. Обработка полученных результатов: 1. Оформить табл. 4.2 (работа 4.1) и заполнить ее после окончания манипуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы). Количество строк должно соответствовать введенным в культуру эксплантам. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована после введения экспланта (отметить его размер) в культуру. 2. По прошествии 1–2…4 недель в таблицу вносят данные об изменениях, произошедших в пробирках (заражение, изменение цвета и размеров экспланта, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза), заполняя остальные две графы. Вопросы 1. Каково влияние гормонального состава среды на процессы индукции возникновения адвентивных почек и развития из них побегов бегонии и сенполии? Проанализировать полученные результаты и сделать выводы. 2. Какие условия лучше использовать для проведения микроразмножения декоративных культур? 3. Зачем нужны изменения гормонального состава среды при пересадке культур? 4. Каков возможный коэффициент микроразмножения комнатных растений? Рассчитайте его. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 60 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ Цель работы: ознакомить с основным способом клонального микроразмножения растений и путями его использования. Провести выделение апикальных почечных меристем (недифференцированная ткань, локализованная в пределах верхушечной почки, представляющаяся обычно в виде блестящей куполоподобной структуры – дистальной к самому молодому листовому примордию и размером, менее чем 0,1 мм в длину при вырезании) картофеля и осуществить введение их в культуру (задание 1). Дать представление о следующих этапах микроразмножения на примере микрочеренкования пробирочных растений картофеля (задание 2) и дальнейшей их адаптации к грунту (задание 3). Активация развития уже существующих в растении меристем – это основной метод клонального микроразмножения растений. Главное направление его использования – получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала, путем введения в культуру меристемных тканей апексов (верхушка побега и корня, состоящая из первичной меристемы, обеспечивающей формирование всех частей и первичных тканей побега) и пазушных почек органов стеблевого происхождения. Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях растений впервые высказано Чуигом в 1938 и Уайтом в 1943 гг. Начиная с 1950-х гг. были предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстрорастущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться вплоть до полного отсутствия. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время. Строение точки роста растений имеет свою специфику: дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, которая состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков Рис. 4.1. Схема (примордий – первый, первичный зачаточный лист) мест формирования (рис. 4.1). У разных растений средний диаметр растительных меридо 200 мкм, высота от 20 до 150 мкм. В более низких стем на побеге: 1 – верхушечные, 2 – бо- слоях дифференцирующиеся клетки меристемы обраковые, 3 – промежу- зуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы. точные Известно, что успех клонального микрораз Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 61 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ множения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения. С другой стороны, чем больше размер выделяемого экспланта, тем больше вероятность присутствия в нем вируса. Вместе с тем зона, свободная от вирусов, различна для вирусов и зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле (влагалищный, первый лист злаков, в отличие от настоящих, не имеет листовой пластинки и представляет собой замкнутую трубку, в которую заключены листовые зачатки и конус нарастания) злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм. Наиболее часто в нашей стране метод оздоровления посадочного материала в культуре изолированных тканей растений используется для картофеля. Установлена неодинаковая эффективность при оздоровлении различных сортов картофеля от вирусов и даже штаммов одного вируса. Меристемы большего размера свободны от вируса скручивания листьев картофеля, Y и A-вирусов, наименьшего – от M, X и S-вирусов. Оздоровить картофель от последних наиболее трудно. В числе многочисленных болезней картофеля особое место занимают вирусные, вироидные и микоплазменные. Большинство из них способно передаваться через клубни, которые в случае заражения становятся резерваторами инфекции. Кроме того, эти болезни обладают способностью быстро распространяться. В результате сорт постепенно теряет свою первоначальную продуктивность и вырождается. Продление жизни и длительное сохранение репродуктивных качеств сорта достигаются за счет хорошо налаженного семеноводства или поддерживающей селекции, суть которой сводится к сохранению репродуктивных качеств сорта в системе элитного семеноводства, а также ежегодном производстве элиты в необходимом объеме. Качество этой элиты обеспечивается проведением семеноводства на безвирусной основе с применением биотехнологических методов. Их регулярное применение обеспечивает повышение урожайности картофеля в 2 раза. Задание 1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля Культура изолированных апикальных меристем используется для получения свободного от вирусов посадочного материала и для его микроклонального размножения. Апикальная меристема обычно совершенно свободна от вирусов и представляет собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мк) и шириной 0,25 мм. Это минимальный размер меристемы, при котором морфогенетическая способность еще сохраняется. Поскольку меристему бывает трудно вычленить без повреждений, часто ее отделяют с двумя листовыми примордиями (апексы размером 100–250 мкм, рис. 4.1). Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 62 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ Для повышения эффективности оздоровления картофеля применяют сочетание метода верхушечной меристемы с термо- или химиотерапией. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие. Выращенные из апикальных меристем безвирусные растения могут быть размножены и высажены в теплицы для получения безвирусных клубней. Для ускоренного размножения оздоровленного материала используются также клубни, образовавшиеся на безвирусных растениях в пробирках. Материалы и оборудование: клубни картофеля; бинокулярная лупа; скальпели (или лезвия), зажатые в держателе с удлиненной ручкой; препаровальные иглы; пенициллиновые флаконы со стерильной питательной средой MS, содержащей кинетин (0,5 мг/л) и активированный уголь и др.; стаканы со стерильной дистиллированной водой; чашки Петри, скальпели, пинцеты. Ход работы: Подготовка ростков клубней для вычленения меристем заключается в их проверке на исходную зараженность вирусами, поверхностном обеззараживании от грибных и бактериальных инфекций. Клубни картофеля хранят при температуре 4–6 °С, затем проращивают на свету до образования ростков 2–3 см длины при 20–22 °С. 1. Клубень картофеля промыть в проточной воде, отделить ростки. 2. Ростки упаковать в марлевые салфетки, опустить в раствор 0,1 % диацида на 3-5 мин., затем не менее трех раз промыть стерильной водой, опустить в стерильную чашку Петри, добавив туда воды для предотвращения высыхания эксплантов. Работы по вычленению проводят в ламинар-боксе. 3. Перед вычленением с помощью препаровальной иглы под бинокулярным микроскопом с верхушки ростка удалить покровные листочки, последовательно обнажая боковые и верхушечные меристемы с примордиальными листочками. 4. Меристему (рис. 4.1), включающую кусочек ткани размером 100–250 мк без листовых зачатков (примордиев), вычленить иглой, зажатой в цанговый держатель. Для этого можно использовать и специальную заточенную дисцизионную (разовую иглу от шприца) иглу или кусочек лезвия, зажатый в цанговый держатель. Эту операцию лучше проводить под бинокулярным микроскопом с 24-кратным увеличением с масштабной сеткой. Вычленить можно как верхушечную, так и боковые меристемы – точки роста. Каждую операцию проводят отдельным простерилизованным инструментом. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 63 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ 5. После вычленения меристему на острие иглы перенести на поверхность питательной среды в пробирку или пенициллиновый флакон и закрыть ее фольгой. 6. Штативы с пробирками или поднос с флаконами поместить в световую комнату. 7. Дальнейшее культивирование проводить в световой комнате на стеллажах. Обработка полученных результатов: 1. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована после введения экспланта в культуру, а затем при проведении наблюдений и пассажах на свежие питательные среды должны быть отражены все изменения. Оформить табл. 4.2 и заполнить ее после окончания манипуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы). Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам. 2. В табл. 4.2 после учета характеристик (заражение, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза) в процессе последующего их наблюдения внести изменения в остальные две графы. а б в Рис. 4.2. Этапы развития апикальной меристемы картофеля на питательной среде, содержащей активированный уголь: а – меристема после ведения в культуру; б – начало развития адвентивных почек; в – формирование адвентивных побегов (фото Н.В. Зобовой) В течение периода регенерации (морфогенетический ответ на стимул, который приводит к образованию органов, зародышей или целых растений) разросшуюся ткань меристемы пересаживают на новую порцию той же среды для дальнейшего развития адвентивных почек. Образовавшиеся проростки пересаживают на новую по составу среду. Растения-регенеранты, содержащие до пяти междоузлий, используют для черенкования (задание 2). Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 64 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ Вопросы 1. Зачем в питательную среду при культивировании картофеля добавляется активированный уголь? 2. Какие выводы можно сделать, проанализировав полученные результаты культивирования меристем? 3. Какие условия лучше использовать для проведения дальнейшего микроразмножения картофеля? Задание 2. Микроразмножение картофеля черенкованием побегов Клональное размножение оздоровленного картофеля решает вторую не менее важную задачу – получение оздоровленного исходного материала в количествах, достаточных для включения его в семеноводческую работу. Одним из наиболее распространенных способов ускоренного размножения картофеля является черенкование в пробирочной культуре. Главное требование к питательной среде – обеспечение высокого коэффициента размножения, то есть максимального выхода растений из микрочеренков в минимальные сроки. Этому требованию в наибольшей степени отвечает среда с минеральной основой по Мурасиге – Скуга с добавлением кинетина (0,04 мг/л), ИУК (1,0 мг/л) и феруловой кислоты (0,02 мг/л). Суть метода сводится к следующему, растение извлекают пинцетом из пробирки и разрезают на микрочеренки, содержащие участок стебля 1,0–1,5 см с одним междоузлием (рис. 4.3, а). Черенки высаживаются на питательную среду (рис. 4.3, б). Размножение основано на подавлении апикального доминирования (подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки) и активации путем удаления верхушечного побега пазушных меристем, из которых при помещении на питательную среду развивается побег (рис. 4.3, в). Растения-регенеранты, полученные в культуре тканей, должны быть подвергнуты анализу на наличие вирусной инфекции. Контроль растенийрегенерантов проводят с помощью нескольких методов. Электронно-микроскопический анализ основан на визуальном выявлении вирусов. Для приготовления препаратов при первом и последующих черенкованиях из нижней части растения отбирают один черенок с хорошо развитым листом. Чтобы получить достоверные результаты, необходимо при последовательных черенкованиях провести трехкратную диагностику по 2–4 препарата каждый раз. Биологический метод основан на определении инфекционных свойств вирусов с помощью растений-индикаторов, реагирующих определенными симптомами на тот или иной вирус. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 65 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ а б в Рис. 4.3. Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием: а – микропобег – объект черенкования (линиями отмечены места разрезов при черенковании); б – микрочеренок на питательной среде; в – развитие растения картофеля из черенка (фото Н.В. Зобовой) Хорошие результаты дает использование для контроля зараженности растений наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на использовании антител, меченых ферментом. За рубежом этот метод известен как ЭЛИЗА-тест. В качестве фермента обычно используют щелочную фосфатазу с субстратом – n-нитрофенилфосфатом, а также пероксидазу хрена с 5-аминосалициловой кислотой или ортофенилдиамином в качестве субстратов. Материалы и оборудование: пробирочные растения картофеля (сформированные в результате выполнения задания 1); пробирки с модифицированной питательной стерильной средой MS с добавлением кинетина – 0,04 мг/л, ИУК – 1,0 мг/л; стерильные скальпели и чашки Петри. Ход работы: 1. Выросшие в пробирках растения картофеля с 5–6 листочками перенести из световой комнаты в бокс. 2. Пробирочное растение картофеля вынуть пинцетом из пробирки и поместить его в чашку Петри, разрезать на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой), часть стебля над листом при этом должна быть в 2–3 раза Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 66 МОДУЛЬ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ Работа 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ меньше, чем часть ниже листа. Необходимо соблюдать строгую стерильность. 3. Черенки перенести на свежую питательную среду в пробирки, заглубив нижнюю часть стебля в среду. 4. Закрыть пробирки фольгой, поставить в штатив и перенести в световую комнату. Черенкование проводят с интервалом 14–21 день. Вопросы 1. Сколько черенков можно получить из клубней одного растения картофеля за три месяца? 2. С помощью каких процедур увеличивается эффективность оздоровления растений в культуре апикальных меристем? 3. Какие способы микроразмножения растений используются при получении безвирусного посадочного материала картофеля? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 67 МОДУЛЬ 5 Работы не предусмотрены. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 68 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Цель: знакомство с основными подходами получения целевых продуктов биотехнологии, их анализа современными методами жидко-жидкостной хроматрграфии и хромато-масс-спектрометрии. Задачи: – общая характеристика выделения и очистки целевых продуктов биотехнологии и освоение метода экстракции на примере биоразрушаемых полимеров; – освоение метода гель-проникающей жидко-жидкостной хроматографии на основе высокоэффективной хроматографической системы Breeze фирмы Waters (США); – освоение метода хромато-масс-спектрометрии на примере анализа жирных кислот бактерий с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 5975Inert (Agilent, США). Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнологического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на два большие группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. Стадия получения конечного целевого продукта в биотехнологии существенно различается в зависимости от природы продукта и его локализации. Если продукт находится в культуральной жидкости, то он, как правило, образует очень разбавленные растворы и суспензии, содержащие, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, поэтому необходимо использовать методы, позволяющие провести разделение, например, тот или иной вид хроматографии. Если целевой продукт локализуется в клетке, то нужно использовать более сложный подход к его извлечению из клетки. Заключительная стадия биотехнологического производства – приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Независимо от локализации целевого продукта на первом этапе его очистки проводят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Иногда сепарации предшествует специальная обработка – изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков или флокуллянтов для более эф Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 69 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ фективного отделения биомассы и стабилизации продукта. Существует несколько способов сепарации. Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например, интерферонов, гормонов), вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы. К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления). Физические способы разрушения клеток более экономичные, чем химические и химико-ферментативные. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща неизбирательность: обработка может влиять на качество получаемого продукта. Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты или других детергентов, клетки дрожжей – зимолиазой улитки или ферментами грибов, актиномицетов. Можно использовать автолиз клеток при лимитировании по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагом. За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок. Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. Однако применяют более высокоскоростное центрифугирование или фильтры с меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессах клеточные стенки отбрасывают как балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта. Для идентификации структуры и степени чистоты биотехнологического продукта применяют различные методы, среди которых наиболее значимыми сегодня являются хроматография и масс-спектрометрия. Хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия оказались столь значимы для всех естественных наук, что Федерация европейских химических обществ приводит имя Цвета наряду с четырьмя другими русскими именами (Ломоносов, Менделеев, Бутлеров и Семенов) в числе ста выдающихся химиков прошлого. В настоящее время хроматография представляет собой: самый распространенный и совершенный метод разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц; Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 70 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей; самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения; препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде; мощную отрасль научного приборостроения. Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены более 1000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе "Геном человека". Диапазон применения хроматографических методов огромен: от анализа атмосферы планет Солнечной системы до полного анализа содержимого одной живой клетки. Исключительную роль хроматография играет в химической, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно-бумажной и многих других отраслях промышленности, прежде всего в технологическом контроле и поддержании оптимального режима производства, в контроле исходного сырья и качества готовой продукции, анализе газовых и водных сбросов производства. В биотехнологии хроматография является основным процессом выделения вирусов гриппа, энцефалита, бешенства и ящура, очистки вакцин, промышленного производства инсулина, других белков и полипептидов. На промышленную основу поставлено хроматографическое выделение фуллеренов, сапонинов, интерлейкина-2 человека, гистонов, плазмид, ДНК, антибиотиков и многих других ценнейших природных и синтезируемых веществ. Масс-спектрометрия – это физико-химический метод измерения отношения массы ионов к их заряду. Приборы, которые используются в этом методе, называются масс-спектрометрами или масс-спектрометрическими детекторами, которые имеют дело с материальным веществом, состоящим, как известно, из мельчайших частиц – молекул и атомов. Масс-спектрометры устанавливают молекулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный состав, а также пространственную структуру расположения атомов. Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, а также в биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать превращения вещества в процессе химической реакции, что важно для уста- Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 71 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ новления ее механизмов. Существенное отличие масс-спектрометрии от других аналитических физико-химических методов состоит в том, что оптические, рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами (например, такие методы как ИК-, УФ-, КР- и ЯМР), а масс-спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества и, в отличие от вышеуказанных методов, является деструктивным методом анализа, то есть из образующихся при разрушении молекулы ионов исходная молекула регенерироваться не может. Метод масс-спектрометрии основан на ионизации молекул, разделении ионов в газовой фазе, которое происходит в зависимости от соотношения их массы и заряда, и регистрации разделенных ионов. В данном разделе лабораторных работ будут использованы новейшие приборы Центра коллективного пользования СФУ, а также оборудование, расположенное на кафедрах и лабораториях Института фундаментальной биологии и биотехнологии. Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Завершающая стадия биотехнологического процесса – выделение целевого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от локализации продукта и его химической природы. Если продукт находится в культуральной жидкости, то он, как правило, образует очень разбавленные растворы и суспензии, содержащие, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, поэтому необходимо использовать методы, позволяющие провести разделение, например, тот или иной вид хроматографии. Если целевой продукт локализуется в клетке, то необходимо использовать более сложный подход к его извлечению из клетки. Независимо от локализации целевого продукта, на первом этапе его очистки проводят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Существует несколько способов сепарации. 1. Флотация – разделение мелких частиц и выделение капель дисперсной фазы из эмульсий. Этот метод основан на различной смачиваемости частиц жидкостью и на их избирательном прилипании к поверхности раздела. Основные виды флотации – пенная, масляная и пленочная. Наибольшее распространение в биотехнологии получила пенная флотация, которая заключается в следующем: культуральную жидкость с биомассой микроорганизмов непрерывно вспенивают воздухом, подаваемым снизу вверх под давлением. Клетки и их агломераты «прилипают» к пузырькам тонкодиспергированного воздуха и всплывают вместе с ними, собираясь в специальном отстойнике. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 72 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Этот метод идеален для дрожжей, которые имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. 2. Фильтрация. В этом методе используется принцип задержки биомассы на пористой фильтрующей перегородке. В настоящее время используются разные фильтры: барабанные, дисковые, ленточные, тарелочные, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы различной конструкции, мембранные фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток, однако при этом эффективность фильтрации практически не снижается, так как по мере прохождения жидкости диаметр капиллярных каналов сужается из-за прилипания частиц к стенкам. По мере утолщения слоя биомассы на фильтре скорость протока жидкости падает. Для фильтров непрерывного действия, рассчитанных на длительное действие, предусматривают системы автоматического удаления слоя биомассы, забивающего поры. Биомассу сдувают с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. Такой способ удаления биомассы характерен для барабанного вакуум-фильтра. Существуют также фильтры, предназначенные для однократного или многократного периодического использования. Среди них выделяют мембранные фильтры, через которые возможно проводить фильтрацию очень разбавленных растворов. Однако проблемой использования таких фильтров является их закупорка клетками, белками, коллоидными частицами. Приемы сдувания или срезания для этих фильтров не приемлемы, так как они быстро разрушаются. Один из путей преодоления этих проблем – покрытие мембран гидрофильным слоем. В настоящее время создана целая отрасль по производству мембранных фильтров и существуют огромное количество фирм, которые поставляют фильтры для всех задач биотехнологии. 3. Центрифугирование. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется две фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость. Центрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем вышеперечисленные методы сепарации. Поэтому оно оправдывает себя, если, во-первых, суспензия фильтруется медленно, во-вторых, необходимо максимально освободить культуральную жидкость от частиц, в-третьих, нужно наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодический режим. Центрифугирование и фильтрация могут проходить одновременно, этот процесс реализован в фильтрационных центрифугах. Наиболее перспективны для осаждения центрифуги-сепараторы, в которых биомасса осаждается на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки. Следующим этапом получение целевого продукта является разрушение клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами. К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 73 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления). Физические способы разрушения клеток более экономичные, чем химические и химикоферментативные. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща неизбирательность: обработка может влиять на качество получаемого продукта. Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. За дезинтеграцией клеток следует этап отделения клеточных стенок. Для этого используют те же методы фильтрации и центрифугирования. Однако применяют более высокоскоростное центрифугирование или фильтры с меньшим диаметром, чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасывают как балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции или адсорбции. В данной работе для выделения целевого продукта будет использован метод экстракции органическим растворителем. Экстракция – это процесс избирательного извлечения одного или нескольких растворимых компонентов из твердых тел или растворов с помощью жидкого растворителя – экстрагента. Различают твердо-жидкостную и жидко-жидкостную типы экстракции. При твердо-жидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую; при жидко-жидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Жидко-жидкостную экстракцию органическими растворителями часто применяют для извлечения из культуральной среды антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов. Витамин В12 экстрагируют фенолом, высокоспецифичным экстрагентом является бензиловый спирт. Такие фосфолипиды, как фосфатидилэтанол и фосфатидилхолин, извлекаются хлороформом. Эффективность экстракции может быть повышена за счет повторной экстракцией свежим экстрагентом, выбором оптимального растворителя, нагреванием экстрагирующего агента или экстрагируемой жидкости, понижением давления в аппарате для экстракции. Во многих случаях процесс нагревания может быть губительным для целевого продукта. Для предотвращения этого используется криоэкстракция, которая осуществляется растворителями, кипящими при низких температурах и находящимися при комнатной температуре в газообразном состоянии. Для экстракции неполярных соединений используют жидкий пропан или бутан. При последующем осторожном нагревании до 0 °С растворитель улетучивается и остается продукт в чистом виде. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 74 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Экстракция хлороформом используется при выделении из бактериальной биомассы полигидроксиалканоатов (ПГА), представляющих собой полиэфиры 3-гидроксиалкановых кислот с разной длиной цепи. Основные структуры ПГА представлены следующим образом: n = 1 R = водород – поли (3-гидроксипропионат), R = метил – поли (3-гидроксибутират), R = этил – поли (3-гидроксивалерат), R = пропил – поли (3-гидроксигексаноат), R = пентил – поли (3-гидроксиоктаноат), R = нонил – поли (3-гидроксидодеканоат), n = 2 R = водород – поли (4-гидроксибутират), n = 3 R = водород – поли (5-гидроксивалерат). Полимер хорошо растворяется в хлорсодержащих органических растворителях, таких как хлороформ, трихлорметан, трихлорэтан, но не растворяется в спиртах, ацетоне, гексане, воде. Эти свойства полимера используются при его отделении от липидов после извлечения из бактериальных клеток. Существует несколько подходов для извлечения ПГА из клеток. Сырую биомассу, собранную центрифугированием, заливают 20 объемами хлороформа и оставляют на 15–20 часов в ёмкости при комнатной температуре при периодическом перемешивании. Далее разделяют биомассу и хлороформ с полимером в делительной воронке, нижний слой хлороформа собирают, а остаток биомассы еще трижды экстрагируют хлороформом для усиления полноты экстракции. Объединенные хлороформные экстракты полимера и липидов концентрируют, добавляют двойной объем спирта или гексана. Выпавший в осадок полимер отделяют от смеси растворителей. Второй подход, используемый в лабораторных условиях, заключается в следующем: предварительно лиофилизированная биомасса закладывается в патрон аппарата Сокслет, и полимер экстрагируется хлороформом в течение нескольких часов. Третий подход выделения полимера заключается в удалении из биомассы неполимерных компонентов и получении гранул полимера. Для этого обычно обрабатывают биомассу детергентами, такими как додецилсульфат натрия, ЭДТА или лизирующими ферментами. Такое извлечение особенно эффективно для выделения полимера из клеток с высоким его содержанием. Однако чаще всего гранулы полимера, выделенные после химической или ферментативной обработки биомассы, загрязнены остатками бактериальных клеток и требуется дополнительная экстракция полимера и его осаждение. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 75 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Наиболее перспективными для биотехнологического производства биоразрушаемых полимеров ПГА являются водородокисляющие бактерии, группа грамотрицательных аэробных бактерий, способных накапливать полимер более 90 % на сухое вещество. Водородные бактерии широко распространены в природе. Они характеризуются способностью к росту как на минеральном субстрате за счет энергодающей реакции окисления водорода и использования углекислоты в качестве конструктивного субстрата, так и на различных органических соединениях. Специфика хемолитотрофии на водороде заключается в функционировании в клетках водородактивирующей системы. Активацию водорода и передачу электронов в ЦПЭ производит гидрогеназный ферментный комплекс по реакции: Н2 → 2Н+ + 2e. Продукты катаболизма – АТФ и восстановительные эквиваленты в виде НАДН потребляются главным образом при ассимиляции углекислоты в восстановительном пентозофосфатном цикле и на путях синтеза аминокислот. Среди ранних продуктов фиксации углекислоты – фосфоглицериновая кислота и первично синтезируемые аминокислоты (глутаминовая, аспарагиновая, аланин), служащие субстратом для синтеза всех остальных аминокислот. В качестве запасных соединений бактерии накапливают полимеры гидроксипроизводных жирных кислот и полифосфаты. Рост и направленность биохимической программы синтеза клеточных макромолекул у водородных бактерий определяются условиями внешней среды, а также концентрацией биогенных элементов, рН и температуры среды. Цель работы: знакомство с основными методами получения целевого продукта биотехнологии – биоразрушаемого полигидроксиалканоата. Материалы и оборудование: суспензия бактерий Ralstonia eutropha B-5786, выращенных в условиях лимита по азоту; высокоскоростная центрифуга Avanti J-26XPI (Beckman Int., США); аналитические весы; диспергатор IKA (Германия); делительная воронка объемом 1–2 л; роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Германия); водяная баня; обратный холодильник; хлороформ; спирт этиловый; гексан; серная кислота; безводный сернокислый натрий; Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 76 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА воронки; колбы со шлифом; бюксы; водоструйный насос; высокоскоростная центрифуга Avanti J-26XPI (Beckman Int., США); роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Швейцария). Характеристика оборудования Для осаждения биомассы бактерий используется высокоскоростная центрифуга (рис. 6.1), позволяющая центрифугировать большие объемы (до 6 л) бактериальной суспензии при 6000 об/мин в условиях пониженной температуры. Рис. 6.1. Высокоскоростная напольная центрифуга с охлаждением Avanti J-26XPI Beckman Coulter Int.S.A., США Технические характеристики центрифуги Размеры: 865х876х711 мм. Максимальная скорость вращения 26 000 об/мин. Максимальное ускорение 82 000 g. Максимальная вместимость ротора – 6 л. Контроль скорости: ±10 об/мин. Объем центрифужных пробирок от 1,5 до 1000 мл. Система охлаждения камеры: экологически безопасный хладоагент. Устанавливаемый температурный режим камеры: от –10 0С до 40 0С. Контроль температуры камеры ±2 0С. Контроль дисбаланса ±2,5 % при загрузке в противоположные позиции. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 77 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА ные). Тип двигателя: вентильно-индукторный. Программы, устанавливаемые пользователем: 30 программ (двухэтапУстановка времени: до 180 мин. Динамическое определение ротора: автоматическое. Набор роторов. Ротор на 8 стаканов – 8 x 50 мл, 26000 об/мин, 81770 g. Ротор на 6 пробирок: 6х1000мл, 8000 об/мин, 15910 g. Для отгонки растворителей после экстракции полимера используется роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Швейцария) высокой производительности (рис. 6.2). Рис. 6.2. Роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Швейцария) Технические характеристики Роторный испаритель позволяет проводить операции по упариванию растворов термолабильных веществ в органических и водных растворителях в условиях, предотвращающих их разложение, в том числе в вакууме с возможностью автоматической регулировки уровня вакуума, подачи инертных газов в систему, улавливания растворителей и работы без использования ло- Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 78 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА вушек жидкого азота, а также проведение сопутствующих операций, включая сушку твердых веществ, перекристаллизации и т. п. 1. Возможность использования отгонных колб объемами от 50 мл до 4 л с массой колбы с растворителем до 3 кг ( в случае опытных наработок). 2. Возможность запитки отгонной колбы без остановки операции отгонки (в случае опытных наработок). 3. Наличие электромеханического подъемника отгонной колбы. 4. Скорость вращения отгонной колбы, регулируемая в пределах от 0 до 280 об/мин. 5. Нагревательная баня с цифровым дисплеем индикации заданной и реальной температуры с регуляцией температуры в пределах от комнатной до 180 0С. 6. Вакуумное уплотнение, устойчивое к органическим растворителям и агрессивным средам. 7. Наличие инертного к агрессивным средам и растворителям безмасляного вакуумного насоса, обеспечивающего производительность до 30 л/мин и вакуум до 7 мм рт. ст., обеспечивающего легкую очистку клапанов, оснащенного ловушкой между роторным испарителем и насосом и ловушкой для остаточных количеств растворителей, устанавливаемой за насосом. 8. Наличие вакуумного контроллера, обеспечивающего задание вакуума в мм рт. ст. или миллибарах, автоматическое поддерживание заданного вакуума в вакуумируемой системе, индикацию заданного и реального вакуума. 9. Оборудование рассчитано на напряжение в сети 220 В, частоту 50 Гц. Ход работы: 1. Суспензию бактериальных клеток поместить в центрифужные стаканы и уравновесить на весах. Далее уравновешенные стаканы поместить в ротор центрифуги Avanti J-26XPI. Центрифугирование проводить в течение 20 мин при 7000 об/мин. 2. После остановки центрифуги вынуть стаканы, слить супернатант, из твердого остатка биомассы, осевшей на дно стакана, взять навеску 1 г на аналитических весах и перенести в стакан дезинтегратора. 3. Для определения содержания сухого вещества в биомассе в предварительно взвешенный бюкс (А г) поместить 200–250 мг сырой биомассы, взвесить бюкс с сырой навеской (Б г), поставить в сушильный шкаф и сушить в течение 24 ч при температуре 105 °С. 4. После высушивания бюкс вынуть из шкафа и охладить в эксикаторе. Охлажденный бюкс взвесить и записать навеску (В г). Затем снова поставить бюкс с высушенной биомассой в сушильный шкаф и сушить пробу в течение 0,5 ч. Процедуру охлаждения бюкса повторить и снова взвесить. Если вес Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 79 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА бюкса не изменился, то проба высохла до абсолютно сухого веса и можно рассчитать сухой вес биомассы по формуле Сухой вес = (В−А)х100/(Б−А) (%). 5. К сырой биомассе в стакане дезинтегратора добавить 10 мл смеси хлороформа и спирта (2:1 по объему) и обработать биомассу на дезинтеграторе IKA в течение 30 с для разрушения бактериальных клеток. 6. Затем количественно перенести разрушенную биомассу в колбу с притертой пробкой и добавить еще 10 мл смеси спирт-хлороформ, колбу закрыть и оставить на 3 ч для экстракции из биомассы полигидроксиалканоата и липидов при периодическом помешивании. 7. Отделить фильтрованием на стеклянном фильтре под вакуумом водоструйного насоса растворитель и остатки биомассы. Промыть 3 порциями хлороформа по 5 мл осадок на фильтре для полноты извлечения полимера. Хлороформ объединить с растворителем. 8. Смесь растворителей пропустить через безводный сернокислый натрий. Для этого используется обычная воронка с ватой, на которую наносится слой соли. 9. Обезвоженный экстракт поместить во взвешенную коническую колбу (А г), отогнать растворитель на роторном испарителе Rotovapor R210/V, поместить колбу с экстрагированными липидами и полимером в эксикатор на 2 ч, а затем взвесить (Б г). 10. Для отделения полимера от липидов в колбу с экстрактом налить 5 мл хлороформа. После полного растворения экстракта добавить 2 объема гексана (10 мл). В этих условиях происходит осаждение полимера в виде хлопьев, а липиды остаются растворенными в хлороформе. 11. Отделить полимер от растворителя на стеклянном фильтре, промыть тремя (по 5 мл) порциями гексана полимер, осевший на фильтр, количественно собрать с фильтра полимер во взвешенный бюкс (В г), сушить в течение 2 ч в сушильном шкафу при 60 °С. 12. Перенести бюкс с полимером в эксикатор. После остывания взвесить бюкс с полимером и рассчитать содержание выделенного полимера из биомассы. 13. Для расчета содержания полимера в сухой биомассе будем учитывать сухой вес сырой биомассы. Если сухой вес составляет 50 %, то для экстракции полимера было взято 500 мг сухой биомассы. Далее по разности бюкса с полимером и пустого (Г-Б) находим количество выделенного полимера. Если за 100 % принять вес сухой биомассы, то содержание полимера будет составлять (Г-Б)х100/500 (%). Таким образом определяется содержание полимера весовым методом. Выделенный полимер сохраняется для следующих лабораторных работ. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 80 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА 14. Растворитель с липидами собрать в отдельную колбу, отогнать на роторном испарителе, липидный экстракт сохранить для следующих лабораторных работ в морозильной камере холодильника. 15. Для проверки полноты экстракции необходимо определить содержание полимера в сухой биомассе хроматографическим методом. Для этого взвешиваем на аналитических весах 4 мг сухой биомассы, переносим навеску в колбу со шлифом, добавляем 1 мл метанола, 0,75 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл хлороформа с внутренним стандартом. В качестве внутреннего стандарта используется бензойная кислота (0,5 мг/мл). Прикрепляем колбу к обратному холодильнику, помещаем в водяную баню и проводим метанолиз в течение 2,5 ч при температуре 90 °С. После того как колба с реакционной смесью остынет, ее снимаем и добавляем 2 мл дистиллированной воды. После расслоения фаз (нижняя хлороформная фаза содержит метиловые эфиры мономеров полимера и бензойной кислоты) записываем пробу на газовом хроматографе и рассчитываем содержание полимера в исходной биомассе (образец хроматограммы дан на рис. 6.3). Расчет проводится так. Sстандарт соответствует 0,5 мг, а SC4 – Х мг. Из пропорции находим Х = k·SC4·0,5/ Sстандарт, где k – коэффициент, полученный экспериментальным путем. Процентное содержание полимера находим из учета навески. 16. Оценить полноту экстракции, сравнивая результаты весового и хроматографического методов определения полимера в биомассе. Оформляем результаты в виде табл. 6.1. Рис. 6.3. Типичная хроматограмма полигидроксибутирата после метанолиза. Пик, обозначенный как С4, соответствует мономеру гидроксибутирата, внутренний стандарт – бензойная кислота (материал кафедры биотехнологии ИФБиБ СФУ) Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 81 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА НА ПРИМЕРЕ БИОРАЗРУШАЕМОГО БИОПЛАСТИКА Таблица 6.1 Сравнение весового и хроматографического методов определения содержания полимеров в биомассе бактерий Навеска, г Содержание полимера, % Весовой метод Полнота экстракции, % Хроматографический метод Вопросы 1. Каковы основные методы сбора биомассы? Дать краткую характеристику этим методам. 2. Каковы методы разрушения клеток? 3. Сколько основных этапов выделения целевого продукта? 4. Что такое экстракция? 5. Какой экстрагент подходит для выделения полигидроксиалканоатов из бактерий? 6. В чем заключается принцип весового метода определения содержания полимера в бактерия? 7. В чем преимущество хроматографического метода определения содержания полимера? Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают следующие основные виды хроматографии: – адсорбционную, – распределительную, – ионообменную, – эксклюзионную (молекулярно-ситовую), – осадочную. Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твёрдое тело с развитой поверхностью). Распределительная хроматография — на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесённая на твёрдый макропористый носитель) и элюенте (следует иметь в виду, что Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 82 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ при распределительном механизме разделения на перемещение зон компонентов частичное влияние оказывает и адсорбционное взаимодействие анализируемых компонентов с твёрдым сорбентом). Осадочная хроматография основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твёрдой неподвижной фазе. Ионообменная хроматография – на различии констант ионнообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси. Эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография – на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Эксклюзионная хроматография подразделяется на гельпроникающую (ГПХ), в которой элюент – неводный растворитель, и гельфильтрацию, где элюент – вода. Последний тип хроматографии является разновидностью жидкостной хроматографии и в аппаратурном оформлении ничем не отличается от других видов жидкостной колоночной хроматографии, в том числе от высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖК). ВЭЖХ – это жидкостная колоночная хроматография, механизмы сорбции в которой могут использоваться самые различные. По существу, ВЭЖХ – это современная форма реализации классической жидкостной колоночной хроматографии. Ниже перечислены некоторые наиболее существенные качественные характеристики ВЭЖК: – высокая скорость процесса, позволившая сократить продолжительность разделения от нескольких часов и суток до минут; – минимальная степень размывания хроматографических зон, что дает возможность разделять соединения, лишь незначительно различающиеся по константам сорбции; – высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработки информации, благодаря чему колоночная жидкостная хроматография достигла нового уровня воспроизводимости и точности. Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров. Колонки, предназначенные для гельфильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков или других соединений по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми (рис. 6.5). В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза). Таким образом, при помощи ГПХ можно разделить смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход веществ из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярной массы. Так можно разделить полипептиды, белки и другие макромолекулы. Гельпроникающая хроматография на колонке используется для очистки пестицидов, а также жирорастворимых витаминов перед их определением методом ВЖХ. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 83 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ Рис. 6.4. Принципиальная типичная схема жидкостного хроматографа: 1 – резервуар; 2 – дегазатор; 3 – смеситель; 4 – фильтр; 5 – насос; 6 – перекрывающие краны; 7 – устройство для сглаживания пульсации давления; 8 – предварительная насыщающая колонка; 9 – устройство для ввода проб; 10 – хроматографические колонки; 11 – детектор; 12 – термостат; 13 – измеритель потока; 14 – кран; 15 – сборник фракций; 16 – регистратор Рис. 6.5. Хроматография на основе «молекулярных сит (компоненты, размеры которых соответствуют размерам пор или входов в поры адсорбента, задерживаются на колонке): а, б – две стадии процесса Основной тип сорбенты для гельпроникающей хроматографии – стирол-ДВБ. Гельпроникающая хроматография широко используется для изуче Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 84 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ ния распределения молекулярных масс полимеров. Этот процесс можно реализовать на специально собранной системе высокоэффективной жидкостной хроматографии Breeze фирмы Waters (США) (рис. 6.6). Прибор комплектуется изократическим насосом, ручным инжектором, рефрактометрическим детектором и собственным программным обеспечением, адаптированным для пользователей, имеющих начальный опыт работы с ВЭЖХ. Гельпроникающая хроматография – наиболее простая технология для молекулярномассового разделения полимеров. Олигомеры, мономеры и добавки в комплексных полимерных растворах также могут быть разделены, если молекулярно-массовые разницы между компонентами существенны. Для характеристики полимеров разработаны специальные колонки: Styragel®, UltraStyragel™ и Shodex®, которыми снабжена хроматографическая система Breeze. Рис. 6.6. Общий вид ВЭЖК Breeze фирмы Waters (США) Цель работы – приобретение навыков работы с жидко-жидкостной хроматографией. Материалы и оборудование: полигидроксибутират, выделенный из биомасса R. eutrophus B-5786; система ВЭЖХ «Бриз» с ручным инжектором и рефрактометрическим детектором для анализа молекулярно-массовых распределений полимеров; набор полистеролов с молекулярной массой от 50 000 до 600 000 дальтон для построения калибровочного графика. Ход работы: 1. Приготовить 0,1 % раствор полимера в хлороформе. Для этого надо взвесить 50 мг полимера, выделенного на предыдущем занятии, перенести Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 85 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.2. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС БИОПЛАСТИКОВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ в мерную колбу на 50 мл, добавить в колбу 10–15 мл хлороформа и после растворения полимера довести хлороформом объем до метки. 2. Таким же способом приготовить 0,1 % растворы полистерола с разной молекулярной массой – от 50 000 до 600 000 дальтон. 3. Приготовить элюент, в качестве которого служит обезвоженный и перегнанный хлороформ, перед использованием хлороформ дегазируется пропусканием через элюент инертного газа – гелия. 4. Включить систему Бриз и задать программу хроматографирования. 5. Ввести через ручной инжектор 10 мкл стандартного раствора и дать команду «старт» для проведения хроматографирования. 6. После завершения хроматографирования стандартов записать пробу полимера. 7. Провести расчеты хроматограмм в соответствии с заданной калибровкой. 8. Оформить результаты в виде графика распределения молекулярных масс полимера. Вопросы 1. Какова история открытия хроматографии? 2. Каковы перспективы использования хроматографического метода? 3. Какие виды хроматографии различают по агрегатному состоянию элюента? 4. Каковы основные виды хроматографии в зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой? Перечислить и охарактеризовать их. 5. В чем заключаются преимущества и достоинства ВЭЖК? 6. Какой метод используется для исследования молекулярного распределения полигидроксиалканоатов? Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОМАССЫ RALSTONIA EUTROPHA B-5786, МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. Цель работы: знакомство с методом газовой хроматографии и массспектрометрии. Газовая хроматография (ГХ) – вид хроматографии, в которой подвижной фазой служит газ (пар). Разделение компонентов в ГХ основано на различии скоростей движения и размывании концентрационных зон исследуемых веществ, движущихся в потоке газовой фазы относительно слоя непод Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 86 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. вижной фазы, причем эти вещества распределены между обеими фазами. Газноситель (воздух, Не, N2, Аr, СО2 и др.) должен обычно иметь небольшую вязкость и обеспечивать высокую чувствительность детектирования. Далее приводятся основные характеристики ГХ. Основные уравнения в газовой хроматографии Коэффициент распределения – отношение концентраций исследуемого соединения в неподвижной и подвижной фазах в равновесных условиях: K= cн . cп (6.3.1) Фазовое отношение – это отношение объемов подвижной и неподвижной фаз в колонке: β= Vпод . Vнеп (6.3.2) Фактор удерживания (фактор емкости) – это отношение приведенных времен удерживания к мертвому времени: kk = t R′ . tм (6.3.3) Фактор разделения – величина, характеризующая селективность разделительной системы, равная отношению факторов удерживания или приведенных времен удерживания двух соседних пиков на хроматограмме: α 2 /1 = K 2 t2′ . = K1 t1′ (6.3.4) Эффективность колонки – характеристика степени размывания полос в колонке, характеризуется числом теоретических тарелок N или H. 2 t N = 5,545 R , W 0,5 (6.3.5) где W0,5 – ширина пика на половине высоты. H= L , N Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум (6.3.6) 87 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. где L –длина колонки; N – безразмерная величина; Н имеет размерность длины обычно в миллиметрах. Разрешение Rs – это отношение расстояния между максимумами исследуемых соседних пиков к сумме их полуширин, выраженных в одних и тех же единицах измерения: Rs = 2 t R2 − t R1 Wb1 + Wb2 . (6.3.6) Связь степени разрешения с фактором разделения α, фактором удерживания k и эффективностью N: . (6.3.7) Число тарелок, необходимое для полного разделения при Rs = 1: , (6.3.8) при k > 10 это уравнение можно упростить: . (6.3.9) На хроматографическое разделение (на величины α, R и N) влияют многие факторы: природа сорбента, длина и сечение колонки, толщина жидкой пленки на носителе или на стенках капиллярной колонки. При небольших давлениях инертные газы-носители практически не адсорбируются, особенно в газожидкостной хроматографии. Поэтому природа газа-носителя практически не влияет на селективность разделения, за исключением некоторых случаев в газоадсорбционной хроматографии при разделении газов на активных тонкопористых адсорбентах. В большинстве случаев на входе в колонку используют избыточное давление в пределах от 0,1 до 2 атм (в очень редких случаях выше). Изменение давления в этих пределах практически не влияет ни на селективность, ни на эффективность разделения. Размер введенной пробы анализируемой смеси должен быть таким, чтобы не вызывать перегрузку колонки. При введении пробы больше максимально допустимой изменяются времена удерживания. Особенно важно не перегружать капиллярную колонку, так как ее эффективность сильно падает с перегрузкой. Развитие высокоэффективной ГХ связано прежде всего с изобретением капиллярных колонок. Первоначально капилляры выдувались из стекла. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 88 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. Хрупкость таких колонок ограничивала их использование. Появление гибких колонок из кварца с инертной поверхностью дало толчок к развитию ГХ как метода с большей эффективностью разделения по сравнению с насадочными колонками, откуда и появился термин «высокоэффективная газовая хроматография». Разработка программного обеспечения, производство колонок на коммерческой основе привело к совершенствованию хроматографического оборудования, что существенно расширило область применения газовой хроматографии в науке и промышленности. Схема современного газового хроматографа изображена на рис. 6.7. Рис. 6.7. Функциональная схема газового хроматографа Для создания перепада давления через колонку хроматограф подсоединяют к источнику со сжатым газом 1 (баллонная или лабораторная линия со сжатым газом). Через колонку поток газа-носителя должен проходить с постоянной и определенной скоростью, поэтому на входе в колонку на линии газа-носителя устанавливают регулятор и стабилизатор расхода газаносителя 2 и измеритель расхода газа 3. Если газ-носитель загрязнен нежелательными примесями, то в этом случае устанавливается еще фильтр 4. В современных хроматографах используются блок подготовки газа с электронным заданием и управлением расходов газов. Перед входом в колонку устанавливается устройство для ввода анализируемой пробы в колонку – дозаториспаритель 5. Обычно анализируемую пробу вводят микрошприцем 8 через самозатекающее термостойкое резиновое уплотнение в дозаторе. Анализируемая проба, введенная в дозатор, захватывается потоком газа-носителя и направляется в хроматографическую колонку 6. Детектор 11 зарегистрирует присутствие разделенных компонентов в газе-носителе. Эти сигналы в случае необходимости усиливаются (усилитель 13) и регистрируются на шкале вторичного самопишущего прибора 14 или дисплея компьютера. Для обеспечения стабильного режима работы детектора используется блок питания детектора 12. Сорбируемость веществ зависит от температуры. Для исключения Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 89 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. влияния колебания температуры на результаты разделения колонку помещают в специальную камеру-термостат, температура которой устанавливается и поддерживается терморегулятором 9. В случае необходимости температура колонки в процессе разделения может изменяться по определенной программе с помощью блока программирования температуры 10. Высота или площадь пика пропорциональны количеству или концентрации компонента в смеси. Площадь пика может быть измерена с помощью электронного интегратора 15 или по специальной программе. Всего для газовой хроматографии предложено более 60 типов детектирующих систем. Но к наиболее часто используемым относятся пламенноионизационный детектор, детектор по теплопроводности, электроннозахватный детектор, термоионный детектор, пламенно-фотометрический детектор, фотоионизационный детектор, масс-спектрометрический детектор. Хромато-масс-спектрометры – одни из наиболее распространенных современных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкостных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предварительное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и измерение их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому массспектрометры в хроматографии большей частью имеют дело не со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями. Масс-спектрометрия (масс-спектральный анализ), метод анализа вещества путем определения массы (чаще, отношения массы к заряду m/z) и относительного количества ионов, получаемых при ионизации исследуемого вещества или уже присутствующих в изучаемой смеси. Совокупность значений m/z и относительных величин токов этих ионов, представленная в виде графика или таблицы, называется масс-спектром вещества. Масс-спектрометры устанавливают молекулярную массу вещества, ее атомарный и изотопный состав, а также пространственную структуру расположения атомов. Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать следовые количества органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, а также в биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать превращения вещества в процессе химической реакции, что существенно для установления ее механизмов. Масс-спектрометрия в сочетании с газовой хроматографией активно используется в СФУ для решения ряда биотехнологических задач. Для выполнения работы используется хромато-масс-спектрометр Agilent 5975Inert (Agilent, США) (рис. 6.8). Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 90 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. Рис. 6.8. Общий вид хромато-масс-спектрометра Agilent 5975Inert Технические характеристики хромато-масс спектрометра Agilent 5975Inert Хромато-масс-спектрометрическая система представляет собой совокупность самых современных технологий. Применение химически инертных материалов для изготовления источника ионизации позволяет практически полностью устранить возможность разложения и деградации термолабильных соединений и получать в процессе масс-спектрометрического анализа данные, максимально пригодные для идентификации по библиотекам массспектров. В модели Agilent 5975 Inert упрощена процедура настройки режима химической ионизации: поток газов-реактантов управляется электронными регуляторами, и настройка их оптимальных значений осуществляется в автоматическом режиме практически без участия оператора. К прибору может быть одновременно подключено два газа-реактанта, их переключение осуществляется при помощи программного обеспечения. Возможность использования источника химической ионизации для работы с ионизацией электронным ударом позволяет программно переключать способ ионизации во время анализа одной пробы. Применение технологии QuickSwap дает возможность в считанные минуты производить замену аналитической хроматографической колонки без выключения хромато-масс-спектрометра, проводить обратную продувку колонки для удаления тяжелых компонентов. Используя функцию eMethod, оператор может загружать аналитические методы, разработанные компанией Agilent для анализа тех или иных групп химических соединений, непосредственно с интернет-сайта www.agilent.com. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 91 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. Программа выявления индивидуальных спектров позволяет находить и идентифицировать целевые соединения в сложных матрицах даже в случаях, когда эти вещества не имеют выраженного хроматографического пика. Система управляется Химической станцией на базе современного компьютера, работающего в среде Windows XP. Управление хроматографом и детектором осуществляется посредством LAN коммуникации. В стандартный комплект входят программы автоматической настройки, программы сбора и обработки данных, включая библиотечный поиск массспектров и распечатки отчетов о различных форматах. Для удобства обслуживания и ухода за системой имеется комплект стандартных диагностических программ. Дополнительно включены библиотеки масс-спектров NIST05 (190 825 соединений) со структурными формулами, WiLey (621 600 соединений). Технические характеристики масс-селективного детектора: диапазон масс от – 1,6 до 1050 а.е.м., параметры могут быть выбраны внутри этого диапазона; максимальная скорость сканирования составляет 10 000 а.е.м./с. Рекомендуемая скорость сканирования составляет 800–1600 а.е.м./с, что позволяет получать два или три спектра в секунду. Чувствительность при ионизации электронным ударом, режим сканирования – 1 пикограмм октафторнафталина при введении в 1 мкл изооктана и использовании стандартной колонки HP-5MS 0,25 мм×30 м×0,25 мкм дает отношение сигнал/шум не хуже 200:1 на отдельной хроматограмме по массе m/z 272. Чувствительность при ионизации электронным ударом, режим регистрации отдельных ионов – 20 фемтограмм октафторнафталина при введении в 1 мкл изооктана и использовании стандартной колонки HP-5MS 0,25 мм×30 м×0,25 мкм дают отношение сигнал/шум не хуже 50:1 на отдельной хроматограмме по массе m/z 272. Система Agilent 6890/5975 Inert работает при объемной скорости потока газа-носителя (гелия или водорода) до 2 мл/мин при использовании стандартного турбомолекулярного насоса, до 4 мл/мин при использовании высокоэффективного турбомолекулярного насоса (262 л/с) и колонок с внутренним диаметром 0,32 мм. Применение химически инертных материалов для изготовления источника ионизации позволяет практически полностью устранить возможность разложения и деградации термолабильных соединений и получать в процессе масс-спектрометрического анализа данные, максимально пригодные для идентификации по библиотекам масс-спектров. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 92 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. Цель работы: знакомство с методом газовой хроматографии и массспектрометрии. Материалы и оборудование: липидный экстракт из Ralstonia eutropha B-5786; реактивы: хлороформ, этанол, метанол, концентрированная серная кислота, гексан, бензол, дистиллированная вода, натрия сульфат безводный; лабораторная посуда: грушевидные колбы на 50 мл, пипетки, обратные холодильники, воронки, делительные воронки, пробки, шприц хроматографический на 10 мкл; лабораторное оборудование: роторный испаритель Rotovapor R210/V (Buchi, Германия), водяная баня, хромато-масс-спектрометр Agilent 5975Inert (Agilent, США). Ход работы: 1. Приготовление метиловых эфиров ЖК: – приготовить смесь из 10 мл метанола и 0,2 мл концентрированной серной кислоты; – добавить в колбу к осушенным липидам 2–3 капли бензола и 0,5 мл метанольной смеси; – нагреть водяную баню до 90 оС, подключить водяное охлаждение к обратным холодильникам, установить колбу на шлиф холодильника и поместить нижнюю часть колбу (1/2–1/3) в воду; – длительность метанолиза составляет1,5–2 ч, в течение этого времени необходимо наблюдать за охлаждением, температурой в бане, целостью колбы и пр.; – по окончании процесса снять колбу, добавить 1 мл дистилированной воды и 2 мл гексана, интенсивно встряхнуть несколько раз; – перелить смесь в делительную воронку, добавить 5 мл дистилированной воды, слить из воронки нижний водный слой, повторно добавить и слить 5 мл дистилированной воды; – верхний слой, состоящий из гексана с растворенными метиловыми эфирами ЖК, пропустить через слой Na2SO4 в грушевидную колбу, затем испарить гексан на роторном испарителе так, как описано ниже; – готовые метиловые эфиры ЖК хранить в морозильной камере непосредственно до проведения газовой хроматографии. 2. Выпаривание гексана: – подключить вакуум, водяное охлаждение к роторному испарителю, отрегулировать температуру водяной бани в пределах 35–40 оС; – поместить колбу с экстрактом на стеклянный выход-шлиф испарителя, закрыть герметизирующий кран и включить вращение колбы; Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 93 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. – по окончании испарения растворителей из колбы выключить вращение, открыть герметизирующий кран, снять колбу, отключить вакуум и охлаждение. 3. Подготовка газового хроматографа к выполнению анализов: – открыть газовую линию (гелий) и проверить ее на герметичность; – включить хроматограф, масс-спектрометр, запустить управляющую компьютерную программу; – дождаться прогрева вакуумного насоса, установить температурный режим всех блоков хроматографа, через 4 ч работы провести тестирование и настройку детектора с помощью программного обеспечения; – при успешном результате тестирования прибор готов к работе. 4. Газовая хроматография метиловых эфиров ЖК: – выбрать нужный метод проведения анализа из имеющихся, установить режим ввода пробы «split», то есть с делением потока газа при вводе пробы; – заполнить данные о пробе при формировании файла, где будут храниться результаты анализа; – в колбу с метиловыми эфирами с помощью микрошприца добавить 20–40 мкл гексана, смыть и сконцентрировать вещество на дне колбы, по окончании отобрать шприцем 1–3 мкл раствора; – запустить «анализ пробы» из компьютерной программы, дождаться сигнала готовности прибора, ввести пробу в инжектор; – процесс хроматографии происходит далее около 1 ч, за это время введенные метиловые эфиры ЖК разделяются на колонке, подаются в массспектрометрический детектор, где производится регулярное сканирование спектров вещества, выходящего из колонки, спектры и общая ионная интенсивность записываются в соответствующий файл. 5. Идентификация пиков метиловых эфиров ЖК: – по окончании анализа возможна работа с сформированным файлом пробы с помощью специальной программы обработки данных; – провести идентификацию пиков на хроматограмме путем сравнения масс-спектров веществ с имеющимися в базе данных; – рассчитать процентное содержание основных жирных кислот от их общей суммы; – занести данные в таблицу; – провести сравнение результатов с литературными данными. Вопросы 1. В чем заключается принцип действия газовой хроматографии, каковы основные функциональные блоки газового хроматографа? 2. В чем заключается принцип метода масс-спектрометрии? 3. Для чего необходимо образование метиловых эфиров жирных кислот перед выполнением газохроматографического анализа? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 94 МОДУЛЬ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ Работа 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ ЛИПИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ. 4. Как происходит формирование и запись масс-спектров веществ в детекторе прибора, каковы основные блоки масс-спектрометрического детектора квадрупольного типа? 5. Какую информацию о структуре молекулы ЖК можно получить с помощью масс спектрометрии? 6. Какие ЖК являются наиболее распространенными у бактерий? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 95 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Цель: ознакомление с основными принципами, используемыми при конструировании и эксплуатации оборудования биотехнологических процессов Задачи: ознакомление с принципами составления материально-энергетического баланса процессов микробного роста и синтеза продуктов; определение и расчет массообменных характеристик ферментационного оборудования; определение величины и роли межфазной поверхности в системе газжидкость в ферментерах различных конструкций. Аппаратурное оформление технологических процессов производства продуктов биотехнологии и, прежде всего, микробиологического синтеза весьма разнообразно и во многом специфично. Специфические требования к оборудованию биотехнологической промышленности связаны с санитарногигиеническими вопросами и предотвращением контаминации, что имеет решающее значение при проектировании. В этой связи одним из основных требований к оборудованию микробиологического производства является его герметичность. Применение герметичных аппаратов, особенно для стадии культивирования биологических объектов, – важное условие качественного проведения процесса и получения стандартного продукта с высоким выходом. Большое значение имеет правильный выбор материала, из которого изготовлено оборудование, поскольку компоненты материала могут оказывать как активирующее, так и ингибирующее действие на биосинтез биологически активных веществ. Еще одним важным требованием к оборудованию для биотехнологии является необходимость обеспечения высокой производительности. Чем больше производительность аппарата, тем меньше требуется сложных автоматических приборов контроля и регулирования параметров процесса, запорной аппаратуры, трубопроводов и др. Оборудование должно быть рассчитано на проведение непрерывных процессов, поскольку это создает возможность интенсифицировать и автоматизировать биотехнологические процессы. Важной особенностью биотехнологии является проведение основной технологической стадии (стадии ферментации) в водной среде, при постоянном перемешивании и вибрации, а также меняющихся параметрах (рН, температуры, ионной силы среды и др.). Эти обстоятельства предопределяют схожесть процессов приготовления питательных сред для микроорганизмов, проведения биосинтеза и выделения целевых продуктов и обуславливают создание универсальных установок, позволяющих осуществлять без серьезной переналадки большое количество процессов, производящих ценные про Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 96 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ дукты. Биотехнологическая установка (ферментер, биореактор) состоит из стандартных модулей, реализующих типовые операции. Их конкурентоспособность по сравнению с установками, проектируемыми конкретно для заданного технологического процесса, определяется тем, что в них заранее заложена возможность быстрой замены технологий в широком диапазоне в зависимости от меняющихся потребностей рынка. Это сокращает вынужденный простой установки и связанные с ним нерациональные накладные расходы. Использование модульного принципа в биоинженерии позволяет добиться высокой степени заводской готовности оборудования и снижает затраты на его изготовление и монтаж. Модульный принцип также предусматривает разработку и использование типовых алгоритмов и программ оптимального управления оборудованием, модулей с использованием микропроцессоров, а также пакета программ, оптимального для управления выбранными технологическими процессами. Использование возобновляемого сырья с одновременным производством ценных, например кормовых, препаратов существенно снижает себестоимость получаемого продукта, что также повышает конкурентоспособность модульных линий, а их малая мощность облегчает обеспечение ее экологической безопасности. Кроме того, предлагаемое сырье и процесс его подготовки предусматривают полную утилизацию твердых отходов, концентрирование и использование стоков, и возврат конденсата от их упаривания в технологический процесс. Модульные линии имеют определенные перспективы для выхода на международный рынок, поскольку есть достаточное количество средних и малых стран, испытывающих потребность в препаратах, но не имеющих достаточных средств для создания крупных предприятий. Однотипность модулей позволяет объединять их в сети, в которых отдельные функции линии могут быть сосредоточены в специализированных подразделениях. Важнейшей задачей биотехнологического производства является получение максимального выхода целевого продукта. Для достижения этой цели процесс ферментации должен проходить в оптимальных условиях, которые создаются с помощью ферментационного оборудования и той инфраструктуры, которая обеспечивает его функционирование. В этой связи на первый план выдвигаются задачи, связанные с устранением заражения культуры посторонней микрофлорой и обеспечения качественного управления процессом культивирования. Заражение культуры микроорганизмов или клеток посторонней микрофлорой приводит к прямым экономическим потерям, причем в ряде случаев очень значительным. Поэтому при выборе ферментационного оборудования в первую очередь обращают внимание на надежность обеспечения асептики процесса культивирования. Другое важное требование относится к процессу стерилизации питательной среды. Питательная среда не должна быть «перегрета» при тепловой стерилизации, что приводит к деструкции таких ее компонентов, как витамины и аминокислоты, а результатом этого становится замедление роста культуры и падение продуктивности. Стерилизация питательной среды должна проводиться в автоматическом режиме. Практика показывает, что ошибки оператора являются главной причи Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 97 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ ной отсутствия стерильности питательной среды. Процессы, протекающие при ферментации, требуют непрерывного управления. Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ Цель работы: экспериментально подтвердить закономерность между тепловыделением клеточной популяции и ее потреблением кислорода. Точное измерение количества метаболического тепла связано с серьезными техническими трудностями. Имеет место противоречие между требованием контролируемости условий роста и специфическими требованиями корректности калориметрических измерений. При культивировании помимо метаболического тепла генерируется тепло техническое, связанное с аэрацией, перемешиванием и теплопотерями. Сам процесс калориметрии измерения требует законченности переходных процессов по тепловым потокам в объекте и окружающем его оборудовании. Таким образом, чем лучше проба подготовлена к калориметрическим измерениям, тем больше условия в клетках отличаются от истинных, поскольку наблюдается лимит как по газовому, так и органическому субстратам. Более перспективны в этом плане измерения, проводимые не с образцами, а с целым ферментером. Но в этом случае точность измерения меньше, чем при измерении тепла химических реакций. В этой связи более целесообразно использовать аналогию между выделением культурой тепла и потреблением ею кислорода. Такой зависимостью является среднее значение коэффициента пропорциональности Q0 = 103,68 кДж/экв RO, которое справедливо на протяжении всего жизненного цикла клеток и вне зависимости от их возраста. Метаболическое тепловыделение согласно [1] включает rН = rSHSRO - µ HВRO- rPHPRO, где rН – удельная скорость тепла в расчете на 1 экв. RO; HSRO, HВRO, HPRO – энтальпии RO в субстрате, биомассе и продуктах. При HSRO = HВRO = HPRO = HORO уравнение имеет вид rН = HORO. Степень точности последнего выражения тем больше, чем ближе друг к другу величины энтальпии, то есть когда образуется меньше продуктов метаболизма, и чем больше редоксонов субстрата уходит на кислород. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 98 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ Показанная пропорциональность между тепловыделением и дыханием при аэробном росте имеет место при росте на любом органическом субстрате, так как конструктивный обмен протекает приблизительно на постоянном энергетическом уровне, а дыхательный обмен опускает редоксоны со стандартного уровня, имеющего место в органических соединениях до нуля. Поэтому в случае аэробного роста в отсутствие большого количества продуктов метаболизма целесообразнее тепловыделение клетками измерять через скорость потребления кислорода. В этой связи тепло Q, которое получила культуральная жидкость за время отключения системы термостатирования, можно представить в виде баланса Q = Qб + Qм - Qп, где Qб – тепло, выделяемое клетками, Дж/c; Qм – тепло, выделяемое перемешивающим устройством при постоянной мощности, Дж/c; Qп – потери тепла в окружающую среду, Дж/c. Тепло, выделяемое в окружающую среду, Qп определяется экспериментально с использованием стандартного нагревателя при калибровке в питательной среде без клеток. Аналогично тепло, выделяемое перемешивающими устройствами, также определяется опытным путем. Например, тепло выделяемое турбинной мешалкой биореактора BioFlo110 при 1200 об/мин и диаметре мешалки 80 мм, составляет 18–20 Дж/c. Тепло в рабочем объеме биореактора Q определяется на основании начальной и конечной температуры среды достигаемо за время отключения системы термостатирования. Таким образом, из теплового баланса определяется скорость тепловыделения клеток, Дж/ч, а при помощи газоанализаторов скорость потребления кислорода G02, моль O2/ч. После чего величина скорости потребления кислорода переводится в экв.редоксонов в час из расчета 4 экв. RO/моль O2. На основании полученных данных определяется отношение скорости тепловыделения к скорости дыхания Qб /G02. кДж/экв.RO, которое составляет [1] 103,7 кДж/экв.RO. Материалы и оборудование: культура штамма R. eutrophus B-5786; раствор базового фосфатного буфера для среды; стерильные растворы микроэлементов, железа лимонно-кислого, сульфата магния и хлористого аммония; установка для гетеротрофного культивирования, включающая теплоизолированный биореактор с турбинной мешалкой BioFlo110 и устройство для термостабилизации подаваемого воздуха и насыщения его водяным паром; газоанализатор для измерения концентрации кислорода; термометр Beckmann (точность 0,01 oC). Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 99 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОВЫДЕЛЕНИЯ И ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА ПРИ РОСТЕ БАКТЕРИЙ Ход работы: 1. Определить потери тепла в окружающую среду; 2. Определить тепло, выделяемое перемешивающим устройством; 3. Определить тепло, выделяемое клетками; 4. Провести статистическую обработку экспериментальных данных и рассчитать отношение Qб /G02, кДж/экв.RO. 5. Сравнить полученные значения с известными в литературе данными и сделать выводы. Вопросы ет? 1. Какие методы измерения тепловыделения микроорганизмов вы зна2. Какова связь редоксона с количеством потребленного киcлорода? 3. В каком виде представляют тепловой баланс биореактора? Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА Цель работы: приобретение навыков определения величины коэффициента массоотдачи в газожидкостном биореакторе. Перенос газового субстрата (кислорода) через жидкость характеризуется общеизвестным уравнением GO 2 = dc = βa(c * −c ), dτ где GO2 – скорость сорбции (переноса), растворенного O2 (моль O2/л⋅с); β – поверхностный коэффициент массоотдачи (переноса), м/c; βv = βa – объемный коэффициент массоотдачи, с-1: a – межфазная поверхность контакта, м2 /м3; c* – равновесная концентрация O2 в жидкости, моль O2/л; c – текущая концентрация кислорода в жидкости, моль O2/л. Коэффициент массопереноса рассматривают как масштабный параметр, необходимый для поддержания функционирования биореактора и получения наибольшей продуктивности процесса. Наилучшую сходимость расчетных значений βv с опытными в лабораторных биореакторах дает уравнение типа [2] Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 100 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ nd d β =0,33 м п ν 0,6 Sc 0,5 ( Dж / d п ) , где dп – средний диаметр пузырьков газа, м; ν – коэффициент кинематической вязкости жидкости, м2/c; β – поверхностный коэффициент массоотдачи, м/с; Sh – критерий Шервуда; Sc – критерий Шмидта. Изменение концентрации растворенного газа в культуре с учетом его потребления клетками и поступления его из газовой фазы представляют в виде dc/dτ = βa(c* − c) − qx, где q – удельная скорость потребления газа биомассой, кг О2/(кг⋅ч); x – концентрация биомассы, кг/м3. В стационарном состоянии dc/dτ = 0, и тогда βa(c* − c) = qx. При равенстве количества газа, поступающего из газовой фазы в жидкость и потребляемого микроорганизмами, имеем c = c*− qx/(βa). Если O2 выполняет роль лимитирующего субстрата, можно записать уравнение Михаэлиса – Ментена в виде q = q мак − с , Ko + c где q – удельная скорость поглощения O2, отнесенная к весу сухих клеток, ммоль O2/г клеток ⋅ ч; qмак – максимальная скорость поглощения кислорода, ммоль O2/г клеток ⋅ ч; Ko – константа. Так, например, согласно [3] удельная скорость потребления компонентов газовой смеси (CO2, O2, H2) растущей и аккумулирующей полимеркуль Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 101 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ турой Ralstonia eutropha при периодическом культивировании на первой стадии составляет для водорода 0,036–0,04, кислорода 0,17–0,18, диоксида углерода 0,11–0,14 кг/(кг ⋅ ч). На стадии накопления ПГА в безазотной среде скорость потребления газа существенно уменьшается, что обусловлено снижением роста клеток. При этом экономический коэффициент культуры в среднем на первом этапе культивирования составляет: по H2 – 1,5 кг АСБ /кг; O2 – 0,34; CO2 – 0,48, на втором этапе, соответственно, 0,9; 0,2; 0,4. Среди микроорганизмов существуют значительные различия в потребности O2. Для определения скорости поглощения кислорода используются в основном четыре метода: динамический; сульфитный; прямое измерение и теоретический расчет, учитывающий рост биомассы. Динамический метод осуществляется в периодической ферментации путем измерения скорости снижения концентрации газа в жидкости после прекращения аэрации и построения линейной зависимости, величины снижения концентрации кислорода от времени. Угол наклона построенной прямой линии определяет обратную величину объемного коэффициента массоотдачи – 1/βv. Сульфитный метод заключается в том, что в присутствии 10-3 молей Со2+ или Сu2+ сульфит натрия окисляет растворенный кислород. Затраченный сульфит определяют путем добавки раствора йода, а остаточный йод титруют Na-тиосульфатом. Однако метод не дает представления о динамике обеспечения жидкости кислородом, а характеризует только условия аэрации. Определение скорости переноса кислорода можно реализовать по измерению микробного роста в аэробных услових [4]: С= A − B, Y s где С – потребление кислорода, моль O2/г сухих клеток; A – количество кислорода, необходимое клеткам для окисления 1 г субстрата до CO2, H2O, NH3; B – количество кислорода, необходимое для окисления 1 г сухой биомассы в CO2, H2O, NH3; Ys – экономический коэффициент, г биомассы/ г субстрата. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 102 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ Величина А определяется в результате теоретических расчетов окисления субстрата и В = 400 – 590 мл O2/ г сухих клеток – опытная величина. Для определения общего количества кислорода, которое требуется культуре за 1 ч, необходимо знать удельную скорость роста µ, ч-1; коэффициент Yo, г клеток/ г O2: N = µx K , Y o где N – общее количество кислорода, необходимое культуре за 1 ч; K – корректирующий фактор, молей O2/г O2. Для определения Yo используют следующее уравнение: 2C + H / 2 − O 1 O′ C′ N′ H′ = 16 + − + − , Y Y M 1600 600 933 200 o s где C, H, O – число атомов углерода, водорода и кислорода в субстрате; С ′, H ′,O′, N ′ − проценты углерода, водорода, кислорода и азота в биомассе; M – молекулярный вес субстрата. Расчет объемных значений коэффициента массоотдачи при физической сорбции обычно проводят по опытным данным, полученным при насыщении дистиллированной воды кислородом из воздуха, по уравнению c − 1 β = ln c * / τ , v A где с – концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м3; с* – равновесная концентрация кислорода в жидкости, кг/м3; А – коэффициент, определяемый из начальных условий; τ – время насыщения, с; βv – объемный коэффициент массоотдачи, с-1. Величина коэффициента A определяется из начальных условий (с = сн): Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 103 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КОЭФФИЦИЕНТА МАССООТДАЧИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ A = 1− c н с* ( ), /e − βτ где сн – начальная концентрация растворенного кислорода в жидкости, кг/м3. При приготовлении рабочей смеси жидкость обескислороживается путем пропускания через нее азота либо за счет создания в аппарате вакуума с последующей дегазацией. Материалы и оборудование: культура штамма R. eutrophus B-5786; стерильный раствор базового фосфатного буфера для среды; стерильные растворы микроэлементов, железа лимонно-кислого, сульфата магния и хлористого аммония; установка для гетеротрофного культивирования, включающая биореактор с турбинной мешалкой BioFlo110; газоанализатор для измерения концентрации кислорода. Ход работы: 1. Определить концентрацию биомассы в рабочем объеме биореактора. 2. Установить удельную скорость поглощения O2. 3. Используя полученные экспериментальные данные, провести расчет объемного коэффициента массоотдачи. 4. Определить продуктивность биореактора по биомассе. Вопросы 1. Каковы способы определения коэффициента массоотдачи в биореакторе? 2. Как выразить связь объемного и поверхностного коэффициента массопередачи? 3. Какой биореактор наиболее эффективен с позиции массопереноса? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 104 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ Цель работы: определение газосодержания, диаметра пузырьков газа и межфазной поверхности в аппаратах с мешалкой и в пленочном. Величина межфазной поверхности позволяет оценить массообменные параметры биореактора и осуществлять переход от поверхностного коэффициента массоотдачи к объемному. Если в объеме Vр, заполненном газожидкостной смесью, имеется n газовых пузырьков осредненного диаметра dп, то их поверхность составит F = π dп2n, а их объем Vг = π dп3n/6, отсюда можно записать Vг = Fdп/6. Поделив левую и правую части последнего выражения на Vр, получим ϕ = Vг/ Vр = Fd/Vр6. Из этого следует, что удельная межфазная поверхность контакта фаз (поверхность газовых пузырьков в 1 м3 смеси) а= F 6ϕ , = Vp d п где а – удельная межфазная поверхность контакта, м2/м3; ϕ – газосодержание. Доля газа в объеме жидкости обычно определяется так: ϕ = (Vгж − Vж)/Vгж , где Vгж – объем газожидкостной смеси в биореакторе, м3; Vж – объем жидкости в биореакторе, м3. Среднеповерхностный диаметр пузырьков газа ∑ ni d i 2 d = п ∑ ni , Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 105 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ N – количество пузырьков, шт.; d – диаметр пузырька, м. В лабораторных биореакторах с мешалками величина газосодержания рассчитывается из соотношения ρµ ϕ = K 0,8 σ 0,25 c N (1 − φ) n m H uг . V D Для лопастной мешалки при N(1– ϕ)/V ≤ 10 (кВт/м3) : K = 0,8; n = 0,5; m = 0,62; с = 0. Для турбинной мешалки при N(1– ϕ)/V ≤ 10: K = 0,65; n = 0,5; m = 0,6; c = – 0,65, при N(1– ϕ)/V > 10: K = 0,17; n = 0,1; m = 0,2; c = – 0,65. Среднеповерхностный диаметр пузырьков газа в рассматриваемых аппаратах при N(1 – ϕ)/V < 10 в биореакторе с лопастной мешалкой составляет 5–6 мм, для турбинной мешалки – 3–4 мм. Наилучшую сходимость экспериментальных значений диаметра пузырька газа с расcчетными дает зависимость типа [5] σ0,6 d п = 0,8 . 0,4 ( N / V ) ρ0,2 Удельная межфазная поверхность рассчитывается N 0,4 0,2 0,5 ρ u V г a = 1, 44 uп , σ0,6 где ϕ – газосодержание; N – мощность на перемешивание, Вт; V – рабочий объем биореактора, м3; H – уровень жидкости в аппарате, м; D – внутренний диаметр корпуса аппарата, м; uг – среднерасходная скорость воздуха, м/c; ρ – плотность суспензии, кг/м3; µ – коэффициент динамической вязкости суспензии, Па⋅с; σ – поверхностное натяжение жидкости, Н/м. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 106 МОДУЛЬ 7. ИНЖЕНЕРНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ Работа 7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖФАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ГАЗОЖИДКОСТНОМ БИОРЕАКТОРЕ Данные по межфазной поверхности в пленочном биореакторе представлены в работе [6]. Материалы и оборудование: биореактор с турбинной мешалкой BioFlo110; трубчатая насадка пленочного биореактора; система отбора газожидкостной смеси и уровня жидкости в аппарате; термометр Beckmann (точность 0,01 oC); цифровой фотоаппарат. Ход работы: 1. Определить газосодержание в биореакторах. 2. Определить при помощи фотографирования диаметр пузырьков в культуре. 3. Рассчитать удельную межфазную поверхность. 4. Провести анализ и сделать выводы. Вопросы 1. Каково назначение межфазной поверхности при масштабировании биореакторов? 2. Какие способы определения газосодержания вы знаете? 3. Какие расчетные зависимости используются для определения гидродинамических параметров в биореакторе с мешалкой? Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 107 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Большой практикум по биотехнологии : учеб. пособие / Т. Г. Волова, И. В. Кожевников, Л. А. Франк [и др.]. – Красноярск : Краснояр. гос. ун-т, 2005. – 128 с. 2. Винаров, А. Ю. Ферментационные аппараты для процессов микробиологического синтеза / А. Ю. Винаров, Л. С. Гордеев, А. А. Кухаренко, В. И. Панфилов ; под ред. В. А. Быкова. – М. : ДеЛи Принт, 2005. – 278 с. 3. Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Изд-во СО РАН. – 1999. – 252 с. 4. Волова, Т. Г. Полиоксиалканоаты – биоразрушаемые полимеры для медицины / Т. Г. Волова, В. И. Севастьянов, Е. И. Шишацкая. – Новосибирск : Наука, 2003. 5. Войнов, Н. А. Пленочные биореакторы / Н. А. Войнов, Е. В. Сугак, Н. А. Николаев, С. М. Воронин. – Красноярск : Изд-во «Боргес», 2001. – 252 с. 6. Войнов, Н. А. Пленочные трубчатые газо-жидкостные реакторы / Н. А. Войнов, Н. А. Николаев. – Казань : Отечество, 2007. – 271 с. 7. Высоцкий, Е. С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е. С. Высоцкий, С. В. Маркова, Л. А. Франк // Молекулярная биология. – 2006. – С. 40, 404–417. 8. Гладков, Е. А. Биотехнологические методы получения растений, устойчивых к тяжелым металлам. Оценка комплексной фитотоксичности тяжелых металлов и получение растений, обладающих комплексной устойчивостью // Биотехнология / Е. А. Гладков, О. В. Гладкова. – 2007. – № 1. – С. 81–85. 9. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. 10. Другов, Ю. С. Газохроматографическая идентификация загрязнений воздуха, воды, почвы и биосред / Ю. С. Другов, И. Г. Зенкевич, А. А. Родин. – М. : Бином, 2005. –752 с. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 108 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 11. Егорова, Т. А. Основы биотехнологии / под ред. Т. А. Егоровой, С. М. Клуновой, Е. А. Живухиной. – М. : Академия, 2003. – 208 с. 12. Жимулев, И. В. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие / И. В. Жимулев. – 3-е изд. – Новосибирск : Сибирское университетское издательство. – 2006. – 479 с. 13. Зобова, Н. В. Использование биотехнологических методов в повышении соле- и кислотоустойчивости ярового ячменя / Н. В. Зобова, Е. Н. Конышева. – Новосибирск : СО Россельхозакадемия, 2007. – 124 с. 14. Использование биотехнологических методов в генетико- селекционных исследованиях плодовых и ягодных культур / Н. И. Савельев, В. М. Тюленев, Н. В. Солоновых [и др.]. // Сельскохозяйственная биология, 2003. – № 30. – С. 51–63. 15. Квеситадзе, Г. И. Введение в биотехнологию / Г. И. Квеситадзе, А. М. Безбородов / РАН. Ин-т биохимии им. А. Н. Баха. – М. : Наука, 2002. – 283 с. 16. Клонирование ДНК (методы) /под ред. Д. Гловера. – М. : Мир, 1988. 17. Максимов, Г. В. Теоретические и практические аспекты использования биотехнологии и генной инженерии / Г. В. Максимов. – М. : Вузовская книга, 2004. 18. Минкевич, И. Г. Материально-энергетический баланс и кинетика роста микроорганизмов / И. Г. Минкевич. – Москва – Ижевск : НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика» ; институт компьютерных исследований, 2005. – 352 с. 19. Отто, М. Современные методы аналитической химии / М. Отто. – М. : Техносфера, 2003. – Т. 1. – 412 с. 20. Отто, М. Современные методы аналитической химии / М. Отто. – М. : Техносфера, 2003. – Т. 2. – 281 с. 21. Очерки экологической биофизики / под ред. Т. Г. Воловой. – Новосибирск : Изд-во СО РАН, 2003. 22. Першина, Л. А. Основные методы культивирования in vitro в биотехнологии растений : учеб. пособие / Л. А. Першина. – 2-е изд., перераб. и доп. – Новосибирск : Новосиб. гос. ун-т, 2005. – 142 с. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 109 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 23. Репин, С. В. Медицинская клеточная биология / С. В. Репин, Г. Т. Сухих. – М., 1998. 24. Сазыкин, Ю. О. Биотехнология / Ю. О. Сазыкин, С. Н. Орехов, И. И. Чакалева. – М. : Академия, 2006. – 256 с. 25. Сельскохозяйственная биотехнология : учеб. / под ред. В. С. Шевелухи. – М. : Высш. шк., 2003. – 469 с. 26. Современные проблемы и методы биотехнологии : учеб. пособие / Н. А. Войнов и [др.]. – Красноярск : ИПК СФУ, 2009. – c. – (Современные проблемы и методы биотехнологии : УМКД № 1323-2008 / рук. творч. коллектива Т. Г. Волова). 27.Сычев, С. Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии Миллихром : учеб. пособие / С. Н. Сычев, К. С. Сычев, В. А. Гаврилина. – Орел, 2002. – 258 с. 28. Суриков, В. Т. Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой. Образование ионов / В. Т. Суриков. – Екатеринбург : УрО РАН, 2006. – 276 с. 29. Торчилин, В. П. Иммобилизованные ферменты в медицине / В. П. Торчилин. – М. : ВНТИЦ, 1998. – 198 с. 30. Трансгенные растения для фармакологии / Е. Б. Рукавцова, Я. И. Бурьянов, Н. Я. Шульга, В. А. Быков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2006. – № 2. – С. 3–12. 31. Штильман, М. И. Полимеры медико-биологического назначения / М. И. Штильман. – М. : ИКЦ «Академкнига», 2006. – 399 с. 32. Boehm R. Bioproduction of therapeutic proteins in the 21st century and the role of plants and plant cells as production platforms.Ann.NY Acad. Sci, 2002, V.1102(1), P.121-134. 33. www.biotechnolog.ru 34. Bajji M. Bertin P., Lutts S., Kinet J-M. Evaluation of drought-resistancerelated traits in durum wheat somaclonal lines selected in vitro // Australian Journal of Experimental Agriculture. – 2004. – V. 44. – Р. 27–35. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 110 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 35. Birsin M. A., Özgen M. A. Comparison of callus induction and plant regeneration from different embryo explants of triticale (x Triticosecale Wittmack) Cellular & Molecular Biology Letters Volume 9, (2004). Р. 353 – 361. 36. Lutts S., Almansouri M., Kinet J.-M. Salinity and water stress have contrasting effects on the relationship between growth and cell viability during and after stress exposure in durum wheat callusPlant Science 167 (2004) 9–18. Современные проблемы и методы биотехнологии. Лаб. практикум 111
