На правах рукописи Троянова Наталья Игоревна ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ БТШ70
advertisement
На правах рукописи Троянова Наталья Игоревна ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ БТШ70 В ИНДУЦИРОВАННОМ АЛЛЕРГИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ У МЫШЕЙ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2015г. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН). Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Сапожников Александр Михайлович. Официальные оппоненты: Филатов доктор биологических наук, Александр лабораторией Васильевич иммунологии» ФМБА России. Стенина доктор медицинский наук, профессор, профессор кафедры Марина иммунологии Александровна исследовательский медицинский университет им. Н.И. иммунохимии ГБОУ ВПО профессор, ФГБУ заведующий «ГНЦ Российский Институт национальный Пирогова Минздрава России. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова». Защита диссертации состоится 5 октября 2015 г. в 15:30 на заседании диссертационного Федерального высшего совета Д 501.001.93 государственного образования при бюджетного «Московский биологическом факультете образовательного учреждения государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12. С диссертационной работой можно ознакомиться Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте www.bio.msu.ru. Автореферат разослан 3 сентября 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета: Доктор биологических наук Умарова Бэлла Анверовна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования Во многих странах с различным уровнем развития астма является одной из основных проблем здравоохранения. Несмотря на внедрение эффективных мер для лечения и профилактики этого заболевания, даже в странах с высоким уровнем оказания медицинской помощи до сих пор выявляются случаи летального исхода, связанного с астмой. В связи с высокой частотой встречаемости и тяжелой симптоматикой этого заболевания, поиск препаратов, способных останавливать развитие аллергического воспаления и облегчать течение астмы, не теряет своей актуальности. В последние годы в большой серии научных работ продемонстрировано присутствие в сыворотке периферической крови человека и лабораторных животных циркулирующего пула белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70). Показано, что содержание сывороточных циркулирующих БТШ70 в организме значительно возрастает в условиях стресса и при ряде заболеваний, в том числе при аллергической астме. Хорошо известно, что БТШ70 является внутриклеточным протеином, выполняющим протективные и обслуживающие функции в отношении других протеинов. Причины формирования и функции внеклеточного пула БТШ70 находятся пока на начальной стадии изучения. В то же время внеклеточные белки БТШ70 рассматривают как эволюционно сформировавшиеся «сигналы опасности» для иммунной системы, указывающие на возникновение и локализацию очага воспаления в организме, а также как элементы механизма защиты различных тканей от стресс-опосредованных повреждений. Сравнительно недавно было обнаружено, что одной из важных характеристик иммуномодулирующей активности БТШ70 является способность регулировать процесс продукции фагоцитами активных форм кислорода (АФК). АФК играют важную роль в первой линии защиты организма от болезнетворных микроорганизмов, однако, повышенная концентрация внеклеточных АФК в очагах воспаления оказывает 3 повреждающее действие на окружающие ткани и на сами клетки-продуценты, усиливая воспалительные процессы. Приведенные данные свидетельствуют о потенциальной протективной активности БТШ70 при воспалительных процессах. Тем не менее роль данного белка в регуляции аллергического воспаления дыхательных путей до сих пор не изучена. Исследования необходимы как для регуляторной активности фундаментальной БТШ70 физиологии, при так астме и для экспериментальной и клинической медицины. Настоящая работа посвящена изучению регуляторной активности БТШ70 в мышиной мадели аллергической астмы, а также анализу механизмов участия внеклеточных БТШ70 в системе ограничения уровня продукции фагоцитами АФК. Цель исследования – исследование роли внеклеточного пула БТШ70 в регуляции аллергического воспаления дыхательных путей. Задачи исследования: 1. Исследовать динамику развития аллергического воспаления дыхательных путей в мышиной модели овальбумин-индуцированной астмы. 2. Оценить иммуномодулирующие эффекты экзогенного внеклеточного БТШ70 в модели индуцированного воспаления дыхательных путей. 3. Оценить влияние БТШ70 на продукцию клетками активных форм кислорода в оптимизированной модели «окислительного взрыва» фагоцитов. 4. Провести анализ молекулярных механизмов антиоксидантного действия БТШ70. 5. Исследовать механизмы супрессорного воздействия БТШ70 на развитие аллергического воспаления путем оценки влияния БТШ70 на активацию нейтрофилов костного мозга мышей с индуцированной астмой. 4 Научная новизна В настоящем исследовании впервые продемонстрирована способность аутологичного БТШ70 подавлять индуцированное воспаление дыхательных путей. В модели индуцированной астмы впервые было обнаружено, что механизмы противоаллергического восстановлением пониженной действия продукции БТШ70 активных связаны форм с кислорода нейтрофилами костного мозга. Существенную степень научной новизны имеют также экспериментальные данные, полученные при анализе модулирующего действия экзогенного БТШ70 на спонтанную и индуцированную продукцию активных форм кислорода фагоцитирующими клетками разных типов. Научно-практическая значимость работы Полученные в работе данные о способности БТШ70 препятствовать развитию аллергического воспаления в дыхательных путях позволяет рассматривать этот протеин как потенциальную основу для создания препаратов, способных останавливать процесс аллергического воспаления в дыхательных путях у больных астмой. Была разработана система для дифференцированного определения влияния антиоксидантов на уровень вне- и внутриклеточных АФК, основанная на сравнении показателей люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминесценции. Преимуществом данной системы является отсутствие необходимости добавления в клеточную суспензию белковых скэвенджеров, способных маскировать эффекты исследуемых антиоксидантов. Исследование было поддержано грантом РФФИ («Мой первый грант» № 14-04-32203 в 2014-2015 гг.) Основные положения, выносимые на защиту 1. Локально вводимый БТШ70 подавляет развитие индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей у мышей, снижая уровень проаллергических цитокинов и специфических иммуноглобулинов и смещая 5 популяционный баланс клеток бронхоальвеолярных лаважей от эозинофилов к нейтрофилам. 2. БТШ70 ингибирует продукцию активных форм кислорода нейтрофилами мыши и приводит к подавлению индуцированной неапоптотической гибели нейтрофилов. 3. Антиоксидантный эффект БТШ70, по-видимому, опосредуется его прямым взаимодействием с NADPH-оксидазой. Степень достоверности и апробация работы: Достоверность полученных результатов обеспечена использованием в работе комплекса высокочувствительных методологических подходов: молекулярно-биологических, современных биохимических и иммунологических методов исследования, подробным учетом и тщательной оценкой результатов, использованием адекватных методов статистической обработки данных, сопоставления результатов, полученных разными методами. Материалы диссертации были представлены на научной конференции «Х чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» (Москва, 2011 г.); на 1-м международном конгрессе по клеточной гибели и раку (Сан-Мало, 2012 г.); на XХIV Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2012 г.); на 3-м Европейском конгрессе по иммунологии (Глазго, 2012 г.); на международной конференции «Аллергия и Астма» (Брюгге, 2013 г.); на XXV Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2013 г.); на Х Зимней Школе EAACI «Фундаментальные Иммунологические исследования в Аллергологии и Клинической Иммунологии» (Пихль, 2013 г.); на Международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва, 2014 г.); на XXVII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" 6 (Москва, 2015 г.); на VII Российском симпозиуме «белки и пептиды» (Москва, 2015 г.); Апробация диссертации состоялась 20 апреля 2015 г. на расширенном семинаре отдела иммунологии ИБХ РАН. Публикации По теме диссертационного исследования опубликованы 16 печатных работ. Из них 8 публикаций в печатных изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 275 наименований, из них 10 отечественных и 265 зарубежных источников. Работа изложена на 130 страницах и иллюстрирована 34 рисунками. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе были использованы самки мышей линии BALB/c из питомника Российской Академии Медицинских Наук в возрасте 10-12 недель, весом 18-20 г. Содержание животных и протоколы экспериментов были одобрены комиссией ИБХ РАН по контролю за содержанием и использованием животных. Все исследования проводились в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным. Эвтаназия мышей проводилась ингаляцией CO2. Мышей сенсибилизировали путем двукратного внутрибрюшинного введения белка овальбумина (OVA) в концентрации 10 µг/мышь/инъекцию, адсорбированного на носителе Imject Alum, с разницей в неделю. После этого, на день 19, 20 и 21 от первой инъекции мыши получали интрафарингеальные ингаляции 0.1% раствора OVA в PBS. Контрольные животные получали тот же 7 объем PBS. Для определения влияния БТШ70 на развитие воспаления мышам вводили интрафарингеально БТШ70 в дозе 1 µг/мышь в острой фазе воспаления (через 24 ч после последней ингаляции аллергена). Эффекты БТШ70 оценивали через 48 ч после последней ингаляции аллергена (в эффекторной фазе воспаления). Для определения общего количества и популяционного состава клеток бронхоальвеолярного смыва, или лаважа (БАС), использовали дифференциальное окрашивание клеток, осажденных на стекле методом цитоцентрифугирования. Определение локальной и системной концентрации цитокинов и иммуноглобулинов проводили методом ИФА. Эксперименты in vitro проводили на обогащенной методом отрицательной магнитной селекции суспензии нейтрофилов, выделенных из костного мозга трубчатых костей лабораторных мышей. Измерение уровня внеклеточной РНК проводили при помощи флуоресцентного нуклеотид-связывающего красителя Sytox-Green. Измерение общего и внеклеточного уровня АФК проводили методом люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминесценции соответственно. Для оценки уровня внутриклеточного содержания АФК также использовали метод проточной цитофлуориметрии с применением 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетата (DCF-DA). Для активации клеток, приводящей к лавинообразной продукции АФК («окислительный взрыв»), были использованы хемотактический пептид N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP) в концентрации 1–20 µМ, форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) в концентрации 8–2000 µМ и Ca2+-ионофор А23187 в концентрации 2–10 µМ. Для направленного подавления продукции АФК ферментным комплексом NADPH-оксидазы использовали специфический ингибитор p47phox-субъединицы этого комплекса – апоцинин в концентрации 15 µМ и ингибитор флавинсодержащих ферментов дифенилениодоний – DPI в 8 концентрации 1.5 µМ. Ингибиторы вносили в образцы клеток за 15 мин до добавления белков. В качестве аутологичного БТШ70 для инрафарингеального введения мышам использовали БТШ70, получаемый из внутренних органов сингенных мышей с последующей аффинной хроматографией на АТФ-агарозе. В экспериментах на клеточных моделях использовали препараты рекомбинантного индуцируемого БТШ70 человека, обладающего высокой гомологией с мышиным БТШ70, очищенные от примеси липополисахарида. Статистический анализ проводили с помощью пакета функций для статистической обработки программы Prism и программы Statistics. На графиках представлены средние значения и стандартная ошибка (m). Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стьюдента (t-тест). Различие значений при p<0.05 рассматривалось как достоверное. РЕЗУЛЬТАТЫ Снижение уровня секреции проаллергических цитокинов и специфических иммуноглобулинов под действием БТШ70. Известно, что усиление аллергического воспаления, в том числе в дыхательных путях, обусловлено воздействием Th2-ассоциированных цитокинов, в частности IL-4 и IL-13 на эпителиальные клетки и IL-5 непосредственно на эозинофилы. В данной работе была проведена оценка изменения уровня про-аллергических цитокинов в бронхоальвеолярных смывах (БАС) мышей с индуцированной астмой под действием БТШ70. Показали, что у мышей, получавших ингаляцию БТШ70, достоверно снижались уровни IL-4, IL-5 и IL-13 на 48 часов после последней ингаляции аллергена по сравнению с контрольной группой мышей, получавшей PBS вместо БТШ70 (рис. 1 а). Для оценки влияния БТШ70 на продукцию антител были выбраны сывороточные IgG1 и IgE, а также IgA БАС, так как для этих иммуноглобулинов было выявлено повышение уровня секреции в эффекторной 9 фазе по сравнению с острой фазой воспаления (рис. 1 б). Ингаляция БТШ70 в острой фазе воспаления останавливала рост уровня аллерген-специфических IgG1 и IgЕ в сыворотке периферической крови и IgA в надосадочной жидкости БАС мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей (рис. 1 б). б ** 30 OVA/OVA-острая OVA/OVA-эффекторная OVA/OVA+БТШ70 NM * 1.25 1.00 20 ** ** 10 OD450 концентрация цитокина, пг/мл а * * 0.75 0.50 0.25 0 0.00 IL-4 IL-5 IL-13 IgG1 IgA IgE Рис. 1. Изменение уровня проаллергических гуморальных факторов у мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей после ингаляции БТШ70. Уровень IL-4, IL-5, IL-13 (а) и IgA (б) в бронхоальвеолярных смывах и IgG и IgE (б) в периферической крови мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей в эффекторной фазе, получавших интрафарингеально БТШ70 (OVA/OVA+БТШ70) и не получавших протективной ингаляции (OVA/OVAэффекторная), мышей с острой фазой индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей (OVA/OVA-острая) и интактных мышей (NM). Разведение сыворотки для определения IgG1 – 1:10000, для определения IgE – 1:10, Разведение БАС для определения IgА – 1:1. Результаты представлены в виде средних значений ± стандартные ошибки среднего (SEM) по данным 3 экспериментов: 5 мышей в группе. Уровень достоверности: * – p≤0.05, ** p≤0.01. Подавление роста общего количества клеток и изменение популяционного состава БАС мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей после введения БТШ70 Оценка изменения клеточного состава БАС показала, что локальное введение аутологичного БТШ70 в острой фазе индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей ограничивало общий приток клеток в легкие в эффекторной фазе воспаления (рис. 2 а). При этом у мышей, получавших ингаляцию БТШ70, процент эозинофилов в легких был значительно снижен по сравнению с контрольными мышами (рис. 2 б). Также в 10 группе мышей, получавших БТШ70, процент нейтрофилов в БАС на 48 часов после последней ингаляции аллергена оставался более высоким, чем в контрольных группах (рис. 2 б). а ns 0.4 100 * * 0.6 ns * 24 48 OVA/OVA-острая OVA/OVA-эффекторная OVA/OVA-БТШ70 OVA/OVA-PBS ** 0.2 0.0 б ** ** 72 клетки, % клетки, млн/мл 0.8 NM время после последней ингаляции OVA 75 50 *** 0 * *** 25 24 48 72 макрофаги 24 48 72 24 нейтрофилы 48 72 лимфоциты 24 48 72 эозинофилы Рис. 2. Эффект ингаляции БТШ70 в острой фазе аллергического воспаления дыхательных путей на развитие воспалительного процесса. Общее количество клеток (а) и процент макрофагов, нейтрофилов, лимфоцитов и эозинофилов (б) в БАС мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей в острой (OVA/OVA-острая) и эффекторной (OVA/OVAэффекторная) фазе, получавших интрафарингеально БТШ70 (OVA/OVA-БТШ70) или PBS (OVA/OVA-PBS). Результаты представлены в виде средних значений ± стандартные ошибки среднего по данным 3 экспериментов: 5 мышей в группе. Достоверные отличия от значений, полученных для мышей, с острой фазой аллергического воспаления дыхательных путей (24 часа после ингаляции аллергена) или, где показано, между группами обозначали: p≤0.05: *; p≤0.01: **; p≤0.001: ***. Одной из ключевых характеристик протективного влияния БТШ70 при аллергическом воспалении дыхательных путей, как следует из вышеприведенных данных, является ограничение притока эозинофилов в ответ на ингаляцию аллергена. При этом введение БТШ70 через 24 часа после ингаляции аллергена способствовало сохранению количества нейтрофилов на уровне достоверно более высоком, чем у мышей, не подвергавшихся воздействию БТШ70. Таким образом, увеличение концентрации внеклеточного БТШ70 в острой фазе аллергического воспаления дыхательных путей стабилизирует клеточный ответ и смещает популяционный баланс в дыхательных путях от эозинофилов к нейтрофилам. 11 Смещение популяционного баланса клеток БАС под действием БТШ70 происходит не за счет рекрутмента новых нейтрофилов из костного мозга Процент нейтрофилов среди клеток костного мозга был снижен у мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей (как в острой, так и в эффекторной фазе) по сравнению с интактными и сенсибилизиронными мышами. При этом локальное введение БТШ70 не изменяло процентное содержание и количество нейтрофилов в костном мозге (рис. 3). Эти данные говорят об отсутствии рекрутмента нейтрофилов из костного мозга при локальном введении БТШ70 в дыхательные пути мышей с OVA-индуцированной астмой. клетки, % 100 *** *** *** 75 50 25 0 24 48 NM Рис. 3. Влияние БТШ70 на процентное содержание нейтрофилов в костном мозге мышей в эффекторной фазе аллергического воспаления дыхательных путей Доля нейтрофилов среди клеток костного мозга мышей в различных стадиях аллергического воспаления дыхательных путей представлена в процентах от общего числа клеток. Приведены средние значения ± SEM. n=4, достоверность отличий от показателей мышей с индуцированной астмой с p≤0.001 обозначена ***. Присутствие БТШ70 в суспензии нейтрофилов отменяет РМА-индуцированное повышение уровня внеклеточной РНК. Было показано, что в дозе 20 нМ и выше, РМА вызывает достоверное увеличение уровня внеклеточной РНК в суспензии нейтрофилов, выделенных из костного мозга мыши негативной селекцией, уже через 3 ч после добавления. При этом инкубация активированных нейтрофилов в присутствии БТШ70 приводила к достоверному подавлению РМА-индуцированного роста 12 концентрации внеклеточной РНК через 3 и 4 ч после добавления индуктора (рис. 4 а и б соответственно). б а Рис. 4. Влияние БТШ70 на уровень внеклеточной РНК в культуре РМА-активированных нейтрофилов мыши. Уровень внеклеточной РНК при окраске флуоресцентным нуклеотидсвязывающим красителем через 3 (а) и 4 (б) часа после добавления к клеткам 2 µМ РМА приведен в относительных единицах. Приведены репрезентативные данные одного из четырех независимых экспериментов. Приведены средние значения ± m. Уровень достоверности: * – p≤0.05. Исследование влияния БТШ70 на продукцию активных форм кислорода in vitro Зарегистрированные в последующих сериях экспериментов эффекты предобработки клеток костного мозга экзогенными БТШ70 подтвердили ингибирующее действие этих протеинов на продукцию АФК и свидетельствовали о зависимости их эффектов от дозы. Так, было показано, что добавление к образцам нейтрофилов костного мозга мыши экзогенных БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и выше значительно снижает fMLP-индуцированный «окислительный взрыв» (рис. 5 в, г), а снижение фонового уровня продукции АФК при добавлении БТШ70 наблюдается начиная с дозы этого протеина 0.5 мкг/мл (рис. 5 а, б). Достоверный окислительный ингибирующий взрыв проявлялся эффект также БТШ70 при Ca2+-ионофором А23187 (рис. 6 а) и РМА (рис. 6 б). 13 на индуцированный активации нейтрофилов Относительный уровень хемилюминесценции Относительный уровень хемилюминесценции б а *** *** *** в 10 8 8 6 6 * 4 2 1 2 3 4 * 4 2 ** * *** 0 г 10 5 * 0 6 1 2 3 4 5 ** 6 Рис. 5. Влияние БТШ70 на продукцию АФК покоящимися и активированными fMLP нейтрофилами костного мозга мыши. Нейтрофилы мыши в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации 0.1 (2), 0.5 (3), 1 (4), 2.5 (5), 5 µг/мл (6). Оценку влияния БТШ70 на фоновую продукцию АФК (а–б) проводили путем сравнения нормированных по базовому уровню значений хемилюминесценции через 5 мин после добавления БТШ70. Оценку влияния БТШ70 на «окислительный взрыв», вызванный 10 µМ fMLP (в–г) проводили путем сравнения нормированных по базовому уровню (до активации) максимальных значений хемилюминесценции. 1 – контрольные образцы. Приведены средние значения ± m; 4 мыши в группе; * – p<0.05, ** – p≤0.01, *** – p≤0.001. 14 12 8 * 4 0 1 2 Относительный уровень хемилюминесценции Относительный уровень хемилюминесценции а 16 3 б 16 12 8 * 4 0 1 2 3 Рис. 6. Влияние БТШ70 на А23187-индуцированный (а) и РМА-индуцированный (б) окислительный взрыв в нейтрофилах КМ мыши. Нейтрофилы мыши в количестве 2х105 на лунку плоскодонного 96-луночного планшета инкубировали с БТШ70 в концентрации 2.5µг/мл. Оценку влияния БТШ70 на А23187-индуцированный (а) и РМА-индуцированный (б) «окислительный взрыв» проводили путем сравнения нормированных по базовому уровню (до активации) максимальных значений люминол-зависимой хемилюминесценции. 1 – контрольные образцы, 2 – референтный белок БСА, 3 – БТШ70. Приведены средние значения ± m; n=4; приведены усредненные данные четырех независимых экспериментов; Достоверность отличий с p<0.05 обозначена *. Влияние БТШ70 на fMLP-индуцированную продукцию АФК нейтрофилами мыши в присутствии ингибиторов NADPH-оксидазы. Для оценки возможного вклада в зарегистрированные эффекты БТШ70 модулирующего действия этого протеина на уровень активности NADPHоксидазы, было протестировано действие экзогенного БТШ70 на клетки костного мозга в присутствии ингибиторов NADPH-оксидазы апоцинина и дифенилиодония (DPI). Специфический ингибитор NADPH-оксидазы апоцинин в дозе 15 мкМ практически полностью подавлял продукцию АФК в используемых моделях. Это говорит об обусловленности окислительного взрыва исключительно работой NADPH-оксидазы. Внесение fMLP в клеточные культуры в присутствии этого ингибитора не приводило к типичной лавинообразной продукции АФК, поэтому эффект БТШ70 на «окислительный взрыв», очевидно, не мог быть зарегистрирован (рис. 7 а, б). Однако присутствие апоцинина в меньшей дозе (10 мкМ) в образцах клеток не отменяло ингибирующий эффект БТШ70 на фоновую продукцию АФК в 15 данной модели (рис. 8 а, б). Это указывает на то, что антиоксидантный эффект БТШ70 достигается, вероятнее всего, не за счет его взаимодействия с субъединицей NADPH-оксидазы p47phox, обеспечивающей транслокацию цитозольных субъединиц NADPH-оксидазы к плазматической мембране. Возможно, что обусловленное БТШ70 снижение активности NADPH-оксидазы связано с взаимодействием этого протеина с другими субъединицами данного ферментного комплекса. Относительный уровень хемилюминесценции Относительный уровень хемилюминесценции 1.5 1.5 а 1 1 0.5 0.5 0 1.5 0 1.5 в 1 1 0.5 0.5 б г * * 0 0 1 2 1 3 2 3 Рис. 7. Влияние БТШ70 на fMLP-индуцированную продукцию АФК нейтрофилами мыши в присутствии ингибиторов NADPH-оксидазы. Оценку влияния БТШ70 на «окислительный взрыв» в присутствии 15 µМ специфичного ингибитора NADPH-оксидазы – апоцинина (а, б) и 1.5 µМ неспецифического ингибитора NADPH-оксидазы DPI (в, г) проводили путем сравнения значений амплитуды «окислительного взрыва», нормированных по показателям котрольных клеток, активированных в присутствии соответствующих ингибиторов. 1 – контрольные клетки, инкубированные с ингибиторами NOX, 2 – 2.5 µг/мл референтного белка БСА, 3 – 2.5 µг/мл БТШ70. Приведены средние значения ± m; n=4; * – p<0.05. 16 Еще одна серия экспериментов была посвящена анализу эффектов БТШ70 в присутствии в клеточной культуре DPI – неспецифического ингибитора флавинсодержащих ферментов, в том числе и NADРН-оксидазы, а именно - ее трансмембранной субъединицы gp91phox, представленной на клеточной поверхности, и, таким образом, доступной для прямого взаимодействия с внеклеточным пулом БТШ70. DPI в избыточной концентрации (1.5 мкМ) существенно, но не полностью, подавлял в наших моделях уровень фоновой продукции АФК и амплитуду окислительного взрыва в образцах клеток костного мозга мыши без нейтрофилов и фракции нейтрофилов костного мозга, а также в образцах нейтрофилов, выделенных из периферической крови человека. Полученные результаты продемонстрировали, что, как и в экспериментах с апоцинином, внесение экзогенного БТШ70 в культуры клеток, инкубируемых в присутствии DPI, приводило к снижению общего и внеклеточного фонового уровня продукции АФК (рис. 8 в, г), а также к достоверному снижению амплитуды fMLP-индуцированного ответа фагоцитов (рис. 7 в, г). Поскольку присутствие избыточного количества специфического ингибитора NADPH-оксидазы апоцинина практически полностью отменяло fMLP-индуцированный клеточный ответ при регистрации как люминолзависимой, так и изолюминол-зависимой хемилюминесценции, окислительный взрыв, по-видимому, происходит только за счет выработки NOX-зависимых АФК. В связи с этим, антиоксидантный эффект, проявляемый БТШ70 в условиях активации клеток, очевидно, связан с действием этого белка на NADPH-оксидазу. В присутствии как DPI, так и апоцинина в дозе, не подавляющей полностью окислительный взрыв, антиоксидантная активность БТШ70 сохраняется. Это свидетельствует в пользу предположения, что эффект этого протеина не связан с его непосредственным взаимодействием с субъединицами gp91phox и p47phox NADPH-оксидазы, ингибиторов - DPI и апоцинина, соответственно. 17 мишенями ее Относительный уровень хемилюминесценции Относительный уровень хемилюминесценции 1 1 а 0.8 *** 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 1 0 1 в 0.8 0.6 г 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0 0 2 ** 0.8 *** 1 б 0.8 3 *** 1 2 3 Рис. 8. Влияние БТШ70 на фоновую продукцию АФК нейтрофилами мыши в присутствии ингибиторов NADPH-оксидазы. Оценку влияния БТШ70 на фоновую продукцию АФК в присутствии 10 µМ специфичного ингибитора NADPH-оксидазы – апоцинина (а, б) и 1.5 µМ неспецифического ингибитора NADPH-оксидазы DPI (в, г) проводили путем сравнения нормированных по базовому уровню значений хемилюминесценции через 5 мин после добавления БТШ70. 1 – контрольные клетки, инкубированные с ингибиторами NOX, 2 – 2.5 µг/мл референтного белка БСА, 3 – 2.5 µг/мл БТШ70. Приведены средние значения ± m; n=4; ** – p<0.01, *** – p<0.001. Мы предполагаем, что продемонстрированное в наших экспериментах ингибирующее действие БТШ70 на уровень фоновой продукции АФК, не связано с воздействием на субъединицы gp91phox и p47phox NADPH-оксидазы. Наиболее вероятной мишенью внеклеточного БТШ70 субъединица p22phox, представленная на поверхности может являться плазматической мембраны и потому доступная для прямого взаимодействия с экзогенными регуляторами. Это предположение подкрепляется тем фактом, что эффект экзогенно добавленного БТШ70 на фоновую продукцию АФК проявляется одинаково как на нейтрофилах, так и на других клетках, т.е. его действие, по18 видимому, затрагивает участки NOX, общие для нескольких ферментов этого семейства. В то же время из известных на данный момент субъединиц только гомологи gp91phox и p22phox являются общими элементами для большинства ферментов семейства NOX. Влияние БТШ70 на способность нейтрофилов костного мозга мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей продуцировать АФК Как было показано ранее, при использовании модели индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей, временный приток нейтрофилов в дыхательные пути наблюдается в острой фазе воспаления, тогда как наступление эффекторной фазы, напротив, характеризуется снижением количества нейтрофилов в дыхательных путях и супрессией нейтрофилопосредованного иммунного ответа относительно острой фазы. Так как костный мозг является основным источником привлекаемых на периферию нейтрофилов, потенциал нейтрофил-опосредованного ответа должен коррелировать с активностью нейтрофилов костного мозга. В данном исследовании мы анализировали уровень продукции АФК в клетках костного мозга мышей с острой и эффекторной фазой аллергического воспаления дыхательных путей (рис. 9). Индуцированная продукция АФК нейтрофилами, выделенными в острой фазе аллергического воспаления, значительно возрастала по сравнению с нейтрофилами как нормальных, так и сенсибилизированных мышей (рис. 9 а). В тоже время, выделенные из костного мозга мышей на стадии эффекторной фазы аллергического воспаления нейтрофилы демонстрировали снижение индуцированной продукции АФК (рис. 9 б). Локальное введение БТШ70 мышам с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей приводило к восстановлению способности нейтрофилов костного мозга к окислительному взрыву, сниженной у таких 19 животных, через 48 ч после последней ингаляции аллергена (в эффекторной фазе воспаления) до значений, сравнимых с показателями интактных мышей (рис. 10). Относительная амплитуда "окислительного взрыва" 2.5 ** а 2.5 2 2 1.5 1.5 1 1 0.5 0.5 0 0 1 2 3 б * 1 2 3 Рис. 9. «Окислительный взрыв» нейтрофилов костного мозга мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей. Оценку амплитуды «окислительного взрыва» в нейтрофилах костного мозга мышей с острой (а) и эффекторной (б) фазой воспаления дыхательных путей проводили путем сравнения нормированных по показателям интактных животных максимальных значений люминол-зависимой хемилюминесценции. 1 – нейтрофилы интактных мышей, 2 – нейтрофилы сенсибилизированных мышей, 3 – нейтрофилы мышей с OVA-индуцированной астмой. Приведены средние значения ± m; n = 4; достоверность различий с p<0.05 обозначали *, p<0.01 – **. Относительная амплитуда окислительного взрыва 1.5 1 ** 0.5 0 1 2 3 4 Рис. 10. Влияние локально введенного БТШ70 на продукцию АФК клетками костного мозга мышей в эффекторной фазе воспаления дыхательных путей. Приведены данные амплитуды «окислительного взрыва», нормированной по базовому уровню (до активации). В эксперименте использовали нейтрофилы, выделенные из костного мозга мышей с овальбумин-индуцированной астмой в эффекторной фазе воспаления (1), таких же мышей, получивших в острой фазе ингаляцию БТШ70 (2), сенсибилизированных (3) и интактных (4) мышей. Приведены средние значения ± m; n=4; ** – p<0.01. 20 Острая фаза воспаления характеризуется рекрутментом нейтрофилов из костного мозга в дыхательные пути. Этот процесс опосредуется циркуляцией в крови гуморальных факторов, выделяемых при ингаляции аллергена как структурными клетками, так и клетками иммунной системы, ассоциированными с дыхательными путями. Циркулирующие гуморальные факторы обеспечивают активацию процесса выхода нейтрофилов из костного мозга и их привлечение в легкие. Получая активирующие сигналы, нейтрофилы костного мозга находятся в более возбудимом физиологическом состоянии. Это проявляется, в том числе, в достоверно более высокой амплитуде окислительного взрыва, регистрируемого в случае нейтрофилов мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей, по сравнению с мышами, получавшими ингаляции PBS (рис. 9 а). Полученные данные коррелируют с литературными данными об увеличении возбудимости нейтрофилов при астме. Эффекторная фаза характеризуется практически полным исчезновением нейтрофилов в дыхательных путях, связанным с их гибелью путем апоптоза, некроза или нетоза. При этом в наших экспериментах амплитуда ответа нейтрофилов костного мозга мышей с индуцированной астмой на активатор снижена по сравнению с нейтрофилами как интактных, так и сенсибилизированных мышей (рис. 9 б). Такое изменение физиологического состояния нейтрофилов, по-видимому, связано с изменением набора циркулирующих в крови гуморальных регуляторов и молекулярных паттернов опасности, выделяемых поврежденными клетками дыхательных путей и иммунными клетками. Несмотря на то, что подобная регуляция направлена на снижение активности нейтрофилов для уменьшения повреждения собственных тканей в очаге воспаления, системное снижение противомикробной активности нейтрофилов способствует ослаблению иммунной защиты организма. Вероятно, продемонстрированный в наших экспериментах феномен может являться одним из определяющих факторов сопутствующих сезонных инфекций у астматиков. 21 В данном исследовании было продемонстрировано ингибирующее действие БТШ70 на процессы неапоптотической гибели нейтрофилов. При этом повышенное содержание нейтрофилов в БАС мышей, получавших БТШ70, не связано с изменением уровня нейтрофилов в костном мозге (он остается постоянным). Сопоставление этих данных позволяет предположить, что именно увеличение времени жизни нейтрофилов БАС, а не рекрутмент новых нейтрофилов из костного мозга, опосредует БТШ70-зависимое повышение уровня нейтрофилов в БАС мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей через 48 часов после последней ингаляции OVA относительно таких же мышей, получавших PBS. Это предположение также косвенно подтверждается тем фактом, что БТШ70 вызывает снижение концентрации в БАС IL-4 и IL-5, являющихся важными факторами, обеспечивающими рекрутмент и инфильтрацию в ткани не только эозинофилов, но и нейтрофилов. Помимо увеличения количества (приблизительно в 2 раза) и процентного содержания нейтрофилов в БАС мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей, БТШ70 оказывает достоверный эффект на инфильтрацию дыхательных путей эозинофилами. Так, концентрация эозинофилов в БАС мышей с OVA-индуцированной астмой через 48 часов после последней инъекции аллергена снижена более чем 2 раза в группе, получавшей БТШ70 относительно контрольных мышей. Мы полагаем, что протективное действие БТШ70 на нейтрофилы, вследствие которого более половины нейтрофилов, мигрировавших в дыхательные пути через 24 часа после инъекции OVA, остаются в легких на 48 часов, является одним из важных факторов, препятствующих росту числа эозинофилов в БАС (у мышей, не получивших БТШ70, уровень эозинофилов возрастает в 2 раза). Важными факторами регулирования количества эозинофилов безусловно являются провоспалительные цитокины IL-4, IL-5 и IL-13, концентрация которых также значительно снижается 22 у мышей с индуцированным аллергическим воспалением дыхательных путей, получивших БТШ70, по сравнению с контрольными группами, не получавшими белок. Известно, что недостаток нейтрофилов может к приводить развитию проаллергических Th-2 вместо характерного воспалительного Th1-ответа. При этом селективное удаление нейтрофилов отменяет развитие CD8+ Т-хеперных клеток, ответственных за развитие первого типа иммунного ответа. Мы полагаем, что введенный в острой фазе воспаления БТШ70 снижает смертность нейтрофилов посредством ограничения продукции этими клетками АФК. При этом антиоксидантное действие экзогенного БТШ70 обусловлено его взаимодействием с белками клеточной поверхности, приводящим к подавлению активности NADPH-оксидазы. Наиболее вероятной молекулярной мишенью БТШ70 является трансмембранная субъединица NADPH-оксидазы p22phox. Пролонгированное присутствие нейтрофилов в легких приводит к подавлению синтеза IL-4 и инфильтрации в дыхательные пути эозинофилов. Это прерывает положительную обратную связь в развитии аллергического воспаления дыхательных путей, где приток эозинофилов приводит к синтезу большего числа провоспалительных цитокинов, вызывающих рекрутмент и активацию новых эозинофилов. Таким образом, приток эозинофилов и синтез проаллергических цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13 супрессируется. При последующей элиминации нейтрофилов на 72 ч после последней ингаляции аллергена количество эозинофилов по-прежнему не увеличивается, т.к. концентрация активирующих факторов уже недостаточна для их рекрутмента. ВЫВОДЫ 1. С целью анализа иммуномодулирующих эффектов внеклеточного пула БТШ70 охарактеризована динамика развития аллергического воспаления дыхательных путей в мышиной модели овальбумин-индуцированной астмы. 2. Установлено, что интрафарингеальная ингаляция БТШ70 в острой фазе воспаления ограничивает приток эозинофилов в дыхательные пути в 23 эффекторной фазе, препятствует повышению уровней специфических IgA в лаважной жидкости и IgG1 и IgE в сыворотке периферической крови, а также снижает уровень проаллергических цитокинов – IL-4, IL-5 и IL-13 в бронхоальвеолярных смывах. 3. Продемонстрирована способность БТШ70 подавлять как спонтанную, так и индуцированную продукцию активных форм кислорода в модели «окислительного взрыва» фагоцитов. 4. Зарегистрированный антиоксидантный эффект БТШ70, по-видимому, может быть опосредован молекулярным взаимодействием этого протеина с p22phox субъединицей комплекса NADPH-оксидазы. 5. Ингибирующее действие БТШ70 на развитие аллергического воспаления в использованной модели сопровождается нормализацией продукции АФК нейтрофилами костного мозга и повышением жизнеспособности этих клеток в дыхательных путях, препятствующим росту числа эозинофилов в БАС. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Троянова Н.И., Постовская А.М., Сервули Е.А., Сапожников А.М., Шевченко М.А. Характеристика острой и эффекторной фазы аллергического воспаления дыхательных путей с целью подбора параметров для оценки регуляторных свойств БТШ70 // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9 (18), №2 (1). – С. 328-330. 2. Троянова Н.И., Шевченко М.А., Бойко А.А., Мирзоев Р.Р., Перцева М.А., Коваленко Е.И., Сапожников А.М. Модулирующий эффект внеклеточного пула БТШ70 на продукцию активных форм кислорода в популяциях фагоцитов // Биоорганическая химия. – 2015. – Т. 41, № 3. – С. 271-279. 3. Троянова Н.И., Шевченко М.А., Бойко А.А., Мирзоев Р.Р., Перцева М.А., Коваленко Е.И., Сапожников А.М. Внеклеточные белки теплового шока 70 кДа оказывают ингибирующий эффект на продукцию активных форм кислорода фагоцитами // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9 (18), №1. – С. 107-110. 24 4. Перцева М.А., Троянова Н.И., Мирзоев Р.Р., Шевченко М.А., Сапожников А.М. Контаминация БТШ70 бактериальным липополисахаридом подавляет ингибирующее действие этого протеина на продукцию фагоцитами активных форм кислорода // Материалы XXVII Зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – Москва. – 2015. – С. 97. 5. Троянова Н.И., Шевченко М.А., Бойко А.А., Мирзоев Р.Р., Перцева М.А., Коваленко Е.И., Сапожников А.М. Модулирующее действие внеклеточной формы БТШ70 на интенсивность продукции АФК фагоцитами // ActaNarurae. –2014. – №1. – С. 48. 6. Мирзоев Р.Р., Троянова Н.И., Болховитина Е.Л., Сапожников А.М., Шевченко М.А. Изменение продукции активных форм кислорода клетками костного мозга мышей на различных стадиях аллергического воспаления дыхательных путей // Материалы XXV Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – Москва. – 2013. – С. 91. 7. Троянова Н.И., Мирзоев Р.Р., Бойко А.А., Сапожников А.М. Влияние БТШ70 на продукцию АФК в культурах моноцитарных клеточных линий // Российский иммунологический журнал. – 2013. – Т. 7 (16), № 2-3. – С. 136. 8. Мирзоев Р.Р., Троянова Н.И., Болховитина Е.Л., Сапожников А.М., Шевченко М.А. Изменение продукции активных форм кислорода клетками костного мозга мышей на различных стадиях аллергического воспаления дыхательных путей // Материалы XXV Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – Москва. – 2013. – С. 91. 9. Троянова Н.И., Мирзоев Р.Р., Сапожников А.М. Исследование влияния БТШ70 на продукцию активных форм кислорода клетками иммунной системы // Материалы XXV Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – Москва. – 2013. – С. 92. 10. Troyanova N; Bolkhovitina E; Sapozhnikov A; Shevchenko M. Alteration of reactive oxygen species production in bone marrow neutrophils at the different stages of allergic airway inflammation // The Materials of EAACI 10th Winter School “Basic Immunology Research in Allergy and Clinical Immunology”. – Pichl. – 2013. – P. 24. 25 11. Shevchenko M.A., Bolkhovitina E.L., Servuli E.A., Troyanova N.I., Sapozhnikov A.M. The implication of extracellular Hsp70 in the natural regulation of allergic airway inflammation // The Materials of Allergy and Asthma. – Brugge. – 2013. – p. 26. 12. Зяблицин А.В., Алекперов Э.А., Бойко А.А., Клинкова А.В., Троянова Н.И., Сапожников А.М. Анализ механизмов неклассического пути секреции БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток // Иммунология. – 2012. – Т. 33, №1. – С. 49-50. 13. Streltsova M., Boyko A., Klinkova A., Troyanova N., Shustova O., Kovalenko E., Sapozhnikov A. Hsp70 is involved in different immune processes // Immunology. – 2012. – V. 137, I. suppl. s1. – Р. 254. 14. Троянова Н.И., Бойко А.А., Шевченко М.А., Коваленко Е.И., Сапожников А.М. Экспериментальная модель для изучения механизмов влияния БТШ70 на продукцию АФК клетками иммунной системы // Материалы XXIV Зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". – Москва. – 2012. – С. 66. 15. Servuli E., Troyanova N., Bolkhovitina E., Sapozhnikov A., Shevchenko M. Extracellular heat shock protein 70 inhibits impairment of airway neutrophils responses in induced allergic airway inflammation // Immunology. – 2012. – V. 137, I. suppl. s1. – p. 447. 16. Троянова Н.И., Мирзоев Р.Р., Сапожников А.М. Разработка экспериментальной модели для анализа влияния белков теплового шока 70 кДа на продукцию активных форм кислорода иммунокомпетентными клетками // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012. – №4 (41). – С. 172. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода БАС – бронхоальвеолярный смыв (лаваж) БСА – бычий сывороточный альбумин, V фракция БТШ70 – белок теплового шока 70 кДа DCF-DA – 2',7'-дихлорфлуоресцеин диацетат DPI – дифенилиодоний fMLP – N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин OVA – овальбумин PBS – фосфатный буфер PMA – форбол 12-миристат 13-ацетат 26
