РАЗРАБОТКА АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ФРАКЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ГОМОЦИСТЕИНА И ДРУГИХ
advertisement
1 на правах рукописи ИВАНОВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ РАЗРАБОТКА АНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ФРАКЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ГОМОЦИСТЕИНА И ДРУГИХ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИШЕМИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА 14.03.03 – Патологическая физиология 03.01.04 - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК Москва - 2015 г. 2 Работа выполнена в лаборатории функциональной ангиопротеомики и метаболомики Федерального государственного бюджетного научного учреждения “Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии” (ФГБНУ “НИИОПП”). Научные руководители: Кубатиев Аслан Амирханович - лауреат Государственной премии РФ, академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом молекулярной и клеточной патофизиологии ФГБНУ “НИИОПП” Лузянин Борис Петрович - доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией функциональной ангиопротеомики и метаболомики ФГБНУ “НИИОПП” Официальные оппоненты: Петр Францевич Литвицкий - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, проректор, заведующий кафедрой патофизиологии лечебного факультета Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Мирошниченко Игорь Иванович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией фармакокинетики Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Научный центр психического здоровья". Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов". Защита состоится «___» __________ 2015 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.003.01. при при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ “НИИОПП”. Диссертация размещена на сайте института ФГБНУ «НИИОПП» www.niiopp.ru. -адрес Ученого совета, для направления отзывов на автореферат; Автореферат разослан «___» ________ 2015 г. Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук Л.Н. Скуратовская 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Низкомолекулярные аминотиолы, такие как гомоцистеин (Гцис), глутатион (Глн), цистеин (Цис) и др., участвуют в разнообразных физиологических процессах (защита от активных форм кислорода и азота, ферментативное метилирование, внутриклеточная сигнализация, модуляция функций белков и проч.), которые активно вовлекаются в патогенез широкого спектра заболеваний (Newton L.A.A. et al. 2010, Santilli F. et al. 2015). Особое внимание уделяется Гцис, обладающему высокой реакционной способностью по отношению к различным биологическим структурам, прежде всего, сосудистому эндотелию, тромбоцитам и др. форменным элементам крови, а также ферментам, рецепторам, структурным белкам и др. Многочисленные исследования выявляют тесную связь гипергомоцистеинемии (ГГц) с проявлениями сосудистой дисфункции при инсультах, ИБС, инфаркте миокарда, тромбозах, что выводит Гцис в ранг независимого фактора риска развития сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний (Жлоба А.А. 2009, Кравцова О.Ю. и др. 2012, Шмелева В.М. и др. 2012, Подзолкова Н. М. и Скворцова М. Ю. 2014, Ansari R. et al. 2014, Han L. et al. 2015). У 20-30% пациентов с ранним развитием ССЗ, не имеющих отклонения по прочим факторам риска развития этих заболеваний, наблюдается ГГц (Львова О.А. и др. 2013, Акопян Г.Р. и др. 2014, Ganguly P. and Alam S.F. 2015). Было показано, что повышение Гцис на каждые 2,5 мкМ повышают риск развития инфаркта миокарда на 10% и инсульта на 20 %, а сосудистые стенки, пораженные атеросклерозом, содержат Гцис на порядок выше, чем не измененные (Sen U. 2010, Santilli F. et al. 2015, Дунаевская С. С. и др. 2015). Диагностика инсультов имеет важное медико-социальное значение, т.к. его ежегодно переносят около полумиллиона человек в России, а во всем мире – более 5 миллионов, из которых 70-80% становятся инвалидами (Гусев Е. И. и др. 2013). Смертность как первичных, так повторных инсультов составляет около 20%. Несмотря на достигнутый в последние годы прогресс, заключающийся в снижении смертности и летальности, средний возраст больных инсультом остается ещё ниже, чем в Западной Европе и США (Lenti L. et al. 2013; Скворцова В. И. и др. 2013, 2014). В структуре инсультов доминирующее положение занимает ишемический инсульт, на долю которого приходится около 80% случаев (Стаховская Л.В. и др. 2013). Как можно отметить, Гцис оказывает влияние и/или ассоциирован с патогенезом основных факторов риска инсультов - артериальной гипертонии, атеросклерозом и сахарным диабетом. Он, наряду с С-реактивным белком и P-селектином входит в тройку наиболее значимых маркеров инсульта (Hasan N. et al. 2012, Полушин А.Ю. и др. 2013, He Y. et al. 2014). Однако, как показали исследования, снижение уровня общего Гцис не приводит к снижению заболеваемости ишемическим инсультом (Jakubowski H. 2008, Ansari R. et al. 2014), что требует поиска других связанных с ним диагностических маркеров. Вместе с тем, на сегодняшний день ещё недостаточно изучены системные вазомоторные эффекты инсульта (JimenezAltayo F. et al. 2014), а данные о влиянии ишемии головного мозга как на метаболизм самого Гцис, так и на гомеостаз низкомолекулярных аминотиолов в целом отсутствуют. Изучение этого вопроса имеет значение для представлений 4 о факторах риска развития инсульта, гетерогенности ишемического инсульта, раскрытия молекулярно-биологических и патофизиологических основ ишемического инсульта, контроля над жизненно важными показателями гомеостаза в острейшем периоде инсультов. Нормальный уровень Гцис в плазме составляет 10-15 мкМ и находится под влиянием многочисленных физиологических и социальных факторов: возраст, пол, раса, качество питания, курение, употребление некоторых продуктов, состояние беременности и климакса и др. (Obersby D. et al. 2013). Особую роль среди них отводят недостаточности фолата (В9) и кобаламина (В12) как наиболее важным кофакторам, участвующим в превращениях Гцис. Ряд исследований показывают возможность использования гомоцистеина в качестве индикатора B9- и В12 – недостаточностей (Тапильская Н. И. и Гайдуков С. Н. 2013, Farrell Chr.-J. L. et al. 2013). Многочисленные комплексные эффекты Гцис, его вовлеченность в патогенез многих заболеваний является отражением, с одной стороны, сложной системы нормальных (физиологических) метаболических путей, в которых это соединение занимает одну из центральных ролей и, с другой стороны, возникновением или резким возрастанием концентрации нехарактерных для нормального метаболизма продуктов окисления Гцис в условиях протекания патологических состояний. В связи с этим диагностическая значимость Гцис как маркера заболеваний остается предметом дискуссий. Это во многом обусловлено тем, что, как и другие аминотиолы, Гцис присутствует во многих формах (или фракциях). В плазме крови только небольшая часть Гцис присутствует в восстановленной форме, большая его количество окисляется и образует дисульфидные связи с белками (связанная фракция), цистеином и др. тиолами (растворимая или свободная фракция). Некоторое количество Гцис через образование тиолактона способно присоединяться к аминогруппам белков. Все эти формы имеют различную реакционную способность и кинетику обменных процессов, что обуславливает интерес к определению именно фракционного состава, т.к. оно позволяет получить более подробную информацию, открывая абсолютные или относительные изменения редоксстатуса Гцис и др. аминотиолов или их долю, связанную с определенным белком. Существует много методов определения Гцис в биологических жидкостях. Наиболее активно используются такие методы как ВЭЖХ-УФ или ВЭЖХ-Фл. Большинство из них позволяет определять только общее содержание Гцис (и ещё нескольких тиолов – Цис, Глн, ЦисГли и др.) и только небольшая их часть дает возможность количественного анализа восстановленных форм. Многие методы ограничены по чувствительности и технологическим процессам (методика дериватизации, время реакции или пробоподготовки и пр.), затрудняющим определение восстановленной формы аминотиолов. Сравнительно недавно появились такие высокочувствительные и специфические методы как КЭ-ЛИФ и ВЭЖХ-МС, позволившие поднять чувствительность и системность анализа на новый уровень, однако стоимость оборудования ограничивает широту их применения. Таким образом, разработка новых и оптимизация существующих методов определения общего содержания и фракционного состава гомоцистеина (а также других аминотиолов) представляет собой актуальную 5 задачу как для фундаментальных, так и для клинических исследований, и требует привлечения современных и доступных платформ разделения и детектирования аналитов. Используя их преимущества, можно охватить широкий круг задач – от рутинных скрининговых до высокочувствительных целевых исследований. Цель работы - разработка аналитических методик исследования содержания гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови для ранней диагностики, мониторинга и прогноза течения ишемического повреждения головного мозга. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Определение возможностей и преимуществ подходов высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза в сочетании с абсорбционными и масс-спектрометрическими детекторами для анализа аминотиолов. 2. Разработка методик анализа аминотиолов в плазме крови (выбор реагентов для дериватизации, оптимизация пробоподготовки и анализа, определение чувствительности и сопоставление с существующими методами) на основе вышеперечисленных подходов. 3. Апробация методик на биологических образцах (плазмы крови человека и лабораторных животных). Валидация на моделях экспериментальной гипергомоцистеинемии и ишемии головного мозга. 4. Выявление диагностической роли восстановленных форм гомоцистеина и других аминотиолов при ишемии головного мозга. Научная новизна результатов 1. В работе был впервые предложен метод прямого определения общего Гцис с помощью КЭ-МС, а также его фракций с использованием ВЭЖХ-МС и дериватизацией N-этилмалеимидом (что является одной из самых чувствительных методик с использованием ВЭЖХ-МС). 2. Разработан новый подход фракционного определения тионитробензойных производных аминотиолов с использованием ВЭЖХ-УФ, увеличивающий стабильность результатов анализа восстановленной фракции. 3. Впервые применен методический прием определения белок-связанных аминотиолов по их циклическим тиокарбонильным производным посредством КЭ-УФ с обращенным полем и электрокинетическим концентрированием. 4. Впервые установлены дифференциальные отличия системы аминотиолов плазмы крови в реакции на глобальную и локальную ишемию головного мозга. 5. Впервые показано, что редокс-статус аминоитиолов плазмы крови, в отличие от их общего содержания, претерпевает значительное снижение системного характера при острой ишемии головного мозга. 6. Впервые доказано, что метиониновая нагрузка способна вызывать не только состояние гипергомоцстеинемии, но и значительно повышать редоксстатус аминотиолов плазмы крови. Научно-практическая ценность Результатами работы является разработка аналитических методов, позволяющих определять как общий гомоцистеин плазмы крови, так и фракции гомоцистеина, цистеина, глутатиона и цистеинилглицина, максимально 6 приближенные к условиям лабораторной диагностики, для мониторинга и прогноза течения инсульта, а также исследования эндотелиальной дисфункции. Положения, выносимые на защиту: 1. Применение N-этилмалеимида в качестве дериватизирующего агента для масс-спектрометрического определения фракций гомоцистеина в плазме крови повышает чувствительность метода и стабильность аналитов. 2. Метод определения связанных форм Гцис, Цис и Цис-Гли по их циклическим S,N-тиокарбонильным производным с использованием капиллярного электрофореза упрощает процесс пробоподготовки и не уступает в чувствительности аналогичному подходу ВЭЖХ-УФ. 3. Применение N-этилмалеимида в качестве блокатора побочных реакций дисульфидного обмена при определении восстановленных аминотиолов плазмы крови с дериватизацией дитиобиснитробензойной кислотой позволяет повысить стабильность результатов анализа. 4. Экспериментальная гипергомоцистеинемия сопровождается повышением уровня восстановленных аминотиолов в плазме крови. 5. Фокальная ишемия головного мозга вызывает значительное снижение редокс-статуса аминотиолов в плазме крови, тогда как глобальная ишемия индуцирует этот эффект лишь в сочетании с декомпенсированной кровопотерей. Апробация работы Материалы диссертации отражены в 7 статьях, опубликованных в ведущих отечественных журналах, 5 из которых входит в Перечень российских рецензируемых научных журналов ВАК. Результаты работы представлены на двух всероссийских конференциях (VIII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием “Молекулярная диагностика-2014”, Москва и XVII Всероссийская конференция “Человек и его здоровье”, Санкт-Петербург, 2014). Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, их результатов и обсуждения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы из 322 наименований. Работа изложена на 127 страницах, содержит 30 рисунков и 7 таблиц. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы. Систематизированы сведения о метаболизме гомоцистеина, а также о системе низкомолекулярных плазменных аминотиолов, их фракционном составе. Рассмотрены основные методы определения их в биологических жидкостях с преимуществами и недостатками. Описаны современные представления о молекулярных мишенях патологического действия гомоцистеина, механизмах его нейротоксичности и нейропротективной роли глутатионилирования белков. 7 Материалы и методы исследования. 1. Общая характеристика материала. Работа проводилась в два этапа. На первом шла разработка методических подходов и апробацией на биологическом материале. На втором этапе был выбран наиболее оптимальный подход для изучения гомеостаза плазменных аминотиолов, который был использован в исследовании экспериментальных моделей патологии (ГГц и ишемии головного мозга). 2. Оборудование 2.1 ВЭЖХ: а) Модульная система Perkin Elmer 200 Series c бинарным градиентным насосом, ручным петлевым инжектором (20, 100 и 500 мкл), УФ-детектором и ПО TotalCrom v. 6.2. Колонки Dr. Maisch C18 ReproSil-Pur AQ 3 мкм, 150х2 мм, Agilent Eclipse ODS C18 5 мкм, 150х4,6 мм, Agilent Zorbax XDS C18 5 мкм, 150х4,6 мм б) Модульная система Waters UPLC Acquity с 4-хканальным градиентным насосом, УФ-детектором PDA , флуоресцентным детектором FLR и ПО MassLynx v4.2. Колонки Agilent Poroshell-120 SB-C18 150x2,1 мм х 2,7 мкм и Phenomenex Luna C18 150x2 мм 5 мкм зернение. 2.2 Капиллярный электрофорез: Система Agilent CE 3D c изократическим насосом 1100 Series и электроспрейным источником ионизации. ПО ChemStation Rev. B 01.03 2.3 Масс-спектрометрия: Ионная ловушка Agilent MSD Trap VL c электрораспылительным источником ионизации и ПО Trap Control v. 5.3. 3. Собственные аналитические методики 3.1 Прямое определение гомоцистеина методом КЭ-МС. 3.2 Анализ связанных аминотиолов методом КЭ-УФ с дериватизацией ТКДИ. 3.3 Определение фракций Гцис в плазме крови методом хроматомассспектрометрии с дериватизацией ЭМ.. 3.4 Метод ВЭЖХ-УФ для определения общих и восстановленных аминотиолов с дериватизацией ДТНБ. 4. Методика сравнения Метод ВЭЖХ-Фл с дериватизацией монобромобиманом (Ivanov A.R. et al. 2000 с изменениями). 5. Экспериментальные модели 5.1 Моделирование фокальной ишемии головного мозга Использовали 50 белых половозрелых беспородных крыс – самцов (260-300 г) возрастом 2-3 мес, содержавшихся в условиях вивария (влажность 55-60% и 20oC). Животные имели свободный доступ к воде и содержались на рационе ПК-120, соответствующем ГОСТ Р 50258-92. Состав ПК-120: пшеница, ячмень, отруби пшеничные, мясо, мука мясокостная, шрот подсолнечный, витамины (А, D3, E, B1, B2, B5, B6, B9, B12, C, K3 и др.), микроэлементы (Fe, Mn, Zn, Cu, J,Se, K). Питательный состав (в %): белок >19, жиры <5, клетчатка <4, зола <7, кальций 0,9-1,2, фосфор 0,6-0,9, NaCl <0,2. Операции проводили под наркозом (хлоралгидрат внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг). Для измерения системного АД, кровопотери и забора крови выделяли и 8 катетеризировали бедренные артерии и вводили гепарин внутриартериально в дозе 500 Ед/кг. Фокальная ишемия ГМ воспроизводилась с помощью модели окклюзии средней мозговой артерии по методике (Koizumi J. et al. 1986) в модификации (Дайнеко А.С. и др. 2012). Голову крысы жестко фиксировали в стереотаксическом станке. Полипропиленовая нить (4-00, Ethicon) длиной 22 мм, обработанная силиконом и поли-L-лизином, вводилась ретроградно в левую наружную сонную артерию, после чего проводилась через бифуркацию общей сонной артерии и внутреннюю сонную артерию к устью среднемозговой артерии, перекрывая его. В группе контроля проводили операцию без окклюзии. 5.2 Моделирование глобальной ишемии головного мозга Эксперимент проводился на 30 белых половозрелых беспородных крыс – самцах (260-300 г) возрастом 3-4 мес, содержавшихся в условиях вивария. Операции проводили под наркозом (хлоралгидрат внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг). Глобальная ишемия головного мозга у крыс воспроизводилась как описано в (Grogaard B. et al. 1989) с изменениями. Уровень системного артериального давления снижали посредством кровопотери до 40-45 мм рт.ст. (~30% объема циркулирующей крови или 2,5±0,2 мл / 100 г веса) с последующей двусторонней окклюзией общих сонных артерий сроком на 10 минут с последующей реинфузией крови и снятием зажимов с сонных артерий. Кровопотерю и реинфузию осуществляли через бедренную артерию. Для контроля использовали две группы животных. У первой группы воспроизводилась двусторонняя окклюзия общих сонных артерий сроком на 10 минут с последующим снятием зажимов с сонных артерий. Кровь брали перед ишемией и на 40 минуте реинфузии. У второй группы воспроизводилась кровопотеря (до 30% объема циркулирующей крови или 2.5 ±0.2 мл/100 г веса), снижающая уровень системного АД до 40-45 мм рт.ст. сроком на 10 минут с последующей реинфузией крови. Кровь в пробирку с гепарином брали перед ишемией и на 40 минуте реинфузии. Во всех случаях объем забора венозной крови для анализа содержания тиолов составлял 0,7-1,3 мл. 5.3 Моделирование гипергомоцистеинемии у крыс ГГц была воспроизведена на 10 белых половозрелых беспородных крыс – самцах (260-300 г), которым в воду добавляли L-метионин в концентрации 10 г/л (Ungvari Z. et al. 1999). Метиониновую нагрузку проводили в течение двух недель. Рацион животных состоял из ПК-120 с добавлением моркови, яблок и картофельного крахмала. Забор крови осуществляли перед её началом, через 7 и 14 дней. 6. Клинико-лабораторный материал В работе было использовано 30 образцов плазмы крови доноров (предоставлены ФГБУ Гематологический Научный Центр Минздрава РФ), 10 образцов плазмы крови самцов кролика-шиншиллы, 90 образцов плазмы беспородных крыс. Общее количество произведенных анализов составляло более 2000. 7. Статистическая обработка Первичная обработка сигналов осуществлялась с использованием инструментального ПО (Agilent Data Analysis, QuantAnalysis; TotaChrom; Masslynx). Построение калибровочных зависимостей, вычисление статистических характеристик методик – Microsoft Excel’97. Во всех случаях были использованы внутренние стандарты. Сравнение методик проводили по 9 методу Бланда-Альтмана (Hanneman S.K. 2008). Экспериментальная часть. Результаты исследований и их обсуждение. 1. Прямое определение общего гомоцистеина плазмы крови с помощью капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии Сопряжение капиллярного электрофореза (КЭ) с масс-спектрометром открыло новые подходы к анализу метаболитов, в частности, определению аминокислокислот в биологических матрицах. Т.к. принцип разделения веществ в КЭ принципиально отличается от ВЭЖХ, то его применение позволяет обойти проблемы, характерные для обращено-фазовой хроматографии, в частности недостаточное удерживание полярных аминокислот и связанную с этим ионную супрессию. В качестве осаждающих белки реагентов были изучены метанол, этанол (~80об.%), трихлоруксусная кислота (0,6 М) и 5-сульфосалициловая кислота (0,3М). При использовании кислот целевые пики были расширены и слабо выражены. Осаждение белков метанолом или этанолом приводит к хорошо выраженным и разделенным пикам Гцис и внутренних стандартов. Для перевода аминотиолов в восстановленную форму использовали меркаптоэтанол, дитиотреитол и трис-(2-карбоксиэтил)фосфин. Только первые два агента оказались совместимы с методом КЭ-МС. При использовании фосфина наблюдалось сильное подавление пика Гцис и делало его определение невозможным. В качестве основного электролита для КЭ использовали муравьиную кислоту (Рис. 1). Оптимальная концентрация составила 0,2 М. В качестве внутреннего стандарта был выбран глицициласпарагин. Благодаря характерной для КЭ высокой разделяющей способности и предварительному концентрированию достигнут предел обнаружения ~ 0,5-1 мкМ. Разработанный подход по точности не уступает большинству методик с использованием метода КЭ-МС и внутренним стандартом без изотопной метки. Таким образом, применение КЭ-МС позволяет определять без дериватизации общий Гцис в плазме крови, однако его чувствительность недостаточна для фракционного анализа. Основными путями повышения чувствительности КЭ-МС являются концентрирование аналитов, увеличение ионизационной способности и техническое совершенствование как собственно масс-спектрометров, так и физических схем КЭ. Существуют много подходов, позволяющих концентрировать образцы непосредственно в капилляре, однако, они, как правило, не совместимы с МС или ухудшают электрораспылительную ионизацию аналитов, т.е. данный метод практически не имеет путей увеличения чувствительности за счет оптимизации капиллярного электрофореза. 10 Рис. 1 Типичные электрофореграммы образцов плазмы крови для определения Гцис (а) и внутреннего стандарта Гли-Асп (б). Условия КЭ: напряжение 30 кв, давление 25 мбар (после 10 мин), 0,2М муравьиной кислоты, капилляр 75 мкм * 97см, m/z 136 (a), m/z 191(б). Увеличение ионизационной способности является востребованной задачей для короткоцепочечных аминокислот, таким как Гцис. Её можно добиться за счет дериватизации пробы или изменения самого механизма ионизации, например заменив электрораспылительный источник на источник химической ионизации. Другой путь – совершенствование узла сопряжения (интерфейса) КЭ с МС представляет большой потенциал. Так, обычная схема КЭ-МС содержит источник омывающей жидкости, которая выполняет следующие функции а) создание основного потока жидкости, необходимого для электрораспыления и б) жидкостного заземления выходного конца капилляра. Благодаря такому простому решению КЭ может быть легко соединен со стандартными источниками, адаптированными к потокам от 1 мкл/мин. Однако за счет многократного разбавления аналитов омывающей жидкостью, невысокая чувствительность КЭ также многократно уменьшается. Решением этой проблемы могли бы стать нанопотоковые источники с заземлением капилляра. Одним из таких решений является недавняя разработка Beckman Coulter CESI 8000. 2. Определение связанных аминотиолов плазмы с помощью капиллярного электрофореза по их циклическим S,Nтиокарбонильным производным Тиокарбонилдиимидазол (ТКДИ) является быстодействующим и специфичным реагентом, переводящий большинство аминотиолов в циклические S,N-тиокарбонильные формы. Его ранее применили для анализа общих аминотиолов плазмы крови посредством ВЭЖХ-УФ. В данной работе был применен метод капиллярного электрофореза для разделения соответствующих производных с их детекцией при 254 нм. Существенного повышения чувствительности нам удалось достичь, применяя 11 электрокинетический ввод образца и щелочи в обращенном поле. Методика применена для определения белок-связанных форм Цис, Гцис и Цисгли. На Рис.2 показаны электрофореграммы плазмы крови с использованием электрокинетического и гидродинамического ввода. Как видно, при одном времени инжекций ЭИ обеспечивает более чем 10-ти кратный рост интенсивности сигналов. Цис Гцис ЦисГли Рис.2 Сравнение гидродинамического и электрокинетического ввода образца фильтрата плазмы крови, обработанной ТКДИ. Постинжекция 0,15 М NaOH -10кВ 60 сек во втором случае). Электролит – 0,2 М ацетат аммония с 25 мкМ гексадецилтриметилбромид аммония. Капилляр 48,5 см (40 см. эфф.), 50 мкм внутр. диам. В процессе пробоподготовки были использованы два шага ультрафильтрации: 1) для очистки белков от низкомолекулярных компонентов и 2) для очистки ТКДИ-производных аминотиолов от белков. Обычно применяемые для ВЭЖХ-анализа методы осаждения белков кислотами, спиртами, а также ионообменная экстракция мало совместимы с КЭ ввиду требования минимализировать содержание солей в пробе. Чувствительность методики по Гцис составила ~ 1 мкм в плазме, что вполне достаточно для его количественного определения. Основным фактором, ограничивающим чувствительность является содержание солей в пробе. Линейность анализа исследована в диапазоне от 0-100 мкМ для гомоцистеина до 0-500 мкМ для цистеина путем добавления к обработанной плазме крови известных количеств аналитов. В качестве внутреннего стандарта был использован пеницилламин (ПА). Коэффициент корреляции во всех случаях превышал 0,99, а разница коэффициентов наклона между калибровкой на плазме и воде не превышала 5%. Относительное стандартное отклонение, исследованное на серии (n=6) последовательных инжекций, Цис/ПА и Гцис/ПА не превышало 5 % (Цисгли/ПА - до 11%), в то время как по абсолютным интенсивностям сигналов оно варьировались более существенно (8-12%). Это подчеркивает необходимость применения внутреннего стандарта. 12 Было проанализировано 8 образцов плазмы крови от здоровых доноров. Содержание связанного Цис, Гцис, Цисгли составило 110±20; 5,5±1,25; 11,3±2,5 мкМ соответственно во всей выборке, у мужчин — 106±17; 5,7±1,55; 10±2 мкМ, у женщин — 108±20; 5,2±1; 12,6±2,6 мкМ соответственно. Значения Гцис и Цисгли близки к ранее полученным (Williams R.H. et. al. 2001), однако содержание Цис повышен в 1,8 раз, что, по-видимому, можно объяснить особенностями процедуры восстановления и дериватизации. Таким образом, представленная методика демонстрирует возможность применения КЭ-УФ для определения связанных аминотиолов плазмы крови с достаточной чувствительностью (порядка 1 мкМ по Гцис) и воспроизводимостью. Основным преимуществом такого подхода перед методиками ВЭЖХ является существенно меньший расход растворов и пробы на анализ и регенерацию, а также не требуется использовать неподвижные фазы. Доступность оборудования тоже является важным фактором для использования подобных подходов. Т.к. достижение требуемой чувствительности возможно только при условии обессоливания образцов, то применяемая ультрафильтрация (или её аналог – диализ) ограничивает анализ только связанной фракцией аминотиолов. Для анализа других фракций необходимо использование других методов пробоподготовки, например, селективного ионного обмена с помощью специальных мембран - ионных подавителей или же ионообменной ТФЭ. Несмотря на то, что усложнение пробоподготовки является нежелательным для лабораторного анализа, современные установки обладают высокой производительностью и степенью автоматизации, что также позволит снизить время обессоливания, автоматизировать и упростить саму процедуру. 3. Анализ плазменных фракций гомоцистеина по его Nэтилсукцинимидному производному с помощью ВЭЖХ-МС В последние годы для определения общего гомоцистеина все чаще используется хромато-масс-спектрометрия (Li S. et al. 2008, Мирошниченко И.И. и др. 2014). Однако определение фракционного состава аминотиолов плазмы этим методом крови находит ограниченное применение, в первую очередь, в виду методологических трудностей стабилизации восстановленных аминотиолов и его ограниченной чувствительностью. Одним из агентов, сочетающий в себе доступность, специфичность, быстроту реагирования и повышение ионизационной способности аналитов, является N-этилмалеимид (ЭМ). Плюсом его использования также является возможность проводить дериватизацию непосредственно в крови. Для определения общего и свободного гомоцистеина получают плазму, которую депротеинизируют, восстанавливают и обрабатывают ЭМ. В случае определения общего содержания Гцис депротеинизация проводится на последнем этапе. На Рис.4 приведена хроматограмма ЭМ-производных гомоцистеина и цистеамина (внутренний стандарт). Определение проводили по протонированным однозарядным ионам ([M+H]+) в MS-режиме, т.к. использование режима выбранных реакций (MRM) не продемонстрировало в данном случае преимуществ. 13 СА-ЭМ 5 мкМ 10 нМ Гцис-ЭМ 0,64 мкМ Рис.4. Хроматограмма образца плазмы крови с добавленным внутренним стандартом (5 мкМ СA-ЭМ). Bставкa – хроматограмма модельного раствора 10 нМ Гцис. В водном растворе сигнал аналита демонстрировал линейную зависимость (R2>0,999) от концентрации Гцис в диапазоне 0,01-10мкМ при пределе детекции (s/n~3) 5 нМ. В плазме за счет повышения химического шума линейный диапазон и предел детекции составляли 0,025-10 мкМ и 10нМ Hcy соответственно. Правильность методики составляла в плазме 101,3±3,8% восстановленного Гцис. Воспроизводимость была исследована на образцах плазмы крови для всех трех фракций и результаты приведены в Табл. 1. Табл.1 Воспроизводимость результатов анализа фракций Hcy в плазме крови кролика. Фракция Гцис восст Гциссвоб Гцисобщий Hcy, мкМ 0.64 3.9 9.1 ±межгрупповое станд. ±внутригр. станд. откл.(%) откл. (%) 0.024 (3.8) 0.027 (4,2) 0,30 (7,9) 0,2 (5,2) 1,1 (12,1) 0,6 (6,6) Как видно из таблицы, в ряду восстановленный>свободный>общий происходит последовательное увеличение межгрупповой (т.е. между днями) ошибки анализа от ~4 до 12%, в то время, как внутригрупповая ошибка колеблется значительно меньше, несмотря на то, что в случае анализа свободного и общего Гцис используются разбавленные растворы плазмы, т.е. со сниженным содержанием загрязняющих веществ. Это может свидетельствовать о том, что усложнение процедуры пробоподготовки приводит к существенному снижению воспроизводимости результатов анализа, так как подготовка 14 образцов для анализа общего Гцис сопряжена с восстановлением и последующей модификацией большего числа соединений, чем при подготовке проб для определения свободного и восстановленного. Применение ЭМ позволило поднять чувствительность МС-анализа до уровня достаточного для анализа его восстановленной фракции. Это открывает возможности и для ВЭЖХ-МС анализа других аминотиолов (Цис, Цисгли, Глн). Однако особенностью дериватизации ЭМ является появление хирального атома углерода при связывании с тиолом. Сам пятичленный цикл ЭМ не является плоским и из-за этого образуются пространственные изомеры ЭМ-производных двух типов, которые имеют различные хроматографические свойства и выходят в виде пиков различной площади. Наиболее это выражено для Цис, Цисгли и Глн т.к. их боковая цепь имеет меньшую подвижность по сравнению с Гцис или ПА (Рис. 5). Рис.5 Хроматограмма модельного раствора ЭМ-производных аминотиолов. 1 – Цис 2 – ЦисГли 3 – Гцис 4 – Глн 5 – ПА. Колонка ReproSil-Pur C18 AQ 3 мкм, 150х2 мм, элюент 1,75% ацетонитрил с 0,1% HCOOH, 0,3мл/мин. Таким образом, несмотря на то, что масс-спектрометрия с электрораспылительным источником ионизации позволяет производить прямой анализ низкомолекулярных аминотиолов, для определения их восстановленных форм требуется химическая дериватизация по трем причинам. Во-первых, ввиду низкого содержания аналитов для увеличения ионизационной способности. Вовторых, для увеличения времени удерживания аналитов и отделения их от соединений, проявляющих подавление ионизации ионов. И, в-третьих, для собственно стабилизации восстановленных форм (предотвращения их окисления). Последние две проблемы можно решить альтернативными путями за счет выбора неподвижных фаз/введения ТФЭ/ и кислотной преципитации образцов, но первая остается основной проблемой МС. Имеющиеся публикации, как было показано выше, продемонстрировали, что чувствительность даже современных приборов недостаточна для определения концентрации Гцис на уровне 100 нМ и ниже. Поэтому применение модификатора являлось необходимым шагом на пути решения этой задачи. Оно позволило поднять чувствительность ВЭЖХ-МС на уровень методик ВЭЖХФл, но, в отличии от последних, не требует применения дорогостоящих модификаторов, многие из которых дают нестабильные и интерферирующие аддукты. Кроме того, объем данных, который может быть получен с помощью 15 МС, позволяет проводить исследования метаболомного характера. При этом также сохраняется возможность использования ЭМ ввиду специфического характера проводимой им модификации. 3. Оптимизация условий пробоподготовки для определения восстановленной фракции аминотиолов плазмы с использованием дитиобиснитробензойной кислоты Основной сложностью при подготовке проб для определения восстановленных форм аминотиолов с использованием ДТНБ являются побочные реакции дисульфидного обмена между тиолат-анионом (ТНБ) и окисленными формами тиолов, что приводит к завышенным результатам. При определении восстановленных тиолов в плазме крови образуется небольшое количество тиолат-аниона, который может восстанавливать окисленые дисульфиды плазмы, и так как концентрации дисульфидов в плазме заметно выше их восстановленных форм, то даже небольшой процент их перехода в ТНБ-связанные формы существенно искажает результаты анализа. Поэтому необходима быстрая остановка реакций дисульфидного обмена после дериватизации. В работе было показано, что использование ацидификации проб сульфосалициловой кислотой (до 136 мМ) недостаточно и ведет к росту продуктов до 150% за 48 часов хранения образцов при 24оС. Дальнейшее же снижение рН может приводить к выпадению осадка вследствие малой растворимости ДТНБ в кислых условиях. Тогда для остановки реакций был применен ЭМ. Показано, что при этом рост продуктов заметно снизился до уровня статистической погрешности. Интересно также отметить, что добавление ЭМ происходило уже после ацидификации проб, в условиях, когда его реакция с аминотиолами практически полностью ингибируется, но, по всей видимости, он сохраняет возможность блокировать ТНБ. Добавление же ЭМ без ацидификации приводила к быстрому исчезновению пиков ТНБ-производных, что может быть обусловлено повышенной реакционной способностью их аминогрупп к ЭМ в нейтральных или слабощелочных условиях. Таким образом, использование ацидификации и ЭМ необходимо для стабилизации уровня ТНБпроизводных. 4. Сравнение ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-Фл методик определения гомоцистеина, цистеина и глутатиона. Т.к. применение ДТНБ позволяет определять восстановленные формы аминотиолов с достаточной чувствительностью (менее 100 нМ для плазмы крови), то данный подход может быть сравним с давно применяющимися методами ВЭЖХ, использующими флуоресцентные модификаторы, например, монобромбиман. Сравнительный анализ содержания Цис, Гцис и Глн в 23 образцах (плазма крови крыс) показал, что для всех аналитов характерна высокая степень линейной корреляции (R2>0,96) и коэффициенты наклона для всех аналитов (кроме Глн) близки к единице. Исключение составляет глутатион, дающий в среднем заниженные значения с использованием ДТНБ (наклон 0,88), и также показывающий более высокую дисперсию данных. Сравнительный анализ двух методов также показал, что данные измерений методами ВЭЖХ- 16 УФ и ВЭЖХ-Фл отличаются статистически незначимо (р<0,001). Однако, анализ относительной разницы измерений показывает, что это обусловлено скорее дисперсией данных, чем высокой точностью методов. Так на уровне низких концентраций (<0,1 мкМ) относительная разница может достигать 200%, но в области более высоких, физиологически значимых, концентраций относительная разница находилась в пределах 40%. При том, что усредненные по выборке относительные разницы измерений составляют всего -0,2-7 %, но их стандартное отклонение находится на уровне 20%, что превышает относительную ошибку измерения каждого из методов (10-12%). Таким образом, сравнение методов определения аминотиолов ВЭЖХ-УФ (с ДТНБ) и ВЭЖХ-Фл (с монобромбиманом) демонстрирует, что полученные результаты статистически эквиваленты на сериях образцов, но могут значимо отличаться при сравнении результатов индивидуальных проб. 5. Апробация метода ВЭЖХ-УФ для определения аминотиолов по их тионитробензойным производным на экспериментальной модели гипергомоцистеинемии На примере ГГц, обусловленной двухнедельной метиониновой диетой, была исследована динамика изменений общего содержания и восстановленных фракций аминотиолов плазмы с использованием ДТНБ в качестве модификатора. На первой неделе такой диеты у крыс развивается выраженная ГГц. Общий Гцис возрастает в среднем в ~13 раз (Табл. 3), а восстановленный в 33 раза (с 15 до 30% от общего содержания). Также наблюдался подъем общего и восстановленного Цис в 3,5 и 7,7 раз соответственно. Возрастание Глн было менее выражено (~1,5-2 раза). Исходно наблюдалась корреляция между уровнями общего (R2=0,7) и восстановленного (R2=0,92) Гцис и Цис, но с началом диеты она исчезла. Эти данные указывают на изменение не только общего содержания аминотиолов, но также на изменение окислительновосстановительного состояния всей системы тиолов плазмы крови. На второй неделе метиониновой диеты происходит падение уровня общего Цис и Гцис, а также, в меньшей степени, их восстановленных форм. Эти изменения, по-видимому, отражают процесс адаптации организма к метиониновой нагрузке, что проявляется в активации путей деметилирования Гцис и окисления цистеина. Исходный уровень Гцис составлял 3 мкМ, что в 2,3 раза меньше, чем базальный уровень в работе (Ungvari Z. et al. 1999), однако близко к ранее опубликованным значениям (Woo C.W.H. et al. 2005). Рост общего Гцис в ходе эксперимента на первой неделе был несколько выше, чем показано в этих работах (41 против 23 мкМ). Однако к концу второй неделе эксперимента уровень Гцис понижался до того же уровня. Табл.3 Общие и восстановленные аминотиолы плазмы крови крысы на метиониновой диете (в мкМ). Исходный уровень 7 дней 15 дней Тиол Общий Восст. % восст. Общий Восст. % восст. Общий Восст. % восст. Цис 27 5 18,5 94 37,0 39,4 51 33,0 64,7 17 Гцис Глн N=9 3 17 0,4 4 13,3 23,5 41 25 13,0 7,0 31,7 28,0 22 15 8,0 5,0 36,4 33,3 Таким образом, моделирование ГГц сопровождается повышением не только общих аминотиолов, но также и восстановленных. Избыточное поступление метионина приводит к изменению окислительновосстановительного состояния (редокс-статуса) тиольного пула организма в сторону восстановленных форм. Необходимо отметить, при ГГц у лиц с атеросклерозом, инсультом, почечной недостаточностью и др. (Andersson A. et al. 1993; Williams R.H. et al. 2001) не наблюдается значительных изменений редокс-статуса аминотиолов или же он сдвигается в сторону окисления. Отсюда можно сделать вывод о том, что модельные и наблюдаемые в клинике гипергомоцистеинемии неэквивалентны по редокс-статусу. 6. Редокс-статус аминотиолов плазмы крови крыс при локальной и глобальной ишемии головного мозга Острые нарушения мозгового кровообращения и плазменный гомоцистеин находятся во взаимосвязанных отношениях. С одной стороны гомоцистеин признан независимым фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, а с другой стороны само возникновение острого инсульта является стрессовым событием и запускает механизм метаболического ответа в периферических тканях, который может оказывать влияние на окислительновосстановительный баланс и обмен аминотиолов. Было ранее показано, что при ишемии среднемозговой артерии у крыс наблюдается нарушение вазодилатации сосудов вне зоны ишемии при действии ацетилхолина, а также реактивное повышение плазменных интерлейкинов 6 и 1b, АФК, нитрозилирование белков (Martinez-Revelles S. et. al. 2008, Coucha M. et al. 2013, Jimenez-Altayo F. et al. 2014). Всё это указывает на дисфункцию эндотелия периферических сосудов, но невыясненными остаются вопросы о степень её вовлечения в процессы постинсультного ответа периферическими органами и органоспецифичности этой реакции, но очевидно, что здесь вовлечены АФК (Kovacs A. et al. 2010). В связи с этим представляет интерес исследование изменений окислительновосстановительного состояния аминотиолов плазмы, обусловленных мозговой ишемией. Была смоделирована ишемия среднемозговой артерии путем введения в её просвет металлической нити. Контрольный забор крови осуществлялся за 7 дней до оперативного вмешательства. Затем кровь собирали через 3 часа и 7 дней после ишемии. Измерение мозгового кровотока через 3 ч после окклюзии мозговой артерии показал, что он уменьшался примерно вдвое (с 33,4 ±2,1 до 18.0±1.0 перфузионных единиц, р<0.01), что можно трактовать как срыв его ауторегуляции. Изменения уровня общего содержания аминотиолов носили незначительный характер, в то время как концентрации восстановленных тиолов значительно снижались в 10-20 уже через 3 часа после операции (Табл.4). Особенно этот эффект был выражен для Глн. В контрольной группе животных, с которыми проводили ту же операцию, но без ишемии, 18 наблюдалось снижение восстановленного Глн и, в меньшей степени Цис, не носящее столь выраженный характер изменений. Повторное взятие крови через неделю выявляет разделение группы крыс на две подгруппы: у одних происходит подъем восстановленных тиолов в среднем выше изначального уровня, у других эти значения остаются низкие. Просматривается четкая корреляция между восстановленными Гцис и Цис (Рис. 6). Табл.4 Изменения содержания восстановленных аминотиолов плазмы крови крыс при моделировании локальной ишемии ГМ (в мкМ). ишемия контроль Цис Глн Гцис Цис Глн Гцис Исходно 6,2±3,0 4,3±1,1 0,3±0,15 6,9±2,5 3,0±1,0 0,35±0,17 3-ий час 0,6±0,2 0,3±0,16 0,04±0,03 5,5±2,2 2,3±0,6 0,34±0,16 ишемии 7-ой день 11,4±0,4 4,4±1,5 0,6±0,2 ишемии 0,7±0,5 0,4±0,3 0,04±0,03 Гцис, мкМ 7-ой день (R2=0,89) Исх. уровень (R2=0,78) Цис, мкМ Рис. 6. Восстановленные Гцис и Цис до и после моделирования локальной ишемии ГМ. 19 Изменения общих аминотиолов плазмы при ишемии среднемозговой артерии представлены в табл. 5. Табл. 5. Содержание общих аминотиолов плазмы крови при локальной ишемии ГМ. Группа Цистеин, мкМ Глутатион, мкМ Гомоцистеин, мкМ Контроль 73±19 23±4 2,3±0,6 3 ч. ишемии 64±19 22±6 2,6±0,5 7 дн. ишемии 27±8 13±3 2,5±0,5 Как видно из таблицы, общее содержание аминотиолов за 3 часа ишемии меняется незначительно. Но за неделю ишемии происходит падение уровня Цис в 2,7 раз и Глн в 1,7 раз. Уровень общего Гцис практически не меняется. Изменения редокс статуса аминотиолов при локальной ишемии ГМ представлены на Рис. 7. Как видно из рисунка после ишемии происходит не только драматическое падение редокс-статуса аминотиолов, но и нарушаются исходные пропорции между долями их восстановленных форм. У крыс, в отличие от человека, % восстановленного к общему Гцис превышает тот же показатель для Цис, что, по-видимому, обусловлено скоростью процессов выработки/утилизации и клеточного экзоцитоза Гцис. Доля восстановленного Цис после ишемии падает в 8 раз, Гцис в 10 раз, а наибольшее падение наблюдается для Глн (в 15 раз). Это непропорциональное падение может свидетельствовать о том, что возможности антиокислительных систем, участвующих в восстановлении Глн, оказываются исчерпанными. % восст./общ. Глн Гцис * * Цис * ** ** ** Рис. 7. Редокс-статус аминотиолов плазмы при ишемии среднемозговой артерии. “*” - исходные значения, “**” - через 3 часа после ишемии. 20 Также было проведено исследование влияния кратковременной (10 мин) глобальной ишемии ГМ (путем пережатия сонных артерий) на фракцию восстановленных аминотиолов плазмы, как отягощенной временной кровопотерей (5 мл), так и без неё. Измерения проводили до операции и через час после ишемии. В результате глобальной ишемии мозговой кровоток снижался с 30,8±1,9 до 8,9±0,9 (р<0,01), т.е. более чем в три раза. После ишемии ГМ на фоне кровопотери наблюдается значительное снижение восстановленных аминотиолов (в 6-9 раз в среднем по группе, а в отдельных случаях более 20-ти раз). При этом для всех тиолов был характерен широкий разброс значений внутри группы. Для выявления ведущего фактора данного эффекта были введены дополнительно группа животных, у которых производили пережатие сонных артерий без создания кровопотери и группа, у которой осуществляли кровопотерю без пережатия артерий. Результаты показали, что основной вклад в падение восстановленных тиолов вносит именно кровопотеря, а влияние на восстановленные тиолы непосредственно пережатия артерий статистически недостоверно. Таким образом, глобальная ишемия ГМ как более легкая её форма по сравнению с локальной, не вызывает достоверных изменений восстановленных форм плазменных аминотиолов. С другой стороны кровопотеря и локальная ишемия дают их значительные и однонаправленные изменения, что может говорить о том, что в данных случаях задействованы общие стрессорные механизмы. Известно, что в условиях хронического окислительного стресса происходит снижение редокс-статуса тиолов (Apeland T. et al. 2009, Winther J.R. and Thorpe C. 2014), что подчеркивает диагностическую важность определения именно редокс-статуса для оценки окислительного стресса. Падение уровня общего Глн в нашем эксперименте может быть объяснено в рамках той же концепции, за счет его расходования в условиях развивающегося окислительного стресса. Падение уровня общего Цис, по всей видимости, указывает на истощение антиоксидантной защиты организма. Изменения общего Гцис незначительны, что согласуется с ранее сделанным выводом о том, что в острую фазу ишемических эпизодов различных тромбозов не происходит изменений его уровня (Шмелева В.М. и др. 2010). Величина изменений редокс-статуса аминотиолов (в 10-20 раз) при ишемии среднемозговой артерии указывает на их системность и задействование периферических органов. Таким образом, природа изменений содержания восстановленных тиолов может рассматриваться как системный эффект ишемии ГМ и требует дальнейшего изучения. Вовлеченность симпатико-адреналовой системы в процессы периферического сосудистого ответа была показана на моделях ишемии ГМ (Boselli C. et al. 2002, Martinez-Revelles S. et al. 2008, Coucha M. et al. 2013) и сердца (Zhao M. et al. 2012). Одним из ключевых потенциальных звеньев, опосредующих эту системную реакцию, могут являться адренэргические рецепторы 3-го типа (3R). Их действие проявляется в условиях гиперстимуляции симпатической системы и носит антагонистический характер по отношению к эффектам, опосредованных -адренэргическими рецепторами первых двух типов (Moens A.L. et al. 2010). 3R активируются при значительно больших концентрациях катехоламинов, чем 1R и 2R (Balligand J.L. 2013). Как было указано выше, локальная ишемия ГМ сопровождается 21 массированным выбросом катехоламинов в кровоток, т.е. создаются условия для их стимуляции. Если 1R и 2R подвергаются десенсетизации при продолжительной стимуляции, то для 3R это не характерно. Активация 3R приводит к увеличению синтеза NO, но пока ещё нет полной ясности, какая из изоформ NO-синтаз в каких случаях играет ведущую роль и через какие пути внутриклеточного сигналинга опосредуется увеличение экспрессии или ферментативной активации NOS (Moens A.L. et al. 2010). Так показано, что активность nNOS ассоциирована с белком теплового шока Hsp90 (Damy T. et. al. 2003, Ghosh D. K. Et al. 2012), а iNOS – с быбросом цитокинов (ФНО, Ил-1, Ил-6) и нитрозилированием белка Ras (Drexler H. et al. 2005, Lee M. and Choy J. C. 2013). NO, являясь в физиологических концентрациях вазодилататором, при массированном выбросе за счет активации iNOS может, наоборот, оказывать повреждающий эффект. Так было показано, что S-нитрозоглутатион обладает нейропротективным действием за счет снижения экспрессии iNOS (Khan M. et. al. 2005, Li W. et al. 2012). Поэтому реактивный выброс NO периферическими тканями может быть дополнительным фактором повреждения ГМ. На Рис. 8 схематично обобщены предполагаемые механизмы, связывающие окисление/нитрозилирование плазменных аминотиолов с ишемией ГМ. Рис. 8. Предполагаемые пути окисления/нитрозилирования аминотиолов в острый период ишемии ГМ. Таким образом, полученные в данной работе результаты согласуются с концепцией системной реактивной эндотелиальной дисфункции. Выявленные изменения редокс-статуса аминотиолов указывают на то, что этот показатель может иметь диагностическую роль в острую стадию ишемии ГМ (в первые часы – дни), когда изменения общих аминотиолов ещё не выражены. Кроме того, эти результаты обуславливают актуальность исследования новых аспектов эндотелиальной дисфункции. Заключение 22 В работе проведено исследование ряда аналитических платформ для определения как общего содержания, так и фракционного состава низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови. На основе КЭ и ВЭЖХ в сопряжении с УФ- и МС- детекторами были созданы новые и модифицированы имеющиеся методики прямого определения тиолов или их производных. Впервые была показана возможность прямого определения общего Гцис посредством КЭ-МС и фракционный его анализ посредством ВЭЖХ-МС с использованием ЭМ в качестве дериватизирующего агента. Проведена оптимизация альтернативного подхода к фракционному анализу тиолов посредством ВЭЖХ-УФ их ТНБ-производных аминотиолов, заключающаяся в блокировке нежелательных реакций посредством ЭМ. Использование этого подхода позволило впервые выявить значительные изменения редокс-статуса аминотиолов при моделировании острой кровопотери и локальной ишемии головного мозга у крыс. Это позволяет считать редокс-статус (или восстановленные формы) аминотиолов перспективным индикатором эндотелиальной дисфункции при ишемическом повреждении головного мозга. Интерес также представляет использование КЭ как простого анализатора с большими возможностями технологического развития и миниатюризации. Предложенный подход к определению свободных аминотиолов с использованием тиокарбонилдиимидазола, несмотря на относительную трудоёмкость и невысокую чувствительность, имеет потенциал для дальнейшего развития и применения в лабораторной диагностике. Применимость разработанных методов определения аминотиолов плазмы крови на практике подтверждается их апробацией на донорской крови, в экспериментальных моделях гипергомоцистеинемии и ишемии головного мозга. ВЫВОДЫ 1. Разработан метод прямого определения общего гомоцистеина плазмы крови при использовании капиллярного электрофореза в сопряжении с массспектрометром. Этот метод обладает достаточно высокой чувствительностью (1 мкМ) и по точности не уступает большинству методик с использованием внутреннего стандарта без изотопной метки. 2. Разработан метод капиллярного электрофореза для определения связанных форм гомоцистеина, цистеина и цистеинилглицина в плазме крови по их S,N-тиокабонильным производным. Данный метод обладает высокой чувствительностью (0,4 мкМ) и отличается простотой пробоподготовки и эффективностью (15 мин на анализ) по сравнению с ранее предложенным хроматографическим методом (Amarnath K. et al. 2003). 3. Разработан хромато-масс-спектрометрический метод анализа общего содержания, восстановленной и свободной фракции гомоцистеина. Применение N-этилмалеимида в качестве дериватизирующего агента позволило более чем на порядок (до 5 нМ или 100 фмоль) повысить чувствительность метода по сравнению с прямым хромато-масс-спектрометрическим анализом. Этот метод также позволяет проводить анализ содержания других аминотиолов в плазме крови – цистеина, глутатиона, цистеинилглицина, цистеамина и пеницилламина. 23 4. Модифицирован хроматографический метод определения восстановленных форм аминотиолов плазмы крови с дериватизацией дитиобиснитробензойной кислотой. Метод показал высокую чувствительность (10 нМ) и согласованность при его сравнении с хроматографическим методом анализа, использующим модификацию тиолов монобромобиманом и флуоресцентное детектирование. Учитывая простоту пробоподготовки, высокую воспроизводимость (5-12%) и доступность оборудования и реактивов, данный метод является оптимальным для анализа фракций аминотилов в лабораторной диагностике. 5. Экспериментальная гипергомоцистеинемия, индуцированная метиониновой нагрузкой, сопровождается увеличением не только общего уровня аминотилов в плазме крови, но и повышением их восстановленной фракции, а также редокс-статуса, что отличает её от гипергомоцистеинемий, наблюдаемых при сердечно-сосудистых заболеваниях и почечной недостаточности. 6. Глобальная ишемия головного мозга в сочетании с декомпенсированной кровопотерей, а также фокальная ишемия головного мозга при окклюзии среднемозговой артерии сопровождаются быстрым (1-3 ч) и значительным (в 5 и более раз) падением редокс-статуса аминотиолов плазмы крови за счет снижения содержания их восстановленных форм. 7. При глобальной ишемии головного мозга, не сопровождающейся декомпенсированной кровопотерей, не происходит значимого изменения редокс-статуса гомоцистеина и других тиолов плазмы. 8. Восстановленные формы аминотиолов плазмы крови имеют дифференциальные особенности ответа в зависимости от типа и тяжести ишемии головного мозга и их определение может иметь диагностическое значение как на раннем этапе развития инсульта ГМ, так и для мониторинга его развития. Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Иванов, А.В. Определение восстановленной фракции гомоцистеина в плазме крови с помощью ВЭЖХ-МС / А.В. Иванов, А.А. Московцев, Б.П. Лузянин, А.С. Роткина, А.А. Кубатиев // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2011 - №2 - С. 55-60. 2. Иванов, А.В. Использование N-этилмалеимида для массспектрометрического детектирования фракций гомоцистеина в плазме крови / А.В. Иванов, Б.П. Лузянин, А.А. Кубатиев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2011 - Т. 152. № 9 - С. 256-259. 3. Ivanov A.V. Determination Of Total Homocysteine In Blood Plasma By Capillary Electrophoresis With Mass Spectrometry Detection / Ivanov A.V., Luzyanin B.P., Moskovtsev A.A., Rotkina A.S., Kubatiev A.A. // Journal of Analytical Chemistry – 2011 - v. 66. № 3. - p. 317-321. 4. Иванов, А.В. Общие аминотиолы плазмы крови крыс при внутрибрюшинном и подкожном введении гомоцистеина / А.В. Иванов, А.А. Московцев, Е.А. Мартынова, Г.Д. Савина, Б.П. Лузянин, А.А. Кубатиев // 24 Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2013 - №.4 - С. 4145. 5. Иванов, А.В. Влияние мозговой ишемии на редокс-статус аминотолов плазмы крови / А.В. Иванов, В.В. Александрин, Б.П. Лузянин, А.А. Кубатиев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2014 - т. 158 № 10 - С. 409-412. 6. Иванов, А.В. Определение связанной фракции цистеина, гомоцистеина и цистеинилглицина в плазме крови с помощью капиллярного электрофореза / А.В. Иванов, Б.П. Лузянин, Э.Д. Вирюс, А.А. Кубатиев // Патогенез. – 2013 - т. 11 № 4 - С. 49-53. 7. Иванов, А.В. Определение основных низкомолекулярных аминотиолов в плазме крови методом ВЭЖХ-МС / А.В. Иванов, П.В. Кудан, Б.П. Лузянин, А.А. Кубатиев // Патогенез. – 2012 - Т. 10. № 2 - С. 68-71. 8. Иванов, А.В. Изменения общего содержания и восстановленной фракции аминотиолов плазмы крови крысы при гипергомоцистеинемии, индуцированной метиониновой диетой / А.В. Иванов, В.В. Александрин, Б.П. Лузянин, А.А. Кубатиев // Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Молекулярная диагностика-2014” под ред. акад. РАН В.И. Покровского, Москва. - 2014. - т.2 - С. 383-384. 9. Иванов, А.В. Оптимизация методов определения восстановленных аминотиолов и их производных в качестве перспективных маркеров эндотелиальной дисфункции / А.В. Иванов // Сборник тезисов XVII Всероссийской конференции “Человек и его здоровье” (Всероссийская медикобиологическая конференция молодых ученых “Фундаментальная наука и клиническая медицина”), Санкт-Петербург. - 2014. - С. 180. 25 Список используемых сокращений 3R NOS СА АГ АМ АФК ВЭЖХ ГГц Гли-асп Глн ГМ Гцис ДТНБ ИБС ИФА КЭ ЛИФ МС ОНМК ПА ПО ССЗ ТКДИ ТНБ УФ Фл Цис ЦисГли ЭМ - -адренэргические рецепторы 3-го типа синтаза оксида азота цистамин S-аденозилгомоцистеин S-аденозилметионин активные формы кислорода высокоэффективная жидкостная хроматография гипергомоцистеинемия глициласпарагин глутатион головной мозг D,L-гомоцистеин дитиобиснитробензойная кислота ишемическая болезнь сердца иммуноферментный анализ капиллярный электрофорез лазер-индуцируемая флуоресцентция масс-спектрометрия острое нарушение мозгового кровообращения D-пеницилламин программное обеспечение сердечно-сосудистые заболевания 1,1’- тиокарбонилдиимидазол тионитробензоил ультрафиолет флуоресценция L-цистеин цистеинилглицин N-этилмалеимид 26 Ivanov Alexander Vladimirovich Analytical methods development of homocysteine and other aminothiols determination in blood plasma for brain ischemic injury estimation. Abstract Low molecular weight aminothiols (cysteine, homocysteine, glutathione and other) are involved in many pathological processes. A special attention is paid to the role of homocysteine in oxidative stress, endothelial dysfunction and prothrombotic state. It is well known that homocysteine is an independent risk factor for many cardiovascular diseases complications include acute stroke. Due to the high degree of morbidity and mortality after stroke, its diagnosis have a great importance. In the structure of strokes ischemic stroke is dominated. It accounts for about 80% of cases. Homocyteine, along with C-reactive protein and P-selectin, belongs to the three most significant biochemical markers of stroke. But its diagnostic value as a marker of disease remains a subject of discussion because the decrease in total plasma homocysteine does not reduce the potential incidence of ischemic stroke. This requires a search for other metabolic related diagnostic markers. This is largely due to the fact that, like other aminothiols, homocysteine is present in many forms (or fractions). In plasma, only a small part of the homocysteine is present in reduced form, a large amount of this amino acids is oxidized forming disulfide bonds with proteins (bound fraction), cysteine and other thiols (free fraction). All these forms have different reactivity and the kinetics of metabolic processes, which leads to interest in fractional analysis because it provides more detailed information about whole aminothiols composition and their redox status. This is also actual because systemic vasomotor effects of a stroke are not been well studied to date, and information about the effect of cerebral ischemia on metabolism and redox status of the aminothiols are absent. To solve this problem a using of high-sensitive and efficient analytical methods is necessary. In this work a four methods was offered based on capillary electrophoresis (CE) and high performance liquid chromatography (HPLC). First method allows determinate only total homocysteine in plasma using CE coupled with mass-spectrometer (MS) via electrospray interface (ESI). This is a direct method that does not require derivatization, but its sensitivity is restricted. Second, more sensitive CE-UV method with thiocarbonyldiimidazole derivatization was applied to determinate bound forms of aminothiols. Fractional analysis of aminothiols were perform using HPLC-MS and HPLC-UV with N-ethylmaleimide and dithiobisnitrobenzoic acid derivatization. Using the last method a ten-fold and greater changes of aminothiols redox state was found at experimental model of focal brain ischemia and haemorrhagia. Thus, the obtained in this work results complement the set of systemic biochemical changes that occur with stroke. The developed methods can be used in clinical laboratory diagnostics.
