Генерация перекиси водорода митохондриями
advertisement
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра биохимии Кареева Александра Владимировна ГЕНЕРАЦИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА МИТОХОНДРИЯМИ: ФЕРМЕНТЫ И ИХ АКТИВНОСТИ Дипломная работа Руководитель: кандидат биологических наук Гривенникова В. Г. Москва 2010 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................................................................ 3 ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................................. 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................ 5 ДЫХАНИЕ И АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА (АФК)....................................................................................... 5 ГЕНЕРАЦИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА МИТОХОНДРИЯМИ ..................................................................................... 7 ГЕНЕРАЦИЯ АФК В ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ.......................................................................................................... 9 МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ УДАЛЕНИЯ АФК ........................................................................................ 12 О НОВОЙ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ .................................................................................................... 14 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ ..................................................................................................... 17 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................................................... 18 ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ ............................................................................................................................. 18 Получение митохондрий из сердца крысы [42].......................................................................18 Получение митохондрий сердца быка [38] ..............................................................................19 Получение препаратов митохондриальных мембран и митохондриального матрикса ............................................................................................................................................................19 Выделение аммоний-чувствительной NADH:кислород-оксидоредуктазы (NADHоксидазы) из фракции митохондриального матрикса .........................................................19 АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ............................................................................................................................ 21 Определение концентрации белка...........................................................................................21 Измерение активности NADH-оксидазы по скорости образования перекиси водорода [39] .....................................................................................................................................................21 Измерение активности NADH-оксидазы в присутствии NADH-регенерирующей системы............................................................................................................................................22 Измерение скорости дыхания митохондрий...........................................................................22 Измерение генерации перекиси водорода митохондриями, обработанными аламетицином и ротеноном.......................................................................................................23 Измерение липоамидредуктазной активности [46] ...............................................................23 Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS (метод Лэммли [38]) ......23 РЕЗУЛЬТАТЫ ........................................................................................................................................... 24 ГЕНЕРАЦИЯ Н2О2 ИНТАКТНЫМИ МИТОХОНДРИЯМИ ........................................................................................ 24 ГЕНЕРАЦИЯ Н2О2 МИТОХОНДРИЯМИ, ОБРАБОТАННЫМИ АЛАМЕТИЦИНОМ И РОТЕНОНОМ .............................. 27 ПРОНИЦАЕМОСТЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ ДЛЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА ......................................... 29 ОБРАЗОВАНИЕ Н2О2 МЕМБРАННОЙ И РАСТВОРИМОЙ ФРАКЦИЯМИ МИТОХОНДРИЙ ...................................... 30 ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА NADH: О2-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО МАТРИКСА .................................................................................................................................................................... 33 ЗАВИСИМОСТЬ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ АКТИВАТОРА NH4CL .......................................... 34 ОЧИСТКА ФЕРМЕНТА МЕТОДОМ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА Q-СЕФАРОЗЕ .................................. 37 ИДЕНТИФИКАЦИЯ АММОНИЙ-ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ NADH:КИСЛОРОД-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ .............................. 38 СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ ИЗУЧАЕМОГО ФЕРМЕНТА И КОММЕРЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛДГ ................................. 39 ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НЕОЧИЩЕННОГО МИТОХОНДРИАЛЬНОГО МАТРИКСА НА КОЛОНКЕ С QСЕФАРОЗОЙ ................................................................................................................................................ 40 ГИДРОФОБНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКЕ С ФЕНИЛ-СЕФАРОЗОЙ ......................................................... 42 ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ ГЕНЕРАЦИИ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА ОЧИЩЕННЫМ ПРЕПАРАТОМ ДИГИДРОЛИПОИЛДЕГИДРОГЕНАЗЫ МИТОХОНДРИЙ СЕРДЦА БЫКА ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ NADH........................ 45 ИЗУЧЕНИЕ NADPH-ОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ........................................................................................... 46 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................................................ 49 ВЫВОДЫ................................................................................................................................................. 51 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................................... 52 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДГ – алкогольдегидрогеназа; АФК – активные формы кислорода; ДЛДГ – дигидролипоилдегидрогеназа; ПО – пероксидаза хрена; СДГ – сукцинатдегидрогеназа; СМЧ – субмитохондриальные частицы; CОД – супероксиддисмутаза; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; ADP – аденозиндифосфат; Amplex Red (AR) – 10-ацетил-3,7-дигидрофеноксазин; АТР – аденозинтрифосфат; FAD – флавинадениндинуклеотид; FMN – флавинмононуклеотид; FCCP – трифлурометоксикарбонилцианид фенигидразон; NADH – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный; NAD+ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный; NADPH – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; SDS – додецилсульфат натрия. 3 ВВЕДЕНИЕ Активные формы кислорода (АФК) (супероксид-радикал, перекись водорода, гидроксил-радикал) – продукты его неполного восстановления. Из-за своей высокой реакционноспособности они могут необратимо разрушать белки, липиды и нуклеиновые кислоты. В то же время они участвуют во многих естественных физиологических процессах (фагоцитоз, апоптоз, синтез тиреоидных гормонов, внутриклеточная сигнализация). Перекись водорода привлекает внимание исследователей тем, что, участвуя в нормальной жизнедеятельности клетки, она одновременно представляет угрозу для неё, так как при ее одноэлектронном восстановлении образуется самая опасная форма АФК – гидроксил-радикал. Грубая оценка показывает, что около 15–20% перекиси в печени образуется в митохондриях. Основным её источником здесь считают супероксидрадикал, образующийся в результате одноэлектронных «утечек» на кислород с низкопотенциальных редокс-компонентов дыхательной цепи. Главную роль в этом процессе отводят NADH:убихинон-оксидоредуктазе – дыхательному комплексу I. В лаборатории, где я выполняла дипломную работу, были получены данные, свидетельствующие о том, что в условиях, моделирующих физиологические, супероксидгенерирующая активность комплекса I сильно подавлена. Было предсказано, а после экспериментально показано, что в митохондриальном матриксе существует фермент, способный с высокими скоростями генерировать перекись водорода. В задачу этой работы входила количественная оценка вкладов комплекса I и аммоний-активируемой NADH:O2-оксидоредуктазы матрикса митохондрий в генерацию перекиси водорода митохондриями, а также изучение каталитических свойств этого ранее не изученного фермента. 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Дыхание и активные формы кислорода (АФК) Основная доля кислорода, потребляемого аэробными организмами, восстанавливается до воды в результате окисления электрон-транспортной цепью митохондрий NADH. В состав дыхательной цепи, которая расположена во внутренней мембране митохондрий, входят 4 белковых комплекса. Вместе они катализируют последовательную цепь реакций, в конечном итоге приводящих к запасанию энергии (рис. 1). В общем виде процесс можно описать следующим образом. Рис. 1. Схема окислительного фосфорилирования во внутренней мембране митохондрий [3]. Комплекс I (NADH:убихинон-оксидоредуктаза) окисляет NADH и передает электроны на мембранный убихинон. При окислении сукцината комплексом II (сукинат:убихинон-редуктаза) также происходит восстановление убихинона. Окисление убихинола и перенос электронов на цитохром с катализируется комплексом III (убихинол:цитохром с-редуктазой). Комплекс IV (цитохромоксидаза) окисляет 4 молекулы цитохрома с молекулярным кислородом. Окислительно-восстановительные 5 реакции, катализируемые комплексами I, III и IV, сопряжены с генерацией трансмембранного потенциала H+, Запасенная свободная энергия H+ используется комплексом V (ATP-синтетазой) для образования ATP из ADP и неорганического фосфата [1–3]. Ступенчатое восстановление кислорода осуществляется комплексом IV (цитохромоксидазой), при этом освобождения частично восстановленных интермедиатов в среду не происходит. Тем не менее, в клетке присутствуют и продукты неполного восстановления кислорода. Так называемые активные формы кислорода (АФК): супероксид-радикал и перекись водорода – это продукты одно- и двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода. К ним также относится и гидроксил-радикал, который представляет собой результат одноэлектронного восстановления перекиси водорода (или трехэлектронного восстановления молекулярного кислорода). АФК могут оказывать повреждающее воздействие на белки, липиды, нуклеиновые кислоты. Предполагают, что они, случайным образом повреждая ДНК и другие компоненты белок-синтезирующей системы клетки, способствуют накоплению «информационных нарушений» и приводят к старению [5-6]. Наиболее короткоживущее (время опасным его жизни из АФК является гидроксил-радикал. в клетке составляет 100 нс), Это очень реакционноспособное соединение может инициировать цепные радикальные реакции окисления липидов, приводящие к образованию липопероксидов, органических перекисей, которые, в свою очередь, могут выступать как ингибиторы ферментов, влиять на мембраносвязанные белки и на проницаемость мембран. Перекись водорода – относительно стабильное соединение, и не вызывает таких эффектов, однако может вызывать повреждения ДНК, такие как разрушение сахаро-фосфатного остова, хромосомные аберрации. Несмотря на потенциальную способность наносить вред клетке, АФК участвуют в её нормальной жизнедеятельности, в частности, Н2О2, супероксид-радикал и другие свободные радикалы принимают участие в клеточной сигнализации. Перекись водорода и супероксид-радикал присутствуют в клетке в стационарной концентрации (10-9–10-7 М и 10-12–10-10, соответственно), которая поддерживается за счёт их постоянного образования одними ферментами и разрушения другими. Ниже кратко суммированы основные сведения, касающиеся митохондриальных генераторов АФК и ферментов, участвующих в их утилизации. 6 Генерация перекиси водорода митохондриями К генерации H2O2 в клетке способны митохондрии, микросомы, пероксисомы и цитоплазматические ферменты и их вклад в суммарное образование перекиси печенью оценен Чансом и сотр. как 15%, 45%, 35%, 5%, соответственно [4]. На сегодняшний день известно несколько митохондриальных ферментов, для которых была показана способность генерировать АФК [8]. Моноаминооксидазы А и В, расположенные во внешней митохондриальной мембране, катализируют окислительное дезаминирование различных аминов с образованием в качестве продукта реакции перекиси водорода. Дегидрогеназа дигидрооротата, расположенная на внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий, окисляет дигидрооротат до оротата, восстанавливая убихинон. Фермент способен окислять дигидрооротат кислородом до H2O2. Дегидрогеназа α-глицерофосфата расположена на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны и содержит FAD в качестве кофактора. Этот фермент катализирует окисление α-глицерофосфата до дигидроксиацетонфосфата убихиноном. Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, комплекс II), в состав которой входит ковалентносвязанный FAD и три железо-серных кластера – интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Фермент окисляет сукцинат до фумарата убихинононом. Встроенная в липосомы СДГ способна генерировать АФК при окислении сукцината кислородом. В СМЧ эта активность подавляется ингибитором СДГ – карбоксином. Им же, однако, подавляется и образование АФК, индуцированное антимицином (см. ниже), и генерация АФК при окислении NADH. Так как эти две реакции считаются независимыми от СДГ, то такой эффект карбоксина заставляет усомниться в способности СДГ генерировать АФК в митохондриях. Аконитаза локализована в митохондриальном матриксе. Она катализирует изомеризацию цитрата в изоцитрат в цикле Кребса. Аконитаза содержит железосерный кластер, который может окисляться под действием супероксид-аниона. При этом фермент инактивируется, а высвобожденный Fe2+ может участвовать в генерации гидроксилрадикала (см. схему в правой части рис. 3). α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс локализован в матриксе митохондрий. Он состоит из множества копий трёх ферментов: дегидрогеназного компонента, дигидролипоамидтрансферазного компонента и липоамиддегидрогеназы. Этот комплекс обеспечивает окисление α-кетоглутарата до сукцинил-КоА и восстановление NAD+ матрикса. В отсутствие других отличных от кислорода акцепторов электронов комплекс 7 способен генерировать одновременно супероксид-радикал и перекись водорода, окисляя α-кетоглутарат [18-20]. В присутствии α-кетоглутарата и кофермента А комплекс генерирует супероксид-радикал со скоростью ~1 нмоль/мин*мг, что сравнимо со скоростью генерации супероксида дыхательной цепью (0,3–6 нмоль/мин*мг) [18]. Кроме того, скорость генерации АФК α-кетоглутаратдегидрогеназным комплексом возрастает при увеличении соотношения NADH/NAD+ , т.е. в тех условиях, когда реокисление NADH дыхательной цепью подавлено [20]. Изолированная липоамиддегидрогеназа также обладает этой активностью. Липоамиддегидрогеназа (дигидролипоилдегидрогеназа, ДЛДГ) – это флавинзависимая оксидоредуктаза, имеющая в своем составе молекулу FAD и редокс-активную дисульфидную связь [21], и функционирующая в составе мультиферментных комплексов. Однако липоамиддегидрогеназа обнаружена в митохондриальном матриксе не только в виде комплексов, но и в свободном виде [22]. В митохондриальном матриксе гомодимер ДЛДГ функционирует как Е3-компонент в составе дегидрогеназ α-кетокислот, дегидрогеназы разветвленных аминокислот и в системе расщепления глицина [23]. В составе этих комплексов ДЛДГ катализирует реокисление связанного с белком остатка липоамида в присутствии NAD+ в качестве акцептора электронов. Кроме того, ДЛДГ обладает диафоразной активностью – способна катализировать окисление NADH искусственными акцепторами электронов: кислородом [24-25], убихиноном [26], ионами железа [27], оксидом азота [28]. Если ДЛДГ функционирует как диафораза и использует в качестве акцептора кислород, то основным продуктом реакции является перекись водорода. Супероксид-радикал образуется в соотношении 1:9 по отношению к перекиси [24]. При рН 6,8 скорость генерации Н2О2 дигидролипоилдегирогеназой составляет порядка 1 мкмоль/мин*мг [24]. Олигомерная структура ДЛДГ в зависимости от рН может изменяться от димерной к моно- или тетра-мерной, и эти изменения кореллируют с изменением активности: фермент катализирует липоамидоксидазную активность в случае димера и тетрамера и диафоразную активность – в случае и олигомерной, и мономерной форм. При закислении митохондриального матрикса олигомеры диссоциируют, дегидрогеназная активность уменьшается, а диафоразная активность увеличивается [29]. В последнее время в литературе появилось много данных о митохондриальных ферментах, способных генерировать АФК. Однако основную роль в этом процессе в митохондриях отводят ферментам дыхательной цепи. В пользу таких рассуждений приводят такой факт. Генерация перекиси водорода чувствительна к состоянию дыхательной цепи. Если в митохондриях присутствуют субстраты окисления, кислород и 8 ADP, дыхание активируется, так как электрохимический градиент постоянно тратится комплексом V на образование ATP (состояние 3 по Чансу). При этом генерация перекиси не происходит (тот же эффект достигается при добавлении разобщителей). Когда ADP исчерпывается (состояние 4 по Чансу), дыхание замедляется, уровень восстановленности NADH увеличивается и происходит генерация Н2О2 [17]. Хотя митохондрии содержат ферменты, способные образовывать непосредственно перекись водорода, например оксидазы аминокислот, считают, что основным источником (предшественником) перекиси водорода в митохондриях является супероксид-радикал. Генерация АФК в дыхательной цепи Рассмотрим более подробно те компоненты дыхательной цепи, которые считают основными источниками супероксид-радикала. Комплекс I (NADH:убихинон–оксидоредуктаза) [31-32] катализирует окисление NADH убихиноном, сопряженное с векторным переносом четырёх протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. Комплекс I состоит из 45 субъединиц, объединённых в два домена: гидрофильный, обращённый в матрикс, и гидрофобный, погружённый в бислойную мембрану. В состав комплекса входят FMN, 8–9 железосерных кластеров и прочно связанный убихинон. Гидрофильный домен содержит центры связывания пиридиннуклеотидов и большинство редокс компонентов. В гидрофобном домене связывается убихинон. Помимо NADH:убихинон-оксидоредуктазной активности (см. схему на рис. 2, путь 1 + 2) комплекс I обладает и другими активностями. Если митохондриальная мембрана сопряжена, то в присутствии сукцината комплекс II восстанавливает убихинон, а комплекс I обеспечивает обратный перенос электронов от убихинола на NAD+ (путь 2 + 3) и для преодоления энергетического барьера использует трансмембранный потенциал. Кроме того, он может катализировать трансгидрогеназную реакцию (путь 1 + 3) [33] и др. Комплекс I считают главным компонентом дыхательной цепи, продуцирующим супероксид-радикал, и в целом – основным источником продукции АФК в митохондриях. Супероксид-радикал образуется в комплексе I при окислении NADH (путь 1 + 3). Эта активность стимулируется ротеноном, который блокирует перенос электронов на убихинон. Первичным акцептором электронов от NADH считают FMN, с которого электроны могут переноситься во второй центр связывания пиридиннуклеотидов (путь 3), 9 Рис. 2. Генерация супероксид-радикала комплексом I. Заштрихованная часть – внутренняя мембрана митохондрий. Некоторые авторы [1, 31, 35] считают, что фермент содержит два центра связывания пиридиннуклеотидов, один из которых функционирует в прямом переносе электронов от NADH на убихинон (путь 1 + 2), а во втором центре происходит восстановление NAD+ в реакции обратного переноса электронов (путь 2 + 3) или образование супероксид-радикала. Серой стрелкой показано тормозящее действие NADH на генерацию супероксид-радикала [35]. который функционирует в реакции обратного переноса электронов. В этом центре происходит восстановление кислорода с образованием супероксид-радикала. Кроме того, при окислении сукцината супероксид может образовываться в реакции обратного переноса электронов. Скорость этого процесса выше, чем в присутствии NADH. Генерация супероксида в этом случае ингибируется разобщителями (в присутствии которых обратный перенос невозможен) и ротеноном (который препятствует переносу электронов с убихинола на FMN комплекса I). Максимальная регистрируемая скорость генерации супероксида комплексом I в составе субмитохондриальных частиц составляет ~1,2 нмоль/мин*мг. Эта величина составляет не более 2% от общего количества кислорода, подвергающегося в таких условиях четырёхэлектронному восстановлению до воды. Недавно было показано, что помимо супероксид-радикала комплекс I способен образовывать и перекись водорода [34]. Комплекс III (убихинол: цитохром с–редуктаза) катализирует окисление убихинола цитохромом с, сопряженное с векторным переносом электронов из матрикса в межмембранное пространство. Механизм этой реакции носит название Q-цикла (рис. 3). Донором электронов для комплекса III служит восстановленный убихинон (QH2), а акцептором электронов – цитохром с. Цикл начинается с окисления убихинола и 10 восстановления железа в геме b(I) в Qо-центре комплекса III. Реакция сопровождается освобождением первого протона в межмембранное пространство. Электрон от гема b(I) переносится через мембрану к железу гема b(II), а семихинон (HQ●) отдает второй электрон железосерному белку Риске (Fe-S) и на этой стадии вновь происходит освобождение протона в межмембранное пространство. Электрон с белка Риске переносится на цитохром с1 и затем на цитохром с. Окисленный убихинон (Q) диффундирует на противоположную сторону мембраны в Qi-сайт, где получает электрон от гема b(II), протон из водной фазы матрикса и превращается в семихинон (●QH). Рис. 3. Схема функционирования комплекса III [30]. Пояснения в тексте. Qo-центр расположен со стороны межмембранного пространства, Qi-центр – со стороны матрикса. Антимицин А блокирует перенос электронов от b(II) на семихинон ●QH. Получив второй электрон от комплекса I (или комплекса II) и второй протон из водной среды, семихинон превращается в убихинол, и цикл повторяется снова [30]. Источником супероксид-радикала в комплексе III считают нестабильный радикал семихинона в Qо-сайте, генерация супероксида активируется антимицином А, который 11 блокирует перенос электронов от гема b(II) на семихинон (●QH) в Qi-сайте. В отсутствие антимицина супероксид в комплексе III практически не образуется [8]. Митохондриальные системы удаления АФК Супероксид-радикал и перекись водорода являются естественными метаболитами, которые в низких концентрациях содержатся в клетках (10-12-10-10 М для супероксида и 10-9-10-7 М для Н2О2) [4,16]. В митохондриях существует несколько уровней защиты от АФК, включающих ферментативные и неферментативные антиоксиданты (рис. 4). Во-первых, есть системы, защищающие мембранные липиды от перекисного окисления. Это α-токоферол и глутатионпероксидаза гидроперекисей фосфолипидов. αТокоферол восстанавливает радикалы липидов и регенерируется восстановленным мембранным убихиноном или аскорбиновой кислотой [8]. Глутатионпероксидаза неселективна в отношении субстратов и может восстанавливать гидроперекиси фосфолипидов, Н2О2, пероксиды холестерина, перекись тимина. [9]. Глутатионпероксидаза содержит селеноцистеин в активном центре и для восстановления Н2О2 до Н2О использует восстановленный глутатион. Она участвует в защите клеток от острого окислительного стресса, но не является незаменимой в защите против хронической фоновой генерации митохондриальных АФК [8, 15]. Марганец-содержащая супероксиддисмутаза локализована исключительно в митохондриальном матриксе, содержит Mn и железо в качестве кофакторов и катализирует реакцию дисмутации двух молекул супероксид-радикала с образованием молекулы кислорода и Н2О2 [10]. Цитохром с может восстанавливаться как дыхательной цепью, так и супероксидрадикалом, эффективно устраняя его из митохондрий [10]. Окисление цитохрома с происходит при участии митохондриальной цитохром с оксидазы. Следующий уровень защиты – удаление токсичной перекиси водорода, образующейся при дисмутации супероксида, его обеспечивают каталаза, глутатион, глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза. Каталаза – это гомотетрамер, каждый мономер которого связывает один гем. Этот фермент катализирует превращение Н2О2 в Н2О и О2. Величина Км для Н2О2 составляет порядка 10 мМ, поэтому долгое время считали, что основной вклад в удаление перекиси водорода в митохондриях вносит глутатионпероксидаза, а роль каталазы сводится к 12 удалению избытка перекиси в пероксисомах. Однако в последнее время было показано, что каталаза вносит существенный вклад в удаление Н2О2 и в митохондриях [13]. Глутатион находится в митохондриях в концентрации 2-14 мМ, и около 90% представлено восстановленной формой. Восстановленный глутатион может или сам по себе служить ловушкой для супероксида и гидроксил-радикала [14], или функционировать в качестве субстрата-донора для ферментов, обеспечивающих детоксикацию АФК. Глутатионредуктаза катализирует восстановление окисленного глутатиона внутримитохондриальным NADPH и таким образом поддерживает высокое соотношение восстановленного и окисленного глутатиона. Рис. 4. Антиоксидантные системы и окислительный стресс. В левой части схемы представлены основные реакции метаболизма АФК, в скобках указана локализация ферментов. Активность глутатионредуктазы регулируется уровнем NADPH, который образуется в цитоплазме на первом этапе пентозофосфатного пути. Когда скорость генерации супероксид-радикала становится больше, чем скорость работы антиоксидантных систем, супероксид может спонтанно вступать в реакции, приводящие, в частности, к образованию гидроксил-радикала (правая часть схемы) (адаптировано из [5]). Последнее время в литературе увеличивается число работ, опровергающих изначальное представление о том, что АФК являются «непреложным злом» (цит. по [8]). Показано, что они принимают участие в таких естественных физиологических процессах, как фагоцитоз, синтез тиреоидных гормонов, апоптоз и т.д. Предполагают, что Н2О2 может принимать участие в сигнальных путях клетки, выступая в роли вторичного посредника. 13 Таким образом, перекись водорода (и супероксид-радикал) для клетки имеет двойное значение. С одной стороны, эти соединения важны для её нормального функционирования как участники некоторых важных внутриклеточных процессов. С другой – они являются потенциальным источником чрезвычайно опасного гидроксилрадикала, тем более что в клетке существует большое количество одноэлектронных восстановителей. О новой каталитической активности Как уже было сказано выше, в настоящее время считают, что АФК играют важную роль в поддержании нормального физиологического состояния и/или развития патологий. Что касается генерации АФК дыхательной цепью, то в большинстве работ, посвященных этой проблеме, полагают, что именно комплекс I – главный компонент в митохондриях, продуцирующий супероксид-радикал. В нашей лаборатории последнее предположение было поставлено под сомнение по нескольким причинам: Во-первых, было показано, что скорость генерации супероксид-радикала линейно (без насыщения) зависит от концентрации кислорода [36]. Это указывает на то, что в комплексе I, скорее всего, отсутствует специфическое место связывания кислорода и что генерация супероксида представляет собой неконтролируемую «утечку» электронов от низкопотенциальных доноров (кофакторов фермента) на высокопотенциальный акцептор – кислород. Маловероятно, чтобы функционально важная реакция протекала бы за счет «утечек», и если АФК действительно принимают участие в сигнальных путях клетки, то это предполагает жесткий контроль над их образованием. Во-вторых, было показано, что высокие концентрации NADH и даже низкие концентрации NAD+ предотвращают образование супероксид-радикала [35]. Между тем общая концентрация пиридиннуклеотидов (NAD(P)+ + NAD(P)H) в матриксе митохондрий составляет около 10-2 М [8], а это означает, что в интактных митохондриях комплекс I не способен катализировать образование супероксида. На основании этих фактов была сформулирована гипотеза: за генерацию супероксид-радикала (с последующим образованием перекиси водорода) ответствен специальный NADH(NADPH)-зависимый фермент митохондриального матрикса, а участие в этом процессе дыхательной цепи, в частности, комплекса I, сводится только к регулированию в матриксе соотношения NAD+(NADP+)/NADH(NADPH) [35]. Прямые опыты подтвердили эту гипотезу. В результате экспериментов, описанных ниже, в матриксе митохондрий была обнаружена новая каталитическая активность – аммоний-чувствительное NADH-зависимое образование перекиси водорода [37]. 14 Следует отметить, что ингибирующее влияние NADH на генерацию супероксида было показано на препарате вывернутых субмитохондриальных частиц (СМЧ) [35], в которых гидрофильная часть комплекса I, содержащая нуклеотид-связывающие центры, обращена в окружающий раствор. Между тем в матриксе интактных митохондрий комплекс I окружен концентрированным раствором белков и низкомолекулярных компонентов, и это может влиять на его свойства, в том числе и на чувствительность генерации супероксид-радикала к высоким концентрациям пиридиннуклеотидов. Поэтому аналогичные эксперименты были проведены на митохондриях, пермеабилизованных аламетицином [37]. Аламетицин – это каналообразующий антибиотик, который в определенной концентрации вызывает появление проницаемости внутренней мембраны митохондрий только для низкомолекулярных соединений, при этом крупные молекулы (например, белки) остаются в матриксе митохондрий [45]. Рис. 5. Зависимость скорости образования Н2О2 в присутствии СОД от NADH, катализируемой вывернутыми СМЧ (А) и митохондриями, пермеабилизованными аламетицином (Б) (цит. по [37]). Так как в матриксе митохондрий находится высокоактивная супероксиддисмутаза, в этих экспериментах изучали образование перекиси водорода, а не супероксид-радикала. Оказалось, что в митохондриях NADH ингибирует генерацию перекиси водорода в меньшей степени, чем в СМЧ (рис. 5). Кроме того, было обнаружено, что эта активность ~ в 5 раз активируется ионами аммония. Такой результат мог либо подтверждать предположение о том, что в физиологических условиях комплекс I всё-таки может генерировать супероксид, либо 15 указывать на существование фермента, осуществляющего аммоний-чувствительную NADH-зависимую генерацию перекиси, которая не ингибируется высокими концентрациями NADH. Чтобы проверить эту гипотезу, опыт провели в присутствии NADH-OH – специфического ингибитора NADH-связывающего центра комплекса I. В таких условиях NADH-оксидазная активность комплекса I была подавлена практически полностью, однако генерация перекиси сохранялась на 40% и активировалась ионами аммония уже в 9 раз (рис. 6). Когда вместо митохондрий использовали белковую фракцию митохондриального матрикса, полученную после освобождения от мембран ультрацентрифугированием, то также обнаружили аммоний-чувствительную NADHзависимую генерацию перекиси, но с более высокими удельными активностями. Рис. 6. NADH-зависимая генерация Н2О2 пермеабилизованными митохондриями. Цифры на кривых обозначают скорости образования Н2О2 в нмоль/мин на мг белка. (А) Активность измеряли в присутствии 5 мкм ротенона. (Б) Пермеабилизованные митохондрии преинкубировали с 50 нМ NADH-OH в течение 1 мин. Комплекс I при этом полностью терял свою активность [37]. Таким образом, в митохондриальном матриксе был обнаружен фермент, который окисляет NADH и генерирует H2O2, причем скорость этой реакции превышает максимальную скорость генерации супероксида комплексом I в ~3 раза, в ~15 раз активируется ионами аммония в миллимолярных концентрациях (Ка ~ 4мМ) и не ингибируется 1 мМ NADH. Оставалось неизвестным, является ли фермент, катализирующий аммонийчувствительное NADH-зависимое образование перекиси водорода (далее в тексте мы будем называть его NADH-оксидазой), новым и ранее неизученным, или это новая каталитическая активность уже известного белка матрикса. 16 ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель этого исследования заключается в том, чтобы выяснить, какой фермент митохондриального матрикса катализирует новую каталитическую активность, NADHзависимое стимулируемое аммонием образование перекиси водорода. Чтобы ответить на этот вопрос, нужно получить препарат белка в гомогенном состоянии и идентифицировать его, а также изучить каталитические свойства этого фермента. Конкретные задачи этой работы формулируются следующим образом: 1. Изучить генерацию Н2О2 интактными митохондриями. 2. Количественно определить вклад комплекса I и NADH:О2-оксидоредуктазы, стимулируемой аммонием, в генерацию Н2О2 в митохондриях. 3. Получить гомогенный препарат NADH:О2-оксидоредуктазы, аммонием, и охарактеризовать его свойства. 17 стимулируемой МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Препаративные методы Получение митохондрий из сердца крысы [42] Все процедуры проводили при температуре от 0 до +4оС. Трех крыс декапитировали и извлекали сердца, обсушивали их на фильтровальной бумаге и дважды промывали в среде выделения (0,3 М сахароза, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 0,2мМ ЭГТА), охлажденной в ледяной бане с солью до появления первых кристаллов льда. Сердца измельчали ножницами на чашке Петри, затем продавливали через металлическую пластину с небольшими отверстиями с помощью пресса. Полученный фарш переносили на капроновый фильтр, помещенный в стеклянную воронку, и промывали средой выделения до обесцвечивания промывных вод. Затем фарш помещали в стакан и добавляли к нему 10 мл среды выделения. При постоянном перемешивании на магнитной мешалке к фаршу добавляли 0,5 мл раствора трипсина, содержащего 2,5 мг трипсина в 1 мл 1 мМ HCl, и инкубировали в течение 15 мин. За это время, на 4-ой и 9-ой минутах, суспензию вручную гомогенизировали, переносили в другой стакан и продолжали перемешивание. По истечении 15 мин, к гомогенату добавляли 6,5 мг ингибитора трипсина, растворенного в 10 мл среды выделения, содержащей БСА (1 мг/мл). Смесь перемешивали в течение 1 мин, затем гомогенизировали в большом стеклянном гомогенизаторе Поттера в течение 1-2 минут при напряжении 50-70 В. К гомогенату приливали 20 мл среды выделения и центрифугировали 15 мин при 600 g (2500 об/мин) на центрифуге «Beckman» (ротор JA-20). Осадок отбрасывали, а супернатант переливали в другой центрифужный стакан и центрифугировали 15 мин при 8500 g. Супернатант отбрасывали, а осадок трижды ополаскивали 1 мл среды выделения, содержащей БСА (1 мг/мл), стараясь освободиться от белой полосы вокруг коричневого осадка митохондрий. Затем осадок суспендировали вручную в маленьком гомогенизаторе в 1 мл среды выделения без БСА, переносили в центрифужный стакан и добавляли 20 мл среды выделения. Центрифугировали 15 мин при 8500 g. Супернатант отбрасывали, осадок суспендировали в 600 мкл среды выделения. Суспензию митохондрий во время экспериментов хранили на холоду не более 7 часов. 18 Получение митохондрий сердца быка [38] Митохондрии сердца быка получали по стандартной методике, принятой в нашей лаборатории [38]. Полученный препарат суспендировали в 0,25 М сахарозе и хранили при -18оС. Получение препаратов митохондриальных мембран и митохондриального матрикса Препарат митохондрий сердца быка размораживали и разводили раствором 0,25 М сахарозы до концентрации белка 30 мг/мл. После этого суспензию разбавили ещё раз, но уже бидистиллированной водой, до конечной концентрации 20 мг белка/мл. Затем добавляли нейтрализованный раствор ЭДТА-КОН до конечной концентрации 1 мМ. В течение 20 минут суспензию митохондрий деаэрировали в токе аргона для удаления кислорода из среды и для того, чтобы избежать процессов перекисного окисления липидов мембран в получаемом препарате. При постоянном перемешивании pH суспензии доводили до 8,6 с помощью 1 М NH4OH. С помощью ультразвукового дезинтегратора “Soniprep 150-MSE” препарат митохондрий озвучивали 5 раз по 30 секунд с перерывами в 1 минуту. Процесс озвучивания проводили на льду в атмосфере аргона. Неразрушенные митохондрии отделяли с помощью центрифугирования при 26 тыс. g в течение 15 минут (центрифуга “Beckman”, ротор JA-20, 0С). Осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали при 105 тыс. g в течение 1 часа при 0оС. Полученный осадок использовали для дальнейшего получения препарата субмитохондриальных частиц [43], а из супернатанта, представляющего собой суммарный препарат белков митохондриального матрикса, выделяли аммоний-чувствительную NADH:кислородоксидоредуктазу (NADH-оксидазу). Выделение аммоний‐чувствительной NADH:кислород‐оксидоредуктазы (NADH‐оксидазы) из фракции митохондриального матрикса Для того чтобы освободиться от остатков СМЧ и обломков митохондриальных мембран, препарат матрикса подвергали ультрацентрифугированию при 200 тыс. g в течение 60 минут. Для очистки NADH-оксидазы мы использовали несколько способов: 1. Кислое осаждение использовали для удаления из препарата мелких обломков мембран. К препарату матрикса добавляли Tris-HCl буфер (рН 7,6) до конечной концентрации 15 мМ. Затем доводили рН матрикса до 6,0 (1 N CH3COOH), полученный помутневший раствор центрифугировали в течение 60 мин при 15000 g. Осадок отбрасывали, а рН супернатанта доводили до 7,6 с помощью 1 М КОН и сохраняли. 19 2. Высаливание сульфатом аммония. К матриксу или к частично очищенному препарату фермента добавляли сухой (NH4)2SO4 до степени насыщения 30%. После 20 мин инкубации помутневший раствор центрифугировали (20 мин, 10000g), осадок отбрасывали. Супернатант диализовали против 1 л 15 мМ Tris-HCl буфера (рН 7,6), содержащего 0,1 мМ ЭДТА (4 смены). 3. Термообработка. Препарат фермента подвергали тепловой обработке в течение 20 мин при 60оС. Полученный мутный раствор охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали (20 мин, 10000g при 4оС). Осадок отбрасывали, а супернатант сохраняли для дальнейшей очистки. Стадии 1–3 применяли в различных комбинациях, чтобы достичь лучшего выхода и самой высокой активности фермента. Дополнительные стадии включали два типа хроматографии. 4. Ионообменная хроматография на колонке с Q-сефарозой. Колонку с Qсефарозой (V=5 мл) уравновешивали 15 мМ трис-ацетатным буфером (рН 7,6), содержавшим 0,1 мМ ЭДТА. На колонку наносили 28 мл исходного («нативного») матрикса или матрикса, прогретого при 60оС в течение 20 минут. Препарат предварительно разводили водой 1:2. Скорость элюции – 3 мл/мин. После того, как белок был пропущен через колонку, колонку промывали 4 объемами (20 мл) того же буфера. Затем элюцию проводили градиентом NaCl (0-400 мМ) в 12 объемах колонки (60 мл). Фракции белка, не связавшегося с носителем, собирали по 3 мл, а фракции с элюированным белком – по 1 мл. 5. Гидрофобная хроматография на колонке с фенил-сефарозой. Колонку с фенил-сефарозой (V=5 мл) уравновешивали 30 мМ трис-ацетатным буфером (рН 8,0), содержавшим 0,1 мМ ЭДТА и 1,8 М сульфат аммония (72,6 г/300 мл, ~ 40%). На колонку наносили 30 мл фермента, очищенного на Q-сефарозе, к которому предварительно добавили 7,3 г сульфата аммония. Скорость элюции – 1,5 мл/мин. После того, как раствор был пропущен через колонку, колонку промывали 4 объемами (20 мл) того же буфера. Затем элюцию проводили обратным градиентом сульфата аммония (40– 20%) в том же буфере в 7 объемах колонки (35 мл), а затем градиентом сульфата аммония (20–0%) в том же буфере в 10 объемах колонки (50 мл). Фракции белка, не связавшегося с носителем, собирали по 3 мл, а фракции с элюированным белком – по 1 мл. 20 Аналитические методы Определение концентрации белка Концентрацию белка определяли либо по методу Лоури (чувствительность метода 0–100 мкг белка в пробе) [38], либо с биуретовым реактивом (чувствительность метода от 0,2 до 2 мг белка в пробе объемом 1 мл) [38]. Измерение активности NADH‐оксидазы по скорости образования перекиси водорода [39] За реакцией следили по увеличению оптического поглощения при 572 нм (мМ=54), которое сопровождает появление резоруфина, образующегося при окислении Amplex Red перекисью водорода H2O2 в присутствии пероксидазы хрена со стехиометрией 1:1 (рис. 7): COCH3 H2O + 1 /2 O2 H2O2 N N пероксидаза O HO OH HO O O резоруфин Amplex Red Рис. 7. Схема реакции ферментативного окисления Аmplex Red перекисью водорода. Мы убедились в том, что в присутствии 20 мкМ Amplex Red величина оптического поглощения при 572 нм линейно зависит от концентрации Н2О2 в диапазоне концентраций от 5 до 20 мкМ (рис. 8). 1,6 А572 1,2 0,8 0,4 0 0 5 10 15 Н2О2, мкМ 20 25 Рис. 8. Линейная зависимость ΔА572 от концентрации Н2О2 в среде с 20 мкМ Amplex Red. 21 Измерение активности митохондриальных препаратов проводили при 30оС в среде, содержавшей 5 мМ KH2PO4, рН 7,5, 10 мМ KCl, 0,25 М сахарозу, 0,1 мМ ЭДТА, ПО (2 ед/мл), СОД (6 ед/мл) и 100 мкМ NADH. При измерении активности интактных митохондрий использовали двухволновой режим регистрации (572-600 нм), чтобы исключить влияние оптических эффектов, связанных с набуханием митохондрий. Измерение активности растворимых препаратов фермента проводили при 30оС в среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 50 мМ Tris-HCl буфер, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА, ПО (2 ед/мл), СОД (6 ед/мл) и 100 мкМ NADH. Концентрация NADH-оксидазы в среде измерения составляла около 10 мкг/мл. Измерение активности NADH‐оксидазы в присутствии NADH‐ регенерирующей системы За реакцией следили по появлению Н2О2 (см. раздел Измерение активности NADH- оксидазы по скорости алкогольдегидрогеназы образования (АДГ), этилового перекиси спирта и водорода) в семикарбазида, присутствии связывающего образующийся ацетальдегид. На рисунке 9 изображена схема сопряженных реакций, благодаря которым концентрация NADH в среде измерения остаётся на постоянном уровне. O2 NADH CH3C NAD+ CH3 O семикарбазид АДГ NADH-оксидаза H2O2 H2O H N NH NH2 O C2H5OH Рис. 9. Схема сопряженных реакций, катализируемых NADH-оксидазой и АДГ. Измерения проводили при 30оС в среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 50 мМ Tris- HCl буфер, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА, ПО (2 ед/мл), СОД (6 ед/мл), NADPH (1 мМ или 0,1 мМ), 30 мМ NH4Cl, 0,45 мг/мл АДГ, 100 мМ С2Н5ОН и 10 мМ семикарбазид. Измерение скорости дыхания митохондрий Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом с помощью закрытого электрода Кларка по уменьшению концентрации кислорода в среде измерения [44]. Объем полярографической кюветы был равен 1,3 мл. Измерения активности 22 проводили при 30оС в среде, содержавшей 5 мМ KH2PO4, 10 мМ KCl, рН 7,5, 0,25 М сахарозу и 0,1 мМ ЭДТА. Концентрация субстратов дыхания (сукцината, глутамата и малата) в среде измерения составляла 5 мМ. Для измерения дыхательного контроля в среду добавляли 400 мкМ ADP. Приблизительная концентрация митохондрий составляла 1 мг/мл среды измерения. Измерение генерации перекиси водорода митохондриями, обработанными аламетицином и ротеноном Для того чтобы убрать барьеры проницаемости внутренней мембраны митохондрий для низкомолекулярных соединений (например, для NADH), митохондрии (25 мкг/мл) преинкубировали в среде, содержавшей 5 мМ KH2PO4, рН 7,5, 10 мМ KCl, 0,25 М сахарозу и 0,1 мМ ЭДТА, в присутствии аламетицина (30 мкг/мл), 3 мМ MgCl2 и 5 мкМ ротенона [45]. После этого в среду измерения вносили Amplex Red, ПО и СОД (см. раздел Измерение активности NADH-оксидазы по скорости образования перекиси водорода) и начинали регистрацию образования перекиси водорода после добавления NADH (50 мкМ). Через 1–2 мин после начала регистрации в среду измерения активности вносили 30 мМ NH4Cl. Измерение липоамидредуктазной активности [46] За реакцией следили по уменьшению оптического поглощения при 340 нм в результате окисления NADH. Измерение активности проводили при 30ОС в среде, содержавшей 100 мМ КН2РО4, рН 7,6, и 3,4 мМ ЭДТА, в присутствии 1 мМ липоамида, 100 мкМ NADH и 2 мг/мл БСА. Концентрация NADH-оксидазы составляла около 10 мкг/мл. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS (метод Лэммли [38]) Электрофорез проводили по стандартной методике в 12,5% разделяющем геле. В качестве стандартов использовали набор метчиков фирмы “Sigma” с молекулярными массами: 14,2 кДа, 20,1 кДа, 24 кДа, 29 кДа, 36 кДа, 45 кДа и 66 кДа. 23 РЕЗУЛЬТАТЫ Генерация Н2О2 интактными митохондриями В митохондриях образуется около 15% Н2О2, приходящейся на клетку1 [4]. Мы решили измерить скорость генерации Н2О2 интактными митохондриями сердца крысы и оценить соотношение одно- и двухэлектронного восстановления О2 (образование АФК: супероксида и Н2О2), с одной стороны, и основной реакции, катализируемой дыхательной цепью (четырехэлектронное восстановление О2 с образованием Н2О). Кроме того, нас интересовало, какой вклад в образование перекиси водорода дает комплекс I, который до недавнего времени считали основным источником АФК в митохондриях; а также открытый в нашей лаборатории фермент матрикса митохондрий, катализирующий стимулируемую аммонием генерацию Н2О2 при окислении NADH. Для этого мы получили препарат митохондрий из сердца крысы и измерили скорости дыхания в присутствии различных субстратов (таблица 1). Скорость дыхания при сопряженном окислении сукцината и малата в присутствии глутамата составляла около 80 и 35 натом О/мин*мг, соответственно. Добавление ADP увеличивало скорости дыхания до 285 и 245 натом О/мин*мг, соответственно. а Таблица 1. Скорости дыхания митохондрий в присутствии различных субстратов дыхания . Субстрат дыханияб Скорость дыхания (натом О/мин*мг белка) Состояние 4 (сопряженное дыхание) Состояние 3 (+ ADP 400 мкМ) Сукцинат 80 10 28535 Глутамат + малат 35 6 245 30 а Усредненные значения активности, полученные в результате 4 экспериментов полярографическим методом; концентрация митохондрий в среде измерения 1 мг/мл . б Каждый из субстратов добавляли в концентрации 5 мМ. Таким образом, мы выделяли сопряженные препараты митохондрий (дыхательный контроль на сукцинате – 3,2 ± 0,4, а на паре глутамат + малат – 6,7 ± 0,1), на которых в дальнейшем мы измеряли скорость генерации перекиси водорода. Для регистрации мы 1 Благодаря работам Чанса [4] в настоящее время общепринято, что предшественником перекиси водорода в митохондриях является супероксид-радикал, который в присутствии супероксиддисмутазы, локализованной в матриксе митохондрий, превращается в Н2О2. 24 использовали двухволновой режим (572–600 нм), чтобы набухание митохондрий не мешало измерению оптического поглощения. Результаты приведены в таблице 2. а Таблица 2. Генерация Н2О2 интактными митохондриями сердца крысы . Субстратб Генерация Н2О2 (нмоль/мин*мг) Состояние 4в Сукцинат + ротенон Глутамат + малат +ротенон Состояние 3г – NH4Cl + NH4Clд – NH4Cl + NH4Cl 0,65±0,01 1,6±0,15 0,08±0,01 0,15±0,05 0,25±0,05 0,4±0,10 0,30±0,10 0,30±0,10 0,12±0,01 0,35±0,15 0,09±0,01 0,40±0,15 0,32±0,01 0,50±0,30 0,36±0,02 0,77±0,03 а Усреднённые значения, полученные в результате 4 экспериментов, концентрация митохондрий 0,1 мг/мл. Генерацию перекиси водорода измеряли спектрофотометрически по окислению Amplex Red. б Каждый из субстратов добавляли в концентрации 5 мМ, где указано, добавляли 5 мкМ ротенон. в В среде измерения отсутствует АDP. г Измерения проводили в присутствии 400 мкМ АDP. д NH4Cl добавляли в концентрации 30 мМ. При сопряженном окислении сукцината скорость генерации Н2О2 интактными митохондриями составляла 0,65 нмоль/мин*мг. Образование перекиси сильно падало после добавления ротенона или ADP2. Это соответствует представлениям о том, что при окислении сукцината митохондрии генерируют перекись водорода в основном за счет реакции обратного переноса электронов, катализируемой комплексом I [35–36]. Добавление ADP в среду измерения, содержащую неорганический фосфат, приводит к синтезу АТР и снижению ∆µН+ на мембране митохондрий, что значительно уменьшает скорость энергозависимого обратного переноса электронов. Ротенон, в свою очередь, блокирует перенос электронов от убихинола на FMN комплекса I, что также приводит к значительному ингибированию образования Н2О2. Остаточная активность, по-видимому, связана с генерацией перекиси в комплексе III [35-36]. При сопряженном окислении малата в присутствии глутамата скорость генерации Н2О2 составляла 0,12 нмоль/мин*мг. В этом случае основным источником генерации перекиси также считают комплекс I дыхательной цепи, который при использовании 2 Полученные данные полностью согласуются с результатами, полученными Чансом [17]: скорость генерации Н2О2 митохондриями печени крысы при окислении сукцината составляла 0,6 нмоль/мин*мг в состоянии 4 и 0,1 нмоль/мин*мг в присутствии АДР. 25 NAD+-зависимого субстрата (малат) в реакции прямого переноса электронов от NADH на FMN восстанавливает О2 до супероксида. В присутствии ADP скорость работы дыхательной цепи увеличивается, редокс-компоненты дыхательной цепи становятся более окисленными, поэтому скорость образования супероксида слегка уменьшается (0,09 нмоль/мин*мг). В присутствии ротенона генерация перекиси возрастала почти в три раза. Это связано, по-видимому, с тем, что ротенон, блокируя перенос электронов на убихинон, повышает уровень восстановленности флавина в комплексе I и тем самым активирует генерацию Н2О2. Хлорид аммония, активатор матриксного фермента, катализирующего NADHзависимую генерацию перекиси водорода [37], стимулировал генерацию Н2О2 в присутствии как глутамата и малата, так и сукцината. Мы сравнили скорости дыхания интактных митохондрий и скорости генерации Н2О2. В состоянии 4 образование Н2О2 ничтожно мало по сравнению с переносом электронов на кислород с образованием воды (цитохромоксидазная реакция) и составляет всего 0,8% и 0,3% от общей скорости потребления кислорода митохондриями при окислении сукцината или малата и глутамата, соответственно. Следует отметить, что при генерации Н2О2 интактными митохондриями регистрируемая скорость реакции зависит сразу от нескольких факторов: 1) от скорости генерации супероксид-радикала и перекиси водорода комплексом I и ферментами митохондриального матрикса; 2) от активности митохондриальной супероксиддисмутазы, катализирующей превращение супероксид-радикала в Н2О2; 3) от активности митохондриальной глутатионпероксидазы и каталазы, разрушающих Н2О2; и 4) от способности образующейся перекиси свободно выходить из митохондрий. Оценить, какой из этих процессов является скорость-лимитирующим, довольно сложно. Поэтому мы решили обработать митохондрии каналообразующим антибиотиком аламетицином который в использованных концентрациях вызывает появление проницаемости внутренней мембраны митохондрий только для низкомолекулярных соединений, при этом крупные молекулы (например, белки) остаются в матриксе митохондрий [45]. Это дает возможность, с одной стороны, использовать в качестве субстрата окисления экзогенный NADH, а с другой стороны, обеспечивает быстрый выход образующейся перекиси водорода (или супероксида, для которого внутренняя мембрана митохондрий непроницаема) из митохондрий, в результате чего перекись становится значительно менее доступной для глутатионпероксидазы и каталазы, локализованных в митохондриальном матриксе. 26 Однако после такой обработки измерять генерацию Н2О2 при окислении сукцината становится невозможно, т.к. митохондрии становятся полностью проницаемыми для ионов водорода и разобщаются, а обратный перенос электронов, катализируемый комплексом I, блокируется. Поэтому на пермеабилизованных митохондриях мы изучали образование Н2О2 только при окислении добавленного NADH. Генерация Н2О2 митохондриями, обработанными аламетицином и ротеноном До обработки скорость окисления NADH интактными митохондриями составляла 0,06 мкмоль/мин*мг (таблица 3). После преинкубации митохондрий с аламетицином их NADH-оксидазная активность возрастала более чем в 20 раз (1,4 мкмоль/мин*мг). Высокая степень стимуляции свидетельствует о целостности внутренней мембраны исходных митохондрий и непроницаемости для экзогенного NADH. Добавление NADHOH, специфического ингибитора комплекса I в нуклеотидсвязывающем центре [48], приводило к резкому падению NADH-оксидазной активности. В дальнейшем мы использовали NADH-OH для оценки доли комплекса I в суммарном образовании перекиси водорода митохондриями, обработанными аламетицином. Таблица 3. Окисление NADH интактными митохондриями и митохондриями, обработанными аламетицином. NADH-оксидазная активность (мкмоль/мин*мг белка)а Контроль 0,06 + аламетицинб в отсутствие NADH-OH 1,4 + аламетицин и NADH-OHв 0,06 а За реакцией следили по уменьшению оптического поглощения при 340 нм. Митохондрии (25 мкг/мл) инкубировали в присутствии аламетицина (40 мкг/мл) и 2,5 мM MgCl2 в течение 30 сек. в Митохондрии инкубировали, как описано выше (б), затем добавляли NADH-OH (5 нмоль/мг белка) и инкубировали митохондрии в течение еще 1 мин. б После этого мы приступили к изучению генерации Н2О2 митохондриями, обработанными аламетицином и магнием в присутствии NADH. Митохондрии дополнительно обрабатывали ротеноном, дыхательной цепи. 27 для того, чтобы блокировать работу Таблица 4. Генерация Н2О2 митохондриями после обработки аламетицином а . Генерация Н2О2 (нмоль/мин*мг белка) б в - NADH-OH + NADH-OH - NH4Cl + NH4Cl г - NH4Cl + NH4Cl 50 мкM NADH 5,1±0,4 19,2±2,6 2,4±0,2 15,1±0,6 50 мкM NADH + 50 мкM NAD+ 1,0±0,2 3,1±0,6 0,7±0,1 3,9±1,0 a б в г Усреднённые значения, полученные в результате 4 экспериментов, концентрация митохондрий 20 мкг/мл. Генерацию перекиси водорода измеряли спектрофотометрически по окислению Amplex Red. Митохондрии (20 мкг/мл) инкубировали в присутствии аламетицина (40 мкг/мл) и 2,5 мM MgCl2 и 5 мкМ ротенона в течение 30 сек. Митохондрии инкубировали, как описано выше (a), затем добавляли NADH-OH (5 нмоль/мг белка) и инкубировали митохондрии в течение еще 1 мин. Активность измеряли в присутствии 30 мM NH4Cl. Как видно из таблицы 4, скорость генерации Н2О2 в присутствии 50 мкМ NADH составляла 5,1 нмоль/мин*мг и больше чем на порядок превосходила скорость генерации Н2О2 интактными митохондриями. Это означает, что с помощью аламетицина и магния мы действительно устранили влияние различных факторов, препятствующих определению скорости генерации Н2О2. Для того чтобы оценить вклад комплекса I в общую генерацию Н2О2, мы преинкубировали митохондрии с NADH-OH. В присутствии NADH-OH скорость генерации Н2О2, уменьшается в 2 раза, но не исчезает полностью. Это означает, что комплекс I участвует в генерации Н2О2, но не является единственным её источником. Кроме того, если в отсутствие NADH-OH генерация Н2О2 в 4 раза активируется ионами аммония, то в присутствии NADH-OH она активируется почти в 7 раз. Это подтверждает наличие в матриксе митохондрий еще одного фермента, катализирующего образование Н2О2, активность которого сильно увеличивается в присутствии ионов аммония. Активность этого фермента (ферментов) в присутствии NH4Cl намного превосходит генерацию Н2О2 комплексом I. Одна из основных биологических функций комплекса I заключается в поддержании баланса NADH/NAD+ в митохондриях. Нам стало интересно, не находится ли генерация Н2О2 под контролем уровня восстановленности пары NADH/NAD+. Поэтому мы сравнили скорости генерации Н2О2 в присутствии и в отсутствие NAD+ (см. таблицу 4). Действительно, при снижении соотношения NADH/NAD+ скорость генерации Н2О2 сильно уменьшалась, таким образом, генерация Н2О2 в митохондриях чувствительна к 28 изменению концентраций NADH/NAD+ и уменьшается при увеличении доли окисленного NAD+. Итак, в результате обработки интактных митохондрий аламетицином скорость генерации перекиси резко повысилась. На основании измеренных значений скорости образования Н2О2, мы решили рассчитать возможное количество перекиси, образующейся в матриксе интактных митохондрий. Если исходить из того, что 1 мг митохондрий имеет внутренний объём 1 мкл, то получается, что за 1 мин во внутреннем пространстве митохондрий образуется порядка 10-2 М Н2О2. Проницаемость митохондриальной мембраны для перекиси водорода Как уже было сказано (ср. таблицы 2 и 4), скорость генерации Н2О2 пермеабилизованными митохондриями в присутствии NADH существенно больше, чем скорость генерации Н2О2 интактными митохондриями в присутствии сукцината или глутамата и малата. Это может означать, что митохондриальная глутатионпероксидаза в присутствии эндогенного восстановленного глутатиона и каталаза разрушают перекись, которая образуется в матриксе интактных митохондрий при окислении субстратов дыхания, таким образом уменьшается количество Н2О2, доступной для экзогенной пероксидазы, используемой для аналитической детекции. После добавления аламетицина, с одной стороны, из митохондрий выходит эндогенный глутатион, в результате чего глутатионпероксидаза теряет способность катализировать разрушение перекиси, с другой стороны, если в интактных митохондриях существует барьер проницаемости для перекиси водорода, то в присутствии аламетицина Н2О2 начинает свободно покидать митохондрии и становится недоступной для ферментов, разрушающих ее внутри митохондрий. Наше предположение о том, что в присутствии аламетицина увеличивается проницаемость митохондриальной мембраны для перекиси водорода, было подтверждено в результате эксперимента, представленного на рисунке 10. В среду измерения вносили митохондрии, глутамат и малат, ADP. После того, как весь кислород был израсходован, в среду измерения вносили ротенон, чтобы блокировать работу дыхательной цепи, и перекись водорода. В ответ на добавку перекиси мы наблюдали выделение кислорода, обусловленное активностью внутримитохондриальной каталазы. Наблюдаемая каталазная активность оказалась высокой и составила 68 нмольО2/мин*мг. В присутствии аламетицина мы наблюдали значительную стимуляцию этой активности (более чем в три раза). В силу того, что митохондриальная мембрана 29 проницаема для кислорода, мы сделали вывод об ограниченной проницаемости её для перекиси водорода. Рис.10. Проницаемость митохондриальной мембраны для Н2О2. А, Кривая 1: в полярографическую кювету вносили митохондрии и регистрировали изменение концентрации кислорода. Стрелками указаны добавки: Мито, 1,8 мг/мл ; Глу+Мал, 5 мМ глутамат и 5 мМ малат; АDP 2 мМ; Ротенон 5 мкМ; Ала, аламетицин 40 мкг/мл и 2,5 мМ MgCl2. Кривая 2. Аламетицин и MgCl2 были добавлены непосредственно перед перекисью водорода. Б, контроль, в среде измерения отсутствуют митохондрии. Цифрами (курсивом) на кривых указаны скорости поглощения/выделения кислорода в нмольО2/мин*мг. Образование Н2О2 мембранной и растворимой фракциями митохондрий Таким образом, мы убедились в том, что комплекс I не является главным и единственным источником Н2О2 в митохондриях. Мы решили проанализировать, каким образом распределены Н2О2-генерирующие активности между мембранносвязанными и растворимыми ферментами митохондрий. С этой целью мы подвергли препарат митохондрий ультразвуковой обработке и методом ультрацентрифугирования получили мембранную и растворимую фракцию. В основном это была процедура, описанная в разделе Получение препаратов митохондриальных мембран и митохондриального матрикса, за исключением того, что после ультразвуковой обработки мы не проводили осаждения неразрушенных митохондрий при 26000g, а получали суммарный препарат мембран (субмитохондриальные частицы и остатки митохондрий) осаждением при 200000g в течение 1 часа. Затем измерили скорости генерации Н2О2 в исходном препарате 30 митохондрий, а также во фракции мембран и в неочищенном препарате растворимых белков митохондриального матрикса. Активности измеряли в присутствии ротенона (5 мкМ) после преинкубации препаратов в присутствии аламетицина (30 мкг/мл) и MgCl2 (3 мМ). Результаты представлены в таблице 5. Скорость генерации Н2О2 митохондриями составляла 4,9 нмоль/мин*мг. В присутствии NH4Cl она возрастала в 3 раза. В присутствии NADH-OH скорость генерации Н2О2 уменьшалась в 2 раза, а степень стимуляции ионами аммония возрастала до 5 раз. Фракция мембран катализировала образование Н2О2 со скоростью 4,4 нмоль/мин*мг. Так как наш препарат содержал примеси солюбилизированных белков, генерация Н2О2 была не полностью чувствительна к NADH-OH (на 70 %) и сохранялась небольшая стимуляция ионами аммония (в 1,6 раза). Скорость генерации Н2О2 фракцией растворимых белков составляла 10,6 нмоль/мин*мг белка. Она стимулировалась ионами аммония в 5 раз и была практически не чувствительна к NADH-OH. В присутствии NADH-OH степень активации ионами аммония увеличивалась с 5 до 7 раз. Эти данные указывают на то, что стимулируемый аммонием фермент, генерирующий Н2О2, локализован в митохондриальном матриксе. Небольшая чувствительность к NADH-OH объясняется, вероятно, наличием фрагментов мембран во фракции растворимых белков. Таблица 5. Распределение Н2О2-генерирующих активностей мембранными ферментами митохондрий между растворимыми и а Скорость образования Н2О2 (нмоль/мин*мг белка) б в - NADH-OH + NADH-OH - NH4Cl + NH4Clг) - NH4Cl + NH4Cl Митохондрии 4,9 15,8 2,6 14,1 Фракция мембран 4,4 6,9 1,4 4,6 Фракция растворимых белков 10,6 56,7 8,9 63,8 a Активности измеряли в присутствии 50 мкМ NADH. Митохондрии (20 мкг/мл) и фракцию мембран (20 мкг/мл) инкубировали в присутствии аламетицина (40 мкг/мл), 2.5 мM MgCl2 и 5 мкМ ротенона в течение 30 сек. в Митохондрии и фракцию мембран инкубировали, как описано выше (б), затем добавляли NADH-OH (5 нмоль/мг белка) и инкубировали митохондрии в течение 1 мин. Фракцию растворимых белков (45 мкг/мл) инкубировали в течение 1 мин в присутствии NADH-OH (5 нмоль/мг белка) г Активность измеряли в присутствии 30 мM NH4Cl. б 31 На рис. 11 представлена диаграмма распределения суммарной активности между фракцией мембран и растворимыми белками матрикса. Видно, что в отсутствие ионов аммония активности распределяются примерно поровну между мембранной фракцией и фракцией растворимых белков (матрикс). Примерно половина активности интактных митохондрий принадлежала комплексу I (50%-ная чувствительность к NADH-OH в интактных митохондриях), что подтверждается тем, что во фракции мембран генерация перекиси чувствительна к NADH-OH значительно сильнее, чем в растворимой фракции (ингибирование на 70% и 16%, соответственно). В присутствии ионов аммония (рис. 11, справа) картина менялась. Скорость генерации Н2О2 митохондриями увеличилась примерно в 4 раза и была намного менее чувствительной к NADH-OH (ингибирование на 10%). Подавляющая часть активности митохондрий, стимулируемой аммонием, была обнаружена в растворимой фракции белков матрикса и она была не чувствительна к NADH-OH. Полученные результаты прямо показывают, что в присутствии ионов аммония основным источником перекиси водорода в митохондриях является фермент (ферменты) матрикса. Рис.11. Распределение Н2О2-генерирующих активностей между растворимыми и мембранными ферментами митохондрий. На диаграмме представлены общие активности (удельные активности каждой фракции умножали на общее количество белка в этой фракции). Измерения проводили так же, как описано в подписях к таблице 5. 32 Кроме того, мы наблюдали, что фракция растворимых белков способна генерировать Н2О2, используя NADPH (1,3 мМ) в качестве донора электронов. Скорость генерации в отсутствие NADH-OH составляла 6,4 нмоль/мин*мг и увеличивалась до 18,6 нмоль/мин* мг в присутствии NH4Cl. В присутствии NADH-OH скорости уменьшались и составляли 5,0 нмоль/мин*мг и 17,7 нмоль/мин*мг в отсутствие и в присутствии NH4Cl, соответственно. Это может означать, что фермент, осуществляющий чувствительную к аммонию NADH-зависимую генерацию Н2О2 может использовать не только NADH, но и NADPH (с меньшим сродством) в качестве субстрата-донора. С другой стороны, возможно, что за NADPH-зависимую генерацию перекиси отвечает другой фермент митохондриального матрикса. В литературе нет сведений о существовании ферментов, обладающих такой активностью. Получение очищенного препарата NADH: О2-оксидоредуктазы из митохондриального матрикса Мы установили, что в матриксе митохондрий существует фермент, окисляющий NADH (или и NADH, и NADPH) с образованием перекиси водорода. Для того чтобы охарактеризовать и идентифицировать его, нам необходимо было получить гомогенный препарат фермента. В качестве исходного препарата мы использовали матрикс митохондрий сердца быка. Для предварительной очистки фермента мы использовали несколько стадий в различных комбинациях: кислое осаждение, высаливание сульфатом аммония при 30% с последующим диализом полученного супернатанта и термообработку препарата при 60ОС (см. раздел «Методы исследования»). Степень очистки оценивали по удельной активности фермента в реакции образования Н2О2 в присутствии 30 мМ активатора фермента NH4Cl. Мы испробовали 4 процедуры, и из таблицы 6 видно, что они дали приблизительно одинаковые результаты. Однако процедура II оказалась оптимальной: мы получили препарат фермента с высокой удельной активностью (236 нмоль/мин*мг) с наибольшим выходом (60%). 33 Таблица 6. Очистка NADH-оксидазы из митохондриального матрикса. Количество Удельная Общая белка активностьа активность активности (мг) (нмоль/мин*мг) (нмоль/мин) (%) 336 29 9740 1 100 кислое осаждениеб 95 68 6475 2,3 66 высаливаниев 56 75 4183 2,6 43 термообработкаг 23 172 4016 5,9 41 высаливаниев 84 95 7980 3 82 термообработкаг 25 236 5900 8,1 60 термообработкаг 53 115 6095 4 62 кислое осаждениеб 50 122 6123 4,2 63 22 242 5325 8,3 55 53 115 6095 4 62 22,5 200 4483 6,9 46 Стадия очистки Исходный матрикс Очистка Выход по I процедура II процедура III процедура высаливание в IV процедура термообработкаг высаливаниев а Измеряли скорость генерации Н2О2 в присутствии 100 мкМ NADH и 30 мМ NH4Cl. См. раздел «Методы исследования». бвг Зависимость активности фермента от концентрации активатора NH4Cl Как было сказано выше, обнаруженный нами в матриксе митохондрий фермент, катализирующий образование перекиси водорода при окислении NADH, сильно активировался в присутствии ионов аммония. На рис. 12 представлена зависимость активности фермента от концентрации NH4Cl в среде измерения. Видно, что ионы аммония активируют образование перекиси примерно в 15 раз. Полумаксимальная активация достигается при 10 мМ концентрации NH4Cl. Концентрация ионов аммония в митохондриях в норме колеблется в пределах от 5 до 10 мМ [49]. Это означает, что в таких условиях активность фермента практически линейно зависит от концентрации ионов аммония и в физиологических условиях скорость образования Н2О2 может эффективно регулироваться. 34 Рис. 12. Зависимость активности NADH-оксидазы от концентрации NH4Cl в среде измерения. За реакцией следили по образованию Н2О2 в присутствии 50 мкМ NADH. Концентрация частично очищенного фермента была равна 13 мкг/мл. Активность выражали в нмоль образованной Н2О2 в минуту на 1 мг белка. Мы решили проверить, могут ли другие соединения, содержащие четвертичный азот, активировать NADH-оксидазу. Как оказалось, спермин, аргинин, лизин, гуанидинхлорид в концентрации 10 мМ не оказывали никакого влияния на активность NADH-оксидазы и, в то же время, не препятствовали активирующему влиянию ионов аммония (данные не приведены). Аналоги иона аммония метиламин, диметиламин и триметиламин в концентрации 30 мМ также не обладали активирующим действием. В митохондриях существуют эндогенные источники аммиака. К ним относятся глутаматдегидрогеназа, АМР-деаминаза, система расщепления глицина и глутаминаза. Мы решили оценить вклад одного из этих ферментов, глутаминазы, в эндогенное образование ионов аммония. Мы обнаружили, что интактные митохондрии с высокими скоростями потребляют кислород и фосфорилируют ADP при добавлении глутамина в качестве субстрата дыхания (см. рис. 13). 35 Рис. 13. Поглощение кислорода митохондриями в присутствии 20 мМ глутамина и 35 мМ фосфата измеряли полярографическим методом. Цифры над кривой обозначают активности, выраженные в натом О/мин*мг. Концентрация митохондрий в среде измерения составляла 1 мг/мл. По-видимому, под действием глутаминазы в интактных митохондриях сердца глутамин превращается в глутамат и происходит выделение аммония. Митохондрии используют образованный глутамат в качестве субстрата дыхания [50-51]. Методом тонкослойной хроматографии мы убедились в том, что препарат глутамина не содержал примесей глутаминовой кислоты. Скорости дыхания митохондрий при дезаминировании глутамина и последующем окислении глутамата оказались сопоставимы со скоростями дыхания при окислении малата в присутствии глутамата (таблица 7). Таблица 7. Скорости дыхания митохондрий в присутствии глутамина и пары глутамат-малат. Субстрат дыхания Скорость дыханияа (натом О/мин*мг белка) Глутамат+Малат (5 мМ) сопряженное дыхание 40 + ADP 1 мМ 280 Глутамин 20 мМ 48 112 а Измерения проводили в присутствии 35 мМ фосфата. Полученые данные свидетельствуют о том, что глутаминаза способна производить значительные количества аммиака, что указывает на физиологическую значимость активации изучаемой нами NADH-оксидазы ионами аммония. 36 Очистка фермента методом ионообменной хроматографии на Q-сефарозе Итак, используя высаливание сульфатом аммония и тепловую обработку, мы получили препарат фермента с относительно высокой удельной активностью. Однако на электрофореграмме этого препарата оказалось много белковых полос различной интенсивности (данные будут приведены ниже). Для дальнейшей очистки мы решили провести ионообменную хроматографию на колонке с Q-сефарозой, как описано в разделе Методы исследования. На колонку наносили препарат фермента, полученный после термообработки митохондриального матрикса. Полученный профиль элюции представлен на рисунке 14. Видно, что бóльшая часть белков сорбируется на колонке и элюируется в первой половине градиента в виде нескольких неразделяемых пиков. Мы измерили активность и обнаружили, что NADHоксидаза элюируется примерно в середине градиента NaCl (максимальная активность во фракции 60, синяя кривая на рис. 14). Небольшое количество активности было обнаружено во фракциях 1–28 (белок, не связавшийся с Q-сефарозой, таблица 8). Мы объединили фракции № 49–70, соответствующие максимальной удельной активности. Общий выход по активности на этой стадии очистки составил 78 % от общей активности, нанесённой на колонку. Рис. 14. Профиль элюции белков, полученный в результате ионообменной хроматографии на колонке с Q-сефарозой. На колонку наносили препарат фермента, полученный после термообработки «нативного» матрикса. Синяя кривая – распределение активностей во фракциях, измеренных по скорости генерации Н2О2 в присутствии 100 мкМ NADH и 30 мМ NH4Cl. 37 Таблица 8. Распределение активности при очистке NADH-оксидазы методом ионообменной хроматографии на колонке с Q-сефарозой (рис. 14). На колонку наносили препарат, полученный после тепловой обработки матрикса. Фракция Объём фракции, мл «Нативный» матрикс 14 Общая активность, нмоль/мин 2030 Выход по активности Матрикс после термообработки, 14 1200 60% Фракции 1–28 28 90 4% Фракции 49–70 23 940 45% 100% который наносили на колонку В результате хроматографии на колонке с Q-сефарозой мы получили препарат фермента с удельной активностью около 400 нмоль/мин*мг, чистоту которого оценивали методом SDS-электрофореза. Мы наблюдали, что в процессе очистки увеличивается доля пептида с молекулярной массой около 50 кДа. При таком способе выделения иногда получается электрофоретически чистый препарат фермента, а иногда он загрязнен низкомолекулярными примесями. Идентификация аммоний-чувствительной NADH:кислород-оксидоредуктазы Полученный после хроматографии на Q-сефарозе белок мы подвергли электрофорезу в присутствии SDS, окрасили с помощью Кумасси R-250 с последующей отмывкой и вырезали полосу с молекулярной массой около 50 кДа. В ЗАО «ПИННИ» («Постгеномные и нанотехнологические инновации») был проведен трипсинолиз предоставленного нами препарата и был получен MALDI масс-спектр, который затем был проанализирован с помощью базы данных Mascot. Было исследовано около 26 пептидов (общая масса около 32 кДа). Результаты показали, что изучаемый нами фермент имеет 15 пептидов, аналогичных пептидам дигидролипоилдегидрогеназы сердца быка (изоформа 2). Это составляет около 28% от всей массы дигидролипоилдегидрогеназы. В то же время оставшиеся 11 пептидов в базах данных обнаружены не были. Поэтому можно предположить, что наш фермент либо идентичен дигидролипоилдегидрогеназе, либо он может относиться к семейству высокогомологичных ферментов, к которым относятся дигидролипоилдегидрогеназа, глутатионредуктаза и некоторые диафоразы [47]. 38 Сравнение свойств изучаемого фермента и коммерческого препарата ДЛДГ Мы решили воспользоваться коммерческим препаратом дигидролипоилдегидрогеназы сердца свиньи для того, чтобы сравнить её с выделенным нами ферментом. Нас интересовало, способен ли коммерческий препарат катализировать NADH:О2-оксидоредуктазную активность, стимулируемую аммонием, которой обладает изучаемый нами фермент. И, наоборот, способна ли изучаемая нами NADH-оксидаза катализировать липоамидредуктазную реакцию. В таблице 9 видно, что коммерческий препарат дигидролипоилдегидрогеназы сердца свиньи способен катализировать NADH-зависимую генерацию перекиси водорода. Эта активность стимулируется ионами аммония, однако степень активации меньше, чем у выделенного нами фермента. В экспериментах, проводимых на митохондриях, мы показали, что генерация перекиси ингибируется NAD+. Поэтому мы проверили его влияние на активности обоих препаратов. В таблице видно, что и выделенный нами фермент, и дигидролипоилдегидрогеназа сердца свиньи ингибируются продуктом реакции NAD+. В таблице также видно, что выделенный нами фермент способен катализировать липоамидредуктазную реакцию. В присутствии 1 мМ липоамида коммерческий фермент катализировал окисление NADH со скоростью 32,2 мкмоль/мин*мг, а изучаемый фермент – со скоростью 13,3 мкмоль/мин*мг. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что наш фермент является дигидролипоилдегидрогеназой. Таблица 9. Сравнение свойств фермента, выделенного в настоящей работе, и коммерческого препарата дигидролипоилдегидрогеназы сердца свиньи. Активность, мкмоль/мин*мг NADH-оксидазаа ДЛДГб – NH4Cl + NH4Cl – NH4Cl + NH4Cl контроль 0,023 0,36 0,10 0,96 + NAD+ 0,004 0,04 0,02 0,1 Генерация Н2О2 в Липоамидредуктазная активностьг 13,31 а 32,2 Препарат фермента, полученный после термообработки и хроматографии на Q-сефарозе, 8,4 мкг/мл в среде измерения. б Коммерческий препарат дигидролипоилдегидрогеназы из сердца свиньи, 2,45 мкг/мл в среде измерения. в Активность измеряли в присутствии 100 мкМ NADH, где указано, добавляли 100 мкМ NAD+. г За реакцией следили по окислению NADH при 340 нм в присутствии 1 мМ липоамида. 39 Известно, что дигидролипоилдегидрогеназа – это флавин-зависимый фермент. Она содержит в своём составе FAD в качестве простетической группы. Если флавин действительно является кофактором нашего фермента и в процессе выделения частично диссоциирует из фермента, то можно ожидать, что флавины могут увеличить активность фермента. Однако FMN, FAD, рибофлавин, добавленные в среду измерения активности в концентрации 10 мкМ, не оказывали активирующего влияния на фермент (данные не приведены). Ионообменная хроматография неочищенного митохондриального матрикса на колонке с Q-сефарозой Дигидролипоилдегидрогеназа функционирует в митохондриях в составе 4 мультиферментных комплексов (α-кетоглутарат- и пируватдегидрогеназного комплекса, дегидрогеназного комплекса разветвленных 2-оксокислот и комплекса, расщепляющего глицин [23]). По данным Сингера дигидролипоилдегидрогеназа содержится в митохондриях и в свободной форме, но ее физиологическая роль остается неизвестной [22]. Можно ожидать, что способность к связыванию с ионообменным носителем для свободной формы дигидролипоилдегидрогеназы и для фермента, объединенного в комплекс с другими белками, будет различаться. Между тем, при очистке на колонке с Qсефарозой митохондриального матрикса, предварительно обработанного при температуре 60оС, NADH-оксидазная активность интересующего нас фермента выходила в виде единственного пика (рис. 14 и таблица 8). Мы рассмотрели два возможных объяснения полученного результата. Можно предположить, что свободная форма фермента термостабильна в отличие от дигидролипоилдегидрогеназы, связанной в комплексы. На это косвенно указывает значительная (около 40%) потеря активности фермента после термообработки. Если это так, то в результате хроматографии на Q-сефарозе мы выделили свободную форму дигидролипоилдегидрогеназы. Альтернативное объяснение состоит в том, что в результате термообработки мы разрушили комплексы, содержащие дигидролипоилдегидрогеназу, в результате чего она вышла из их состава. В этом случае следует ожидать, что хроматография на Q-сефарозе исходного («нативного») препарата митохондриального матрикса, не подвергнутого термообработке, приведет к получению значительно меньшего количества дигидролипоилдегидрогеназы. На рис. 15 показан профиль элюции «нативного» препарата белков митохондриального матрикса, нанесенного на колонку с Q-сефарозой. Видно, что значительное количество белка не связалось с носителем. Примерно в середине градиента 40 NaCl элюировался пик (рис. 15), в котором содержалось около 40% исходной активности «нативного» матрикса, нанесённого на колонку (примерно столько же, что и в случае хроматографии матрикса, предварительно подвергнутого тепловой обработке, где эта цифра составляет 46%)3. Таким образом, предположение о том, что термообработка приводит к диссоциации дигидролипоилдегидрогеназы из состава комплексов не оправдалось. Кроме того, как будет показано ниже (электрофореграмма на рис. 17, дорожка №3), в препарате фермента, полученного после хроматографии на Q-сефарозе, отсутствовала полоса с молекулярной массой 67 кДа, соответствующая дигидролипоамидсукцинилтрансферазе, которая формирует ядро α-кетоглутарат- и пируват-дегидрогеназных комплексов. Это означает, что в пике на Рис. 15. Профиль элюции белков, полученный в результате ионообменной хроматографии на колонке с Q-сефарозой. На колонку наносили «нативный» матрикс. Синим показано распределение активностей во фракциях, измеренное по скорости генерации Н2О2 в присутствии 100 мкМ NADH и 30 мМ NH4Cl. профиле элюции после хроматографии на Q-сефарозе, где обнаруживается наша активность (рис. 14 и 15), содержится дигидролипоилдегидрогеназа, не связанная с комплексами. Это, в свою очередь, означает, что выделенная нами 3 Следует отметить, что для того, чтобы можно было сравнивать результаты хроматографического разделения, приведенные на рисунках 14 и 15, мы брали две равные порции одного и того же «нативного» о матрикса. Одну из этих порций прогревали при 60 С и затем наносили на колонку с Q-сефарозой (рис. 14), а вторую порцию пропускали через носитель без предварительной обработки (рис. 15). 41 дигидролипоилдегидрогеназа изначально присутствовала в препарате «нативного» матрикса в свободном виде. Кроме того, в таблице 10 видно, что около 40% от общей активности, нанесенной на колонку, принадлежит ферменту, который не сорбируется на носителе (фракции 1–14). Мы предполагаем, что в этих фракциях может находиться дигидролипоилдегидрогеназа в составе комплексов, которые не связываются с Q-сефарозой. При предварительной тепловой обработке матрикса комплексы вместе с дигидролипоилдегидрогеназой, входящей в их состав, вероятно, увлекаются в осадок, поэтому при хроматографии на Qсефарозе практически отсутствует фракция белков, не связавшихся с носителем (см. таблицу 8). Таблица 10. Распределение активности при очистке NADH-оксидазы методом ионообменной хроматографии на колонке с Q-сефарозойа. Фракция а Объём фракции, Общая активность, Выход по мл нмоль/мин активности «Нативный» матрикс 14 2030 100% Фракции 1–14 14 730 40% Фракции 45–72 27 780 40% На колонку наносили «нативный» матрикс в том же количестве, которое использовали для получения термообработанного матрикса для хроматографического разделения, представленного на рис. 14. Результаты, приведенные на рис. 14 и 15, а также в таблицах 8 и 10, могут служить указанием на то, что в матриксе митохондрий одновременно присутствует свободная и связанная форма дигидролипоилдегидрогеназы. Однако для доказательства такого утверждения требуются дополнительные эксперименты, направленные на изучение термостабильности и способности связываться с Q-сефарозой изолированных препаратов -кетоглутарат- и пируватдегидрогеназного комплексов. Гидрофобная хроматография на колонке с фенил-сефарозой Как уже было сказано, метод ионообменной хроматографии на колонке с Qсефарозой не всегда позволяет получить чистый препарат фермента. Поэтому мы решили ввести дополнительную стадию очистки – хроматографию на колонке с фенил-сефарозой (см. Методы исследования). Полученный профиль элюции представлен на рис. 16. На колонку наносили препарат фермента, полученный после хроматографии на Q-сефарозе. На рисунке видно, что большая часть белков не сорбируется на колонке (фракции № 1– 42 17). По мере уменьшения концентрации сульфата аммония с колонки элюируется 3 пика белков. После измерения активности скорость генерации перекиси водорода в присутствии 30 мМ NH4Cl мы идентифицировали NADH-оксидазу во втором пике. Общий выход по активности на стадии гидрофобной хроматографии составил 80% от активности, нанесённой на колонку (см. таблицу 11). Рис. 16. Профиль элюции белков, полученный в результате гидрофобной хроматографии на колонке с фенил-сефарозой. На колонку наносили препарат фермента, полученный после термообработки и хроматографии на Q-сефарозе. Синим показано распределение активностей во фракциях, измеренное по скорости генерации Н2О2 в присутствии 100 мкМ NADH и 30 мМ NH4Cl. Таблица 11. Идентификация пика, соответствующего NADH-оксидазе (см. рис. 16). Номер фракции Исходный белок, нанесенный на колонку 30 Общая активностьа, нмоль/мин 1390 Фракция 7 3 0 Фракция 57 1 0 Фракция 92 1 290 Фракции № 89–96 8 1130 а Объем, мл Выход по общей активности Скорость генерации Н2О2 в присутствии 100 мкМ NADH и 30 мМ NH4Cl. 43 100 % 80 % В результате хроматографии на колонке с фенил-сефарозой мы получили препарат фермента с удельной активностью около 1000 нмоль/мин*мг, чистоту которого оценивали методом SDS-электрофореза. Как видно на рисунке 17А, благодаря этой стадии очистки нам удалось получить электрофоретически чистый препарат фермента (дорожка №4). Кажущаяся молекулярная масса изучаемой NADH-оксидазы по данным электрофореза составила около 56 кДа. Для сравнения приведена электрофореграмма коммерческого препарата дигидролипоилдегидрогеназы из сердца свиньи (дорожка №5). Рис. 17. Определение чистоты различных препаратов NADH-оксидазы и ее кажущейся молекулярной массы по результатам SDS-электрофореза по методу Лэммли. А – электрофореграммы белковых фракций, полученных на разных стадиях выделения (1 – нативный матрикс, 5 мкг белка; 2 – матрикс после тепловой обработки, 6 мкг; 3 – препарат, полученный после хроматографии на Q-сефарозе, 5 мкг; 4 – препарат, полученный после хроматографии на фенил-сефарозе, 0,25 мкг; 5 – коммерческий препарат липоилдегидрогеназы, 0,45 мкг; 6 – стандарты молекулярных масс, выраженных в кДа и указанных стрелкой справа). Б – зависимость логарифма молекулярной массы белка от отношения расстояния, пройденного белком, к расстоянию, пройденному лидирующим красителем (Rf). Во фракциях № 89–96, в которых мы обнаружили NADH:О2-оксидоредуктазную активность, мы также измерили липоамидредуктазную активность. На рисунке 18 видно, что пики двух активностей совпадают. Так как фермент, содержащийся в этих фракциях, является гомогенным и ему принадлежат обе активности, можно считать, что выделенный нами белок является дигидролипоилдегидрогеназой. 44 Рис. 18. Распределение липоамидредуктазной и NADH:О2-оксидоредуктазной активностей во фракциях, полученных в результате гидрофобной хроматографии на колонке с фенилсефарозой. Генерацию перекиси водорода измеряли спектрофотометрически по окислению Amplex Red в присутствии 100 мкМ NADH и 30 мМ NH4Cl. Липоамидредуктазную активность измеряли по окислению NADH при 340 нм в присутствии 100 мкМ NADH и 1 мМ восстановленного липоамида. Зависимость скорости генерации перекиси водорода очищенным препаратом дигидролипоилдегидрогеназы митохондрий сердца быка от концентрации NADH Зависимость скорости генерации перекиси водорода от концентрации субстратадонора NADH в отсутствие и в присутствии ионов аммония, активирующих фермент, представлена на рис. 19. Видно, что эта реакция подчиняется кинетике МихаэлисаМэнтен. В отсутствие ионов аммония насыщение достигается при ≥ 80 мкМ NADH, а в присутствии 30 мМ NH4Cl – при ≥ 200 мкМ NADH. В таблице 12 приведены значения максимальных удельных активностей (Амакс) и констант Михаэлиса (КмNADH) фермента, полученные в результате линеаризации в двойных обратных координатах. 45 А Б Рис. 19. Зависимость активности фермента от концентрации NADH в прямых и обратных координатах: А) в присутствии 30 мМ NH4Cl; Б) в отсутствие NH4Cl. Концентрация NADHоксидазы в среде измерения 14 мкг/мл. За реакцией следили по образованию перекиси водорода. Таблица 12. Кинетические параметры NADH-оксидазы, определённые в отсутствие и в присутствии 30 мМ NH4Cl. КМNADH, мкМ Амакс, нмоль/мин*мг + NH4Cl (30 мМ) 56 1100 – NH4Cl 15 50 Как видно из таблицы 12, в присутствии ионов аммония константа Михаэлиса увеличивается в 3,3 раза, а максимальная скорость возрастает почти в 20 раз. Изучение NADPH-оксидазной активности Как было сказано выше, неочищенная фракция растворимых митохондриальных белков способна образовывать перекись водорода не только при окислении NADH, но и при использовании в качестве субстрата-донора NADPH (см. стр. 33). С другой стороны, известно, что дигидролипоилдегидрогеназа абсолютно специфична в отношении NADH и не окисляет NADPH [52]. Мы решили измерить генерацию Н2О2 препаратом фермента из сердца быка, очищенным с помощью хроматографии на Q-сефарозе. При использовании 46 100 мкМ NADPH мы обнаружили драматическое падение скорости генерации во времени (рис. 20 А). Фермент катализировал реакцию с высокой начальной скоростью, которая затем резко снижалась, и реакция прекращалась вовсе в тот момент, когда в среде измерения активности происходило окисление только 1% добавленного субстрата (~100 нМ NADPH). Добавление второй порции фермента по ходу измерения не приводило к восстановлению начальной скорости. Это означает, что необратимой инактивации фермента во времени не происходило. Накопленные продукты реакции, NADP+ и Н2О2, в таких концентрациях не оказывали ингибирующего действия на фермент (результаты не приведены). Добавление более высоких концентраций NADPH (1 мМ) практически не меняло картины, за исключением того, что происходило окисление бóльшего количества субстрата (~1 мкМ) (рис. 20 Б. Обратите внимание на разницу в величинах шкалы оптического поглощения на рис. А и Б). Мы предположили, что в препарате NADPH содержится примесный NADH, который быстро окисляется ферментом до полного исчерпания. Для того чтобы проверить это предположение, мы воспользовались системой регенерации NADH, состоящей из АДГ, семикарбазида и этанола. Результаты приведены на рис. 20. Внесение NADH-генерирующей системы после завершения реакции приводило к резкому увеличению образования перекиси водорода, которое выходило на стационарный начальный уровень скорости. Таким образом, наше предположение о наличии примеси NADH в препарате NADPH подтвердилось. Рис. 20. Генерация Н2О2 в присутствии NADPH в качестве донора электронов (А – 0,1 мМ NADPH, Б – 1 мМ NADPH). Цифры над кривыми означают скорости генерации, выраженные в нмоль/мин*мг. Черными стрелками обозначены моменты добавления фермента, красными стрелками обозначены моменты внесения в реакционную среду регенерирующей системы. Регистрировали скорость образования Н2О2 в присутствии 30 мМ NH4Cl. Концентрация белка в пробе 2,25 мкг/мл. 47 Это, в свою очередь, означает, что в процессе очистки фермента мы освободились от NADPH-оксидазной активности и выделенный нами фермент, как и дигидролипоилдегидрогеназа, специфичен в отношении NADH. Так как неочищенный препарат белков митохондриального матрикса способен к генерации перекиси водорода при окислении NADPH (см. стр. 34), то это означает, что в нем находится не известный ранее фермент, способный катализировать эту реакцию. 48 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Одна из основных задач данного исследования заключалась в том, чтобы количественно оценить вклад комплекса I и белков матрикса в генерацию перекиси водорода митохондриями. Проблема генерации Н2О2 митохондриями широко представлена в литературе. Однако нет статей, в которых бы были даны количественные оценки соотношения одно- и двух-электронного восттановления кислорода и четырехэлектронного восстановления до воды, полученные в состоянии 3 и в состоянии 4 при использовании разных субстратов дыхания, исключая классическую работу [53] по генерации Н2О2 митохондриями сердца голубя и более современных данных, полученных для дыхания митохондрий крысы и мозга человека при насыщающих концентрациях кислорода [54]. Интересно, что средние значения, полученные в нашей работе для генерации перекиси интактными митохондриями сердца крысы в присутствии сукцината в состоянии 4 при рН 7,5 (0,65 нмоль/мин*мг) совпадают с данными, полученными Чансом на митохондриях сердца голубя в тех же условиях (0,7 нмоль/мин*мг)[53]. Как видно в таблице 2, скорость генерации снижается в присутствии ротенона и при переходе от состояния 4 к состоянию 3 (см. также [17]). Из этого следует, что снижение скорости восстановления NAD(P)+ в результате обратного переноса электронов, который является одним из наиболее чувствительных индикаторов сопряжённости препаратов митохондрий, представляет собой критический фактор уровня образования Н2О2. В условиях, когда генерация перекиси водорода, обусловленная активностью комплекса I, ингибировалась NADH-OH, мы наблюдали значительную стимуляцию генерации Н2О2 ионами аммония (таблица 4). Как общая, так и нечувствительная к NADH-OH активность существенно возрастали при обработке митохондрий аламетицином. Общепринято, что внутренняя мембрана митохондрий проницаема для перекиси водорода, в отличие от её предшественника супероксид-радикала. Наши данные (таблица 4 и рис. 10) показывают, что это не так. Насколько нам известно, это первое свидетельство ограниченной диффузии перекиси водорода через митохондриальную мембрану. На линии Т-клеток Jurkat было показано существование градиента концентрации Н2О2 между цитоплазмой и внутренним пространством пероксисом [55]. Кроме того, было показано, что существует облегченный транспорт перекиси водорода через плазматическую мембрану, который опосредован аквапоринами [56]. Ограниченность диффузии Н2О2 через митохондриальную мембрану, которую мы продемонстрировали, ставит два вопроса: (1) если существует градиент Н2О2 между митохондриальным матриксом и цитозолем, то каков он, и (2) находится ли генерация Н2О2 внутри митохондрий под контролем каких-либо белков, подобных аквапоринам? 49 Очевидно, необходимо дальнейшее изучение транспорта Н2О2 через митохондриальную мембрану. Мы считаем, что в силу ограниченной проницаемости мембраны митохондрий для перекиси водорода, результаты, полученные на интактных митохондриях (таблица 2) являются заниженными. И более реалистичными представляются скорости, измеренные на пермеабилизованных митохондриях (таблица 4). В своей работе мы подтвердили данные [37], показывающие, что в общую продукцию перекиси водорода митохондриями существенный вклад вносит растворимый фермент матрикса. Мы получили гомогенный препарат этого фермента. Ряд данных (результаты MALDI-спектроскопии, таблица 9, рис. 17-18) указывает на то, что выделенный нами фермент, который отвечает за устойчивую к NADH-OH, активируемую аммонием генерацию перекиси водорода в митохондриях, является дигидролипоилдегидрогеназой. ДЛДГ функционирует в митохондриях в составе мультиферментных комплексов, однако по данным Сингера [22] присутствует и в свободном виде. Данные, полученные нами при ионообменной хроматографии «нативного» и термообработанного матрикса на колонке с Q-сефарозой (рис. 14-15) косвенно указывают на то, что выделенный нами фермент присутствовал в матриксе митохондрий изначально в свободном виде. Мы показали, что NADH:О2-оксидоредуктазная активность дигидролипоилдегидрогеназы активируется ионами аммония. Константа активации превосходит физиологическую концентрацию NH4+, таким образом, в митохондриях скорость генерации перекиси водорода дигидролипоилдегидрогеназой должна линейно зависеть от концентрации ионов аммония. В силу того, что в митохондриях существуют ферменты, способные генерировать ионы аммония (глутаминаза, глутаматдегидрогеназа, АМР-деаминаза, система расщепления глицина), и их активность зависит от метаболического состояния митохондрий, NADH:О2-оксидоредуктазная активность дигидролипоилдегидрогеназы может тонко регулироваться. Мы обнаружили, что фракция растворимых митохондриальных белков (т.е. белков матрикса) способна генерировать перекись водорода не только при окислении NADH, но и при использовании NADPH в качестве субстрата-донора. Однако очищенная дигидролипоилдегидрогеназа оказалась специфична к NADH (рис. 20), что соответствует данным литературы [52]. Это означает, что в митохондриях существует фермент, катализирующий образование перекиси водорода (или супероксид-радикала) при окислении NADPH. В литературе отсутствуют данные о ферментах, обладающих такой активностью. 50 ВЫВОДЫ 1. Только 0,8 и 0,3% от общего потребления кислорода при окислении сукцината или пары малат/глутамат интактными митохондриями сердца в состоянии 4 связано с образованием Н2О2. 2. В отсутствие ионов аммония комплекс I вносит существенный (~50%) вклад в генерацию Н2О2 митохондриями, однако в матриксе митохондрий присутствует фермент, который осуществляет аммоний-стимулируемую NADH-зависимую генерацию Н2О2, намного превосходящую комплекс I по числу оборотов. 3. Из матрикса митохондрий сердца быка выделен электрофоретически чистый белок с молекулярной массой около 56 кДа, катализирующий NADH-зависимую генерацию Н2О2, скорость которой примерно в 20 раз стимулируется ионами аммония. Измерены стандартные кинетические характеристики этого фермента. 4. Результаты MALDI масс-спектроскопии показали высокую степень гомологии выделенной нами NADH-оксидазы с дигидролипоилдегидрогеназой сердца быка (изоформа 2). 51 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Виноградов А.Д. и др. (1999) Каталитические свойства митохондриальной NADH: убихинон-оксидоредуктазы (комплекса I). Биохимия, 64, 174-193. 2. Nelson D. L., Cox M. M. (2004) Lehningers principles of biochemistry. Hardcover. 3. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. (1994) Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Inc., NY, p. 678. 4. Chance B., Sies H., Boveris A. (1979) Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol. Rev., 59, 527-605. 5. Lenaz G., Bovina C., D'Aurelio M., Fato R., Formiggini G., Genova M.L., Giuliano G., Pich M.M., Paolucci U., Castelli P.G., Ventura B. (2002) Role of mitochondria in oxidative stress and aging. Ann. N. Y. Acad. Sci., 959, 199-213. 6. Скулачев В.П. (2001) Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода. Соросовский образовательный журнал, № 6, 4-10 7. Nulton-Persson A.C., Szweda L.I. (2001) Modulation of Mitochondrial Function by Hydrogen Peroxide. The Journal of Biological Chemistry, 276, 23357-23361. 8. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. (2005) Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия, 74, 246-264. 9. Thomas J.P., Maiorino M., Ursini F., Girotti A.W. (1990) Protective action of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase against membrane-damaging lipid peroxidation. In situ reduction of phospholipid and cholesterol hydroperoxides. Journal of Biological Chemistry, 265, 454-461. 10. McCord J.M., Fridovich I. (1969) Superoxide Dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). Journal of Biological Chemistry, 244, 6049-6055 11. Casteilla L., Rigoulet M., Penicaud L. (2001) Mitochondrial ROS metabolism: modulation by Uncoupling proteins. IUBMB Life, 52, 181-188. 12. Lenaz G. (2001) The mitochondrial production of reactive oxygen species: mechanisms and implications in human pathology. IUBMB Life, 52, 159-164. 13. Salvi M., Battaglia V., Brunati A.M., La Rocca N., Tibaldi E., Pietrangeli P., Marcocci L., Mondovı B., Rossi C.A., Toninello A. (2007) Catalase takes part in rat liver mitochondria oxidative stress defense. Journal of Biological Chemistry, 282, 2440724415. 52 14. Fernández-Checa J.C., Kaplowitz N., García-Ruiz C., Colell A., Miranda M., Marí M., Ardite E., Morales A. (1997) GSH transport in mitochondria: defense against TNFinduced oxidative stress and alcohol-induced defect. Am. J. Physiol., 273, 7-17. 15. Takebe G., Yarimizu J., Saito Y., Hayashi T. , Nakamura H., Yodoi J., Nagasawa S. , Takahashi K. (2002) A comparative study on the hydroperoxide and thiol specificity of the glutathione peroxidase family and selenoprotein. Journal of Biological Chemistry, 277, 21254-21258. 16. Cadenas E., Davies K.J. (2000) Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med.,29, 222-230. 17. Boveris A., Oshino N., Chance B. (1972) The cellular production of hydrogen peroxide. Biochem J., 128, 617-630. 18. Bunik V.I., Sievers C. (2002) Inactivation of the 2-oxo acid dehydrogenase complexes upon generation of intrinsic radical species. Eur. J. Biochem, 269, 5004–5015 19. Starkov A.A, Fiskum G., Chinopoulos C., Lorenzo B.J., Browne S.E., Patel M.S., Beal M.F. (2004) Mitochondrial α -ketoglutarate dehydrogenase complex generates reactive oxygen species. The Journal of Neuroscience, 24(36), 7779-7788. 20. Tretter L., Adam-Vizi V. (2004) Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by α –ketoglutarate dehydrogenase. The Journal of Neuroscience, 24(36), 7771-7778. 21. Massey V., Hofmann T., Palmee G. (1962) The relation of function and structure in lipoyl dehydrogenase. The Journal of Biological Chemistry, 237, 3820-3828. 22. Kenney W.C., Zakim D., Hogue P.K., Singer T.P. (1972) Myltiplicity and origin of isoensymes of lipoyl dehydrogenase. Eur. J. Biochem, 28, 253-260. 23. Carothers D.J., Pons G., Patel M.S. (1989) Dihydrolipoamide dehydrogenase: functional similarities and divergent evolution of the pyridine nucleotide-disulfide oxidoreductases. Arch. Biochem. Biophys., 268, 409-425. 24. Bando Y., Aki K. (1991) Mechanisms of generation of oxygen radicals and reductive mobilization of ferritin iron by lipoamide dehydrogenase. J. Biochem. 109, 450-464. 25. Tahara E.B., Barros M.H., Oliveira G.A., Netto L.E.S., Kowaltowski A.J. (2007) Dihydrolipoyl dehydrogenase as a source of reactive oxygen species inhibited by caloric restriction and involved in Saccharomyces cerevisiae aging. The FASEB Journal, 21, 274-283. 26. Xia L., Bjornstedt M., Nordman T., Eriksson L.C., Olsson J.M. (2001) Reduction of ubiquinone by lipoamide dehydrogenase. An antioxidant regenerating pathway. Eur. J. Biochem., 268, 1486–1490. 53 27. Petrat F., Paluch S., Dogruoz E., Dorfler P., Kirsch M., Korth H.G., Sustmann R., de Groot H. (2003) Reduction of Fe(III) ions complexed to physiological ligands by lipoyl dehydrogenase and other flavoenzymes in Vitro. Implications for an enzymatic reduction of Fe (III) ions of the labil pool. J. Biol. Chem., 278, 46403–46413. 28. Igamberdiev A.U., Bykova N.V., Ens W., Hill R.D. (2004) Dihydrolipoamide dehydrogenase from porcine heart catalyzes NADH-dependent scavenging of nitric oxide. FEBS Lett. 568, 146–150 29. Klyachko N.L., Shchedrina V.A., Efimov A.V., Kazakov S.V., Gazaryan I.G., Kristal B.S., Brown A.M. (2005) pH-dependent substrate preference of pig heart lipoamide dehydrogenase varies with oligomeric state. Response to mitochondrial matrix acidification. J. Biol. Chem., 280, 16106–16114. 30. Виноградов А.Д. (1999) Преобразование энергии в митохондриях. Соросовский образовательный журнал, 9, 11-19. 31. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2003) Митохондриальный комплекс I. Успехи биологической химии, 43, 19-58. 32. Виноградов А.Д. (2001) Комплекс I дыхательной цепи: структура, редокс компоненты и возможные механизмы трансформации энергии. Биохимия, 66, 13461360. 33. Захарова Н.В. (2002) Кинетика трангидрогеназной реакции, катализируемой митохондриальной NADH: убихинон оксидоредуктазой (комплексом I). Биохимия, 67, 785-797. 34. Pepelina T.Yu., Chertkova R.V., Ostroverkhova T.V., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Givennikova V.G., Vinogradov A.D. (2009) Site-directed mutagenesis of cytochrome c: reactions with respiratory chain components and superoxide radical. Biochemistry (Moscow), 74(6), 625-632. 35. Grivennikova V.G., Vinogradov A.D. (2006) Generation of superoxide by mitochondrial Complex I. Biochim. Biophys. Acta, 1757, 553-561. 36. Виноградов А.Д., Гривенникова В.Г. (2005) Генерация супероксид-радикала NADH: убихинон оксидоредуктазой митохондрий сердца. Биохимия, 70, 150-159. 37. Grivennikova V.G., Cecchini G., Vinogradov A.D. (2008) Ammonium-dependent hydrogen peroxide production by mitochondria. FEBS Lett., 582 , 2719-2724. 38. Северин С. Е., Соловьёва Г. А. (1989) Практикум по биохимии, МГУ, М. 39. Gomes A., Fernandes E., Lima J. L.F.C. (2005) Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J. Biochem. Biophys. Methods 65, 45-80 54 40. Tarpey M.M., Fridovich I. (2001) Methods of detection of vascular reactive species. Nitric oxide, superoxide, hydrogen peroxide, and peroxynitrite. Circ Res., 89, 224-236. 41. Massey V., Hofmann T., Palmer G. (1962) The relation of function and structure in lipoyl dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry, 237, 3820-3828. 42. Jacobus W.E., Saks V.A. (1982) Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties indused by coupling to oxidative phosphorilation. Arch. Biochem. Biophys., 219, 167-178. 43. Kotlyar A.B., Vinogradov A.D. (1990) Slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. Biochim. Biophys. Acta, 1019, 151-158. 44. Виноградов А.Д., Лейкин Ю.Н., Липская Т.Ю. (1977) Биохимия митохондрий. Издательство Московского Университета. 45. Gostimskaya I.S., Grivennikova V.G., Zharova T.V., Bakeeva L.E., Vinogradov A.D. (2003) In situ assay of intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem., 313, 46-52. 46. Reed J.K. (1973) Studies on the kinetic mechanism of lipoamide dehydrogenase from rat liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry, 248, 4834-4839. 47. Williams C. H., Arscott L. D., Schulz G. E. (1982) Amino acid sequence homology between pig heart lipoamide dehydrogenase and human erythrocyte glutatione reductase. Biochemistry, 79, 2199-2201. 48. Grivennikova V.G., Kotlyar A.B., Karliner J.S., Cecchini G., Vinogradov A.D. (2007) Redox-dependent change of nucleotide affinity to the active site of the mammalian complex I. Biochemistry, 46, 10971-10978. 49. Harris E. J., Basset D.J. (1971) Distribution of ammonia and methylamine between mitochondria and suspension medium. FEBS Lett., 19, 214-216. 50. Nelson D., Rumsey W.L., Erecinska M. (1992) Glutamine catabolism by heart muscle. Biochem. J., 282, 559-564. 51. The pathway of glutamine and glutamate oxidation in isolated mitochondria from mammalian cells. Biochem. J., 125, 757-763. 52. Massey V. (1966) Lipoyl Dehydrogenase from Pig Heart. Meth. Enzymol, 9 , 272-278. 53. Chance B., Boveris A., Oschino N., Loschen G. (1973) The nature of the catalase intermediate in its biological function, in: T.E. King, H.S. Mason, M. Morrison (Eds), Oxidases and Related Redox Systems, University Park Press, Baltimore, London, Tokyo, pp. 350-353. 55 54. Kudin A.P., Bimpong-Buta N.Y., Vielhaber S., Elger C.E., Kunz W.S. (2004) Characterization of superoxide-producing sites in isolated brain mitochondria. J. Biol. Chem., 279, 4127-4135. 55. Antunes F., Cadenas E. (2000) Estimation of H2O2 gradients across biomembranes. FEBS Lett., 475, 121-126. 56. Bienert G.P., Møller A.L., Kristiansen K.A., Schulz A., Møller I.M., Schjoerring J.K., Jahn T.P. (2007) Specific aquaporins facilitate the diffusion of hydrogen peroxide across membranes. J. Biol. Chem., 282, 1183-1192. 56
