Гидролиз сахаросодержащих субстратов

Гидролиз сахаросодержащих субстратов
препаратом фруктаваморин Г10х
Ю. 3. Серова, Г. М. Д о б р о л и н с к а я , В. Ф. С у х о д о л
ВНИИПрБ
А. М. Куц
КТИПП
С целью возможного применения препарата фруктаваморин г10х [2],
содержащего активную β- ф руктофуранозидазу, при производстве спирта из
мелассы исследовали динамику гидролиза сахарозы, рафинозы, их смесей и
растворов мелассы в зависимости от температуры и дозировок препарата.
В литературе имеются сведения о динамике гидролиза сахарозы
ферментом β-фруктофуранозидазой дрожжей [1, 5, 6] и плесневых грибов [3,
4]. Нельсоном и др., установлено, что гидролиз сахарозы инвертазой
происходит в 2 раза быстрее, чем рафинозы [6].
В работе Мендельсона [1] показано, что скорость гидролиза сахарозы
инвертазой пирных дрожжей зависит от дозы фермента, концентрации
реагирующих веществ, а также от температуры.
Гидролиз сахарозы и рафинозы β-фруктофуранозидазой
грибов
Penicilium spinulosum, Aspergillus uryzae, Aspergillus niger описан Биллингом и
Бэконом [3, 4]. Показано, что наряду с гидролитическим действием грибная
инвертаза обладает трансферирующим действием, сопровождающимся
образованием олигосахаридов.
Добавление к растворам сахарозы моносахаров глюкозы, фруктозы,
галактозы,
маннозы,
арабинозы
снижало
скорость
освобождения
редуцирующих сахаров.
Исследования по динамике гидролиза субстратов β-фруктофуранозидазой
из Asp. awamori-16 проводили с 1%-ным и 13%-ным водными растворами
сахарозы, 1%-ным раствором рафинозы, смесями, состоящими из сахарозы и
1% рафинозы, а также растворами мелассы, содержащими 22% сухих веществ,
в том числе 14,5% сахарозы и 0,8% рафинозы. Для гидролиза субстратов
сахарозы задавали препарат в количестве, 1, 5, 10, 15, 100 и 200 ед. активности
на 1 г сахарозы с последующей инкубацией реакционных смесей при
температуре 30, 50 и 70° С. Когда в состав субстрата входили рафиноза,
препарат вводили пропорционально доле сахарозы в молекуле рафинозы. Через
определенные промежутки времени контролировали изменение состава
субстрата по содержанию в нем редуцирующих сахаров, определенных
методом Бертрана.
На рис. 1 представлена динамика гидролиза 1%-ного раствора сахарозы
препаратом в количестве 5, 10, 15 ед. активности р-фруктофуранозидазы на 1 г
сахарозы при температурах 30 и 50° С. Из рисунка видно, что степень
гидролиза возрастала с увеличением дозировки препарата и повышением
температуры. Сахароза гидролизовалась на 90% при внесении препарата в
количестве 5 ед. активности при 50° С. Та же степень гидролиза наблюдалась и
42
при 30° С, но количество препарата при этом удваивалось. Полный гидролиз
сахарозы удалось достичь лишь при расходе препарата 15 ед. активности
фермента и 50° С.
Что касается субстрата рафинозы, то ее гидролиз осуществлялся
значительно медленнее. При введении препарата с 15 ед. активности на 1 г
сахарозы при 50° С гидролиз раффинозы проходил только на 47% (рис. 2).
Более глубокой степени гидролиза (73%) удалось достичь при увеличении
дозировки препарата до 100 ед. активности.
Полученные данные позволяют сделать предположение о том, что
незначительные дозировки препарата (5—45 ед.), обеспечивающие полный
гидролиз сахарозы, не дают увеличения степени гидролиза рафинозы более
чем на 47% за 24 ч.
Следующим этапом исследования явилось изучение гидролиза смеси
сахаров, состоящей из 13% сахарозы и 1% рафинозы и приближающейся по
своему углеводному составу к
производственным мелассным рассиропкам в зависимости от температуры и
концентрации фермента. Из рис 3 следует, что при малых дозировках препарата
(5 ед. активности на 1 г сахарозы) за 24 ч при 50 ° С гидролиз осуществлялся
на 80%. Понижение температуры до 30° С влекло за собой уменьшение степени
гидролиза, но все же она была довольно высокой и составляла 67%. Увеличение
расхода препарата до 100 ед. активности β-фруктофуранозидазы на 1 г
сахарозы резко повышало скорость гидролиза субстрата. Степень гидролиза за
1 ч при 50° С составляла
43
83%, при 30° С — 59%. Далее с увеличением времени до 24 ч степень
гидролиза субстрата уравнивалась для обеих температур и достигала 92—94%.
То что субстрат не гидролизовался полностью, можно отнести за счет
неполного гидролиза рафинозы, содержащейся в субстрате. Доказательством
этого служат данные по гидролизу 13% раствора сахарозы, приведенные на рис.
3. Гидролиз этого субстрата осуществлялся полностью уже за 5 ч при малых
дозировках фруктаваморина г10х.
Опыты с мелассными рассиропками, содержащими 22% сухих веществ, в
основном подтвердили данные но динамике гидролиза субстрата, содержащего
13% сахарозы и 1% рафинозы (рис. 4). Существенное влияние на скорость
гидролиза сахаров мелассы оказывает концентрация фермента в растворе. Доза
до 5 ед. активности фермента на 1 г сахарозы обеспечивала гидролиз сахаров
мелассы лишь на 23% за 6 ч при 30° С. Увеличение дозировки ферментного
препарата до 100 единиц активности |3-фруктофуранозидазы на 1 г сахарозы
резко повышало скорость гидролиза.
Так, количество прогидролизованных сахаров за 6 ч при 30° С составляло
87%, при 50° С —89%. Повышение температуры до 70° С также
способствовало
ускорению
гидролиза
субстрата.
Количество
прогидролизованного сахара составляло уже 95%. Такая же степень гидролиза
была достигнута при дозе фермента 200 ед. активности фермента на 1 г
сахарозы. Эти данные позволяют сделать заключение о том, что несахара
мелассы не оказывают существенного влияния на каталитическое действие
препарата грибного происхождения.
С целью выяснения влияния этилового спирта на фермент рфруктофуранозидазу проводили гидролиз смеси, состоящей из 13% сахарозы и
1% рафинозы, в присутствии 8% этилового спирта. Ингибирующего влияния
указанного количества спирта на фермент и, следовательно, на динамику
гидролиза указанных сахаров не обнаружено.
44
Выводы
1. Применение препарата фруктаваморин ГЮх обеспечивает полный гидролиз
сахарозы при дозировке 15 ед. активности β-фруктофуранозидазы на 1 г
сахарозы и температуре 50° С.
2. Значительная степень гидролиза сахарозы и рафинозы позволяет предложить
возможность применения препарата фруктаваморин ГЮх при получении
спирта из мелассы с целью увеличения выхода спирта и интенсификации
процесса брожения.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мендельсон Л. Н. Разработка технологии получения из пивных дрожжей
комплексного ферментного препарата для хлебопекарной и кондитерской
промышленности. Автореф. канд. дисс., Киев, 1971, с. 83—90.
2. Серова Ю. 3., Добролинская Г. М. Выделение препарата pфруктофуранозндазы и его характеристика,— Прикладная биохимия и
микробиология, 1976, т. XII, вып. 5, с. 709.
3. Bealing Т. 1 . Mould’glucosaccharase: a Fructosidase «Biochem. J.», 1953, 55, №
1, p. 93—101.
4. Bealing F. J., Bacon Z. S. D. The action of Mould Enzymes on sucrose «Biochem.
J.», 195.3, 53, № 2,. p. 277—285.
5. Gascon S., Nuemann N. P., Zampen J. O. Comparatiwe study of the properties of
the purified internal and external invertases from yeast. «J. Biol. Chem.»,. 1968, 243,
№ 7, p. 1573— 1577.
6. Nelson L. М., Schubert M. P. «J. Am. Chem. Soc.»„ 1928, 50, p. 2188-2193.
45