Liquid ALT (SGPT)
Reagent Set
Каталожный № HTI-A7526
Каталожные номера:
Уровень снижения абсорбции прямо пропорционален
активности АЛТ.
HTI-A7526-120
HTI-A7526-600
Реагенты
Назначение
Набор
предназначен
для
количественного
определения аланинаминотрансферазы (АЛТ) в
сыворотке крови.
Клиническое значение
Активность фермента аланинаминотрансферазы
(АЛТ) определяется во многих тканях. Наиболее
высокая активность АЛТ обнаружена в ткани печени,
сердца, скелетной мускулатуры и почек. Однако, АЛТ
считается более специфичным для печени, чем АСТ.
При заболеваниях печени и желчного пузыря, таких
как цирроз, метастатическая карцинома, вирусный
гепатит происходит повышение уровня АЛТ.
Повышение уровня АЛТ происходит и при таких
состояниях
как
мышечная
дистрофия,
дерматомиозиты, острый панкреатит, инфекционный
мононуклеоз.
История метода
Ультрафиолетовый метод для определения АЛТ был
описан Henley в 1955 году и Wroblewski и La Due в
1956. Henry и соавт. в 1960 году. В 1974 году комитет
по
ферментам
Скандинавского
Общества
Клинической Химии и Клинической Физиологии
(Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical
Physiology) рекомендовали этот метод в оптимальной
модификации. В 1980 году Международная
Федерация
Клинической
Химии
(IFCC)
рекомендовала
совместное
использование
лактадегидрогеназа-НАДH. Процедура, описанная
далее, основана на этом методе.
Принцип теста
L-аланин + α-кетоглутарат
Пируват + NADH + H+
АЛТ
ЛДГ
Пируват + L-глутамат
L-Лактат + NAD+ + H2O
АЛТ катализирует перенос аминогрупп с L-аланина на
α-кетоглутарат с образованием пирувата и Lглутамата.
Лактатдегидрогеназа
подвергается
окислению, при этом NADH окисляется до NAD.
После смешивания реагента А и реагента В концентрация
L-аланиновой кислоты 500 мМ, α-кетоглутаровой кислоты
15 мМ, Лактатдегидрогеназы (микробная) > 2000 МЕ/мл,
NADH 0,18 мМ, Буфер, 100мМ, Буфер рН 7,5+0,1, азид
натрия 0,01. Стабилизаторы.
Подготовка реагентов
Смешать 5 объемов реагента R1 и 1 объем реагента R2
(например, 250 мл реагента R1 и 50 мл реагента R2).
Хранение реагентов и стабильность
1.
2.
Хранить в холодильнике при 2-80С.
Неоткрытый набор можно использовать до
истечения срока годности, который указан на
этикетке набора. Растворенные реагенты стабильны
в течение 2 дней при комнатной температуре (18250С) и 14 дней в холодильнике при 2-80С.
Непригодные для анализа реагенты
Не использовать реагент если:
1. Начальная абсорбция рабочего реагента против
воды при 340 нм больше 0,800.
2. Изменились свойства реагента.
Предостережения
1. Только для in vitro диагностики
2. Реагент R1 содержит в качестве консерванта раствор
азида натрия <0.1% (w/v). Азид натрия при контакте с
металлом может образовывать взрывоопасные
соединения. Поэтому при удалении реагентов в
сточные трубы (свинец) необходимо смывать их
большим количеством проточной воды.
Сбор и хранение образцов
1. Использовать только свежие, негемолизированные
образцы сыворотки крови.
2. Концентрация фермента стабильна в течение 3 дней
при комнатной температуре (15-300С), 7 дней в
холодильнике при 2-80С и 30 суток в холодильнике при
-200С.
Влияние других соединений
1. Билирубин при концентрации 30 мг/дл, гемоглобин при
концентрации 400 мг/дл, не оказывают влияние на
результаты исследования.
Liquid ALT (SGPT)
Reagent Set
Каталожный № HTI-A7526
Материалы, входящие в состав набора
Реагенты АЛТ (SGPT): реагент R1, реагент R2.
Материалы
необходимые,
поставляемые
но
не
1.
2.
3.
4.
Автоматические пипетки.
Пробирки
Таймер
Биохимический анализатор, для измерения
абсорбции при длине волны 340 нм.
5. Термостатируемый блок / водяная баня (370С).
Автоматический метод определения
Wavelength:
Assay Type:
Sample/Reagent Ratio:
Reaction Direction:
Temperature:
Lag Time:
Read Time:
Low Normal:
High Normal:
340 nm
Kinetic
1:10
Decreasing
37°C
60 seconds
60 seconds
5 U/L
34 U/L
Существуют параметры измерения концентрации АЛТ
на других анализаторах. Необходимо связываться со
службой технической поддержки.
Ручной метод определения
1. Приготовить рабочий реагент в соответствии с
инструкцией.
2. Внести по 1,0 мл реагента в каждую пробирку.
Инкубировать в течение 5 минут при 370С.
3. Настроить спектрофотометр на «0» по воде при
340.
4. Внести по 100 мкл исследуемых образцов
сыворотки крови. Перемешать. Инкубировать в
течение 1 минуты при 370С.
5. После инкубации измерить абсорбцию. Прогреть
реакционную смесь до 370С. Повторить измерение
2 раза с интервалом в 1 минуту.
6. Определить изменение абсорбции в минуту
(∆А/мин)
7. ∆А/мин помноженная на фактор 1768 (смотрите
Подсчёт результатов) даст результат в IU/L.
Замечания к проведению процедуры
1. Если
используется
спектрофотометр
с
автоматическим
температурным
контролем
реакционной кюветы, считывание абсорбции
должно проводиться в отдельной кювете.
2. Очень низкое последнее считывание, вместе с
небольшим
изменением
абсорбции
между
считываниями могут отражать очень большой уровень
АЛТ. Разбавьте и проведите тест заново если
необходимо.
Ограничения
1. В мутных и сильно иктеричных образцах начальная
абсорбция может быть очень высокой. Рекомендовано
для анализа использовать 50 мкл образца.
Полученные результаты необходимо умножить на 2.
2. Если в исследуемом образце предполагаемая
концентрация фермента выше, чем 500 МЕ/мл, то
необходимо провести разведение: 1 объем
исследуемой плазмы/сыворотки на 1 объем
изотонического солевого раствора. Полученные
результаты необходимо умножить на 2.
Калибровка
Процедура
стандартизована
по
миллимолярной
абсорбции NADH (6,22 при 340 нм) при стандартных
условиях.
Подсчет результатов
Одна международная единица(IU/L) – это то количество
фермента, которое при определенных условиях
катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1
минуту.
АЛТ(МЕ/л)=(∆Аbs/минХ1,10Х1000)/(6,22Х0,10Х1,0)=
=∆А/минХ1768
Где:
∆А/мин – изменение абсорбции в минуту.
1,10 – общий объем реакционной смеси (мл)
1000 – перевод МЕ/мл в МЕ/л.
6,22 – миллимолярная абсорбция NADH
0,10 – объем исследуемого образца, мл.
1,0 – длина светового пути, см.
Пример подсчета:
∆А/мин = 0.12
тогда, 0,12Х1768=212 МЕ/л
Внимание: если объемы реакционной смеси изменены,
необходимо
сделать
пересчет
результатов
в
соответствии с формулой.
Международные
единицы:
для
перевода
в
международные единицы (nkat/l) умножить концентрацию
фермента в МЕ/л на 16,67.
Liquid ALT (SGPT)
Reagent Set
Каталожный № HTI-A7526
Контроль качества
Рекомендовано при каждом проведении серии
анализов включать коммерческие контрольные
сыворотки (патологические и нормальные) с
известной концентрацией АЛТ. Рекомендовано в
каждой лаборатории устанавливать свою частоту
проведения контроля качества.
Концентрация у практически здоровых лиц
АЛТ: 4-24 МЕ/л при 300С, до 4-36 МЕ/мл при 370С. В
каждой лаборатории необходимо устанавливать свои
границы нормальных значений.
Характеристики теста
Линейность: 0-500 МЕ/л
Сравнение
Проведен корреляционный анализ результатов,
полученных на данных тест-наборах и другого
коммерческого
тест-набора.
Коэффициент
корреляции составил 0,999, регрессионный анализ:
у=0,96Х+3,2. (n=128, диапазон концентраций 7-625
МЕ/мл).
Точность
Внутри серии
Среднее
S.D.
30
106
381
0.7
0.8
3.1
C.V.%
От серии к серии
Среднее S.D.
C.V.%
2.3
0.7
0.8
31
118
382
2.3
1.4
0.9
0.7
1.7
2.5
Чувствительность
Определялась
по
изменению
абсорбции
изотонического солевого раствора при 340 нм и в
образце сыворотки крови с известной концентрацией.
Были проведены серии из 10 исследований.
Результаты показали, что абсорбция в АЛТ реагенте
практически не отличается от таковой в нулевом
стандарте. Изменение абсорбции на 0,0004 примерно
эквивалентно активности АСТ 1 МЕ/л.
Произведено High Technology Inc.
109 Production Rd
Walpole, MA 02081 USA
Fax: 1 508 660-22-24
e-mail: [email protected]
Скачать

Liquid ALT (SGPT) Reagent Set Каталожный № HTI