Автореферат Розовой О.Н.
advertisement
На правах рукописи РОЗОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА СВОЙСТВА И РОЛЬ ПИРОФОСФАТ-ЗАВИСИМЫХ 6-ФОСФОФРУКТОКИНАЗ У АЭРОБНЫХ МЕТАНОТРОФОВ И МЕТИЛОБАКТЕРИЙ 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино – 2011 Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ю.А. Троценко Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.А. Головлева доктор биологических наук, профессор Р.Н. Ивановский Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино декабря Защита состоится «01» 2011 г. в 10:00 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, проспект Науки, д.5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru./ и http://www.ibpm.ru./ Автореферат разослан « » 2011 г. Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук Т.В. Кулаковская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Углеводный метаболизм многих организмов основан на гликолизе, функционирующем во всех трех доменах – Bacteria, Archaea и Eukarya. У большинства из них ключевую стадию этого пути – фосфорилирование фруктозо-6фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата, катализирует аллостерически регулируемая АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (АТФ-ФФК). У архей эту реакцию осуществляет АДФ-зависимый фермент из семейства глюкокиназ, не проявляющий сходства аминокислотной последовательности с 6-фосфофруктокиназами (ФФК), но имеющий аналогичную кристаллическую структуру (Sakuraba, Ohshima, 2002; Ronimus, Morgan, 2001; Ito et al., 2001). Однако у ряда про- и эукариот – фототрофных бактерий, анаэробов, паразитических микроорганизмов, Euglena gracilis, а также у высших растений присутствует пирофосфат-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ПФК), гомологичная по аминокислотной последовательности АТФ-ФФК. Реакция, катализируемая ПФК, обратима, что предполагает участие фермента как в гликолизе, так и глюконеогенезе: Mg2+ Фруктозо-6-Ф + ФФн Фруктозо-1,6-Ф2 + Фн Причины и следствия замены АТФ на ФФн в ключевой реакции гликолиза неясны. Предложены альтернативные гипотезы, рассматривающие присутствие ПФК как проявление “ископаемого метаболизма”, который сохранился в качестве рудимента у небольшого числа организмов, или, напротив, ПФК могли возникнуть из АТФзависимых ферментов под давлением условий обитания, и это приобретение явилось адаптивным приспособлением к анаэробным условиям (Bapteste et al., 2003; Siebers et al., 1998; Chi, Kemp, 2000). Ранее ПФК была обнаружена у аэробных метанотрофов – специализированной группы бактерий, использующих метан в качестве источника углерода и энергии. Считалось, что ПФК нехарактерна для не растущих на метане метилобактерий, что указывало на ее возможную связь с метаболизмом метана (Шишкина, Троценко, 1990; Бесчастный и др., 1992), за исключением актиномицета Amycolatopsis methanolica, растущего на метаноле (Alves et al., 1994). Однако недавно в геномах Methylibium petroleiphilum PM1 (Kane et al., 2007) и ризосферных фитосимбионтов Methylobacterium nodulans ORS 2060 и Methylobacterium sp. 4-46 найдены гены-гомологи ПФК. Метанотрофы и метилобактерии ассимилируют углерод метана и метанола посредством двух альтернативных циклических путей – рибулозомонофосфатного (РМФ) (метанотрофы I типа) или серинового (II тип), в которых первичными продуктами биосинтеза являются, соответственно, С6-фосфосахара или С3-соединения. Кроме того, метилобактерии могут ассимилировать углерод метанола после окисления до СО2 через цикл Кальвина. Особую группу представляют метанотрофы X типа, реализующие одновременно три пути С1-ассимиляции – РМФ, сериновый и минорный 1 цикл Кальвина, где в числе первых продуктов образуются С6- и С3-соединения. Как следствие, у метилотрофов с различными путями первичного С1-метаболизма значение гликолиза в биосинтезе фосфотриоз или фосфогексоз различно, что обусловило их перспективность для изучения функциональной роли ПФК и ФФн. Доступность нуклеотидных последовательностей геномов ряда облигатных метанотрофов и факультативных метилобактерий Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (I тип), Methylococcus capsulatus Bath (X тип), Methylosinus trichosporium OB3b (II тип), а также Methylobacterium nodulans ORS 2060, позволила использовать основанную на клонировании современную методологию очистки рекомбинантных ПФК для последующей характеристики и филогенетического анализа. Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы – изучить свойства и роль ПФК в метаболизме метилотрофных бактерий, реализующих различные пути С1метаболизма. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК и фруктозо-1,6бисфосфатальдолазы (ФБА) из Methylococcus capsulatus Bath. 2. Изучение организации кластера (возможности котранскрипции) генов pfp и hpp в хромосоме Mс. capsulatus Bath. 3. Очистка и характеристика рекомбинантной ПФК из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. 4. Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК из Methylosinus trichosporium OB3b и Methylobacterium nodulans ORS 2060. 5. Проведение филогенетического анализа ПФК. Научная новизна. Обнаружено, что ПФК Mс. capsulatus Bath, кроме фруктозо-6фосфата (Фр-6-Ф), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (С-7-Ф) и рибулозо-5фосфат (Ру-5-Ф), проявляет наиболее высокое сродство и активность с С-7-Ф, и имеет наибольшее сходство аминокислотной последовательности с ортологами из хемолитоавтотрофных бактерий. Предложена схема модифицированного цикла Кальвина с участием ПФК в реакциях восстановительного пентозофосфатного пути. Впервые установлено, что у Mс. capsulatus Bath гены pfp и hpp, кодирующие ПФК и мембранную H+-транслоцирующую пирофосфатазу, транскрибируются в виде бицистронной мРНК, на основании чего предположено участие ПФК и ФФн в энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Показано, что ФБА Mс. capsulatus Bath обратимо катализирует расщепление как фруктозо-1,6-бисфосфата (ФБФ), так и седогептулозо-1,7-бисфосфата (СБФ). Доказано, что ПФК Mm. alcaliphilum 20Z высокоактивна в направлении гликолиза и глюконеогенеза, но неэффективна в реакции с С-7-Ф. ПФК Ms. trichosporium OB3b и Mb. nodulans ORS 2060 проявляют более высокое сродство к ФБФ, чем к Фр-6-Ф, что указывает на преимущественное участие данных ферментов в глюконеогенезе. 2 Найдено, что ПФК Ms. trichosporium OB3b ингибируется АМФ и АДФ, что подразумевает участие фермента в регуляции синтеза и распада углеводов в зависимости от энергетического статуса клеток. Индуцибельность ПФК при росте Mb. nodulans ORS 2060 на арабинозе и более высокое сродство с С-7-Ф, чем с Фр-6-Ф, указывают на специфическую функцию фермента при использовании сахаров в анаэробных условиях фитосимбиоза. Установлено, что ПФК Mс. capsulatus Bath и Ms. trichosporium OB3b проявляют наибольшее сходство аминокислотных последовательностей с ортологами хемолитоавтотрофов и принадлежат к филогенетической подгруппе «В2» группы II 6фосфофруктокиназ. Ферменты Mm. alcaliphilum 20Z и Mb. nodulans ORS 2060 отнесены к ФФК филогенетической подгруппы «Р», для большинства которых доказана гликолитическая функция. Научно-практическое значение. Благодаря высокой активности и стабильности, ПФК Mm. alcaliphilum 20Z может быть использована в аналитической биохимии как специфический реагент для определения ФБФ в качестве сопрягающего фермента при измерении скорости реакции альдольной конденсации, катализируемой ФБА, а также для измерения скорости образования ортофосфата или пирофосфата. Уникальная способность ПФК Mс. capsulatus Bath обратимо фосфорилировать С-7-Ф может найти применение в синтезе СБФ и С-7-Ф. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2006-2010гг), на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), на международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на I и III школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008; Нижний Новгород, 2010), на III и IV международном конгрессе европейских микробиологов (FEMS; Гётеборг, Швеция, 2009; Женева, Швейцария, 2011), на ХIII международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), на VIII международном конгрессе экстремальных микроорганизмов (Понта-Дельгада, Португалия, 2010), на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010), на научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», посвященной памяти акад. Е.Н. Кондратьевой (МГУ, 2010). Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 10 тезисов. 3 Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН и ИБ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Мустахимову И.И., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Бесчастному А.П., Глухову А.С. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям ― д.б.н. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 197 ссылки, из них 16 на русском и 181 на английском языках, содержит 11 таблиц и 41 рисунок. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследований служили чистые культуры облигатных метанотрофов Mc. capsulatus Bath, Mm. alcaliphilum 20Z, Ms. trichosporium OB3b и факультативной метилобактерии Mb. nodulans ORS 2060. Облигатных метанотрофов выращивали на минеральной среде «П» в атмосфере СН4 и воздуха (1:1) (Гальченко и др., 1986), а Mb. nodulans ORS 2060 на минеральной среде «К» (Doronina et al., 2004) с метанолом (1%) или арабинозой (1 г/л). Для выращивания Mm. alcaliphilum 20Z в среду дополнительно вносили Na-карбонатный буфер и 3% NaCl. Штаммы Escherichia coli BL21(DE3) и Rosetta (DE3) выращивали при 37оС на жидкой или агаризованной средах “LB” с добавлением при необходимости хлорамфеникола и/или ампициллина (100 мкг/мл). Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом (Marmur, 1961). Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование, получение компетентных клеток и их трансформацию, определение стартовой точки транскрипции, нозерн-блот анализ проводили стандартными методами (Sambrook, Russell, 2001). Тотальную РНК выделяли модифицированным методом (Chomczynski, Sacchi, 1987). Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и VectorNTI®Advance v.9.0. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (v1.62b). Филогенетический анализ проводили с помощью пакета программ MEGA4 (Tamura et al., 2007). Последовательности генов pfp получены из незавершенных геномов Mm. alcaliphilum 20Z и Methylocaldum szegediense O-12 (http://www.genoscope.cns.fr/externe/English/corps_anglais.html). Клонирование и экспрессия генов. Гены pfp амплифицировали из геномной ДНК Mс. capsulatus Bath, Mm. alcaliphilum 20Z, Ms. trichosporium OB3b и Mb. nodulans ORS 2060 и клонировали в векторах pET22b+ или pHUE. Полученную рекомбинантную плазмиду pET22b:pfpBath трансформировали в клетки Е. coli BL21(DE3), рЕТ22b:pfp20Z 4 – в клетки E. coli Rosetta (DE3), а pET22b:pfpOB3b и pHUE:pfpnod – в клетки Е. coli BL21(DE3), содержащие дополнительную плазмиду pT-groE. Ген fba Mс. capsulatus Bath амплифицировали с геномной ДНК и клонировали в векторе pET22b+. Полученную плазмиду pET22b:fba трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3). Экспрессию генов в штаммах E. coli индуцировали добавлением ИПТГ. Рекомбинантные ферменты ПФК-His6, ПФК-убиквитин-His6 и ФБА-His6 очищали из E. coli с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni2+-NTA-агарозой, согласно протоколу фирмы “Quiagen” (Германия). После очистки, ПФК-убиквитин-His6 Mb. nodulans ORS 2060 обрабатывали деубиквитинирующей протеазой Usp2, затем снова очищали на колонке с Ni2+-NTA. В результате получали ПФК без дополнительных навесок. Чистоту белковых препаратов и молекулярную массу субъединиц белков определяли электрофорезом в 12%-ном SDS-ПААГ по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Молекулярные массы нативных ПФК и ФБА определяли с помощью градиентного 4-30% ПААГ электрофореза. Для ПФК Ms. trichosporium OB3b и ФБА Mс. capsulatus Bath дополнительно проводили гель-фильтрацию на колонках с Ультрагелем AcA 34 и сефакрилом S-200, соответственно (“Pharmacia”, США). Характеристика ПФК. Активность ПФК определяли в прямой и обратной реакциях непрерывно (с сопрягающими ферментами) и периодически (по образованию Фн) по начальной скорости реакции при 30°С (Bertagnolli, Cook, 1984). За единицу активности ферментов принимали количество, вызывающее превращение 1 мкмоль субстрата в минуту. При исследовании влияния рН на активность и стабильность ПФК использовали следующие буферные растворы (50 мМ): MES-NaOH (pH 5,56,5), имидазол-HCl (pH 6,0-8,0), HEPES-HCl (pH 7,0-8,0), Трис-HCl (pH 7,0-9,0), глицин-NaOH (8,5–10). В качестве потенциальных эффекторов были проанализированы пируват, цитрат, ФЕП, АТФ, АДФ, АМФ, НАДФ, НАД, НАДФН, рибозо-5-фосфат, глюкозо-6-фосфат, глюкозо-1-фосфат, серин, фосфогликолат, фосфоглицерат. Для тестирования возможности замены Mg2+ другими двухвалентными металлами добавляли водные растворы BaCl2, MnCl2, CoCl2, CuCl2. Значения Km каж и Vmax рассчитывали с помощью программы SigmaPlot 10. Характеристика ФБА. Расщепляющую активность ФБА по отношению к ФБФ и СБФ измеряли с помощью сопрягающего фермента α-глицерофосфатдегидрогеназы (“Sigma”, США) по окислению НАДН при 30°С. Влияние рН на активность ФБА изучали с использованием следующих буферов: ацетатного (pH 5,0–5,5), фосфатного (pH 6,0–6,5), Трис-HCl (pH 7,0–9,0) и глицин-NaOH (pH 9,5–10,0). Активность ФБА в направлении синтеза ФБФ оценивали спектрофотометрически, используя в качестве сопрягающих ферментов глюкозофосфатизомеразу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (“Sigma”, США) и рекомбинантную ПФК из Methylomonas methanica 12, полученную, как описано в работе Решетникова с соавторами (2005). 5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика ПФК и ФБА Methylococcus capsulatus Bath 1.1. Характеристика ПФК-His6 Для получения рекомбинантной ПФК из Mс. capsulatus Bath, ген pfp (MCA1251) клонировали в экспрессионном векторе pET22b+. Плазмиду pET22b:pfpBath трансформировали в клетки E. coli BL21(DE3). Аффинной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA агарозой получен гомогенный препарат ПФК-His6 с удельной активностью в прямой реакции 7,6 Е/мг белка и обратной – 9,0 Е/мг белка. А кДа 94,6 66,2 45,0 М 1 2 Б кДа 440 М Рис. 1. ПААГ-электрофорез ПФК Mс. capsulatus Bath (А) в присутствии ДСН и (Б) в нативных условиях при градиенте пористости 4-30%. 1, 2 – 3 и 5 мкг ПФК. М – маркеры молекулярных масс. 232 140 31,0 21,5 67 14,4 ПААГ-электрофорезом в денатурирующих и нативных условиях показано, что ПФК Mс. capsulatus Bath является гомодимером с м. м. субъединицы около 45 кДа (рис. 1), что характерно для большинства изученных бактериальных ПФК. Активность фермента зависела от ионов Mg2+, с ионами Co2+ или Mn2+ (50 мкМ) составляла 69% и 50%. ПФК наиболее активна при рН 7,0, строго специфична к ФФн как фосфатному донору (табл. 1). Аллостерические эффекторы фермента не обнаружены. Кривые насыщения фермента субстратами в прямой и обратной реакциях подчинялись уравнению Михаэлиса-Ментен. При этом полученные значения Km каж сопоставимы с таковыми для ПФК из других организмов, за исключением более высокого Km каж для Фр-6-Ф (табл. 1). ПФК Mc. capsulatus Bath использует в качестве субстратов С-7-Ф и СБФ, а также Ру-5-Ф/РБФ, при этом сродство и активность с С-7-Ф выше (Km каж 0,03 мМ, Vmax 31 Е/мг белка), чем с Фр-6-Ф (Km каж 2,27 мМ) или Ру-5-Ф (Km каж 4,05 мМ). Ранее активность с С-7-Ф обнаружена у ПФК Еntamoeba histolytica (Susskind et al., 1982) (табл. 1), а также у факультативного анаэроба Propionibacterium freudenreichii и золотистой фасоли Phaseolus aureus (Bertagnolli et al., 1986), однако, специфичность и активность этих ферментов с Фр-6-Ф были выше, чем с С-7-Ф. Поскольку у Mс. capsulatus Bath функционирует цикл Кальвина, но отсутствуют гены, кодирующие ключевые для этого пути СБФ/фруктозо-1,6-бисфосфатазу (СБФ/ФБФазу) или седогептулозо-1,7-бисфосфатазу (СБФазу), логично предположить, что ПФК может участвовать в превращениях пентозофосфатов в цикле Кальвина (рис. 2). Кроме того, у Mc. capsulatus Bath отсутствуют гены АТФ-ФФК и фруктозо-1,6бисфосфатазы (ФБФазы), катализирующих необратимые стадии гликолиза и 6 глюконеогенеза. Следовательно, функционально ПФК заменяет эти ферменты. На основании свойств ПФК и данных анализа генома Mc. capsulatus Bath, нами предложена схема метаболизма углерода, отражающая участие ПФК в гликолизе, глюконеогенезе и перестроечных реакциях модифицированного цикла Кальвина (рис. 2). ХН2 О2 Н2О Х ММО CH4 НАДH2 PQQ МДГ X PQQH HCHO CH3OH НАД+ ГФС Рибулозо-5Ф XH2 ФАДГ НАД+ НАДH2 ФДГ HCOOH CO2 Н2О ГФИ Гексулозо-6Ф Фруктозо-6Ф ФФн Ксилулоза-5Ф Полисахариды ТК Фн ФГИ ПФК Глюкозо-6Ф Фруктозо-1,6Ф2 Фруктозо-6Ф ФФн ПФК Фн Эритрозо-4Ф АТФ ФБА ТА ФРК АДФ ФБА КДФГ ДОАФ КДА ГА-3Ф Седогептулозо -1,7Ф2 ПФК ГА-3Ф Фн ФФн Седогептулозо -7Ф О2 ТК СО2 РБФК Рибулозо-1,5Ф2 3-ФКГ 2-фосфоглицерат Пируват АТФ ПФДК АМФ, Фн CO2 ПК АДФ 2-ФГК Рибозо-5Ф Ксилулозо -5Ф РФИ АТФ, Фн ЦТК ФЕП РФЭ Сериновый цикл Рибулозо-5Ф Биосинтез Глицин СН2О Серин Рис. 2. Предполагаемая схема С1-ассимиляции у Methyloсoccus capsulatus Bath. О способности ПФК обратимо фосфорилировать Ру-5-Ф до сих пор не сообщалось. У Mс. capsulatus Bath имеется АТФ-зависимая фосфорибулокиназа (ФРК), катализирующая необратимую реакцию синтеза РБФ из Ру-5-Ф. При этом известно, что активности ключевых ферментов цикла Кальвина у Mс. capsulatus Bath и других метанотрофов Х типа модулируются ростовой температурой (Ешинимаев и др., 2004). Поэтому при зависимых от температуры флуктуациях уровней интермедиатов цикла Кальвина ПФК может вовлекать избыточный РБФ в основной метаболизм (рис. 2). 1.2. Изучение транскрипционной организации pfp и hpp генов У Mс. capsulatus Bath в непосредственной близости к гену pfp (2133 п.н.) обнаружена ОРС (MCA1252), продукт которой гомологичен Н+-ФФн-азам V-типа из Geobacter sulfureducens (62% идентичности транслированных аминокислотных 7 Таблица 1. Некоторые свойства ПФК различных микроорганизмов Параметры Methylomicrobium Methylobacterium Methylomonas Propionibacterium Methylococcus Methylosinus Rhodospirillum Amycolatopsis alcaliphilum nodulans methanica freudenreichii capsulatus trichosporium rubrum methanolica Entamoeba histolytica Vmax, Е/мг белка Фр-6-Ф 577 86,89 840 258 7,6 88 20 107 45,7 ФБФ 805 74,7 850 232 9,0 89 24,2 н.о. 45,0 C-7-Ф 0,18 46,56 н.о. н.о. 31 85 н.о. н.о. н.о. 0,118 ± 0,006 0,0060 ± 0,0003 0,051 0,069 0,027 ± 0,005 0,011 ± 0,001 0,025 0,2 0,014 Фр-6-Ф 0,64 ± 0,02 0,65 ± 0,11 0,39 0,1 2,27 ± 0,24 0,24 ± 0,04 0,38 0,4 0,038 C-7-Ф 1,01 ± 0,09 0,21 ± 0,02 н.о. н.о. 0,030 ± 0,004 0,51 ± 0,26 н.о. н.о. 0,064 3,4 ± 0,2 1,04 ± 0,10 1,7 0,6 8,69 ± 1,22 2,4 ± 0,2 0,82 0,84 0,8 0,095 ± 0,017 0,043 ± 0,001 0,1 0,051 0,328 ± 0,012 0,074 ± 0,008 0,02 0,025 0,018 0,22 ± 0,02 0,047 ± 0,001 0,038 0,008 0,028 ± 0,005 0,030 ± 0,001 н.о. 0,04 н.о. 0,33 ± 0,04 0,32 ± 0,01 0,35 0,083 2,00 ± 0,31 0,363 ± 0,007 н.о. 0,77 0,5 180 4х45 180 4x45 92 2х45 95 2х48 90 2х45 270 6х45 95(40/360) 2х40 170 4х45 100 2х60 Оптимум pH 7,5 7,5 8,0 7,4 7,0 7,5 7,2/8,6 7,5 7,0 Оптимум температуры, °C 30 30 40 25 30 50 н.о. 35-46 20 Эффекторы нет нет нет нет нет АМФ, АДФ АМФ, АТФ, АДФ нет нет Данная работа (Beschastny et al., 1992) (O’Brien et al., 1975) Km каж, мМ: ФФн Фн ФБФ 2 Mg +: В прямой реакции В обратной реакции Mr , кДа Число субъединиц Ссылки Данная работа н.о. – не определяли 8 (Pfleiderer, Данная работа Данная работа Klemme, 1980) (Reeves et al., (Alves et al., 1976; 1994) Susskind et al., 1982) последовательностей) и Rhodospirillum rubrum (58%). Для изучения возможной котранскрипции генов pfp и hpp, проводили ПЦР с применением обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР). кДНК, синтезированную с праймером RT-Mcap1, использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами McapF2 и RT-Mcap2. В результате был получен фрагмент ожидаемой длины, что указывало на котранскрипцию генов pfp и hpp в виде одной бисцистронной мРНК (рис. 3, А). А pfp Б hpp McapF2 1 RT-Mcap2 RT-Mcap1 2 3 4 500 п.н В Рис. 3. Транскрипционная организация pfp и hpp генов Mс. capsulatus Bath. (A) ОТ-ПЦР для определения межгенного участка pfp-hpp генов. 1 – молекулярные маркеры; 2 – ПЦРпродукт, полученный с хромосомной ДНК; 3 – ПЦР-продукт, полученный с кДНК, 4 – продукт ПЦР с мРНК. (Б) Картирование стартовой точки транскрипции pfp-hpp-оперона. Стрелкой обозначен +1 нуклеотид. (В) Схематическое представление результатов картирования. Последовательности -10 и -35 предполагаемого промотора выделены и подчеркнуты; последовательность Шайн-Дальгарно выделена курсивом. Методом удлинения праймера установлено, что транскрипция оперона pfp-hpp осуществляется с единственного промотора, причем стартовой точкой транскрипции является нуклеотид A, находящийся на расстоянии 30 н.п. от стартового кодона гена pfp (рис. 3, Б). Анализ in silicо нуклеотидной последовательности выше стартового транскрипционного сайта выявил области -10 (TAAGTT) и -35 (TTGTAA) предполагаемого промотора, сходные с консервативными последовательностями, узнаваемыми субъединицей σ-70 РНК-полимеразы E. coli (рис. 3, В). 3′-область гена hpp содержала ГЦ-богатый инвертированный повтор (5’-ccctcctgcctcctccgcccggcgggaggg-3’), который, возможно, формирует шпильку со свободной энергией ∆G = -18.3 кКал/моль. Этот участок может функционировать как ρ-независимый транскрипционный терминатор, однако поли-Т в данной последовательности отсутствует. Таким образом, нами обнаружено, что гены, кодирующие два пирофосфатзависимых фермента, являются сцепленными и транскрибируются с одного промотора 9 как одна бисцистронная мРНК (рис. 3). Можно предположить, что ФФн, синтезируемый в реакции, катализируемой ПФК, а также как побочный продукт анаболических реакций, у Mс. capsulatus Bath и ряда автотрофных бактерий гидролизуется мембранной Н+-ФФн-азой. Создаваемый при этом протонный градиент на мембране, в свою очередь, может обеспечивать энергией синтез АТФ в обход дыхательной цепи. Таким образом, ПФК Mс. capsulatus Bath является многофункциональным ферментом, участвующим в конструктивном и энергетическом метаболизме метанотрофа. Анализ транслированной аминокислотной последовательности показал, что ПФК Mс. capsulatus Bath принадлежит к филогенетической подгруппе “В2” II типа 6фосфофруктокиназ, согласно принятой классификации (Bapteste et al., 2003). При этом составляющие данную подгруппу 6-фосфофруктокиназы имеют в активном центре и Asp124 (данные относительно аминокислотной аминокислоты Lys104 последовательности АТФ-ФФК E. coli). Следовательно, подгруппа “В2” представлена только ФФн-зависимыми ферментами. ПФК Mс. capsulatus Bath на 80% идентична ферменту из другого метанотрофа Х типа - термофильного Methylocaldum szegediense О12, и проявляет также высокую гомологию (70-74% идентичности) с ортологами из литоавтотрофных β-протеобактерий: нитрификаторов Nitrosomonas europaea и Nitrosospira multiformis, денитрификатора Thiobacillus denitrificans, а также факультативного метилотрофа Methylibium petroleiphilum PM1 (рис. 4). Перечисленные бактерии обладают сходными метаболическими особенностями: у них функционирует цикл Кальвина (или, по крайней мере, в геномах присутствуют гены ключевых ферментов этого пути), а окисление энергетического субстрата осуществляется по монооксигеназному механизму. Кроме того, анализ геномов T. denitrificans, N. europaea и N. multiformis выявил, что гены pfр у этих бактерий локализованы в одном кластере с геном, кодирующим мембрансвязанную Н+-ФФн-азу. Резонно полагать, что ПФК Mс. capsulatus Bath и автотрофных протеобактерий имеют близкие свойства и аналогичные функции. 1.3 Характеристика ФБА-His6 У Mc. capsulatus Bath изучали свойства фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы (ФБА) фермента гликолиза/глюконеогенеза, сопряженного с ПФК. Гомогенный рекомбинантный фермент с 6 гистидинами на С-конце получен клонированием гена fba (MCA3041) в экспрессионном векторе pET22b+, трансформацией полученной плазмиды pET22b:fba в клетки E. coli BL21(DE3) и использованием аффинной хроматографии. Согласно данным электрофореза и гель-фильтрации ФБА является гексамером (Mr = 240 кДа). Для ФБА II класса характерны двумерные, тетрамерные или октамерные формы, однако о шести-субъединичных ферментах ранее не сообщалось. Фермент Mc. 10 81 Nitrosomonas europaea (CAD85845) Nitrosospira multiformis (ABB74047) Methylibium petroleiphilum (ABM95730) 58 93 Thiobacillus denitrificans (AAZ97455) 53 Methylococcus capsulatus (AAU92465) 91 Methylocaldum szegediense* Beggiatoa sp. PS (EDN70902) Nitrosococcus oceani (ABA59292) Chromohalobacter salexigens (ABE58887) 94 Hahella chejuensis (ABC32449) Marinobacter aquaeolei (ABM19478) Legionella pneumophila (AAU27983) Nitrococcus mobilis (EAR21417) 54 Xylella fastidiosa (AAF83087) 99 100 Xanthomonas oryzae (BAE67633) Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7 (ACL71381) Saccharophagus degradans (ABD80197) Moorella thermoacetica (ABC19548) Opitutus terrae (ACB74686) Clostridium difficile (CAJ70002) 100 Gallionella capsiferriformans (ZP_04831102) Mariprofundus ferrooxydans (EAU55532) Magnetococcus sp. MC-1 (ABK44425) 100 Methylosinus trichosporium (ZP 06888368) 100 99 Polaromonas naphthalenivorans (ABM38853) 96 Rhodoferax ferrireducens (ABD68116) 97 Leptothrix cholodnii (ACB32316) 53 Thioalkalivibrio sp. HL-EbGR7 (ACL71453) Magnetospirillum magnetotacticum (ZP 00055860) Rhodospirillum rubrum (ABC24201) Hoeflea phototrophica (EDQ35137) 83 100 Labrenzia alexandrii (EEE44488) Nakamurella multipartite (ACV78222) 68 Rhizobium leguminosarum (ACS57129) 100 Agrobacterium radiobacter (ACM27062) 70 Sinorhizobium medicae (ABR60939) 100 Methylobacterium nodulans (ACL55713) 100 Methylobacterium sp. 4-46 (ACA16250) Methylomicrobium alcaliphilum* 100 Methylobacter tundripaludum (EFO03887) 91 84 Methylomonas methanica (AAY28468) Opitutus terrae (ACB73441) Rhodopirellula baltica (CAD78962) Mastigamoeba balamuthi (AAF70463) 92 Nocardioides sp. JS614 (ABL82600) Kribbella flavida (ADB35868) Propionibacterium freudenreichii (AAA25675) Propionibacterium acnes (AAT82837) Beutenbergia cavernae (ACQ80161) Cellulomonas flavigena (EEN39659) 85 Jonesia denitrificans (ACV09088) 97 Sanguibacter keddieii (ACZ21515) 61 74 Xylanimonas cellulosilytica (ACZ31018) SHORT Rhodopirellula baltica (CAD75440) LONG Entamoeba histolytica (EAL47787) B1 Escherichia coli (ATP; POA796) Methylacidiphilum infernorum (ATP; ACD84176) Rhodospirillum rubrum (ATP; ABC21848) III Planctomyces maris (EDL56936) Amycolatopsis methanolica (AAB01683) 94 69 100 80 98 66 99 0.1 B2 P Рис. 4. Филогенетическое дерево ПФК прокариот и эукариот. Подчеркнуты метилотрофные бактерии. В скобках указаны номера аминокислотных последовательностей, депонированных в GenBank. 11 capsulatus Bath был активен в широком диапазоне рН от 5,5 до 8,5, увеличиваясь на 25% при рН 9,0–9,5. Активность фермента обнаруживалась в отсутствие металла, но увеличивалась в 2,5 раза в присутствии Со2+, при этом инкубация с 1 мМ ЭДТА полностью ингибировала активность ФБА. Таким образом, фермент Mc. capsulatus Bath принадлежит ко II классу фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаз. В отсутствие металла в реакционной смеси зависимость скорости реакции от концентрации ФБФ соответствовала кинетике Михаэлиса–Ментен (Km кажФБФ 0,018 мМ, Vmax 1,26 Е/мг белка) (рис. 4, А). Однако добавление 20 мкM Co2+ приводило к появлению двух значений Km каж. При концентрациях субстрата 0,008–0,5 мM Km кажФБФ = 0,0052 (Vmax = 4,46 ± 0,11). При концентрациях субстрата 0,5–1,5 мM Km кажФБФ=1,1 мМ (Vmax =13,9 ± 2,8 Е/мг белка) (рис. 5, Б). ФБФ при концентрации >2 мМ ингибировал активность фермента в присутствии добавленного Co2+ (20 мкM), но не в отсутствие металла. Вероятно, Со2+ изменяет степень агрегации субъединиц фермента, что оказывает влияние на кинетические константы. Б 1,4 1,2 Активность, E/мг белка Активность, Е/мг белка А 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 1 2 3 4 5 8 6 4 2 0 0 1 2 3 [Фруктозо-1,6-Ф2], (мМ) [Фруктзо-1,6-Ф2], (мM) 4 Рис. 5. Зависимость активности ФБА Mc. capsulatus Bath от концентрации ФБФ как субстрата в отсутствие Co2+ в реакционной смеси (А) и в присутствии 20 мкМ Со2+ (Б). В обратной реакции зависимость между концентрацией субстрата и скоростью реакции имела гиперболический характер (Km каж ДОАФ 0,095 ± 0,027 мМ, Km каж ГАФ 1,17 ± 0,12 мМ, Vmax 0,46 Е/мг белка). Фермент не имеет аллостерических эффекторов, следовательно направленность реакции регулируется соотношением С6- и С3интермедиатов. Важно отметить, что реакция конденсации ДОАФ и ГАФ, катализируемая ФБА, редко исследовалась из-за сложности измерения ФБФ. Проблема детекции образующегося ФБФ была нами решена с использованием в качестве сопрягающего фермента рекомбинантной ПФК, катализирующей обратимую реакцию образования фруктозо-6-фосфата из фруктозо-1,6-бисфосфата. ФБА также катализировала расщепление СБФ (Km каж =0,19 мМ, Vmax =0,71 Е/мг белка). При этом активность фермента увеличивалась в 2 раза в присутствии 20 мкM Co2+, однако ингибирования высокими концентрациями СБФ (2–4 мМ) не наблюдалось как при добавлении, так и в отсутствие Со2+ в реакционной смеси. Таким образом, 12 помимо гликолиза и глюконеогенеза ФБА Mc. capsulatus Bath может участвовать в восстановительных реакциях пентозофосфатного цикла (рис. 2). В хромосоме Mc. capsulatus Bath ген fba, кодирующий ФБА, расположен в окружении генов, кодирующих ферменты цикла Кальвина и специфические ферменты РМФ-пути. С помощью нозерн-блот анализа показано, что ген fba транскрибируется как моноцистронная мРНК размером 1,5 т.п.н. (размер гена 1,06 т.п.н.) (рис. 6). При этом уровень экспрессии гена fba выше при росте Mc. capsulcatus Bath при 45°С, по сравнению с клетками, растущими при 27°С и 37°С. Аналогичная прямая зависимость от температуры роста показана для активности РубисКО в экстрактах клеток метанотрофа. Эти данные косвенно указывают на роль ФБА в цикле Кальвина. 1 2 3 1500 п.н. Рис. 6. Нозерн-блот анализ транскрипции гена fba. Тотальную РНК выделяли из клеток Mc. capsulatus Bath, выращенных при 27°С (1), 37°С (2) и 45°С (3). 10 20 10 20 10 20 мкг мкг мкг мкг мкг мкг Транслированная аминокислотная последовательность гена fba метанотрофа имеет наиболее высокую идентичность с ФБФ-альдолазами из автотрофных бактерий Magnetospirillum magnetotacticum (72%), Xanthobacter autotrophicus, X. flavus и Nitrosomonas europaea, а так же метилотрофа Methylibium petroleiphilum (71%). Эти бактерии также содержат пирофосфат-зависимые 6-фосфофруктокиназы, высоко гомологичные ПФК Mc. capsulatus Bath. Ген fba у этих бактерий (аннотируется как сbbA) входит в состав оперона cbb, кодирующего ферменты цикла Кальвина. Полученные результаты указывают на эволюционный тандем ФБА и ПФК, необходимый для функционирования цикла Кальвина. 2. Характеристика ПФК Methylomicrobium alcaliphilum 20Z Электрофоретически гомогенный препарат ПФК-His6 получен клонированием гена pfp Mm. alcaliphilum 20Z в экспрессионном векторе pET22b+, трансформацией плазмиды pET22b:pfp20Z в клетки продуцента E. coli Rosetta (DE3) и аффинной хроматографией клеточного лизата E. coli на колонке с Ni2+-NTA агарозой. Удельная активность фермента в прямой и обратной реакциях составила 577 и 805 Е/мг белка. ПФК Mm. alcaliphilum 20Z является гомотетрамером с м.м. субъединицы 45 кДа (рис. 7). Ранее тетрамерная структура была показана только для ПФК факультативного метилотрофа Amycolatopsis methanolica (Alves et al., 1994). Гиперболический характер кривых насыщения субстратами указывает на подчинение ПФК Mm. alcaliphilum 20Z 13 кинетике Михаэлиса-Ментен (рис. 8). Основные характеристики ПФК Mm. alcaliphilum 20Z представлены в таблице 1. 3 А 2 1 M M кДа Б кДа 175 80 58 46 Рис. 7. 12% SDS-ПААГэлектрофорез (А) и градиентный 430% ПААГ-электрофорез (Б) рекомбинантной ПФК Mm. alcaliphilum 20Z. 1, 2, 3 – 3, 5, 15 мкг ПФК, соответственно. М – маркеры молекулярных масс. 440 232 30 140 25 67 17 В отличие от ПФК Mc. capsulatus Bath, фермент Mm. alcaliphilum 20Z проявлял незначительную активность с С-7-Ф (0,18 ± 0,01 Е/мг белка), а также имел низкое сродство к данному субстрату (Km каж =1,01 ± 0,09 мМ). Фермент не активен с Ру-5-Ф. Высокая удельная активность ПФК Mm. alcaliphilum 20Z в прямой и обратной реакциях и отсутствие аллостерических эффекторов указывают на активное участие фермента в гликолизе и глюконеогенезе (рис. 9). 350 800 Активность, Е/мг белка Активность, Е/мг белка А 300 600 250 200 400 150 200 100 0 50 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0 4 Б 12 16 600 Активность, Е/мг белка 240 Активность, Е/мг белка 8 [Фн], мМ [Фруктозо-1,6-Ф2], мМ 500 200 400 160 300 120 80 200 40 0 1 2 100 3 0,0 [Фруктозо-6-Ф], мМ 0,5 1,0 1,5 2,0 [ФФн], мМ Рис. 8. Зависимость активности ПФК Mm. alcaliphilum 20Z от концентрации субстратов прямой (А) и обратной (Б) реакций. У Mm. alcaliphilum 20Z отсутствует АТФ-зависимая ФФК, следовательно, ПФК является единственным ферментом, катализирующим ключевую реакцию гликолиза. 14 Однако в геноме имеется ген ФБФазы, катализирующей необратимое дефосфорилирование ФБФ. Mm. alcaliphilum 20Z – галотолерант, и в качестве одного из осмопротекторов синтезирует сахарозу, что сопровождается образованием ФФн. Возможно, при росте метанотрофа в условиях высокой солености сопряженная работа ПФК и ФБФазы формирует футильный цикл, в котором удаляется избыток ФФн и происходит регенерация Фр-6-Ф – субстрата для синтеза сахарозы (рис. 9). XH2, O2 мММО X, H2O PQQH2 CH4 НАДH, O2 HCOH рММО НАД+, H2O PQQ МДГ НАД HCНO + ФАДГ НАДH НАД HCOOH + ГФС 3-Гексузоло-6Ф Рибулозо-5Ф ГФИ HCНO Рибулозо-5Ф ГФС ГФС Рибулозо-5Ф 3-Гексулозо-6Ф 3-Гексулозо-6Ф СФС Фруктозо-6Ф ФФн ФБФаза ПФК Фн Фн Фруктозо-1,6Ф2 HCНO ФРЭ УДФ CO2 ФДГ Гликоген Сахароза-6P НАДH УДФ УДФ-глюкоза ФГИ Глюкозо-1Ф Глюкозо-6Ф НАД(Ф)+ ГФДГ ФБА ГФС НАД(Ф)H Фруктозо-6P 6-Ф-глюконат ДОАФ Фруктозо-6Ф ТК ГА-3Ф Эритрозо-4Ф ТК НАДФ ФРЭ Фосфоглю конатДГ ТФИ ТА Ксилулозо-5Ф УТФ ФГМ ГФС ФРИ Рибозо-5Ф Седогептулозо-7Ф ФФн УДФ-ГПФ ГАФ + КДА Фн Пируват ГАФ-ДГ НАДФH Ксилулозо-5Ф 2-Кето-3-дезокси-6-Ф-глюконат ATФ, Фн AДФ 1,3-ФГК ФГК ATФ ПФДК AMФ, ФФн 3-ФГК 2-ФГК энолаза НАДФH СО2 ATФ ПК AДФ ФГМ Рис. 9. Предполагаемая схема С1-ассимиляции у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. НАДФ+ Ацетил-КoA AТФ ФЕПС АМФ, Фн ЦТК ФЕП Биосинтез ПФК Mm. alcaliphilum 20Z принадлежат к филогенетической подгруппе «Р» II типа 6-фосфофруктокиназ, включающей хорошо изученные ферменты из M. methanica 12 и Pr. freudenreichii. ПФК Mm. alcaliphilum 20Z наиболее близка (87-89% идентичности) с ферментами из метанотрофных γ-протеобактерий, также реализующих РМФ путь (Mm. album, Methylobacter tundripaludum). Следует отметить, что подгруппа «Р» в основном представлена ферментами из гетеротрофных микроорганизмов, для ПФК которых доказана гликолитическая функция, в том числе амитохондриального простейшего Mastigamoeba balamuthi. 15 3. Характеристика ПФК Methylosinus trichosporium OB3b и Methylobacterium nodulans ORS 2060 Гены pfp Ms. trichosporium OB3b (EFH03142) и Mb. nodulans ORS 2060 (Mnod_0681) клонировали в экспрессионных векторах pET22b+ или pHUE, соответственно. Полученные плазмиды рЕТ22b:pfpOB3b и pHUE:pfpnod трансформировали в клетки E. coli BL21 (DE3), с предварительно внесенной плазмидой pT-groE. Аффинной хроматографией на Ni2+-NTA агарозе были получены гомогенные препараты ПФК-His6 Ms. trichosporium OB3b и ПФК Mb. nodulans ORS 2060. ПФК Mb. nodulans ORS 2060 – гомотетрамер с м. м. 180 кДа, тогда как фермент Ms. trichosporium OB3b – гомогексамер с м. м. 270 кДа (рис. 10). Ранее о гексамерной структуре ПФК не сообщалось. Показано, что ПФК R. rubrum в растворе может быть в виде мономера, димера и октамера (Pfleiderer, Klemme, 1980). А кДа М 116,0 66,8 1 2 Б 2 1 M кДа Рис. 10. 12% SDS-ПААГэлектрофорез (А) и градиентный 4-30% ПААГ-электрофорез (Б) рекомбинантных ПФК. 1 – ПФКHis6 Ms. trichosporium OB3b, 2 – ПФК Mb. nodulans ORS 2060. М – молекулярные маркеры. 440 45,0 35,0 232 140 25,0 67 18,0 14,4 Основные биохимические и кинетические характеристики ПФК Ms. trichosporium OB3b и Mb. nodulans ORS 2060 представлены в таблице 1. ПФК Ms. trichosporium OB3b и Mb. nodulans ORS 2060 фосфорилировали также С-7-Ф (табл. 1 и 2, рис. 11). Несмотря на то, что активность ПФК Mb. nodulans ORS 2060 с С7-фосфосахаром ниже, специфичность фермента к этому субстрату, как показал расчет соотношения Kcat/Km каж, выше, чем к Фр-6-Ф (табл. 2). Таблица 2. Специфичность ПФК метилотрофных бактерий к С6- и С7-фосфосахарам Фруктозо-6-фосфат Метилотрофные бактерии Methylomicrobium alcaliphilum Methylococcus capsulatus Methylobacterium nodulans Methylosinus trichosporium Седогептулозо-7-фосфат Фруктозо-1,6-бисфосфат Km каж, мМ Kcat Kcat/ Km каж Km каж, мМ Kcat Kcat/ Km каж Km каж, мМ Kcat Kcat/ Km каж 0,64 104 163 1,01 0,032 0,03 0,095 145 1526 2,27 0,68 0,3 0,03 2,8 93 0,328 0,8 2,4 0,65 16 24 0,21 8,3 40 0,043 13,4 312 0,24 24 99 0,51 23 45 0,070 24 343 16 50 Б 70 Активность, Е/мг белка Активность, Е/мг белка А 40 30 20 10 0 1 2 3 60 50 40 30 20 10 4 0 [Седогептулозо-7-Ф], мМ 1 2 [Седогептулозо-7-Ф], мМ 3 Рис. 11. Зависимость активности ПФК Ms. trichosporium OB3b (А) и Mb. nodulans ORS 2060 (Б) от концентрации С-7-Ф. Более высокая специфичность ПФК к С-7-Ф коррелирует со способностью этого фитосимбионта расти на сахарах, при этом участие ПФК в реакциях пентозофосфатного цикла увеличивает возможность получения С3-соединений (рис. 12). Кроме того, в экстАрабиноза изомераза Рибулоза киназа (ACL62836) Рибулозо-5Ф РФЭ РФЭ (ACL56729) (ACL56729) Ксилулозо-5Ф Ксилулозо-5Ф Рибозо-5Ф фосфокетолаза (ACL62773) Ацетил-Ф цикл Кребса ГАФ ГАФ 1,3-ФГК транскетолаза (ACL59258) трансальдолаза (ACL62182) Фруктозо-6Ф Седогептулозо-7Ф ФФн ПФК Фн Седогептулозо-1,7Ф2 ФБА 3-ФГК 2-ФГК Ксилулозо -5Ф транскетолаза (ACL59258) ГАФ ФЕП Эритрозо-4Ф ГАФ Фруктозо-6Ф ФФн Фн ПФК Фруктозо-1,6Ф2 ФБА Биосинтез Пируват ДОАФ ГАФ ТФИ Рис. 12. Предполагаемая схема метаболизма арабинозы у Mb. nodulans ORS 2060. 17 рактах клеток Mb. nodulans ORS 2060, выращенных с L-арабинозой в качестве субстрата, выявлена в два раза более высокая активность ПФК (50 мЕ/мг белка), по сравнению с клетками, выращенными на метаноле (22 мЕ/мг белка). Активность ПФК Ms. trichosporium OB3b с С-7-Ф и Фр-6-Ф оказалась практически одинаковой – 85 и 88 Е/мг белка, соответственно, однако специфичность к С6-фосфосахару была выше, чем к С-7-Ф (табл. 1 и 2). Интересно, что ПФК Ms. trichosporium OB3b может фосфорилировать Ру-5-Ф (1,4% от активности с Фр-6-Ф), тогда как ПФК Mb. nodulans ORS 2060 не проявляла активности с данным субстратом. Тестирование влияния различных интермедиатов на активность ферментов выявило, что ПФК Mb. nodulans ORS 2060, как и большинство представителей ФФнзависимых ФФК, не имеет аллостерических регуляторов. Напротив, на активность ПФК Ms. trichosporium OB3b влияли АМФ и АДФ. Так, в прямой реакции 1 мМ АМФ фактически полностью ингибировал фермент, а АДФ в той же концентрации снижал активность до 57%. В обратной реакции АМФ и АДФ полностью ингибировали активность ПФК. Полисахариды, сахароза CH4 НАДH2 цит c НАДH2 рММО мММО ATФ Серин CH2O СТОМ N,N-метиленТГФ TНMП ФАДГ NH4 ПФК ФБФаза Глицерат МДГ Фн Фруктозо-1,6Ф2 + ФБА АДФ ДОАФ Глицеральдегид-3Ф Глицин AMФ, ФФн ПФДК НАД(Ф)H2 НАДH2 ФФн Фн СГАТ CH3OH CO2 Фруктозо-6Ф ОПР Оксипируват НАД(Ф)H2 HCOOH ATФ, Фн Фосфоенолпируват Глиоксилат ФЕП-КО ФДГ CO2 УДФ ПК Пируват УTФ Ацетил-КоА Оксалоацетат Малат ЭМП малилКоА-лиаза АТФ-МТК Малил-КоА ЦТК Ацетил-КоА Рис. 13. Предполагаемая схема С1-ассимиляции у Methylosinus trichosporium OB3b. Метанотроф Ms. trichosporium OB3b и не растущий на метане фитосимбионт Mb. 18 nodulans ORS 2060 представляют класс альфапротеобактерий. Обе культуры ассимилируют С1-соединения сериновым путем, первичным интермедиатом в котором является серин. Образовавшиеся С3-сединения затем направляются на синтез как шестиуглеродных сахаров, так и интермедиатов цикла Кребса. Свойства ПФК, в частности, более высокое сродство к ФБФ, соответствуют доминирующей функции ПФК в реакциях глюконеогенеза (рис. 13). Однако ПФК этих бактерий принадлежат к различным филогенетическим подгруппам “В2” и “Р” (рис. 4) и имеют низкую идентичность аминокислотных последовательностей (16%). При этом ПФК Mb. nodulans ORS 2060 проявляет наиболее высокое сходство (64–65% идентичности) с ферментами из неметилотрофных протеобактерий, находящихся в симбиотических отношениях с высшими растениями (рис. 4). Итак, филогенетический анализ позволяет предположить специфическую роль ПФК у бактерий-фитосимбионтов. Напротив, фермент Ms. trichosporium OB3b имеет наибольшее сходство (75-77% идентичности) с ПФК альфа- и бетапротеобактерий (R. rubrum, Polaromonas naphthalenivorans и Rhodoferax ferrireducens), но проявляет также невысокое сходство с ПФК гаммапротеобактерии Mс. capsulatus Bath (34% идентичности). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Анализ имеющейся в Database информации свидетельствует о том, что наличие ПФК у микроорганизмов, как правило, коррелирует с отсутствием или дефектами в механизмах аэробного синтеза АТФ в дыхательной цепи. Так, у анаэробных бактерий и амитохондриальных простейших ПФК катализирует одну из основополагающих реакций модифицированного ФФн-зависимого гликолиза, который более эргономичен по сравнению с классической гликолитической последовательностью (5 молекул АТФ вместо 2) (Slamovits, Keeling, 2006). Анализ секвенированных геномов показал присутствие генов pfp у всех аэробных метанотрофов, окисляющих СН4 мембранной метанмонооксигеназой (мММО), за исключением филогенетически обособленной группы термоацидофильных метанотрофов рода Methylacidiphilum. Поскольку окисление метана с участием мММО сопряжено с потреблением кислорода и энергии восстановленных цитохромов, этот процесс составляет конкуренцию синтезу АТФ в реакциях окислительного фосфорилирования. Очевидно, что использование метанотрофами ФФн, в качестве фосфорильного донора в ряде метаболических превращений – один из путей экономии АТФ и решения данной биоэнергетической проблемы. Исследования свойств ФФн-зависимой 6-фосфофруктокиназы у различных метанотрофов выявили многофункциональность ПФК в метаболизме этих бактерий. У метанотрофов I типа (Mm. alcaliphilum 20Z), ассимилирующих углерод метана на уровне формальдегида в РМФ-цикле, где в качестве первичных продуктов образуются фосфогексозы, основная роль ПФК, вероятнее всего, связана с синтезом фосфотриоз в 19 гликолитической последовательности. Однако примечательной особенностью Mm. alcaliphilum 20Z и других метанотрофов I и Х типов является наличие двух путей распада С6-фосфосахаров – кроме гликолитического пути, у них функционирует путь Энтнера-Дудорова, приводящий к образованию глицеральдегид-3Ф и пирувата. Присутствие ПФК обеспечивает обратимость реакций одного из этих путей – гликолитической последовательности, а высокое сродство фермента к ФБФ и отсутствие аллостерических эффекторов свидетельствуют о том, что направленность реакций зависит от концентраций субстратов и продуктов. Поэтому очевидна роль фермента в регуляции необходимого для клетки соотношения фосфотриоз и фосфогексоз. Mm. alcaliphilum 20Z способен расти при высоких концентрациях NaCl, аккумулируя в качестве одного из осмопротекторов сахарозу, синтез которой происходит с образованием ФФн. Присутствие в геноме метанотрофа гена, кодирующего ФБФазу, указывает на возможность функционирования футильного цикла, в котором сопряженное действие ФБФазы и ПФК может осуществлять сток ФФн, активно образуемого в условиях повышенной осмолярности среды. У метанотрофов II типа первичными продуктами серинового пути С1что предполагает участие ПФК ассимиляции являются С3-соединения, преимущественно в глюконеогенезе. С такой ролью фермента согласуется более высокое сродство ПФК Ms. trichosporium OB3b к ФБФ, чем к субстрату прямой реакции – Фр-6-Ф. ПФК Ms. trichosporium OB3b – уникальный фермент, поскольку, в отличие от большинства исследованных ФФн-зависимых ФФК, ингибируется АДФ и АМФ, причем, в большей степени в направлении глюконеогенеза. Следовательно, поток углерода на биосинтез углеводных компонентов замедляется в условиях пониженного энергетического статуса клеток, при этом важную регуляторную роль играет ПФК. У метанотрофа X типа Mс. capsulatus Bath, реализующего одновременно РМФ-, РБФ- и сериновый пути, первичными продуктами биосинтеза являются С3- и С6соединения. Для ПФК Mс. capsulatus Bath аллостерические эффекторы не найдены, поэтому следует ожидать, что фермент участвует в регуляции внутриклеточной концентрации фосфотриоз и фосфогексоз. Поскольку в хромосоме данного метанотрофа отсутствует ген, кодирующий ФБФазу, ПФК у Mс. capsulatus Bath – единственный фермент, катализирующий взаимопревращение ФБФ и Фр-6-Ф. Примечательной особенностью ПФК Mc. capsulatus Bath является в 103 раз более высокая специфичность и более высокая активность с С-7-Ф, чем с Фр-6-Ф. Следовательно, фермент у данного метанотрофа является 7фосфоседогептулозокиназой (табл. 1 и 2). У Mc. capsulatus Bath функционирует цикл Кальвина, в котором реакция фосфорилирования С-7-Ф является важной стадией восстановительного пентозофосфатного цикла, ведущего к регенерации РБФ – 20 акцептора СО2. Ген pfp, кодирующий ПФК, филогенетически «родственную» ПФК Mc. capsulatus Bath, обнаружен также у группы автотрофных протеобактерий (рис. 4). Напротив, у Mm. alcaliphilum 20Z и M. methanica 12, реализующих только РМФ цикл, ПФК имеет лишь следовую активность с С-7-Ф, и близок по аминокислотной последовательности ферментам гетеротрофных микроорганизмов, для которых доказана функция ПФК в гликолизе. Способность ПФК Ms. trichosporium OB3b и Mb. nodulans ORS 2060 фосфорилировать С-7-Ф также коррелирует с наличием в геномах этих метилотрофов генетических элементов цикла Кальвина. Так у Mb. nodulans ORS 2060 присутствуют два гена, кодирующие большую субъединицу рибулозобисфосфаткарбоксилазы (РубисКО) и ген предполагаемой фосфорибулокиназы (ФРК), хотя активность РубисКО в грубом экстракте не обнаружена (Капаруллина и др., 2011). В геноме Ms. trichosporium Ob3B имеется ген, кодирующий ФРК, но отсутствуют гены для большой и малой субъединиц РубисКО. Указанные данные согласуются с гипотезой о том, что автотрофные и метилотрофные бактерии имеют общее происхождение. При этом Mс. capsulatus, реализующий одновременно три пути С1-ассимиляции, рассматривается в качестве аналога «Розеттского камня» (Whittenbury, 1981), дающего ключ к расшифровке феномена метилотрофии в целом. Очевидно, гены, кодирующие ферменты для некоторых метаболических путей, были утеряны в процессе дивергентной эволюции и специализации их углеродного метаболизма. Нами обнаружено, что у Mc. capsulatus Bath гены, кодирующие ПФК и Н+транслоцирующую мембрансвязанную пирофосфатазу (Н+-ФФн-азу), находятся в одном опероне pfp-hpp. Можно полагать, что ФФн – продукт реакции, катализируемой ПФК, гидролизуется мембранной Н+-ФФн-азой. При этом, благодаря создаваемому протонному градиенту, синтез АТФ становится возможным в обход дыхательной цепи. Более того, BLAST анализ выявил наличие гена hpp во всех секвенированных геномах метанотрофов, что указывает на участие ФФн и ПФК в энергетическом метаболизме этих бактерий. Анализ геномов выявил у метанотрофов ген пируват-фосфатдикиназы (ПФДК), которая катализирует синтез АТФ из АМФ за счет энергии и фосфора ФЕП и ФФн. Два ФФн-зависимых фермента, ПФК и ПФДК, могут обеспечить полностью обратимый ФФн-зависимый гликолиз, ранее описанный у анаэробных бактерий и амитохондриальных простейших (Slamovits, Keeling, 2006). Присутствие генетических основ для функционирования ФФн-зависимого гликолиза у метанотрофов коррелирует с микроаэрофильной природой этих бактерий, у которых лишь первая стадия окисления субстрата – окисление метана, облигатно зависит от кислорода. Реутилизация энергии ФФн, очевидно, дает метанотрофам преимущество, позволяя выживать в неблагоприятных условиях дефицита кислорода (и метана) за счет эндогенных 21 резервных соединений, что ранее было показано на примере Ms. trichosporium OB3b (Roslev, King, 1995). Таким образом, для метанотрофов характерна эффективная реутилизация ФФн – побочного продукта анаболических реакций, что отличает эту специализированную группу бактерий от большинства микроорганизмов, расщепляющих ФФн высокоактивной растворимой неорганической пирофосфатазой с диссипацией энергии данного макроэрга. Ярким примером связи ПФК с анаэробиозом является функционирование этого фермента у Mb. nodulans ORS 2060. Присутствие ПФК у не растущих на метане метилобактерий является скорее исключением, чем правилом. Mb. nodulans ORS 2060 – ризосферный метилотрофный фитосимбионт, жизненный цикл которого включает стадию бактероида, существующего в клубеньках бобового растения за счет продуктов фотосинтеза (Renier et al., 2011). Для процесса азотфиксации, осуществляемого бактероидами в анаэробных условиях, требуется большое количество АТФ. В этом случае переключение углеводного метаболизма на ФФн-зависимый гликолиз – наиболее эффективный способ получения энергии для азотфиксации. Анализ представленных в DataBase геномов выявил, что ПФК Mb. nodulans ORS 2060 наиболее близка по первичной последовательности ферменту из других (неметилотрофных) фитосимбионтов, что подтверждает его важную роль в фитосимбиозе бактерий. Несмотря на отличия в свойствах и возможной роли, метилотрофные ПФК (за исключением актиномицета A. methanolica) филогенетически принадлежат к двум подгруппам II типа ФФК – «Р», включающую в основном гетеротрофов и бактерийфитосимбионтов, и «В2», представленную автотрофными и гетеротрофными микроорганизмами. ПФК Mc. capsulatus Bath (γ-proteobacteria) и Ms. trichosporium OB3b (α-proteobacteria) из подгруппы «В2» имеют лишь 34% идентичности аминокислотных последовательностей и значительно отличаются по своим биохимическим свойствам, что указывает на гетерогенность этой подгруппы ФФК. Ферменты Mb. nodulans ORS 2060 (α-proteobacteria) и Mm. alcaliphilum 20Z (γproteobacteria) являются представителями подгруппы «Р», проявляют между собой 60% гомологии, но также обладают низким сходством биохимических свойств. Между ферментами подгрупп «Р» и «В2» имеется всего 12-16% идентичности. Полученные результаты дают основание сделать вывод, что в эволюции ПФК имел место не только «неупорядоченный» латеральный перенос генов (Bapteste et al., 2003), но также специализация фермента к определенному типу метаболизма бактерий. 22 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. ВЫВОДЫ Впервые очищены и охарактеризованы рекомбинантные пирофосфат-зависимые 6фосфофруктокиназы облигатных метанотрофов Methylococcus capsulatus Bath, Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, Methylosinus trichosporium OB3b (ПФК-His6) и факультативного метилотрофа Methylobacterium nodulans (ПФК). ПФК Mc. capsulatus Bath – гомодимер (2×45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7фосфат (Km каж 0,03 мМ, Vmax 31 Е/мг белка), фруктозо-6-фосфат (Km каж 2,27 мМ, Vmax 7,6 Е/мг белка) и рибулозо-5-фосфат (Km каж 4,05 мМ), не имеет аллостерических эффекторов. Предположено участие фермента в гликолизе, глюконеогенезе и в регенерации рибулозо-1,5-бисфосфата в минорном цикле Кальвина. Установлено, что ген pfp, кодирующий ПФК Mc. capsulatus Bath, котранскрибируется с геном hpp, кодирующим предполагаемую Н+транслоцирующую пирофосфатазу V-типа, что указывает на участие ПФК и ФФн в энергетическом метаболизме метанотрофа. Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза Mc. capsulatus Bath – гомогексамер (6×40 кДа), обратимо катализирует расщепление фруктозо-1,6-бисфосфата и седогептулозо1,7-бисфосфата, не имеет аллостерических эффекторов. Предположено, что ФБА совместно с ПФК регулирует соотношение С6, С5 и С3 интермедиатов в клетках метанотрофа. ПФК Mm. alcaliphilum 20Z – гомотетрамер (4×45 кДа), высокоактивна и специфична в направлении глюконеогенеза (Km кажФр-6-Ф 0,64 мМ, Vmax 577 Е/мг белка; Km кажФБФ 0,095 мМ, Vmax 805 Е/мг белка), не имеет аллостерических эффекторов. Предположено участие ПФК в гликолизе и глюконеогенезе Mm. alcaliphilum 20Z и регуляции внутриклеточного уровня ФФн. ПФК Ms. trichosporium OB3b – гомогексамер (6×45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (Km каж 0,51 мМ, Vmax 85 Е/мг белка), фруктозо-6-фосфат (Km каж 0,24 мМ, Vmax 88 Е/мг белка), ингибируется АМФ и АДФ. Предположено участие ПФК преимущественно в глюконеогенезе. ПФК Mb. nodulans ORS 2060 – гомотетрамер (4×45 кДа), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (Km каж 0,21 мМ, Vmax 46,6 Е/мг белка), фруктозо-6-фосфат (Km каж 0,65 мМ, Vmax 786,9 Е/мг белка), не имеет аллостерических эффекторов. Предполагается, что фермент играет важную роль при гетеротрофном росте метилотрофа в анаэробных условиях фитосимбиоза. На основании филогенетического анализа и выявленных различий в биохимических свойствах ПФК постулировано, что, наряду с «неупорядоченным» горизонтальным переносом гена pfp, происходила адаптация ПФК к специализированному метаболизму метанотрофов и некоторых метилобактерий. 23 Список публикаций по теме диссертации Статьи: 1) Reshetnikov A.S., Rozova O.N., Khmelenina V.N., Mustakhimov I.I., Beschastny A.P., Murrell J.C., Trotsenko Y.A. Characterization of the pyrophosphate-dependent 6phosphofructokinase from Methylococcus capsulatus Bath. FEMS Microbiol. Lett. 2008. V. 288(2), P. 202-10. 2) Бесчастный А.П., Хмеленина В.Н., Розова О.Н., Троценко Ю.А. Активности 6фосфофруктокиназ и неорганической пирофосфатазы у аэробных метилотрофных бактерий. Микробиология. 2008. Т. 77, № 5, с. 713-715. 3) Розова О.Н., Хмеленина В.Н., Мустахимов И.И., Решетников А.С., Троценко Ю.А. Характеристика рекомбинантной фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы Methylococcus capsulatus Bath. Биохимия. 2010. Т. 75. № 7. С. 1014-1022. 4) Rozova O.N., Khmelenina V.N., Vuilleumier S., Trotsenko Y.A. Characterization of the recombinant pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase from halotolerant methanotroph Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. 2010. Research. Microbiol.V. 161, P. 861-868. 5) Khmelenina V.N., Rozova O.N., Trotsenko Y.A. Characterization of the recombinant pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinases from Methylomicrobium alcaliphilum 20Z and Methylococcus capsulatus Bath. Methods Enzymol. 2011. V. 495, P.1-14. Тезисы: 1) Розова О.Н., Мустахимов И.И., Решетников А.С. Пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа Methylomonas methanica 12 и Methylococcus capsulatus Bath. III Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2007, с. 97. 2) Розова О.Н., Мустахимов И.И., Решетников А.С. Пирофосфатзависимая 6-фосфофруктокиназа Methylococcus capsulatus Bath. VI Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск, 2008, с. 220. 3) Розова О.Н., Мустахимов И.И., Решетников А.С. Свойства и роль рекомбинантной пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы термотолерантного облигатного метаноторфа Methylococcus capsulatus Bath. I Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008». Казань, КГУ, 2008, с. 27. 4) Rozova O.N., Reshetnikov A.S., Mustakhimov I.I., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Properties of the pyrophosphate-dependent 6-phosphofructokinase from Methylococcus capsulatus Bath. The 3rd International Congress of Microbiologist FEMS 2009. Sweden, Gothenburg. 5) Розова О.Н. Пирофосфатзависимая фосфофруктокиназа и ее роль в метаболизме облигатных метанотрофов. 14 Международная школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2010, с. 58. 6) Розова О.Н. Роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы в метаболизме метанотрофов I и X типов. III Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2010». Нижний Новгород, ННГУ, 2010, с. 27. 7) Rozova O.N., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A.. PPi-dependent 6-phosphofructokinases from two methanotrophs, halotolerant Methylomicrobium alcaliphilum 20Z and thermotolerant Methylococcus capsulatus Bath. 8th International Congress on Extremophiles. Azores, Ponta-Delgada. 2010, р. 283. 8) Розова О.Н., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Роль пирофосфат-зависимых ферментов у облигатного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Тула, ТулГУ, 2010, с. 40. 9) Хмеленина В.Н., Розова О.Н., Троценко Ю.А. Функции пирофосфат-зависимой 6фосфофруктокиназы в метаболизме аэробных метанотрофов: факты и гипотезы. 4-ый научный симпозиум «Автотрофные микроорганизмы», посвященный памяти ак. РАН, Е.Н. Кондратьевой (1925-1995), и приуроченный к 80-летию биологического факультета МГУ. Москва. 2010, с. 111. 10) Rozova O.N., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Multifunctional pyrophosphate-dependent 6phosphofructokinase (PPi-PFK) in the metabolism of aerobic methylotrophic bacteria. The 4th International Congress of Microbiologist FEMS 2011. Geneva, Switzerland. 24