На правах рукописи Дьячкова Лариса Германовна РОЛЬ

На правах рукописи
Дьячкова Лариса Германовна
РОЛЬ АУТОКРИННЫХ ФАКТОРОВ В КОНТРОЛЕ ВЫЖИВАНИЯ
АКТИВИРОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ
14.00.36 – Аллергология и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
МОСКВА – 2009
Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
Луценко Геннадий Владимирович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Ляшенко Всеволод Андреевич
доктор биологических наук, профессор
Филатов Александр Васильевич
Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение
«Российский геронтологический научно-клинический центр»
Защита диссертации состоится «______» _________________ 2009г. в __________час. на
заседании диссертационного совета Д 208.046.02 при Федеральном Государственном
учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и
микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека по адресу: 1255212, г. Москва, ул. Адмирала
Макарова, д.10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н.
Габричевского».
Автореферат разослан «_______»_________________200___г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук
Новикова Л.И.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Выживание клеток в многоклеточном организме находится под
контролем множества цитокинов различной природы. Согласно концепции «социального»
контроля выживания и гибели клеток М. Рэффа (Raff, 1992) все клетки многоклеточного
организма для своего выживания постоянно нуждаются в поступлении сигналов от других
клеток этого организма. В случае отсутствия таких сигналов клетка погибает, выбывая из
клеточного сообщества. Такой контроль выживания клеток необходим для поддержания
гомеостаза тканей, который достигается за счет баланса между скоростями клеточной
пролиферации и клеточной гибели.
Как и другие клетки в многоклеточном организме, Т-лимфоциты зависят от
специальных
сигналов
для
своего
выживания,
причем
для
покоящихся
и
для
активированных Т-клеток эти сигналы различны. Покоящиеся Т-клетки чувствительны к
своему микроокружению и постоянно поддерживаются in vivo факторами выживания,
такими, как IL-6 и IL-7. Когда покоящиеся Т-клетки встречаются с антигеном, они
активируются и проходят несколько циклов деления, а на завершающей стадии ответа на
антиген большинство Т-клеток, участвовавших в ответе, элиминируется путём апоптоза.
Часть активированных Т-клеток гибнет из-за того, что они теряют восприимчивость к IL-6,
фактору выживания, который поддерживает их покоящихся предшественников. Для
выживания активированных Т-лимфоцитов необходимо присутствие таких лимфокинов, как
IL-2, IL-4, IL-7 и IL-15. В результате взаимодействия этих лимфокинов с рецепторами на
клеточной поверхности либо усиливается экспрессия и функция антиапоптозных белков
семейства Bcl-2, либо угнетается функция проапоптозных белков этого семейства.
Регуляция энергетического метаболизма является другим важным механизмом, с
помощью которого цитокины и факторы роста осуществляют контроль выживания клеток.
Цитокины и факторы роста стимулируют экспрессию транспортера глюкозы и его
активность, вследствие чего поддерживается метаболизм клетки через усиление процесса
гликолиза. Кроме того, цитокины контролируют работу таких ферментов гликолиза, как
гексокиназа и фосфофруктокиназа-1. В лимфоцитах в отсутствие экзогенных факторов
выживания происходит снижение внутриклеточного АТФ вследствие снижения транспорта
глюкозы и активности ферментов гликолиза, что может приводить к апоптозу клеток, а в
некоторых случаях к атрофии клеток и их гибели независимым от каспаз образом.
3
Наряду с данными об участии в контроле клеточного выживания паракринных
факторов, т.е. факторов, которые клетка получает от клеток других типов, имеются данные,
указывающие на то, что контроль выживания клеток могут осуществлять также
аутокринные факторы (АФ), т.е. факторы, продуцируемые клетками того же типа. Главной
трудностью при изучении участия АФ в различных процессах, протекающих в клетках,
является их постоянное присутствие в среде, окружающей клетки, вследствие чего, эффекты
АФ могут проявляться при любом исследовании физиологии клеток.
Т-лимфоциты,
характеризующиеся
интенсивным
обновлением,
постоянной
миграцией и циркуляцией в организме, подвержены значительным метаболическим
перестройкам и регулярным воздействиям изменяющихся условий микроокружения, в том
числе и неблагоприятным для жизнедеятельности. Поэтому именно Т-лимфоциты являются
тем типом клеток, для которых поддерживающее влияние АФ должно быть наиболее
выраженным. Анализ участия АФ в процессах выживания Т-клеток не ограничивает круг
задач, связанных с исследованием роли АФ в физиологии Т-лимфоцитов. Поскольку есть
основания полагать, что АФ способны осуществлять контроль энергетического метаболизма
Т-клеток, то следует ожидать влияния АФ на функциональную активность Т-лимфоцитов.
Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют, что
контроль выживания и энергетического метаболизма клеток различными цитокинами и
факторами роста играет ключевую роль в физиологии всей иммунной системы и Тлимфоцитов в частности. Однако в настоящее время совершенно не изученным остается
вопрос о контроле выживания и энергетического метаболизма активированных Тлимфоцитов аутокринными факторами. Вследствие постоянного присутствия АФ в среде,
окружающей клетки, актуальной является разработка экспериментального подхода,
позволяющего минимизировать эффекты эндогенных АФ таким образом, чтобы стало
возможным исследование АФ, добавляемых к клеткам извне.
Цель исследования: выяснение роли АФ в контроле выживания активированных Тлимфоцитов и в механизме регуляции их энергетического метаболизма в нормальных
условиях и в условиях клеточного стресса, анализ вовлеченности АФ в процесс
программированной гибели Т-клеток.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать влияние плотности клеточной культуры, как величины, определяющей
уровень АФ в культуре, на выживание клеток интерлейкин-2-зависимой линии CTLL-2 в
отсутствие сыворотки.
4
2. Разработать экспериментальную модель для тестирования способности экзогенных АФ к
поддержанию выживания клеток.
3. Проанализировать роль энергетического метаболизма в механизме контроля выживания
клеток линии CTLL-2 и охарактеризовать его путь.
4. Провести сравнительный анализ
активности
АФ, осуществляющих регуляцию
энергетического метаболизма нормальных и трансформированных Т-клеток.
5. Проанализировать роль АФ в поддержании выживания клеток линии CTLL-2 и в
сохранении их энергетического метаболизма в условиях клеточного стресса.
6. Изучить влияние АФ на протекание апоптоза в клетках линии CTLL-2.
7. Провести анализ физико-химических характеристик АФ клеток линии CTLL-2.
Научная новизна. Получены новые знания о роли АФ в физиологии иммунной
системы и, в частности, в контроле выживания Т-лимфоцитов. Разработана оригинальная
экспериментальная модель для тестирования эффектов экзогенных АФ. Проведенный
сравнительный анализ активности АФ, осуществляющих регуляцию энергетического
метаболизма нормальных активированных Т-лимфоцитов и клеток линий Т-ряда, показал,
что АФ этих клеток не различаются по своим функциональным свойствам. Впервые
показано, что в условиях дефицита АФ наблюдается временное нарушение гликолиза Тлимфоцитов, которое сопровождается падением уровня АТФ в клетках с последующим
постепенным его восстановлением в течение нескольких часов; добавление экзогенных АФ
полностью устраняет дефицит АФ и препятствует падению уровня АТФ. Показано, что в
условиях дефицита АФ клетки приобретают большую чувствительность к клеточному
стрессу (гипотермия, окислительный стресс), что сопровождается значительным снижением
клеточного выживания и гибелью клеток преимущественно по пути некроза. При индукции
апоптоза в клетках актиномицином Д дефицит АФ в культуре приводит к быстрому
переходу от апоптоза к вторичному некрозу. Впервые показано, что в условиях гипоксии
избыток АФ способствует сохранению энергетического метаболизма клеток в нормальном
состоянии. С использованием метода гель-фильтрации получены три группы протеиновых
молекул, различающихся по массе и способности оказывать регулирующее влияние на
гликолиз клеток CTLL-2.
Практическая значимость.
Состояние энергетического
метаболизма клеток
иммунной системы влияет на их функциональную активность и таким образом может быть
важным для эффективной работы иммунной системы. Полученные в работе данные
расширяют существующие представления о роли АФ в функционировании иммунной
5
системы, особенно в вопросе контроля энергетического метаболизма Т-лимфоцитов.
Наиболее важным с практической точки зрения является обнаруженный в работе эффект
восстановления энергетического метаболизма клеток CTLL-2 в условиях гипоксии в
присутствии избытка АФ. Ответственность за этот эффект несут протеиновые молекулы,
выделенные из состава кондиционированной среды и обладающие массой 4,9 кДа. Эти
данные целесообразно использовать для создания новых лекарственных препаратов на
основе олигопептидов, предназначенных для стимуляции энергетического метаболизма Тлимфоцитов и клеток других типов при гипоксии и других патологических состояниях,
приводящих к угнетению энергетического метаболизма клеток. Важным для практики
испытания противоопухолевых препаратов на клеточных линиях является получение в
работе данных о повышении чувствительности клеток к цитотоксическому действию
пероксида водорода в условиях дефицита АФ, что указывает на возможность получения
ошибочных результатов, вызванных артефактами, связанными с АФ. Разработанные в
работе методические рекомендации позволяют свести к минимуму артефакты, связанные с
влиянием дефицита АФ или их избытка, при проведении тестирования цитотоксических
препаратов и при постановке других экспериментов на клеточных линиях.
Внедрение результатов работы. Методические рекомендации по проведению
экспериментов с культурами различных клеточных линий без возникновения артефактов,
связанных с влиянием АФ, внедрены в практику работы лаборатории белков гормональной
регуляции
Института
биоорганической
химии
им.
академиков
М.М.Шемякина
и
Ю.А.Овчинникова РАН.
Положения, выносимые на защиту:
1. В результате культивирования нормальных активированных Т-лимфоцитов и
клеток линий Т-ряда CTLL-2 и EL-4 в высокой плотности и последующего их переноса в
культуры низкой плотности в последних образуется дефицит АФ. Дефицит АФ приводит к
временному нарушению энергетического метаболизма, которое сопровождается падением
уровня АТФ в клетках. Если клетки, полученные из культур высокой плотности, вплоть до
переноса в культуры низкой плотности содержать на тающем льду (для предотвращения
изменений в клеточном метаболизме), по завершению культивирования наблюдается
значительное снижение клеточного выживания.
2.
Экзогенные
АФ
способны
восстанавливать
энергетический
метаболизм
нормальных активированных Т-лимфоцитов и клеток линий CTLL-2 и EL-4 в условиях
дефицита эндогенных АФ. Факторы, секретируемые этими клетками, не различаются по
6
своим функциональным свойствам, как при аутокринном, так и при паракринном действии.
Аутокринные факторы осуществляют контроль энергетического метаболизма клеток линии
CTLL-2 через регуляцию ферментов гликолиза. Пируват, субстрат цикла трикарбоновых
кислот, способен восстанавливать энергетический метаболизм клеток в условиях дефицита
эндогенных АФ за счет интенсификации окислительного фосфорилирования.
3. Дефицит АФ в культуре, сопровождающийся нарушением гликолиза в клетках и
падением уровня внутриклеточного АТФ, делает их более чувствительными к стрессовым
воздействиям (кратковременная гипотермия, окислительный стресс), что приводит к
массовой гибели клеток преимущественно по пути некроза. При индукции апоптоза в
клетках актиномицином Д дефицит АФ в культуре вызывает дополнительное снижение
клеточного выживания и быстрый переход от апоптоза к вторичному некрозу. Избыточное
количество АФ в культуре в условиях гипоксии приводит к сохранению содержания АТФ в
клетках на нормальном уровне.
4. Из протеиновых молекул АФ трех типов, полученных фракционированием
кондиционированной среды клеток линии CTLL-2 с использованием гель-фильтрации лишь
молекулы с массой 4,9 кДа обладают способностью по нормализации уровня АТФ в клетках
CTLL-2 в условиях «химической гипоксии», получаемой с использованием ингибитора
дыхания азида натрия.
Апробация работы. Диссертация апробирована на научной конференции отдела
иммунологии ИБХ РАН. Материалы диссертации представлены на 3-й, 5-ой, 6-ой, 8-ой и 11ой научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в СанктПетербурге» (Санкт-Петербург, 1999, 2001, 2002, 2004, 2007), на чтениях, посвященных
памяти Ю.А. Овчинникова (Москва, 1998, 2004), на школе-конференции «Горизонты
физико-химической биологии» (Пущино, 2000), на 5-ой и 8-ой международных
иммунологических летних школах им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2000, 2007), на 17-ой зимней
молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии» (Москва, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов:
введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их
обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 143 страницах
машинописного текста, содержит 25 рисунков, 2 таблицы. Список литературы включает 286
источников, из которых 278 иностранных.
7
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные. В экспериментах использовали самок мышей инбредной линии Balb/c,
полученных из питомника экспериментальных животных (ФИБХ РАН, г. Пущино, МО) в
возрасте 8–11 недель и с исходной массой 18–20 г.
Клеточные линии. Клетки ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2 и T-клеточной лимфомы
EL-4 выращивали в среде RPMI-1640 (“Sigma”, США) с добавлением 10% эмбриональной
телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина ("Flow Laboratories", Великобритания), 50 мкМ 2меркаптоэтанола ("Serva", Германия), 50 мкг/мл гентамицина. К клеткам CTLL-2 добавляли
100 ед./мл рекомбинантного ИЛ-2 (“Биотех”, Санкт-Петербург). Клетки культивировали в
24-луночных и 6-луночных планшетах (“Costar”, США) при 37C в атмосфере с 5% CO2.
Приготовление клеточных суспензий. Суспензии нативных спленоцитов получали
общепринятым способом от мышей, забитых методом цервикальной дислокации.
Приготовление клеточных суспензий проводили по стандартному протоколу при
температуре тающего льда в среде RPMI-1640. Для удаления эритроцитов использовали
раствор Бройля.
Нормальные активированные T-лимфоциты получали из спленоцитов мышей
BALB/c путем их стимуляции конканавалином А (Кон А, 2,5 мкг/мл) в течение 3-х дней. По
истечении этого времени клетки отмывали от Кон А с использованием метил -Dманнопиранозида (“Sigma”). Клетки инкубировали в 1%-м растворе этого реагента при 37 C
в течение 20 мин и после отмывки переводили в культуральную среду. Полученные таким
способом активированные T-лимфоциты поддерживали в культуре в течение 10  12 дней,
добавляя по 50 ед./мл ИЛ-2 каждые 2  3 дня.
Среды для культивирования и опытов. При подготовке культур высокой
плотности и проведении большинства экспериментов использовали бессывороточную среду
на основе среды RPMI-1640 (Ohmori, 1988) с добавлением 0,5 мг/мл -циклодекстрина
("Sigma"), 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА, "Serva"), 5 мкг/мл инсулина,
25 мкг/мл трансферрина ("Sigma"), 5х10
-7
М путресцина ("Sigma"), 2 мМ L-глутамина, 50
мкМ 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина и 100 ед./мл ИЛ-2. В экспериментах по
индукции апоптоза вместо бессывороточной среды использовали среду RPMI-1640 с
8
добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл
гентамицина и 100 ед./мл ИЛ-2.
Культуры высокой (ВП) и низкой плотности (НП). В качестве ВП-культуры
использовали
так
называемую
pellet-культуру
с
некоторой
модификацией.
Для
культивирования использовали круглодонные культуральные пробирки объемом 10 мл
(“Nunc”, Дания). Непосредственно перед началом культивирования в пробирки вносили по 1
мл клеточной суспензии, содержащей 1х106 клеток CTLL-2, 2x10 6 клеток EL-4 или 3х106
нормальных T-лимфоцитов в бессывороточной культуральной среде. Затем клетки осаждали
центрифугированием (200 g, 1 мин) и в таком плотном осадке их культивировали в течение
1620 ч при 37C. Клетки CTLL-2 и нормальные T-лимфоциты культивировали в
присутствии 200 ед./мл ИЛ-2. По окончании первого этапа культивирования клетки
переносили в НП-культуры. Для этого клетки собирали, отмывали и в свежей среде
переносили в плоскодонный 96-луночный планшет (“Nunc”) в количестве 2х104 клеток на
лунку (2х10 5 клеток/мл). В ряде экспериментов вместо свежей среды, с клетками вносили
кондиционированную среду (КС) из ВП-культур. Общее время культивирование клеток в
НП-культурах составляло 56 ч. На начальном этапе данной работы клетки линии CTLL-2
из ВП-культур вплоть до внесения в НП-культуры 10–15 мин содержали на тающем льду.
Приготовление кондиционированной среды (КС). КС различных типов получали в
виде надосадочной жидкости культур клеток CTLL-2 (1х106 клеток/мл), EL-4 (2x10 6
клеток/мл)
или
нормальных
активированных
T-лимфоцитов
(5х106
клеток/мл),
культивируемых в бессывороточной среде с добавлением 200 ед./мл рекомбинантного ИЛ-2
(кроме клеток EL-4) в течение 24 ч. Для проведения гель-фильтрации КС клеток CTLL-2 ее
приготавливали на основе безбелковой среды (среда Ohmori без БСА, инсулина и
трансферрина). Для получения такой КС клетки CTLL-2 культивировали при плотности
3х106 клеток/мл в течение 20 ч с добавлением 200 ед./мл рекомбинантного ИЛ-2.
Жизнеспособность клеток определяли путем их окрашивания трипановым синим
(0,2% на фосфатном буферном растворе).
Выживание клеток определяли с использованием MTT-теста с некоторыми
изменениями. Для проведения теста клетки осаждали в планшете центрифугированием (400
g, 5 мин) и стряхиванием удаляли надосадочную жидкость из лунок. После этого в лунки
вносили по 30 мкл раствора MTT (“Sigma”), приготовленного на среде RPMI-1640 (0,5
мг/мл), и инкубировали 2 ч при 37С в атмосфере с 5% CO2. По истечении этого времени к
содержимому каждой лунки добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида и растворяли
9
кристаллы формазана, образованного в результате восстановления MTT живыми клетками.
Измерение оптической плотности содержимого каждой лунки проводили на приборе
"Multiscan MCC/340" ("Titertek", Великобритания) при длине волны 540 нм. Выживание
клеток оценивали по величине оптической плотности раствора формазана в каждой пробе.
Холодовую инкубацию клеток проводили, помещая пробирки с клеточной
суспензией на 10 мин в тающий лед. Холодовой инкубации подвергали клетки, полученные
после культивирования в ВП-культурах, перед их внесением в НП-культуры.
Содержание АТФ в клетках определяли люциферин-люциферазным методом с
использованием стандартного набора для определения АТФ (“Sigma”) на биолюминометре
“Triathler” (“Hidex”, Финляндия).
Регистрацию апоптоза и некроза проводили с использованием двойного
окрашивания клеток аннексином V – ФИТЦ для регистрации фосфатидилсерина и пропидия
йодида (ПИ) для регистрации целостности клеток. После отмывки в фосфатном буфере
2х105 клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера (10 мМ HEPES/ NaOH, pH 7,4, 140 мМ
NaCl, 2,5 мМ CaCl2) и добавляли 2,3 мкг/мл аннексина V – ФИТЦ (“Sigma”) и 10 мкг/мл ПИ
(“Sigma”). Затем клетки инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре, а по
истечении этого времени добавляли к суспензии 400 мкл указанного выше буфера и
проводили измерение на проточном цитофлуориметре “FACScan” (“Becton Dickinson”,
США). В каждом образце проводился анализ не менее 10000 клеток.
Электрофорез ДНК. Для приготовления каждого образца 2х10 6 клеток дважды
отмывали в фосфатном буферном растворе, ресуспендировали в 20 мкл лизирующего
раствора (10 мМ ЭДТА; 50 мМ трис-HCl; 0,5% додецил сульфат натрия (ДСН); 0,5 мг/мл
протеиназы К; pH 8) и инкубировали 1 ч при 50C, а затем добавляли 10 мкл РНКазы (0,5
мг/мл), очищенной от ДНКазной активности (100C, 15 мин), и еще раз инкубировали 1 ч
при 50C. Затем проводили депротеинизацию образца фенолом: добавляли 400 мкл фенола,
100 мкл хлороформа и интенсивно перемешивали образец на шейкере в течение 2 мин,
после чего проводили центрифугирование (10000 g, 15 мин). Отбирали водную фракцию,
содержащую ДНК, и добавляли 3 объема перегнанного этилового спирта и 10 мкл 1 М NaCl
и инкубировали смесь в течение ночи при -20C. Затем снова проводили центрифугирование
(10000 g, 15 мин), отбирали надосадок и вносили 25 мкл TAE-буфера (40 мМ трис-ацетата, 1
мМ ЭДТА) и 5 мкл смеси красителей и раствора глицерина в равных долях: 0,25% бром
фенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 30% глицерина в воде. Полученные образцы
10
вносили в лунки агарозного геля (1,8% агарозы), содержащего 0,5 мкг/мл ПИ и проводили
электрофорез при стандартных условиях.
Гель-фильтрация КС. В качестве матрицы был выбран гель “Bio-Gel P-10”, для
которого характерен диапазон разделения глобулярных белков от 1,5 до 20 кДа. В качестве
элюента был использован фосфатный буфер (рН 7,2–7,4), сохраняющий молекулы АФ в
нативном состоянии. Для разделения использовалась колонка диаметром 8 мм и длиной 75
см. Скорость элюции составляла 76 мл/см2/ч. Перед нанесением на колонку КС
концентрировали в пять раз без замораживания на SpeedVac-концентраторе (“Savant”,
США). Общий белок, наносимый на колонку, составлял 30 мг в объеме 200 мкл.
Определение
биологической
активности
фракций
КС
проводили
с
использованием тест-системы, основанной на эффекте восстановления уровня АТФ в
клетках CTLL-2 в условиях «химической гипоксии» (10 мМ NaN3) при внесении в культуру
КС, содержащей АФ (см. раздел 4). При проведении тестирования активности полученных
фракций клетки CTLL-2 переносили из НП-культур (2х10 5 клеток/мл) в НП-культуры с
добавлением 10 мМ NaN3 и 100 ед./мл рекомбинантного ИЛ-2. Фракции смешивали с
бессывороточной средой на основе среды RPMI-1640 в соотношении 1:1.
Определение молекулярной массы АФ проводили хроматографическим методом
на матрице “Bio-Gel P-10”. В качестве маркерных протеинов были использованы инсулин
(5,75 кДа) и синтетические пептиды, любезно предоставленные И.А. Костанян (лаборатория
белков гормональной регуляции ИБХ РАН), с молекулярными массами: 712, 984 и 3047 Да.
При определении молекулярных масс исследуемых АФ использовали метод линейной
регрессии (программа “SigmaPlot 8.0”).
Глицин-ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле белков с молекулярной
массой более 10 кДа. Глицин–ДСН электрофорез в полиакриламидном геле белков с
молекулярной массой более 10 кДа проводился стандартным способом. Для этого готовили
10% полиакриламидный гель с содержанием 3% бисакриламида в качестве разделяющего
геля, состав концентрирующего геля был следующим: 8% акриламида и 3 % бисакриламида.
Электродный буфер был следующего состава: 1,4% глицина, 0,25 М трис, 0,1% ДСН. Режим
тока: при прохождении концентрирующего геля – 60 мА, при прохождении разделяющего
геля – 25 мА. В качестве стандартов использовался набор белков (Sigma) для проведения
электрофореза с глициновым буфером (94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1 и 14,4 кДа).
Трицин-ДСН-электрофорез белков в полиакриламидном геле. Разделение белков
производили на ступенчатом геле, где разделяющий гель имел следующий состав: 16,5%
11
акриламида, 6% бисакриламида и 6 М мочевины, промежуточный гель – 10% акриламида и
3% бисакриламида, а концентрирующий гель – 4% акриламида и 3% бисакриламида. В
качестве катодного буфера был использован буфер следующего состава: 0,2 M трис-HCl, 0,1
M трицина, 0,1% ДСН, pH 8,25, а в качестве анодного – 0,2 М трис-HCl, pH 8,9. Режим тока:
при прохождении через концентрирующий гель – 86 мА, при прохождении промежуточного
геля – 60 мА, а при прохождении разделяющего геля – 10 мА. В качестве стандартов
использовался специальный набор белков (Sigma) для проведения электрофореза с
трициновым буфером (16,95; 14,44; 10,05; 8,16; 6,31; 3,48 и 2,51 кДа).
Статистическая обработка. Количество повторов для каждой экспериментальной
точки составляло от 2-х до 4-х. Все опыты были повторены не менее трех раз. На всех
графиках указаны средние значения и стандартные ошибки. Достоверность различия
сравниваемых средних значений оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Влияние плотности культуры на выживание активированных Т-лимфоцитов
В данной работе в качестве модели активированного Т-лимфоцита использовали
клетки ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2. Для исследования влияния высокой плотности
культуры на выживание клеток CTLL-2 мы использовали так называемую pellet-культуру,
которую получают, осаждая клетки в пробирке центрифугированием и оставляя их в
плотном осадке (1х10 6 клеток) на весь срок культивирования (16–20 ч). В такой культуре
высокой плотности (ВП-культуре) в локальной области, прилегающей к клеткам,
происходит накопление АФ до высоких концентраций. Для предотвращения изменений в
клеточном метаболизме клетки из ВП-культур содержались на тающем льду. Тестирование
жизнеспособности клеток, полученных из такой культуры сразу по завершении
культивирования, с использованием трипанового синего выявило достаточно высокий ее
уровень (92%). В то же время выживание этих клеток, определенное с использованием MTTтеста, составило 67% от уровня контроля (рис. 1, 1). Если клетки, полученные из ВПкультур, переносили в свежей среде во вторичные культуры низкой плотности (НПкультуры, 2х10 5 клеток/мл) и подвергали дополнительному культивированию в течение 6 ч,
выживание таких клеток снижалось в еще большей степени и составляло 18% от уровня
контроля (рис. 1, 2). Внесение во вторичные НП-культуры 75% кондиционированной среды
(КС) с высоким содержанием АФ, полученной из ВП-культур, полностью восстанавливало
выживание клеток до контрольного уровня (рис. 1, 3).
12
Последний факт указывает на важную роль АФ в контроле выживания клеток и на
наличие дефицита АФ, который образуется при переносе клеток из ВП-культур в НПкультуры и который удается ликвидировать путем внесения экзогенных АФ в составе КС.
Причиной сниженного выживания клеток, взятых непосредственно из ВП-культуры (рис. 1,
1), по-видимому, также является дефицит АФ, который испытывают клетки в процессе
проведения MTT-теста, поскольку плотность клеток при постановке MTT-теста была
идентична плотности клеток во вторичной НП-культуре.
0,16
Выживание, отн. ед.
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
1
2
3
4
Рис. 1. Влияние культивирования в высокой плотности
на выживание клеток линии CTLL-2.
Выживание клеток CTLL-2 сразу после их
прекультивирования в ВП-культуре (1х10 6 клеток в
осадке) в течение 16 ч (1), последующего переноса в
НП-культуры (2х105 клеток/мл) и культивирования в
них в течение 6 ч: 2 – клетки культивировали в свежей
среде; 3 – клетки культивировали в 75% КС; 4 –
контроль, клетки переносили в свежей среде из
первичных НП-культур во вторичные НП-культуры.
Возникновение дефицита АФ в культуре можно объяснить с помощью явления,
называемого клеточной десенситизацией, и заключающегося в том, что при длительном
воздействии какого-либо фактора на клетки их первоначальная чувствительность к нему
постепенно снижается. Это явление, называемое также адаптацией, позволяет клеткам
регулировать свою чувствительность к данному фактору. По нашему мнению клетки в ВПкультуре в условиях повышенной концентрации АФ адаптируются к этим условиям, при
этом их чувствительность к АФ значительно снижается и перенос клеток в НП-культуру с
низкой концентрацией этих факторов приводит к дефициту АФ в такой культуре.
Экспериментальная система с переносом клеток из ВП-культур в НП-культуры и
формированием дефицита АФ в культурах была использована для дальнейшего
исследования влияния АФ на выживание Т-клеток. Проведенный подбор условий
культивирования в этой системе показал, что для ВП-культуры с 1х106 клеток оптимальной
является НП-культура с плотностью 2х105 клеток/мл (рис. 2). Для предотвращения
изменений в клеточном метаболизме клетки из ВП-культур вплоть до внесения в НПкультуры 10–15 мин содержали на тающем льду.
13
Выживание, отн. ед.
0,35
Рис. 2. Зависимость выживания клеток CTLL-2
от концентрации КС во вторичных НПкультурах различной плотности.
0,30
3
0,25
0,20
Клетки 16 ч культивировали в ВП-культуре
(1х106 клеток в плотном осадке) и переносили в
НП-культуры: 1 – 2х105, 2 – 4х105, 3 – 6х105
клеток/мл.
2
0,15
0,10
1
0,05
2. Роль энергетического метаболизма в
0,00
0,5
1
2
5
10
20
30
40
50
60
70
80
механизме контроля выживания клеток
% КC
линии CTLL-2
Для выяснения роли энергетического метаболизма в механизме контроля выживания
клеток
CTLL-2
аутокринными
факторами
мы
исследовали
влияние
основных
энергетических субстратов на выживание клеток CTLL-2 после их переноса из ВП-культур в
НП-культуры. Как видно из данных, представленных на рис. 3, повышенные концентрации
глюкозы (50 мМ) и глутамина (20 мМ) практически не влияли на выживание клеток в
данной системе. В то же время пируват оказывал выраженное протективное действие на
клетки CTLL-2. Выживание клеток при внесении 1 мМ пирувата в НП-культуру составляло
70% от контроля Б (рис. 3) и поднималось до 90%, если кроме вторичной НП-культуры
пируват вносили в первичную ВП-культуру.
Выживание, отн. ед.
0,18
Рис. 3. Выживание клеток CTLL-2 через 6 ч после
их переноса из ВП-культур в НП-культуры со
свежей средой, в которую добавлены различные
энергетические субстраты.
1–контроль А, среда без добавков; 2 – контроль Б,
цельная КС; 3 – среда с 50 мМ глюкозы; 4 – среда с
20 мМ L-глутамина; 5 – среда с 1 мМ пирувата; 6 –
среда с 1 мМ пирувата (пируват добавлен также в
первичную ВП-культуру)
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
1
2
3
4
5
6
Тот факт, что пируват, субстрат цикла трикарбоновых кислот, способен спасать
клетки CTLL-2 от гибели, является аргументом в пользу предположения, что причиной
гибели клеток является нарушение их энергетического метаболизма, приводящее к падению
уровня АТФ в клетках. Такое нарушение можно объяснить, если предположить
существование контроля энергетического метаболизма клеток со стороны АФ, который
14
нарушается при резком снижении их уровня, возникающем при переносе клеток из ВПкультуры в НП-культуру. Поскольку известно, что главным путем энергетического
метаболизма активированных T-лимфоцитов является гликолиз, то полученные данные
наводят на мысль, что, по-видимому, наличие пирувата в среде позволяет клетке
перестроиться на интенсификацию процесса окислительного фосфорилирования и обойти
контроль метаболизма глюкозы, нарушенный вследствие дефицита АФ.
Далее были проведены эксперименты, в которых исследовали влияние дефицита АФ
в культуре на уровень внутриклеточного АТФ. Оказалось, что после адаптации клеток к
условиям ВП-культуры, характеризуемой высоким содержанием АФ в среде, их перенос в
свежую среду сопровождается быстрым снижением уровня АТФ в клетках более чем в пять
раз, причем максимальная скорость снижения приходится на первую минуту инкубации в
свежей среде (рис. 4, А). При дальнейшем культивировании клеток уровень АТФ в них
несколько увеличивался, однако по сравнению с контролем оставался сниженным до конца
культивирования (рис. 4, Б, кривая 2). Часть клеток из ВП-культуры не подвергалась
холодовой инкубации перед их внесением в НП-культуры. Уровень АТФ в этих клетках
после быстрого падения восстанавливался до нормальных значений уже ко 2-му часу
культивирования (рис. 4, Б, кривая 3). Хотя кратковременная холодовая инкубация (0 °C, 10
мин) никак не сказывалась на энергетическом метаболизме контрольных клеток (рис. 4, Б,
кривая 1), она, по-видимому, является стрессирующим фактором для клеток, находящихся в
условиях дефицита АФ (рис. 4, Б, кривая 2). В отсутствие холодовой инкубации
происходило восстановление энергетического метаболизма клеток, оказавшихся в условиях
дефицита АФ, что, по-видимому, можно трактовать, как адаптацию клеток к новым
условиям культивирования с низким содержанием АФ в культурах. Полученные данные
показывают,
что
энергетический
метаболизм,
играя
главную
роль
в
контроле
физиологического состояния клеток линии CTLL-2 аутокринными факторами, в условиях
дефицита АФ нарушается. Со временем происходит его восстановление, однако
кратковременный гипотермический стресс препятствует этому процессу.
А
Б
15
Уровень АТФ, нмоль/106 клеток
5
Уровень АТФ, нмоль/106 клеток
1
5
1
4
4
3
3
2
2
3
2
2
1
1
0
0
0
2
4
6
8
10
12
0
1
2
3
4
5
6
7
Время, ч
Время, мин
Рис. 4. Зависимость уровня внутриклеточного АТФ от времени инкубации клеток
CTLL-2 в условиях дефицита АФ. А – краткосрочная кинетика; Б – долгосрочная кинетика.
Клетки из первичных культур переводили в свежую среду, охлажденную до 0 °C, а затем
переносили в НП-культуры и культивировали при 37°C. 1 – контроль, клетки из НП-культур;
2 – клетки из ВП-культур; 3 – клетки из ВП-культур (без холодовой инкубации).
6
Уровень АТФ, нмоль/10 клеток
2
5
4
Рис. 5. Влияние цельной КС или 1 мМ пирувата на
уровень АТФ в клетках CTLL-2, полученных из ВПкультур, подвергнутых холодовой инкубации (0 °C, 10
мин) и последующему культивированию в НПкультурах.
1 – контроль: свежая среда; 2 –цельная КС; 3 – свежая
среда с 1 мМ пирувата.
3
3
1
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Время, ч
Внесение в НП-культуры экзогенных АФ в составе цельной КС способствовало
сохранению на высоком уровне содержания АТФ в клетках, полученных из ВП-культуры и
подвергнутых холодовой инкубации (рис. 5, кривая 2). Такое же действие оказывало
добавление к свежей среде 1 мМ пирувата (рис. 5, кривая 3), что свидетельствует в пользу
нашего предположения о том, что наличие пирувата позволяет обойти контроль
метаболизма глюкозы, нарушенный вследствие дефицита АФ, за счет интенсификации
окислительного фосфорилирования.
Из литературы известно, что для активированных клеток T-ряда характерен высокий
уровень анаэробного гликолиза. Для определения пути энергетического метаболизма
опытных и контрольных клеток CTLL-2 и сравнения вклада в него аэробного и анаэробного
гликолиза мы провели ингибиторный анализ энергетического метаболизма этих клеток.
Иодоацетат (ИА) был использован в качестве ингибитора гликолиза, а в качестве
ингибиторов окислительного фосфорилирования  ингибитор клеточного дыхания азид
16
натрия (NaN3) и разобщитель ClCCP. В этой серии экспериментов холодовую инкубацию
клеток не проводили; для контрольных клеток ингибиторы добавляли в свежую среду, а для
опытных клеток – в цельную КС.
Таблица 1. Ингибиторный анализ энергетического метаболизма нормальных клеток
CTLL-2 (контроль) и клеток, полученных из ВП-культур
Контроль
Уровень АТФ,
Клетки
нмоль/106 кл.
Свеж. Цельн.
среда КС
Нормальные
5,53±
–
клетки CTLL-2
0,44
Клетки CTLL-2 0,74 ± 4,29 ±
из ВП-культур
0,15
0,19
Ингибиторы
Уровень ингибиции АТФ, %
ИА
ИА
50 µМ
100µМ
90,8 ±
0,6
92,8 ±
0,6
92,1 ±
0,7
95,5 ±
0,4
ClCCP ClCCP
10 µМ 20 µМ
37,4 ±
–
0,6
36,4 ±
39,2 ±
2,8
2,7
NaN3
5 мМ
–
39,9 ±
0,6
NaN3
10 мМ
39,7 ±
4,5
42,7 ±
3,3
Представленные в таблице 1 данные показывают, что энергетический метаболизм
опытных клеток не претерпевает изменений в процессе прекультивирования клеток в ВПкультурах. Единственное, что, по-видимому, отличает опытные клетки CTLL-2 от
контрольных клеток – это их сниженная чувствительность к АФ, добавление к таким
клеткам среды с повышенным содержанием АФ нивелирует это отличие. В клетках CTLL-2
практически весь запас внутриклеточного АТФ (более 90%) обеспечивается за счет
гликолиза, который протекает как в анаэробной, так и в аэробной форме (около 40% АТФ).
Поэтому контроль уровня внутриклеточного АТФ аутокринными факторами может
осуществляться либо путем регуляции транспорта глюкозы в клетках, либо путем регуляции
ферментов гликолиза.
Чтобы проверить возможность контроля энергетического метаболизма клеток CTLL2 аутокринными факторами посредством регуляции транспорта глюкозы, мы провели серию
экспериментов с использованием флоретина, ингибитора транспорта глюкозы. Для этого
флоретин добавляли к клеткам, находящимся в условиях дефицита АФ, и определяли его
влияние на уровень АТФ в этих условиях (рис. 6).
Уровень АТФ, %
Рис. 6. Влияние флоретина на уровень АТФ в
клетках CTLL-2, находящихся в условиях дефицита
АФ.
1–исходное содержание АТФ в клетках; к клеткам
из ВП-культуры добавлены: 2–свежая среда; 3–
цельная КС; 4–свежая среда с 300 мкМ флоретина;
5–свежая среда с 500 мкМ флоретина.
17
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
Внесение флоретина в НП-культуры с дефицитом АФ приводило к повышению
уровня АТФ в клетках. Этот факт свидетельствует в пользу представления, что транспорт
глюкозы не подвержен регулирующему действию АФ, а мишенью последнего в клетках
CTLL-2 являются ферменты гликолиза. В противном случае флоретин в условиях дефицита
АФ приводил бы к дополнительному снижению уровня АТФ в клетках. Данные литературы
свидетельствуют в пользу того, что ферментами гликолиза, контроль которых могли бы
осуществлять АФ, являются гексокиназа и/или фосфофруктокиназа-1. Парадоксальное
повышение уровня АТФ в клетках в условиях дефицита АФ, полученное при ингибировании
транспорта глюкозы флоретином (рис. 6), может являться результатом взаимного влияния
работы гексокиназы и фосфофруктокиназы-1 в условиях дефицита АФ.
3. Сравнительный анализ регуляции уровня АТФ аутокринными факторами в
нормальных и трансформированных Т-лимфоцитах
Для того чтобы проверить справедливость результатов, полученных на клетках линии
CTLL-2, для других клеток Т-ряда, было проведено сравнение влияния дефицита АФ в
культуре на содержание АТФ в клетках CTLL-2, нормальных активированных Tлимфоцитах и клетках линии EL-4. Для создания дефицита АФ в культурах этих клеток их
сначала культивировали в течение 1620 ч в плотном осадке: 1х106 клеток CTLL-2, 2x10 6
клеток EL-4 или 3х106 нормальных активированных T-лимфоцитов мыши, а затем
переносили в НП-культуры. После переноса из ВП-культур в НП-культуры во всех клетках
уровень АТФ снижался на 75–90% (табл. 2). Таким образом, и нормальные T-лимфоциты, и
клетки обеих T-клеточных линий отвечают на нехватку АФ одинаковым образом 
снижением уровня внутриклеточного АТФ.
Таблица 2. Уровень АТФ в нормальных и трансформированных T-клетках до и после их
переноса из ВП-культур в НП-культуры
Клетки
CTLL-2
Уровень АТФ, нмоль/106 клеток
до переноса
после переноса
4,22 ± 0,14
%*
после переноса
0,46 ± 0,03
10,9
EL-4
2,23 ± 0,18
0,57 ± 0,05
Нормальные активированные
1,30 ± 0,11
0,21 ± 0,02
T-лимфоциты
* Приведены % от исходных (до переноса) уровней АТФ в клетках.
25,6
18
16,2
В следующей серии экспериментов мы исследовали аутокринное действие факторов,
продуцируемых нормальными активированными T-лимфоцитами и клетками обеих Tклеточных линий, и сравнили его с паракринным действием этих факторов. Для этого мы к
клеткам каждого из трех типов после культивирования в ВП-культуре добавляли КС,
полученную от каждой из культур исследуемых клеток, а затем после короткой инкубации в
НП-культуре (1015 мин) определяли уровень внутриклеточного АТФ. Сравнение
аутокринного и паракринного действия факторов, продуцируемых исследуемыми клетками,
показало, что и аутокринные, и паракринные факторы обладают практически одинаковой
эффективностью в предотвращении падения уровня внутриклеточного АТФ после переноса
клеток из ВП-культур в НП-культуры для всех типов исследуемых клеток (рис. 7).
6
Уровень АТФ, нмоль/10 клеток
5
CTLL-2
4
EL-4
3
нормальные
Т-клетки
2
1
0
1 2 34 5
Рис. 7. Влияние добавления КС из различных
клеточных культур на уровень АТФ в клетках
CTLL-2, EL-4 и нормальных активированных Tлимфоцитах после их переноса из ВП-культур.
1  добавление свежей среды, 2  добавление КС
из культуры нормальных активированных Tлимфоцитов, 3  добавление КС из культуры
клеток CTLL-2, 4  добавление КС из культуры
клеток EL-4, 5  содержание АТФ в клетках до
переноса (контроль).
1 2345
1 2345
Полученные данные указывают на отсутствие какой-либо специфичности в действии
факторов, продуцируемых нормальными T-лимфоцитами и клетками линий CTLL-2 и EL-4.
Это позволяет сделать заключение о том, что АФ нормальных активированных Tлимфоцитов, ИЛ-2-зависимых (CTLL-2) и трансформированных злокачественных клеток Tряда (EL-4) не различаются по своим функциональным свойствам, как при аутокринном, так
и при паракринном действии.
6
Уровень АТФ, нмоль/10 клеток
5
4
Рис. 8. Зависимость уровня АТФ в различных
клетках от содержания АФ в НП-культурах (%КС)
после переноса клеток из ВП-культур.
1
3
2
2
1
1  клетки линии CTLL-2, 2  клетки линии EL-4,
3  нормальные активированные T-лимфоциты.
3
0
0
20
40
60
% КС
80
100
19
Внутриклеточное содержание АТФ в нормальных T-лимфоцитах и клетках обеих Tклеточных линий, полученных из ВП-культур, монотонно возрастает в зависимости от
концентрации КС в НП-культурах (рис. 8). Этот факт является дополнительным
свидетельством в пользу представления о существовании регуляторного действия АФ на
энергетический метаболизм клеток T-ряда. Таким образом, экзогенные АФ способны
восстанавливать энергетический метаболизм активированных Т-лимфоцитов в условиях
дефицита эндогенных АФ в культуре, осуществляя свое влияние через регуляцию
ферментов гликолиза. Факторы, секретируемые различными клетками Т-ряда не отличаются
по своим функциональным свойствам.
4. Роль АФ в поддержании выживания клеток CTLL-2 и в сохранении их
энергетического метаболизма в условиях клеточного стресса
Использование
кратковременной
холодовой
инкубации
для
предотвращения
изменений в метаболизме клеток CTLL-2 после их культивирования в ВП-культурах
выявило ее стрессирующее действие на клетки в том случае, если их затем культивировали в
НП-культурах в условиях дефицита АФ. Это действие проявилось в существенном
снижении уровня АТФ в клетках (рис. 4, Б). Тестирование жизнеспособности таких клеток
выявило значительное снижение их выживания со временем (рис. 9, А, кривая 2), которое не
наблюдалось при добавлении в свежую среду 1 мМ пирувата (рис. 9, А, кривая 3).
Выживание клеток, находившихся в условиях дефицита АФ, но не подвергнутых
гипотермии, также оставалось на высоком уровне (рис. 9, А, кривая 4).
А
Б
Жизнеспособность, %
1
100
3
80
4
60
2
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Время, ч
1
20
2
3
4
Рис. 9. А – Выживание клеток CTLL-2 после холодовой инкубации (0 °C, 10 мин) и
последующего культивирования в условиях дефицита АФ. 1 – контроль: клетки из НПкультур; 2 – клетки из ВП-культур в свежей среде; 3 – клетки из ВП-культур в свежей среде
с 1 мМ пирувата; 4 – клетки из ВП-культур в свежей среде (без холодовой инкубации).
Б – Электрофорез ДНК клеток CTLL-2, полученных после холодовой инкубации и
культивирования в условиях дефицита АФ. 1 – через 0 ч; 2 – через 2 ч; 3 – через 4 ч;
4 – позитивный контроль апоптоза: нормальные клетки CTLL-2, лишенные ИЛ-2 на 30 ч.
Для определения характера гибели клеток после гипотермии и последующего
культивирования в условиях дефицита АФ был использован метод электрофореза ДНК в
геле, который позволяет отличить некроз от апоптоза по регулярному характеру
фрагментации ДНК клеток в случае апоптоза. Полученная картина электрофореза ДНК, для
которой характерно равномерное свечение всей полосы геля, указывает на случайный
характер фрагментации ДНК, присущий клеточному некрозу (рис. 9, Б, полоса 3).
Таким образом, даже кратковременный гипотермический стресс клеток CTLL-2 на
фоне нарушения энергетического метаболизма, вызванного дефицитом АФ, способен
приводить к их массовой гибели по пути некроза. В то же время добавление пирувата в
культуральную среду предотвращает снижение уровня внутриклеточного АТФ в условиях
дефицита АФ и гибель клеток после гипотермического стресса.
Представляло интерес проверить и при других видах клеточного стресса, способен ли
дефицит АФ, вызывая снижение уровня АТФ в клетках, усугублять повреждающее действие
стресса на клетки и приводить к дополнительному снижению их выживания. Ввиду большой
значимости для физиологии клеток окислительного стресса в последующих экспериментах
мы проверили, как дефицит АФ в культурах сказывается на выживании клеток CTLL-2 при
этом виде стресса. Оказалось, что дефицит АФ приводит к значительному снижению
выживания клеток при окислительном стрессе. При культивировании в течение 3-х ч в
условиях дефицита АФ клетки оказывались более чувствительными к окислительному
стрессу, чем клетки, не испытывающие недостатка в АФ (контроль), и погибали при
меньших концентрациях пероксида водорода, чем последние (рис. 10, А).
А
Б
21
В
**
20
25
50
4
10
3
10
2
10
3
2
FL2-H -->
3
4
1
21,2%
10
4
4
10
1
10
2
10
3
FL1-H -->
FL1-H -->
Аннексин V-ФИТЦ
Аннексин V-ФИТЦ
100
Концентрация H2O2 , мкМ
2
R1
1
0,8%
10
12,5
43,5%
10
3
10
2
R1
3
0
1
10
**
40
2
10
60
FL2-H -->
*
2,1%
1
80
1
10
Выживание,%
100
Пропидия йодид
дефицит АФ
контроль
10
10
4
120
10
4
Рис. 10. А – Зависимость выживания клеток CTLL-2 от концентрации H2O2 при
окислительном стрессе в условиях дефицита АФ. P<0.01 (*), P<0.001 (**).
Б, В – Двухпараметрические цитограммы распределения клеток CTLL-2 после стресса (50
мкМ H2O2) в координатах «Аннексин V-ФИТЦ» и «Пропидия йодид» (приведены данные
одного из трех репрезентативных экспериментов). Б – контрольные клетки после
окислительного стресса; В – клетки после окислительного стресса в условиях дефицита АФ.
Далее с использованием проточной цитометрии мы провели оценку характера гибели
клеток CTLL-2 в условиях окислительного стресса и дефицита АФ. Для того чтобы отличить
апоптоз от некроза, было проведено двойное окрашивание клеток с использованием
аннексина V-ФИТЦ (для обнаружения фосфатидилсерина на внешней стороне клеточной
мембраны) и пропидия йодида (ПИ) (для регистрации целостности клеток). На
двухпараметрических цитограммах (рис. 10, Б и В) зона апоптоза соответствует
окрашиванию только аннексином V-ФИТЦ, без окрашивания ПИ (квадрант 4), а зона
некроза – двойному окрашиванию (квадрант 2). Полученные результаты показывают, что
при окислительном стрессе клеток CTLL-2 дефицит АФ приводит к значительному
отягощению клеточного стресса, что проявляется в массовой гибели клеток по пути
апоптоза (более 20%) или некроза (более 40%).
Еще одним видом стресса, с которым Т-лимфоциты постоянно сталкиваются в
процессе своей жизнедеятельности, является гипоксия. Для исследования роли АФ в
реакции Т-клеток на этот вид стресса мы использовали клетки CTLL-2, полученные из НПкультур, обладающие высокой чувствительностью к АФ. В состоянии «химической
гипоксии», вызванном внесением азида натрия в культуры, содержание АТФ в клетках
CTLL-2 снижалось до уровня 36–42% от исходного значения и сохранялось на этом уровне в
течение нескольких часов (рис. 11, кривая 1). Создание избытка АФ в НП-культурах путем
их внесения в составе КС к клеткам, обладающим высокой чувствительностью к АФ,
предотвращало снижение уровня АТФ и тем самым способствовало его сохранению в
интервале нормальных значений (рис. 11, кривая 2).
22
Рис. 11. Влияние АФ на уровень АТФ в клетках
CTLL-2 в условиях «химической гипоксии»,
создаваемой при внесении 10 мМ NaN3.
1 – контроль, NaN3 вносили со свежей средой;
2 – NaN3 вносили вместе с 50% КС.
6
Уровень АТФ, нмоль/10 клеток
4
2
3
2
1
1
Наиболее вероятным механизмом ответа
0
0
1
2
3
Время, ч
клеток
CTLL-2
на
гипоксию
в
присутствии
избыточного количества АФ, содержащихся в КС, является интенсификация анаэробного
гликолиза клеток, вызванная дополнительной активацией ферментов гликолиза.
5. Влияние дефицита АФ на протекание апоптоза в клетках CTLL-2
Ключевую роль в регуляции интенсивности и длительности иммунного ответа зрелых
Т-лимфоцитов играет апоптоз, который осуществляет его завершение посредством гибели
отработавших активированных Т-клеток. В связи с этим большой интерес представляло
изучение роли АФ в протекании апоптоза в активированных Т-лимфоцитах. Апоптоз в
клетках CTLL-2 вызывали с помощью актиномицина Д (АМД), ингибитора синтеза РНК,
который является известным индуктором апоптоза в клетках различных линий. В первой
серии экспериментов мы провели оценку влияния дефицита АФ на выживание и рост клеток
CTLL-2 в течение 20 ч при индукции апоптоза различными дозами АМД.
Внесение АМД в культуры приводило к снижению уровней восстановления MTT
опытными и контрольными клетками в зависимости от его дозы (рис. 12, А). Уровни
восстановления MTT опытными клетками, начиная с дозы 50 нг/мл АМД, были на 15–17%
ниже, чем в случае контрольных клеток. Далее мы провели оценку характера гибели клеток
CTLL-2 при индукции апоптоза (50 нг/мл АМД) в нормальных условиях и в условиях
дефицита АФ с помощью метода цитометрии путем окрашивания клеток Аннексин VФИТЦ и ПИ. Оказалось, что в нормальных условиях через 20 ч около 20% клеток
претерпевало апоптоз и менее 5% – некроз (рис. 12, Б). В условиях дефицита АФ большая
часть клеток (31%) была подвержена некрозу, а меньшая (8%) – апоптозу (рис.12, В). Таким
образом, дефицит АФ в культуре при индукции апоптоза в цитотоксических клетках CTLL-2
с помощью АМД приводит к дополнительному снижению выживания клеток и быстрому
переходу апоптоза во вторичный некроз.
А
Б
23
В
4
4
2
10
10
1
1
2
4,4%
20
*
**
**
3
19,6%
3
25
50
75
100
125
150
Концентрация АМД, нг/мл
10
1
10
2
10
75,1%
0
0
FL3-H -->
2
10
FL3-H -->
R1
R1
60,2%
1
2 **
10
**
1
40
10
1
60
10
3
80
Пропидия йодид
Восстановление МТТ, %
100
10
2
10
3
4
10
31,0%
7,9%
3
4
4
10
1
FL1-H -->
10
2
10
3
10
4
FL1-H -->
Аннексин V-ФИТЦ
Аннексин V-ФИТЦ
Рис. 12. А – Влияние дефицита АФ на выживание и рост клеток CTLL-2 при индукции
апоптоза. 1 – контроль, отсутствие дефицита АФ; 2 – дефицит АФ; P<0,05 (*) и P<0,01 (**).
Б, В – Двухпараметрические цитограммы распределения клеток CTLL-2 в координатах
«Аннексин V-ФИТЦ» и «Пропидия йодид» через 20 ч после индукции апоптоза (приведены
данные одного из трех репрезентативных экспериментов). Б – контроль, индукция апоптоза
в отсутствие дефицита АФ; В – индукция апоптоза в условиях дефицита АФ.
6. Разделение КС клеток CTLL-2 методом гель-фильтрации и определение
активности и физико-химических характеристик полученных фракций
Для проведения анализа молекул АФ, содержащихся в КС клеток CTLL-2,
приготовленной на безбелковой среде, была использована процедура гель-фильтрации на
колонке (0,8х75 см). С этой целью был выбран гель “Bio-Gel P-10”, для которого характерен
диапазон разделения глобулярных белков от 1,5 до 20 кДа. Для определения биологической
активности фракций мы использовали тест-систему, основанную на эффекте восстановления
уровня АТФ в клетках CTLL-2 в условиях «химической гипоксии» (10 мМ NaN3) при
внесении в культуру КС, содержащей АФ.
На хроматограмме, получаемой после гель-фильтрации КС можно выделить три
отдельных пика, соответствующих трем видам протеиновых молекул, которые были
собраны в объединенные фракции A, B и C (рис. 13, А). Фракция A выходила из колонки в
исключенном объеме, она содержала самые крупные молекулы.
Оказалось, что
способностью предотвращать снижение уровня АТФ в клетках CTLL-2 при «химической
гипоксии» обладают только фракции, соответствующие на хроматограмме пику В,
остальные фракции такой способностью не обладали (рис. 13, Б). Поскольку фракции пика B
оказывали свое протективное действие на энергетический метаболизм клеток CTLL-2 в
условиях ингибирования окислительного фосфорилирования, это указывает на то, что
молекулы, содержащиеся в этих фракциях, способны регулировать гликолиз.
А
Б
24
6
Уровень АТФ, нмоль/ 10 клеток
5
* *
*
4
*
3
2
К1
К2
К3
A
B1
Контроли
B2
B3 B4 C
Фракции
Рис. 13. А – Хроматограмма, полученная после гель-фильтрация КС. Б – Результаты
тестирования способности фракций КС предотвращать снижение уровня АТФ в клетках
CTLL-2 при «химической гипоксии» (10 мМ NaN3). К1 – исходное содержание АТФ в
клетках; К2 – клетки в свежей среде; К3 – клетки с добавлением 50% КС; A, B1, B2,…, C –
клетки в среде с добавлением 50% фракций, соответствующих пикам A, B и C (пик В разбит
на 4 фракции). Уровень значимости отличия опытных данных от контроля К2 – P<0,01 (*).
Для получения физико-химических характеристик АФ, содержащихся во фракциях
КС,
полученных
с
помощью
гель-фильтрации,
мы
провели
электрофорез
в
полиакриламидном геле в двух вариантах: в системе глицин-ДСН (для фракции A) и трицинДСН (для фракций B и C).
Глицин-ДСН-ПААГ
электрофорез
фракции
А
выявил
наличие
4-х
полос,
соответствующих протеинам, входящим в эту фракцию (рис. 14, А). Кроме 3-х протеинов с
молекулярными массами 43–67 кДа был обнаружен протеин с молекулярной массой около
19 кДа, присутствующий в КС в очень малых количествах. Трицин-ДСН-ПААГ
электрофорез в полиакриламидном геле показал, что фракции B и C, полученные гельфильтрацией КС, являются, по-видимому, гомогенными и содержат по одному виду
молекул. Масса молекул из фракции B находится в интервале 3,5–6,3 кДа (рис. 14, Б), а
масса молекул из фракции C оказалась близкой к 3,5 кДа (рис. 14, В).
А
Б
В
25
Г
110
94
67
100
43
30
кДа
20,1
B
кДа
6,3
3,5
2,5
6,3
3,5
2,5
14,4
C
Объем элюции, мл
кДа
1
2
90
80
70
3
60
50
C
B
40
4
30
1000
10000
Молекулярная масса, Да
Рис. 14. Результаты анализа физико-химических характеристик АФ, содержащихся во
фракциях КС, полученных с использованием гель-фильтрации.
А – результаты глицин-ДСН-ПААГ электрофореза фракции А; Б – результаты трицин-ДСНПААГ электрофореза фракции B; B – результаты трицин-ДСН-ПААГ электрофореза
фракции C.
Г – Определение молекулярных масс АФ, содержащихся во фракциях B и C, с
использованием хроматографического метода. Маркерные протеины: 1 – 712 Да, 2 – 984 Да,
3 – 3047 Да, 4 – инсулин (5,75 кДа).
Для получения более точных оценок молекулярных масс этих АФ был использован
хроматографический метод на матрице “Bio-Gel P-10” с использованием маркерных
протеинов для построения калибровочной прямой (рис. 14, Г). В качестве маркерных
протеинов были использованы инсулин (5,75 кДа) и синтетические пептиды, любезно
предоставленные И.А. Костанян (лаборатория белков гормональной регуляции ИБХ РАН), с
молекулярными массами: 712, 984 и 3047 Да. Определенные с использованием метода
линейной регрессии массы молекул, содержащихся во фракциях B и C, составили 4,9 и
3,8 кДа соответственно. Эти данные хорошо согласуются с оценками, полученными
методом трицин-ДСН-электрофореза.
ВЫВОДЫ
1.
Культивирование клеток CTLL-2 в высокой плотности само по себе не приводит к
снижению жизнеспособности клеток, однако перенос клеток из ВП-культур в НПкультуры и последующее культивирование в них приводят к значительному снижению
выживания клеток, если клетки перед переносом содержать на тающем льду для
предотвращения изменений в клеточном метаболизме.
26
2.
Разработана оригинальная экспериментальная модель для тестирования биологической
активности экзогенных АФ, в основе которой лежит создание дефицита эндогенных АФ
в культуре.
3.
Энергетический метаболизм играет ведущую роль в механизме аутокринного контроля
выживания клеток линии CTLL-2. Главный путь энергетического метаболизма в этих
клетках – гликолиз, регуляцию которого через ферменты гликолиза осуществляют АФ.
В условиях дефицита эндогенных АФ в культуре в клетках происходит временное
нарушение гликолиза, которое приводит к значительному снижению уровня
внутриклеточного АТФ. Внесение экзогенных АФ в такие культуры полностью
восстанавливает энергетический метаболизм клеток CTLL-2.
4.
Сравнительный анализ активности АФ, осуществляющих регуляцию энергетического
метаболизма нормальных активированных Т-лимфоцитов и клеток линий Т-ряда EL-4 и
CTLL-2, показал, что АФ этих клеток не различаются по своим функциональным
свойствам, как при аутокринном, так и при паракринном действии.
5.
Дефицит АФ в культуре в условиях окислительного стресса или гипотермии клеток
CTLL-2 приводит к значительному отягощению клеточного стресса, что проявляется в
массовой гибели клеток преимущественно по пути некроза. При индукции апоптоза в
клетках дефицит АФ в культуре вызывает дополнительное снижение выживания клеток
и быстрый переход от апоптоза к вторичному некрозу. В условиях гипоксии
избыточное количество АФ в культуре приводит к сохранению содержания АТФ в
клетках на нормальном уровне.
6.
В результате фракционирования АФ клеток CTLL-2 с помощью гель-фильтрации
получены три группы протеиновых молекул, различающихся по массе и способности
оказывать регулирующее влияние на гликолиз клеток CTLL-2. Эта способность связана
исключительно с молекулами, обладающими массой 4,9 кДа.
Практические рекомендации
1. При тестировании цитотоксической активности лекарственных препаратов и проведении
других экспериментов на клеточных линиях необходимо избегать формирования
дефицита АФ в культурах, для чего желательно не использовать клетки, полученные из
культур высокой плотности. Плотность культур, из которых получены клетки для
эксперимента, не должна превышать 0,5х10 6 клеток/мл.
27
2. Проведение экспериментов на клетках, полученных из культур высокой плотности,
возможно в том случае, когда в культуральной среде присутствует пируват (1 мМ).
Пируват позволяет обойти контроль гликолиза, нарушенный вследствие дефицита АФ, и
нормализует
продукцию
АТФ
за
счет
интенсификации
окислительного
фосфорилирования. В случае испытания препаратов, цитотоксическое действие которых
осуществляется через посредство перекисных форм кислорода, пируват использовать
нежелательно, поскольку он является сильным антиоксидантом.
3. При тестировании цитотоксических препаратов необходимо избегать внесения в
опытные культуры вместе с клетками кондиционированной среды из основной
культуры. Желательно перед внесением в опытные культуры отмывать клетки от
кондиционированной среды.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Луценко Г.В., Дьячкова Л.Г., Сапожников А.М. Анализ роли аутокринных и
сывороточных факторов в контроле выживания Т-лимфоцитов. Тезисы докладов IV
чтений, посвященных памяти акад. Ю.А. Овчинникова. Москва–Пущино, 1998, С.24.
2. Луценко Г.В., Дьячкова Л.Г., Сапожников А.М. Контроль выживания Т-лимфоцитов:
роль аутокринных факторов. Медицинская иммунология, 1999, Т. 1, № 3–4, С.18.
3. Дьячкова Л.Г., Шибанова В.А., Луценко Г.В. Роль аутокринных факторов в контроле
выживания Т-лимфоцитов. «Горизонты физ.-хим. биологии». Школа-конференция,
Пущино, 2000. Т.1. Тезисы стенд. сообщений, С.171.
4. Diachkova L.G., Shibanova V.A., Lutsenko G.V. A role of autocrine factors in the control of T
lymphocyte survival. Fith John Humphrey advanced summer programme and lecture series in
immunology. Abstracts. September 16-21, 2000, Pushchino, P.21.
5. Дьячкова Л.Г., Гапон М.В., Костанян И.А., Луценко Г.В. Об аутокринных факторах
выживания клеток цитотоксической линии CTLL-2. Медицинская иммунология, 2001, Т.
3, № 2, С.124.
6. Луценко Г.В., Дьячкова Л.Г., Сапожников А.М. Контроль выживания клеток
цитотоксической линии CTLL-2 аутокринными факторами. Роль плотности клеточных
культур. Биол. Мембраны, 2001, Т.18, №4, С. 312–319.
7. Луценко Г.В., Гапон М.В., Дьячкова Л.Г. Роль энергетического метаболизма в
поддержании выживания клеток линии CTLL-2 аутокринными факторами после
холодового стресса. Медицинская иммунология, 2002, Т. 4, № 2, С.127.
28
8. Луценко
Г.В.,
Дьячкова
Л.Г.
Роль
энергетического
метаболизма
клеток
цитотоксической линии CTLL-2 в механизме контроля их выживания аутокринными
факторами. Биол. Мембраны, 2003, Т.20, №5, С. 401–408.
9. Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г., Луценко Г.В. Роль аутокринных факторов в регуляции
уровня
АТФ
в
нормальных
и
трансформированных
Т-клетках.
Медицинская
иммунология, 2004, Т. 6, № 3–5, С.227–228.
10. Луценко Г.В., Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г. Влияние дефицита аутокринных
факторов на выживание Т-лимфоцитов в условиях стресса. Международная конференция
по физ.-хим. биологии, посвященная 70-летию со дня рождения акад. Ю.А.
Овчинникова. Москва, 2004. Тезисы докладов и стенд. сообщений, С.72–73.
11. Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г., Луценко Г.В. Регуляция уровня АТФ в нормальных и
трансформированных Т-клетках аутокринными факторами. XVII зимняя молодежная
научная школа «Перспективные направления физ.-хим. биологии и биотехнологии».
Москва, 2005. Тезисы докладов и стенд. сообщений, С.20.
12. Луценко Г.В., Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г. Регуляция уровня АТФ в нормальных и
трансформированных Т-клетках аутокринными факторами. Иммунология, 2005, Т.26,
№2, С.91–95.
13. Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г., Луценко Г.В. Об участии аутокринных факторов в
защите клеток линии CTLL-2 от окислительного стресса. Медицинская иммунология,
2007, Т. 96, № 2–3, С.131.
14. Луценко Г.В., Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г., Луцан Н.И. Влияние дефицита
аутокринных факторов в культуре на выживание и энергетический метаболизм клеток
линии CTLL-2 в условиях окислительного стресса. Цитология, 2007,Т.49, №4,С.284–291.
15. Grechikhina M.V., Diachkova L.G., Lutsenko G.V. Role of autocrine factors in the defence of
CTLL-2 cells from oxidative stress. 8th John Humphrey advanced summer programme in
immunology. Abstracts. September 10–14, 2007, Moscow, P.19.
16. Луценко Г.В., Гречихина М.В., Дьячкова Л.Г. О влиянии дефицита аутокринных
факторов
в
культуре
на
протекание
апоптоза
в
Иммунология, 2008, Иммунология, 2009, Т.30, №1, С.4-6.
29
цитотоксических Т-клетках.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
АТФ (ATP)
Аденозинтрифосфат
АМД
Актиномицин Д
АФ
Аутокринные факторы
ВП-культура
Культура высокой плотности
ДСН
Додецил сульфат натрия
ИЛ (IL)
Интерлейкин
ИА
Иодоацетат
КС
Кондиционированная среда
НП-культура
Культура низкой плотности
ПААГ
Полиакриламидный гель
ПИ
Пропидия йодид
ФИТЦ
Флуоресцеина изотиоцианат
ЭДТА
Этилендиамин тетраацетат
ClCCP
Карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон
MTT
3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилбромид тетразолия
30