ФЕДОРОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА Генетика – 03.02.07 диссертации на соискание ученой степени
advertisement
На правах рукописи ФЕДОРОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ МУТАЦИЙ, ЗАТРАГИВАЮЩИХ ВТОРОЙ ИНТРОН ГЕНА TRITHORAX-LIKE DROSOPHILA MELANOGASTER Генетика – 03.02.07 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск, 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук, Сибирское Отделение, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск, лаборатория эволюционной биологии клетки. Научный руководитель: кандидат биологических наук Баричева Э.М., Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Меркулова Т.И., Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск кандидат биологических наук Волкова Е.И., Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский университет кафедра генетики, г. Санкт-Петербург Защита диссертации состоится « » ________2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан « » _________2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М.Хлебодарова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной генетики является изучение механизмов, дифференциальной активности генов. обеспечивающих регуляцию В настоящее время не вызывает сомнения, что интронные последовательности многих генов, наряду с их 5’– областями, являются полноценными регуляторными районами. К настоящему времени описано множество как позитивных, так и негативных регуляторных элементов, расположенных в интронах. Особенно часто регуляторные последовательности располагаются в интронах генов, характеризующихся сложной картиной экспрессии. К таким генам относится и ген Thrithorax-like D.melanogaster, который кодирует многофункциональный белок GAGA, одна из основных функций которого заключается в регуляции экспрессии многих генов дрозофилы. Ген Trl экспрессируется на всех стадиях онтогенеза, однако картина его экспрессии меняется в зависимости от органа и типа ткани, от стадии онтогенеза и температуры окружающей среды. Разнообразная картина экспрессии гена Trl предполагает наличие сложной регуляции. В настоящее время с использованием культуры клеток и трансгенных мух исследована 5’регуляторная область гена. Однако проведенные ранее в нашей лаборатории предварительные исследования позволили предположить наличие функционально-значимых последовательностей и во втором интроне гена, поскольку одна из гипоморфных мутаций TrlEP(3)3184, локализованная в этом интроне, в гомозиготе или в сочетании с нуль-аллелями приводит к снижению жизнеспособности, оказывает негативное влияние на динамику компактизации и сегрегации хромосом, а так же нарушает процесс оогенеза. В данной работе для идентификации и анализа функциональнозначимых районов второго интрона гена Trl применяется комплексный подход, включающий использование компьютерных и молекулярно- генетических методов. Использование дрозофилы, как модельного объекта исследований, позволило получить набор мутаций, нарушающих структуру интрона, что делает возможным исследование функционально-значимых 3 элементов второго интрона в эндогенном локусе в контексте целого организма. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление и анализ функционально-значимых районов второго интрона гена Trithorax-like D.melanogaster. В ходе выполнения данной работы были поставлены следующие задачи: 1. Получение и картирование мутаций, затрагивающих второй интрон гена Trl D.melanogaster. 2. Молекулярно-генетический анализ полученных мутантов: а) исследование влияния полученных мутаций на выживаемость дрозофил при различных температурах содержания мух; б) изучение транскрипции гена Trl у мутантов. 3. Идентификация и анализ функционально-значимых участков второго интрона гена Trl: а) выявление сайтов связывания белка GAGA во втором интроне и изучение связывания рекомбинантного белка GAGA и белков эмбриональных ядерных экстрактов с выявленными сайтами; б) выявление эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне гена Trl. Научная новизна. С помощью Р-элемент-индуцированной рекомбинации у самцов получены 23 новые мутации по гену Trl Dr.melanogaster, в том числе семь новых гипоморфных мутаций, представляющих собой делеции, удаляющие различные участки второго интрона гена. Эти мутации являются удобным инструментом в изучении регуляции экспрессии гена Trl. полученные мутации (20 делеций и три дупликации) Все картированы. Проведенный генетический, компьютерный и молекулярный анализ позволил установить наличие функционально-значимых районов во втором интроне гена Trl. Впервые экспериментально показано связывание последовательностей второго интрона с рекомбинантным белком GAGA и белками ядерных экстрактов клеток эмбрионов. 4 Положения, выносимые на защиту. Данные, представленные в работе, свидетельствуют о наличии во втором интроне гена Trl функциональнозначимых районов. В ходе работы были получены 23 новые мутации гена Trl, семь из которых затрагивали только второй интрон гена и были использованы в дальнейших экспериментах. Было установлено, что удаление различных фрагментов второго интрона гена Trl приводит к достоверному снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при 25ºС и/или 29ºС. У мутантов Trl1-72, характеризующихся наиболее сильным снижением жизнеспособности, выявлено изменение по сравнению с нормой картины транскрипции гена Trl при 29ºС на поздних стадиях эмбриогенеза. С помощью метода торможения ДНК-зонда в геле для трех теоретически предсказанных сайтов связывания белка GAGA во втором интроне гена Trl было показано наличие специфического связывания как с белками или белковыми комплексами эмбриональных ядерных экстрактов, так и с рекомбинантным белком GAGA. Используя известные геномные последовательности гена Trl двенадцати различных видов дрозофил, был проведен поиск эволюционноконсервативных элементов во втором интроне гена. В результате было идентифицировано семь таких элементов, с размерами, варьирующими от 17 до 23 п.н. Из них пять – со 100% гомологией. Научно-практическая значимость. Полученные результаты дополняют имеющуюся информацию о регуляторном потенциале интронных последовательностей и расширяют возможности для дальнейших более детальных исследований регуляции гена Trl. Материалы данной диссертационной работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей. Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: International women’s conference on Bien-technology (Daejion, Korea, 2003); Международная конференция “Генетика в России и мире” (Москва, 2006); ВОГИС III (Москва, 2004); XIV Школы по биологии развития «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 5 2004); 10-ой Пущинской Школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2006); Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Украина, Харьков, 2008). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в реферируемых журналах и 7 тезисов в сборниках конференций. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 241 ссылка. Работа изложена на 139 страницах печатного текста, содержит 3 таблицы и 21 рисунок. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Линии D. melanogaster , использованные в работе, описаны в справочнике (Lindsley, Zimm, 1992), базе данных FlyBase (www.Flybase.org), а также в статьях (Федорова и др., 2006; Огиенко и др., 2006). Цитогенетические методы: приготовление препаратов политенных хромосом и анализ жизнеспособности дрозофил проводили по описанным ранее методикам (Федорова и др., 2001). Достоверность результатов оценивали, используя t-критерий Стьюдента и критерий Фишера. Молекулярно-генетические процедуры, связанные с выделением, очисткой, клонированием, амплификацией и введением 32 Р-нуклеотидов в ДНК, проводили стандартными методами, описанными в руководстве Sambrook and Russell (www.MolecularCloning.com). Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 согласно методике производителя (“Applied Biosystems”). Выделение РНК и Нозерн-блот гибридизацию проводили по методике Бурнета (Burnett, 1997). Выделение ядерного экстракта эмбрионов дрозофил проводили согласно методике Soeller et al., 1988. Получение и очистку рекомбинантного белка осуществляли на колонках HisTrap™ HP (GE Healthcare), как описано в руководстве производителя. Торможение проводили по Ueda et al., 1990. 6 ДНК-зонда в геле (EMSA) Праймеры для ПЦР и олигонуклеотиды (для EMSA) синтезированы В.Ф.Кобзевым (ИЦиГ СО РАН). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Получение мутаций по второму интрону гена Trl На момент начала настоящей работы только одна из доступных мутаций – гипоморфная мутация TrlEP(3)3184 – подходила для анализа регуляторного потенциала второго интрона. Поэтому было необходимо получить новые гипоморфные мутации по второму интрону, пригодные для исследования функционально-значимых районов гена Trl. Для этой цели был использован метод индуцированной получения рекомбинации мутаций у самцов, с помощью позволяющий Р-элемент получать перестройки в заданном районе (Preston et al., 1996A; Preston et al., 1996B). Для получения мутаций были использовали две линии: l(3)s2325 и ЕР(3)3184, несущие транспозоны, локализованные, соответственно, в начале второго интрона и ближе к его 3’- концу. В эксперименте, проведенном с использованием линии EP(3)3184, было проанализировано 11268 мух и получено 183 рекомбинанта. В эксперименте с линией l(3)s2325 было проанализировано 20745 мух и получено 220 рекомбинантов. Поскольку рекомбинантные самки в дальнейших скрещиваниях не использовались (чтобы избежать последующих событий рекомбинации), а 34 рекомбинантных самца оказались стерильными, было получено 158 индивидуальных линий, которые далее обозначены как “1-n” для линий, полученных с использованием линии EP(3)3184, и “3-n” для линий, полученных с использованием линии l(3)s2325. Все полученные линии были проверены на наличие перестроек, затрагивающих ген Trl, с помощью ПЦР-анализа. Оказалось, что 23 линии содержат новые мутации гена Trl (рис. 1). 7 Рисунок 1. Размеры полученных делеций. Верхняя линия изображает геномную последовательность гена Trl с отмеченными сайтами рестрикции BamHI (B), EcoRI (E), Nco I (N), Pst (P), Xho I (X). Под ней указано положение праймеров, использованных в данной работе. Треугольники обозначают места встроек Рэлементов в линиях l(3)s2325 и ЕР (3)3184, стрелки внутри треугольников указывают на ориентацию транспозонов. Ниже представлен фрагмент РНК гена Trl. Низкие прямоугольники соответствуют некодирующим районам, высокие – кодирующим. Серым прямоугольником выделен второй интрон гена Trl. Делеции обозначены горизонтальными линиями. I : делеции, затрагивающие кодирующую область гена Trl. Многоточие указывает на то, что границы делеций лежат за пределами гена. II : делеции, затрагивающие область второго интрона гена Trl. Картирование полученных мутаций Большие делеции, выходящие за границы гена Trl (линии 1-3, 1-36, 347, 3-74, 1-25, 3-57 и 3-101), были картированы с помощью световой микроскопии. Эти делеции удаляют различное число дисков, но все они удаляют диск 70F1-2, в котором локализуется ген Trl. 8 Границы остальных шестнадцати перестроек (три дупликации и тринадцать делеций) были определены с точностью до нуклеотида с помощью ПЦР и последующего секвенирования продуктов амплификации. Было установлено, что размеры полученных небольших делеций, варьируют от 45 п.н. до 3.5 т.п.н. Эти делеции можно разделить на две группы (см. табл.1 и рис.1): (1) делеции, затрагивающие наряду со вторым интроном также и кодирующую область гена (линии 1-1; 1-14; 1-56: 1-68; 3-46; 3-92); (2) делеции, затрагивающие только второй интрон гена (линии 1-23; 1-72; 323; 3-37; 3-48: 3-59; 3-85), которые и были использованы в дальнейших экспериментах. Таблица 1. Характеристика полученных делеций по гену Trl Номер линии Границы делеции в соответствии с последовательностью AJ225042, EMBL Наличие концов Рэлемента: 5’-конец 3’-конец Длина делеции, пн 26 45 26 146 995 439 12 638 3-48 4440-4485 3-85 4440-4586 – – 1-23 5456-5895 + 1-72 5456-6094 3-46 3309-4439 + 146 1130 3-23 4440-5621 1181 4440-5686 * 1246 3-92 1929-4439 3-59 4440-5815 1-14 5456-8023 1-56 2842-5448 1-68 3951-6749 1-1 2141-5448 3-47 4440-…. – – – + + – – + – – – 4 3-37 – – – – – + + – – + + – – + + – – * 3-74 1-25 3-57 4440-… 3-101 4440-… – – – – Размер Рэлемента, пн 16 2510 Целый 1375 Целый 2567 29 2606 Нет 2798 Целый 3307 * Удалены диски 70F1-2 и 70Е7 * То же Нет Удалены диски 70F1-2, 70Е7 и 70Е4-5 * 1-3 …-5448 * * * 1-36 …-5448 * * * * - нет данных 9 То же Удалены диски 70F1-2,70Е7, 70Е4-5 и 70Е1-2 * * Анализ жизнеспособности полученных мутантов Для линий 1-23; 1-72; 3-23; 3-59; 3-85 (с нарушениями только в интроне), были проведены стандартные генетические тесты на жизнеспособность (по признаку достижения взрослой стадии) при различных температурах: нормальной (25ºС) и при температуре слабого теплового шока (29ºС). В результате проведенных экспериментов было установлено, что удаление фрагмента в центральной части второго интрона гена Trl (делеции Trl3-85, Trl3-23 и Trl3-59) приводит к достоверному снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при 25ºС. Делеции, удаляющие районы в 3’-конце интрона (Trl1-23 и Trl1-72), снижают выживаемость трансгетерозигот при 29ºС примерно в семь и пять раз, соответственно, по сравнению с нормой (табл. 2). Таблица 2. Выживаемость компаундов делеция/нуль-аллель, развивавшихся при температуре 25˚С и в условиях слабого теплового шока (29˚С) Количество Доля особей, Количество Доля особей, Генотип отложенных доживших до отложенных доживших до яиц при 25ºС имаго при 25ºС яиц при 29ºС имаго при 29ºС Trl 3-85/ Trl R85 Trl 3-23/ Trl R85 Trl3-59(ex)/ TrlR85 Trl 1-23/ Trl R85 Trl 1-72/ Trl R85 OregonR/TrlR85 TrlEP(3)3184/TrlR85 786 1046 1569 310 843 1012 215 0,63±0,017*** 0,57±0,015*** 0,53±0,013*** 0,84±0,021ндр 0,76±0,015*** 0,85±0,011 0,61±0,034ндр 217 1690 1120 261 1165 1089 877 0,51±0,034ндр 0,40±0,012*** 0,35±0,014*** 0,07±0,016*** 0,12±0,009*** 0,56±0,015 0,51±0,017*** *** Отличие от контроля (Oregon R/TrlR85) при Р < 0,001 ; ндр – нет достоверного различия. По-видимому, район второго интрона, удаляемый этими делециями, содержит функционально-значимый элемент, имеющий отношение к температурной чувствительности дрозофилы. Для мутации Trl1-72 было исследовано, как сказывается удаление этого района на протекание различных стадий онтогенеза. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. При нормальной температуре почти все личинки, несущие аллель Trl1-72 в сочетании с нуль-аллелями (TrlR85 и 10 TrlR67) окукливаются, а затем превращаются в имаго. Если развитие идет при температуре слабого теплового шока (29ºС) – менее половины окуклившихся личинок доживают до стадии имаго, а другая часть окуклившихся особей гибнет на стадии предкуколки и/или куколки (таб. 3). Напомним, что при температуре 29ºС гибель мутантов Trl1-72 происходит в основном на эмбриональной стадии развития (табл. 2). Таблица 3. Выживаемость компаундов Trl1-72/нуль-аллель, отсаженных на стадии личинки 1-2 возраста, развивавшихся при температуре 25˚С и в условиях слабого теплового шока (29˚С) Количество Количество Количество отсаженных личинок- окуклившихся особей вылетевших имаго Генотип компаундов (штук) (в % от личинок) (в % от личинок) 90 (при 25ºС) 95% (при 25ºС) 83% (при 25ºС) Trl1-72/TrlR85 Trl1-72/TrlR67 130 (при 29ºС) 90% (при 29ºС) 44% (при 29ºС) 40 (при 25ºС) 80% (при 25ºС) 67% (при 25ºС) 80 (при 29ºС) 81% (при 29ºС) 30% (при 29ºС) Таким образом, при 25ºС у мутантов Trl1-72/нуль-аллель наблюдается одна фаза летальности – эмбриогенез, а при 29ºС появляется еще одна фаза – на стадии предкуколки/куколки. Это наблюдение согласуется с выдвинутым ранее предположением, что нормальная экспрессия гена Trl особенно необходима при преодолении особями дрозофилы основных критических моментов в развитии, таких как вылупление из яйца и вылет из куколки (Катохин и др., 2001). Частичное восстановление жизнеспособности мутантов Trl1-72/TrlR85 при введении дополнительных кДНК копий гена Trl Чтобы проверить, не является ли нарушение экспрессии гена Trl причиной вышеописанного снижения жизнеспособности, были проведены эксперименты по спасению фенотипа мутантных особей. С помощью генетических скрещиваний в геном 11 мутантов Trl1-72 были введены транспозоны hsp83:GAGA-519 или hsp83:GAGA-581, экспрессирующие кДНК гена Trl. Линии, несущие транспозоны, любезно предоставлены профессором П.Шедлом (Greenberg and Schedl, 2001). В результате проведенных экспериментов было установлено, что при добавлении одной копии любого из трансгенов выживаемость (по признаку достижения взрослой стадии) компаундов Trl1-72/TrlR85 при 29ºС возросла – с 12% до 33% (для hsp83:GAGA-519) и до 36% (hsp83:GAGA-581) (рис. 2). Разница между различными транспозонами несущественна, что свидетельствует о том, что обе изоформы белка одинаково важны для спасения фенотипа мутантов Trl1-72/TrlR85. % 40 Рисунок 2. GAGA-трансгены увеличивают выживаемость транс-гетерозигот 1-72 Trl /TrlR85 при 29ºС (в % от ожидаемого, Восток согласно Менделевскому расщеплению, числа). Запад 1-Север генотип Trl1-72/TrlR85 (1168 отложенных яиц); 2- генотип Trl1-72/TrlR85 + Р[GAGA-581] (2050 отложенных яиц); 3- генотип Trl1-72/TrlR85 + Р[GAGA-519] (1162 отложенных яиц). 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 Не полное, а частичное улучшение жизнеспособности (примерно на 20%) может объясняться тем, что «спасение» происходит только на одной стадии летальности. Можно предположить, что на эмбриональной и куколочных стадиях развития определяющими являются разные мРНК и, соответственно, разные изоформы белка. Таким образом, восстановление выживаемости при введении в геном мутантных особей нормальной копии гена Trl свидетельствует о том, что снижение жизнеспособности у мутантов белка GAGA. 12 Trl1-72 обусловлено недостатком Анализ экспрессии гена Trl у мутантов Trl1-72 У мутантов Trl1-72 с помощью Нозерн-блот гибридизации был проведен анализ экспрессии гена Trl при 250С и 290С на разных стадиях эмбриогенеза, так как было показано, что их гибель происходит в основном на этой стадии онтогенеза. У эмбрионов, гомозиготных по аллелю Trl1-72 , выращенных при 250С, картина транскрипции гена соответствует норме, тогда как у эмбрионов, выращенных при 290С, отличается от нее (рис. 3). На ранних стадиях развития эмбрионов (до 8 часов) представленность транскриптов гена Trl у мутантов не отличается от нормы (OregonR). Различия проявляются на поздних стадиях эмбриогенеза. В норме у эмбрионов после 12 часов развития преобладающим становится транскрипт длиной 3,0 т.п.н., а количество доминирующего на ранних стадиях развития транскрипта в 2,5 т.п.н. начинает постепенно уменьшаться. У мутантов в первые 12-16 часов эмбриогенеза представленность транскриптов 2,5 и 3 т.н. примерно одинакова, а на стадии 16-20 часов преобладающим является транскрипт длиной 2,5 т.н. Рисунок 3. Нозерн-блот-анализ экспрессии гена Trl при 29ºС: Нозерн-блот, содержащий тотальную РНК, выделенную из эмбрионов дикого типа (Oregon R) и гомозигот Trl1-72 . Внизу – гибридизация этого же блота с зондом rpl19 в качестве контроля нанесения РНК. В качестве зонда для гибридизации использовали [Р32]-меченые фрагменты кДНК гена Trl (экзоны 2, 3 и 4) и гена rpl19. 13 По-видимому, функционально-значимые элементы, локализованные в районе второго интрона гена Trl, удаляемом делецией 1-72, необходимы для обеспечения правильной эмбриогенеза, а их экспрессии удаление гена приводит на Trl к поздних стадиях нарушению строго стадиеспецифичной картины наработки определенных транскриптов гена Trl. Изучение связывания ядерных экстрактов и рекомбинантного белка GAGA с последовательностями второго интрона гена Trl С помощью компьютерного анализа во втором интроне гена Trl выявляются сайты связывания белка GAGA. Для экспериментального подтверждения связывания последовательностями олигонуклеотиды, белка второго или интрона соответствующие белкового были трем потенциальным комплекса с синтезированы GAGA-сайтам второго интрона гена Trl: GA1 (5’-agaacgagagagtgagacgtagagacagagc-3’); GA2 (5’-gcagacagagagggagagagcgagagaa-3’); GA3 (5’-ggagagtgtgagcgacgctcgaccggagt3’). Методом торможения ДНК-зонда в геле было показано наличие взаимодействия вышеперечисленных олигонуклеотидов с белками или белковыми комплексами эмбриональных ядерных экстрактов, выделенные из клеток эмбрионов дрозофилы, развивающихся при нормальной (25ºС) и повышенной (29ºС) температурах (рис. 4). При связывании белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы, развивавшихся при 25ºС, с олигонуклеотидами GA1, GA2, и GA3 выявляются три полосы задержки – А и Б и В (рис. 4). Эксперимент, когда олигонуклеотиды были нанесены на один гель, показал, что подвижность белковых комплексов, соответствующих этим полосам, одинакова для всех трех олигонуклеотидов. Специфичность полос А и Б подтверждается тем, что они исчезают, когда реакция связывания проводится в условиях конкуренции с тем же самым олигонуклеотидом, который использовался в качестве зонда (GA1, GA2 или GA3, соответственно), но при 14 этом сохраняются при конкуренции с олигонуклеотидами, последовательность которых не содержит GA-последовательностей (CDC73 и C/EBP) (на примере олигонуклеотида GA2 – рис. 4). Из этих же экспериментов следует, что полоса задержки В не является специфичной. При связывании белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы, развивавшихся при 29ºС, картина связывания выглядит несколько иначе – медленномигрирующий комплекс А, специфичный для олигонуклеотидов GA1, GA2 и GA3, присутствующий в ядерных экстрактах клеток эмбрионов, развивавшихся при нормальной температуре, отсутствует в ядерных экстрактах клеток эмбрионов, развивавшихся при 29ºС (рис. 4). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 А Б В Рисунок 4. Связывание белков экстракта ядер эмбрионов дрозофилы, развивавшихся при 25ºС (дор. 1-6) и при 29ºС (дор. 7-10) с олигонуклеотидом GA2: 1 – свободный зонд; 2, 7 – связывание зонда с белками эмбрионального экстракта; 3 – связывание в присутствии 10х молярного избытка олигонуклеотида GA2; 4, 8 – связывание в присутствии 50х молярного избытка олигонуклеотиды GA2; 5, 9 – связывание в присутствии 100х молярного избытка олигонуклеитида C/EBP; 6, 10 – связывание в присутствии 100х молярного избытка олигонуклеитида CDC73. Таким образом, картина связывания олигонуклеотидов GA1 и GA2 и GA3 характеризуется наличием двух специфических белковых комплексов А и Б, если ядерный экстракт выделялся их эмбрионов, развивавшихся при нормальной температуре (25ºС), и одного специфического комплекса – Б, если ядерный экстракт выделялся их эмбрионов, развивавшихся при повышенной температуре (29ºС). Что представляют собой специфические полосы, сказать трудно – это могут быть как белковые комплексы, состоящие из различных ядерных белков, так и комплексы, состоящие только из белка GAGA, что также возможно, благодаря его способности к самоассоциации. 15 Для подтверждения того, что связывание данных районов второго интрона происходит именно с белком GAGA, был проведен эксперимент по торможению ДНК-зонда в геле с использованием экспрессированного и очищенного из клеток E.coli рекомбинантного белка GAGA, который подтвердил связывание синтезированных олигонуклеотидов с белком GAGA. Связывание есть и оно специфичное (рис. 5). 1 2 3 4 5 Рисунок 5. Связывание рекомбинантного белка GAGA, экспрессированного в клетках E.coli, с олигонуклеотидами: 1– экспериментально подтвержденный GAGA-сайт района bxd PRE гена Ultrabithorax (Horard et al., 2000): ccgtatctctccctctctccgcagt (положительный контроль); 2– сайт связывания белков семейства FOXA: (ttttg)x6 (отрицательный контроль); 3 – GA1; 4 – GA2; 5 – GA3. Выявление консервативных фрагментов во втором интроне гена Trl Одним из подходов к идентификации регуляторных элементов является поиск эволюционно-консервативных районов в ортологичных геномных последовательностях – метод филогенетического футпринтинга. Этот подход основан на том, что последовательности, имеющие функциональное значение, часто намного более эволюционно-консервативны, чем нефункциональные последовательности. Используя доступные геномные последовательности гена Trl двенадцати различных видов дрозофил http://www.genome.ucsc.edu (UCSC Genome Bioinformatics Site), был проведен поиск эволюционноконсервативных элементов во втором интроне гена. Было идентифицировано семь консервативных элементов, размеры которых варьируют от 17 до 32 п.н. Пять элементов имеют последовательности, полностью идентичные у всех 12 видов (рис. 6). 16 L(3)s2325 E(P)3184 2 экзон 3 экзон 1 2 5 6 3 4 7 Рисунок 6. Схема второго интрона гена Trl. Треугольниками над линией обозначены транспозоны, под линией – эволюционно-консервативные элементы (1, 3-6 – со 100% гомологией). Стрелками указаны сайты гиперчувствительности к ДНКазе I. Наличие районов со 100% гомологией у всех видов дрозофил (чьи геномы на данный момент секвенированы и доступны для анализа), в том числе и тех, которые эволюционно «разошлись» более 40 млн. лет назад (например, виды D.melanogaster и D.virilis), дает весомые основания считать, что эти районы являются функционально-значимыми (Hartl and Lozovskaya 1994; Gumucio.et al., 1993; Shelton et al., 1997). Эволюционное расстояние между D.melanogaster и D.virilis примерно эквивалентно таковому между мышью и человеком и считается достаточным для оценки возможной функциональности некодирующих последовательностей (Russo et al., 1995). Следует отметить, что большая часть выявленных эволюционноконсервативных последовательностей гиперчувствительных к ДНКазе находится I вблизи (неопубликованные районов, данные Д.А.Карагодина). Районы гиперчувствительности к ДНКазе I, как правило, указывают на возможную локализацию в них регуляторных элементов генома, таких как промоторы, энхансеры, инсуляторы и сайленсеры (Satyamoorthy et al., 1997; Youn, 2001; Felsenfeld, et al., 2003). Таким образом, во втором интроне гена Trl выявлены функциональнозначимые последовательности, о чем свидетельствуют следующие факты: 1) снижение выживаемости особей с делециями по второму интрону; 2) изменение транскрипции гена Trl у мутантов с делецией во втором интроне; 3) наличие во втором интроне сайтов связывания белка GAGA; 17 4) наличие эволюционно-консервативных последовательностей во втором интроне; 5) перекрываемость этих консервативных последовательностей с сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I. Несмотря на то, что не все регуляторные элементы, локализованные во втором интроне гена Trl, идентифицированы, существование функциональнозначимых районов во втором интроне и их влияние на экспрессию гена Trl не вызывает сомнений. ВЫВОДЫ: 1. Получено 23 новых аллеля гена Trl, позволяющих детально исследовать регуляцию экспрессии гена Trl на разных стадиях онтогенеза у D.melanogaster. Проведено цитогенетическое картирование полученных мутаций, из которых 10 мутаций (7 делеций и 3 дупликации) затрагивают только район второго интрона гена Trl, а 13 мутаций, наряду с интронной, затрагивают и кодирующую область гена. 2. Установлено, что удаление фрагмента в центральной части второго интрона гена Trl (делеции Trl3-85, Trl3-23 и Trl3-59) приводит к снижению выживаемости трансгетерозигот делеция/нуль-аллель при нормальной температуре (25º) относительно дикого типа, а удаляющие района в 3’-конце интрона (Trl1-23 и Trl1-72) снижают выживаемость трансгетерозигот при температуре слабого теплового шока (29ºС). Это свидетельствует о том, что центральная часть интрона содержит функционально-значимые элементы, имеющие значение для жизнеспособности дрозофил при нормальной, а 3’-конец интрона – при повышенной температуре. 3. С помощью Нозерн-блот гибридизации показано, что удаление участка второго интрона длиной 700 п.н. приводит к нарушению строго стадиеспецифичной картины наработки определенных транскриптов гена Trl: картина транскрипции гена Trl у мутантов Trl1-72 при повышенной 18 температуре (29ºС) на поздних стадиях эмбриогенеза отличается от нормы соотношением представленности транскриптов 2,5 и 3,0 т.н. 4. Методом задержки ДНК-зонда в геле для трех потенциальных сайтов связывания GAGA, предсказанных методом SITECON во втором интроне гена Trl, показано связывание с ними: а) ядерных белков клеток эмбрионов дрозофил; б) рекомбинантного белка GAGA, экспрессированного в клетках E.coli. Показано, что картина связывания трех GAGA сайтов с белковыми экстрактами ядер клеток эмбрионов меняется в зависимости от температуры, при которой развивались эмбрионы. 5. В результате сравнения последовательности гена Trl 12 различных видов дрозофил во втором интроне гена было выявлено семь эволюционноконсервативных элементов, размеры которых варьируют от 17 до 32 п.н., из них пять – со 100% гомологией. Публикации: 1. А.В.Катохин, А.В.Пиндюрин, Е.В.Федорова, Э.М.Баричева. Молекулярногенетический анализ гена Trithorax-like, кодирующего транскрипционный фактор GAGA Drosophila melanogaster // Генетика. 2001. Т.37, № 4, С.467-474. 2. Е.В.Федорова, А.АОгиенко., Д.А.Карагодин, К.Г.Айманова, Э.М.Баричева. Получение и анализ новых мутаций по гену Trithorax-like Drosophila melanogaster // Генетика. 2006. Т.42. № 2. С. 149-158. 3. А.А.Огиенко, Д.А.Карагодин, С.А.Федорова, Е.В.Федорова, В.В.Лашина, Э.М.Баричева. Анализ новой гипомофной мутации гена Trithorax-like, влияющей на оогенез Drosophila melanogaster // Онтогенез. 2006. Т. 37. № 3. С. 157–166. 4. Е.В.Федорова, А.В.Пиндюрин, Э.М.Баричева. Поддержание паттернов экспресии гомеозисных генов в развитии Drosophila melanogaster белками групп Polycomb, trithorax и ETP // Генетика. 2009. Т. 45. №.10. С.1301–1318. 19 Подписано к печати 18.02.2010 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч.изд. 0,7 Тираж 100 экз. Заказ 9. ______________________________________________ Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10 20
