Брошюра Direct Detect
advertisement
Система количественного анализа биологических молекул Direct Detect Использование ™ мембранных технологий для высокоточной инфракрасной (ИК -) детекции Аннотация Система Direct Detect (система прямой детекции) Введение - спектрометрическая система, основанная на Ограничения использовании (ИК) количественного анализа белковых молекул. В излучения, является инновационным методом основе классических методов количественной количественного анализа биологических молекул. оценки белков лежат колориметрические способы Ключевым преимуществом этого метода является анализа, в том числе метод, основанный на новая мембранная технология подготовки жидких образовании комплексных соединений белковых биологических образцов молекул последующего проведения области инфракрасного с возможностью медью (анализ методов на основе анализа. бицинхониновой кислоты (БХК) и метод Лоури), Основываясь на большом опыте компании Merck а также детекция, основанная на связывании Millipore в области мембранных технологий, для красителей создания данной системы была использована концентрации гидрофильная политетрафторэтиленовая (ПТФЭ) спектроскопические методы с использованием мембрана, пропускающая большую часть спектра УФ/видимой части спектра. Каждый из этих ИК методов излучения, растворов с ИК с традиционных - возможностью нанесения биологических молекул (метод Брэдфорда белка обладает при рядом колориметрических и 660 анализ нм) или ограничений. способах В анализа непосредственно на саму мембрану. Система концентрация Direct Detect оптимизирована для детекции и сравнения образцов с неизвестным составом с количественного эталонными анализа белковых молекул. белков определяется стандартами путем (состоящими из Путем измерения пептидных (амидных) связей в общеизвестных белковых молекул, таких как белковой цепи, система определяет с высокой бычий степенью приготовленными точности внутренние компоненты сывороточный альбумин непосредственно (БСА)), перед каждой белковой молекулы, вне зависимости от применением для каждого эксперимента. В этом её аминокислотного состава, свойств связывания случае, результаты с кривой от красителем или окислительно- образца определения к образцу стандартной значительно восстановительного потенциала. 1 варьируют, оказывая влияние на точность и является дорогостоящим и длительным методом, воспроизводимость оценки концентрации белка. в случае если образцы направляются для анализа УФ третьей - методы исследования основаны на стороне. Если же оценка поглощении лучей ультрафиолетовой области аминокислотного состава осуществляется за счет спектра с длиной волны 280 нм ароматическими ресурсов самой организации, то в этой ситуации аминокислотами, преимущественно триптофаном остается и, в меньшей степени, тирозином. В этом случае, трудоёмкости пробоподготовки и требования к коэффициент наличию экстинкции белковых молекул нерешенной проблема высокой высокоспециализированного может широко варьировать (более чем двукратная оборудования. разница экстинкции Система Direct Detect наиболее универсальна в альбумина и иммуноглобулина G). При этом применении, имеет минимальные ограничения и такие белки как протеин А, не содержащие позволяет тирозин, количественную оценку белка при минимальных между не коэффициентом могут быть количественно осуществлять затратах волны 280 нм. Благодаря новой мембранной технологии система Анализ аминокислотной последовательности (АК Direct анализ) манипуляций и может быть использована при возможно, наиболее точную количественную оценку белка, однако, Каким образом Detect таких удобна, ценных быструю определены на основе абсорбции УФ при длине обеспечивает, зачастую более требует образцов. минимальных наличии различных образцов для исследования. ИК-спектроскопия обеспечивает универсальный, высокоточный количественный анализ? ИК-спектроскопия является одним из наиболее Первичная структура белков (общая для всех старых и хорошо известных экспериментальных белков) представлена длинной цепью амидных 1 технологий для анализа структуры белков. ИК- (пептидных) связей. Каждая амидная связь спектроскопия основана на способности молекул состоит из функциональных групп, способных к поглощать ИК излучение определенных частот в поглощению ИК излучения в девяти областях зависимости от их структуры. спектра (табл. 1). Таблица 1. Характеристика групп пептидной связи в зависимости от ИК спектров поглощения Наименование Приблизительная частота (см-1) Описание Amide A 3,300 NH валентныe колебания Amide B 3,100 NH валентныe колебания Amide I 1,600-1,690 C=O валентные колебания Amide II 1,480-1,575 CN валентные колебания, NH деформационные колебания 2 Наименование Приблизительная частота (см-1) Amide III 1,229-1,301 Amide IV 625-767 Описание CN валентные колебания, NH деформационные колебания OCN деформационные колебания 640-800 Amide V Внеплоскостные NH деформационные колебания 537-606 Amide VI Внеплоскостные C=O деформационные колебания 200 Amide VII Скелетные (торсионные) колебания Для определения концентрации белка система интенсивность пептидных связей. Как результат, система Direct поглощения ИК излучения амидной группой I Detect может быть использована для измерения (Amide I), 80% которой определяется валентными концентрации белков в диапазоне от 0.2 мг/мл до колебаниями С=О связи пептидной цепи с менее 5 мг/мл в течение нескольких минут, без значительным вкладом валентных колебаний С-N использования каких-либо био- или имунно- Direct Detect вычисляет оказывает влияния на количественную оценку химических 2 связи (рис.1) . Присутствие различных ряда общих буферных компонентов системах, таких в как способов окрашивания, непосредственно в образце, в том числе и в буферном растворе. детергенты, редуцирующие агенты и хелаторы, не Рис. 1. Колебания, определяющие полосы поглощения амидных групп Amide I и Amide II в ИК спектре белков. 3 10-2001-00) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Методы Белковая Подготовка образца продукции компании Merk Millipore: «The Direct Detect™ assay-free sample card» (Cat. No. DDAC00010-8P) и «The Direct Detect™ quantitation system» (Cat. No. DDHW00010-00). «The Direct Detect™ assay-free sample card» (Cat. No. DDAC00010-8P) содержит 4 рабочих состояла из бычьего сывороточного альбумина (Cat. No. 126609), Все количественные измерения проводились с использованием смесь зоны гидрофильной политетрафторэтиленовой С (Cat. No. 250600), алкогольдегидрогеназы (Sigma-Aldrich, Cat. No. A8656), трансферрина человека (Cat. No. 616395), конканавалина А (Cat. No. 234567), лизоцима (Cat. No. 5990), гамма-глобулинов (Sigma-Aldrich, Cat. No. G2018) кролика и протеина А (RepliGen, Cat. No. 10-2001-00) в растворе ФСБ. В качестве контроля концентрации всех белковых мембраны, растворов были определены с помощью анализа удобного АК последовательности (ААА). Для получения нанесения образца, окруженные гидрофобным раствора с концентрацией 1 мг/мл, лизоцим был кольцом, удерживающим образец в области ИК растворен в ФСБ в соотношении 1 к 68 (расчетная излучения. Все измерения проводились в расчете концентрация по ААА 68 мг/мл). Протеин А 2 мкл раствора образца на один рабочий сектор (расчетная концентрация по ААА 52 мг/мл) мембраны. растворен также в ФСБ в соотношении 1 к 13 для расположенные для (ПТФЭ) цитохрома максимально Калибровка прибора. Концентрация образца определялась с помощью калибровочного метода. В системе Direct Detect определение стандартной кривой осуществляется однократно при инсталляции прибора. Для постановки данного получения концентрации 4 мг/мл. Белковая смесь (концентрация по ААА использована в расчетной согласно ААА, а также 1.98 мг/мл) была концентрации, как разведение в соотношении 1 к 8. эксперимента система была откалибрована с Влияние примесей на количественный анализ использованием сертифицированного раствора белка. Потенциальное влияние детергентов и БСА SRM927d в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) редуцирующих (National Institute of Standards & Technology использованием известных концентраций БСА в (NIST)). Для построения калибровочной кривой растворе ФСБ (от 0.25 до 2 мг/мл) с добавлением прибора использована серия из 10 рабочих возрастающих концентраций растворов в диапазоне от 0.125 примесного вещества. Влияние Твин-20 (Tween® мг/мл до 5 мг/мл. 20) и Тритон Х (Triton® X) на количественную Белки, использованные для количественной оценки. Оценка качества работы системы Direct осуществлялась Detect динамическом в диапазоне заявленном концентраций с использованием чистых белковых растворов, а также белковых растворы смесей. подготовлены Чистые с белковые использованием лизоцима (Cat. No. 5990), растворенного в воде Milli Q, а также протеина А (RepliGen, Cat. No. оценку агентов исследовано концентраций белков протестировано с исследуемого в диапазоне концентраций детергента от 0,1 до 5%, а влияние NP40 проанализировано только при 1% концентрации. Влияние β-меркаптоэтанола (βmercaptoethanol) (BME) и дитиотриэтола (DL- dithiothreitol) (DTT) оценивали при концентрациях до мМ мМ, соответственно. 150 Потенциальное и 50 воздействие додецилсульфата натрия (SDS, sodium dodecyl sulfate) на количественную оценку белка 4 анализировали с использованием буфера, + 0.00267. В дальнейшем полученное уравнение используется ПО системы Direct Detect (Direct содержащего 1% детергента. Анализ лизата ткани. Лизат печени кролика был получен путем гомогенизации замороженной Detect™ software) для определения концентрации белков в анализируемых образцах. ткани печени в RIPA буфере, содержащим Динамический фосфатазу и коктейль ингибиторов протеаз с точность работы прибора. последующей получения серией чистого проведения центрифугирования раствора дальнейшего лизата. анализа до Для было подготовлено 40-кратное разведение исходного лизата в ФСБ, исключающее любое возможное содержание примесей. Система диапазон Direct использования рекомендуется Detect при концентраций работе с и для белковыми образцами в диапазоне концентраций от 0.2 до 5 мг/мл. Несмотря на возможность прибора регистрировать концентрации в более широких пределах - от 0.1 до 30 мг/мл, наиболее точные результаты все же достигаются в рекомендуемых Результаты пределах. Получение стандартной кривой. Система количественной оценки биологических молекул Точность Direct Detect откалибрована с использованием динамического диапазона была определена с сертифицированного использованием, раствора БСА (NIST- оценки концентраций как в пределах однокомпонентных certified BSA). Серия из 10 разведений (в трех белковых растворов, так и белковых смесей. повторностях) в диапазоне концентраций от 0.125 Полученные до 5 мг/мл использована для построения точной сопоставлены с данными, полученными при калибровочной прямой (рис. 2). проведении результаты анализа АК (рис. 3), были последовательности. Концентрация раствора лизоцима, определенная с помощью системы Direct Detect составила 0.922 ± 0.мг/мл, протеина А - 4.047 ± 0.184 мг/мл. Концентрация белковых смесей I и II составила 0.273 ± 0.016 мг/мл и 1.944 ± 0.028 мг/мл, соответственно. Рис. 2. Пример получения калибровочной прямой. Значения интенсивности стандартной пиковых сигналов амидных групп, полученные при измерении каждой концентрационной точки, формируют регрессионную линейную зависимость, отражаемую линейным уравнением y = 0.01379x 5 первого образца и 1.942 мг/мл с КВ = 1.5% для второго. Точность измерения для каждой позиции на карте продемонстрирована на рис.4. У образца с концентрацией 0.25 мг/мл, коэффициент вариации варьировал в пределах от 1.23 до 2.34%. Измерения образца с концентрацией 1.98 мг/мл показали наиболее точные результаты, с КВ в пределах от 0.1 до 0.3%. А. Белковая смесь (концентрация 0.25 мг/мл) Рис. 3. Результаты количественной оценки белков с помощью системы Direct Detect согласуются с данными, полученными при проведении анализа АК последовательности. С помощью Direct Detect определены концентрации образцов в пределах динамического диапазона и сопоставлены с референсным (эталонным) методом анализа АК последовательности. Погрешность полученных результатов не выходит за пределы нормальных допустимых значений стандартного среднего отклонения. Воспроизводимость и точность. В отличие от других, имеющихся в настоящее время способов Б. Белковая смесь (концентрация 1.98 мг/мл) оценки концентрации белков, система Direct Detect позволяет пользователю проводить несколько измерений без дополнительных затрат образца. «The Direct Detect™ assay-free sample card» (Cat. No. DDAC00010-8P) предоставляет возможность для проведения многократного анализа одного и того же образца с интервалом от нескольких часов до нескольких дней. Тестовые образцы, подготовленные с использованием белковых смесей в концентрации полученные для каждой из рабочих зон, также как Рис. 4. Система Direct Detect обеспечивает точный количественный анализ белковых смесей при концентрации 0.25 мг/мл (А) и 1.98 мг/мл (В). Каждая точка – результат 4 независимых измерений. Погрешность измерений не выходит за пределы нормальных допустимых значений стандартного среднего отклонения. и для всей карты, были сравнены. Средняя Измерение концентрации белков в буферных концентрация растворах, 0.25 и 1.98 мг/мл, были проанализированы несколько раз в каждой из рабочих позиций карты (3 позиции) для определения воспроизводимости полученных результатов. Каждая анализируемая карта была измерена 4 раза и результаты, составила 0.277 мг/мл с коэффициентом вариации (КВ, CV) 4.9% для содержащих детергенты и редуцирующие агенты. Система Direct Detect 6 позволяет проводить точную количественную энергии оценку (DL- функциональных групп. Полученные профили dithiothreitol) в растворе в концентрации до 50 спектров поглощения многих биохимических мМ. Влияние более высоких доз детергента не соединений различаются, что позволяет системе было Direct белка в исследовано, присутствии так как ДТТ большая часть колебательных движений определять Detect широкий его спектр экспериментальных протоколов, описывающих биологических молекул. Спектральный диапазон использование ДТТ системы Direct Detect подходит для анализа биологических образцов, при приготовлении указывает на белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов концентрации в пределах от 0.5 до 10 мМ. и Согласно исследование полученным данным BME (β- многих других молекул. сложного К образца примеру, клеточного mercaptoethanol) не влияет на количественную лизата (рис. 6) не только обеспечивает получение оценку в пределах точной 150 мМ). белков диапазона (до излучения SDS (sodium анализируемого Поглощение dodecyl sulfate) количественной оценки белковой ИК концентрации, но и предоставляет информацию о (в содержании липидов в анализируемом образце. концентрации до 1%) не перекрывается со спектром белковой абсорбции ИК излучения (рис. 5), что позволяет проводить количественную оценку белка в присутствии данного детергента. Наши исследования также демонстрируют, что количественные измерения, полученные с применением системы Direct Detect, остаются точными и воспроизводимыми в присутствии в растворе таких детергентов как Твин-20 (Tween® 20) и Тритон Х (Triton® X) в концентрации до 5% (данные не представлены). Рис. 5. Додецилсульфат натрия (SDS) не оказывает влияния на количественную оценку белков. Спектр поглощения ИК излучения SDS (показан голубым цветом) не вносит значительного вклада в интенсивность пика амидной группы в спектре поглощения белка в присутствии SDS (зеленый цвет на графике). Рис. 6. Количественная оценка белковых молекул в присутствии липидов в образце клеточного лизата возможна благодаря значительному отличию интенсивности пика поглощения ИК излучения липидами от спектральных пиков белковых амидных групп Amide I и Amide II. Заключение Система количественной оценки биологических Анализ небелковых компонентов. Практически молекул каждое органическое соединение поглощает ИК инновационную излучение с частотой волн, соответствующей количественного Direct Detect представляет разработку анализа в белковых собой области молекул, 7 обеспечивающую точный, независимый от модернизированная настольная система характера аминокислотной последовательности количественного анализа как Direct Detect будет белковый быстро интегрирована в среду жизни ученых расхода анализ, требующий анализируемого минимального образца. Точность работы системы и сопоставимость результатов, практически во всех областях научных исследований. полученных при проведении АК анализа, ставит Direct Detect в один ряд с наиболее надежными технологиями количественного анализа белков доступных на сегодняшний день. References 1. Kong, J., Yu, S., Fourier Transform Infrared Благодаря тому, что система основана на ИК- Spectroscopic детекции биологических молекул, пользователь Structure. Acta Biochimica et Biophysica Sinica получает точный и воспроизводимый результат 2007; 39 (8): 549–559. количественной оценки белков в присутствии 2. Jackson, M., Mantsch, H.H., The use and misuse редуцирующих агентов и детергентов. Система of FTIR spectroscopy in the determination of protein Direct также Detect информацию о позволяет получать присутствии небелковых Analysis of Protein Secondary structure. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 1995, 30 (2): 95-120. компонентов в растворе, таких как липиды. В дополнение к своим аналитическим возможностям система Direct Detect представляет собой инновационный избежать подход, традиционных подготовки образцов, проведения позволяющий рутинных способов необходимых количественного анализа. для После нанесения образцов «The Direct Detect™ assayfree cards» можно хранить в условиях окружающей среды без значительных изменений при дальнейшем считывании информации. Построение калибровочной кривой в системе Direct производится Detect однократно, что дополнительно сохраняет ваше время и облегчает работу с прибором. Поскольку сложных качества точная смесей и количественная оценка способствует улучшению воспроизводимости результатов, полученных в ходе проведения биологических и биохимических исследований, такая гибкая, 8 9
