Характеристика РНК, связанной с протеогликанами в печени крыс

ХАРАКТЕРИСТИКА РНК, СВЯЗАННОЙ
С ПРОТЕОГЛИКАНАМИ В ПЕЧЕНИ КРЫС
В.И.Рыкова, О.А.Любинский, Л.М.Скобельцина
Лаборатория структуры генома
Институт цитологии и генетики СО РАН
630090, Новосибирск, просп. ак. Лаврентьева, 10
тел.: (3832) 33–39–10, факс: (3832) 33–12–78
еmail: dimshits@niboch.nsc.ru
Протеогликаны ( ПГ) – сложные макромолекулы, состоящие из цепей гликозаминогликанов (ГАГ), ков алентно св язанных с белков ым кором. Они яв ляются обязательным компонентом в сех жив отных клеток и участвуют в таких фундаментальных
биологических процессах, как дифференциров ка, морфогенез, пролиферация.
Функция этих молекул основ ана на в заимодейств ии цепей ГАГ или белков ого кора с
различными молекулами клетки. ПГ св языв ают ионы кальция, в заимодействуют с
белками в неклеточного матрикса, цитокинами, ферментами (РНК- и ДНК-полимеразами, топоизомеразами), факторами роста. ПГ представ ляют собой очень гетерогенный класс макромолекул, которые отличаются друг от друга по молекулярному
в есу, состав у, тонкой структуре ГАГ цепей и функциям. Однако св ойств а молекул ПГ
и механизм их действ ия в настоящее в ремя изучены недостаточно.
Ранее мы показали, что ПГ способны в заимодейств ов ать с РНК с образов анием комплекса ПГ-РНК [1, 2]. В данной работе мы охарактеризов али РНК, в ходящую
в состав комплекса, и определили длину молекулы РНК.
Материалы
–
–
–
–
–
–
–
ДЭАЭ-сефадекс А-25, «Farmacia», Шв еция;
агароза, «Bio-Rad», США;
ЭДТА, «Fluka», Шв ейцария;
метилен-бис-акриламид, додецилсульфат натрия, персульфат аммония, ксиленцианол, Stains-All, «Serva», Германия;
акриламид, «Reanal», Венгрия;
бромфенолов ый синий, «MERCK», Германия;
ацетат натрия, ацетат бария, хлорид натрия, борная кислота, мочев ина, фенол –
были отечеств енного произв одств а классификации х.ч. и о.с.ч.
Методы
Выделение комплекса ПГ- РНК
В работе использовали печень крыс линии WISTAR в в озрасте 2–3 месяцев . Выделение пров одили по методу, ранее разработанному в нашей лаборатории [3]. Для
этого печень крыс гомогенизировали в 0,14 М раств оре NaCl, 5 мМ ЭДТА (1:10). Гомогенат фильтров али через 4 слоя капрона для освобождения от неразрушенной ткани,
добав ляли равный объем в одонасыщенного фенола и центрифугировали (40 мин, 3600
g, 40С). Верхний в одный слой отделяли и повторяли депротеинизацию водонасыщенным фенолом. После центрифугирования к в ерхнему в одному слою добав ляли концентрированную хлорную кислоту до 0,5 N конечной концентрации для удаления нуклеинов ых кислот. РНК отделяли центрифугиров анием (10 мин, 3600 g, 40С). Кислый супернатант нейтрализов али до рН 7, добав ляли ацетат натрия до концентрации 4% и дв а
объема этанола. Образовав шийся осадок (комплекс ПГ-РНК) центрифугировали (10
мин, 3600 g, 40С), промыв али 96%-м этанолом и проводили хроматографию на ДЭАЭсефадексе А25. С этой целью колонку урав новешив али дистиллированной водой, затем наносили раствор, содержащий комплекс ПГ-РНК, и в ели ступенчатую элюцию: 1)
в одой для удаления гликогена; 2) 0,05 М ацетатом натрия для удаления белков и слабозаряженных гликопротеинов; 3) 0,6 М ацетатом натрия для удаления примеси РНК,
не связанной с ПГ; 4) собственно комплекс ПГ-РНК элюиров али 2 М раствором ацетата
натрия и осаждали дв умя объемами 96%-го этанола. Осадок формировался в течение
24 часов при температуре 40С, затем его отделяли центрифугиров анием, промыв али
этанолом и хранили под этанолом при температуре -150С.
Электрофорез комплекса ПГ-РНК в агарозном геле
Горизонтальный электрофорез пров одили в пластинах 1%-го агарозного геля
5x8 см, толщиной 1 мм. В качеств е буфера использов али 0,07 М ацетат бария рН 8.
Разделение в ели при силе тока 30 мА в течение 50 мин при 40С. Окрашив ание электрофореграмм пров одили 0,1%-м раств ором толуидинов ого синего в 1%-й уксусной
кислоте в течение 15–20 мин. Избыток красителя удаляли промыв анием геля 1%-й
уксусной кислотой до полного просв етления фона. Затем пластину геля переносили
на пластиков ую подложку и сушили на в оздухе при комнатной температуре. Используемый в работе краситель толуидинов ый синий позв оляет получить дифференциальное окрашив ание ПГ и нуклеинов ых кислот. Сульфатиров анные ПГ приобретают
фиолетов ые тона, нуклеинов ые кислоты – голубые.
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)
Электрофорез пров одили в 20%-м ПААГ на ТВЕ-буфере (89 мМ трис-HCl,
89 мМ борная кислота, 2,5 мМ ЭДТА, рН 8,2) с 7 М мочев иной. Пробы наносили в
буфере для образцов (95%-й формамид, 0,5% SDS, 0,5 М ТВЕ, рН 8,2), содержащем
0,5%-й ксиленцианол и перед нанесением кипятили 1 минуту на в одяной бане. Размеры пластины геля 150 x 105 x 1 мм. Электрофорез в ели при 540 В и 8 мА в течение 3 часов . После пров едения электрофореза гель окрашив али 0,5%-м «Stains-All»
в 50%-м формамиде в течение 15 минут в темноте с последующей отмыв кой геля
дистиллиров анной в одой и обесцв ечив анием фона на св ету. Гель в ысушив али на
бумаге Whatman 3MM с помощью сушилки для гелей.
Ионнообменная хроматография на ДЭАЭ-сефадексе А25
Колонку заполняли 100 мкл геля, промыв али в одой и наносили раств ор препарата комплекса ПГ-РНК в 50 мМ ацетате натрия. Хроматографию пров одили в диссоциирующих услов иях (7 М мочев ина) в линейном градиенте NaAc (50 мМ –
1 М). Элюент подав али с помощью перистальтического насоса со скоростью
19,6 мл/час. Общий объем градиента 40 мл. Содержание нуклеинов ых кислот определяли с помощью проточного спектрофотометра Uvicord по поглощению на длине
в олны 254 нм.
Результаты и обсуж дение
Комплекс ПГ-РНК, в ыделенный из печени крыс (см. Методы), идентифициров али на присутств ие РНК и ПГ. Протеогликаны в комплексе определяли с помощью
электрофореза в агарозном геле и специфических ферментов , как описано ранее
[3]. РНК определяли по УФ-спектру, а также с помощью электрофореза в агарозном
геле по дифференциальному окрашив анию с толуидинов ым синим (см. Методы). На
рисунке 1 прив едена электрофореграмма комплекса. Верхняя фракция содержит
РНК (окрашена в голубой цв ет), нижние фракции, содержащие только ПГ, окрашены
в фиолетов ый цв ет. После обработки комплекса последов ательно рибонуклеазами
А и Т фракция, окрашенная в голубой цв ет, исчезает. При этом заметно изменяется
подв ижность нижней фракции ПГ и в озрастает ее количеств о, что яв ляется одним
из доказательств существ ов ания комплекса ПГ-РНК.
Для характеристики РНК, в ходящей в состав комплекса, на перв ом этапе исследов ания мы определили ее длину. С этой целью были использов аны дв а метода: метод ионнообменной хроматографии и метод электрофореза в ПААГ (см.
Методы).
a
a1
РНК
Окраска
голубая
ПГ
Окраска
фиолетов ая
ПГ
Окраска
фиолетов ая
Рис. 1. Электрофоретическая картина комплекса ПГ-РНК.
А – исходный препарат; А 1 – исходный препарат после обработки рибонуклеазами А и Т (см.
объяснение в тексте).
При пров едении ионнообменной хроматографии однов ременно с исследуемым в еществ ом на колонку наносили АТФ и [32 P] меченые олигонуклеотиды длиной
в 15 нуклеотидов . Для определения размера РНК использов али линейную зав исимость длины РНК от концентрации NaAc, необходимой для элюции ее из колонки,
полученную при хроматографии стандартных препаратов олигонуклеотидов и АТФ.
Согласно полученным данным, исследуемая РНК элюиров алась из колонки при концентрации NaAc, рав ной 0,56 М, что соотв етствует длине приблизительно 20 нуклеотидов (рис. 2).
При определении длины РНК методом электрофореза в 20% ПААГ в качеств е
маркеров молекулярного в еса наносили красители (бромфенолов ый синий и ксиленцианол) и олигорибонуклеотиды длиной в 20 нуклеотидов . Электрофорез препаратов , нанесенных на гель в денатурирующих услов иях (95%-й формамид,
0,1%-й додецилсульфат натрия), в ыяв ил гетерогенную популяцию олигорибонуклеотидов длиной от 10 до 20 нуклеотидов (рис. 3).
Таким образом, по данным ионнобменной хроматографии и электрофореза в
ПААГ можно сделать в ыв од, что РНК в комплексе ПГ-РНК из печени крыс содержит
гетерогенный набор олигорибонуклеотидов длиной от 10 до 20 нуклеотидов .
25000
1,0
АТФ
[32 Р] 15 н.
20000
0,8
15000
0,6
10000
0,4
5000
0,2
0
[NaAc] M
радиоактивность, импульс/мин
РНК
0,0
Рис. 2. Ионнообменная хроматография РНК из комплекса на ДЭАЭ- сефадексе А-25 в 7 М
мочевине с линейным градиентом NaAc (50 мМ – 1 М) (объяснение см. в тексте).
КЦ
БФС
1
2
3
Рис. 3. Электрофоретический анализ РНК из комплекса в денатурирующих условиях (20%
ПААГ, ТВЕ-буфер, рН 8,2, 540 В, 3 час ).
1 – красители ксиленцианол (КЦ) и бромфеноловый синий (БФС); 2 – маркер: олигорибонуклеотид длиной 20 нуклеотидов; 3 – РНК из комплекса.
Следует отметить, что наиболее актив ной частью молекулы ПГ яв ляется ее
углев одная часть – гликозаминогликаны (ГАГ), обладающие в ысоким отрицательным зарядом. Во многих работах показана способность ГАГ в заимодейств ов ать с
самыми различными молекулами клеток: ионами металлов [4], коллагеном, фибронектином, ламинином [5], ростов ыми факторами [6]. Кроме того, обнаружено и подробно исследов ано св ойств о самоассоциации ГАГ. Показано, что гепарансульфаты,
а также дерматансульфаты образуют ассоциаты, соединенные между собой в одо-
родными св язями и разделяющиеся на мономеры в 4 М гуанидингидрохлориде, т.е.
ГАГ способны образов ыв ать комплексы полианионов , несмотря на силы отталкив ания между одноименно заряженными группами [7]. Мы, в св ою очередь, показали,
что ПГ могут в заимодейств ов ать с полианионами другой природы, к которым относятся молекулы РНК. Работ по в заимодейств ию полисахаридов с нуклеинов ыми кислотами изв естно немного. Так, срав нительно дав но было показано, что, полисахариды растительного происхождения, ксиланы, которым приписыв алась против оопухолев ая актив ность, образуют комплексы с одноцепочечной ДНК. Такое в заимодейств ие, как полагают авторы, пов ышает хрупкость ДНК и в ызыв ает ее разрывы [8].
В последние годы комплекс ПГ- РНК описан в работах Умбрейта, который в ыделил комплекс ПГ с олигорибонуклеотидами из кожи св иньи [9] и молочной железы
мышей [10]. По данным этого автора, РНК, в ходящая в состав комплекса, также
представ лена олигорибонуклеотидами длиной 10–20 нуклеотидов .
В настоящее в ремя о функциях ПГ в клетке изв естно относительно много, однако феномен подобного комплекса ПГ- РНК совсем не изучен, и роль, которую в
комплексе в ыполняет РНК, не ясна. Одна из теорий предполагает структурную роль
РНК. Поскольку св языв ание с РНК меняет физико-химические св ойств а ПГ, в ероятно образов ание при этом более плотной и компактной структуры цепей ГАГ. Изменение в структуре мембран-св язанных ПГ пов лекут за собой изменения в рецепторных системах, конформации в неклеточного матрикса [9]. Может оказаться, что олигорибонуклеотиды из комплекса ПГ- РНК в ыполняют самостоятельную специфическую функцию в клетке. Не ясна природа этих олигорибонуклеотидов , яв ляются ли
они продуктом специфического считыв ания с ДНК или получаются в результате
расщепления РНК боль шего размера и несущей другие функции. Неясным также
остается на каком этапе в клетке к молекуле ПГ присоединяется РНК. Все эти в опросы требуют дальнейших исследов аний.
Список литературы
1. Grigorieva E.V., Rykova V.I. Nuclear proteoglycans of mouse liver cells: specific
interaction w ith G-rich oligonucleotides // Protein Sci. 1995. V. 4. Suppl. 1. P. 106.
2. Григорьева Э.В., Рыкова В.И. Взаимодейств ие специфических ядерных протеогликанов с олигорибонуклеотидами // Докл. АН. 1997. Т. 356. Р. 693–695.
3. Рыкова В.И., Зимина Н.П., Николаева Е.С. Срав нение состав а протеогликанов ,
в ыделенных из интактной и регенерирующей печени крысы // Биохимия. 1985.
Т. 50. С. 1249–1253.
4. Steward W.P., Christmas S.E., Lyon M., Gallagher J.T. The synthesis of proteoglycans
by human T lymphocytes // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1052.
P. 416–425.
5. Templeton D.M. Metal-binding properties of the isolated glomerular basement
membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 926. P. 94–105.
1. Subramanian S.V., Fitzgerald M.L., Bernfield M. Regulated shedding of syndecan-1
and -4 ectodomains by thrombin and grow th factor activation // J. Biol. Chem. 1997.
V. 272, № 23. P. 14713–14720.
7. Fransson L.A. Structure and functions of cell-associated proteoglycans // TIBS. 1987.
V. 12, № 1. P. 406–411.
8. Yamafuji K., Lio M., Ero M. Interaction of deoxyribonucleic acid w ith xylans having
antitumor activity // Z.Krebsforsch. 1970. V. 75. P. 55–58.
9. Umbreit J.N. A small RNA is associated w ith dermatan sulfate proteoglycan //
Anticancer Res. 1996. V. 16, № 4a. P. 1899–1914.
10.Umbreit J.N. Proteoglycans and glycosaminoglycans during maturation of the mouse
mammary gland // Anticancer Res. 1996. V. 16, № 5a. P. 3013–3029.