015794 B1 015794 B1 (11) 015794

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(12)
(45)
015794
(13)
B1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
Дата публикации и выдачи патента
2011.12.30
(21)
(11)
Номер заявки
(51) Int. Cl. C12N 9/04 (2006.01)
C12R 1/07 (2006.01)
C12P 7/06 (2006.01)
200702153
(22)
Дата подачи заявки
2006.05.03
(54)
ТЕРМОФИЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ВИДА GEOBACILLUS С
ИНАКТИВИРОВАННЫМ ГЕНОМ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (LDH) ДЛЯ
ПРОИЗВОДСТВА ЭТАНОЛА
B1
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Получен мутированный термофильный микроорганизм с модификацией, инактивирующей ген
лактатдегидрогеназы микроорганизма дикого типа. Этот мутированный микроорганизм применяют
при продуцировании этанола, используя С3, С5 или С6 сахара в качестве субстрата.
Аткинсон Энтони, Криппс Роджер,
Элей Кирстин, Рудд Брайан, Тодд
Мартин (GB), Томпсон Энн (NZ)
Липатова И.И., Рыбаков В.М.,
Новоселова С.В., Дощечкина В.В.,
Хмара М.В. (RU)
B1
015794
(56) WO-A-02/29030
BISWAS I. ET AL.: "HIGH-EFFICIENCY
GENE INACTIVATION AND REPLACEMENT
SYSTEM FOR GRAM-POSITIVE BACTERIA",
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, WASHINGTON,
DC, US, vol. 175, no. 11, 1 June 1993 (1993-06-01),
pages 3628-3635, XP000563688, ISSN: 0021-9193,
the whole document
WO-A-01/83784
015794
(31) 0509068.3; 0511603.3
(32) 2005.05.04; 2005.06.07
(33) GB
(43) 2008.06.30
(86) PCT/GB2006/001586
(87) WO 2006/117536 2006.11.09
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ТМО РЕНЬЮАБЛЗ ЛИМИТЕД (GB)
015794
Область изобретения
Данное изобретение относится к продуцированию этанола как продукта бактериальной ферментации. В частности, изобретение относится к продуцированию этанола термофильными бактериями.
Предшествующий уровень техники
Бактериальный метаболизм может осуществляться посредством ряда различных механизмов в зависимости от вида бактерий и условий окружающей среды. Гетеротрофные бактерии, которые включают
все патогены, получают энергию от окисления органических соединений, причем самыми распространенными окисляемыми соединениями являются углеводы (в частности, глюкоза), липиды и белок. Результатом биологического окисления этих органических соединений бактериями является синтез АТФ
как химического источника энергии. Этот процесс также дает возможность образования более простых
органических соединений (молекул-предшественников), которые требуются бактериальной клетке для
реакций биосинтеза. Общим процессом, посредством которого бактерии метаболизируют подходящие
субстраты, является гликолиз, который представляет собой последовательность реакций, превращающих
глюкозу в пируват с образованием АТФ. Судьба пирувата при генерировании метаболической энергии
зависит от микроорганизма и условий окружающей среды. Существует три основных реакции пирувата.
Во-первых, в аэробных условиях многие микроорганизмы будут генерировать энергию, используя
цикл лимонной кислоты и превращение пирувата в ацетилкоэнзим А, катализируемое пируватдегидрогеназой (PDH).
Во-вторых, в анаэробных условиях некоторые образующие этанол микроорганизмы могут осуществлять спиртовую ферментацию путем декарбоксилирования пирувата до ацетальдегида, катализируемого
пируватдекарбоксилазой (PDC), и последующего восстановления ацетальдегида до этанола посредством
НАДФ (никотинамиддинуклеотидфосфата), катализируемого алкогольдегидрогеназой (ADH).
Третьим процессом является превращение пирувата в лактат, которое происходит посредством катализа лактатдегидрогеназой (LDH).
Существует большой интерес в использовании микроорганизмов для продуцирования этанола либо
с использованием микроорганизмов, которые претерпевают анаэробную ферментацию естественным
путем, либо посредством использования рекомбинантных микроорганизмов, которые включают гены
пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Хотя достигнут некоторый успех в продуцировании
этанола путем использования этих микроорганизмов, ферментация часто подвергается риску за счет повышенной концентрации этанола, в частности, когда микроорганизм обладает низким уровнем толерантности к этанолу.
Для продуцирования этанола предложены термофильные бактерии, их применение обладает тем
преимуществом, что ферментацию можно проводить при повышенных температурах, которые дают возможность удаления продуцированного этанола в виде пара при температурах выше 50°С; это также дает
возможность проведения ферментации с использованием высоких концентраций сахара. Однако поиск
подходящих термофильных бактерий, которые могут эффективно продуцировать этанол, проблематичен.
В WO 01/49865 раскрыта грамположительная бактерия, которая трансформирована гетерологичным
геном, кодирующим пируватдекарбоксилазу, и которая обладает нативной функцией алкогольдегидрогеназы, для продуцирования этанола. Эта бактерия представляет собой термофильную Bacillus, и эта бактерия может быть модифицирована инактивацией гена лактатдегидрогеназы с использованием вставки
транспозона. Все бактерии, раскрытые в WO 01/49865, имеют происхождение от штамма Bacillus LLD-R,
штамма с дефицитом споруляции, который возник спонтанно из культуры и в котором ген Idh инактивирован спонтанной мутацией или химическим мутагенезом. Штаммы LN и TN раскрыты в качестве улучшенных производных штамма LLD-R. Однако все штаммы содержат рестрикционные системы типа Нае
III, что затрудняет плазмидную трансформацию и, следовательно, предотвращает трансформацию неметилированной ДНК.
В WO 01/85966 раскрыты микроорганизмы, которые получают путем метилирования in vivo, чтобы
преодолеть проблемы рестрикции. Это требует трансформации метилтрансферазы Нае III из Haemophilus
aegyptius в штаммы LLD-R, LN и TN. Однако штаммы LLD-R, LN и TN являются нестабильными мутантами и спонтанно ревертируют к продуцирующим лактат штаммам дикого типа, в частности, при низком
рН и при высоких концентрациях сахара.
Результатом этого являются изменения продукта ферментации с этанола на лактат, что делает эти
штаммы непригодными для продуцирования этанола.
В WO 02/29030 раскрыто, что штамм LLD-R и его производные включают встречающийся в природе инсерционный элемент (IE) в кодирующей области гена Idh. Транскрипция этого элемента внутри гена Idh (и вне его) и последующая инактивация гена является нестабильной, приводя к реверсии. В качестве решения была предложена интеграция плазмидной ДНК в последовательность IE.
Таким образом, на уровне техники получение микроорганизмов для продуцирования этанола основано на модификации полученных в лаборатории мутированных химическим путем микроорганизмов
Bacillus, их обработке in vivo с помощью методик метилирования и последующей модификации этих
микроорганизмов интеграцией плазмидной ДНК в последовательность IE. Эта процедура сложна, ненадежна, а также существуют спорные предписания по использованию этих штаммов.
-1-
015794
Таким образом, существует необходимость в усовершенствованных микроорганизмах для продуцирования этанола.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно первому аспекту настоящего изобретения термофильный микроорганизм модифицирован
таким образом, чтобы дать возможность повышенного продуцирования этанола, где эта модификация
представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы термофильного микроорганизма дикого типа.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения этот микроорганизм депонирован как NCIMB,
номер по каталогу 41275.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения способ продуцирования этанола включает
культивирование микроорганизма в соответствии с приведенным выше определением в пригодных условиях в присутствии С3, С5 или С6 сахара.
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения плазмида является такой, как определено
здесь как pUB190-Idh (депонирована как NCIMB, номер по каталогу 41276).
Согласно пятому аспекту настоящего изобретения термофильный микроорганизм содержит плазмиду, определенную здесь как pUB190 (фиг. 4).
Описание графических материалов
Настоящее изобретение описано со ссылкой на сопроводительные графические материалы, где
фиг. 1 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола микроорганизмом по
изобретению (Idh 35) с различными субстратами;
фиг. 2 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола микроорганизмом по
изобретению (Idh 58) с различными субстратами;
фиг. 3 представляет собой график, показывающий продуцирование этанола нокаут-мутантом по
LDH 11955;
фиг. 4 и 5 представляют собой схематические изображения плазмид pUB, используемых в изобретении; фиг. 4 представляет собой мутант Idh согласно изобретению;
фиг. 6 представляет собой график, показывающий стабильность нокаут-мутанта LDH в различных
условиях культивирования.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на модификации термофильного микроорганизма дикого типа,
прерывающей экспрессию гена лактатдегидрогеназы.
Инактивация гена лактатдегидрогеназы способствует предотвращению расщепления пирувата до
лактата и, следовательно, стимулирует (в подходящих условиях) расщепление пирувата до этанола с использованием пируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. Предпочтительно, если ген лактатдегидрогеназы прерывают путем делеции внутри гена или всего гена.
Микроорганизм дикого типа может представлять собой любой термофильный микроорганизм, но
предпочтительно, если этот микроорганизм представляет собой Bacillus spp. В частности, предпочтительно, если этот микроорганизм принадлежит к виду Geobacillus, в частности Geobacillus
thermoglucosidasius.
Микроорганизмы, выбранные для модификации, указаны как микроорганизмы "дикого типа", т.е.
они не являются мутантами, полученными в лаборатории. Эти микроорганизмы могут быть выделены из
образцов окружающей среды, которые, как ожидают, содержат термофилы. Изолированные микроорганизмы дикого типа будут обладать способностью к продуцированию этанола, но, если они не модифицированы, лактат, вероятно, является основным продуктом ферментации. Изоляты также отбирают на их
способность к росту на сахарах гексозах и/или пентозах и их олигомерах при термофильных температурах.
Предпочтительно, чтобы микроорганизм по изобретению обладал некоторыми желательными характеристиками, которые дают возможность использования этого микроорганизма в процессе ферментации. Предпочтительно этот микроорганизм не должен иметь систему рестрикции, посредством чего избегают необходимости в метилировании in vivo. Кроме того, микроорганизм должен быть стабильным
по меньшей мере к 3% этанолу и должен обладать способностью к утилизации С3, С5 и С6 сахаров (или
их олигомеров) в качестве субстрата, включая целлобиозу и крахмал. Предпочтительно, если этот микроорганизм является трансформируемым при высокой частоте. Кроме того, этот микроорганизм должен
иметь скорость роста в непрерывной культуре для поддержания степеней разбавления 0,3 ч-1 и выше (типично 0,3 ОП500).
Микроорганизм является термофилом и растет в температурном диапазоне 40-85°С. Предпочтительно этот микроорганизм растет в температурном диапазоне 50-70°С. Кроме того, желательно, чтобы
этот микроорганизм рос в условиях рН 7,2 или ниже, в частности рН 6,9-4,5.
Микроорганизм может быть спорообразующим либо может не спорулировать. Успех процесса
ферментации не обязательно зависит от способности микроорганизма к споруляции, хотя при некоторых
обстоятельствах может быть предпочтительно иметь спорообразующий микроорганизм, когда желательно использовать микроорганизмы в качестве корма для животных по окончании процесса ферментации.
Это является следствием способности спорообразующих микроорганизмов к обеспечению хорошей им-2-
015794
муностимуляции при использовании в качестве корма для животных. Спорообразующие микроорганизмы также обладают способностью к осаждению во время ферментации, и, следовательно, их можно выделить без необходимости в центрифугировании. Соответственно эти микроорганизмы можно использовать в корме для животных без необходимости в сложных или дорогостоящих методиках выделения.
Последовательность нуклеиновой кислоты для лактатдегидрогеназы сейчас известна. Используя эту
последовательность, специалист в данной области техники имеет возможность использовать ген лактатдегидрогеназы в качестве мишени для достижения инактивации этого гена посредством различных механизмов. Предпочтительно, если ген лактатдегидрогеназы инактивируют либо путем инсерции транспозона, либо предпочтительно путем делеции последовательности этого гена или участка последовательности этого гена. Делеция является предпочтительной, поскольку позволяет избежать трудностей повторной активации последовательности гена, которая часто происходит при использовании транспозонной
инактивации. В предпочтительном воплощении ген лактатдегидрогеназы инактивируют путем интеграции термочувствительной плазмиды (плазмиды pUB190-Idh), которая достигается естественной гомологичной рекомбинацией или интеграцией между плазмидой и хромосомой микроорганизма. Хромосомные интегранты можно отобрать на основании их устойчивости к антибактериальному агенту (например
к канамицину). Интеграция в ген лактатдегидрогеназы может происходить посредством события рекомбинации по типу одиночного кроссинговера или посредством события рекомбинации по типу двойного
(или более чем двойного) кроссинговера.
В предпочтительном воплощении микроорганизм содержит гетерологичный ген алкогольдегидрогеназы и гетерологичный ген пируватдекарбоксилазы. Результатом экспрессии этих гетерологичных генов является продуцирование ферментов, которые меняют направление метаболизма таким образом, что
этанол является основным продуктом ферментации. Эти гены могут быть получены из микроорганизмов,
которые типично претерпевают анаэробную ферментацию, включая виды Zymomonas, включая
Zymomonas mobilis.
Способы получения и включения этих генов в микроорганизмы известны, например, в Ingram et al.,
Biotech & BioEng, 1998; 58 (2+3): 204-214 и US 5916787, где содержание каждой публикации включено
здесь путем ссылки. Эти гены могут быть введены на плазмиде или интегрированы в хромосому, как
должно быть известно специалистам в данной области техники.
Микроорганизмы по изобретению можно культивировать в общепринятых условиях культивирования в зависимости от выбранного термофильного микроорганизма. Выбор субстратов, температуры, рН
и других условий роста можно произвести на основании известных требований к культивированию, например, см. WO 01/49865 и WO 01/85966, где содержание каждой публикации включено здесь путем
ссылки.
Теперь настоящее изобретение будет описано только путем примера со ссылкой на сопроводительные графические материалы в приведенных ниже примерах.
Инактивация гена LDH.
Пример 1. Мутация в результате одиночного кроссинговера.
Разработка нокаут-вектора LDH.
Частичный фрагмент гена Idh примерно 800 п.о. субклонировали в термочувствительном векторе
доставки pUB190 (SEQ ID NO: 1), используя HindIII и XbaI, с получением в результате плазмиды 7,7 кб
pUB190-Idh (фиг. 4 и SEQ ID NO: 2). Плазмида pUB190 депонирована в NCIMB, как указано ниже. Десять предполагаемых трансформантов Е.coli JM109 (pUB190-Idh) проверяли с помощью рестрикционного анализа, и две культуры использовали для получения плазмидной ДНК для целей трансформации. В
результате переваривания pUB190-Idh рестриктазами HindIII и XbaI высвобождается ожидаемый фрагмент Idh.
Трансформация Geobacillus thermoglucosidasius 11955 плазмидой pUB190-Idh.
Трансформанты были получены со всеми тремя плазмидами, протестированы после 24-48 ч при
54°С селекцией канамицином. Трансформанты Idh очищали из Geobacillus thermoglucosidasius (Gt) 11955
и проверяли с помощью рестрикционного анализа, используя HindIII и XbaI.
Нокаут гена LDH.
Нокаут гена осуществляли посредством интеграции термочувствительной плазмиды в ген Idh на
хромосоме.
Плазмида pUB190-Idh реплицируется при 54°С в Gt11955, но не реплицируется при 65°С. Селекцию поддерживали канамицином (кап) (12 мкг/мл). Затем температуру роста повышали до 65°С (плазмида больше не является репликативной). Естественная рекомбинация или интеграция происходит между
плазмидой и хромосомой. Хромосомные интегранты отбирали по их устойчивости к канамицину. Интеграция была направлена в сторону гена Idh, поскольку на плазмиде находится гомологичная последовательность. Направленная интеграция в ген Idh происходила посредством процесса, известного как рекомбинация по типу одиночного кроссинговера. Плазмида становится встроенной в ген Idh, результатом
чего является неактивный ген Idh. Тандемные повторы могут встречаться, если интегрирует несколько
копий плазмиды.
-3-
015794
Методология и результаты.
Для интеграции предпринимали два различных метода.
Метод 1. 4×50 мл культур TGP (kan) выращивали при 54°С в течение 12-18 ч. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл TGP. Эту суспензию высевали на чашки (5×200 мл) TGP
(kan) и инкубировали в течение ночи при 68°С. Интегранты собирали и высевали на 50-квадратную решетку на свежих чашках TGP (kan) и инкубировали в течение ночи при 68°С.
Метод 2. 1×50 мл культуры TGP (kan) выращивали при 54°С в течение 12-18 ч. 1 мл этой культуры
использовали для инокуляции 50 мл свежих культур TGP (kan), которые выращивали при 68°С в течение
12-18 ч. Эту культуру субкультивировали на следующие сутки в 50 мл свежих культур TGP (kan) и выращивали при 68°С еще в течение 12-18 ч. Эту культуру высевали на чашки TGP (kan) и инкубировали
при 68°С в течение ночи. На чашках был получен конфлюентный рост. Отдельные колонии высевали на
50-квадратную решетку на свежие чашки TGP (kan) и инкубировали в течение ночи при 68°С.
Скрининг.
Предполагаемые интегранты подвергали скринингу на нокаут гена Idh, используя приведенное ниже.
1) Скрининг на чашках.
Несколько сотен интегрантов перепечатывали на чашки SAM2 (с kan) при 68°С. Отрицательные по
лактату клетки продуцируют меньше кислоты и могут обладать ростовым преимуществом по сравнению
с диким типом на ферментационных средах без буферов.
2) Скрининг с помощью ПЦР.
ПЦР колоний использовали для определения того, интегрировали ли плазмида в ген Idh. Путем
подбора праймеров, которые фланкируют сайт интеграции, возможно определить, произошла ли интеграция гена Idh (для вставок фрагмент ПЦР не амплифицируется).
3) Анализ на лактат.
Данный анализ определяет, продуцируют ли интегранты лактат при росте в течение ночи на SAM2
(kan) при 68°С. Надосадочную жидкость культуры тестировали на концентрацию лактата реагентом на
лактат фирмы Sigma для определения лактата. Отрицательные по лактату интегранты дополнительно
характеризовали с помощью ПЦР и оценивали в ферментере на стабильность.
Протокол электропорации для Geobacillus thermoqlucosidasius NCIMB 11955.
Замороженную исходную культуру NCIMB 11955 получали путем выращивания ночной культуры в
среде TGP (250 об/мин при 55°С, объем 50 мл в конической колбе на 250 мл, ОП600), добавления равного
объема 20% глицерина и деления на аликвоты по 1 мл и хранения в пробирках для криоконсервации при
-80°С. 1 мл этой исходной культуры использовали для инокуляции 50 мл TGP в конической колбе на
250 мл, инкубация при 55°С, 250 об/мин, до достижения культурой ОП600 1,4.
Колбу охлаждали на льду в течение 10 мин, затем культуру центрифугировали в течение 20 мин
при 4000 об/мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 50 мл охлажденной во льду среды для электропорации и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин. Проводили три дополнительных отмывки,
1×25мл и 2×10 мл, а затем осадок ресуспендировали в 1,5 мл охлажденной во льду среды для электропорации и делили на аликвоты по 60 мкл.
Для электропорации 1-2 мкл ДНК добавляли к 60 мкл электрокомпетентных клеток в пробирке типа
Эппендорф, которую держали на льду, и мягко перемешивали. Эту суспензию переносили в предварительно охлажденную кювету для электропорации (щель 1 мм) и проводили электропорацию при 2500 В,
емкости 10 мФ и сопротивлении 600 Ом.
Сразу после импульса добавляли 1 мл TGP, перемешивали и суспензию переносили в пробирку с
завинчивающейся крышкой, инкубировали при 52°С в течение 1 ч в водяной бане с качалкой. После инкубации суспензию либо высевали непосредственно (например, 2×0,5 мл), либо центрифугировали при
4000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендировали в 200-500 мкл TGP и высевали на агар TGP, содержащий соответствующий антибиотик.
Инактивация гена LDH.
Мутация в результате двойного кроссинговера.
Праймеры разрабатывали на основе доступной последовательности 11955 LDH. Нокаут-стратегия
была основана на создании внутренних делеций внутри гена LDH путем двух подходов.
При стратегии 1 два существующих уникальных сайта рестрикции вблизи середины кодирующей
последовательности LDH использовали для образования делеций. Из геномной ДНК получали один
-4-
015794
большой продукт ПЦР, покрывающий большую часть доступной последовательности LDH, и клонировали в сайте SmaI во множественном сайте клонирования в pUC19. Затем клон pUC19 последовательно
переваривали BstEII и BsrGI и повторно лигировали после переваривания фрагментом Кленова с образованием внутренней делеций в гене LDH между BstEII и BsrGI.
При стратегии 2 (см. пример 2) ген LDH клонировали в виде 2 продуктов ПЦР, вводя сайты NotI на
олигопраймерах, чтобы образовать 2 продукта ПЦР для совместного лигирования в pUC19 с образованием делеций в середине последовательности LDH. Два гена LDH с внутренними делециями субклонировали в трех потенциальных системах доставки для Geobacillus.
Векторы доставки трансформировали в 11955 путем электропорации.
Информация по генетической стратегии: разработка систем доставки для гомологичной рекомбинации.
Для создания нокаутов необходима эффективная система для доставки мутированного гена в организм-мишень и отбора на интеграцию в геном в результате гомологичной рекомбинации с геноммишенью "дикого типа". В принципе, это может быть достигнуто путем введения ДНК на векторе Е.coli
без грамположительного репликона, но который несет грамположительный селективный маркер. Для
этого необходима высокая эффективность трансформации. Метод электропорации, разработанный для
Geobacillus 11955, создает 3×104 трансформантов на 1 мкг ДНК с pNW33N. Грамположительный репликон выделен из рВС1 по каталогу BGSC и из рТНТ15 по базе данных последовательностей.
Ген cat на pNW33N используют для селекции как в Е.coli, так и в Geobacillus. Термочувствительные
мутанты pNW33N были получены с помощью пассажей плазмиды через штамм-мутатор Statagene XL1r
ed.
Пример 2. Получение мутанта LDH путем замещения гена.
Для получения стабильной мутации гена LDH в Geobacillus thermoglucosidasius NCIMB 11955 была
разработана дополнительная стратегия путем замещения гена. В эту стратегию вовлечено создание делеции 42 п.о. вблизи середины кодирующей последовательности и инсерции 7 п.о. в данном положении,
вводящей новый сайт рестрикции NotI. Эта последовательность вставки была предназначена для того,
чтобы вызвать мутацию сдвига рамки считывания правее. В данную стратегию вовлечено создание делеции с использованием 2 фрагментов ПЦР, используя олигопраймеры, вводящие сайт рестрикции NotI.
Праймеры были разработаны на основании частичной последовательности кодирующей области LDH из
11955. Последовательность использованных праймеров показана ниже.
Фрагмент 1:
Праймер 1 (прямой):
(SEQ ID NO: 3; затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта EcoRI).
Праймер 2 (обратный):
(SEQ ID NO: 4; затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта NotI).
Фрагмент 2:
Праймер 3 (прямой):
(SEQ ID NO: 5; затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта NotI).
Праймер 4 (обратный):
(SEQ ID NO: 6; затененная последовательность указывает основания, введенные для создания нового сайта PstI).
Получение препарата геномной ДНК.
Препарат геномной ДНК, который служит матрицей для ПЦР, получали из 11955. Клетки из 20 мл
ночной культуры 11955, выращенной в среде TGP при 52°С, собирали центрифугированием при
4000 об/мин в течение 20 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл буфера STE 0,3 М сахароза,
25 мМ Трис HCl и 25 мМ ЭДТА, доведенного до рН 8,0, содержащего 2,5 мг лизоцима и 50 мкл 1 мг/мл
рибонуклеазы А. Эту смесь инкубировали в течение 1 ч при 30°С, затем добавляли 5 мл протеиназы K и
50 мкл 10% ДСН с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. Затем лизированную культуру последовательно экстрагировали равными объемами фенола/хлороформа, а затем хлороформом, после чего
осаждали изопропанолом. После отмывки дважды охлажденным во льду 70% этанолом осадок ДНК снова растворяли в 0,5 мл буфера ТЭ.
-5-
015794
Создание конструкции с делецией LDH.
ПЦР проводили, используя Robocycler Gradient 96 (Stratagene), и условия реакции были следующими: цикл 1: денатурация при 95°С в течение 5 мин, отжиг при 47°С в течение 1 мин, элонгация при 72°С
в течение 2 мин; циклы 2-30: денатурация при 95°С в течение 1 мин, отжиг при 47°С в течение 1 мин,
элонгация при 72°С в течение 2 мин, последующая инкубация при 72°С в течение 5 мин. Используемые
ферменты представляли собой равную смесь полимеразы Pfu (Promega) и полимеразы Taq (New England
Biolabs, NEB). Используемые буфер, состав и концентрация dNTP были такими, как рекомендовано для
Pfu поставщиками. Продукты ПЦР, полученные с использованием геномной ДНК из NCIMB 11955 в
качестве матрицы, очищали путем электрофореза в агарозном геле и элюировали из агарозного геля с
использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Очищенные продукты ПЦР лигировали с
pUC19 (New England Biolabs), предварительно переваренной SmaI, и лигазную смесь использовали для
трансформации Escherichia coli DH10B (Invitrogen). Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и
содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом и устанавливали ориентацию вставок.
Плазмиду (рТМ002) с фрагментом 2, встроенным в pUC19 (с новым сайтом PstI, введенным на
праймере 4 ближе всего к сайту PstI в сайте поликлонирования (mcs) pUC19), переваривали NotI и PstI.
Полученный в результате фрагмент (примерно 0,4 кб) лигировали в плазмиду pUC19 (pTM001), несущую
фрагмент 1 (с новым сайтом EcoRI, введенным на праймере 1 ближе всего к сайту EcoRI в mcs pUC19),
переваренную NotI и PstI для линеаризации плазмиды. Лигазную смесь использовали для трансформации
E.coli DH10B. Отбирали колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и
характеризовали рестрикционным анализом. Плазмиду (рТМ003) с ожидаемым паттерном рестрикции
для желаемой конструкции (кодирующая область LDH, несущая делецию и введенный сайт NotI) идентифицировали и проверяли секвенированием, используя прямой и обратный праймеры М13mp18.
Мутированный ген LDH вырезали из рТМ003 путем переваривания HindIII и EcoRI и очищали путем электрофореза в агарозном геле с последующей элюцией из агарозного геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (в виде фрагмента примерно 0,8 кб). Этот фрагмент обрабатывали полимеразой Кленова (NEB, согласно инструкциям изготовителей) с образованием тупых концов и вводили в
вектор pUB190. Это было достигнуто путем лигирования по тупым концам с pUB190, линеаризованной
перевариванием XbaI, а затем обработанной фрагментом Кленова с последующей очисткой из геля, как
описано выше. Лигазную смесь использовали для трансформации Е.coli SCS110 (Stratagene). Отбирали
колонии, устойчивые к ампициллину, и содержащиеся плазмиды выделяли и характеризовали рестрикционным анализом. Плазмиду (рТМ014) с ожидаемым паттерном рестрикции для желаемой конструкции
идентифицировали и использовали для трансформации NCIMB 11955 путем электропорации, используя
протокол электропорации, как описано в примере 1.
Получение и характеристика мутанта LDH с замещением гена посредством двойного кроссинговера.
Предполагаемый первичный интегрант рТМ014, полученный таким способом (штамм ТМ15), использовали для получения двойных рекомбинантов (замещения гена). Это было достигнуто с помощью
серийной субкультуры ТМ15 в среде TGP без канамицина. Использовали пять последовательных культур при качании, чередуя 8 ч при 54°С и 16 ч при 52С°, используя 5 мл TGP в пробирках на 50 мл
(Falcon) при 250 об/мин, 1% пересев на каждой стадии. После этих 5 пассажей полученную в результате
культуру серийно разводили в TGP и высевали пробы по 100 мкл на чашки с агаром TGP для инкубации
при 54°С. Перепечатку полученных в результате колоний на агар TGP, содержащий 12 мкг/мл канамицина, использовали для идентификации колоний, чувствительных к канамицину. После рассева истощающим штрихом на агаре до отдельных колоний для очистки эти производные, чувствительные к канамицину, тестировали на продуцирование лактата, и, как ожидали, оказалось, что они представляют собой
смесь LDH+ и LDH-. Одно производное LDH-, TM89, было дополнительно охарактеризовано с помощью
ПЦР и Саузерн-блоттингов.
Геномную ДНК получали из ТМ15 (первичный интегрант) и ТМ89 (предполагаемый двойной рекомбинант LDH-) и использовали в качестве матрицы для ПЦР с использованием праймеров 1 и 4 и условий, описанных выше. Геномную ДНК из 11955 использовали в качестве контроля. Продукты ПЦР
(полосы примерно 0,8 кб получены для всех 3 матриц) очищали электрофорезом в агарозном геле и
элюировали из агарозного геля, используя набор QIAquick Gel Extraction Kit. Образцы переваривали NotI
и разгоняли на 0,7% агарозном геле для визуализации продуктов. Продукт ПЦР 11955 не показал данных
рестрикции NotI, как ожидали, тогда как продукт ПЦР ТМ89 дал 2 полосы примерно по 0,4 кб, что указывает на замещение гена дикого типа мутированным аллелем. Переваривание NotI продукта ПЦР ТМ15,
первичного интегранта, дало преимущественно 2 полосы, наблюдаемые для ТМ89, со следом нерестрицированной (0,8 кб) полосы. Это можно объяснить результатом, полученным Саузерн-блоттингом геномной ДНК ТМ15.
Геномную ДНК 11955, ТМ15 и ТМ89 переваривали NotI, PstI и NotI и HindIII и NotI и подвергали
электрофорезу в агарозном геле. ДНК переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану
(Roche) и гибридизовали с меченым DIG зондом, полученным с помощью ПЦР гена LDH 11955, исполь-6-
015794
зуя праймеры 1 и 4, с мечеными DIG dNTP, следуя инструкциям поставщиков (Roche Molecular
Biochemicals DIG application manual). Гибридизовавшиеся полосы визуализировали, используя поставляемый набор для обнаружения (Roche). Данные Саузерн-блоттинга показали наличие множественно
амплифицированной полосы примерно 7,5 кб в переваре NotI TM15 с так же амплифицированными полосами примерно 7 и 0,4 кб в переварах HindIII/NotI и PstI/NotI TM15, что указывает на интеграцию множественных тандемных копий рТМ014, интегрированных при локусе LDH в данном первичном интегранте. Со всеми 3 рестрикционными переварами ТМ89 показала наличие другого паттерна рестрикции,
показывающего дополнительную полосу гибридизации по сравнению с11955, соответствующую замещению гена. ТМ89 депонирована в NCIMB под номером по каталогу 41275, как указано ниже.
Пример 3. Продуцирование этанола термофилом дикого типа.
Воспроизводимый рост и образование продукта было достигнуто в культурах с подпиткой и непрерывных культурах для термофила дикого типа. В табл. 1, 2 и 3 показаны условия, используемые для процесса ферментации.
Таблица 1
Таблица 2
Сульфатный концентрированный раствор микроэлементов
Таблица 3
Условия ферментера
-7-
015794
Таблица 4
Пример 4. Повышение продуцирования этанола термофилами.
С целью достижения целевых выходов этанола и производительности термофила продуцирование
молочной кислоты было минимизировано посредством нокаута активности L-лактатдегидрогеназы
(LDH) путем инактивации гена Idh. Имело место два подхода, предпринятых для инактивации гена Idh:
рекомбинация ДНК-маркера по типу одиночного кроссинговера в области Idh хромосомы, предотвращающая ее транскрипцию, или рекомбинация по типу двойного кроссинговера гомологичных областей
ДНК в гене Idh с образованием мутации внутри области этого гена, делающая его нефункциональным.
В результате метода одиночного кроссинговера были быстро получены LDH-отрицательные мутанты, которые проявляли повышение продуцирования этанола по сравнению со штаммом дикого типа
(NCIMB 11955).
Улучшения продуцирования этанола мутантами LDH.
LDH-отрицательные мутанты выращивали в культурах с подпиткой в разработанной минимальной
среде для изверения повышения продуцирования этанола в результате нокаута активности LDH. Изменения профиля метаболитов мутантов LDH показано в табл. 5 в сравнении с оптимальным продуцированием этанола из штамма дикого типа. Профили продуцирования метаболитов двух мутантов LDH показаны на фиг. 1 и 2. В табл. 6 показано повышение продуцирования этанола, вызванное нокаутом активности LDH.
Таблица 5
Таблица 6
Мутанты LDH продуцировали значительно более высокие выходы этанола, чем термофил дикого
типа, демонстрируя успешное переключение пути метаболизма этих термофилов. Дополнительная оптимизация условий культивирования и состава сред для мутантных штаммов LDH будет приводить к повышенным выходам этанола.
Продуцирование этанола мутантами LDH в непрерывной культуре.
Наиболее стабильный из мутантов по лактату в результате одиночного кроссинговера выращивали
в непрерывной культуре, чтобы оценить его долговременную стабильность в качестве продуцента этанола. Этот штамм культивировали в минимальной среде с глюкозой в качестве источника углерода. Стабильное состояние культуры наблюдали в течение примерно 290 ч до появления реверсии к продуцированию лактата.
Пример 5.
Мутант ТМ89, представляющий собой двойной кроссовер (пример 2), оценивали на продуцирование этанола, как изложено в примере 4. Результаты представлены в табл. 8, и они показывают, что этот
мутант достигал значительных уровней продуцирования этанола (выше чем 200 мМ). Этот мутант также
оценивали на продуцирование этанола с утилизацией глюкозы или ксилозы в качестве источника углерода. Результаты представлены в табл. 7.
-8-
015794
Таблица 7
Было показано, что глюкоза является лучшим источником углерода, но результаты четко показывают, что организмы способны к ферментации ксилозы без дополнительной модификации.
Стабильность мутанта, отрицательного по лактатдегидрогеназе, также тестировали при ряде условий в непрерывной культуре в течение периода 1500 ч. Результаты показаны на фиг. 6 и демонстрируют,
что отрицательный фенотип по лактатдегидрогеназе остается стабильным, несмотря на значительное
заражение культуры, и не основан на сохранении отбора по антибиотику. В процессе непрерывного
культивирования степень разведения варьировала между 0,1 и 0,5 ч-1, и культуру переключали с кислородных условий (подача воздуха) на бескислородные (подача N2) условия без изменений в концентрации
лактата. Более значимо варьировал рН культуры и падал до рН 4,4, что находится вне нормального интервала рН для роста организма дикого типа. Однако культура быстро восстанавливалась без изменения
фенотипа, а именно концентрация лактата не менялась.
Микроорганизм, определенный здесь как ТМ89, и плазмида pUB190-Idh депонированы под номером по каталогу NCIMB 41275 и 41276 соответственно. Хранилище представляет собой NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksbum, Aberdeen, AB21 9YA, United Kingdom.
Таблица 8
-9-
015794
Перечень последовательностей
- 10 -
015794
- 11 -
015794
- 12 -
015794
- 13 -
015794
- 14 -
015794
- 15 -
015794
- 16 -
015794
- 17 -
015794
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Термофильный микроорганизм, модифицированный для возможности повышенного продуцирования этанола, где модификация представляет собой инактивацию гена лактатдегидрогеназы термофильного микроорганизма дикого типа, где нативный ген лактатдегидрогеназы или его участок делетирован и
где этот микроорганизм представляет собой вид Geobacillus.
2. Микроорганизм по п.1, где этот микроорганизм не содержит систему рестрикции.
3. Микроорганизм по любому из пп.1, 2, где этот микроорганизм представляет собой Geobacillus
thermoglucosidasius.
4. Микроорганизм по любому из пп.1-3, где этот микроорганизм представляет собой спорообразующий микроорганизм.
5. Микроорганизм по любому из пп.1-4, где этот микроорганизм способен к метаболизму целлобиозы, и/или крахмала, или их олигомера.
6. Микроорганизм по любому из пп.1-5, где этот микроорганизм растет при температуре 40-85°С,
предпочтительно 50-70°С.
7. Микроорганизм по любому из пп.1-6, где этот микроорганизм содержит ненативный ген пируватдекарбоксилазы.
8. Микроорганизм по любому из пп.1-7, где этот микроорганизм содержит ненативный ген алкогольдегидрогеназы.
9. Микроорганизм по любому из пп.1-8, где этот микроорганизм не содержит интегративный элемент в гене лактатдегидрогеназы.
10. Geobacillus thermoglucosidasius, обеспечивающий повышенное продуцирование этанола, депонированный в NCIMB под номером 41275.
11. Способ продуцирования этанола, при котором культивируют микроорганизм по любому из
пп.1-10 в подходящих условиях в присутствии С3, С5 или С6 сахара или его олигомера.
12. Способ по п.11, где этот способ осуществляют при температуре между 40 и 70°С.
13. Способ по п.11, где температура составляет от 52 до 65°С.
14. Способ по любому из пп.11-13, где микроорганизм поддерживают в культуре при рН между 4 и
7,5.
15. Плазмида для делетирования нативного гена лактатдегидрогеназы, определенная здесь как SEQ
ID NO: 2.
16. Термофильный микроорганизм, содержащий плазмиду по п.15.
17. Корм для животных, содержащий микроорганизм по любому из пп.1-10.
Фиг. 1
- 18 -
015794
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 19 -
015794
Фиг. 5
Фиг. 6
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 20 -