На правах рукописи АМАХИН Дмитрий Валерьевич ВЗАИМОВЛИЯНИЕ ГАМК- И ГЛИЦИНЕРГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
advertisement
На правах рукописи АМАХИН Дмитрий Валерьевич ВЗАИМОВЛИЯНИЕ ГАМК- И ГЛИЦИНЕРГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРИ РЕГУЛЯЦИИ ВОЗБУДИМОСТИ НЕЙРОНА 03.03.01 – Физиология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Николай Петрович ВЕСЕЛКИН ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук, профессор Александр Алексеевич АЛЕКСАНДРОВ доктор биологических наук, профессор Денис Борисович ТИХОНОВ ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Учреждение Российской академии наук Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Защита диссертации состоится «12» апреля 2011 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.127.01 при Учреждении Российской академии наук Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, г. Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Автореферат разослан «____»______________2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук М.Н. Маслова ОБЩАЯЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Долгое время считалось, что каждый отдельный нейрон центральной нервной системы (ЦНС) высвобождает только один тип нейромедиатора из всех своих синаптических окончаний. Данная идея была названа Экклсом «принципом Дейла». С конца 70-х годов появились многочисленные работы, показывающие, что несколько нейропептидных медиаторов могут присутствовать в качестве нейромодуляторов в одном нейроне совместно со всеми видами быстрых нейромедиаторов. Затем была выявлена ко-локализация классических нейромедиаторов. На сегодняшний день продемонстрировано, что в различных отделах ЦНС позвоночных многие классические нейромедиаторы могут быть совместно локализованы в одном нейроне. Например, была продемонстрирована совместная локализация ацетилхолина и ГАМК (Jia et al., 2003), ГАМК и серотонина (Barreiro-Iglesias, Cornide-Petronio et al., 2009), ГАМК и АТФ (Jo and Schlichter, 1999), глутамата и ацетилхолина (Li et al., 2004; Nishimaru et al., 2005), дофамина и ГАМК (Barreiro-Iglesias, VillarCervino et al., 2009), дофамина и серотонина (Zhou et al., 2005), глутамата и дофамина (Hnasko et al., 2010), глутамата и ГАМК (Seal and Edwards, 2006; Somogyi, 2006), а также ГАМК и глицина (Todd et al., 1996). Таким образом, согласно существующей на данный момент модели, одиночный нейрон представляет собой гибкую систему с вариабельным набором нейромедиаторов, высвобождаемых в разных сочетаниях. При этом продемонстрирована возможность как высвобождения разных сигнальных веществ в разных высвобождения синапсах нескольких одного нейрона, сигнальных веществ так в и совместного одном синапсе (Виноградова, 2000). Дальнейшие исследования этой особенности нервных клеток показали, что при совместном высвобождении нескольких сигнальных веществ, процессы, запускаемые ими, могут влиять друг на друга. 3 ГАМК и глицин – основные тормозные нейромедиаторы центральной нервной системы аминокислотами. позвоночных. Ионотропные Оба этих рецепторы, вещества являются активируемые данными нейромедиаторами, принадлежат к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов и имеют сходное строение (Jentsch et al., 2002). Но при этом, особенности процесса торможения, вызываемого действием глицина и ГАМК, могут существенно отличаться. На нейронах млекопитающих продемонстрировано, что ГАМК и глицин могут совместно накапливаться в одной синаптической везикуле и совместно высвобождаться в синаптическую щель (Jonas et al., 1998; O'Brien and Berger, 1999). Результаты, демонстрирующие возможность совместного высвобождения глицина и ГАМК в спинном мозге лягушки, были получены в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия с применением как иммуноцитохимических, так и электрофизиологических методов. Так, например, результаты иммуноцитохимических исследований показывают, что в значительном проценте тормозных синапсов (70%) на мотонейронах спинного мозга лягушки возможно совместное высвобождение глицина и ГАМК (Аданина et al., 2010). Также сотрудниками этой лаборатории продемонстрировано наличие трех типов миниатюрных тормозных потенциалов, вызываемых спонтанным высвобождением глицина, ГАМК и совместным высвобождением глицина и ГАМК из одной синаптической везикулы в синапсе на мотонейроне спинного мозга лягушки (Полина et al., 2006). Таким образом, можно заключить, что в нейронах спинного мозга лягушки существуют физиологические условия для осуществления взаимодействий процессов, вызываемых одновременной активацией рецепторов глицина и ГАМК. В настоящий момент имеется информация о взаимодействии ответов, опосредованных активацией глициновых взаимодействие проявляется в и особенностях ГАМКА-рецепторов. ответов нейронов Это на одновременное действие нейромедиаторов. Продемонстрировано, что в 4 нейронах млекопитающих ГАМК-глициновое взаимодействие носит сложный нелинейный характер и характеризуется окклюзией ответов и их перекрестной десенситизацией (Li et al., 2003; Li and Xu, 2002; Russier et al., 2002). Охарактеризованы некоторые молекулярные механизмы, участвующие в осуществлении данного взаимодействия (Li et al., 2003). Но в целом, особенности регуляции возбудимости нейрона посредством одновременной активации рецепторов глицина и ГАМК изучены недостаточно. Основным объектом, на котором проводятся исследования взаимодействия ГАМК- и глицин-опосредованных процессов являются нейроны различных отделов ЦНС млекопитающих. Имеющиеся сведения о ГАМК-глициновом немногочисленны взаимодействии и у противоречивы. результаты позволяют заключить, что низших Полученные позвоночных предварительные особенности ГАМК-глицинового взаимодействия у низших позвоночных существенно отличаются от таковых у млекопитающих. Исследование этих особенностей позволяет пролить свет на эволюционное развитие механизмов тонкой регуляции возбудимости нейронов. Амфибии, как эволюционное звено, практически не исследованы в ракурсе этой проблемы и поэтому представляют собой интересный объект. В представленной работе объектом исследования являются свежевыделенные переживающие нейроны поясничного отдела спинного мозга лягушки (Rana temporaria, Rana ridibunda). Целью работы является выяснение возможных механизмов взаимодействия ГАМК- и глицин-опосредованных ответов мотонейронов спинного мозга лягушки. Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи: Исследовать свойства ответов, вызываемых действием глицина и ГАМК на нейроны спинного мозга лягушки. Исследовать взаимовлияние ГАМК- и глицин-опосредованных ответов при различных физиологических условиях 5 Проверить возможность реализации известных из опубликованных исследований механизмов ГАМК-глицинового взаимодействия Научная новизна работы Впервые описано взаимодействие ГАМК- процессов в нейронах спинного мозга амфибий. и глицинергических Выявлены основные факторы и механизмы, влияющие на его протекание. Впервые показано, что в нейронах спинного мозга амфибий ГАМК в физиологических концентрациях может с относительно высокой эффективностью активировать рецепторы глицина, что играет важную роль при совместном действии этих нейромедиаторов. Научно-практическое значение работы. Данное исследование посвящено малоизученным особенностям процесса торможения активности нейрона. Результаты проведенного исследования представляют интерес для общей нейрофизиологии, нейробиологии, физиологии и биофизики нервной клетки. Они вносят существенный вклад в понимание механизмов торможения и его регуляции в нервной системе позвоночных. В работе впервые проведено прямое сопоставление результатов, полученных методом пэтч-кламп и методом внутриклеточного отведения, и даны объяснения полученным различиям результатов, что представляет методический интерес и позволяет выявить новые особенности применения электрофизиологических методов. Результаты настоящей работы могут быть полезны для понимания эволюционного развития тормозной рецепции у позвоночных. Полученные результаты могут быть использованы при разработке рациональных подходов лечения расстройств нервной системы, связанных с нарушением тормозных процессов. Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях: Одиннадцатая и Двенадцатая Всероссийской исследователей медико-биологической «Фундаментальная наука конференции и клиническая молодых медицина», проходившие в Санкт-Петербурге, 2008 г. и 2009 г., соответственно; XXI 6 съезд российского проходивший в физиологического Калуге, 2010 г.; общества им. И.П.Павлова, Корейско-Российский научно- технологический форум, проходивший в Москве, 2010 г. Также результаты были представлены и обсуждены на коллоквиумах и семинарах лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия ИЭФБ им. И.М.Сеченова РАН Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах и 5 публикаций в сборниках тезисов. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 269 источников. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 44 рисунка, 5 таблиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом настоящего исследования являются нейроны спинного мозга лягушки. Большая часть исследований проводилось методом пэтчкламп на изолированных нейронах в режиме фиксации напряжения. Часть данных была получена с помощью метода внутриклеточного отведения от нейронов изолированного спинного мозга. В дальнейшем, при описании результатов исследования, по умолчанию будет подразумеваться, что использовался метод пэтч-кламп. Если использовался метод внутриклеточного отведения, то на это будет сделано указание в тексте. Регистрация методом пэтч-кламп. Эксперименты выполнялись на изолированных нейронах спинного мозга озерных (Rana ridibunda) и травяных (Rana temporaria) лягушек. Различий между результатами, полученными на нейронах лягушек разного вида, выявлено не было, так что экспериментальные данные были объединены. Для исследования отбирались взрослые особи обоего пола с типичными для своего вида окраской и размерами. В опытах было использовано более 100 животных. Производилось выделение нейронов поясничного утолщения спинного мозга 7 по ранее описанной методике с помощью сочетания ферментативной обработки срезов спинного мозга и их механической диссоциации (Adachi et al., 1990; Akaike et al., 1985; Akaike et al., 1989; ffrench-Mullen et al., 1988). Изолированные нейроны оседали на дно экспериментальной камеры, перфузируемой раствором №1 (Таблица 1). В результате диссоциации в камере оказывалось множество нейронов разнообразной формы и размеров. Для опытов использовались клетки с размером сомы 5-50 мкм с максимально сохраненными отростками и неповрежденными клеточными мембранами. После выбора клетки к ней с помощью наноманипулятора DTI Nanotechnology NM3D подводилась микропипетка, заполненная каким либо пипеточным раствором (растворы 2-4 из таблицы 1), и производилось касание поверхности нейрона. Пипетка изготавливалась на пуллере Sutter Instrument P-87 из трубочек боросиликатного стекла (Sutter Instrument, наружный диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 0,86 мм). Внутренний диаметр кончика изготовленной пипетки составлял около 2 мкм. За счет адгезионных свойств стекла и клеточной мембраны формировался плотный контакт. Создание отрицательного давления в пипетке приводило к прорыву участка мембраны, расположенного под кончиком (происходил переход в конфигурацию «целая клетка»). Мембранный потенциал фиксировался на значении -100 мВ. Данное значение способствовало наиболее длительному поддержанию хорошего функционального состояния нейрона. Дальнейшая регистрация проводилась, если сопротивление системы микропипетканейрон составляло более 90 МОм, и клетка не проявляла признаков ухудшения функционального состояния. Нейрон, образовавший плотный контакт с микропипеткой, изображен на рис. 2. Для регистрации ионных токов, проходящих через мембрану нейрона, использовался усилитель A-M Systems Model 2400. Запись тока через мембрану осуществлялась на жесткий диск персонального компьютера с помощью аналогово-цифрового преобразователя National Instruments USB-6211 (16 бит, 250 кГц) и 8 компьютерной программы Strathclyde Electrophysiology Software Whole Cell Analysis Program V4.1 (WinWCP). В ходе работы проводились аппликации различных веществ на нейроны. Все апплицируемые вещества разводились в растворе №1 (см. таблицу 1) до необходимых концентраций. Аппликация реактивов осуществлялась по описанному ранее методу концентрационного скачка (Vorobjev et al., 1996). Данный метод обеспечивает очень быструю смену апплицируемого раствора и низкий расход реактивов. Таблица 1. Растворы, используемые в экспериментах на изолированных нейронах Номера растворов и концентрации веществ (мМ) Наружный NaCl KCl CaСl2 MgCl2 KF HEPES Глюкоза ЭГТА АТФ* Щелочная фосфатаза** pH Доводка pH Пипеточные №1 160 4 2.5 2 10 30 7.4 NaOH №2 18 155 10 10 4 - №3 18 157 10 10 - №4 18 157 10 10 0.1 7.2 7.2 7.2 KOH KOH KOH * - использовался двунатриевая соль (Fluka) ** - использовалась щелочная фосфатаза типа VII-S из слизистой оболочки кишечника быка (Sigma) Сокращения: 9 АТФ – Аденозин-трифосфат, ЭГТА – этиленгликоль тетрауксусная кислота, HEPES – [4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulonic acid] Регистрация методом внутриклеточного Опыты отведения. проводили на препарате сегмента изолированного спинного мозга лягушки Rana ridibunda. Для исследования отбирались взрослые особи обоего пола с типичными для своего вида окраской и размерами. В опытах было использовано более 50 животных. Из выделенного спинного мозга вырезали IX и X сегменты (в виде фронтальных срезов толщиной около 2 мм). Один из них закрепляли на дно перфузируемой камеры ростральным срезом вверх. Для перфузии использовали раствор следующего состава (мМоль/л): 100 NaCl, 2 KCl, 0.5 MgCl2, 5.5 глюкозы, 1.5 CaCl2, 9 NaHCO3, 2 ТРИС, рН 7.4 7.6. Раствор непрерывно аэрировался карбогеном (98% О2 и 2% СО2) и имел температуру 16-18°С. Потенциалы отводились от мотонейронов IX или X сегментов с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных 3М раствором KCl, с диаметром кончика 1-1.5 мкм и сопротивлением 10-20 МОм. Микроэлектрод вводился вертикально в ростро-каудальном направлении. Для исследования отбирались мотонейроны, у которых ПД превышал 80 мВ по амплитуде, а значение потенциала покоя находилось в пределах от -80 мВ до -60 мВ. Для регистрации и записи изменений мембранного потенциала мотонейрона использовался разработанный в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия ИЭФБ РАН микроэлектродный усилитель с автоматической стабилизацией нулевой линии (Рябов Б.Т.). Сигналы с его выхода с помощью аналого- цифрового преобразователя L-card L780M (14 бит, 400 кГц) и компьютерной программы L-Graph записывались на жесткий диск персонального апплицировались путем переключения компьютера. Агонисты и антагонисты перфузирующего раствора на раствор, содержащий нужный агент в определенной концентрации. Для устранения конвульсивных эффектов в 10 ряде опытов добавляли блокатор НМДА рецепторов DL-2-амино-5фосфоновалериановую кислоту (AР-5). Обработка экспериментальных данных осуществлялась с помощью компьютерной программы Clampfit 8.2 из пакета PClamp 8.2 Axon Instruments. Для статистического анализа и графических построений использовались компьютерные программы Systat SigmaPlot 11 и Microsoft Excel 2007. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Свойства изолированных нейронов спинного мозга лягушки Нейроны, ферментативно изолированные из спинного мозга лягушки, четко разделяются по внешнему виду и электрофизиологическим свойствам на два типа – крупные мультиполярные, имеющие сопротивление мембраны 100-200 МОм и мелкие линзовидные (реже мультиполярные) с сопротивлением свыше 300 МОм (некоторые клетки имели сопротивление в несколько ГОм). Диапазоны значений сопротивлений крупных и мелких клеток практически не перекрываются. В результате сопоставления структурных особенностей изолированных клеток с особенностями нейронов, тип которых известен (Dityatev et al., 2001), можно утверждать, что в перфузируемой камере четко идентифицируются моторные и вставочные нейроны. При этом, несмотря на различия в сопротивлении мембраны и виде ответа на ступенчатые изменения мембранного потенциала, особенности взаимовлияния ГАМК- и глицинергических процессов, изучаемые в данной работе, одинаковы в моторных и вставочных нейронах спинного мозга лягушки. Это свидетельствует о том, что мотонейроны и интернейроны спинного мозга лягушки имеют одинаковые наборы рецепторов тормозных аминокислот и общие молекулярные механизмы взаимовлияния ГАМК- и глицинергических процессов. 2. Свойства ответов нейронов спинного мозга лягушки на 11 аппликации глицина и ГАМК Методом пэтч-кламп продемонстрировано, что все мотонейроны спинного мозга отвечают на аппликацию глицина и 99% отвечают на аппликацию ГАМК. Примеры токов, вызванных аппликацией данных нейромедиаторов в насыщающих концентрациях приведены на рис 1. Рис. 1. Примеры ответов, вызванных аппликацией 5 мМ глицина и 5 мМ ГАМК Характерной особенностью ГАМК-опосредованных токов является постепенное убывание их амплитуды со временем. Изменение амплитуды происходит до стабильного уровня, который остается неизменным все дальнейшее время эксперимента. Установление стабильных характеристик ответа на аппликацию 5 мМ ГАМК происходит в течение 5-10 минут в отсутствии внутриклеточного АТФ и в течение 15-20 минут при использовании пипеточного раствора, содержащего 4 мМ АТФ. Помимо амплитуды, также изменяются и временные характеристики ответа. Скорость данного изменения характеристик ответа зависит от наличия внутриклеточного АТФ и существенно ускоряется при добавлении во внутрипипеточный раствор щелочной фосфатазы – фермента, осуществляющего неселективное дефосфорилирование (см. рис. 2). Таким 12 образом, можно заключить, что наблюдаемые изменения опосредованы постепенным дефосфорилированием внутриклеточных доменов ГАМКАрецепторов. В литературе это явление носит название ран-даун (run-down) (Chen et al., 1990; Shirasaki et al., 1992). Глицин-опосредованные токи также в некоторой мере подвержены АТФ-зависимому изменению характеристик, но при этом их амплитуда остается неизменной, а увеличивается скорость десенситизации. Изменения характеристик ГАМК- и глицин-опосредованных ответов происходят до устойчивого, стабильного уровня, остающегося неизменным все время регистрации. Примеры изменения характеристик ГАМК- и глицин-опосредованных токов приведены на рис. 3 и рис. 4. Рис. 2. Изменение во времени амплитуды ответов на аппликацию 5 мМ ГАМК в присутствии 4 мМ АТФ (n = 9) и 100 мг/мл щелочной фосфатазы (n=4). Амплитуды токов нормированы на величину первого ответа. 13 Рис. 3. Ответы на аппликацию ГАМК, зарегистрированные без АТФ во внутрипипеточном растворе спустя различные промежутки времени с момента установления контакта нейрона с микропипеткой. Рис. 4. Усредненные ответы на аппликацию 5 мМ глицина (n = 4) и 5 мМ ГАМК (n = 7) в первую минуту и спустя 20 минут после образования контакта мотонейрона с микропипеткой. 14 Помимо амплитудных и временных характеристик ответа, в ходе рандауна снижалась чувствительность нейронов к ГАМК. Причем происходила не полная потеря чувствительности, а снижение до стабильного уровня, остававшегося постоянным в течение всего времени регистрации: концентрация половинного эффекта ГАМК растет с 0.5 мМ до 1.2 мМ. Чувствительность нейронов лягушки к глицину не изменяется со временем (концентрация половинного эффекта составляет около 30 мкМ). Зависимости амплитуды ответов от концентраций сигнальных веществ, иллюстрирующие данный эффект, приведены на рис. 5. Рис. 5. Зависимости амплитуды токов от используемых концентраций нейромедиаторов. Для глицина n = 11. Для ГАМК-опосредованных ответов приведены две зависимости: полученная в первую минуту эксперимента (n = 8) и полученная по истечении 15 минут от начала эксперимента (n=6). Ответы нормированы на амплитуды токов насыщения. 15 Зачастую, ответы на аппликации глицина и ГАМК имели в своих спадах длительный недесенситизирующийся компонент. На рис. 6 приведен пример подобного ответа. Этот компонент мог присутствовать в спаде как глицинопосредованных ответов, так и ГАМК-опосредованных, хотя в большей мере он характерен для последних. Как правило, он пропадал спустя некоторое время с начала эксперимента, причем вероятность его исчезновения зависела от внутриклеточного АТФ. Длительный недесенситизируемый компонент ответов не опосредован активацией ГАМКБ-рецепторов, поскольку не блокируется их антагонистом факлофеном. Можно предположить, что наличие длительного компонента в спаде ответа, обусловлено активацией других подтипов глициновых и ГАМКА- рецепторов (предположительно, внесинаптических), имеющих отличный от основного типа субъединичный состав и кинетику десенситизации. И внесинаптические глициновые и внесинаптические ГАМКА-рецепторы, обуславливающие длительный компонент спада, со временном снижают свою проводимость в отсутствии АТФ. Рис. 6. Пример ответа, спад которого имеет ярко-выраженный длительный недесенситизирующийся компонент, существующий все время аппликации агониста (отмечен стрелкой) 16 3. Взаимодействие ГАМК- и глицин-опосредованных ответов нейронов спинного мозга лягушки С помощью метода пэтч-кламп в конфигурации «целая клетка» и метода внутриклеточного отведения мембранного потенциала исследовались особенности суммации ответов на аппликацию глицина и ГАМК. Обоими применямыми экспериментальными методами было продемонстрировано, что ответ на совместную аппликацию глицина и ГАМК в подавляющем большинстве случаев меньше арифметической суммы индивидуальных ответов. Эффект проиллюстрирован на рис. 7, где приведены ответы на аппликацию насыщающих концентраций, при которых эффект наиболее нагляден. Амплитуда ответа на совместную аппликацию глицина (5мМ) и ГАМК (5 мМ), зарегистрированного методом пэтч-кламп, падает со временем с момента образования контакта мотонейрона с микропипеткой до уровня, незначительно превышающего амплитуду глицин-опосредованного ответа, то есть наблюдается постепенное увеличение степени окклюзии, пока она не станет полной. Установившееся совпадение совместного и глицинового ответа остается неизменным все последующее время регистрации. Скорость падения амплитуды, также как у ГАМК-опосредованного ответа, выше в отсутствии внутриклеточного АТФ. Целью дальнейших экспериментов было выяснение возможных механизмов принимающих участие в осуществлении описанных эффектов. С целью активацией исследования глициновых взаимовлияния и процессов, ГАМКа-рецепторов, запускаемых проводились последовательные аппликации данных нейромедиаторов через равные промежутки времени. В контрольной серии проводилось три аппликации ГАМК в насыщающей концентрации. При этом наблюдалось постепенное снижение амплитуды внутриклеточного АТФ ГАМК-опосредованных (проиллюстрировано апплицировать нейромедиаторы токов, на рис. зависящее 8). Но в порядке ГАМК-глицин-ГАМК, 17 от если то Рис. 7. А. Усредненные ответы на аппликацию 5 мМ глицина (n = 4), 5 мМ ГАМК (n = 7) и совместную аппликацию обоих нейромедиаторов (n = 6) в первую минуту после образования контакта мотонейрона с микропипеткой. Б. Примеры ответов на аппликацию глицина, ГАМК и смеси глицина и ГАМК в указанных концентрациях, зарегистрированных методом внутриклеточного отведения. Серым цветом обозначен гипотетический ответ, полученный арифметическим ответов. 18 суммированием индивидуальных происходит резкое изменение характеристик ГАМК-опосредованнного ответа (рис. 8 и рис. 9). То есть, даже однократная активация глициновых рецепторов приводит к ускорению ран-дауна ГАМК-опосредованных ответов. Таким образом, можно заключить, что существовует эффективный механизм блокирования ГАМКа-рецепторов при активации глициновых рецепторов, функционирующий через фосфорилирование внутриклеточных доменов последнего. Аналогичного действия ГАМК на глицин- опосредованные ответы не наблюдалось. Рис. 8. Три аппликации, произведенные последовательно с интервалом 1,5 минуты. А. Контрольная серия из трех последовательных аппликаций ГАМК. Наблюдается постепенное снижение амплитуды ответа. Б. Аппликация глицина, приводит к резкому падению амплитуды ГАМКопосредованного ответа. 19 Рис. 9. Сопоставление ответов на аппликацию ГАМК до и после действия глицина (последние ответы в сериях, изображенных на рис. 21). Величина токов нормирована на амплитуду начального ГАМК- опосредованного ответа, зарегистрированного перед аппликацией глицина. Другим фактором, способным оказать влияние на особенности суммации индивидуальных ответов, является селективность рецепторов к своим нейромедиаторам. Из опубликованных данных известно, что ГАМК в больших не физиологических концентрациях способен активировать рецепторы глицина. В ходе выполнения работы методом пэтч-кламп были получены свидетельства, что у лягушки данная неселективная активация может проходить в нормальных условиях при физиологических концентрациях агониста. Во-первых, в ответе на аппликацию ГАМК в насыщающей концентрации присутствует значительный компонент, устойчивый к блокированию антагонистом ГАМКа-рецепторов габазином, 20 что проиллюстрировано на рис. 10. При этом данный компонент может быть заблокирован антагонистом глициновых рецепторов – стрихнином. Вовторых, как уже упоминалось выше, ран-даун ГАМК-опосредованных токов, происходит до определенного уровня, при котором амплитуда установившегося ответа примерно в 2 раза ниже амплитуды исходного ответа. Данная установившаяся амплитуда стабильна все дальнейшее время эксперимента. Установившийся ответ по своей амплитуде совпадает с ответом на аппликацию ГАМК, зарегистрированным в присутствии габазина (проиллюстрировано на рис. 10) и может быть заблокирован антагонистом глициновых рецепторов стрихнином. Таким образом, можно заключить, что установившаяся после протекания ран-дауна чувствительность нейронов к ГАМК опосредована неселективной активацией глициновых рецепторов, при этом концентрации половинного эффекта ГАМК при его действии на глициновые рецепторы превышает концентрацию половинного эффекта глицина на свои рецепторы всего в 41 раз (1.2 мМ для ГАМК и 30 мкМ для глицина). Третьим фактором, оказывающим влияние на суммацию эффектов глицина и ГАМК являются модуляция ответов нейрона посредством постсинаптических ГАМКб-рецепторов. Методом пэтч-кламп продемонстрировано, что, несмотря на то, что агонист ГАМКб-рецепторов баклофен не дает самостоятельный ответ при аппликации его на клетку, он способен обратимо снижать амплитуду глицин-опосредованных токов. Есть все основания считать, что данный эффект имеет место при совместной активации глициновых и ГАМКб рецепторов, которое происходит при совместном высвобождении глицина и ГАМК. Эффект антагониста ГАМКбрецепторов факлофена на ГАМК-опосредованные ответы статистически недостоверен. 21 Рис. 10. Действие SR95531 (габазина) на токи, опосредованные аппликацией 5 мМ ГАМК. А. В первую минуту эксперимента габазин в концентрации 5 мкМ блокирует ГАМК-опосредованный ответ на 30-40%. Слева приведены исходный ответ и ответ, полученный после добавления габазина. Ответ, приведенный справа, зарегистрирован спустя 20 минут без применения габазина и по своей амплитуде соответствует ответу, полученному в первую минуту после блокады габазином. Б. Сопоставление амплитуд ГАМК-ответа, полученного в первую минуту регистрации в присутствии габазина и ответа, зарегистрированного спустя 20 минут в отсутствии габазина. Амплитуды нормированы на величину начального ГАМК-опосредованного ответа. n = 4. Различия значений амплитуд статистически недостоверны (парный критерий Стьюдента). 22 Одним из основных инструментов регуляции эффективности тормозной синаптической передачи посредством глицина и ГАМК является фосфорилирование внутриклеточных доменов глициновых и ГАМКАрецепторов (Chen et al., 1990; Gentet and Clements, 2002; Moss and Smart, 1996). Как уже упоминалось выше, в нейронах спинного мозга лягушки степень фосфорилирования этих доменов в значительной степени определяет как характеристики ответов на аппликацию глицина и ГАМК, так и особенности взаимодействия ГАМК- и глицинергических процессов: по мере прохождения ран-дауна ГАМК-опосредованных ответов, степень окклюзии увеличивается. Для выяснения наличия каких-либо связанных с фосфорилированием механизмов модуляции взаимодействия ГАМК- и глицинергических процессов производилось сопоставление характеристик ответов нейрона, зарегистрированных в отсутствии внутриклеточного АТФ и в присутствии 4 мМ АТФ во внутрипипеточном растворе. Сопоставление проводилось как на начальном этапе регистрации, когда ран-даун ГАМКА-рецепторов еще себя не проявил, так и на этапе, когда произошел полный ран-даун ГАМКАрецепторов. Результаты наглядно представлены на рис. 11. Поскольку временные характеристики ответов на аппликации глицина или ГАМК слабо зависят от внутриклеточного АТФ (отличия характеристик, полученных без и с АТФ во внутрипипеточном растворе не достоверны как на начальном этапе регистрации, так и спустя 20 минут), логично ожидать такого же поведения от ответов, опосредованных совместной аппликацией глицина и ГАМК. Но на практике в присутствии АТФ наблюдается достоверное увеличение полуширины ответов, на любом этапе эксперимента. Данная особенность взаимодействия ГАМК- и глицин-опосредованных ответов может возможности свидетельствовать модуляции о временного существовании течения дополнительной процесса торможения активности нейронов спинного мозга посредством какого-либо АТФзависимого механизма. 23 Рис. 11. Влияние внутриклеточного АТФ на амплитудные и временные характеристики ответов. Достоверные различия характеристик, связанные с фосфорилированием внутриклеточных доменов рецепторов, отмечены с помощью двухсторонних стрелок. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, из всего вышесказанного можно заключить, что на особенности взаимодействия ГАМК- и гицин-опосредованных ответов 24 влияют способность ГАМК неселективно активировать рецепторы глицина, способность глициновых рецепторов запускать механизм блокирования ГАМКА-рецепторов, способность ГАМКБ-рецепторов влиять на характеристики ГАМК- и глицин-опосредованных ответов. Благодаря процессу окислительного фосфорилирования осуществляется регуляция амплитудных характеристик глицин-опосредованного ответа, а также производится тонкая модуляция временного течения процесса, вызванного совместным действием глицина и ГАМК. Результаты, описанные в предыдущих подразделах, суммированы на рис. 12. Рис. 12. Общая схема взаимовлияния ГАМК- и глицинергических процессов в нейронах спинного мозга лягушки. На схеме отображена возможность высвобождения ГАМК и глицина в синапсах как по отдельности, так и совместно (изображены три синаптических окончания). Черными линиями показаны ингибирующие влияния глициновых рецепторов на ГАМКА-рецепторы и влияния ГАМКБ-рецепторов на глициновые. Также на схеме розовой стрелкой показана возможность 25 неселективной активации глициновых рецепторов посредством ГАМК и возможность существования гипотетических химерных рецепторов, чувствительных к обоим нейромедиаторам – двухцветный рецептор, отмеченный символом «?». ВЫВОДЫ 1) Взаимодействие ГАМК- и глицинергических процессов происходит одинаково в моторных и вставочных нейронах спинного мозга лягушки 2) На нейронах спинного мозга лягушки существует более одного подтипа глициновых и ГАМКА-рецепторов, активация которых приводит к возникновению ответов с различной кинетикой. 3) В нейронах спинного мозга лягушки существует эффективный механизм блокирования ГАМКА-рецепторов при активации глициновых рецепторов. Аналогичного механизма блокирования глициновых рецепторов при активации ГАМКА-рецепторов не обнаружено 4) ГАМК может в значительной мере неселективно активировать рецепторы глицина, что оказывает существенное влияние на взаимодействие ГАМК- и глицинергических процессов 5) ГАМКБ рецепторы могут модулировать взаимодействие ГАМК- и глицин-опосредованных ответов нейронов спинного мозга лягушки 6) Существуют механизмы тонкой регуляции взаимодействия ГАМК- и глицин-опосредованных процессов, осуществляющихся за счет реакции окислительного фосфорилирования 26 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи: Амахин Д.В., Веселкин Н.П., Характеристики и взаимодействия ГАМКи глицинергических процессов в нейронах спинного мозга лягушки, Российский физиологический журнал имени И.М.Сеченова, 2009, 95(4): 313323 Калинина Н.И., Курчавый Г.Г., Амахин Д.В., Веселкин Н.П., Различия в активации тормозных рецепторов мотонейрона лягушки Rana ridibunda ГАМК и глицином и их взаимодействие, Российский физиологический журнал имени И.М.Сеченова, 2008, 94(9), 1005-1016 Полина Ю.А., Амахин Д.В., Кожанов В.М., Курчавый Г.Г., Веселкин Н.П., Три типа тормозных миниатюрных потенциалов в мотонейронах спинного мозга лягушки: возможность ко-медиации ГАМК и глицина, Российский физиологический журнал имени И.М.Сеченова, 2006, 92(1), 1826 Тезисы: Amakhin D.V., Interactions between glycine- and GABA-mediated responses in spinal cord neurons, Korea-Russia Science & Technology Forum, Moscow, 2829, Oct., 2010 Амахин Д.В., Несимметричное взаимовлияние ГАМК- и глицинергических процессов в нейронах спинного мозга лягушки, тезисы XXI съезда физиологического общества им. И.П.Павлова, Калуга, 19-25 сентября 2010 г. Амахин Д.В., Характеристики и взаимодействие ГАМК- и глицинергических процессов в нейронах спинного мозга лягушки, тезисы Двенадцатой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина», СанктПетербург, 18 апреля 2009 Амахин Д.В., Курчавый Г.Г., 27 Калинина Н.И., Веселкин Н.П., Применение различных методов исследования действия ГАМК и глицина на мотонейроны спинного мозга лягушки, тезисы II съезда физиологов СНГ, Кишинев, 29-31 октября 2008 Амахин Д.В., Взаимодействие ГАМК- и глицинергических процессов в нейронах спинного мозга лягушки, тезисы Одиннадцатой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург, 19 апреля 2008 Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 08-0400098) и программы ОБН РАН 28