О.В. Булгакова, Р.И. Берсимбай, Д.Д. Сарбасов Изучение роли

Л.Н. Гумилев атындағы ЕҰУ Хабаршыcы - Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, 2011, №2
О.В. Булгакова, Р.И. Берсимбай, Д.Д. Сарбасов
Изучение роли mTORC 2 в эмбриональном развитии эпителиальных тканей
мышей
( Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, г. Астана, Казахстан )
mTOR - серин-треониновая протеинкиназа, присутствующая в клетках как ратительных так и животных
организмов и играющая центральную роль в клеточном росте. mTOR является членом так называемого семейства
фосфатидилинозитол 3-киназ (PI3Ks). mTOR существует в двух функциональных комплексах - mTOR комплекс 1
(mTORC1) и mTOR комплекс 2 (mTORC2). Оба комплекса регулируют различные процессы, происходящие в клетке,
такие как биосинтез белка, аутофагия, пролиферация, выживание клети и клеточный метаболизм. На основании того,
что mTOR является центральным звеном многих сигнальных путей, многочисленные исследования показали важную
роль mTOR в патогенезе различных заболеваний человека, в том числе и в развитии раковых опухолей. Rictor - важный
компонент mTORC2. С целью изучения роли последнего в процессах эмбрионального развития млекопитающих нами
была создана линия трансгенных мышей, нокаутных по гену риктора в эпителиальных тканях.
Мишень рапамицина млекопитающих (mTOR), серин-треониновая протеинкиназа
семейства фосфатидилинозитол 3-киназ (PI3Ks) [1]. mTOR в виде каталитической
субъединицы входит в состав двух функциональных комплексов - mTOR комплекса 1
(mTORC1)[2] и mTOR комплекса 2 (mTORC2) [3]. Совместно эти комплексы регулируют
процессы синтеза белков, аутофагии, пролиферации, выживание клеток и изменение
клеточного метаболизма в ответ на действие факторов роста, изменения уровня аминокислот
и энергии в клетке. В состав выше упомянутых комплексов помимо mTOR входит
ряд полипептидов. mTOR является неотъемлемой частью многих сигнальных путей,
регулирующих деление, пролиферацию и рост клеток [4,5]. Нарушение регуляции mTOR
сигнального пути лежит в основе патогенеза различных заболеваний, таких как диабет и
болезнь Альцгеймера, а также играет большую роль в канцерогенезе. Однако механизм
этого сложного и многоэтапного процесса до конца не изучен. Rictor - важный компонент
mTORC2[6]. С целью изучения роли последнего в процессах эмбрионального развития
млекопитающих нами была создана линия трансгенных мышей, нокаутных по гену риктора в
эпителиальных тканях.
Материалы и методы исследования
Модельными животными для использования технологии инактивации гена в наших
исследованиях служили мыши линии STOCK Tg(KRT14-cre)1Amc/J. Выбор данных
животных в качестве объекта исследования был обусловлен следующими причинами:
приблизительно одинаковое число генов в геноме мыши и человека; сходство аминокислотных
последовательностей большинства белков человека и мыши; возможность изолирования
эмбриональных стволовых клеток с дальнейшей модификацией гена. Первая линия
трансгенных животных имела в своем геноме интегрированный ген Cre рекомбиназы,
экспрессия которого осуществлялась под контролем человеческого промотора К14. К14
экспрессируется в эпидермисе кожи, эпителиальных клетках, выстилающих полости
внутренних органов и желудочно-кишечного тракта, в эпителии желез внешней и внутренней
секреции.
У второй линии мышей таргетный ген - rictor был фланкирован парой loxP сайтов.
После проведения скрещивания гомозиготных животных K14CRE и Rictor lox/lox линий
было получено первое поколение трансгенных мышей, которые будучи гетерозиготами Rictor lox/wt содержали в геноме ген Cre рекомбиназы. Повторное скрещивание данных особей с
исходной родительской формой Rictor lox/lox должно было привести к появлению животных
с генотипом K14CRE Rictor lox/lox. Активация промотора К14 (14.5 день эмбрионального
развития), контролирующего активность гена Cre приводит к делеции фланкированного
участка и соответственно к инактивации гена rictor в эпителиальных клетках и эпидермисе
[7].
234
О.В. Булгакова, Р.И. Берсимбай , Д. Сарбасов
Генотип модельных животных определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
с применением соответствующих праймеров.
ДНК выделяли из тканей животных следующим образом: образцы инкубировали в
лизисном буфере (240 г. мочевины, 40 мл. 5 М NaCl, 20 мл. 0.5M EDTA (pH 8.0), 16.5 мл.
30% N-laurol sarcosine, 100 мл. 1 M Tris (pH 8.0), ddH2 O до 1 л.) в количесве 480 µ l на один
образец , в совокупности с 20 µ l протеиназы К (Roche) в течение 16 часов, при температуре
+55 ◦ С. После чего гомогенизат центрифугировали при 13000xg 5 минут. Полученный таким
образом супернатант смешивали с 1 мл 100% спирта этилового. Образовавшуюся в результате
преципитации ДНК растворяли в дистиллированной воде и инкубировали в течение 10 минут
при комнатной температуре.
ПЦР проводили по следующей схеме, к 1 µ l ДНК добавляли 7.5 µ l HotStar Taq Plus
полимеразы(Qiagen), 5.5 µ l ddH2O, и 1 µ l смеси праймеров (Sigma).
Для K14CRE использовались следующие праймеры:
5’ -GTGAAACAGCATTGCTGTCATT-3’
5’ - CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3’
5’ - GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC-3’
5’ GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC -3’
Для Rictor lox/lox:
5’- GAAGTTATTCAGATGGCCCAGC-3’
5’- ACTGAATATGTTCATGGTTGTG -3’
ПЦР проводилась в амплификаторе C1000TC Thermo Cycle
Цикл
1
35
1
Температура
95◦ С
94◦ С
60◦ С
72◦ С
72◦ С
4◦ С
Время
15 мин
1 мин
1 мин
1 мин
10 мин
Затем, проводили горизонтальный электрофорез в 1% агарозном геле. Разделение белков
проводили в 7.5% и 10 % полиакриламидном геле в присутствии додицил сульфата (SDSPAGE). Белки переносили на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы посредством
электроблоттинга. Буфером для переноса служил CAPS (8.9 г. CAPS (Amresco), 400 мл.
100 % спирта этилового,ddH2O до 3.6 л., 13 таб. NaOH). Затем блокировали мембрану в 5%
обезжиренном молоке в течение часа и инкубировали последовательно в первичных антителах
(2 часа) и вторичных антителах (1 час). Мембрану троекратно промывали в PBST (850 г.
NaCl, 115 г. N a2 HP O4 , 20,3 г. N a2 HP O4 на 10 л. ddH2 O , 50 мл. TWEEN, рH 7.2). Для
хемилюминисцентной деекции использовался Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore).
В экспериментах были использованы следующие антитела:
С-myc (9E10, Santa Cruz Biotechnology), FRAP(N-19, Santa Cruz Biotechnology), Tubulin (TU02, Santa Cruz Biotechnology), Rictor (S-20, Santa Cruz Biotechnology), Actin (C-2, Santa Cruz
Biotechnology), mTOR(7C10,Cell Signaling), Raptor (24C12, Cell Signaling), mono-HA (16B12,
Covance), S6K1 (Cell Signaling), pS6K1 T389 (Cell Signaling).
235
Л.Н. Гумилев атындағы ЕҰУ Хабаршыcы - Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, 2011, №2
Обсуждение полученных результатов
В противоположность mTORC1, mTORC2 на данный момент слабо изучен. Определенные
трудности, связанные с гибелью в период раннего эмбриогенеза мышей, нокаутных по гену
rictor, не позволяют в достаточной мере изучить данный комплекс in vivo.
Однако использование так называемой Cre loxP системы, позволяющей создать
тканеспецифичный нокаут необходимого гена, не нарушая при этом его экспрессию в других
тканях, сделало возможным изучение функциональной роли гена rictor в различных тканях
млекопитающих.
Речь идет о так называемом "программируемом нокауте генов"(conditional knockout)
"выключающем"гены в определенных условиях, а именно в необходимой ткани или группе
клеток и/или под воздействием индуцирующего вещества.
В основе данного метода лежит сочетание гомологичной рекомбинации и системы сайтспецифической рекомбинации. Сайт-специфические рекомбиназы - это ферменты, узнающие
особые участки ДНК и совершающие обмен между ними. Наиболее часто используются
Cre рекомбиназа бактериофага P1 и Flp рекомбиназа (флипаза) дрожжей. Эти ферменты
распознают нуклеотидные последовательности в 34 основания, называемые, соответственно,
loxP и frt сайты. Если эти последовательности расположены в одной ориентации,
рекомбинация по ним приведет к делеции фланкированного участка. Если же ориентация
последовательностей различна, то это приведет к инверсии фрагмента между ними.
Рис. 1 Схема механизма сайт-специфической рекомбинации
Использование стратегии "программируемого нокаута гена"требует создания двух линий
мышей. Линия А несет интегрированную в геном последовательность гена Cre под контролем
ткане-специфичного или индуцибельного промотора. Линия В содержит два loxP сайта,
фланкирующих подлежащую удалению последовательность исследуемого гена (в нашем случае
гена rictor). Следует отметить, что вставки в геномную последовательность loxP сайтов и гена
Cre осуществляются с использованием тех же приемов, что и при классическом нокауте генов,
но не должны затрагивать функциональные последовательности.
Полученные таким образом гомозиготные линии мышей скрещивают. У потомков от
этого скрещивания исследуемый ген будет инактивирован в ткани или группе клеток,
где будет активен промотор, контролирующий активность гена Cre. Используя стратегию
"программируемой инактивации гена", можно добиться результатов, недоступных при
использовании стандартной процедуры нокаута генов [8].
236
О.В. Булгакова, Р.И. Берсимбай , Д. Сарбасов
Рис. 2 Сre loxP система
Иммуноблотинг образцов, полученных из эпителиальных тканей эмбрионов, выявил
отсутствие фосфорилирования тирозинкиназы AKT, основной мишени mTORC2, по сайту S473
(рис.3) у эмбрионов с нокаутом rictor. Интересным является тот факт, что накаут rictor не имеет
выраженного эффекта в случае фосфорилирования другого сайта - Т308 (рис.3). Объясняется
это тем, что фосфорилирование AKT по данному сайту осуществляется не mTORC2, а киназой
PDK1.
Рис. 3. Вестерн-блот: mTOR, rictor, raptor, уровень фосфорилирования AKT в контроле (+/+ и +/- эмбрионы) и в
эмбриоах с нокаутом rictor (-/-)
Однако, по всей видимости, фосфорилирование лишь одного сайта не приводит к активации
AKT, и как следствие, происходит ингибирование mTORC1 сигнального пути и соответственно
синтеза белков, что в свою очередь приводит к внутриутробной гибели эмбрионов с генотипом
rictor-/- на 8.5 день эмбрионального развития. Что успешно доказали проведенные нами
исследования in vivo (рис.4)
Рис.4. Эмбрион 15.5 и 8.5 дней эмбрионального развития
237
Л.Н. Гумилев атындағы ЕҰУ Хабаршыcы - Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, 2011, №2
Заключение
В данных исследованиях, нами была создана линия трансгеных мышей rictor -/- в
эпителиальных тканях, с целью изучения in vivo роли mTORC2 в эмбриональном развитии
млекопитающих. Полученные результаты позволили нам сделать вывод, что белок rictor является важнейшим компонентом mTORC2 и необходим на ранних стадиях развития
млекопитающихся. Дальнейшие исследования в этом направлении сделают доступным нашему
пониманию весь тонкий механизм регуляции одного из важнейших сигнальных путей в клетке
- mTOR сигнального пути.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Harris T.E., Lawrence J. TOR signaling.// Sci.STKE 2003. Vol.2003 , P.212-215
2. Kim D.H., Sarbassov D.D., Ali S.M., King J.E., Latek R.R., et al. mTOR interacts with
raptort of ormanutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery.//Cell. 2002.
Vol. 110. P.163-175
3. Sarbassov D.D., Ali S.M., Kim D.H., Guertin D.A., Latek R.R., Erdjument-Bromage H.,
Tempst P., and Sabatini D.M. Rictor, a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycininsensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton.// Curr.Biol. 2004. Vol.
14. P. 1296-1302
4. Ballou L. M., Lin R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors.// J Chem Biol. 2008.
Vol.1(1-4), P. 27-36
5. Gingras A., Baught B., Sonenberg N. Regulation of translation initiation by
FRAP/mTOR.//Genes &Development. 2001. Vol. 15. P. 807-826
6. Sarbassov D. D., Guertin D. A., Ali S. M. and Sabatini D. M. (2005).Phosphorylation and
regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. //Science. 2005. Vol. 307. P. 1098-1101
7. Guertin D. A., Stevens D. M., Thoreen C. C., Burds A. A., Kalaany N. Y., Moffat J., Brown
M., Fitzgerald K. J. and Sabatini, D. M. Ablation in mice of the mTORC components raptor, rictor,
or mLST8 reveals that mTORC2 is required for signaling to Akt-FOXO and PKCalpha, but not
S6K1. //Dev. Cell. 2006. Vol.11. P. 859-871
8. Polak P., Cybulski N., Feige J.N., Auwerx J., Ruegg M.A., Hall M.N. Adipose-SpecificKnockout
of raptor Results in Lean Mice with Enhanced Mitocjondril Respration.// Cell Metabolism. 2008.
Vol.8. P. 399-410
Булгакова О.В., Берсимбай Р.I., Сарбасов Д.Д.
Тышқанның ұрықтық дамуы кезiндегi эпители ұлпаларынының mTORC 2 рөлiн зерттеу
Сүтқоректiлердiң рапамицинi (mTOR), фосфатидилинозитол 3- киназалар негiзiндегi серин-треониндi протеинкиназа
(PI3Ks)нысаны[1]. mTOR каталикалық суббiрлiк түрiнде екi функционалдық кешен - mTOR кешенi 1 (mTORC1) [2] және
mTOR кешенi 2 (mTORC2 )[3] құрамына кiредi. Бұл кешендер өзара ақуыз синтезi, аутофагия, пролиферация процесiн,
жасушалардың өсуiн және жасушалық метаболизм өзгерiсiнiң өсу факторларына, жасушадағы амин қышқылдарының
мен энергиясының деңгейдiң өзгерiсi әсерлерiне жауабын реттейдi. mTORдан тысқары жоғары көрсетiлген кешендерiдiң
құрамына полипептидтердi қатар кiредi. mTOR қысымды және жасушалардың пролиферациясы мен өсуiн реттейтiн
көптеген сигналдық жолдардың ажырамас бөлiгi болып табылады [4,5]. Сигналдық жолдың mTOR реттелуiнiң бұзылуы
әр түрлi патогенездiк аурулар альцгеймер, сондай-ақ диабет негiзi жатады, сонымен бiрге канцерогенездегi үлкен рөлдi
ойнайды
Бұл күрделi және көп сатылы процесстiң механизмi дегенмен ақырына дейiн зерттелмеген. Rictor - mTORC2 маңызды
компонентi [6]. Сүтқоректiлердiң соңғы ұрықтық даму процесстерiн зерттеу мақсатпен бiз трансгенных тышқандардың
ген бойынша эпители ұлпаларындағы рикторадың тiзбегiн жасадық.
Bulgakova O.V., Bersimbay R.I., Sarbasov D. D.
mTOR Complex 2 Is Required for the Development of Epithelial cells in Mice
mTOR is an atypical Ser/Thr kinase that is conserved in all species, and is a central controller of cellular growth. TOR is
the founding member of the phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases (PI3Ks) family. mTOR forms two functionally distinct
multiprotein complexes, mTORC1 and mTORC2. Together, these complexes coordinate a variety of processes that include
protein translation, autophagy, proliferation, survival and metabolism in response to nutrient, energy and growth factor signals.
Consistent with its role as a growth-promoting pathway, numerous studies have found that mTOR signaling is hyperactivated
238
О.В. Булгакова, Р.И. Берсимбай , Д. Сарбасов
in a broad spectrum of human cancers. Rictor is a specific and essential component of mTOR complex 2. To investigate a role of
mTORC2 in regulation of the Epithelial cells Development in mammals, we generated mice with an epithelial-specific knockout
of rictor.
Поступила в редакцию 11.01.11
Рекомендована к печати 25.01.11
239