Аннотация работ
advertisement
АННОТАЦИЯ по проекту под руководством д.б.н., профессора Ягужинского Л.С. по результатам 6 этапа Государственного контракта № П331 "Создание возобновляемых источников энергии" (шифр "НК-542П") от 07 мая 2010 по направлению "Физико-химическая молекулярная и клеточная биология" в рамках мероприятия 1.2.1 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук.", мероприятия 1.2 "Проведение научных исследований научными группами под руководством докторов наук и кандидатов наук", направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий" федеральной целевой программы "Научные и научнопедагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы. Настоящая программа направлена на изучение принципов работы, а также на изучение конкретного устройства природного топливного элемента, который локализован в митохондриях, хлоропластах и в микроорганизмах различных классов. Это система так называемого окислительного фосфорилирования, которая в последние десятилетия очень интенсивно исследуется в связи с тем, что принципы трансформации и транспорта энергии в этой системе гораздо более совершенны, чем те, которые в настоящее время используются человечеством. Эти системы имеют очень небольшие (нано-) размеры и гораздо более экономичны. Несмотря на очень большие успехи, достигнутые в последние годы в изучении этих систем, наши знания ещё недостаточны для того, чтобы создавать механизмы, подобные природным. Настоящий отчёт является одним из ключевых этапов исследования принципов работы вышеуказанных систем. До последнего времени основное внимание исследователей, изучающих проблему окислительного фосфорилирования, было сосредоточено на проблеме трансформации энергии окислительных реакций. Общепринятым является механизм, согласно которому электрохимический потенциал ионов водорода на мембране митохондрий образуется в результате трансмембранного переноса протонов В настоящее время общепринятым является механизм, согласно которому энергия окислительных реакций полностью трансформируется в электрохимический потенциал ионов водорода на мембране. В этом случае, в соответствии с моделью Митчелла, протон пересекает мембрану, переходя «из воды в воду». В других условиях протон не выходит из мембраны во внешнее пространство связываясь с мембраной в соответствии с моделью Вильямса. В этом случае часть энергии окислительных реакций запасается в форме сольватационного потенциала ионов водорода, связанных с отрицательно заряженными группировками на поверхности мембраны. В этом случае на поверхности мембраны образуются недиссоциированные ХН-кислоты, имеющие общее химическое название кислоты Бренстеда. Будет правильнее сказать, что в таких условиях энергия запасается в форме термодинамического потенциала электронейтральных кислот Бренстеда, которые обладают избытком свободной энергии. Ранее в серии экспериментов удалось определить процесс, который переключает механизм запасания энергии Митчелла на механизм Вильямса – это так называемый «процесс объёмной регуляции». Благодаря этому открытию удалось направленно фиксировать работу системы окислительного фосфорилирования в митохондриях в режиме того или иного механизма. В условиях работы дыхательных протонных помп механизм Вильямса формально может рассматриваться как стадия, предшествующая полному переносу протона «из воды в воду». Однако, данные, полученные нами ранее при помощи метода малоуглового рассеяния нейтронов, говорят о том, что переход фосфорилирующей системы в режим работы суперкомплекса сопровождается глобальной перестройкой структуры внутренней мембраны. Поэтому следует ожидать, что механизм локального сопряжения, который реализуется при стыковке внешней и внутренней мембран, должен принципиально отличаться от механизма работы фосфорилирующей системы в диссоциированном состоянии. В ходе выполнения предыдущих этапов проекта были завершены основные исследования, направленные на описание процесса локального сопряжения и связанного с ним эффекта взаимодействия ионов водорода с митохондриальными мембранами. Однако к началу настоящего этапа исследований отсутствовало чёткое понимание роли внешней мембраны митохондрий в процессе запасании энергии окислительных реакций, а также не была оценена значимость этого эффекта для создания искусственных генераторов и переносчиков энергии, основанных на принципах работы энергетических систем в биологических объектах.. Многие авторы сравнивают систему окислительного фосфорилирования митохондрий с топливными элементами. Такая формальная аналогия, действительно, правомерна, поскольку в топливных элементах, также как в митохондриях, происходит реакция восстановления кислорода и связанный с этим процесс генерации электрического потенциала. Согласно модели Митчелла, вся энергия окислительных реакций трансформируется в энергию электрохимического потенциала. Однако, как показывает простой расчёт, сопротивление мембран митохондрий слишком велико для того, чтобы получать значительный ток от последовательно соединённых генераторов такого типа. Поэтому с самого начала мы обратились к вопросу о латеральном переносе энергии на протонах Такое направление представлялось наиболее разумным, поскольку аналоги биологических минимашин (создание которых входит в план данного направления работ) должны использовать энергию в той же форме, в какой ее используют сами биологические машины, например, жгутики бактерий. Основное внимание в этом проекте было уделено изучению феномена связывания протонов, обладающих избытком свободной энергии, с поверхностью мембран митохондрий. В работе были найдены условия, в которых эстафетный перенос протона, но не электрическое поле, выступает в роли конкретного переносчика энергии. Был исследован также процесс переноса таких протонов с внутренней на внешнюю митохондриальную мембрану. Были найдены условия, при которых в стационарном режиме работы Н-помп протоны, связанные с внешней мембраной и обладающие избытком свободной энергии, находятся в псевдо-равновесии с такой же фракцией ионов водорода, связанных на поверхности внутренней митохондриальной мембраны. Результаты этих экспериментов дают важную информацию о механизмах переноса энергии в мембранных энергетических системах и будут более подробно обсуждены ниже в настоящем отчёте. Как отмечалось, электрон-транспортная система митохондрий формально может рассматриваться как топливный элемент, в котором энергия реакции восстановления кислорода жёстко сопряжена с системой генерации электрохимического потенциала на внутренней митохондриальной мембране. Таким образом, было показано, что в природе механизм генерации электрического поля сходен только чисто формально с механизмом, который лежит в основе работы топливных элементов. Природный генератор электричества имеет очень небольшие размеры и его создание в ближайшей перспетиве представляется реальным в связи со стремительным развитием методов нанотехнологии. Для выполнения задачи создания топливного элемента, основанного на принципах работы природных генераторов электричества в митохондриях, представляется необходимым выяснить особенности систем генерации и транспорта электрической энергии в мембранных биологических системах, в которых носителем энергии является не электрон, а ион водорода. В первую очередь мы исследовали терминальные стадии работы протонных помп, которые, согласно нашему предположению, должны быть включены в систему транспорта энергии окислительных реакций на АТФ-синтетазный комплекс. Как показали измерения, внутренняя и внешняя мембраны митохондрий представляют собой отрицательно заряженные изопотенциальные поверхность, которые обеспечивают достаточную эффективность связывания ионов водорода в процессе работы фосфорилирующей системы и возможность эффективного перемещения протона в плоскости мембраны. Целью настоящего этапа работы является выявление физико-химических механизмов, лежащих в основе процесса транспорта энергии окислительных реакций на АТФсинтетазный комплекс и установление общей картины системы транспорта энергии мембраносвязанными протонами в митохондриях. До настоящего времени общепринятой была модель транспорта энергии, предложенная П. Митчеллом, которая основана на постулате, согласно которому перенос энергии в митохондриях осуществляется в форме электрохимического потенциала ионов водорода на внутренней митохондриальной мембране. В настоящем отчёте рассмотрен принципиально иной механизм предложенный Р.Вильямсом, согласно которому транспорт энергии осуществляется мембраносвязанными ионами водорода в рамках мультиферментного мембранного суперкомплекса. Обоснование возможности существования такого механизма потребовало проведения глубоких экспериментальных исследований. Успех был достигнут при сопоставлении результатов трёх независимых способов доказательств функционирования системы транспорта энергии в митохондриях на мембраносвязанных протонах. В этом случае система переходит в структурное состояние суперкомплекса. Основное внимание в этих работах было уделено регистрации эффекта образования фракции ионов водорода, которые метастабильно связаны с митохондриальной мембраной и выполняют роль переносчиков энергии окислительных реакций на АТФсинтетазную систему. Ниже приведены доказательства способности фракции неравновесно связанных с мембраной ионов водорода выступать в роли переносчиков полезной энергии для синтеза АТФ. Показана способность ионов водорода переносить энергию в форме сольватационного потенциала. Кроме того было обнаружено неожиданное свойство ионов водорода переносить энергию окислительных реакций в условиях их связывания с внешней митохондриальной мембраной. При этом были найдены условия, при которых становится возможным перенос мембраносвязанных ионов водорода между внутренней и внешней мембранами в процессе синтеза АТФ. Первая серия этих исследований была проведена в нашей лаборатории с помощью ковалентно присоединённого к митохондриальным мембранам рН-зонда. Во второй серии исследований нами был использован метод регистрации изменений поверхностного заряда (дзетта-потенциала) на мембранах митохондрий и митопластов, которые были вызваны включением протонных насосов. В третьей серии исследований, выполненных в рамках настоящей программы в течение последних месяцев, удалось найти реагент, который избирательно взаимодействует с фракцией мембраносвязанных ионов водорода. Избирательность взаимодействия этого реагента определяется повышенной реакционной способностью (повышенной свободной энергией) неравновесно связанных с мембраной протонов. В результате тремя независимыми способами доказано, что в условиях работы протонных помп на поверхности мембран митохондрий образуется фракция мембраносвязанных энергопереносящих протонов. Были исследованы специфические свойства протонов в составе этой фракции. Было показано, что катализаторы (слабые основания) ускоряют реакцию отрыва протонов от поверхности мембраны, уменьшая тем самым объём фракции до минимальных значений. Также было показано, что энергопереносящие протоны, связанные на поверхности мембран митохондрий в зонах межфазных границ, также как АТФ-синтетазная система, избирательно взаимодействуют со слабыми основаниями ароматического ряда, обладающими высокой поверхностной активностью. Иными словами, найден класс соединений, которые имитируют свойства АТФ-синтетазы – её высокое сродство к фракции мембраносвязанных энергопереносящих ионов водорода. Таким образом, на примере ТХФ-С15 найдена общая структура специфических акцепторов энергопереносящих. На митохондриях в условиях синтеза АТФ зарегистрирован неожиданный новый эффект неравновесного связывания ионов водорода с внешней поверхностью наружной митохондриальной мембраны. Была получена достаточно полная информация о путях миграции и свойствах мембраносвязанных протонов, обладающих избытком энергии. На заключительном этапе работы для исследования температурозависимых фазовых переходов во внутренней мембране в живых (интактных) митохондриях был использован метод малоуглового рассеяния нейтронов. Была изучена ультраструктура крист интактных митохондрий, в которых сохранена активность системы окислительного фосфорилирования. В митохондриях печени и сердца крыс обнаружены ультраструктурные перестройки внутренней митохондриальной мембраны в условиях осмотического набухания этих органелл. При этом было зарегистрировано появление дифракционных пиков, свидетельствующих об образовании упорядоченных структур. На митохондриях сердца зарегистрирован переход от ламеллярной упаковки мембран, которая наблюдается в нормальных условиях, к неламеллярной – гексагональной упаковке, которая дает на кривой рассеяния два пика с соотношением значений вектора рассеяния в их максимумах, равным 1 : 3^(0.5) . Помимо этого, методом электронной микроскопии были получены данные, подтверждающие возможность образования гексагональной упаковки внутренней мембраны в митохондриях сердца.
