Сборник тезисов - Институт микробиологии РАН
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО НАУЧНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ» РАН Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского Институт биоинженерии Институт биохимии им. А. Н. Баха РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ МОО «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО» ТЕЗИСЫ X МОЛОДЕЖНОЙ ШКОЛЫ–КОНФЕРЕНЦИИ С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ «АКТУАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ» 27 — 30 ОКТЯБРЯ 2015 г. Организационный комитет конференции Научный оргкомитет: Гальченко Валерий Федорович, член-корр. РАН — председатель Скрябин Константин Георгиевич, академик РАН — сопредседатель Попов Владимир Олегович, член-корр. РАН — сопредседатель Проф. Нильс-Коре Биркеланд, Университет Бергена, Норвегия Д-р Ховик Паносян, Ереванский Государственный Университет, Армения Оргкомитет: Пименов Н. В., д. б. н. — сопредседатель Равин Н. В., д. б. н., проф. — сопредседатель Дзантиев Б. Б., д.б.н., проф. Бонч-Осмоловская Е. А., д. б. н., проф. Дедыш С. Н., д. б. н. Мысякина И. С., д. б. н. Хижняк Т. В., д. б. н. Марданов А. В., д. б. н. Камионская А. М., к. б. н. Кубланов И. В., к. б. н. Юсупов С. К. Гальченко Н. В. — секретарь Адрес оргкомитета: 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского ФИЦ Биотехнологии РАН. Тел.: (499) 135-01-80, Факс: (499) 135-65-30, e-mail: natgal@inmi.ru, natgalch@gmail.com. Спонсоры конференции: 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВЫДЕЛЕНИЕ АЦИДОТОЛЕРАНТНЫХ DESULFOVIBRIO С ПОМОЩЬЮ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В БИОРЕАКТОРЕ Д. В. Анциферов, Т. С. Федорова, Е. А. Латыголец, А. Л. Герасимчук, А. А. Ковалева, Д. А. Ивасенко, О. В. Карначук .......................................................................11 СРАВНЕНИЕ КЛИНИЧЕСКОГО И ДИКОГО ШТАММОВ LISTERIA MONOCYTOGENES, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ОДНОГО ПРИРОДНОГО ОЧАГА Е. И. Аксенова, О. Л. Воронина, М. С. Кунда, А. Н. Семенов, Н. Н. Рыжова ............14 АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АКТИНОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЕЩЕРЫ БОЛЬШАЯ ОРЕШНАЯ Д. В. Аксенов-Грибанов, И. В. Войцеховская, С. В. Гамаюнов, Е. С. Протасов, М. А. Тимофеев .................................................................................................................................16 ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Г. П. Арапиди, Р. Х. Зиганшин, О. М. Иванова, М. С. Осетрова, П. В. Павлович, Т. М. Савельева, В. О. Шендер, С. И. Ковальчук, Н. А. Аниканов, В. М. Говорун, В. Т. Иванов ............................................................................................................................ 19 РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ У БАКТЕРИЙ: ПРАВИЛА И ИСКЛЮЧЕНИЯ Л. В. Асеев, Л. С. Колединская, И. В. Бони .......................................................................20 ПРОРАСТАНИЕ СПОР МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ В СВЯЗИ С ЭКЗОГЕННЫМ ПОКОЕМ Д. А. Бокарева, Г. А. Кочкина, Н. Е. Иванушкина, Е. П. Феофилова, И. С. Мысякина ......................................................................................................................23 СКРИНИНГ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ РОДА RHODOTORULA ПО ПРИЗНАКУ ПРОДУКЦИИ КАРОТИНОИДОВ Н. В. Бондаревич, А. В. Кантерова, Г. И. Новик.............................................................. 27 3 СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗ METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z И МETHYLOSINUS TRICHOSPORIUM OB3b К. А. Бочарова, О. Н. Розова, В. Н. Хмеленина, Ю. А. Троценко .................................30 МИКРОБНЫЕ БИОПЛЕНКИ, СФОРМИРОВАННЫЕ В АНАЭРОБНОМ ЛАБОРАТОРНОМ ПРОТОЧНОМ АНАММОКС-БИОРЕАКТОРЕ Е. А. Бочкова, Ю. В. Литти ..................................................................................................32 ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР БЕЛКОВОЙ И ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОЙ ПРИРОДЫ НА ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE А. А. Буданова, А. А. Широков, Л. Ю. Матора ................................................................ 34 ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ МЕЗОФИЛЬНЫХ АНОКСИГЕННЫХ НИТЧАТЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Е. И. Бурганская, М. В. Сухачева, В. А. Гайсин .............................................................. 36 НОВАЯ ПОЛИМОРФНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДИОКСИДИНА: СИНТЕЗ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ О. И. Верная, В. П. Шабатин, А. М. Семенов, Д. И. Хватов, Т. И. Шабатина ...........39 SPHAEROCHAETA SP. NOV., СПУТНИК ПСИХРОАКТИВНОЙ МЕТАНОСАРЦИНЫ METHANOSARCINA PORCELLINA SP. NOV В. М. Верхова, А. В. Ермакова, С. Н. Паршина ............................................................... 40 ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ EXP1 В ПРОЦЕССЕ МОРФОГЕНЕЗА БАЗИДИОМИЦЕТА LENTINUS EDODES Е. П. Ветчинкина, М. А. Купряшина, С. В. Петров, В. Ю. Горшков, Ю. В. Гоголев, В. Е.Никитина.........................................................................................................................43 СУЛЬФИДОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ ИЗ МИКРОБИОМА ДЕТЕЙ С АУТИСТИЧЕСКИМИ РАССТРОЙСТВАМИ А. Л. Герасимчук, П. А. Бухтиярова, О. В. Карначук ....................................................46 ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ АЦИДОТОЛЕРАНТНЫХ И УСТОЙЧИВЫХ К МЕТАЛЛАМ PENICILLIUM 4 Л. Б. Глухова, Е. В. Стрелкова, О. П. Иккерт, А. Л. Герасимчук, Э. Велес, О. В. Карначук ........................................................................................................................49 ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕРАЦИИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА МИКРОБНЫМИ ИЗОЛЯТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ КРИОЛИТОЗОНЫ А. С. Громова, А. В. Кусакина ............................................................................................. 52 РАЗНООБРАЗИЕ И ЭКОЛОГИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ РОДА NOSTOC: ЗОНАЛЬНЫЙ АСПЕКТ С. А. Дронова, А. Д. Темралеева .........................................................................................53 БАКТЕРИОРОДОПСИН: ДОСТУПЕН, ИЗУЧЕН, НЕПОНЯТЕН (РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ ОБЗОР) М. А. Дубинный ......................................................................................................................56 ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА И СТРУКТУРЫ ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ГЛИКОПОЛИМЕРОВ ПОВЕРХНОСТИ АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE ПРИ АДАПТАЦИИ К ТЕМПЕРАТУРНОМУ СТРЕССУ С. С. Евстигнеева, Ю. П. Федоненко, С. А. Коннова ......................................................57 АНАЛИЗ МЕТАБОЛИТОВ МХА PHYSCOMITRELLA PATENS, ЗАРАЖЕННОГО ФИТОПАТОГЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ Е. Д.Егорова, Г. П. Арапиди, И. А. Фесенко, А. Урбан, Р. А. Хазигалеева, А. Л. Шаварда, А. Н. Игнатов, С. В. Виноградова .......................................................... 60 ВЛИЯНИЕ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ МХА PHYSCOMITRELLA PATENS Е. Д. Егорова, С. В. Виноградова ........................................................................................62 ФИЗИОЛОГИЯ НОВОЙ ЖЕЛЕЗОВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЙ АРХЕИ РОДА PYROBACULUM И. М. Елизаров, К. С. Заюлина, В. В. Кадников, А. А. Корженков, И. В. Кубланов, С. Н. Гаврилов ........................................................................................................................63 ГИДРОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВОГО ТЕРМОФИЛЬНОГО ПЛАНКТОМИЦЕТА TEPIDISPHAERA MUCOSA А. Г.Ельченинов, О. Л.Ковалева, С. В.Тощаков, Е. А.Бонч-Осмоловская, И. В.Кубланов 1 .......................................................................................................................65 5 ГИДРОЛИЗ ПОЛИСАХАРИДОВ НОВЫМИ ГИПЕРТЕРМОФИЛЬНЫМИ АРХЕЯМИ К С. Заюлина , С. Н. Гаврилов, И. М. Елизаров, Д. А. Кожевникова, О. А. Подосокорская, С. В. Тощаков, Е. А. Бонч-Осмоловская, И. В. Кубланов ......68 ГИДРОЛИТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ПЛАНКТОМИЦЕТОВ СЕВЕРНЫХ БОЛОТ: ОЦЕНКА С ПОМОЩЬЮ МЕТАТРАНСКРИПТОМИКИ А. А. Иванова, С. Н. Дедыш .................................................................................................70 ТРАНСКРИПТОМИКА МИКОБАКТЕРИЙ Д. В. Игнатов, Е. Г. Салина, К. Б. Майоров, А. С. Апт, А. С. Капрельянц, Т. Л. Ажикина .........................................................................................................................73 ВЛИЯНИЕ ФУНГИЦИДА ФЕНИЛФЕНОЛА НА АКТИВНОСТЬ ЛИГНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ LENTINULA EDODES В. А. Ильюшин, Е. В. Плотников, О. В. Карначук .......................................................... 74 МЕТАГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОДЗЕМНОЙ БИОСФЕРЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ В. В. Кадников, Ю. А. Франк, А. В. Марданов, О. В. Карначук, Н. В. Равин ............77 ФАКТОРЫ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИЕ УСТОЙЧИОВСТЬ К ОРТОВАНАДАТУ У ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫХ ДРОЖЖЕЙ OGATAEA POLYMORPHA А. В. Каргинов, А. И. Бунеев, М. О. Агафонов .................................................................80 О ПРЕИМУЩЕСТВАХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПЛЁНОК В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД Т. В. Кирилина, А. С. Сироткин .........................................................................................81 АЭРОТОЛЕРАНТНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ А. И. Климко, Т. А. Чердынцева, А. Л. Брюханов........................................................... 84 KLEBSIELLA PNEUMONIAE: ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУЛЕНТНОСТИ И АНТИБИТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ В МОСКВЕ В 2013-2014 ГОДАХ А. И. Князева, Е. И. Асташкин, Н. Н. Карцев, Е. В. Комисарова, В. П. Мякинина, Т. И. Комбарова, Н. В. Воложанцев, Э. А. Светоч, Н. К. Фурсова ............................... 87 6 АНАЛИЗ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА СЕРЫ МАГНИТОТАКТИЧЕСКОЙ СПИРИЛЛЫ MAGNETOSPIRILLUM MOSCOVIENSE BB-1 В. В. Козяева, Д. С. Груздев, М. В. Дзюба ..........................................................................90 ВЛИЯНИЕ ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ PSEUDOMONAS И SERRATIA, НА РАСТЕНИЯ ARABIDOPSIS THALIANA А. С. Колегова, Е. В. Куприянова 2, И. А. Хмель ............................................................. 92 ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ, АКТИВНЫХ ПРОТИВ ГИПЕРМУКОИДНЫХ ШТАММОВ K. PNEUMONIAE Е. В. Комисарова, В. П. Мякинина, В. М. Красильникова, А. И. Князева, Е. А. Денисенко, Н. В. Воложанцев ....................................................................................94 ВНЕКЛЕТОЧНАЯ β-ГАЛАКТОЗИДАЗА ARTHROBACTER SULFONIVORANS — НОВАЯ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗА СЕМЕЙСТВА 2 А. А. Костеневич ....................................................................................................................97 ОПИСАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПОЧВ ПРИЭЛЬТОНЬЯ А. И. Кузнецова, Е. А. Иванова, М. С. Дуброва ............................................................. 100 ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛА АДАПТАЦИИ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ШТАММА ACHROMOBACTER RULANDII ST36 К АНТИМИКРОБНЫМ АГЕНТАМ НА ОСНОВЕ ДАННЫХ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ М. С. Кунда, О. Л. Воронина, А. Н. Семенов, Е. И. Аксенова, Н. Н. Рыжова ..........103 ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ СЕРЕБРЯНЫХ НАНОЧАСТИЦ БАКТЕРИЯМИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE М. А. Купряшина, Е. П. Ветчинкина, В. Е. Никитина .................................................105 БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОХИРАЛЬНЫХ СУЛЬФИДОВ В ОПТИЧЕСКИ ЧИСТЫЕ СУЛЬФОКСИДЫ КЛЕТКАМИ GORDONIA TERRAE Т. И. Кылосова, А. А. Елькин, В. В. Гришко, И. Б. Ившина .......................................108 НОВЫЙ ПОДХОД К ТРАДИЦИОННЫМ БИОЦИДАМ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В КАЧЕСТВЕ АНТИБИОПЛЕНОЧНЫХ АГЕНТОВ М. В. Журина, А. В. Ганнесен, С. В.Мартьянов, Н. А. Тетенева, В. К.Плакунов....112 7 ВЛИЯНИЕ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО КАТИОННОГО ФЛОКУЛЯНТА НА ПРОЦЕСС АНАЭРОБНОГО СБРАЖИВАНИЯ ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД А. А. Никитина, Ю. В. Литти ............................................................................................ 116 ВОЗБУДИТЕЛЬ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS — ХАРАКТЕРИСТИКА, ОПАСНОСТЬ И РЕГУЛИРОВАНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ А. И. Перфильева .................................................................................................................119 ЛЕТУЧИЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ БАКТЕРИЙ: ВЛИЯНИЕ НА БИОПЛЕНКИ И ИНДУКЦИЮ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В. А. Плюта, Т. А. Чуприянова, И. А. Хмель ..................................................................124 ПЕРЕСТРОЙКИ МОРФОЛОГИИ И УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОК НЕКОТОРЫХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ В. Н. Поливцева, Д. В. Росс, Н. Е. Сузина, В. П. Холоденко ........................................126 НЕБЕЛКОВАЯ АМИНОКИСЛОТА ВМАА КАК РЕГУЛЯТОР ОБРАЗОВАНИЯ И РЕПРЕССИИ ГЕТЕРОЦИСТ ЦИАНОБАКТЕРИИ NOSTOC SP. PCC 7120 А. А. Попова, Т. Р. Кравцова, О. А. Кокшарова ............................................................ 129 ФИБРИНОЛИТИЧЕСКАЯ И КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ МИКРОМИЦЕТОВ ASPERGILLUS USTUS И ASPERGILLUS OCHRACEUS Е. А. Попова, А. А. Осмоловский ......................................................................................130 СОВРЕМЕННЫЕ ДОЛОМИТОВЫЕ СТРОМАТОЛИТЫ ИЗ ПЕТУХОВСКОГО СОДОВОГО ОЗЕРА (АЛТАЙСКИЙ КРАЙ) О. С. Самылина, Л. В. Зайцева, М. А. Синетова............................................................ 133 ЦИКЛ МАННИТА ИГРАЕТ ВАЖНУЮ РОЛЬ В АДАПТАЦИИ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA К НИЗКИМ РН СРЕДЫ В. Ю. Секова, И. С. Клемешова ........................................................................................ 136 ДЕЙСТВИЕ ЗЕЛЕНОГО СВЕТА НА ОБРАЗОВАНИЕ БИОМАССЫ И ФЕРМЕНТОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫМИ ГРИБАМИ 8 Л. О. Соколянская, Л. Б. Глухова, Е. В. Плотников, О. В. Карначук, H. Vélëz, Р. А. Карначук ............................................................................................................................... 140 ХАРАКТЕРИСТИКА И РОЛЬ ГЛЮКОКИНАЗЫ ИЗ ОБЛИГАТНОГО МЕТАНОТРОФА METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z Н. П. Солнцева, О. Н. Розова, И. И.Мустахимов, В. Н.Хмеленина, Ю. А.Троценко .................................................................................................................................................141 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФАГОВОЙ ИНФЕКЦИИ В УСЛОВИЯХ ПРОТИВОДЕЙСТВИЯ CRISPR-CAS СИСТЕМОЙ А. В. Строцкая 1, Е. Е. Савицкая 2, К. В. Северинов 1,2 ................................................143 АНТИБИОТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ИНА-№1149: ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ М. А. Суконников, О. А. Лапчинская, А. В. Тимофеева, П. В. Кудан, Л. Г. Стоянова, В. Н. Ташлицкий .....................................................................................146 ПОЛИФАЗНЫЙ ПОДХОД К СИСТЕМАТИКЕ ПРОТОСИФОНАЛЬНЫХ ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ А. Д. Темралеева, С. В. Москаленко, С. А. Дронова, Ю. М. Бачура, Ю. С. Букин .149 ВЛИЯНИЕ ТРИС(ГИДРОКСИМЕТИЛ)АМИНОМЕТАНА И ИОННОГО СОСТАВА СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ Е. О. Титанова, Г. Л. Бурыгин .......................................................................................... 152 ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОГО АЦИДОФИЛЬНОГО САХАРОЛИТИЧЕСКОГО DESULFOSPOROSINUS, РАСТУЩЕГО В МИКРОАЭРОФИЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ Т. С. Фёдорова, А. А. Захарова, Д. А. Ивасенко, А. Л. Герасимчук, М. Р. Авакян, О. В. Карначук ......................................................................................................................154 ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ НОВЫМ ТЕРМОФИЛЬНЫМ THERMODESULFOVIBRIO ИЗ ПОДЗЕМНОЙ БИОСФЕРЫ Ю. А. Франк, А. П. Лукина, О. П. Иккерт, М. Р. Авакян, О. В. Карначук ..............157 ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ БОБОВЫХ КУЛЬТУР В АГРОЦЕНОЗАХ КРЫМА С. А. Хапчаева, В. С. Зотов, С. В. Дидович .....................................................................160 9 ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ — ГИДРОЛАЗ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА Л. М. Хасанова, А. В. Ильина, В. П. Варламов .............................................................. 164 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИХ МОДИФИКАЦИЕЙ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Д. И. Хватов, О. И. Верная, В. П. Шабатин, А. М. Семенов, Т. И. Шабатина .........165 Различия в структурной организации мембран эубактерий и архей А. О. Чугунов*, Р. Г. Ефремов ........................................................................................... 167 ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗАНА НА АНТИБАКТЕРИАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСТАФИНА И ВАРНЕРИНА Б. Ц. Шагдарова, С. Н. Куликов .......................................................................................168 ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОБНОГО КОМПЛЕКСА ЛИСТВЕННОЙ ПОДСТИЛКИ ПРИ ПАССАЖЕ ЧЕРЕЗ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ ДВУПАРНОНОГИХ МНОГОНОЖЕК-КИВСЯКОВ А. В. Якушев, О. А. Фролов, К. К. Соболева ..................................................................170 10 ВЫДЕЛЕНИЕ АЦИДОТОЛЕРАНТНЫХ DESULFOVIBRIO С ПОМОЩЬЮ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В БИОРЕАКТОРЕ Д. В. Анциферов, Т. С. Федорова, Е. А. Латыголец, А. Л. Герасимчук, А. А. Ковалева, Д. А. Ивасенко, О. В. Карначук Национальный исследовательский Томский государственный университет Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томск, Россия Хотя сообщения о микробном восстановлении сульфатов в условиях низких рН известны из литературы давно (обзор см. Koschorreck, 2008), до сих пор выделены в культуру единичные сульфатредуцирующих бактерий к чистую спорообразующим представители (СРБ). Desulfosporosinus. СРБ, ацидофильных/ацидотолерантных Большинство способные из них образовывать относится сульфиды в условиях низких рН, важны для создания биотехнологических схем по очистке кислых шахтных дренажных вод. С точки зрения создания биотехнологических процессов, ацидофильные Desulfosporosinus имеют ряд недостатков, основным из которых является медленный и нестабильный рост. В этом отношении представители Deltaproteobacteria имеют преимущество по сравнению с грамположительными СРБ. Недавно был описан первый ацидотолерантный Desulfovibrio sp. TomC (Karnachuk et al., 2015). Выращивание СРБ в биореакторе может давать преимущества при выделении чистых изолятов, так как позволяет добиваться домнирования различных форм путем контролируемого изменения условий культивирования. Целью настоящего исследования была попытка выделить чистые культуры ацидофильных/ацидотолерантных СРБ с помощью культивирования в биореакторе. Первоначальная накопительная культура СРБ была получена в результате посева пробы ШГ-5 микробного обрастания из заброшенной штольни на Северо-Акатуевском месторождении по добыче цинковой руды (п. Новый Акатуй, Александрово-Заводской район, Забайкальский край). Температура воды в месте отбора пробы составляла 2,8 °С, рН 7,15 и Eh = + 271 mV. Анализ методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS) показал, что, несмотря на нейтральный рН, в воде присутствовали высокие концентрации таких металлов, как Fe (1044 мг/л), Cu (263 мг/л), Zn (1713 мг/л), Cd (32,3 мг/л), Pb (5,42 мг/л), U (2,57 мг/л), а также As (91,4 мг/л). Для получения первоначальной накопительной культуры из пробы ШГ-5 использовали пресноводную среду Видделя с добавлением лактата в качестве донора электронов. Начальный рН составлял 5,04. Накопительную культуру с признаками 11 сульфатредукции (образование сероводорода) использовали в качестве инокулята для биореактора объемом 2 л (Sartorius Biostat Bplus). Культивирование в биореакторе проводили в режиме периодической культуры на среде Видделя с лактатом. Для создания анаэробных условий биореактор продували газообразным азотом марки о.с.ч. При активном росте культуры продувка азотом позволяла также поддерживать концентрацию H2S в газовой фазе на уровне, нетоксичном для клеток накопительной культуры. Культивирование лимитирующего культивирования проводили (селективного) производили при фактора температуре использовали регулярный отбор pH 28 °С. В качестве среды. В процессе проб из биореактора для микроскопического контроля, измерения концентрации H2S (Cline, 1969), и белка по методу Лоури. Для контроля смены филотипов в культуре одновременно отбирали пробы для выделения тотальной ДНК и выделения доминирующих форм методом предельных разведений. ДНК выделяли с использованием набора PowerSoil DNA Kit (MoBio). Определение доминирующих филотипов проводили методом амплификации фрагментов гена 16S рРНК и дальнейшим их разделением путем гель-электрофореза в денатурирующих условиях (PCR-DGGE), как описано нами ранее (Frank et al., 2015). Аналогично, для определения филогенетического положения чистых культур, выделенных методом предельного разведения из биореактора, амплифицировали ген 16S рРНК с праймерами 27F и 1492R (DeLong, 1992; Weisburg et al., 1991) по описанным ранее протоколам (Карначук и др., 2009). Секвенирование проводили коммерчески в Центре «Биоинженерия» РАН. Рисунок 1. Изменение концентрации сероводорода, белка и уровня рН со временем при культивировании накопительной культуры ШГ-5 в периодической культуре в биореакторе. В отличие от серуокисляющих ацидофилов, образующих H+, СРБ в процессе диссимиляционной сульфатредукции потребляют протоны. Поэтому в отсутствие контроля в периодической культуре происходит повышение уровня рН. В условиях 12 нашего биореактора прироста биомассы не наблюдали до повышения рН до 7,39 (Рис. 1). Одновременно концентрация H2S увеличивалась до 133 мг/л. культивирования После 498 часов биомасса (717,8 мг/л), концентрация H2S (513,5 мг/л) и рН (7.83) достигли максимума. Начиная с этой точки, рН в биореакторе последовательно снижали. Снижение уровня рН приводило к преобладанию различных морфотипов на разных стадиях культивирования. Из пробы, отобранной из биореактора через 212 часов после начала культивирования, методом предельных разведений был выделен штамм, обозначенный VK, и из точки 357 ч — штамм ED. Анализ близких к полным последовательностей гена 16S рРНК показал, что штамм VK относится к роду Desulfovibrio и его ближайшим родственником является D. carbinoliphilus, сходство последовательностей с которым составляло 99 % . Штамм ED также относится к роду Desulfovibrio с ближайшим родственником D. idahonensis (99 % сходства последовательностей). На момент взятия проб 212 часов и 357 часов рН культуральной жидкости в биореакторе составлял 5,27 и 5.73, соответственно. Дальнейшие исследования показали, что оба новых штамма относятся к ацидотолерантным формам и могут расти при минимальном рН = 3.39 (Desulfovibrio sp. VK) и рН = 4.09 (Desulfovibrio sp. ED). PCR-DGGE анализ показал присутcтвие в биореакторе других организмов: Acinetobacter pittii (100 %), Acinetobacter calcoaceticus (99-100 %), Terrabacter terrae (96-97 %), Sulfurospirillum multivorans (100 %), Cupriavidus basilensis (100 %), Cellulomonas persica (99 %), Desulfovibrio aerotolerans (99-100 %), Desulfovibrio mexicanus (98-99 %). Таким образом, наше исследование показало, что культивирование накопительных культур микроорганизмов в биореакторе позволяет создавать селективные условия для преимущественного развития целевой группы и ее дальнейшего выделения в чистую культуру. Исследование было поддержано грантом ФЦП, соглашение № 14.575.21.0067 от 07.08.2014 г. Уникальный идентификатор прикладных научных исследований (проекта) RFMEFI57514X0067. 13 СРАВНЕНИЕ КЛИНИЧЕСКОГО И ДИКОГО ШТАММОВ LISTERIA MONOCYTOGENES, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ОДНОГО ПРИРОДНОГО ОЧАГА Е. И. Аксенова, О. Л. Воронина, М. С. Кунда, А. Н. Семенов, Н. Н. Рыжова Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия Введение. Листериоз — один из наиболее типичных сапронозов. Первичной средой обитания и резервуаром основного возбудителя — Listeria monocytogenes — является почва, откуда бактерии могут попадать на растении. Употребление в пищу зараженных L. monocytogenes овощей и продуктов животноводства вызывает вторую по смертности пищевую инфекцию после сальмонеллеза. Для контроля L. monocytogenes в природных очагах, продуктах и клиническом материале эффективны молекулярно-генетические методы. Например, метод мультилокусного секвенирования (Multilocus sequence typing, MLST) с последующим определением генотипа (sequence type, ST); а также изучение локусов факторов вирулентности (Multi-virulent-locus sequence typing, MvLST), в частности, профиля интерналинов — internalin gene profile (IP). В результатае MLST и MvLST анализа штаммов, выделенных в одной географической области из природного очага и от заболевшего листериозом, было показано их высокое сходство. Инструментом выявления отличий, приводящих к различной патогенности, является полногеномное секвенирование (Whole genome sequencing, WGS). Цель работы заключалась анализе секвенированных геномов клинического и дикого изолятов листерий для выявления факторов, отвечающих за адаптацию бактерий к различным условиям обитания и патогенность. Материалы и методы. Штаммы L. monocytogenes VIMVR081 (красная полевка, Приморский край, ST145, IP1) и VIMHA007 (мертворожденный, Хабаровский край, ST2, IP1) из коллекции лаборатории экологии возбудителей инфекции ФНИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи были секвенированы на платформе 454 (Roche) по двум протоколам «shotgun» (случайные фрагменты) и «pair end» (парные концы). Сборка проведена с помощью программного обеспечения GS Junior Software V2.7, V3.0 двумя способами — по референсу и de novo; первичное аннотирование выполнено на сервере RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology, http://rast.nmpdr.org). В качестве референсных использованы геномы, наиболее близкие по серовару, ST и IP, 14 из представленных в GenBank: L. monocytogenes ATCC 1911 (Accession Number FR733643.1, овца, серотип 4d, ST2, IP1), L. monocytogenes serotype 4b str. F2365 (Accession Number NC_002973.6, сыр, серотип 4b, ST1, IP5). Результаты. При сборке данных WGS были получены сходные по протяженности порядка 2,9 Mb последовательности геномов VIMVR081, VIMHA007 с 25-ти и 30-ти кратным покрытием. Первично аннотировано в RAST 2975 и 3043 рамок считывания (ORF), из которых 2874 и 2978 — CDS (coding sequences), кодирующие белки. Анализ группы мобильных элементов с помощью IS finder (https://www-is.biotoul.fr/) показал, что в референсных и собранных геномах IS относятся к однаковым семействам: IS3, IS1182. При поиске областей повторов генома, в частности CRISPR, (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, http://crispr.u-psud.fr/Server/), с помощью сервера CRISPR finder были выявлены только кандидатные области — 2 (VIMVR081) и 4 (VIMHA007). По результатам аннотирования в RAST, состав и структура выявленных категорий белков, участвующих в основных обменных процессах L. monocytogenes, были идентичны. Например, метаболизм РНК / ДНК / аминокислот и белков — 109/109/575 (VIMVR081) и 110/118/575 (VIMHA007); строение клеточной стенки / мембранный транспорт — 142/72 и 133/73; подвижность и «сигналинг» / деление и клеточный цикл — 115/51 и 121/53 белков. Определено сопоставимое количество гипотетических белков — 18,7 % (VIMVR081) и 17,1 % (VIMHA007), а также белков с сигнальной последовательностью — 6,9 % и 5,8 %, и трансмембранным доменом — 27,1 % и 25,9 %. Наибольшее сходство в группе проанализированных геномов отмечено между штаммами, выделенными из природных очагов: VIMVR081 (Дальний Восток), ATCC 1911 (Франция). У штаммов были идентичны 96,3 % кодируемых белков. Замены аминокислотных остатков выявлены только в 87 белках: в 66 — консервативные, и в 17 — радикальные. Отличающиеся белки участвуют в метаболизме углеводов (три из них кодирует оперон транспорта мальтозы — mal E, R, T); входят в транспортные системы, отвечающие за устойчивость к пенициллину, или относятся к факторам вирулентности. Сравнение всех 4-х геномов показало отсутствие различий в последовательностях основных факторов патогенности листерий, таких как интерналины классов A-E, белки Lma A-D, антиген В, металлопротеиназа Mpl, фактор регуляции транскрипции PrfA, белки, ассоциированный с инвазией — P60 и полимеризацией актина — ActA. Однако клинический штамм VIMHA007 отличало количество фагов. Профаг 22,9 Kb был выявлен во всех 4-х геномах с помощью сервера PHAST (PHAge Search Tool, http://phast.wishartlab.com/), в нем обнаружен ген антигена В листерий. Интактный фаг 15 20,5 Kb и профаг 11,4 Kb характерны только для генома клинического штамма. Генов специфических антигенов в этих участках не отмечено, преимущественно выявлены гипотетические белки или белки фага. Заключение. консервативность Таким геномов образом, результаты L. monocytogenes и подтвердили WGS позволили выявить высокую особенности клинического штамма, обосновывающего его патогенность для человека. АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АКТИНОБАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЕЩЕРЫ БОЛЬШАЯ ОРЕШНАЯ Д. В. Аксенов-Грибанов, И. В. Войцеховская, С. В. Гамаюнов, Е. С. Протасов, М. А. Тимофеев НИИ биологии ФГБОУ ВПО «ИГУ» Пещеры являются уникальными природными образованиями, которые характеризуются постоянным микроклиматом и минимальными флуктуациями условий среды. Основной целью настоящей работы было выделение новых штаммов актинобактерий из воды подземного озера и лунного молока пещеры Большая Орешная (55° 17′ 34.8″ N, 93° 44′ 8.52″ E,) с последующей оценкой состава и антибиотических свойств продуцируемых вторичных метаболитов. Выделение и культивирование штаммов актинобактерий выполнено на твердой питательной среде MS и DNPM при 28 °С с добавлением антибиотиков циклогесимида (50 мкг/мл) и фосфомицина (100 мкг/мл). Идентификацию штаммов проводили по гену 16S рРНК. Нуклеотидные последовательности изолятов размещены в GenBank под номерами KT266894-KT266903. Для культивирования микроорганизмов использовали питательные среды NL-19 (жидкая MS) и DNPM. Метаболиты из культуральной жидкости экстрагировали этилцацетатом, а из биомассы — смесью растворителей ацетон : метанол. Один из наиболее активных штаммов (Streptomyces sp. IB2014/78-8) был культивирован в объеме среды 1,5 литров. Экстракт данного штамма был разделен поминутно в ходе высокоэффективной жидкостной хроматографии в системе Ultimate 3000 HPLC system (Dionex) с применением колонки C18 (Affymetrix). Фракции, активные в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов, были проанализированы с помощью масс-спектрометрии высокого с использованием системы LC-QTOF System maXis II (Bruker, Billerica, USA). 16 разрешения Антимикробная активность экстрагированных метаболитов проанализрована с помощью диск-диффузионного метода в отношении Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas putida KT 2440, Escherichia coli ATCC25922, Saccharomyces cerevisiae BY4742 и Candida albicans DSM1665. Проведена оценка инсектицидной, гербицидной и фунгицидной активность экстрактов, а так же активность против патогенного штамма C. albicans (исследования проведены в Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (Saarbrucken, Germany). Проведенный скрининг выявил 10 штаммов актинобктерий на основе морфологических характеристик. Большинство штаммов выделено из лунного молока (8 из 10) и 2 штамма выделено из воды подземного озера. Филогенетический анализ выделенных штаммов на основе гена 16S рРНК показал, что все штаммы, выделенные из воды, относятся к роду Nocardia. Семь из восьми штаммов, выделенных из лунного молока, относятся к роду Streptomyces и один к роду Nocardia. Штаммы, выделенные из лунного молока, показали выраженную антибиотическую активность в отличие от штаммов, выделенных из воды подземного озера. Все активные штаммы относятся к роду Streptomyces. Пять штаммов, культивированные на среде DNPM, и шесть штаммов, культивированные на среде NL-19, были активны против грамположительных бактерий. В случае культивирования на среде DNPM экстракты, которые подавляли рост B. subtilis, были получены из биомассы Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-1, Streptomyces sp. IB 2014 /I/789; из культуральной жидкости Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-8, Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-3 и из агара, на котором росли штаммы Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-3 и Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-6. Штамм Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-8, культивированный на среде NL-19 не проявил активности против всех бактериальных и дрожжевых тест-культур, включая B. subtilis. Однако, два других штамма (Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-12 и Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-11), которые не подавляли рост B. subtilis при культивировании на среде DNPM, проявили антибиотическую активность против B. subtilis при культивировании на среде NL-19. Один штамм Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-8, культивированный на среде DNPM, и два штамма Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-6 и Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-3, культивированные на среде NL-19, показали активность против грамотрицательных бактерий – E. coli и P. putida. Несколько штаммов, культивированных на среде DNPM, показали специфическую активность против дрожжей. Так, два штамма Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-8 и Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-3 были активны против C. albicans. Однако, только один 17 штамм Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-3 подавлял рост S. cerevisae. Два штамма, включая упоминаемые выше Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-3 и Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-9 показали фунгицидную активность против представителей рода Fusarium. Для штамма Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-3 наблюдали активность всех видов тестируемых экстрактов при культивировании бактерии на обоих тестируемых средах. У экстрактов биомассы того же штамма отмечали инсектицидную активность. Активность против представителей рода Fusarium показана только у экстрактов из биомассы штамма Streptomyces sp. IB 2014 /I/789, культивированного на среде DNPM. Гербицидную активность не наблюдали у всех штаммов при всех исследуемых условиях. В ходе исследования проведен анализ состава вторичных метаболитов активных фракций штамма Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-8. Двадцать три минутные фракции штамма Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-8, культивированного на среде DNMP были исследованы в отношении антимикробной активности. Показано, что, семь фракций из 23 были активны против грамположительных и 4 фракции ингибировали рост грамотрицательных бактерий. Пять фракций подавляли рост патогенного штамма дрожжей C. albicans, однако не подавляли рост S. cerevisiae. В то же время у данного штамма обнаружено 122 соединения в активных фракциях. Двадцать два соединения могут быть предварительно идентифицированы на основе характеристик из базы данных Dictionary of Natural Products. Установлено, что штамм Streptomyces sp. IB 2014 /I/78-8 синтезирует два соединения, характерных для представителей рода Streptomyces: циклодизидин Д и хаксалактин Б. Другие соединения, которые нами были обнаружены в составе активных фракций штамма Streptomyces sp. были схожи с пиррол-2 аминоимидазол алкалоидом стилизазолем, ранее выделенным из морской губки Stylissa carteri, и эфиром гирофоновой кислоты – ингибитором диацилглицерол ацилтрансферазы. Таким образом, в ходе представленной работы из лунного молока и воды подземного озера Большой Орешной пещеры выделено десять штаммов актинобактерий. Показано, что штаммы, выделенные из лунного молока обладают выраженной антимикробной, фунгицидной и инсектицидной активностью. Большая группа выделенных штаммов способна подавлять рост патогенного штамма C. albicans. Эти штаммы представляют особый интерес для более детального исследования и характеристики активных веществ. На основании проведенной оценки состава вторичных метаболитов показано, что большинство вторичных метаболитов, продуцируемых исследованными штаммами, не встречаются в базе данных Dictionary of Natural Products. 18 Исследование МИНОБРНАУКИ проведено РФ при частичной (№6.382.2014/K), финансовой Российским поддержке фондом проекта фундаментальных исследований (проекты № 14-04-00501, 15-04-06685, 15-54-04062), грантом Иркутского государственного университета для поддержки молодых ученых и Немецкой службы академических обменов. Авторский коллектив выражает благодарность Ренату Викторовичу Адельшину за сотрудничество и помощь в секвенировании штаммов. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Г. П. Арапиди 1,2, Р. Х. Зиганшин 1, О. М. Иванова 1, М. С. Осетрова 1,2, П. В. Павлович 1,2, Т. М. Савельева 1,2, В. О. Шендер 1, С. И. Ковальчук 1, Н. А. Аниканов 1, В. М. Говорун 1,3, В. Т. Иванов 1 1 Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва, Россия 2 Московский физико-технический институт (Государственный Университет), Долгопрудный, Россия 3 Научно Исследовательский Институт Физико-Химической Медицина ФМБА, Москва, Россия Общее число микроорганизмов, живущих внутри человека составляет до 100 триллионов клеток, что соответствует десятикратному количеству клеток самого человека. Число уникальных генов микробиоты человека в 100 раз превышает число уникальных генов человека (Ley et al., 2006). Большинство микробов живут в кишечнике, оказывая глубокое влияние на физиологию и питание человека. Изменение микробиоты кишечника связывают с различными заболеваниями: ожирением, диабетом первого типа, циррозом печени (Lepage et al., 2014). Мы провели LC-MS/MS исследование образцов сыворотки крови 4 пациентов с лейкемией до начала химиотерапии, на 7 и 14 день после начала курса, а также 6 практически здоровых доноров. Пробоподготовку проводили на основании ранее разработанного нами высокопроизводительного и воспроизводимого метода выделения пептидов из сыворотки крови человека. Для идентификации использовали базу данных 19 известных белковых последовательностей человека по версии UniProtKB и БД известных белков 444 представителей микробиоты кишечника человека. В результате анализа масс-спектрометрических данных идентифицировано более 4000 уникальных пептидных фрагментов белков человека и около 300 пептидов, относящиеся к микроорганизмам, входящих в состав микробиоты кишечника человека. Достоверность идентификации пептидов была подтверждена рядом биоинформатических подходов, а также при помощи синтетических аналогов. По результатам пептидомного анализа сыворотки крови наблюдается воспроизводимое уменьшение видового разнообразия микроорганизмов в процессе химиотерапевтического лечения. Наибольшие изменения в составе микробиоты связаны с уменьшением числа пептидов, идентифицированных как фрагменты белков типов микроорганизмов Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Actinobacteria. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 1450-00131). РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА РИБОСОМНЫХ БЕЛКОВ У БАКТЕРИЙ: ПРАВИЛА И ИСКЛЮЧЕНИЯ Л. В. Асеев, Л. С. Колединская, И. В. Бони Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия Синтез белка у всех организмов происходит на рибосомах, сложных комплексах, состоящих из нескольких молекул рибосомной РНК (рРНК) и десятков различных рибосомных белков (р-белков). Для сборки рибосом необходимо координировать синтез всех рибосомных компонентов. Биогенез рибосом требует значительных энергетических затрат, поэтому экспрессия рибосомных генов строго регулируется каскадом механизмов, нарушение которых гибельно для клетки. Целью нашей работы является изучение механизмов регуляции генов бактериальных р-белков, обеспечивающих их сбалансированный синтез в стехиометрических количествах и координацию с синтезом рРНК в различных условиях роста. Гены бактериальных р-белков объединены в опероны, но ряд генов (у E. coli их 5) представляют собой независимые транскрипционные единицы. Регуляция синтеза р-белков может осуществляться на транскрипционном и трансляционном уровнях. На транскрипционном 20 уровне работает так называемый строгий контроль, при котором транскрипция активируется при росте на богатой среде, но резко снижается при голодании. В этой негативной регуляции участвуют низкомолекулярный алармон ppGpp и его кофактор, белок DksA. На уровне трансляции многие опероны р-белков контролируются механизмом аутогенной регуляции, при котором один из продуктов оперона подавляет трансляцию своей мРНК, если синтезируется в избытке по отношению к рРНК. В настоящее время регуляция изучена только для половины оперонов р-белков. В своей работе мы исследовали регуляцию оперонов р-белков rpsT (S20), rpsB-tsf (S2, Ts), rplY (L25), rplU-rpmA (L21, L27), rplM-rpsI (L13, S9), rpmB-rpmG (L28,L33). Для изучения транскрипционной регуляции сравнивали уровни транскрипции мРНК исследуемых генов в норме и при аминокислотном голодании, для чего применяли метод обратной транскрипции (ОТ) с последующей количественной ПЦР. Трансляционная регуляция изучалась in vivo в хромосомных конструкциях, несущих репортёрный ген lacZ под контролем регуляторных областей исследуемых генов. Штаммы, несущие генырепортеры, трансформировали плазмидами, экспрессирующими продукты исследуемых оперонов. По результатам изменения уровня экспрессии lacZ-репортера в трансформированных штаммах судили о наличии или отсутствии аутогенной регуляции. Как показали наши исследования, транскрипционный контроль работает для всех изученных оперонов, и их промоторы негативно регулируются алармоном ppGpp и его кофактором DksA при аминокислотном голодании, параллельно с промоторами рРНК. В то же время, оказалось, что не все опероны регулируются на уровне трансляции по механизму аутогенного контроля: rpsB-tsf, rplY и rplM-rpsI аутогенно регулируются белками S2, L25 и L13 соответственно, однако в случае оперонов rpsT, rplU-rpmA и rpmBrpmG трансляционная регуляция по принципу обратной связи не наблюдается. Оперон rpsT представляет собой интересный случай. Высоко консервативным элементом последовательности rpsT-мРНК у гамма-протеобактерий является слабый инициаторный кодон UUG. Замена его на канонический AUG в 5 раз усиливала трансляцию. Мы предполагаем, что в основе регуляции экспрессии rpsT-мРНК у гамма-протеобактерий лежит использование слабого инициаторного кодона, препятствующего избыточному синтезу белка S20, который токсичен для клетки. Таким образом, ppGpp-зависимая негативная регуляция является распространённым механизмом контроля транскрипции мРНК рибосомных оперонов при аминокислотном голодании, тогда как аутогенная регуляция трансляции наблюдается далеко не для всех оперонов р-белков. Очевидно, что регуляция трансляции по принципу обратной связи 21 не является универсальным механизмом, контролирующим уровень синтеза р-белков у E. coli и родственных бактерий. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты 12-04-01138а и 15-04-04597а). Результаты работы опубликованы в статьях: 1. Aseev L.V., Levandovskaya A.A., Tchufistova L.S., Scaptzova N.V., Boni I.V. (2008). A new regulatory circuit in ribosomal protein operons: S2-mediated control of the rpsB-tsf expression in vivo. RNA, 14(9): 1882-1894. 2. Асеев Л.В., Левандовская А.А., Скапцова Н.В., Бони И.В. (2009). Консервативность регуляторных элементов, контролирующих экспрессию rpsB-tsf оперона у гаммапротеобактерий. Молекулярная биология, 43(1): 111-118. 3. Асеев Л. В., Бони И. В. (2011). Внерибосомные функции бактериальных рибосомных белков. Молекулярная биология 45(5): 805-816. 4. Асеев Л.В., Колединская Л.С., Бони И.В. (2014).Анализ активности и регуляции удлиненного "-10" rpsB-промотора Escherichia coli in vivo. Биохимия. 79(8): 974-984. 5. Aseev L.V., Bylinkina N.S., Boni I.V. (2015). Regulation of the rplY gene encoding 5S rRNA binding protein L25 in Escherichia coli and related bacteria. RNA, 21(5):851-861. 22 ПРОРАСТАНИЕ СПОР МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ В СВЯЗИ С ЭКЗОГЕННЫМ ПОКОЕМ Д. А. Бокарева 1, Г. А. Кочкина 2, Н. Е. Иванушкина 2, Е. П. Феофилова 1, И. С. Мысякина 1 1 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия 2 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Всероссийская коллекция микроорганизмов, Пущино, Россия Споры — особая стадия в жизненном цикле мицелиальных грибов, характеризующаяся состоянием клеток, называемым покоем (dormancy). Это состояние гипометаболизма, позволяющее клеткам сохранять жизнеспособность при стрессовых/неблагоприятных воздействиях и переходить к процессу прорастания при наступлении благоприятных условий. У спор мицелиальных грибов различают несколько типов покоя, и среди основных рассматривают два — конститутивный и экзогенный. Конститутивный, или эндогенный, глубокий — отличается сложной многоступенчатой регуляцией процессов прорастания (цитоплазматическая регуляция). Для спор, находящихся в состоянии конститутивного покоя, появление воды недостаточно для перехода в стадию активного метаболизма, так как процесс контролируется системой цАМФ, ингибиторами и стимуляторами, системой клеточных барьеров и метаболических блоков. Считается, что второй тип покоя — экзогенный — отличается более простой системой регуляции, и для начала прорастания достаточно удалить лимитирующий фактор, которым чаще всего является отсутствие экзогенной воды. Этот тип покоя свойствен спорам, образованным бесполым путем, например, конидиям и спорангиоспорам. Тем не менее, несмотря на распространенность этого феномена в природе и все возрастающий интерес со стороны исследователей (Osherov, May, 2001; Gray et al., 2004; Kasuga et al., 2005; Lamarre et al., 2008), информация о нем еще весьма ограниченна. Споры представителей разных таксонов грибов (и даже представителей одного вида) могут иметь существенные различия в своем составе и особенностях выхода из поящегося состояния. Цель работы — сравнительное исследование прорастания спор представителей мицелиальных грибов аскомицетного аффинитета и зигомицетовых грибов и определение типа их покоя. 23 В работе использовали штаммы из коллекции ВКМ ИБФМ РАН, характеризующиеся разной скоростью роста: высокой — Aspergillus tamarii ВКМ F-64, Cunninghamella echinulata ВКМ F-663 и низкой — Aspergillus sydowii ВКМ F-441, Umbelopsis ramanniana ВКМ F-582. Грибы выращивали в пробирках со скошенным картофельно-глюкозным агаром (PDA) в течение 7 (или 30 сут) для получения обильного спорообразования. Стерильной водой смывали споры с поверхности мицелия, полученную суспензию отфильтровывали, обрабатывали на встряхивателе Vortex и подсчитывали число спор в камере Горяева. Прорастание спор на картофельноглюкозной среде (PDA) и 2 % «голодном агаре» (ГА), а также прорастание спор в стерильной воде и воде с добавлением сусла (3.5°Б в соотношении 4 : 1) оценивали с использованием световой микроскопии; температура инкубирования 22 °С. Сравнительное исследование процесса прорастания спор (конидий) двух изученных представителей Aspergillus показало, что они находятся в состоянии экзогенного покоя, но имеют разную скорость прорастания, которая зависит от наличия питательных веществ в среде (Рис. 1). Так, если для штамма A. tamarii ВКМ F-64 (слева), несмотря на разную длительность лаг-фазы, степень прорастания на богатой и бедной средах была практически одинакова — около 90 %, то для A. sydowii ВКМ F-441 (справа) на голодной среде она была значительно ниже — не более 15 % (против 95 % на богатой среде). Возраст посевного материала влиял на лаг-фазу прорастания, которая у молодых (7 сут) спор наступала раньше, чем у 30-суточных. Рисунок 1. Прорастание спор штамма Aspergillus tamarii ВКМ F-64 (слева) и A. sydowii ВКМ F-441 (справа) на различных средах: 1 — PDA, 2 — ГА, 3 — вода, 4 — вода с суслом. 24 Исследование процесса прорастания спор представителей зигомицетовых грибов показало, что для них также был характерен экзогенный покой, выход из которого проходил с разной скоростью, и характер прорастания спор различался в зависимости от наличия питательных веществ в среде. Однако споры C. echinulata ВКМ F-663 (Рис. 2А), в отличие от U. ramanniana ВКМ F-582 (Рис. 2Б), начинали прорастать сразу при попадании в воду, причем наличие питательных веществ в среде (источников углерода и азота) не было существенно для прорастания. Рисунок 2. Прорастание спор штаммов Cunninghamella echinulata ВКМ F-663 (А) и Umbelopsis ramanniana F-582 (Б) в жидкой среде (1, 3 — вода; 2, 4 — вода с добавлением сусла). Прорастание спор/конидий у большинства мицелиальных грибов требует присутствия низкомолекулярных питательных веществ — сахаров, аминокислот, неорганических солей и др. Полученные данные свидетельствует о том, что экзогенный покой спор C. echinulata ВКМ F-663 можно отнести к одному из видов, для выхода из которого наличия никаких других соединений, кроме воды, не требуется. У U. ramanniana ВКМ F-582 и представителей Aspergillus наблюдался другой тип экзогенного покоя, для выхода из которого и дальнейшего образования мицелия необходима не только вода, но и присутствие источников углерода и азота. Такой тип покоя ранее был показан у A. niger (Морозова и соавт., 2001). Имеющиеся в литературе сведения об изучении аскоспор стресс-толерантных аскомицетов свидетельствуют, что состояние покоя этих спор настолько глубоко, что для активации прорастания им необходим внешний триггер (Wyatt, 2013). Авторы связывают это с устойчивостью к воздействию стрессоров. В нашем случае по устойчивости к внешним воздействиям культура C. echinulata ВКМ F-663 имеет наиболее слабые позиции по сравнению с тремя другими. Споры многих представителей этого вида не способны сохранить жизнеспособность при сублимационной сушке, а период гарантированного хранения спор в почве также меньше, чем у других изученных в данной работе культур. Напротив, 25 представители вида A. sydowii, часто выделяющиеся из эстремальных местообитаний, в частности, из многолетнемерзлых отложений, устойчивы к действию температурных и осмотических стрессоров. И выход этих спор из состояния покоя был наиболее длительным и зависимым от наличия питательных веществ в среде. Тип покоя оказывает влияние на скорость прорастания спор, и многое в процессе выхода из него зависит от наличия экзогенных соединений, метаболизма углеводов, липидов и др. соединений, а также от условий, в которых происходило формирование спор. Дальнейшие исследования помогут получить данные, актуальные для применения в биотехнологии, например, для сохранения полноценного спорового материала, контроля за его прорастанием и, в конечном счете, за выходом целевых продуктов. Работа проводилась при финансовой поддержке РФФИ (грант № 15-04-03484_а). Osherov N., May G.S. The molecular mechanisms of conidial germination // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. P. 153‒160. Gray J.V., Petsko G.A., Johnston G.C., Ringe D., Singer R.A., Werner-Washburne M. "Sleeping beauty": quiescence in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. V. 68. P. 187–206. Kasuga T., Townsend J.P., Chaoguang T., Gilbert L.B., Mannhaupt G., Taylor J.W., Glass N.L. Long-oligomer microarray profiling in Neurospora crassa reveals the transcriptional program underlying biochemical and physiological events of conidial germination // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 6469–6485. Lamarre C., Sokol S., Debeaupuis J.-P., Henry C., Lacroix C., Glaser P., Coppee J.-Y., Francois J.-M., Latge J.-P. Transcriptomic analysis of the exit from dormancy of Aspergillus fumigatus conidia // BMC Genomics. 2008. V. 9. P. 417. Морозова Е.В., Баранова М.В., Козлов В.П., Меморская А.С., Феофилова Е.П., Терешина В.М. Особенности экзогенного покоя конидий Aspergilllus niger // Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С. 611‒619. Wyatt T.T., Wösten H.A.B., Dijksterhuis J. Fungal spores for dispersion in space and time // Adv. Appl. Microbiol. 2013. V. 85. P. 43‒91. 26 СКРИНИНГ ШТАММОВ ДРОЖЖЕЙ РОДА RHODOTORULA ПО ПРИЗНАКУ ПРОДУКЦИИ КАРОТИНОИДОВ Н. В. Бондаревич, А. В. Кантерова, Г. И. Новик Институт микробиологи НАН Беларуси, Минск, Беларусь Колонии нефотосинтезирующих гетеротрофных дрожжей родов Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Sporidiobolus имеют красную и оранжевую окраску спелых плодов и ягод — благодаря наличию пигментов каротиноидов. У организмов, не обладающих фотосинтетическими системами, каротиноиды выполняют функцию фотопротекторов и антиоксидантов, что позволяет заселять хорошо вентилируемые и освещенные места обитания [1, 2]. Возможность биотехнологической наработки каротиноидов с помощью дрожжей имеет широкие перспективы: инкубирование быстро растущих дрожжей может быть сопряжено с переработкой отходов производства [3], дрожжи синтезируют разнообразные типы каротиноидов [4], необходимые для применения различных областях. В данной работе проводили исследование способности к синтезу каротиноидов 22 штаммов красных дрожжей из Фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов. В задачи исследования входила оценка уровня продукции биомассы и каротиноидов штаммами дрожжей, дифференцировка дрожжей по совокупности синтезируемых пигментов. Дрожжи икубировали в 500 мл колбах в 200 мл пивного сусла при постоянном перемешивании при 26 °С в течение четырех суток, наработанную биомассу лиофилизировали. Клеточные стенки дрожжей разрушали в стеклянной ступке, выделение каротиноидов проводили при помощи ацетона и петролейного эфира [5]. Спектры поглощения в видимой области фракций пигментов получали на спектрофотометре «Солар» UV (PB2201). Расчет уровня продукции каротиноидов проводили по эквиваленту β-каротина (по оптическому поглощению при длине волны 450 нм). Все измерения проводили в трех повторностях. По результатам трех инкубирований наибольший уровень продукции биомассы (более 10 г/л) показан для штаммов дрожжей Rhodotorula glutinis БИМ Y-10, Rhodotorula mucilaginosa БИМ Y-50, Rhodotorula lactosa БИМ Y-118, Rhodotorula aurantiaca БИМ Y156, R. glutinis БИМ Y-157, R. mucilaginosa БИМ Y-162, R. glutinis БИМ Y-167, Rhodotorula rubra БИМ Y-268. Штаммы дрожжей рода Rhodotorula обладают различным уровнем экстрактивности каротиноидов клетки [6], в связи с чем целесообразно рассматривать значение выхода каротиноидов при применении приведенного выше 27 метода выделения как результат продукции пигментов и их экстракции из клеток дрожжей. В данном исследовании наибольший выход каротиноидов (более 80 мкг/г) получен для штаммов R. glutinis БИМ Y-158 и БИМ Y-253; максимальный уровень продукции отмечен для штамма R. glutinis БИМ Y-253 (150,9 ± 78,4 мкг/г). Для штаммов дрожжей R. glutinis БИМ Y-158 и БИМ Y-253 также наблюдалась способность к повышенной продукции биомассы и каротиноидов, концентрация каротиноидов составила более 0,7 и 1 мг/л соответственно. Спектры фракций пигментов дрожжей демонстрируют наличие характерных для каротиноидов трех пиков абсорбции (Рисунок 1) за исключением четырех штаммов, спектры которых не имеют четких пиков поглощения (R. glutinis БИМ Y-33 и БИМ Y-157, R. lactosa БИМ Y-113 и БИМ Y-118). Спектры каротиноидов изученной группы микроорганизмов неоднородны по распределению максимумов поглощения, что свидетельствует о синтезе различных преобладающих пигментов штаммами дрожжей внутри рода Rhodotorula. Рисунок 1. Спектр совокупности каротиноидов, выделенных из культуры R. glutinis БИМ Y-158 с максимумами поглощения при длинах волн 460, 486 и 518 нм. Полученные результаты соответствуют среднему уровню продуктивности каротиноидов (от 100 мкг/г) штаммами дрожжей рода Rhodotorula в поставленных условиях [1] и представляют интерес для дальнейшей оптимизации параметров наработки пигмента микроорганизмами. На сегодняшний день каротиноиды (β-каротин, торулен, астаксантин) применяются в животноводстве, пищевой и косметической промышленности в качестве красителей, антиоксидантов, провитаминов; особое значение каротиноиды приобрели благодаря исследованию их роли в профилактике раковых заболеваний [7]. В связи с малой долей натуральных источников каротиноидов в мировой промышленности [1] развитие биотехнологического получения пигментов на настоящий момент является актуальным. 28 Таким образом, потенциальным объектом для производства каротиноидов могут служить штаммы дрожжей: R. glutinis БИМ Y-253 (полученное количество каротиноидов составляет 150,9 ± 78,4 мкг/г, максимумы поглощения фракции совокупности пигментов при длинах волн 460, 486 и 518 нм) и R. glutinis БИМ Y-158 (соответсвенно 94,1 ± 11,7 мкг/г; 460, 486 и 518 нм). Для получения других типов каротиноидов могут быть использованы штаммы R. glutinis БИМ Y-33 и БИМ Y-157, R. lactosa БИМ Y-113 и БИМ Y-118 (спектры отличаются количеством ярко выраженных максимумом поглощения и соотношением значений высоты максимумов поглощения). 1. Mata-Gómez, L.C. Biotechnological production of carotenoids by yeasts: an overview // L.C. Mata-Gómez et al. / Microb. Cell Fact. – 2014. – Vol. 13(12). – P. 1-11. 2. Moliné, M. Production of Pigments and Photo-Protective Compounds by Cold-Adapted Yeasts / M. Moliné et al. in P. Buzzini, R. Margesin, Ed. // Cold-adapted Yeasts. - 2014. – P. 193-224. 3. Buzzini, P. Production of carotenoids by strains of Rhodotorula glutinis culturedin raw materials of agro-industrial origin / P. Buzzini, A. Martini // Bioresource Technology. – 2000. - Vol. 71, No. 1. - P. 41-44. 4. Maldonade, I.R. Carotenoids of yeasts isolated from the Brazilian ecosystem / I.R. Maldonade et al. // Food Chemistry. - 2008. – Vol. 107. – P. 145–150. 5. 6. Rodriguez-Amaya, D.B. A Guide to Carotenoid Analysis in Foods // D.B. RodriguezAmaya / ILSI Press. – 2001. – P. 42. Peterson, W.J. Quantitative determination of the carotenoids in yeasts of the genus Rhodotorula // W. J. Peterson et al. / J Bacteriol. – 1958. – Vol. 75(5). – P. 586–591. 7. Buzzini, P. Сarotenoid profiles of yeasts belonging to the genera Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, and Sporidiobolus / P. Buzzini et al. // Can J Microbiol. – 2007. - Vol.53(8). – P. 1024-31. 29 СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗ METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z И МETHYLOSINUS TRICHOSPORIUM OB3B К. А. Бочарова 2, О. Н. Розова 1, В. Н. Хмеленина 1, Ю. А. Троценко 1,2 1 2 Лаборатория радиоактивных изотопов Пущинский государственный естественнонаучный институт, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия Е-mail:ksenia.alpha4160@mail.ru Метан — существенный компонент глобального цикла углерода и один из наиболее опасных парниковых газов. Являясь доминирующей составной частью природного газа и возобновляемого биогаза, метан считается перспективным источником углерода для продукции полезных соединений с использованием аэробных метанотрофов и их ферментов в качестве биокатализаторов. Methylomicrobium alcaliphilum 20Z и Methylosinus trichosporium OB3b, имеющие различные типы С1-метаболизма, являются модельными метанотрофами для изучения биотехнологического потенциала данной группы бактерий. Галоалкалофильный облигатный метанотроф I морфотипа M. alcaliphilum 20Z (Gammaproteobacteria) ассимилирует углерод метана через рибулозомонофосфатный (РМФ) путь и характеризуется разомкнутым циклом Кребса из-за отсутствия активности α-кетоглутаратдегидрогеназы. Облигатный метанотроф II морфотипа Ms. trichosporium OB3b (Alphaproteobacteria) реализует сериновый путь С1-ассимиляции, являющийся более энергоемким по сравнению с РМФ путем, и полный цикл Кребса. В связи с вышеуказанными метаболическими особенностями M. alcaliphilum 20Z и Ms. trichosporium OB3b, особый интерес вызывает изучение функциональной роли малатдегидрогеназы, как одного из ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Малатдегидрогеназа (МДГ) является одним из ферментов ЦТК, способствуя протеканию конструктивного и энергетического метаболизма. Помимо ЦТК, МДГ может участвовать в глюконеогенезе и глиоксилатном шунте. Этот фермент катализирует взаимопревращение малата в оксалоацетат (ОА) с использованием НАД(Ф)+ в качестве кофермента, широко распространен в клетках архей, бактерий, грибов, растений и животных. 30 Цель данной работы — изучение роли и свойств рекомбинантных МДГ из метанотрофов I и II типов, реализующих различные пути С1-ассимиляциии и промежуточного метаболизма. Электрфоретически гомогенные препараты МДГ были получены экспрессией генов mdh в клетках E. coli BL21DE3 и очищены металл-хелатной аффинной хроматографии на колонке с Ni2+ - NTA-агарозой. МДГ M. alcaliphilum 20Z - гомодимер (2 × 35 кДа), с оптимальными значениями рН 10,0 и температуры 60−65 ºС и удельной активностью 21 и 15 Е/мг белка в прямом и обратном направлениях, соответственно. После 18-часовой экспозиции фермент M. alcaliphilum 20Z полностью сохранял свою активность при прогревании при 30-40 ºС и показал всего 10 % остаточной активности при 50 ºС. Однако при 60 ºС МДГ потеряла 50 % активности уже после 10 мин прогревания. МДГ в 2 раза более специфична к малату (Kcat/Km = 7343), чем к ОА (Kcat/Km = 3326). Предположено, что в клетках M alcaliphilum 20Z фермент предпочтительно функционирует в направлении образования ОА. МДГ Ms. trichosporium OB3b — гомотетрамер (4 × 35 кДа), с оптимумом рН 9,5-10,0. МДГ Ms. trichosporium OB3b имеет широкий температурный диапазон и сохраняет полную активность после 18-часовой экспозиции при 30-60ºС, но фермент постепенно инактивируется после прогревания в течение 1 ч при 70 ºС. МДГ активнее в направлении образования малата (188 Е/мг белка), чем в реакции окисления малата в ОА (78 Е/мг белка) и в 50 раз специфичнее к ОА (Kcat/Km для малата = 1855, Kcat/Km для ОА = 92851). Свойства МДГ у Ms. trichosporium OB3b коррелируют с ключевой ролью малата, являющегося одним из центраметаболитов серинового пути. Тестирование влияния двухвалентных ионов (Zn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+, Cu2+, Ba2+ и Mn2+) не выявило существенных изменений в активности метанотрофных МДГ. Ионы Na+ и К+ при концентрации в диапазоне 0,1-0,5 М не влияли на активность МДГ, однако при концентрации солей до 1 М наблюдалось сильное ингибирование активности МДГ Ms. trichosporium OB3b (30-40 %), но небольшое МДГ из M. alcaliphilum 20Z (60-70 %). Поскольку M. alcaliphilum 20Z, в отличие от Ms. trichosporium OB3b, является галотолерантным метанотрофом, его фермент более приспособлен выдерживать высокую ионную силу. Для МДГ M. alcaliphilum 20Z и Ms. trichosporium OB3b не выявлены какие-либо аллостерические регуляторы. Пируват, цитрат, серин, ФЕП, лактат, α-кетоглутарат, глицерат, АТФ, глюкозо1-фосфат, АДФ, АМФ, ФФн, фруктозо-1-фосфат, Фн, рибозо-1-фосфат, фруктозо-6-фосфат, рибулозо-5-фосфат, фруктозо-1,6-бисфосфат не оказывали значительного влияния на максимальную активность фермента при 31 насыщающих концентрациях субстратов. Следовательно, функционирование этих ферментов в прямом или обратном направлении может регулироваться только на уровне концентрации субстратов и продуктов. Таким образом, нами впервые очищены и охарактеризованы МДГ штаммов 20Z и OB3b. Анализ транслированных аминокислотных последовательностей МДГ показал, что МДГ метанотрофов находятся в двух различных группах, проявляя 17 % идентичности. Фермент Ms. trichosporium OB3 принадлежит группе ЛДГ-подобных МДГ, представленной в основном тетрамерными формами, тогда как фермент M. alcaliphilum 20Z является представителем димерных МДГ. Следовательно, структурные свойства охарактеризованных метанотрофных МДГ коррелирует с их филогенией. Работа поддержана грантом РНФ 14-14-01045 и Гос. заданием №6.749.2014/К МИКРОБНЫЕ БИОПЛЕНКИ, СФОРМИРОВАННЫЕ В АНАЭРОБНОМ ЛАБОРАТОРНОМ ПРОТОЧНОМ АНАММОКС-БИОРЕАКТОРЕ Е. А. Бочкова, Ю. В. Литти Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, Москва, Россия Анаммокс-бактерии — автотрофные микроорганизмы, осуществляющие анаэробное окисление аммония нитритом с образованием молекулярного азота. Анаммокс-бактерии имеют важное значение для биотехнологии, поскольку широко применяются в биологической очистке сточных вод, богатых азотсодержащими загрязняющими веществами и бедных органическими соединениями. Ни один из видов анаммоксбактерий до сих пор не выделен в чистую культуру. Все анаммокс-бактерии существуют в составе микробных сообществ как в природных, так и в антропогенных местах обитания. В таких микроорганизмами, сообществах вступая с анаммокс-бактерии ними в сосуществуют протокооперативные, с другими симбиотические или конкурентные взаимодействия, зачастую очень сложные и не всегда понятные. Анаммокс-бактерии демонстрируют тенденцию к прикрепленному росту и формированию мультивидовых биопленок. Именно в составе сообщества биопленок анаммокс-бактерии становятся наиболее устойчивыми к меняющимся нагрузкам по азоту, а также к различным неблагоприятным факторам окружающей среды. Многие из современных технологий очистки сточных вод с помощью 32 анаммокс-процесса основаны на использовании мультивидовых биопленок анаммокс-бактерий и их спутников. При применении таких биопленок для очистки сточных вод очень важно глубокое понимание их структуры, микробного состава и особенностей формирования. Объектом исследования в нашей работе стали биопленки анаммокс-бактерий и их спутников, которое сформировалось в ходе длительного (более 4 лет) проточного культивирования в лабораторном анаэробном биореакторе с восходящим током среды. С целью иммобилизации микробной биомассы в биореактор введены полимерные носители-ерши. В биореактор подается минеральная среда, без добавления органики, в определенной степени моделирующая иловую воду, которая содержит сложные органические вещества, неразлагаемые микроорганизмами в анаэробных условиях. Текущая нагрузка по азотным субстратам 5,5 г N/л сут — почти предельная для лабораторных исследований, в анаммокс-реакторов. состав сообщества По входят данным молекулярно-генетических анаммокс-бактерии 3 филотипов. Доминирующий филотип штамм Mzimtia имеет 98 % сходство с анаммокс-бактерией Candidatus ‘Jettenia asiatica’, два других относятся к роду Candidatus ‘Brocadia’. К микроорганизмам-спутникам относятся представители филума Proteobacteria, в том числе нитрифицирующие и денитрифицирующие бактерии, которые, как и анаммоксбактерии, потребляют азотсодержащие вещества. Также присутствуют бактерии, по систематическому положению наиболее близкие к представителям филума Chloroflexi. В биореакторе формируются 2 типа биопленок. Они имеют типичный для биопленок анаммокс-бактерий кирпично-красный цвет. На волокнах ершового носителя- и в осадке образуются сферические биопленки-гранулы диаметром до 3-6 мм с ригидной оболочкой. На стенках биореактора и резервуара для сбора отработанной среды формируются тонкослойные биопленки. Биопленки обоих типов имеют сходных микробный состав и ультраструктуру. На микрофотографиях всегда четко выявляются коккоидные клетки с типичной для анаммокс-бактерий ультраструктурой. Они собраны в кластеры и погружены в толстый слой гликокаликса — внеклеточного полимерного матрикса биопленок. По периферии матрикса выявляются немногочисленные палочковидные клетки, вероятно, принадлежащие микроорганизмам филума Proteobacteria. Кроме того, обнаруживаются разнообразные (3 морфотипа) нитчатые формы. Они окружают кластеры клеток анаммокс-бактерий и в некоторых случаях, прорастают их колонии насквозь. Вероятно, это бактерии, близкие к Chloroflexi, однако филогенетическое сходство составляет всего 85 % (?). В сообществе они могут выступать в качестве гетеротрофного компонента, утилизируя органические вещества, образующиеся в результате отмирания 33 микробной биомассы, или потребляя вещество гликокаликса. Также вероятно, выполняют роль каркаса при формировании структуры биопленки. Для изучения особенностей формирования тонкослойных биопленок de novo при проточном культивировании был использован метод стекол обрастания. Первые явные признаки формирования биопленок de novo обнаруживаются на 10-12 сутки, присутствие анаммокс-бактерий выявляется уже на раннем этапе, к 14 суткам. Дальнейший рост биопленки обуславливается синтезом и накоплением внеклеточного полимерного матрикса, и увеличением количества входящих в состав биопленки микробных клеток. Зрелые биопленки возрастом 90 суток состоят преимущественно из живых клеток. По морфологии они неотличимы от клеток из сферических и тонкослойных биопленок реактора: кластеры клеток анаммокс-бактерий; трихомы, достигающие значительной протяженности (до 100 мкм); а также немногочисленные палочковидные клетки. Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки России. Идентификационный номер проекта RFMEF160714X0024. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ СТРУКТУР БЕЛКОВОЙ И ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОЙ ПРИРОДЫ НА ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE А. А. Буданова, А. А. Широков, Л. Ю. Матора 1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Свободноживущие почвенные бактерии рода Azospirillum относятся к классу α — протеобактерий и включают в себя свободно живущих, N2 — фиксирующих микроорганизмов вибрионо- или спирилло-образной формы, для которых характерен довольно разнообразный тип жгутикования. Именно благодаря бактериальному жгутику становится возможен первый этап взаимодействия растения — хозяина с бактериальным симбионтом — адсорбция бактериальных клеток на корнях растений. Подтверждение роли жгутиков в качестве адгезинов мы находим в многочисленных работах зарубежных авторов [1, 2]. Однако на сегодняшний день в литературе накапливаются довольно обширные данные, позволяющие утверждать, что не только бактериальный жгутик, но и белковые пилеподобные структуры, экспонированные на поверхности данных 34 микроорганизмов, также играют ключевую роль в их симбиотическом взаимодействии с растениями. Так, в 2001 году в работе Шелудько и Кацы [3] было продемонстрировано наличие полярного пучка пилей у бактерий Azospirillum brasilense и высказано предположение о том, что данные структуры участвуют в тянущей подвижности этих бактерий. Также была иммунохимически показана роль белковых структур при колонизации корней пшеницы бактериями Azospirillum brasilense [4]. Наша работа посвящена изучению роли поверхностных белковых структур в процессе растительно-бактериальных ассоциаций и в частности их визуализации на поверхности клеток почвенных ризосферных бактерий рода Azospirillum. В работе нами использовались три штамма бактерий, два из которых относились к дикому типу (A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245) и один мутантный штамм бактерий A. brasilense Sp245, дефектный по синтезу флагеллина, штамм A. brasilense SK048. Для визуализации поверхностных антигенных структур исследуемых штаммов нами применялись с золотые поликлональными и композитные кроличьими золото-серебрянные антителами, полученными наночастицы соответственно к липополисахаридам исходных штаммов, флагеллину типового штамма A. brasilense Sp7, а также антител специфичных к прочим поверхностным белковым детерминантам бактерий, полученных на целые клетки мутантного штамма SK048. Таким образом, результатом нашей работы являлась визуализация поверхностных белковых антигенных детерминант ризосферных бактерий A. brasilense, указывающая на то, что на поверхности данных симбионтов сельскохозяйственных и различных дикорастущих растений присутствуют белковые пилеподобные структуры, вовлеченные в процесс формирования симбиотических взаимоотношений между бактерией и растением-хозяином, а также как было показано ранее вовлеченных в процесс микроколониального распространения данных бактерий на корнях растений. 1. Construction of a flagellum-negative mutant of Proteus mirabilis: effect on internalization by human renal epithelial cells and virulence in a mouse model of ascending urinary tract infection / H.L.Mobley, R. Belas, V.Lockatell, G.Chippendale, A.L. Trifillis, D.E.Johnson, J.W. Warren (1996) Infect. Immun. 64: 5332-5340. 2. Flagellin gene diversity among Helicobacter pylori strains and IL-8 secretion from gastric epithelial cells / U.Ohta-Tada, A.Takagi, Y.Koga, S.Kamiya, T. Miwa (1997) Scand. J. Gastroenterol. 32, №5: 455-459. 35 3. Шелудько, А.В. Образование на стенке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре / А.В. Шелудько, Е.И. Кацы (2001) Микробиология. 70: 662-667. 4. Колонизация корней пшеницы бактериями Azospirillum brasilense с различной подвижностью / А.В. Шелудько, А.А Широков, М.К. Соколова, О.И. Соколов, Л.П. Петрова, Л.Ю. Матора (2010) Микробиология. Т.79, №5: 696-704. ИССЛЕДОВАНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ МЕЗОФИЛЬНЫХ АНОКСИГЕННЫХ НИТЧАТЫХ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Е. И. Бурганская, М. В. Сухачева, В. А. Гайсин Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва Цианобактериальные маты термальных источников являются классическим модельным объектом для изучения взаимодействия микроорганизмов в сложных структурированных сообществах. Эдификаторами в данных сообществах являются фототрофные прокариоты, главным образом цианобактерии, а также и аноксигенные нитчатые фототрофные бактерии (АНФБ). Существует целый ряд исследований, посвященных разнообразию и экологии термофильных АНФБ в составе цианобактериальных матов. Однако гидротермальные системы интересны и как объекты для изучения мезофильных АНФБ. Это связано с тем, что по мере остывания стока термальных вод формируются микрониши, пригодные для развития мезофильных АНФБ, разнообразие которых гораздо менее изучено, чем для термофильных АНФБ. На данный момент известны три основные группы мезофильных АНФБ из гидротермальных источников. Первая группа представлена изолятами бактерий описанного ранее В.М. Горленко рода Oscillochloris [1]. Несколько штаммов Oscillochloris были выделены Калашниковым А.М. [2] из источников Алла, Умхей, Кучигер (Баргузинская долина, Бурятия). Вторая группа представлена изолятами бактерии «Candidatus Chloroploca asiatica», который был выделен из мезофильного выхода гидротермальной системы источника Умхей (18,0 ºС) [3]. Третья группа представлена изолятом Um-2, выделенным из теплого пруда гидротермальной системы источника Умхей (40,5 ºС) [4]. Изучение филогенетического разнообразия и распределения 36 описанных выше мезофильных АНФБ в гидротермах Баргузинской долины может помочь в понимании экологической роли этих бактерий. В связи с этим была сформулирована цель работы: изучить разнообразие мезофильных АНФБ в цианобактериальных матах ряда гидротерм Баргузинской долины с помощью метода ПЦР в реальном времени. Для обнаружения и подсчета в природных сообществах интересующих нас мезофильных АНФБ в нашей лаборатории были разработаны группоспецифические системы праймеров и зонды для проведения ПЦР real-time. Все олигонуклеотиды были сконструированы на основании последовательностей гена 16S рРНК бактерий Oscillochloris, «Candidatus Chloroploca asiatica» и изолята Um-2. ДНК бактерий матов выделяли с помощью набора PowerMax Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc., США) согласно инструкции производителя. Разработанные праймерные системы были использованы в скрининге образцов мезотермальных матов из щелочных источников Алла (2 точки), Гарга, Кучигер (2 точки), Сеюя и Умхей. Значение рН во всех источниках превышает 8,5. Было установлено, что бактерии Oscillochloris присутствуют в источниках Алла (38,8 ºC), Гарга (41,5 ºС), Сеюя (42,0 ºС) и Умхей (37,2 ºС). Бактерии из группы Um-2 обнаружены в источниках Алла (24,0 ºС), Гарга (41,5 ºС) и Умхей (37,2 ºС); а бактерии «Candidatus Chloroploca asiatica» — в источниках Алла (24,0 ºС), Кучигер (38,7 ºС) и Умхей (37,2 ºС). Все три группы бактерий присутствуют в источнике Алла и Умхей, причем в источнике Умхей в одном и том же мате. Ранее бактерия «Candidatus Chloroploca asiatica» была описана только в источнике Умхей [3], поэтому в данной работе мы впервые показали присутствие этой бактерии в других источника Баргузинской долины. Бактерия Um-2 ранее была детектирована, кроме источника Умхей, также в источнике Кучигер. В источниках Гарга и Алла бактерия Um-2 обнаружена впервые. В образцах из источника Кучигер не были обнаружены бактерии Um-2 и Oscillochloris, хотя ранее они были описаны в этих источниках. Очевидно, это связано с тем, что места отбора проб в 2014 году отличались от 2010 и 2012 года. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что разнообразие как бактерий рода Oscillochloris, так и недавно описанных «Candidatus Chloroploca asiatica» и Um-2, в источниках Баргузинской долины шире, чем мы считали ранее. 1. Горленко В.М., Коротков С.А. Морфологические и физиологические особенности новой нитчатой скользящей зеленой бактерии Oscillochloris trichoides nov. comb. // Изв. АН СССР сер. биологич. 1979. № 6. С. 848–857. 37 2. Gorlenko V.M., Korotkov S.A. Morphological and physiological features of the new filamentous gliding green bacterium Oscillochloris trichoides nov. comb. // Izv. Akad. Nauk SSSR Ser. Biol. 1979. № 6. P. 848–857. 3. Калашников А.М., Сухачева М.В., Гайсин В.А., Колганова Т.В., Намсараев Б.Б, Горленко В.М., Кузнецов Б.Б. Характеристика новых изолятов нитчатой аноксигенной бактерии рода Oscillochloris, выделенных из термальных источников Баргузинской долины. / Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний, Улан-Удэ, 11-13 июля 2013 г. Улан-Удэ: Издательство Бурятского Госуниверситета, 2013. – с. 142-145. 4. Gorlenko V. M., Bryantseva I. A., Kalashnikov A. M., Gaisin V. A., Sukhacheva M. V., Gruzdev D. S., and Kuznetsov B. B. Candidatus ‘Chloroploca asiatica’ gen. nov., sp. nov., a New Mesophilic Filamentous Anoxygenic Phototrophic Bacterium. / Microbiology, 2014. – Vol. 83. – No. 6. – p. 838–848. 5. Gaisin V.A., Kalashnikov A.M., Burganskaya E.I., Kuznetsov B.B., Gorlenko V.M. The new mesophilic filamentous anoxygenic phototrophic bacterium from sulfide hot springs. / 6th FEMS Congress of European Microbiologists, June 7-11, 2015, in Maastricht, The Netherlands. 38 НОВАЯ ПОЛИМОРФНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДИОКСИДИНА: СИНТЕЗ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ О. И. Верная 1, В. П. Шабатин 1, А. М. Семенов 2, Д. И. Хватов 2, Т. И. Шабатина 1 1 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Химический факультет, Москва, Россия 2 Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия Высокая стоимость лекарственных и препаратов длительное (ЛП) время стимулируют получения и исследователей апробации новых к путей поиску модифицирования имеющихся ЛП. Одним из возможных путей является получение новых полиморфных модификаций, используемых в лечебной практике ЛП, что может привести к улучшению их биофармакологических свойств. Разработанными нами методами криохимического синтеза, получена новая стабильная наноформа новой полиморфной модификации антибактериального препарата диоксидина (2,3-бис- (оксиметил)хиноксалина 1,4-ди-N-оксида). Методами газовой хроматографии и ядерного магнитного резонанса (ЯМР ЯМР 13 1 Н, С) установлена идентичность химического состава исходного диоксидина и его новой кристаллической модификации. Для подтверждения того, что полученное вещество является новой кристаллической модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N'-диоксида, β-модификацией, проведены рентгенофазовый названной нами анализ (РФА), ИК-спектроскопические и термоаналитические исследования. Различия в рентгенограммах и ИК-спектрах исходного диоксидина и полученного из него вещества свидетельствует о том, что оно является новой кристаллической β-модификацией 2,3-бис- (гидроксиметил)хиноксалин-N,N'-диоксида. Кривые дифференциальной сканирующей калориметрии исходного диоксидина и полученной из него новой кристаллической β-модификации различаются положением и величиной эндотермических эффектов. Методом просвечивающей электронной микроскопии визуализирована новая кристаллическая модификация диоксидина. Размер частиц новой кристаллической β-модификацией 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N'-диоксида составили 0,1-0,8 мкм. Средний размер частиц исходного диоксидина составляет 3-8 мкм. Удельную поверхность исходного диоксидина и новой кристаллической β-модификациии диоксидина определяли методом низкотемпературной адсорбции аргона. 39 Удельная площадь поверхности исходного диоксидина составляет 0,7 м2/г (средний размер частиц 5,7 мкм), удельная площадь поверхности новой кристаллической β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N'-диоксида составляет 16 м2/г (средний размер частиц 0,25 мкм). Устойчивость E. coli 52, M. cyaneum 98 к разным формам диоксидина определяли диско-диффузионным методом. Новая кристаллическая β-модификация диоксидина, оказалась более активна к подавлению роста бактерий по сравнению с исходным диоксидином. SPHAEROCHAETA SP. NOV., СПУТНИК ПСИХРОАКТИВНОЙ МЕТАНОСАРЦИНЫ METHANOSARCINA PORCELLINA SP. NOV. В. М. Верхова, А. В. Ермакова, С. Н. Паршина Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Долгое время внимание ученых привлекали лишь те представители филума Spirochaetes, которые входят в состав микробиоты человека и животных, обладают патогенностью и представляют клинический интерес. Однако в последние годы все больше появляется сведений об обнаружении в почве и воде свободноживущих, непатогенных представителей филума. В 2006 году из кишечника термита Neotermes castaneus была выделена спирохета с очень необычной для этой группы сферической формой клеток. Тогда же бактерия получила название Spirochaeta coccoides. В 2012 году из пресноводных осадков были выделены и описаны два новых кокковидных штамма, для которых было предложено создание нового рода Sphaerochaeta. Штаммы получили названия Sphaerochaeta globosa штамм BuddyT и Sphaerochaeta pleomorpha штамм GrapesT, а Spirochaeta coccoides после этого была переименована в Sphaerochaeta coccoides SPN1T. Сферическая морфология и отсутствие подвижности — два главных признака, которые четко отличали сферохет от других представителей Spirochaetes, для которых характерна спиральная морфология и подвижность благодаря осевому периплазматическому жгуту. Однако в 2014 году была описана Sphaerochaeta multiformis штамм MO-SPC2T со сложным жизненным циклом, в одной из фаз которого клетки были спиралевидными и подвижными. Совсем недавно сотрудниками Института биохимии и физиологии микроорганизмов в Пущино был описан еще один вид — Sphaerochaeta associata GLS2T с неподвижными кокковидными клетками. 40 Таким образом, к настоящему моменту известно и описано пять представителей рода Sphaerochaeta: S. coccoides, S. globosa, S. pleomorpha, S. multiformis и S. associate. Систематическое положение: филум Spirochaetae класс Spirochaetes порядок Spirochaetales семейство Spirochaetaceae род Sphaerochaeta Помимо пяти валидных, известно несколько некультивируемых штаммов из разных мест обитания, которые, на основании анализа гена 16S рРНК, относятся к роду Sphaerochaeta. Полученные данные позволяют предположить, что представители рода Sphaerochaeta широко распространены в самых разных местах обитания. Это дает возможность по-новому взглянуть на экологию, физиологию и эволюцию спирохет. Целью работы было физиологическое описание нового вида бактерии — Sphaerochaeta sp. штамм PS, обнаруженной при выделении в чистую культуру метаногенов — Methanosarcina porcellina штаммов Pr1 и Pr2 из свиного навоза, сброженного при низкой температуре. На основании анализа последовательности гена 16S рРНК (96 % сходства с S. globosa), штамм PS был отнесен к новому виду рода Sphaerochaeta (Рис. 1). Штамм PS был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (= VKM B-2809) и Немецкой коллекции микроорганизмов (= DSM 26296). Рисунок 1. Микрофотография Sphaerochaeta sp. штамм PS. Чистая культура (а) и бинарная культура M. porcellina Pr1 и сферохеты (б). Шкала 10 мкм. Микроорганизм, как и все ранее описанные представители рода Sphaerochaeta, оказался анаэробной, грамотрицательной бактерией с плеоморфной морфологией, не обладал подвижностью. Штамм PS способен утилизировать большое число субстратов, 41 главным образом, углеводы. Основные продукты брожения — ацетат, водород, углекислый газ и этанол. Бактерия предпочитает наличие небольших концентраций NaCl в среде, хотя хорошо растет и без добавления соли. Можно сказать, что штамм PS — это слабогалофильная бактерия. Оптимумы значений pH у сферохеты и других представителей рода совпадают (нейтрофилы). Интересно, что штамм PS, так же как и метаносарцина, спутником которой он является, оказался психроактивным (нижний предел роста при 2 °С, оптимум 25 °С (20-30 °С), верхний 33 °С. Выделенные ранее сферохеты являются мезофилами. Исключение — истинный психрофил и облигатный галофил S. multiformis. Таким образом, Sphaerochaeta sp. штамм PS — это первая психроактивная сферохета. Было замечено, что при совместном культивировании сферохеты и метаносарцины метаноген растет лучше. При отсутствии бактерии-спутника необходимо добавление жидкости рубца для стимуляции роста метаносарцины. Тем не менее, и сферохета, и метаносарцина способны расти в чистых культурах. Следовательно, можно сделать вывод о том, что штамм PS является необязательным спутником метаносарцины. Хороший рост метаносарцины в смешанной культуре, повидимому, связан со способностью сферохеты обеспечивать метаноген дополнительными утилизируемыми им субстратами (Н2/СО2 для Pr1 и ацетат для Pr2), а также, возможно, и другими метаболитами. Таким образом, в данном случае можно говорить о таком виде симбиоза, как протокооперация, когда совместное существование выгодно для обоих видов, но не обязательно для них. 42 ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ EXP1 В ПРОЦЕССЕ МОРФОГЕНЕЗА БАЗИДИОМИЦЕТА LENTINUS EDODES Е. П. Ветчинкина 1, М. А. Купряшина 1, С. В. Петров 2, В. Ю. Горшков 3, Ю. В. Гоголев 3, В. Е.Никитина 1 1 2 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия 3 Для Казанский институт биохимии и биофизики РАН, Казань, Россия расширения представлений о регуляции механизмов морфогенеза базидиомицетов и факторах, определяющих формирование плодовых тел, представляется важным выявление и анализ экспрессии генов, характеризующих морфологические структуры и принимающие участие в развитии высших грибов. Гены, детерминирующие процессы роста и дифференцировки, часто называют генами-регуляторами (переключателями) развития. Они кодируют особые белки или белковые комплексы — транскрипционные факторы, контролирующие программы формирования органов и тканей. Специфические факторы транскрипции являются частью системы координирующей передачу генетической информации в клетке, они обеспечивают включение или выключение определенных генов в нужный момент развития организма, отвечают за селективность и специфичность генной регуляции в различных клетках и тканях. В процессе клеточной дифференцировки появление нового транскрипционного фактора служит сигналом для активации или подавления транскрипции генов на определенной стадии морфогенеза и появления необходимых генных продуктов. Цель исследования – изучение динамики активности гена специфического фактора транскрипции exp1 в процессе цитодифференцировки и плодообразования Lentinus edodes. При культивировании на агаризованной среде в чашках Петри транскрипты гена exp1 детектировали на разных стадиях морфогенеза базидиомицета L. Edodes у непигментированного мицелия, коричневой мицелиальной пленки и в примордиях, однако уровень экспрессии специфического фактора транскрипции был существенно подавлен. После четырех недель культивирования активность гена увеличивалась в два раза, однако на момент образования мицелиальной пленки уменьшалась до первоначального уровня. У шиитаке на чашках Петри с сусло-агаровой средой развивались нормальные примордии, но уровень экспрессии исследуемого гена был также на очень низком уровне и дальнейшего развития не происходило. При данных условиях эксперимента нам не удалось получить плодовых тел. По всей вероятности, 43 при определенных условиях культивирования грибов, в том числе при отсутствии древесины, основного источника фенольных субстратов для нормального питания и морфогенеза ксилотрофных базидиомицетов, могут наблюдаться изменения в морфологическом развитии, которые регулируются специфическими факторами транскрипции. Любое изменение условий окружающей среды улавливают рецепторные системы клетки, специфический сигнал проходит к факторам транскрипции, следствием чего является активация или репрессия генов, продукты которых задействованы в адаптации к изменившимся условиям. Вероятно, при данных условиях культивирования (отсутствии древесного субстрата) происходит сбой в программе нормального плодоношения, что может являться одной из причин, по которой получить базидиомы шиитаке на искусственных средах не удается. В связи с этим ген exp1 может служить маркером степени адекватности условий культивирования данной грибной культуры и прогнозировать развитие плодовых тел. При выращивании ксилотрофа L. edodes на древесном субстрате в условиях наиболее приближенных к естественному культивированию уровень экспрессии специфического фактора транскрипции был в 15-150 раз выше и существенно зависел от конкретной стадии развития. Максимальная транскрипционная активность гена exp1 была отмечена у коричневой мицелиальной пленки, стадии предшествующей образованию примордиев и плодовых тел. Данная морфоструктура представляет собой сплетение толстостенных меланизированных гиф, образовывается поверх вегетативного мицелия и выполняет защитную функцию, особенно в начале формирования базидиом. Нами было отмечено, что полноценные плодовые тела шиитаке образует только после формирования пленки. Структура эта характерна практически для всех штаммов L. еdodes. Некоторые штаммы шиитаке, не образующие пленку, также не были способны и к плодоношению. На стадии мицелиальной пленки происходит многократное увеличение активности гена специфического фактора транскрипции, в 10 раз выше по сравнению со стадией непигментированного мицелия и в три раза относительно базидиом. В примордиях и плодовых телах отмечен спад активности гена exp1. Очевидно, что коричневая мицелиальная пленка в процессе морфогенеза выполняет не только защитную функцию, но является также биохимически активной структурой. Исследование экспрессии гена exp1 на разных этапах созревания органов плодоношения L. еdodes, показало, что в примордиях и молодых, только сформировавшихся плодовых телах, уровень транскрипционной активности исследуемого гена был на одном уровне или чуть выше по сравнению со стадией непигментированного мицелия. По мере созревания активность exp1 возрастала и в старых плодовых телах, 44 где были отмечены физиологические изменения, такие как лизис клеточной стенки, пигментация гимениального слоя, транскрипционная активность гена была в 4-5 раз выше, чем в примордиях. Специфический фактор транскрипции в этом случае может включать регуляторные гены, кодирующие ферменты ответственные за лизис клеточных стенок у базидиомицета. По всей вероятности, специфический фактор транскрипции exp1 у базидиомицета L. edodes может быть вовлечен в процесс старения плодового тела. Таким образом, проведенные исследования показали постоянное присутствие и изменение активности специфического фактора транскрипции в зависимости от стадии развития базидиомицета L. еdodes, что представляет особенность гриба и может свидетельствовать о важной роли гена exр1 в процессе морфогенеза шиитаке. Многократное повышение активности на стадии коричневой мицелиальной пленки, перед плодоношением может свидетельствовать о важной роли гена exр1 в инициировании и формировании базидиом. Вероятно, эта стадия является критической для формирования правильного транскрипционного профиля, отвечающего за переход в фазу плодоношения. По всей вероятности, сбой в этой программе служит одной из причин, по которой не удается получить полноценные плодовые тела. При культивировании ксилотрофа L. еdodes на искусственных питательных средах активность гена exp1 на всех стадиях развития подавлена, в то время как в естественных условиях на древесном субстрате уровень активности exp1 многократно повышался. В связи с этим активация гена exp1 может служить маркером готовности ксилотрофных грибов к плодоношению, а также степени адекватности условий культивирования. Повышение уровня активности гена exp1 в старых плодовых телах, где были отмечены физиологические изменения, может говорить о вовлечении фактора транскрипции в процесс старения культуры шиитаке. Полученные результаты позволяют говорить о многоплановой роли специфического фактора транскрипции в процессе развития базидиомицета L. еdodes, указывающего на его важную роль в освоении субстрата, смене стадий морфогенеза, формировании плодового тела, лизисе клеточной стенки, пигментации гимениального слоя, что дает основание предполагать регуляторную деятельность гена exр1 или его продуктов в процессе развития грибного организма. Эти данные могут быть использованы при разработках по оптимизации культивирования шиитаке, представляющего большой интерес в силу пищевой ценности и исключительных целебных свойств. Исследование выполнено при финансовой поддержке исследовательского гранта РФФИ № 15-04-02926. 45 СУЛЬФИДОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ ИЗ МИКРОБИОМА ДЕТЕЙ С АУТИСТИЧЕСКИМИ РАССТРОЙСТВАМИ А. Л. Герасимчук, П. А. Бухтиярова, О. В. Карначук Томский государственный университет, Томск, Россия Причины развития аутизма и аутистических расстройств до сих пор остаются невыясненными. Показано, что аутизм связан с проявлением ряда расстройств желудочнокишечного тракта (Valicenti-McDermott et al., 2006; Molloy, Manning-Courtney, 2003; Nikolov et al., 2009; Ming et al., 2008; Adams et al., 2006). Часто с кишечными расстройствами связано присутствие сульфатредуцирующих и сульфидогенных микроорганизмов (СРБ) (Goldstein et al., 2003; Loubinoux et al., 2000; Loubinoux et al., 2003). Возможное участие сульфидогенов в этиологии различных заболеваний связывают с цитотоксическим действием сероводорода, являющегося конечным продуктом жизнедеятельности этих микроорганизмов. Химически высокореакционный сероводород может также реагировать с доступными ионами металлов с образованием сульфидов металлов, обладающих чрезвычайно низкой константой растворимости, тем самым вызывая дефицит доступных металлов в организме. Известно, что при аутизме и синдроме Аспергера наблюдается дефицит биодоступного железа. Кроме того, у больных с этими патологиями различными методами было показано повышенное содержание сульфидогенов в микробиоме (Finegold et al. 2012). Нельзя исключить тот факт, что присутствие СРБ может быть связано со снижением содержания биодоступных металлов в кишечнике и развитием патологий. В связи с этим, целью исследования было изучение разнообразия накопительных культур сульфидогенов, полученных из проб фекалий детей с расстройствами аутистического спектра. Образцы фекалий были получены от пяти доноров, которыми являлись дети в возрасте от 4 до 11 лет, пациенты научно-исследовательского института психического здоровья СО РАМН (Томск). Биоматериал был перенесен в 200-мл флаконы со стерильной средой Видделя с лактатом в качестве органического субстрата (Widdel, Back, 1992). Анаэробные условия создавали, доливая 200-мл флаконы питательной средой доверху. Культивирование проводили при 37 °С. Полученные накопительные культуры были условно обозначены АУТ+. Контролем служили накопительные культуры (АУТ˗), полученные по той же методике из фекалий пяти детей 3-7 лет, не страдающих аутистическими расстройствами. Разнообразие культивируемых филотипов анализировали путем амплификации фрагмента гена 16S рРНК из культур АУТ+ и АУТ46 с последующим разделением методом денатурирующего градиентного гель- электрофореза (ДГГЭ). Появление сульфида во всех накопительных культурах АУТ+, определяемое визуально по почернению среды, происходило через1-2 недели. Это превышало скорость сульфидогенеза в культурах АУТ, где первые следы появления H2S наблюдали не ранее чем через 1 месяц от начала культивирования. Визуальные признаки образования сульфида были обнаружены во всех накопительных культурах АУТ+ и двух культурах АУТ-. При микроскопировании накопительных культур АУТ+ наблюдали большое количество клеток разной морфологии, в то время как в культурах АУТ- доминировали вибрионы. Сравнение ДГГЭ-профилей показывает большее число филотипов в накопительных культурах АУТ+ по сравнению с контрольными культурами АУТ-. Обнаруженные в культурах АУТ+ филотипы относились к Verrucomicrobia, Deltaproteobacteria, Bacteroidetes, Lentisphaerae и Firmicutes. Филотипы Firmicutes, большинство из которых близки разным представителям рода Clostridium (87-97 % сходства фрагментов гена 16S рРНК размером 316-52 п.о.), доминировали среди обнаруженныхоследовательностей и были выявлены в четырех из пяти культур АУТ+. Обнаруженные представители Lentisphaerae и Verrucomicrobia, представленные единичными филотипами, показали близкое родство с анаэробными кишечными бактериями, для которых не сообщалось о способности к сульфидогензу. Среди обнаруженных представителей Bacteroidetes выявлен филотип Alistipes finegoldii (99% сходства), который может вызывать бактериемию (Manimunda et al., 2007). Интерес представляет дельтапротеобактериальный филотип, родственный Bilophila wadsworthia. Эта бактерия относится к нормальной флоре кишечника, а также часто выделяется из клинических образцов, связанных с различными инфекциями и близкородственна СРБ рода Desulfovibrio (Baron et al., 1992). Хотя Bilophila wadsworthia не относят к СРБ, она имеет гены ключевого фермента процесса восстановления сульфатов - диссимиляционной бисульфитредуктазы (Laue et al., 2001) и способна восстанавливать сульфонаты с образованием сульфидов (Laue et al., 1997). Хотя ДГГЭ-анализ не выявил представителей классических СРБ, из накопительной культуры АУТ5+ была выделена чистая культура, последовательность гена 16S рРНК которой показала 100 % сходства с сульфатредуцирующей бактерией Desulfovibrio desulfuricans Ser-2, впервые выделенной из анаэробного реактора, содержащего сточные воды пивоваренного производства (Diaz et al., 2010). Штамм способен ферментировать серин в отсутствие внешнего акцептора электрона с образованием ацетата в качестве основного метаболита. Desulfovibrio desulfuricans являются компонентами микрофлоры 47 пищевого тракта человека. Считается, что эти микроорганизмы играют роль в патогенезе таких заболеваний кишечника, как неспецифический язвенный колит и болезнь Крона (Gibson et al., 1991; Florin et al., 1990). На патогенность этих микроорганизмов может оказывать влияние грамотрицательных один из клеточных компонентов бактерий, эндотоксин, представляющий наружной собой мембраны гетерополимер липополисахарид, биологическая активность которого определяется его структурой (Lodowska et al., 2012). Еще одним организмом, не выявленным методом ДГГЭ-анализа, но выделенным при культивировании, является бактерия отдела Firmicutes, родственная анаэробной сахаролитической Christensenella minuta штамм YIT 12065 (99 % сходства последовательности длиной 440 п.о.), выделенной из фекалий человека (Morotomi et al., 2012). Культура представлена палочкообразными клетками, характеризуется замедленным ростом и образованием визуальных признаков образования сульфида в процессе культивирования. Christensenella minuta cоставляют примерно 1% от всех микроорганизмов, обитающих в кишечнике здоровых людей. Имеются исследования, доказывающие, что увеличение числа этих бактерий до 10 % микробиоты кишечника у некоторых млекопитающих и у человека препятствует их ожирению (Goodrich et al., 2014). Филотипы накопительных культур АУТ-, которые удалось секвенировать, показали родство с представителями Deltaproteobacteria (99 % сходства с Desulfovibrio vulgaris DP4) и Firmicutes (100 % сходства c Clostridium glycolicum Nesulana6 из минеральных отложений геотермальной станции и 99 % с Clostridium disporicum NML 05A027 из абсцесса брюшной полости человека), однако представлены отличающимися от обнаруженных в культурах АУТ+ видами. Таким образом, полученные филотипы были родственны последовательностям организмов, выделенных из фекалий и клинических образцов. Хотя получение накопительных культур позволило создать селективные условия для развития преобладающих форм СРБ, многие обнаруженные филотипы принадлежали бактериям, не связанным с процессами восстановления сульфата. Однако среди филотипов обнаружен представитель Akkermansia muciniphila, бактерии, способствующей высвобождению сульфата в ходе брожения муцина (Derrien et al., 2004). Образующийся сульфат может служить акцептором для роста СРБ. Результаты исследований показали присутствие большого числа филотипов Clostridium и Desulfovibrio desulfuricans. Ранее была показана корреляция аутизма с преобладанием некоторых видов Clostridium (Finegold et al., 2010, 2012) и Desulfovibrio (Finegold, 2011). Обнаруженное нами микробное разнообразие соответствует описанным в литературе данным. Исследование было поддержано грантом РФФИ 14-04-31724 мол_а 48 ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ АЦИДОТОЛЕРАНТНЫХ И УСТОЙЧИВЫХ К МЕТАЛЛАМ PENICILLIUM Л. Б. Глухова, Е. В. Стрелкова, О. П. Иккерт, А. Л. Герасимчук, Э. Велес, О. В. Карначук Лаборатория биохимии и молекулярной биологии, Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томский государственный университет Добыча и переработка полезных ископаемых связана с образованием большого количества отходов. Жидкие отходы, известные под названием кислого шахтного дренажа, характеризуются высоким содержанием металлов и протонов. До последнего времени изучение биоразнообразия в шахтных дренажах было сконцентрировано на прокариотах — ацидофильных Bacteria и Archaea (например, см. обзор Johnson, 2014). В последние годы стали появляться сообщения о возможной значительно более важной геохимической роли эукариот, прежде всего грибов, в подобных экосистемах. В большинстве публикаций исследователи устанавливают присутствие грибов путем метагеномного анализа. Культуры грибов, полученных из шахтных дренажных вод, немногочисленны. Недостаточное количество грибных изолятов из шахтных дренажей затрудняет изучение важных биогеохимических процессов, которые эти эукариоты могут осуществлять. Одновременно грибы имеют не до конца раскрытый потенциал для использования в биогеотехнологиях получения и очистки от металлов. Целью данного исследования было выделение и изучение чистой культуры грибов из отходов добычи полисульфидных руд. Для выделения грибов были использованы пробы отходов с месторождения Шерловая гора в Забайкальском крае. Проба ШГ- 4 характеризовалась низким рН (1,95) и исключительно высоким содержанием железа (18,3 г/л), меди (2,08 г/л), цинка (2,76 г/л) и мышьяка (2,91 г/л). Чистые культуры выделяли на среде Чапека-Докса с рН = 2,5 с добавлением ионов As6+ (3 г/л) и Cd2+ (0,5 г/л) в виде Na3AsO4 и CdCl2, соответственно. Были выделены две культуры, обозначенные ShG4В и ShG4С. Оба изолята росли в широком диапазоне pH от 1,5 до 13,0. ШГ4В рос в присутствии высоких концентраций металлов и металлоидов в среде, до 3 г/л Cu(II), 3 г/л Cd(II), 3 г/л As(VI), 1 г/л Ni(II) и 1 г/л Co(II). Аналогично ShG4С выдерживал до 10 г/л Cu(II), 10 г/л Cd(II), 7 г/л As(VI), 0,5 г/л Ni(II) и 1 г/л Co(II). Филогенетический анализ последовательностей гена 18S рРНК, полученных при ПЦР-амплификации с праймерами EukA, Euk360F, EukB показал, что оба изолята 49 относятся к роду Penicillium. Последовательность гена 18S рРНК длиной 1686 п.о. ShG4С показала 100 % сходства с Penicillium namyslowskii. Аналогичная последовательность гриба ShG4В имела 99 % сходства с Penicillium janthinellum. Современные представления о таксономии рода Penicillium предполагают, что сравнение последовательностей генов 18S рРНК и ITS недостаточно для определения видового положения изолята в силу полифилетического характера группы (Houbraken & Samson, 2011, Visagie et al., 2014). Поэтому дополнительно определили последовательность трех генов «домашнего хозяйства» — RPB1, RPB2, Cct8 и Tsr1 (Рис. 1). Филогенетический анализ полученных последовательностей показал, что (1) оба изолята были близкородственны; (2) возможно ShG4B и ShG4C представляют новые виды, родственные P. janthinellum и P. namyslowskii, соответственно. Рисунок 1. Филогенетический анализ генов RPB1, RPB2, Cct8, Tsr1 методом maximum likelihood, проведенный в MEGA6 (Houbraken & Samson, 2011,Tamura et al., 2013). Был проведен ряд экспериментов по выращиванию обеих изолятов в присутствии различных металлов. При выращивании с медью и кобальтом наблюдали образование сферических структур на поверхности гифов (Рис. 2). 50 А Б Рисунок 2. Микрофотографии (сканирующая электронная микроскопия) сферических структур, образуемые Penicillium sp. ShG4С на среде Чапека-Докса (рН 2.5) в присутствии: А — ионов Со2+ (3 г/л), Б – ионов Cu2+ (3 г/л). Продолжительность культивирования составляла 16 суток. Дифракционный анализ (XRD) мицелия Penicillium sp. ShG4С показал присутствие кристаллических фаз. В присутствии кобальта образовывались биберит (CoSO4 × 7H2O) и ферриерит (Co1.62Na0.61(Al3.8Si32.2O72 )). В присутствии никеля - ретгерсит (NiSO46H2O), и меди — халькопирита (CuFeS2). Кристаллических фаз при выращивании ШГ4С в присутствии ионов Cd2+ не обнаружено. Наличие внутриклеточных электронплотных структур при выращивании на кадмии, предполагает, что изолят ShG4С обладает способностью внутриклеточного секвестировния Cd через связывание с металлотионинами, как это происходит с другими организмами (Jaeckel et al., 2005; Chakraborty et al., 2014). Работа поддержана грантом Российского научного фонда соглашение №14-14-00427 от 14.07.2014 г.; Грантом Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, научных учреждениях государственных академий наук и государственных научных центрах РФ договор № 14.Z50.31.0011 от 19 марта 2014 г. 51 ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕРАЦИИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА МИКРОБНЫМИ ИЗОЛЯТАМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ КРИОЛИТОЗОНЫ А. С. Громова, А. В. Кусакина Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова, Москва, Россия Микроорганизмы экологических ниш приполярных районов, в частности, обнаруживаемые в толще вечномерзлых льдов, вызывают особый интерес микробиологов и биотехнологов, поскольку могут содержать в условиях длительного низкотемпературного хранения древние формы микроорганизмов, присутствующих в жизнеспособном виде, и которые при вытаивании способны встраиваться в современные микробиологические сообщества. В данной работе мы оценивали свойства культур из микробных сообществ криолитозоны по их реакции на внесение раствора катионов серебра. Самым обычным и распространенным способом защиты микробных клеток от ионов металлов (Men+), присутствующих в окружающей среде, является их восстановление до нейтральных атомов (Me0), с последующим формированием наночастиц. Объектом исследования являлся образец ручейной воды, взятой в районе термоцирка, расположенного у подножья обнажения льда вечной мерзлоты Мамонтовой горы (Центральная Якутия). Независимые изоляты гетеротрофных аэробных культур были выделены из различных слоев воды: 10 из надосадка (КОЕ 2,8•106 кл/мл) и 6 из среднего слоя с наибольшим содержанием взвешенных частиц в надосадке (КОЕ 1,6•106 кл/мл). Большинство культур оказались грам-положительными. Оценка восстановительного потенциала по анализу формирования биогенных наночастиц серебра в присутствии клеток отдельных изолятов и общей биомассы шести изолятов из среднего слоя показала, что для каждой культуры характерно особое распределение размеров биогенных наночастиц (от 3 до 19 нм для различных культур). В препарате суммарной биомассы наблюдали монодисперсный узкий пик распределения наночастиц (4-5 нм), что свидетельствует о присутствии клеток, способных секретировать БАС, стабилизирующие биогенные наночастицы на ранней стадии их формирования. При изучении изолята РР-306, отнесённого к новому виду актинобактерий рода Serinibacter, была обнаружена уникальная способность поверхностных биополимеров его клеток во всех препаратах неизменно формировать наночастицы серебра в виде димеров — до 66 % от общего количества биогенных наночастиц. 52 РАЗНООБРАЗИЕ И ЭКОЛОГИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ РОДА NOSTOC: ЗОНАЛЬНЫЙ АСПЕКТ С. А. Дронова 1, 2, А. Д. Темралеева 1, 2 1 2 Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия Цианобактерии рода Nostoc широко распространены в наземных экосистемах в связи с их экологической пластичностью: способностью к фотосинтезу, азотфиксации, продукции внеклеточных полисахаридов. Именно благодаря этим механизмам представители рода приспособлены к различным колебаниям освещенности, влажности, температуры и др. Происхождение названия «Nostoc» связано с именем знаменитого алхимика и врача 16-го века Парацельса, который использовал его для описания гелеобразных колоний почвенной цианобактерии Nostoc commune (Potts, 1997). С позиций современной систематики род Nostoc принадлежит к отделу Cyanobacteria, классу Cyanophyceae, порядку Nostocales, семейству Nostocaceae, в которое входят более двух десятков родов (Guiry, Guiry, 2015). Для представителей рода Nostoc характерны такие морфологические признаки как: образование слизистых микро- и макроскопических колоний; изополярность нитей внутри колонии (тесно или рыхло переплетенных); цилиндрическая, боченковидная, овальная или шаровидная формы вегетативных клеток; одиночные терминальные или интеркалярные гетероциты; овальные акинеты, которые всегда развиваются апогетероцитно (в серии), т.е. почти все вегетативные клетки превращаются в акинеты между двумя соседними гетероцитами; отсутствие ветвления нитей (Komárek et al., 2014). Кроме того специфичным и сложным является и жизненный цикл видов рода Nostoc (Mollenhauer, 1986; Lazaroff, 1972; Komárek, Anagnostidis, 1989; Hrouzek et al., 2005). Несмотря на то, что систематика рода подробно изучалась с конца 19-го века, и было описано более 300 морфологических видов, род Nostoc претерпел ряд ревизий, по результатам которых его то описывали как единый (Bornet, Flahault, 1886), то разделяли на несколько родов: Amorphonostoс, Nematonostoc, Sphaeronostoc и Stratonostoc согласно морфологии колоний (Elenkin, 1936), то снова объединяли (Komárek, 1992). Развитие современных технологий позволило оценить однородность рода на основе молекулярногенетических данных. Исследования с большой выборкой штаммов показали его полифилетичное происхождение (Hrouzek et al., 2005; Rajaniemi et al. 2005a, b; 53 Řeháková et al., 2007; Arima et al., 2012). Однако в этих работах был неоднократно найден большой и хорошо поддерживаемый кластер, содержащий штаммы типового вида N. commune, широко используемого N. punctiforme и ряда других четко определенных видов (N. desertorum, N. edaphicum и др.). Объединяющим признаком этой клады было обитание в почвах, многие изоляты характеризовались наличием колоний с массивной слоистой слизью (Řeháková et al., 2007). Это наблюдение привело некоторых авторов к идее назвать эту группу «Nostoc sensu stricto» (Hrouzek et al., 2005; Řeháková et al., 2007). Наряду с данной группой часть видов Nostoc была выделена в новые роды: Mojavia (Řeháková et al., 2007) и Desmonostoc (Hrouzek et al., 2013). Так как таксономия, филогения, морфология и экологические предпочтения представителей рода до сих пор мало изучены, и, по мнению некоторых исследователей, в ближайшем будущем ожидается описание и обособление еще нескольких новых родов из традиционного рода Nostoc (Komárek et al., 2014), то в собственном исследовании мы сосредоточились на изучении морфологического разнообразия и экологии почвенных штаммов цианобактерий рода Nostoc, выделенных из различных природно-климатических зон России. Материалы и методы. Цианобактериальные штаммы были выделены из проб каштановых почв и солонцов (зона сухих степей, Волгоградская область), бурых полупустынных почв (зона полупустынь, Астраханская область и Республика Калмыкия) и серых лесных почв (зона смешанных и широколиственных лесов, Московская область). Отбор почвенных образцов проводили с соблюдением условий стерильности из верхнего горизонта А1 указанных типов почв. Также были собраны и исследованы видимые разрастания цианобактерий на поверхности почвы в форме корочек, пленок, подушек. Для выделения максимального разнообразия цианобактерий использовали методы получения смешанных культур (водно-почвенные и чашечные) и монокультур на различных средах (BG11 с азотом и без, Bold 3N, CyanoM). Культивирование проводили в культуральном боксе при стандартных условиях (температура + 23-25 ºС, освещенность 2000 Лк, световой режим 12:12 ч). Таксономическую идентификацию осуществляли с помощью методов оптической микроскопии: светлого поля и ДИК (микроскопы Leica DM750 и Carl Zeiss Axio Scope A1). В течение нескольких месяцев наблюдали за такими морфологическими признаками как форма и размер колоний; компактность упаковки нитей; присутствие слизи и ее окраска; расположение, размер и форма вегетативных клеток, гетероцит и акинет, а также за особенностями жизненных циклов штаммов. Физико-химические свойства почв (pH, Cорг) определяли по стандартным методикам. Результаты и обсуждение. Всего в каштановых почвах было обнаружено 9 видов (24 %) цианобактерий, в солонцах — 14 (70 %), в бурых полупустынных — 15 (79 %) 54 и в серых лесных почвах — 33 вида (31 %). В составе альгофлоры каштановых почв представители порядка Nostocales найдены не были. Тогда, как в солонцах доля представителей порядка Nostocales от других цианобактерий составила 29 %, среди них были обнаружены N. desertorum, N. edaphicum, N. microscopicum и N. punctiforme. В бурых полупустынных почвах доля цианобактерий порядка Nostocales оказалась выше, чем в солонцах — 40 %, в том числе половина видов принадлежала к роду Nostoc. Кроме видов N. desertorum и N. punctiforme, встречающихся в солонцах, в бурых полупустынных почвах был выделен широко распространенный вид N. commune, который характеризовался макроскопическими колониями с обильной окрашенной в желтый цвет слизью. В серых лесных почвах было обнаружено 13 видов цианобактерий порядка Nostocales (40 %), в том числе 4 вида исследуемого рода: N. muscorum (= Desmonostoc muscorum), N. paludosum, N. punctiforme и Nostoc sp. Таким образом, доминирование цианобактерий в солонцах и бурых полупустынных почвах, связано с наличием у них адаптационных механизмов к активной жизни в условиях засушливости, высокой температуры и инсоляции, щелочности и засолённости. В менее жестких условиях каштановых и серых лесных почв (слабокислая или нейтральная реакция среды, бóльшее содержание гумуса, более густой растительный покров, а, следовательно, более мягкий микроклимат) доля цианобактерий уменьшается более чем в 2-3 раза. Максимальное видовое богатство цианобактерий серой лесной почвы связано с длительностью и детальностью изучения альгофлоры данного типа почвы. Все три типа почв, где были встречены цианобактерии порядка Nostocales, отличались уникальным видовым составом представителей рода Nostoc. Исключением стали виды N. punctiforme, который встречался во всех трех типах почв (солонцы, бурые полупустынные и серые лесные), и N. desertorum (солонцы и бурые полупустынные почвы). Для дальнейшего сравнительного анализа требуется продолжение изучения альгофлор солонцов, каштановых и бурых полупустынных почв, а также уточнение морфологии, филогении и экологической роли азотфиксирующих цианобактерий рода Nostoc в почвах различных природно-климатических зон России. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15-29-01272 офи_м. 55 БАКТЕРИОРОДОПСИН: ДОСТУПЕН, ИЗУЧЕН, НЕПОНЯТЕН (РЕТРОСПЕКТИВНЫЙ ОБЗОР) М. А. Дубинный Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва, Россия Бактериородопсин был впервые выделен из пурпурной мембраны Halobacterium halobium в 1971 году (Oesterhelt 1971) и сразу привлек к себе огромное внимание научного сообщества. За прошедшие 44 года этот светозависимый протонный насос стал образцом детально и всесторонне изученного мембранного белка: почти восемь тысяч публикаций, более сотни мутантов, более восьми десятков рентгеновских структур, тестирование самых передовых научных методов и широкий спектр практических применений — голография, оптическая память, обработка изображений и солнечные батареи. Однако весь объем полученных данных заставляет предположить, что главный вопрос структурной биологии — связь структуры и функции бактериородопсина — в настоящий момент не имеет удовлетворительного ответа. Oesterhelt D (1971) Rhodopsin-like Protein from the Purple Membrane of Halobacterium halobium. Nature New Biol 233:149–152. doi: 10.1038/10.1038/newbio233149a0 56 ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА И СТРУКТУРЫ ЭКСТРАКЛЕТОЧНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ГЛИКОПОЛИМЕРОВ ПОВЕРХНОСТИ АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE ПРИ АДАПТАЦИИ К ТЕМПЕРАТУРНОМУ СТРЕССУ С. С. Евстигнеева1, Ю. П. Федоненко1, С. А. Коннова2 1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия 2 Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия Для формирования устойчивых ассоциаций грамотрицательных почвенных бактерий рода Azospirillum с широким кругом дикорастущих и культурных растений необходимо, чтобы микропартнёры эффективно противостояли негативным воздействиям среды обитания, а также успешно конкурировали с представителями патогенной микрофлоры. Одной из стратегий выживания азоспирилл в ризосфере является синтез специфических белковых и углеводных компонентов поверхности. К числу последних относятся: полисахариды капсулы (КПС), липополисахариды (ЛПС) внешней мембраны, а также продуцируемые в окружающую среду экзополисахариды (ЭПС). Данные гликополимеры участвуют в клеточной агрегации, адсорбции бактерий на корнях растений и их колонизации и т.д., поэтому вариабельность их состава и структуры является важным критерием успешной адаптации бактерий рода Azospirillum к стрессовым условиям. Из широкого набора воздействий, с которыми сталкиваются азоспириллы в ходе жизнедеятельности в ризосфере, к наиболее экстремальным можно отнести перепады температуры. В связи с этим целью нашей работы было изучение влияния температурного стресса на состав и структуру экстраклеточных полисахаридов и гликополимеров поверхности бактерий Azospirillum brasilense. Интервал допустимых для роста Azospirillum spp. температур в пределах 4–45 °С позволяет отнести эти бактерии к мезофиллам. Для изучения штаммовой вариабельности в ответе на температурный стресс нами были выбраны 4 культуры бактерий A. brasilense: типовой штамм Sp7 (изолирован из ризосферы росички, Бразилия), Sp245 (эндофитный симбионт пшеницы, Бразилия), SR8 и SR80 (выделены из ризосферы злаковых растений, Саратовская область). В качестве контрольного варианта азоспириллы культивировали в жидкой синтетической среде с малатом натрия при постоянном перемешивании на вибростенде при температуре 30 °С, экспериментальные варианты бактериальных культур выращивали в среде того же состава, но в диапазоне температур 42-45°С с шагом в 1 °С. Динамику роста азоспирилл оценивали фотометрически при λ = 600 нм. 57 Количественную оценку агрегации бактериальных культур выполняли согласно методике Madi & Henis (1989). Относительную гидрофобность клеточной поверхности устанавливали тестом солевой агрегации по Dufrêne & Rouxhet (1996). Получение препаратов ЭПС, КПС и ЛПС осуществляли в соответствии со схемой, приведённой на рис. 1. Анализ моносахаридного состава данных гликополимеров проводили методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Содержание моносахаридов рассчитано в процентах от суммы площадей всех идентифицированных пиков. Рисунок 1. Схема выделения и очистки экстраклеточных полисахаридов и гликополимеров поверхности бактерий A. brasilense. Выращивание бактерий A. brasilense при повышенных температурах показало, что при 44 и 45 °С количество жизнеспособных клеток по сравнению с контрольными вариантами культур ((4.5 ± 0.3) × 106 КОЕ/мл) существенно снижалось ((1.9 ± 0.2) × 104 КОЕ/мл). Культивирование бактерий при 42 °С приводило к меньшему на порядок снижению жизнеспособности клеток ((4.0 ± 0.2) × 105 КОЕ/мл), что позволило получить необходимое количество биологического материала и оценить воздействие стрессового фактора на полисахариды поверхности бактерий. Оценка динамики роста бактериальных культур A. brasilense при температуре 42 °С, показала сокращение продолжительности лаг-фазы и переход на стационарную фазу роста раньше (12-14 ч), чем в стандартных условиях (18-20 ч), кроме того выбранный температурный режим приводил к формированию клеточных агрегатов. Для бактериальных культур штаммов A. brasilense Sp7 и SR8 агрегация клеток составила 48 и 60 % соответственно, в то время как для штаммов Sp245 и SR80 она была выражена в меньшей степени 26 % и 36 %. 58 Известна защитная роль клеточных агрегатов при выживании бактерий в неблагоприятных условиях. Подобная реакция A. brasilense на стресс свидетельствовала о наличии изменений в составе компонентов поверхности бактериальных клеток, активно участвующих в процессе агрегации. Подтверждает данное предположение тест солевой агрегации, продемонстрировавший увеличение относительной гидрофобности поверхности бактерий A. brasilense Sp7 и Sp245 в 2 раза и её снижение для штаммов SR8 и SR80 в 1.5 раза. Для детального анализа изменений в компонентах поверхности бактерий A. brasilense, выращенных при температуре 42 °С, были выделены препараты ЭПС, КПС и ЛПС. Для всех используемых в работе штаммов азоспирилл было показано, что культивирование в условиях повышенной температуры приводило к увеличению продукции ЭПС, участвующих, как известно, в межклеточной адгезии и агрегации бактериальных клеток. Методом ГЖХ обнаружено увеличение в составе ЭПС содержания глюкозы (Glc) при температурном стрессе в среднем на 15 % у бактерий Sp7, Sp245 и SR80 и на 32 % в случае штамма SR8. В КПС бактерий A. brasilense в условиях стресса были выявлены аналогичные изменения, за исключением типового штамма Sp7, у которого в КПС наблюдалось возрастание доли Glc на 45 % по сравнению с контролем. В составе опытных образцов ЛПС бактерий Sp7, Sp245 и SR80 содержание Glc увеличилось на 12 %, а у штамма SR8 — на 21 %. (Рис. 2). Рисунок 2. Моносахаридный состав ЭПС, КПС и ЛПС бактерий A. brasilense, выращенных в стандартных условиях и при температурном стрессе/ 59 Таким образом, нами было показано, что у бактерий A. brasilense при температурном стрессе увеличивается агрегация клеток, в том числе и за счёт увеличения продукции ЭПС, а также происходит накопление Glc в моносахаридном составе ЭПС, КПС и ЛПС. Хотя тенденция нарастания концентрации Glc в ответ на стресс проявлялась у всех исследованных штаммов азоспирилл, данный эффект был выражен у них в разной степени. Вероятно, эти защитные реакции помогают азоспириллам не только адаптироваться к повышению температуры среды, но и индуцировать образование агрегатов бактериальных клеток, увеличивающих, как известно, эффективность процесса колонизации растений. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ (проект 14-04-01658). АНАЛИЗ МЕТАБОЛИТОВ МХА PHYSCOMITRELLA PATENS, ЗАРАЖЕННОГО ФИТОПАТОГЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ Е. Д.Егорова 1, Г. П. Арапиди 2, И. А. Фесенко 2, А. Урбан 2, Р. А. Хазигалеева 2, А. Л. Шаварда 3, А. Н. Игнатов 1, С. В. Виноградова 1 1 2 Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва, Россия ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков и М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия 3 Научно-исследовательский центр ресурсов для молекулярных и клеточных технологий, ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия Мхи являются одними из первых организмов, колонизировавших сушу. Мох Physcomitrella patens достаточно просто культивируется в лабораторных условиях, имеет преимущественно вегетативное размножение, его геном секвенирован, что позволяет использовать P. patens в качестве модельного объекта для изучения механизмов формирования иммунитета высших растений. Ранее были проведены исследования по изучению взаимодействия P. Patens и некротрофных грибов и бактерий Botrytis cinerea, Verticillium sp., Aspergillus niger, Screrotinium sclerotorum, Fusarium graminearum, Erwinia carotovora, которые поражают растения за счет неспецифичных токсинов и экзоферментов, убивающих клетки до проявления реакции устойчивости. Сообщения о взаимодействии P. Patens и специализированных бактериальных патогенов, которое строится на основе взаимной 60 регуляции метаболических и транспортных систем хозяина и патогена, отсутствуют. Поэтому изучение метаболома мха P. patens, зараженного специализированными фитопатогенными бактериями, является актуальной задачей. Нами впервые обнаружены патогенные для P. patens штаммы специализированных патогенов Xanthomonas arboricola, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Pantoae agglomerans (коллекция ФИЦ Биотехнологии РАН), которые были использованы в данном исследовании для инокуляции гаметофоров. В качестве контроля использовали инокуляцию водой. Из инокулированных гаметофоров выделяли метаболиты и методами газовой хроматографии и масс-спектрометрии определяли их состав. В результате в большинстве образцов были обнаружены фумаровая, лимонная и изолимонная кислоты, которые участвуют в энергетическом обмене, а также гликолитические производные сахаров и сахарофосфатов, участвующие в обмене веществ и формировании защитного механизма растений. Детектированные стерины такие как стигмастерин, ситостерин и кампестерол входят в состав клеточных мембран, локализируются во внутриклеточных органеллах и совместно с фосфолипидами стабилизируют мембраны и контролируют их проницаемость. В результате показано, что бактерии P. syringae и P. fluorescens были наиболее агрессивными, индуцировали накопление соединений, участвующих в системной устойчивости растений и необходимых для размножения бактерий в растениях. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 13-04-40104 и Гранта Президента РФ МК -7138.2015.4. 61 ВЛИЯНИЕ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ НА ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ МХА PHYSCOMITRELLA PATENS Е. Д. Егорова, С. В. Виноградова Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва, Россия В последнее время для изучения взаимодействий растений с фитопатогенами используется новый модельный объект — мох Physcomitrella patens, в том числе для изучения механизмов формирования иммунитета высших растений. Ранее было изучено взаимодействие P. patens с некротрофными патогенами: Erwinia carotovora и грибами родов Botrytis и Pythium. Целью нашей работы является изучение взаимодействия специализированных фитопатогенных бактерий родов Xanthomonas и Pseudomonas и мха P. patens. Гаметофоры P. patens культивировали на агаризованной питательной среде Кнопа в течение двух месяцев, а затем инокулировали фитопатогенными бактериями Xanthomonas arboricola, Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Pantoae agglomerans (коллекция ФИЦ Биотехнологии РАН). Xanthomonas arboricola является возбудителем бактериальной пятнистости косточковых, проникающим в растение через устьица и гидатоды и распространяющимся по побегам. Pseudomonas syringae вызывает пятнистость листьев растений и повреждения плодов. Xanthomonas campestris и Xanthomonas axonopodis вызывают сосудистые бактериозы, поражающие растения через поры листьев и механические повреждения. Пораженные растения отстают в росте, листья желтеют и отмирают. Pantoae agglomerans вызывает бактериальный ожог плодовых культур, проявляющийся в усыхании и скручивании листьев, плодоножек. Бактерии наращивали на агаризованной питательной среде LB в течение 48 часов, готовили суспензию с оптической плотностью 0,4 и использовали ее для инокуляции гаметофоров. В качестве контроля использовали инокуляцию водой. Для подтверждения размножения фитопатогенных бактерий в клетках гаметофоров P. patens сразу после инокуляции, на второй и на пятый день после инокуляции проводили выделение бактерий из гаметофоров мха. Для этого делали смыв бактерий с поверхности гаметофоров и растирание гаметофоров до получения однородной массы. Для подсчета бактериальных колоний суспензии, полученные после смыва с поверхности и после растирания гаметофоров, разводили в 105-109 раз, высевали на питательную среду LB. Было показано увеличение количества колоний всех изучаемых бактерий на питательной 62 среде на второй и пятый день после инокуляции, что свидетельствует о том, что изучаемые штаммы X. arboricola, P. syringae, P. fluorescens, X. campestris, X. axonopodis, P. agglomerans являются патогенами P. patens. Полную гибель гаметофоров наблюдали после инокуляции бактериями P. syringae. При инокуляции P. patens бактериями X. arboricola и P. fluorescens было отмечено слабое пожелтение гаметофоров. Ярко выраженное пожелтение гаметофоров было отмечено при инокуляции бактериями X. campestris и X. axonopodis. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 13-04-40104 и Гранта Президента РФ МК -7138.2015.4. ФИЗИОЛОГИЯ НОВОЙ ЖЕЛЕЗОВОССТАНАВЛИВАЮЩЕЙ АРХЕИ РОДА PYROBACULUM И. М. Елизаров 1, К. С. Заюлина 1, В. В. Кадников 2, А. А. Корженков 3, И. В. Кубланов 1, С. Н. Гаврилов 1 ivan.elizarov@gmail.com 1 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, Москва, Россия 2 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН Институт биоинженерии, Москва, Россия 3 Балтийский федеральный университет имени И. Канта, Россия, Калининград Род Pyrobaculum включает в себя виды, значительно отличающиеся друг от друга по способности использовать различные акцепторы электронов – соединения серы, металлов переменных валентностей и металлоидов. По отношению к кислороду встречаются и аэробы (P. calidifontis), и анаэробы (P. islandicum), и микроаэрофилы (P. aerophylum). Недавно из образца, отобранного из горячего источника острова Кунашир, на среде с ксиланом в качестве единственного субстрата и ферригидритом в качестве единственного акцептора электронов был выделен штамм 2319x2, который позже был отнесен к виду Pyrobaculum arsenaticum. В ходе нашей работы мы установили оптимальные и граничные для роста Pyrobaculum arsenaticum 2319х2 значения физических параметров среды и исследовали способность к использованию широкого спектра акцепторов электронов, в том числе 63 ранее не исследованных, но распространённых в областях с вулканической активностью (сульфид сурьмы(V)). Стимуляция роста микроорганизма была показана в присутствии фумарата, тиосульфата, арсената, селената, сурьмы(V), ферригидрита и магнетита. Максимальный урожай клеток наблюдался на селенате с триптоном в качестве субстрата. Также, в отличии от типового штамма Pyrobaculum arsenaticum, штамм 2319x2 показал способность к микроаэрофильному росту при концентрации кислорода 0,5-5%. В ходе функциональной аннотации генома был выявлен кластер генов, содержащий 4 гена мультигемовых цитохромов с трансмембранными доменами и один ген поринподобного белка. Эти цитохромы, предположительно, обуславливают способность данного микроорганизма к восстановлению нерастворимых форм Fe(III), как ранее было показано для гамма-протеобактерии Shewanella oneidiensis. Также были выявлены кластеры генов, кодирующих молибдоптериновые оксидоредуктазы. Кроме того, было показано, что данный микроорганизм способен сбраживать в отсутствии акцептора электронов богатые белковые субстраты, такие как дрожжевой экстракт и триптон, но к росту на ксилане способен только в присутствии акцептора. Таким образом было показано, что данный микроорганизмом обладает как дыхательным, так и бродильным типом энергетического метаболизма, определен широкий круг растворимых и нерастворимых акцепторов электронов, используемых данным организмом, и определены геномные детерминанты отдельных дыхательных процессов. Впервые показана стимуляция роста микроорганизма при восстановлении нерастворимого соединения сурьмы(V). 64 ГИДРОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВОГО ТЕРМОФИЛЬНОГО ПЛАНКТОМИЦЕТА TEPIDISPHAERA MUCOSA А. Г.Ельченинов 1,, О. Л.Ковалева 1, С. В.Тощаков 2, Е. А.Бонч-Осмоловская 1, И. В.Кубланов 1 1 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, Москва, Россия Балтийский федеральный университет имени И. Канта, Россия, Калининград 2 el.alexander92@yandex.ru В настоящее время филум Planctomycetes разделяют на три глубоких филогенетических группы: классы Planctomycetia и Phycisphaerae, а также аннамокспланктомицеты порядка Candidatus "Brocadiales" [1]. В недавно описанном классе Phycisphaerae пока известно лишь три культивируемых представителя. Как и большинство представителей класса Planctomycetia [2] культивируемые представители класса Phycisphaerae являются сахаролитиками, и наша работа посвящена детальному анализу данной способности у нового представителя класса Tepidisphaera mucosa. T. mucosa способна расти на многих углеводах, включая крахмал, ксилоглюкан, пектин, ксантановую камедь, глюкоманнан, галактан, арабинан и др. В ее геноме, отсеквенированном в ходе данной работы, были обнаружены 62 гена 26 семейств гликозидаз, 19 генов пяти семейств полисахаридлиаз и 11 генов четырех семейств карбогидратэстераз. В целом, геномные данные подтверждают ростовые эксперименты. Сравнение тотального количества генов гликозидаз (Рис. 1) и полисахаридлиаз (Рис. 2) у T. mucosa и других планктомицетов показало, что у этого организма сравнимое с другими планктомицетами количество гликозидаз, но намного большее число полисахаридлиаз. Для проверки выявленных в ходе геномного анализа предполагаемых ферментативных активностей суспензии клеток и культуральную жидкость T. mucosa инкубировали с различными полисахаридами (ксилан, аморфная целлюлоза, аморфный хитин, крахмал и ксилоглюкан) при pH 7,34 и 46 °C. В результате было детектировано разложение ксилоглюкана и крахмала суспензиями клеток T. mucosa. Далее для отделения ферментов от клетки использовали различные реагенты: NaCl, Твин 80, Тритон X-100, мочевина и ДСН. Оптимальная активность ксилоглюканаз проявлялась при использовании мочевины и Тритон X-100, а амилаз — при использовании Твин-80 и Тритон X-100. 65 Рисунок 1. Сравнение количества генов гликозидаз в геномах T. mucosa и других планктомицетов, чьи геномы представлены в базе данных CAZy [3]. Рисунок 2. Сравнение количества генов полисахаридлиаз в геномах T. mucosa и других планктомицетов, чьи геномы представлены в базе данных CAZy [3]. Также с использованием метода зимографии было выявлено, что T. mucosa. либо обладает несколькими ксилоглюканазами, либо один и тот же фермент может принимать различные конформации (Рис. 3). 66 Рисунок 3. Полиакриламидный гель с добавлением ксилоглюкана после инкубации 15 ч при 42 °С. 1 — WR protein marker (Sigma) 2 — Unstained protein marker 661 (Fermentas) 3 — фракция поверхностных белков T. mucosa, смытых с помощью мочевины. В дальнейшем мы планируем выявить активности по отношению к ряду других субстратов. 1. Yoon J., Jang J-H., Kasai H., 2014. Algisphaera agarilytica gen. nov., sp. nov., a novel representative of the class Phycisphaerae within the phylum Planctomycetes isolated from a marine alga. Antony van Leeuwenhoek, 105, 317-324, doi: 10.1007/s10482-0130076-1. 2. Fuerst J.A., Sagulenko E., 2011. Beyond the bacterium: planctomycetes challenge our concepts of microbial structure and function. Nat. Rev. Microbiol., 9, 403 - 413, doi: 10.1038/nrmicro2578. 3. http://www.cazy.org/ 67 ГИДРОЛИЗ ПОЛИСАХАРИДОВ НОВЫМИ ГИПЕРТЕРМОФИЛЬНЫМИ АРХЕЯМИ К С. Заюлина 1,, С. Н. Гаврилов 1, И. М. Елизаров 1, Д. А. Кожевникова 1, О. А. Подосокорская 1, С. В. Тощаков 2, Е. А. Бонч-Осмоловская 1, И. В. Кубланов 1 1 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, Москва, Россия 2 Балтийский федеральный университет имени И. Канта, Россия, Калининград zauylinakc@yandex.ru Среди гипертермофильных архей, растущих оптимально при температурах выше 80 ºС известно довольно много органотрофов, однако до сих пор выделено немного истинных гидролитиков, способных разлагать биополимеры и расти на продуктах их гидролиза. Из образца, отобранного из горячего источника острова Кунашир, на среде с ксиланом в качестве единственного субстрата было выделено два штамма 2319Х1 и 2319Х2, которые позже на основании анализа последовательности генов 16S рРНК были отнесены к родам архей Thermococcus (99 % сходства с T. litoralis) и Pyrobaculum (99 % сходства с P. arsenaticum). Род Thermococcus включает в себя виды, сильно отличающиеся друг от друга по спектру используемых субстратов при этом из 29 описанных на данный момент видов только 5 способны расти на полисахаридах. Нами была проверена субстратная специфичность штамма Thermococcus 2319Х1 в результате чего был выявлен широкий спектр используемых этим организмом сахаров. Рост на аморфной целлюлозе (АМЦ) гипертермофильных архей показан только для двух чистых культур: [1, 2]. По сравнению с двумя ранее описанными видами штамм 2319Х1 более эффективно использует АМЦ в качестве ростового субстрата. 68 Рисунок 1. Сравнение роста на аморфной целлюлозе между чистыми культурами гипертермофильных архей. Была проведена функциональная аннотация отсеквенированного в рамках данной работы генома с целью поиска ферментов, участвующих в разложении сахаров, в ходе которой было найдено 18 гликозидаз, включая одну, уникальную по своей доменной организации, содержащую домены как архейного, так и бактериального происхождения. Также были предложены пути разложения таких субстратов, как ксилан, АМЦ и крахмал. Были получены гидролитические активности фракции поверхностных белков штамма 2319Х1 по отношению к крахмалу, ксилану, хитину и аморфной целлюлозе. Представители рода Pyrobaculum не обладают способностью утилизировать не только поли-, но и дисахариды; тем не менее в их геномах были обнаружены гены гликозидаз, функция которых, по всей видимости, не связана с гидролизом субстрата. Для штамма Pyrobaculum 2319Х2 была проверена возможность роста на различных углеводах. Из всех проверенных субстратов рост наблюдался только на крахмале, целлобиозе, ксилане и мальтозе. Но даже такой небольшой список используемых субстратов является необычным среди представителей данного рода. Анализ генома показал, что Pyrobaculum 2319Х2 незначительно отличается по набору гидролаз от своих ближайших родственников. С помощью функциональной аннотации генома штамма 2319Х2 были предложены пути разложения крахмала и ксилана. Таким образом, обе новые чистые культуры родов Thermococcus и Pyrobaculum способны расти на полисахаридах, причем Thermococcus растет более чем на 11, что делает его одним из самых многосторонних гидролитиков среди архей, а Pyrobaculum — всего на двух: ксилане и крахмале, что для представителей этого рода показано впервые. 69 Дальнейшую работу мы планируем посвятить выделению ферментов из чистых культур штаммов 2319Х1 и 2319Х2 и определению их характеристик. 1. Perevalova A.A., Svetlichny V.A., Kublanov I.V., Chernyh N.A., Kostrikina N.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Bonch-Osmolovskaya E.A., 2005. Desulfurococcus fermentans sp. nov., a novel hyperthermophilic archaeon from a Kamchatka hot spring, and emended description of the genus Desulfurococcus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 55, 3, 995-999. Mardanov A.V., Ravin N.V., Svetlitchnyi V.A., Beletsky A.V., Miroshnichenko M.L., 2. Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G., 2009. Metabolic versatility and indigenous origin of the archaeon Thermococcus sibiricus, isolated from a siberian oil reservoir, as revealed by genome analysis. Appl. Environ. Microbiol., 75, 13, 4580-4588. ГИДРОЛИТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ПЛАНКТОМИЦЕТОВ СЕВЕРНЫХ БОЛОТ: ОЦЕНКА С ПОМОЩЬЮ МЕТАТРАНСКРИПТОМИКИ А. А. Иванова 1, С. Н. Дедыш 1 1 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва Planctomycetes — это одна из широко распространенных, но слабо изученных филогенетических групп домена Bacteria (Fuerst, 1995, 2004; Devos and Ward, 2014). Ее представители являются организмами с необычной морфологией и ультраструктурой клеток, обладающими рядом характеристик, несвойственных другим бактериям (Fuerst, 1995). Введение в микробиологическую практику молекулярных методов анализа показало, что планктомицеты широко распространены в природных и антропогенных местообитаниях. Особенно многочисленны представители этой филогенетической группы в северных болотах (Dedysh et al., 2006; Ivanova and Dedysh, 2012; Serkebaeva et al., 2013), однако функциональная роль планктомицетов в этих биосферно значимых экосистемах остается неясной. За последние годы был получен ряд свидетельств того, что болотные планктомицеты вовлечены в процессы деструкции органического вещества. Клетки этих бактерий были обнаружены в качестве непременного компонента микробных сообществ, осуществляющих разложение фитомассы сфагнума (Kulichevskaia et al., 2007), а в 2012 году был охарактеризован первый планктомицет, обладающий целлюлозолитической активностью (Kulichevskaya et al., 2012). Однако из-за сложностей, связанных 70 с культивированием и выделением планктомицетов в чистую культуру (Dedysh, 2011), знания относительно их гидролитических способностей остаются недостаточными. Целью настоящей работы было исследование гидролитического потенциала планктомицетов и их участия в трансформации ключевых биополимеров болотных экосистем с помощью идентифицировать метода метаболически метатранскриптомики. активные компоненты Последний микробного позволяет сообщества с помощью анализа транскриптов генов рРНК и функциональных генов, задействованных в протекающих в той или иной экосистеме процессах (Urich et al., 2008; Tveit et al., 2013, 2014). В работе был использован сфагновый торф и вода, отобранные с глубины 5-10 см верхового болота Обуховское Ярославской области. Измельченный и перемешанный торф был распределён по 500 мл флаконам таким образом, чтобы в каждом флаконе находилось 10 г торфа и 40 мл болотной воды. В качестве субстратов во флаконы были внесены ключевые биополимеры болотных экосистем: ксилан (Fluka), пектин (Sigma), аморфный хитин и аморфная целлюлоза в концентрации 2 мг л-1. В качестве контроля использовали нативный торф с водой без внесения субстратов. Эксперимент проводили в трёх повторностях, образцы инкубировали при 22 °С в темноте в течение 30 дней. По истечении инкубационного периода из контрольных и экспериментальных флаконов были отобраны аликвоты торфяной суспензии для выделения тотальной РНК (Mettel et al., 2010), конструирования библиотеки РНК и последующего секвенирования на платформе Illumina HiSeq 2000. Библиотека транскриптов РНК была сконструирована с помощью NEBNext Ultra Directional RNA Library Kit for Illumina (New England Biolabs GmbH, Germany), секвенирование проводилось с двух концов нуклеотидной последовательности, размер каждого фрагмента составил около 100 пар оснований. По итогам секвенирования было получено около 90 миллионов нуклеотидных последовательностей, которые были подвергнуты фильтрации по размеру и качеству фрагментов. C помощью программного пакета SortMeRNA (Kopylova et al., 2012) из общего пула данных были отобраны последовательности 16S рРНК, которые в последствии были обработаны в программном пакете QIIME (Caporaso et al., 2010) со стандартными параметрами. Таксономическую классификацию отобранных последовательностей осуществляли согласно базе данных Silva nr 111 (Quast et al., 2013). Изменения в структуре микробного сообщества, вызванные внесением полимерных субстратов, прослеживали с помощью молекулярного анализа транскриптов 16S рРНК. В суспензии нативного торфа принадлежащие планктомицетам последовательности составили 7.2 % общего пула полученных бактериальных транскриптов, что хорошо коррелирует с раннее полученными данными (Serkebaeva et al., 2013; Ivanova and Dedysh, 71 2012). В образцах с внесёнными субстратами доля планктомицетных последовательностей варьировала от 5.7 до 8.8 % общего числа таксономически классифицированных фрагментов. Изменения в ответ на обогащение торфяной суспензии биополимерами наиболее четко прослеживались на уровне состава отдельных групп в пределах филума Planctomycetes. Наибольший отклик был вызван внесением биополимера хитина. Группами, обнаружившими статистически значимый отклик на доступность хитина, были Phycisphaera- и Gemmata-подобные планктомицеты. Значительная доля планктомицетных последовательностей (от 30 до 40 %) принадлежала некультивируемым представителям семейства Planctomycetaceae. Наиболее очевидные изменения внутри этого семейства были обнаружены в результате добавления пектина и ксилана благодаря планктомицетам группы Pirellula, которые ранее уже были обнаружены в сфагновом болоте и в почве, обогащённой целлюлозой (Ivanova and Dedysh, 2012; Eichorst and Kuske, 2012). Полученные данные свидетельствуют, что планктомицеты являются метаболически активным компонентом гидролитического микробного сообщества сфагновых болот и реагируют на внесение различных биополимеров. В деструкции определённого биополимера принимает участие специфическая группа внутри филума Planctomycetes. Примечательно, что подавляющее большинство планктомицетов-гидролитиков, выявленных в нашем исследовании, являются некультивируемыми организмами и требуют дальнейшего исследования. 72 ТРАНСКРИПТОМИКА МИКОБАКТЕРИЙ Д. В. Игнатов 1, Е. Г. Салина 2, К. Б. Майоров 3, А. С. Апт 3, А. С. Капрельянц 2, Т. Л. Ажикина 1 1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, Россия 2 Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук», Москва, Россия 3 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно- исследовательский институт туберкулёза» Российской академии медицинских наук, Москва, Россия Несмотря на секвенирование десятков бактериальных геномов, понимание структуры транскриптома бактериальной клетки нельзя назвать полным. Благодаря использованию технологии микроэрреев получено много информации о специфической экспрессии генов многих видов бактерий в различных условиях внешней среды. Однако этот подход имеет свои ограничения, а именно, не позволяет определить детальную структуру транскриптома: границы оперонов и отдельных транскриптов, а также некодирующие РНК, описанные лишь для немногих видов прокариот. Появление и распространение секвенирования следующего поколения предоставило возможность описать бактериальный транскриптом с высокой точностью. Мы применили платформу Illumina для секвенирования транскриптома Mycobacterium avium, факультативного патогена человека и животных, при росте в культуре. Было обнаружено и картировано несколько десятков малых РНК, и выявлены малые РНК, специфичные для M. avium. Кроме того, были картированы точки начала транскрипции нескольких сотен генов, и обнаружено, что 33 % мРНК M. avium не имеют лидерных последовательностей. Эти данные указывают на необычно высокое количество безлидерных мРНК у микобактерий. Также мы провели секвенирование транскриптома Mycobacterium tuberculosis в дормантном состоянии. Было показано общее снижение количества мРНК в дормантных клетках в 50-100 раз, что демонстрирует общее понижение метаболической активности. Были выявлены гены, уровень экспрессии которых меняется при переходе в дормантное состояние, а также показано наличие транскриптов нескольких малых РНК в дормантном состоянии в количестве, превышающем уровень транскрипции белок-кодирующих генов. Также было обнаружено, что 23S рибосомальная РНК 73 в дормантных клетках подвергается разрезанию по сайту, расположенному за пределами каталитического центра рибосомы. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 13-04-40070-Н, 13-0440071-Н, 13-04-40072-Н и 15-04-04563-а ВЛИЯНИЕ ФУНГИЦИДА ФЕНИЛФЕНОЛА НА АКТИВНОСТЬ ЛИГНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ LENTINULA EDODES В. А. Ильюшин, Е. В. Плотников, О. В. Карначук Лаборатория биохимии и молекулярной биологии, Кафедра физиологии растений и биотехнологии, НИ ТГУ, Россия Загрязнение ксенобиотиками является серьезной проблемой, влияющей на качество жизни и естественное функционирование экосистем. Фенилфенол применяют как фунгицид при обработке сельскохозяйственной продукции. В настоящее время находит все большее применение биологическая деградация загрязнителей (диоксины, красители, пестициды) с помощью ксилотрофных грибов. Lentinula edodes (Berk.) Pegler, шиитаке — биотехнологически значимый ксилотрофный базидиомицет, который ценится не только как источник биологически активных веществ, но и за способность окислять широкий спектр соединений фенольной природы. Ферменты L. edodes, участвующие в деструкции органических загрязнителей, главным образом, относятся к лигнолитической группе, среди которых значимыми являются марганец зависимые пероксидазы (МnР, ЕС 1.11.1.13) и лакказы (полифенолоксидаза, Lcc, ЕС 1.10.3.2). Лигнолитические ферменты индуцибельные, их активность повышается в присутствии биологических активаторов. Ранее было показано, что ванилин может активировать образование Lcc (Tsujiyama et al., 2013). Мы изучили способность L. edodes к биодеградации фенилфенола в присутствии ванилина. L. еdodes, штамм W4 приобретен в компании «Fungi Perfecti» (Olimpia, WA,USA), анализ последовательности гена 18S rRNA подтвердил принадлежность штамма (Glukhova et. al., 2014). Мицелий выращивали на твердой и в жидкой среде при 22 °С с постоянной аэрацией в отсутствии света. После накопления биомассы на 7 сутки добавляли фенилфенол в концентрации 0,01 мМ, 0,1 мМ, 1 мМ. Ванилин добавляли на 3 сутки в концентрации 50 мг/л. Через каждые 3 дня измеряли активность Lcc, MnP, общее содержание фенольных соединений. Время культивирования составило 40 суток. 74 Состав питательной среды может влиять на ферментативную активность. Проведенное нами сравнение показало более высокую активность Lcc и MnP при росте грибов на среде описанной Tsujiyama с соавторами по сравнению со средой Чапека. При культивировании на твердой среде, фенилфенол в концентрации 0,1 мМ ингибировал рост мицелия на твердом субстрате. При этом другие фенольные соединения (фенол, гваякол, пирокатехин, рутин) в диапазоне концентраций 1мкМ – 1мМ не изменяли скорость роста. При выращивании L. edodes в погруженной культуре концентрация фенилфенола 1 мМ была летальной. Ферментативной активности и накопление белка не наблюдали, общий уровень фенольных соединений не изменялся. При более низких концентрациях фенилфенола (0,01–0,1 мМ) в процессе культивирования наблюдалось снижение общего содержания фенольных соединений. Предварительное добавление ванилина с последующим внесением фенилфенола (конечная концентрация 0,1 мМ) подавляло развитие мицелия, при этом ферментативной активности не наблюдалось, таким образом, ванилин усиливал токсический эффект фенилфенола. Данные полученные при погруженном культивировании мицелия показали, что ванилин и фенилфенол повышали лигнолитическую активность изученных ферментов. При этом фенилфенол в концентрации 0,01–0,1 мМ увеличивал продукцию лакказ, но уровень MnP падал по сравнению с контролем. Максимальное значение активности лакказ наблюдали на 28 сутки (Рис. 1). Пик пероксидаз зафиксировали на 36 сутки, что совпадало с падением активности полифенолоксидазных ферментов (Рис. 2). Некоторые исследователи связывают позднюю активацию лигнолитических ферментов со снижением биодоступности азота в питательной среде (Valle et al., 2014). Рисунок 1. Активность лакказ в среде в процессе культивирования. 75 Рисунок 2. Активность Mn-пероксидаз в среде в процессе культивирования. Исследование поддержано грантом Правительства РФ (№ договора 14.Z50.31.0011). 1. Glukhova L.B., Sokolyanskay L. O., Plotnikov E.V. et al. Increased mycelial biomass production by Lentinula edodes intermittently illuminated by green light emitting diodes. // Biotechnol Lett. 2014 DOI 10.1007/s10529-014-1605-3 2. Tsujiyama S1, Muraoka T, Takada N. Biodegradation of 2,4-dichlorophenol by shiitake mushroom (Lentinula edodes) using vanillin as an activator. // Biotechnol Lett. 2013 Jul;35(7):1079-83. doi: 10.1007/s10529-013-1179-5. Epub 2013 Mar 21. 3. Valle J.S., Vandenberghe L.P., Santana T.T. et al. Optimum conditions for inducing laccase production in Lentinus crinitus // Genet Mol Res. 2014 Oct 20;13(4):8544-51. doi: 10.4238/2014.October.20.31. 76 МЕТАГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОДЗЕМНОЙ БИОСФЕРЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ В. В. Кадников 1, Ю. А. Франк 2, А. В. Марданов 1, О. В. Карначук 2, Н. В. Равин 1 1 2 Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томский Государственный Университет, Томск Экстремофильные (обитающие в экстремальных условиях среды), в первую очередь, термофильные, микроорганизмы активно исследуются последние два десятилетия. Они представляют интерес как для фундаментальных исследований, поскольку большинство термофилов представляют эволюционно древние формы жизни, встречающиеся в уникальных экосистемах, так и в качестве биотехнологически-значимых объектов. Одной из наименее изученных экологических ниш является подземная биосфера, где повышение температуры пород и пластовых вод с ростом глубины создает условия для развития термофильных микробных сообществ. Микроорганизмы подземной биосферы составляют значительную часть биомассы на нашей планете, но знания об этих микроорганизмах остаются очень ограниченными. Некоторые подземные местообитания были изолированы от внешней среды десятки миллионов лет и содержат ограниченный набор субстратов, которые могут поддерживать рост микроорганизмов. Также микроорганизмы подземной биосферы характеризуются чрезвычайно низкими скоростями метаболизма и временем удвоения, которые по некоторым оценкам могут составлять сотни и тысячи лет. Целью работы биогеохимических является функций и исследование биоразнообразия, биотехнологического потенциала возможных термофильных микроорганизмов, обитающих в глубинных подземных водах Западной Сибири (Томская область), в результате секвенирования и анализа метагеномов микробных сообществ. Мы исследовали микробное сообщество подземных термальных вод, вытекающих с глубины 2775 метров в нефтепоисковой скважине 3Р Парабельского района, и сообщество микроорганизмов термальных вод в нефтепоисковой скважине 1Р в пос. Белый Яр. Для характеристики сообществ было проведено два эксперимента — идентификация микроорганизмов с помощью пиросеквенирования вариабельных фрагментов генов 16S рибосомной РНК и секвенирование полного метагенома. Определены 77 физико-химические характеристики соответствующих экологических ниш — температура и химический состав термальных вод, состав и изотопный состав растворенных газов. В результате пиросеквенирования вариабельных фрагментов гена 16S рРНК было установлено, что наибольшую долю (~ 80 %) в сообществе термальных вод скважины 3Р Парабельского района составляли бактерии филума Firmicutes, относящиеся к родам Desulfovirgula (~ 53 %), Desulfotomaculum (~ 12 %) и Thermacetogenium (~ 8 %). Гидрогенотрофные метаногены рода Methanothermobacter представляли архейную часть сообщества. Анализ последовательностей функциональных генов в метагеноме позволил отнести их к определенным микроорганизмам и предсказать вероятные функции этих генов. В результате сравнения геномной последовательности Desulfotomaculum kuznetsovii с референсной последовательностью генома другого штамма этого вида (DSM6115, выделен из термального источника в Абхазии), показано, что около 85 % генома D. kuznetsovii DSM6115 покрывается последовательностями метагенома, причем на совпадающих участках уровень идентичности нуклеотидных последовательностей превышает 99,9 %. Участки генома штамма DSM6115, которые отсутствуют в штамме D. kuznetsovii из подземных вод, относятся к трем типам генетических элементов. Во-первых, это сравнительно короткие (длиной не более нескольких т.п.н.) мобильные элементы и их производные, специфические для штамма DSM6115. Во-вторых, несколько штаммоспецифических участков представлены интегрированными в геном профагами. Наконец, штаммоспецифическими являются CRISPR локусы, последовательности спейсеров которого у штаммов DSM6115 и штамма из подземных вод отличаются. Сравнение нуклеотидных последовательностей участков геномов, имеющихся у обеих штаммах, выявило 27,2 тыс. точечных отличий между ними. В ряде работ, посвященных анализу генетических различий между популяциями микроорганизмов, эволюционировавших от общего предка в географически изолированных экосистемах, например, в работе Reno et al., 2009 (Proc. Natl Acad Sdci USA, 106, 8605-8610) в которой сравнивались геномы нескольких штаммов термофильных архей Sulfolobus, скорость накопления мутаций оценивается в 4.7 × 10-9 замен на сайт в год. Если использовать эту оценку скорости накопления мутаций для сравнения геномов двух анализируемых штаммов D. kuznetsovii, то время с момента их дивергенции можно оценить примерно в 1.6 млн. лет. Исследуемые штаммы D. kuznetsovii обнаружены в двух географически изолированных экосистемах подземных термальных вод — Кавказа и Западной Сибири. Предполагается, что подземные термальные воды Западной Сибири являются замкнутой, 78 не обменивающейся с поверхностными водами, экосистемой с момента ее образования в десятки-сотни миллионов лет назад. Сравнение двух штаммов на геномном уровне указывает либо на существование более поздней связи между этими экосистемами, либо на существенно более низкие частоты накопления нуклеотидных замен в геномах микроорганизмов подземной биосферы. Доминирующий в сообществе микроорганизм, Desulfovirgula thermocuniculi, по последовательности гена 16S рРНК на 100 % идентичен штамму Desulfovirgula thermocuniculi DSM16036, выделенному в 2007 г. в горячем источнике в Японии. Сравнение нуклеотидных последовательностей участков геномов, имеющихся у обеих штаммах, выявило 21,8 тыс. точечных отличий между ними, что соответствует времени дивергенции в 1,5 млн. лет. Представители Desulfovirgula и Desulfotomaculum составляют более 90 % всего микробного сообщества и являются сульфатредукторами. Это подтверждает факт наличия двух полных наборов генов, кодирующих ключевые ферменты сульфат-редукции (Apr и Dsr гены). Еще один набор dsr генов с более низкой кратностью прочтения, вероятно, соответствует одной из «некультивируемых» линий филума Firmicutes. Проведенный анализ метагеномных данных показывает, что Desulfovirgula и Desulfotomaculum обладают возможностями для хемолитотрофного метаболизма, основанного на гидрогенотрофной сульфатредукции. Также были идентифицированы гены ключевых ферментов гликолиза, ЦТК и других путей метаболизма На основании анализа состава микроорганизмов и набора присутствующих в метагеноме генов можно сделать вывод о том, что сообщество термальных вод скважины 3Р характеризуется преимущественно хемолитоавтотрофным метаболизмом, в основе которого лежат процессы окисления водорода, сопряженные с восстановлением сульфата. Гидролиз поступающих извне высокополимерных соединений может осуществляться минорными компонентами сообщества, — бактериями Thermacetogenium и другими не сульфатредуцирующими фирмикутами, а также бактериями других групп, например, Ignavibacteriae, Planctomycetes и Chloroflexi, обнаруженными при анализе состава сообщества по вариабельным фрагментам генов 16S рРНК. Метагеномный анализ второй скважины, 1Р, выявил отличающееся от Парабельской скважины и более разнообразное микробное сообщество. Только 30 % последовательностей 16S РНК были отнесены к известным видам микроорганизмам. В числе основных групп микроорганизмов были обнаружены Firmicutes, Deltaproteobacteria, Chloroflexi, Nitrospira и несколько некультивируемых линий бактерий. Работа поддержана грантом РНФ 14-14-01016. 79 ФАКТОРЫ, ОБУСЛАВЛИВАЮЩИЕ УСТОЙЧИОВСТЬ К ОРТОВАНАДАТУ У ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫХ ДРОЖЖЕЙ OGATAEA POLYMORPHA А. В. Каргинов, А. И. Бунеев, М. О. Агафонов Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва Близкородственные виды метилотрофных термотолерантных дрожжей O. poymorpha и O. parapolymorpha сильно отличаются по устойчивости к токсичному аналогу фосфата — ванадату. Природная устойчивость O. poymorpha очень высока, заметно выше, чем у других видов дрожжей, а O. parapolymorpha не обладает такими свойствами. Для изучения механизмов, обуславливающих устойчивость дрожжей к ортованадату, мы провели поиск генов, отвечающих за устойчивость к данному аниону у этих двух видов. В результате был выявлен ряд генов, среди которых наибольшим эффектом обладали гомологи генов Saccharomyces cerevisiae PHO87 и MNN4. Ген PHO87 S. cerevisiae кодирует низкоаффинный переносчик фосфата плазмалеммы. Его гомолог мы также обозначили PHO87, поскольку его инактивация в геноме O. parapolymorpha приводила к значительному росту устойчивости полученных штаммов к ортованадату, что связано с тем, что данный анион является токсичным аналогом фосфата и переносчик фосфата может обеспечивать проникновение этого вещества в клетку. Были получены антитела на Pho87 и оценено количество данного белка в клетках O. poymorpha что и количество O. parapolymorpha. Pho87 в клетках Методом иммуноблотинга O. poymorpha было существенно выявлено, меньше, чем у O. parapolymorpha. Чтобы изучить, отличаются ли свойства Pho87 у двух видов дрожжей, в штамм O. parapolymorpha с инактивированным PHO87 были введены гены PHO87 O. poymorpha и O. parapolymorpha. У полученных трансформантов были сравнены уровни продукции белка Pho87 и определена их устойчивость к ортованадату. При схожих уровнях продукции белка клоны с PHO87 из генома O. poymorpha были устойчивее к ортованадату, чем клоны с PHO87 O. parapolymorpha. Это свидетельствовало о том, что устойчивость связана не только с уровнем продукции, но и со свойствами Pho87. Продукт гена MNN4 у S. cerevisiae участвует в присоединении маннозилфосфата к гликозидным цепям белков секреторного пути. Нарушение этого процесса можно выявлять по окрашиванию клеток альциановым синим. Этот краситель связывается с клеточной стенкой дрожжей, когда она несет отрицательный заряд, обусловленный 80 фосфатными группами в составе гликозидных цепей маннопротеинов. Инактивация гомолога MNN4, названного нами VRE1, в геноме O. polymorpha приводила к отсутствию связывания альцианового синего с клетками. Это свидетельствовало о том, что продукт этого гена также отвечает за участие в маннозилфосфорилировании белков клеточной стенки. Инактивация данного гена в геноме O. polymorpha приводила к существенному падению устойчивости, O. polymorpha в геном а введение мультикопийной O. parapolymorpha плазмиды приводило к с росту геном VRE1 устойчивости к ортованадату. При этом устойчивость возрастала даже в том случае, когда в геноме исходного штамма O. parapolymorpha отсутствовал ген PHO87. Таким образом, VRE1 может оказывать влияние на устойчивость к ортованадату независимо от Pho87. О ПРЕИМУЩЕСТВАХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПЛЁНОК В ПРОЦЕССАХ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД Т. В. Кирилина, А. С. Сироткин Казанский национальный исследовательский технологический университет, Казань, Россия Благодаря современным микробиологическим и молекулярно-биологическим методам доказано, что большинство бактерий в природных экосистемах существует в виде специфически организованных прикрепленных к поверхностям биопленок. Нахождение микроорганизмов в составе иммобилизованных систем предоставляет им ряд преимуществ, которые в целом характеризуют особенности биопленок. При этом преимущества нахождения микроорганизмов в иммобилизованном состоянии обусловлены главным образом матриксом из внеклеточных полимерных веществ. Внеклеточный полимерный матрикс состоит из высокогидратированных биополимеров микробной природы, которые составляют большую часть биомассы биопленки и непосредственно формируют микросреду, определяющую фактические условия для жизни бактерий, обеспечивающую организацию микроконсорций, градиентов концентраций, массоперенос субстрата и продуктов жизнедеятельности, архитектуру и стабильность биопленок. В процессах очистки сточных вод биопленки занимают особое место: в биофильтрах сточная жидкость очищается, обтекая поверхность загрузочного материала, покрытого активной биомассой (биопленкой). 81 В биофильтрах обеспечивается хорошая кинетика процесса биологического окисления загрязнений сточных вод специализированными микроорганизмами. При этом микроорганизмы-специалисты, потребляющие компоненты сточной воды распределены по высоте слоя загрузки. Поэтому в биофильтрах, длительно работающих в системах очистки сточных вод постоянного состава, реализуется концепция пространственной сукцессии как последовательная смена биоценозов по высоте биофильтра и по времени пребывания в нем сточной воды. Каждое предыдущее сообщество микробов, простейших и некоторых высших организмов участвует в удалении из воды характерных примесей и, тем самым, обусловливает развитие последующего биоценоза, в свою очередь, очищающего воду от других характерных загрязнений. При этом пространственная сукцессия наблюдается не только в объеме биофильтра в целом, но и в объеме биопленки. Ограниченная диффузия в объеме матрикса из внеклеточных полимерных веществ приводит к концентрационным градиентам субстратов и продуктов метаболизма бактерий, обуславливая пространственно гетерогенный рост микроорганизмов биопленки, стратификацию ее структуры. Ограниченная диффузия субстрата в объеме матрикса из внеклеточных полимерных веществ принимает особенное значение в случае транспорта кислорода, который потребляется аэробными организмами быстрее, чем происходит его диффузия. Таким образом, в биопленке могут граничить аэробная, аноксическая и анаэробная зоны, и, как результат, в аэробных системах могут возникать, условия благоприятные для развития анаэробов. Все это обусловливает возможность комплексной биотрансформации органических веществ, соединений азота, серы, железа и марганца в системах с биопленками. Наибольшее внимание исследователей привлекает комплексная микробная биотрансформация соединений азота в процессах очистки с имммобилизованной биомассой. Известно, что процессы комплексного микробного превращения соединений азота требуют принципиально различных условий, в частности по содержанию растворенного кислорода. Так, последовательное окисление ионов аммония и нитритов протекает в аэробных условиях. Образующиеся в результате аэробной нитрификации нитраты в аноксических условиях восстановливаются до нитритов и далее, до какой-либо из газообразных форм азота, в процессе денитриифкации. Все бактерии, являющиеся факультативными аэробами и анаэробами и способные к денитрификации, осуществляют этот процесс только в условиях отсутствия кислорода или его недостатке. В анаэробных условиях протекает анаммокс-процесс с окислением аммонийного азота до молекулярного с помощью нитрита или нитрата в качестве акцептора электронов. 82 Кроме того, следует отметить, что комплексное удаление органических веществ и аммонийного азота и подавлением сопровождается автотрофных ингибированием нитрифицирующих процесса бактерий нитрификации гетеротрофными микроорганизмами. Однако быстрорастущие гетеротрофные бактерии оккупируют верхний, поверхностный слой стратифицированной биопленки, где концентрация субстрата и скорость отделения биомассы выше, в то время как медленнорастущие автотрофные нитрифицирующие бактерии развиваются во внутренних слоях биопленки. Проводились биофильтрации экспериментальные коммунально-бытового исследования стока в процесса системе трех непрерывной последовательно работающих биофильтров. Анализ потребления субстрата и накопления продуктов метаболизма, в ее оценка составе активности наглядно биомассы демонстрирует и идентификация концепцию микроорганизмов пространственной сукцессии биоценозов. Было выявлено, что основной вклад в удаление органических веществ вносил микробиоценоз первого биофильтра, тем самым создавая условия для развития нитрифицирующего микробиоценоза в последующих биофильтрах. Так, согласно полученным данным, в среднем, 86 % органических веществ удалялось в первом биофильтре. После завершения периода первоначального накопления биомассы в системе и накопления медленнорастущего автотрофного нитрифицирующего микробиоценоза, основной вклад в удаление аммонийного азота( до 76 %) вносил микробиоценоз второго биофильтра. Анализ полученных данных свидетельствует о дисбалансе между общим количеством потребленного аммонийного азота, с одной стороны, и количеством аммонийного азота, окисленного нитрификаторами и потребленного гетеротрофами, с другой стороны. При этом следует принимать во внимание возможность биотрансформации конечных продуктов нитрификации — нитратов в газообразные продукты (молекулярный азот, оксиды азота (I) и (II)) в результате протекания процессов денитрификации или анаэробного окисления аммония (Anammox-процесса). Результаты идентификации микроорганизмов в составе образцов биопленок трех биофильтров методом флуоресцентной in situ гибридизации подтверждают возможность протекания комплекса процессов биотрансформации соединений азота в процессе аэробной биофильтрации с участием бактерий р. Nitrosomonas, Nitrospira, Сurvibacter, Azoarcus, Brocadia anammoxidans и Kuenenia stuttgartiensis. Полученные экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что в биопленке толщиной 0,5 мм могут эффективно, 83 даже симбиотично, сосуществовать субстрат-конкурентные виды бактерий. В частности, в объеме биопленки аэрируемого биофильтра имеются условия для развития, не только нитрификаторов, но и денитрифицирующих микроорганизмов и анаммокс-бактерий. Таким образом, наряду с такими эксплуатационными преимуществами биофильтров как небольшие затраты на обслуживание, простота работы, отсутствие необходимости рециркуляции и разделения биомассы, относительно небольшое количество избыточной биомассы и т.д., ключевым моментов является возможность создания в системах с биопленками различных условий культивирования микроорганизмов для осуществления сложных многостадийных процессов биологического потребления загрязняющих веществ и, тем самым, реализации современных тенденций к созданию компактных и эффективных систем водоочистки. АЭРОТОЛЕРАНТНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ А. И. Климко, Т. А. Чердынцева, А. Л. Брюханов Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, Россия Молочнокислых бактерий (МКБ) широко используют во многих ферментационных процессах при приготовлении разнообразных продуктов питания, включающих в себя не только молочные и мясные, но так же и овощные продукты. Некоторые штаммы Lactobacillus rhamnosus, например, L. rhamnosus GG и Е-97800, применяют в качестве пробиотических заквасок в производстве сухих колбас [Sanders, 1993]. L. rhamnosus, как и Lactobacillus reuteri, также используют для улучшения состояния желудочно-кишечного тракта человека и для укрепления его иммунной системы [De Angelis, Gobbetti, 2004]. В ходе промышленных процессов МКБ часто подвергаются окислительным стрессам, которые возникают из-за накопления активных форм кислорода (АФК) внутри клеток. АФК образуются в результате неполного восстановления молекулярного кислорода до супероксидного радикала (О2•-), пероксида водорода (Н2О2) или гидроксильного радикала (ОН•) и вызывают повреждения макромолекул (белков, липидов и нуклеиновых кислот), что, в свою очередь, может привести к остановке роста и последующей гибели клеток. 84 Несмотря на это, некоторые МКБ могут сохранять жизнеспособность и физиологическую активность в присутствии достаточно высоких концентраций H2O2. Нами был проведен опыт по изучению устойчивости клеток L. rhamnosus штамм КМ МГУ 528 и L. reuteri штамм 5 по отношению к пероксиду водорода. L. Rhamnosus и L. reuteri относят к аэротолерантным анаэробным микроорганизмам. L. rhamnosus штамм КМ МГУ 528, который достаточно широко применяют в мясной промышленности, даже способен выделять в среду небольшое количество пероксида водорода, а его ростовые характеристики оказались примерно одинаковыми как в строго анаэробных, так и в микроаэробных и аэробных условиях. H2O2 в концентрации 1, 2 и 5 мМ добавляли к жидким культурам, находящимся в середине логарифмической фазе роста. Было показано, что клетки L. rhamnosus и L. reuteri способны выдерживать концентрацию H2O2 вплоть до 2 мМ, хотя скорость роста и выход биомассы снижаются на 20-40% в зависимости от штамма и концентрации H2O2. При концентрации пероксида, равной5 мМ, наблюдалось значительное замедление роста обоих культур. То, что молочнокислые бактерии способны не только сохранять жизнеспособность, но и делиться в условиях достаточно сильных окислительных стрессов, косвенно свидетельствует о том, что в их клетках присутствуют ферменты антиокислительной защиты. К ферментам антиокислительной защиты, осуществляющим разложение H2O2, в первую очередь относят два семейства каталаз (гемовые и марганец-содержащие) и НАДН-пероксидазы. Гемовые каталазы присутствуют у некоторых видов молочнокислых бактерий при условии наличия гема или гематина в питательной среде (поскольку МКБ не способны к синтезу гема), причем в клетках были обнаружены как монофункциональные, так и бифункциональные каталазы-пероксидазы. Каталазы второго семейства (Mn-содержащие) не требуют наличия гема, но являются гораздо более редкими в мире микроорганизмов, хотя тоже были обнаружены в клетках некоторых Lactobacillus spp. [Rochat et al., 2006]. Проведенные нами биохимические эксперименты показали наличие в клетках быстрорастущего штамма L. rhamnosus КМ МГУ 528 только супероксиддисмутазной активности, тогда как активности каталаз и пероксидаз обнаружены не были вне зависимости от условий культивирования по отношению к кислороду. Известно, что НАДН-пероксидазная и каталазная активности в клетках многих штаммов МКБ действительно довольно низки либо отсутствуют вовсе [van Niel et al., 2002], но для некоторых представителей лактобацилл показана СОД активность в диапазоне от 1 до 61 ед./мг белка в зависимости от штамма [Bruno-Barcena et al., 2004]. 85 Исходя из полученных данных, можно предположить, что СОД L. rhamnosus КМ МГУ 528 является конститутивным ферментом, играющим главную роль в защите клеток данного штамма от окислительных повреждений, вызываемых кислородом и продуктами его неполного восстановления. Однако для более детального исследования этого вопроса необходимо в дальнейшем провести анализ экспрессии соответствующего гена в условиях различных окислительных стрессов. 1. Bruno-Bárcena J.M., Andrus J.M., Libby S.L., Klaenhammer T.R., Hassan H.M. Expression of a heterologous manganese superoxide dismutase gene in intestinal lactobacilli provides protection against hydrogen peroxide toxicity. AppL. Environ. Microbiol., 2004, v. 70, pp. 4702-4710. 2. De Angelis M., Gobbetti M. Environmental stress responses in Lactobacillus: a review. Proteomics, 2004, v. 4, pp. 106-122. 3. Rochat T., Gratadoux J.-J., Gruss A., Corthier G., Maguin E., Langella P., van de Guchte M. Production of a heterologous nonheme catalase by Lactobacillus casei: an efficient tool for removal of H2O2 and protection of Lactobacillus bulgaricus from oxidative stress in milk. AppL. Environ. Microbiol., 2006, v. 72, pp. 5143-5149. 4. Sanders M. E. Summary of conclusions from a consensus panel of experts on health attributes of lactic cultures: significance of fluid milk products containing cultures. J. Dairy Sci., 1993, v. 76, pp. 1819-1828. 5. van Niel E.W., Hofvendahl K., Hahn-Hagerdal B. Formation and conversion of oxygen metabolites by Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 under different growth conditions. AppL. Environ. Microbiol., 2002, v. 68, pp. 4350-4356. 86 KLEBSIELLA PNEUMONIAE: ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУЛЕНТНОСТИ И АНТИБИТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ В МОСКВЕ В 2013-2014 ГОДАХ А. И. Князева, Е. И. Асташкин, Н. Н. Карцев, Е. В. Комисарова, В. П. Мякинина, Т. И. Комбарова, Н. В. Воложанцев, Э. А. Светоч, Н. К. Фурсова Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ), Оболенск, Россия Введение. Klebsiella pneumoniae является одним из основных возбудителей нозокомиальных инфекций. Данный патоген широко распространен в природе, у здорового человека может бессимптомно обнаруживаться в кишечнике, на коже, на слизистых горла и носа, в то же время для людей с ослабленным иммунитетом может являться причиной различных заболеваний: бактериемий, поражений респираторного тракта, инфекций мочевыводящих путей, инфекций центральной нервной системы, поражений кожи, эндогенных эндофтальмитов, абсцессов печени и др. В настоящее время известны две эволюционные ветви клебсиелл: классические K. pneumoniae (cKP) и гипервирулентные K. pneumoniae (hvKP). Первая группа характеризуется активным накоплением различных детерминант устойчивости к антибактериальным препаратам, а вторая – обладает широким набором вирулентных свойств по сравнению с cKP. Характерным признаком большинства штаммов hvKP является гипермукоидность, выявляемая с помощью string-теста. Чаще всего это свойство проявляется у штаммов, относящихся к капсульным серотипам К-1, К-2, К-5, К-20, K-54, K-57 (Chen et al, 2014). Целью данного исследования является фенотипическая и генотипическая характеристика изолятов K. pneumoniae, выделенных от пациентов клиник города Москвы в 2013-2014 гг. Материалы и методы. В работе использовали 17 штаммов K. pneumoniae, выделенных из мочи (n = 8), органов дыхания (n = 7) и хирургических ран (n = 2) больных людей. Видовую идентификацию проводили на бактериологическом анализаторе Vitek-2 (Biomireux, France) и масс-спектрометре Microflex MALDI-TOF Biotyper (Bruker, Germany). Чувствительность к антимикробным препаратам (АП) восьми функциональных классов (пенициллинам, PEN; цефалоспоринам, CEF; карбапенемам, CAR; тетрациклинам, TET; фторхинолонам, QNL; хлорамфениколу, CML; аминогликозидам, AMI и сульфаниламидам, SUL) определяли на приборе Vitek-2 (Biomireux, France). Гипермукоидный фенотип штаммов выявляли 87 при постановке string-теста с использованием ночной культуры, выращенной на агаре ГРМ-1 (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) с 5% бараньих эритроцитов, как описано у Shon et al. (2013). Тест считали положительным, если за бактериологической петлей колония «тянулась» более 5 мм от поверхности агара. Гены, ассоциированные с вирулентностью (rmpA, регулятор гипермукоидного фенотипа; aer, ген аэробактина, участвующего в поглощении железа; uge2, ген уридин-дифосфат-галактиронат-4-эпимеразы, участвующей в биосинтезе капсулы и гладкого липополисахарида (ЛПС); wabG, ген глюкозилтрансферазы, вовлеченный в биосинтез внешнего кора ЛПС; kfu, ген, контролирующий поглощение трехвалентного железа; fimH, ген фимбрий I типа; allS, ген активатора аллантоинового регулона) и антибиотикорезистентностью (гены бета-лактамаз blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-48, blaVIM, blaNDM и интегроны 1 и 2 классов) детектировали с помощью ПЦР при использовании ранее описанных олигонуклеотидных праймеров (Ma et al., 2005; Vila et al., 2011; Yu et al., 2006; Pomakova et al., 2012; Paterson et al., 2003; Su et al., 2008; Shon et al., 2012; Poirel et al., 2012). Капсульные типы K. pneumoniae определяли при помощи ПЦР с праймерами, специфичными к генам, определяющим К-1, К-2, К-20, К-54 и К-57 серотипы (Fang et al., 2007). Секвенирование ДНК проводили в OOO SYNTOL (Москва). Мультилокусное сиквенс-типирование (MLST) проводили по схеме базы данных института Пастера, Париж (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/). Анализ последовательностей ДНК осуществляли с помощью программ Vector NTI9 (Invitrogen, USA), Chromas и веб-ресурса BLAST. Вирулентность штаммов (LD50) оценивали на мышах линии Balb/c. Результаты. Все исследованные штаммы K. pneumoniae характеризовались высоким уровнем и спектром устойчивости к АП разных функциональных классов. Шесть штаммов проявляли устойчивость к восьми классам АП, по два штамма — к шести и семи классам, один штамм — к пяти классам, три — к четырем классам, по одному штамму — к трем, двум и одному классу АП. Высокая устойчивость к бета-лактамам коррелировала с наличием генов бета-лактамаз blaTEM, blaSHV, blaCTX-M и blaOXA-48. Секвенирование последовательностей ДНК позволило идентифицировать и депонировать в GenBank гены эпидемически значимых ферментов: цефалоспориназы CTX-M-15 (KJ187476; KM058748; KM058752), карбапенемазы OXA-48 (KJ481798; KM085437; KP100449; KP198290; KP198291; KP198292; KP198293; KP198294) и карбапенемазы OXA-244 (KJ187475; KJ481795; KM058746). Устойчивость к АП других функциональных классов (AMI, QNL, SUL и др.) коррелировала с наличием интегронов класса 1, несущих генные кассеты dfrA12-orfF-aadA2 (GenBank: KJ187477) и dfrA17-aadA5 (GenBank: KM009102). Большая часть идентифицированных интегронов не содержала кассет резистентности в своих 88 вариабельных регионах, что позволяет рассматривать эти структуры в качестве резервуара для будущего накопления детерминант устойчивости. В ходе исследования штаммы были дифференцированы по уровню вирулентности для мышей на три группы: высоко-вирулентные с LD50 не более 50 КОЕ (n=5); умеренновирулентные с LD50 = 103-104 КОЕ (n = 2) и слабо-вирулентные с LD50 более 107 КОЕ (n = 10). При определении генов вирулентности в геномах штаммов с разной выраженностью вирулентных свойств было показано, что все высоко-вирулентные и умеренно-вирулентные штаммы содержали по 6 генов вирулентости из семи тестируемых, в то время как слабо-вирулентные штаммы содержали не более 5 генов. Анализ наборов генов вирулентности показал, что отсутствие в геноме штамма генов kfu или allS не приводило к значительному снижению уровня вирулентности, а отсутствие генов rmpA, aer и uge резко снижало данный показатель. Как правило, высокая степень вирулентности коррелировала с низким уровнем антибиотикорезистентности.. Исключение составили три штамма, два из которых умеренно-вирулентные и один высоко-вирулентный, несущие одновременно шесть генов вирулентности и обладающие устойчивостью к восьми классам АП. При определении капсульного типа исследуемых штаммов показано, что четыре штамма принадлежали к капсульному типу К-1, четыре штамма — К-2 и три штамма — К-57, Остальные штаммы с помощью использованного в работе набора праймеров типировать не удалось. Из 11 штаммов с определенными К-типами 10 являлись гипермукоидными. Установлена принадлежность изучаемых штаммов к шести сиквенстипам: ST23, ST86, ST147, ST218, ST395 и ST833. Примечательно, что 3 штамма сиквенстипа ST218 принадлежали к капсульному типу К-57. Ранее было показано (Liao et al., 2014), что выделение hvKP-штаммов с таким генотипом часто ассоциируется с развитием первичного абсцесса печени у человека. Заключение. В работе описаны три группы госпитальных штаммов K. pneumoniae, отличающихся по степени вирулентности для мышей: высоко-вирулентные, умеренновирулентные и слабо-вирулентные. Показано, что высокая степень вирулентности коррелирует с наличием, по меньшей мере, 6 генов вирулентности и, преимущественно, с малым количеством генов антибиотикорезистентности. Подавляющая часть высоковирулентных штаммов обладает гипермукоидным фенотипом. Умеренно-вирулентные штаммы находятся буквально на «стыке» cKP и hvKP групп клебсиелл, обладая большим набором факторов вирулентности и детерминант антибиотикорезистентности. Это указывает на возможность возникновения нового суперпатогена в будущем. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (Соглашение № 15-15-00058). 89 АНАЛИЗ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА СЕРЫ МАГНИТОТАКТИЧЕСКОЙ СПИРИЛЛЫ MAGNETOSPIRILLUM MOSCOVIENSE BB-1 В. В. Козяева, Д. С. Груздев, М. В. Дзюба Институт биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва Литотрофное окисление серы — один из древних метаболических процессов. Разнообразные по экологии и таксономии прокариоты способны использовать различные восстановленные соединения серы в качестве субстрата для литотрофного роста. Фототрофные и хемотрофные бактерии используют различные ферменты, метаболические пути, механизмы транспорта электронов и запасания энергии для окисления субстрата. Тиосульфат — одно из наиболее распространенных восстановленных соединений серы; является важным компонентом биогеохимического цикла серы; служит донором электронов для большинства сероокисляющих литотрофов, в том числе хемолитоавтотрофов. На данный момент известно о существовании нескольких метаболических путей окисления тиосульфата. Для многих бактерий класса Alphaproteobacteria основным путем метаболизма серы является система ферментов Sox, впервые открытая у Paracoccus pantotrophus. Известно, что 7 из 15 генов, soxX/Y/Z/A/B/C/D, являются ключевыми для полного окисления тиосульфата до сульфата. Другой механизм, так называемый разветвленный путь, осуществляется у бактерий с «усеченным» комплексом генов sox. При этом Sox система действует совместно с реверсной системой восстановления сульфата. Такой разветвленный путь был обнаружен и экспериментально доказан ранее у Allochromatium vinosum. Магнитотактические бактерии (МТБ) — микроорганизмы, синтезирующие внутриклеточный магнетит. Оптимальной зоной обитания МТБ являются придонные осадки с наличием противоположно направленных градиентов кислорода и восстановленных соединений серы, которые могут служить источником энергии для этих микроорганизмов. В результате анализа секвенированных геномов представителей МТБ рода Magnetospirillum восстановленных для соединений энергетического были выявлены серы. метаболизма ключевые Использование показано Magnetospirillum J10 и M. gryhiswaldense MSR-1. 90 для ферменты окисления восстановленной магнитотактических серы спирилл: Целью данной работы является анализ генов метаболизма тиосульфата магнитотактической спириллы M. moscoviense BB-1 на основании секвенированного генома. Новый вид M. moscoviense BB-1, принадлежащий классу Alphaproteobacteria, был выделен в чистую культуру из донных осадков реки Москва на хемоорганогетеротрофной среде в микроаэрофильных условиях. Геном данной бактерии был секвенирован, и в результате его анализа был выявлен кластер генов soxXYZABV, а также отдельные копии soxXY и soxW. Гены soxCD, являющиеся ключевыми для полного окисления тиосульфата, при анализе не обнаружены. Схожее строение кластера генов sox обнаружено ранее в геноме M. gryhiswaldense. В геноме M. magnetotacticum присутствуют гены soxYZ и несколько копий soxAB, в то время как у M. magneticum — только soxYZ. По литературным данным, бактерии, у которых отсутствуют гены soxCD, осуществляют разветвленный путь окисления тиосульфата. В частности, дальнейшее окисление серы, полученной в результате работы Sox системы, до сульфита может идти при участии дисульфидредуктаз, кодируемыми генами dsr. Так, у штамма ВВ-1 обнаружен кластер генов дисульфидредуктаз dsrABEFHCMKLJOP. У известных представителей рода Magnetospirillum также присутствуют аналогичные кластеры генов. Выявленная комбинация ферментных систем Sox-Dsr у M. gryhiswaldense и M. moscoviense имеет сходное строение со многими представителями Beta-, Gammaproteobacteria и Chlorobi. Одним из основных отличий генома штамма ВВ-1 от геномов других магнетоспирилл является наличие организованных в кластеры генов sat, aprAB, hdrABC. С помощью этой системы ферментов сульфат-восстанавливающие бактерии осуществляют диссимиляторное восстановление сульфата до сульфита. Однако было показано, что данная система может использоваться по реверсному пути сероокисляющими бактериями. Одним из представителей сероокисляющих бактерий, имеющих в геноме кластеры генов sat-aprAB и hdrABC, является Thiobacillus denitrificans, представитель класса Betaproteobacteria. Внутри класса Alphaproteobacteria данный кластер ранее был обнаружен только у некультивируемой бактерии Thermopetrobacter sp. TC1. У других представителей рода Magnetospirillum, в частности, M. magnetotacticum обнаружены гены sorAB, предположительно кодирующие сульфит:цитохром с оксидоредуктазу для окисления сульфита до сульфата. В геномах M. Gryhiswaldense и M. magneticum ферментных систем окисления сульфита обнаружено не было. В дальнейшем планируется провести экспериментальное подтверждение функционирования выявленных путей метаболизма тиосульфата у M. moscoviense BB-1. 91 ВЛИЯНИЕ ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ PSEUDOMONAS И SERRATIA, НА РАСТЕНИЯ ARABIDOPSIS THALIANA А. С. Колегова 1,3, Е. В. Куприянова 2, И. А. Хмель 1 1 2 3 Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва, Россия Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева, Москва, Россия Ранее нами было показано, что почвенные и ассоциированные с растениями бактерии родов Pseudomonas и Serratia синтезируют летучие органические соединения (ЛОС), подавляющие рост фитопатогенных бактерий и грибов, цианобактерий, нематод и дрозофил. В совместной работе с сотрудниками Иерусалимского Университета (Израиль) проведен анализ летучих веществ у исследуемых штаммов бактерий с помощью методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Изучено действие на указанные биологические объекты ЛОС, продуцируемых бактериями в наибольшем количестве — диметилдисульфида (ДМДС) и нескольких кетонов. В настоящей работе было исследовано влияние ризосферных штаммов P. chlororaphis 449, P. fluorescens B-4117, S. plymuthica IC1270 и штамма S. proteamaculans 94, выделенного из испорченного мяса, на растения Arabidopsis thaliana. Показано, что общий пул ЛОС, синтезированных исследованными штаммами бактерий, подавляет рост растений и вызывает их гибель. Наибольшее ингибирующее действие оказывала суммарная газовая смесь, образуемая штаммом P. fluorescens B-4117. Добавление в чашки Петри активированного угля резко снижало эффект ЛОС. Уменьшение эффекта ЛОС наблюдалось у штамма P. chlororaphis 449 с мутацией в гене сенсорной киназы gacA глобальной системы регуляции GacA/GacS, контролирующей синтез вторичных метаболитов у бактерий; по-видимому, эта система участвует в контроле синтеза ЛОС. Мутации в гене rpoS (кодирует σ-субьединицу РНК-полимеразы) не уменьшали эффекта ЛОС штаммов P. chlororaphis 449 и S. plymuthica IC1270. Не наблюдалось также влияния введения в P. chlororaphis 449 гетерологичного гена aiiA (кодирует гомосеринлактоназу, деградирующую N-ацил-гомосеринлактоны, сигнальные молекулы Quorum Sensing регуляции). Определено количество цианида, синтезируемого изученными бактериями. Показано, что синтез цианида не является необходимым условием ингибиторного действия на растения общего пула газообразных соединений, продуцируемых бактериями. 92 Изучено действие индивидуальных ЛОС, продуцируемых бактериями — диметилдисульфида, кетонов 2-нонанона, 2-ундеканона, 2-гептанона и алкена 1-ундецена – на растения Arabidopsis thaliana. Наиболее сильное подавляющее действие на растения оказывали 2-нонанон и 2-ундеканон. 1-ундецен слабо ингибировал рост Arabidopsis thaliana. Увеличение концентрации индивидуальных ЛОС или увеличение времени воздействия приводило к более выраженному подавлению роста растений или к их гибели. Подавление роста растений сопровождалось снижением интенсивности их зеленой окраски, по-видимому, в результате действия ЛОС на синтез хлорофилла или его разрушения. Кетоны и ДМДС оказывали необратимое воздействие на растения. Взрослые растения A. thaliana были менее чувствительны к действию ЛОС, чем молодые растения. Работы по изучению синтеза ЛОС бактериями и их действия на растения открывают новые аспекты взаимодействия микроорганизмов и растений. 93 ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ, АКТИВНЫХ ПРОТИВ ГИПЕРМУКОИДНЫХ ШТАММОВ K. PNEUMONIAE Е. В. Комисарова, В. П. Мякинина, В. М. Красильникова, А. И. Князева, Е. А. Денисенко, Н. В. Воложанцев ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, Россия Klebsiella По данным является pneumoniae многоцентрового классическим исследования нозокомиальным грамотрицательных патогеном. возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ в России среди представителей семейства Enterobacteriaceae на её долю приходится 34 % всех выделенных штаммов. Чаще всего K. pneumoniae является причиной внутрибольничных инфекций мочевыводящих путей и респираторного тракта. С середины 1980 г. в странах Азиатско-Тихоокеанского региона начали появляться новые гипервирулентные вырианты K. pneumoniae (hvKp), вызывающие у людей первичный абсцесс печени с метастазированием и развитием гнойных менингитов, абсцессов мозга, легких, простаты, мягких тканей, некротического фасциита, остеомиелита. Причем, заболевания чаще всего носили внебольничный характер, а пациенты, как правило, не имели каких-либо проблем с иммунитетом. В настоящее время отдельные случаи выделения hvKp-штаммов от больных людей зарегистрированы в Соединенных Штатах, Японии, Канаде, Таиланде и некоторых других странах. Характерным признаком большинства штаммов hvKp является гипермукоидность, связанная, как полагают, с повышенным количеством капсульного материала, не отличающегося по составу от поверхностных полисахаридов (КПС) обычных штаммов K. pneumoniae. Избыточная продукция КПС обеспечивает защиту бактерий hvKp от фагоцитоза и антимикробных пептидов. Сдерживающим бактериофаги, фактором распространения продуцирующие специфические hvKp-бактерий ферменты — могут являться деполимеразы. Эти ферменты способны разрушить капсульные полисахариды, обеспечивая тем самым последующую адсорбцию фага на рецепторах наружной мембраны и проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку. Целью данного исследования является выделение и характеристика бактериофагов, активных в отношении гипермукоидных штаммов K. pneumoniae. 94 В экспериментах использовали 160 штаммов K. pneumoniae, выделенных из клинического материала и источников окружающей среды. Бактерии 22 штаммов имели гипермукоидный (ГМ) фенотип (подтверждено положительным стринг-тестом). Бактерии девяти ГМ-штаммов обладали высокой вирулентностью для белых аутбредных мышей (LD50 менее 100 КОЕ); четыре из них по результатам ПЦР-анализа отнесены к капсульному типу K-1, четыре — К-2, бактерии одного штамма типировать не удалось. Для выделения бактериофагов использовали пробы сточных вод, стоков птичников и животноводческих комплексов и клинического материала. Выделено шесть фагов, лизирующих наряду с обычными штаммами штаммы hvKp (Табл. 1). При изучении литической активности фагов и характера лизиса показано, что все они обладают узким спектром литического действия, лизируют от 1,9 до 7,5 % штаммов с различной эффективностью бляшкообразования (Табл. 1). В то же время, все гипермукоидные штаммы, вирулентные для мышей, лизируются комбинацией из двух-трех бактериофагов. Выделенные фаги обладают разной специфичностью по отношению к бактериям K. pneumoniae разных капсульных серотипов. Например, бактериофаг KpV41 лизирует только бактерии капсульного типа K-1, в то же время, фаг KpV289 активен по отношению к бактериям серотипов K-1, K-2, K-57 и некоторых штаммов неустановленного серотипа. Таблица 1. Характеристика бактериофагов, лизирующих гипермукоидные штаммы K. pneumoniae Бактерио фаг Источник выделения Характер негативных колоний прозрачные (диаметр 2-3 мм), ореол 5-10 мм KpV71 очистные прозрачные (1 мм), ореол сооружения 10 мм. KpV93 стоки прозрачные (0,5 мм), животноводческ ореол 6 мм ого комплекса KpV135 сточные воды прозрачные (1-2 мм), ореол 5-10 мм KpV289 сточные воды прозрачные (3-4 мм), «двойной» ореол - 5-10 мм KpV524 очистные прозрачные (1-2 мм), сооружения ореол 5-10 мм KpV41 сточные воды % лизируемых Эффективност штаммов ь бляшкообразов N* ГМ** ания 7,5 36,4 10-6 – 1,0 6,2 36,4 10-4 – 1,0 1,9 4,5 0,1 -1,0 7,5 36,4 10-6 – 1,0 7,5 9,1 10-4 – 1,0 6,2 36,4 0,1 -1,0 * — % от общего числа штаммов K. pneumoniae, использовавшихся в экспериментах; ** — % от общего количества ГМ-штаммов. 95 На газоне бактериальной культуры на плотной питательной среде все KpV-фаги образуют прозрачные негативные колонии с ореолом. Наличие ореолов свидетельствует о продукции фагами растворимого фермента, подобного экзополисахарид деполимеразам. По данным рестрикционного анализа, проведенного с использованием эндонуклеаз рестрикции HindIII и EcoRV, геномы бактериофагов содержат двух-цепочечную ДНК размером не более 50 kb, что характерно для фагов семейства Podoviridae (принадлежность двух фагов, KpV289 и KpV41, к данному семейству подтверждена данными электронной микроскопии). По характеру распределения фрагментов рестрикции ДНК в геле 1 % агарозы бактериофаги отличаются друг от друга (Рис. 1A). Различие бактериофагов также подтверждается данными белкового SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (Рис. 1B). Рисунок 1. Сравнительный анализ бактериофагов K. pneumoniae. А— Электрофорез в геле 1 % агарозы ДНК бактериофагов KpV41, KpV135, KpV289, KpV93, KpV524 и KpV71, обработанных рестрикционными эндонуклеазами EcoRV и HinIII (на электрофореграмме фаги обозначены соответствующими номерами; М — ДНК-маркер GeneRuler™ 1 kb, Thermo Fisher Scientific); B — SDSэлектрофорез в 12 % полиакриламидном геле бактериофагов очищенных в градиенте хлористого цезия; окраска серебром. M1 и M2 — маркеры молекулярных масс. Таким образом, в результате проведенных исследований выделены и охарактеризованы шесть бактериофагов, лизирующих гипермукоидные штаммы K. pneumoniae. и Бактериофаги отличаются специфичности по отношению к по спектру литической активности разным капсульным типам K. pneumoniae. Характерным признаком всех фагов является формирование ореолов вокруг негативных колоний, образуемых на газоне бактериальных культур, что свидетельствует о наличии 96 экзополисахарид-деполимеразной активности. Полученные результаты являются хорошей предпосылкой для проведения исследований по использованию бактериофагов и фаговых деполимераз для разработки лечебно-профилактических препаратов против инфекций, вызванных гипермукоидными штаммами K. pneumoniae. Наличие специфичности фагов по отношению к бактериям различных капсульных типов позволяет рассматривать возможность разработки системы фаготипирования гипермукоидных штаммов K. pneumoniae. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (Соглашение № 15-15-00058). ВНЕКЛЕТОЧНАЯ Β-ГАЛАКТОЗИДАЗА ARTHROBACTER SULFONIVORANS — НОВАЯ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗА СЕМЕЙСТВА 2 А. А. Костеневич Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь Согласно общепризнанной Международной классификации и номенклатуре ферментов, принимающей во внимание их субстратную специфичность и, в отдельных случаях, молекулярный механизм действия, β-галактозидазы относят к классу гидролаз (3), подклассу гликозил-гидролаз (3.2), подподклассу гликозидаз (3.2.1) без учета структурных особенностей ферментных белков [1]. Тем не менее, классификация β-галактозидаз требует совершенствования вследствие накопления новых данных, полученных с использованием современных молекулярногенетических методов. На информации об аминокислотной последовательности молекулы фермента базируется классификация (CAZy database), объединяющая гликозил-гидролазы в семейства [2, 3]. Согласно предлагаемой системе, в семейство объединяют гомологичные белки со степенью идентичности более 30 %. С увеличением числа идентифицированных аминокислотных последовательностей гликозил-гидролаз их классификация постоянно обновляется. В настоящее время эта группа ферментов включает в себя 14 кланов, разделенных на 120 семейств [2, 4]. β-Галактозидазы различного происхождения относят к семействам 1, 2, 35 и 42 гликозил-гидролаз (GH). Они, в свою очередь, принадлежат клану GH-A, объединяющему β/α-белки с каталитически активными остатками глутаминовой кислоты. Принимая во внимание данные об аминокислотных последовательностях и результаты филогенетического анализа предполагается, что все 4 семейства гликозил-гидролаз, 97 к которым относятся β-галактозидазы, имеют различное происхождение и эволюционно удалены друг от друга. Среди 5020 представителей, в настоящее время включенных в семейство 1 гликозилгидролаз, только 4 являются детально охарактеризованными β-галактозидазами. Эти ферменты обладают широкой субстратной специфичностью и не активируются ионами металлов. β-Галактозидазы 3635 представителей, (111 охарактеризовано) проявляют высокую семейства 2, специфичность насчитывающего к β-D-галактозидам и в каталитическом центре содержат ионы двухвалентных металлов — магния, кальция или марганца. Семейство 35 β-галактозидазы объединяет бактериального 789 представителей, происхождения. гликозидазами, которые гидролизуют из Последние которых являются 432 — кислыми α-L-арабинозиды и содержащие галактозу полисахариды, например, арабиногалактан. В семейство 42 общей численностью 651 включены β-галактозидазы различного (640 — бактериального) происхождения, которые отличаются от ферментов других семейств физико-химическими свойствами, структурой, составом аминокислотных последовательностей [2]. Ранее нами было проведено секвенирование гена, кодирующего внеклеточную β-галактозидазу A. sulfonivorans, что позволило узнать первичную аминокислотную полседовательность ферментного белка. При анализе структуры гена β-gal было установлено, что он содержит 3 132 п.о., которые кодируют 1 043 аминокислоты [5]. Проведено сравнение нуклеотидных последовательностей генов β-галактозидаз A. sulfonivorans и микроорганизмов других таксономических групп. Показано, что β-gal исследуемого штамма в наибольшей степени сходен с генами β-галактозидаз бактерий рода Arthrobacter (до 69 %). Соответствие аминокислотного состава β-галактозидаз A. sulfonivorans и других видов этого рода, установленное с помощью Reference Proteins Database, составило 59–95 % [6]. Анализ аминокислотной последовательности β-галактозидазы в пакете программ BLAST показал, что она содержит сахар-связывающий домен Glyco_hydro_2_N (pfam02837, 39–227 а.к. остатки), TIM barrel domain (pfam02836, 318–616 а.к. остатки) и small_chain_domain (smart01038, 754–1039 а.к. остатки) [6]. Это позволило отнести β-галактозидазу A. sulfonivorans к семейству 2 гликозил-гидролаз [2–4]. Стоит отметить, что аминокислотные последовательности β-галактозидаз, принадлежащих 2 семейству гликозил-гидролаз (GH2), идентичны на 44–66 % (таблица). 98 только Таблица. Сравнение* аминокислотных последовательностей β-галактозидаз A. sulfonivorans, бактерий рода Arhtrobacter и E. coli из семейства 2 гликозил-гидролаз (GH2) Бактерии Код доступа GenBank Идентичность, % Последовательность, а.о. A. sulfonivorans Arthrobacter sp. 20B Arthrobacter sp. C2-2 Arthrobacter sp. ON14 Arthrobacter sp. SB Arthrobacter sp. B7 A. psychrolactophilus F2 A. chlorophenolicus A6 Arthrobacter sp. 32cB Escherichia coli K-12 AIX96881.1 ACI41243.1 CAD29775.1 ADJ18283.1 AAQ19029.1 AAA69907.1 BAF33372.1 ACL41674.1 AHY00656.1 ABN72582.1 100 66 65 65 65 64 64 45 44 33 1043 1053 1023 1029 1053 1015 1028 1004 1010 1024 Примечание: *Сравнение аминокислотных последовательностей выполнено с использованием программы BLASTP [6] 1. Enzyme nomenclature. Recommendations of the nomenclature committee of the International union of biochemistry and molecular biology on the nomenclature and classification of enzymes by the reactions they catalyse [Electronic resource] / Nomenclature committee of the International union of biochemistry and molecular biology (NC-IUBMB) in consultation with the IUPAC-IUBMB joint commission on biochemical nomenclature (JCBN). – Mode of access: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/. – Date of access: 10.09.2014. 2. Carbohydrate-Active enZYmes Database (Cazy) [Electronic resource] – Mode of access: http://www.cazy.org/. – Date of access: 11.04.2015. 3. Henrissat, B. A. Classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat // Biochem. J. – 1991. – Vol. 280. – P. 309–316. 4. Наумов, Д. Г. Иерархическая классификация гликозил-гидролаз / Д. Г. Наумов // Биохимия. – 2011. – Т. 76, № 6. – С. 764–780. 5. Костеневич, А. А. β-галактозидазу Клонирование бактерий и Arthrobacter секвенирование sulfonivorans гена, / кодирующего А. А. Костеневич, Л. И. Сапунова, А. Г. Лобанок // Доклады НАН Беларуси. – 2015. – Т. 59, № 1. – С. 70–74. 6. Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs / S. F. Altschul [et al.] // Nucleic Acids Res. – 1997. – Vol. 25, № 17. – P. 3389–3402. 99 ОПИСАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПОЧВ ПРИЭЛЬТОНЬЯ А. И. Кузнецова 1, Е. А. Иванова 2, М. С. Дуброва 3 1 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва, Россия 2 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно- исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, Санкт-Петербург, г. Пушкин, Россия 3 Московский государственный университет, Москва, Россия Озеро Эльтон (Россия) — самое большое по площади минеральное озеро Европы (152 м2) и одно из самых минерализованных в мире. Почвенный покров Приэльтонья представлен типичными солончаками, солянкокупольными структурами и светло-каштановой солонцеватой почвой. Исследование микробных сообществ почв данного региона до настоящего времени не проводилось. В данной работе мы впервые рассматриваем микробные (в том числе актиномицетные) комплексы засоленных почв Приэльтонья на примере почвенной катены, расположенной вдоль реки Хары, впадающей в озеро Эльтон. Для анализа было отобрано 5 образцов. Здесь происходит смена почв от гидроморфных солончаков с хлоридным и сульфатно-хлоридным засолением в дельте реки через солонцы на склонах к светло-каштановым почвам на водоразделе. Образец 1–2 — солончак типичный сульфатно-хлоридный, образцы 3-5 — светло-каштановая слаборазвитая солонцеватая почва. Способ изучения в виде отбора проб по катене выбран не случайно, т.к. ранее на примере Приэльтонья был продемонстрирован тот факт, что от уреза воды озера к водораздельным участкам происходит последовательное рассоление, рассолонцевание и остепнение почв, т. е. на данном участке идут процессы постгидроморфной эволюции почв. Показано, что численность актиномицетов в солончаках, расположенных по внешнему периметру озера Эльтон невелика (Рис. 1) и не превышает первых тысяч в 1 г почвы (трех и двух тысяч КОЕ в 1 и 2 образце почвы соответственно). В этих образцах солончака с содержанием растворимых солей 0,9 и 1 % соответственно, отобранных в нескольких десятках метров от уреза воды, количество выделенных актиномицетов определяется тысячами КОЕ/г почвы, что составляет 100 и 7 % 100 соответственно от всего бактериального комплекса прокариотного микробного сообщества исследуемых образцов. По мере удаления от озера по катене почвы от типичных солончаков (образцы 1-2) сменяются на светло-каштановые с небольшим засолением (образцы 3-5, процент растворимых солей 0,4; 0,3; 0,2 соответственно). Количество выделенных актиномицетов увеличивается на порядок, составляя десятки тысяч КОЕ/г почвы (Рис. 1). Доля актиномицетов от всего бактериального комплекса прокариотного сообщества светло-каштановой почвы составляет от 3 до 35 % в разных образцах. Рисунок 1. Численность (lg N, N-КОЕ/г почвы) немицелиальных бактерий (белые столбики) и мицелиальных актинобактерий (актиномицетов, черные столбики)) в почвах Приэльтонья. Условные обозначения для рис. 1и 2: 1, 2 — типичный солончак; 3, 4, 5 — светло-каштановая засоленная почва. Актиномицетный комплекс, выделенный из обследованных образцов типичных солончаков на среде Гаузе 1, представлен родом Streptomyces. Наиболее распространены в солончаке стрептомицеты с белым или серым воздушным мицелием, виды которых относятся, согласно Определителю актиномицетов (Гаузе и др., 1983) к секциям и сериям Albus Albocoloratus, Albus Albus, Cinereus Сhromogenes. Доминируют виды секции и серии Albus Albocoloratus (образцы 1, 2). Показано, что в светло-каштановых почвах (образцы 3-5) по сравнению с типичным солончаком не только увеличивается на порядок численность стрептомицетов, но и расширяется родовой и видовой спектры выделенных культур. В актиномицетном комплексе светло-каштановой почвы, выявленном на среде Гаузе 1, обнаружены представители рода Streptomyces и Micromonospora примерно в равных долях. Среди представителей рода Streptomyces в луговом солончаке и светло-каштановых почвах 101 определены виды секций и серий Albus Albus, Cinereus Chromogenes, Roseus Lavendulaeroseus (образцы 3-5). Из светло-каштановой почвы (образец 4) выделены виды стрептомицетов Streptomyces luridis штамм 4Э5 и S.lavendulae штамм 4Э9, доминирующие в этом образце светло-каштановой почвы Приэльтонья. Виды секции Albus серии Albus обнаружены и во всех других исследуемых образцах почв Приэльтонья. Доминирующими являются представители Streptomyces albolongus штамм Э6. Методом FISH показано, что биомасса метаболически активных одноклеточных представителей филума Actinobacteria составляет значительную долю от биомассы метаболически активных эубактерий прокариотного микробного сообщества типичных солончаков Приэльтонья — 68-88 % в образце № 1 и № 2 соответственно. Доля метаболически активных одноклеточных представителей филума Actinobacteria в биомассе метаболически активных эубактерий прокариотного микробного сообщества луговом солончаке и светло-каштановых почвах уменьшается до 20, 29, 17 % в исследованных образцах (№№ 3,4,5) светло-каштановой почвы. Изучение разнообразия микробного сообщества почв методом анализа нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, полученных с использованием универсальных бактериальных праймеров, показало, что представители филы Actinobacteria являются минорными компонентами в образцах 1-3 и их численность возрастает в 4 и 5 образцах. Согласно таксономической структуре исследуемых микробных сообществ, представители класса Actinobacteria обнаружены в образцах 1 и 4. В образце 4, отобранный на склоне в дернине выявлено наибольшее разнообразие актиномицетов, которые представлены семействами Micromonosporaceae, Streptosporangiaceae, Streptomycetaceae, Frankiaceae и Promicromonosporaceae. Таксономическая структура исследуемых микробных сообществ на уровне родов позволила выявить представителей рода Streptomyces, Streptosporangium, Actinoplanes и Dactylosporangium. Таким образом, в работе показано видовое разнообразие актиномицетных комлексов почв Приэльтонья. Исследованные образцы можно считать перспективными с точки зрения выявления «редких» родов актиномицетов, что может быть использовано в биотехнологии. Работа поддержана грантами РФФИ № 14-04-31546 мол_а и № 13-04-00740 А. 102 ОЦЕНКА ПОТЕНЦИАЛА АДАПТАЦИИ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ШТАММА ACHROMOBACTER RULANDII ST36 К АНТИМИКРОБНЫМ АГЕНТАМ НА ОСНОВЕ ДАННЫХ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ М. С. Кунда, О. Л. Воронина, А. Н. Семенов, Е. И. Аксенова, Н. Н. Рыжова ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ Актуальность. Achromobacter ruhlandii — представитель условно-патогенных микроорганизмов рода Acromobacter, особенно агрессивно угнетающий дыхательную функцию больных муковисцидозом (МВ). Ранее нами показано, что A. ruhlandii генотипа (sequence type, ST) 36, является эпидемически значимым для российских больных МВ, отличаясь высокой трансмиссивностью. Широкая природная антибиотикоустойчивость и высокая адаптивность к новым антибактериальным препаратам A. ruhlandii, в естественных условиях обитающего в почве, препятствуют эрадикации этого микроорганизма. Поиск новых лекарственных препаратов направленного действия в отношении A. ruhlandii возможен только на основе подробного изучения метаболизма бактерии, которое может быть основано на анализе полногеномного сиквенса. Целью нашей работы было выполнение полногеномного секвенирование штамма A. ruhlandii ST36 и оценка его адаптивного потенциала при инфицировании дыхательных путей больных МВ. Материалы и методы. Штамм A. ruhlandii SCCH3:Ach 33-1365, ST36, выделенный от больного МВ, получен из коллекции лаборатории микробиологии Научного Центра Здоровья Детей. Полногеномное секвенирование штамма A. ruhlandii ST36 выполняли по технологии 454 Roche на приборе GS Junior, используя как методику секвенирования фрагментов ДНК случайной длины (shotgun), так и технологию библиотек парных концов (pairend). Сборку генома de novo проводили с помощью пакета программ GS Junior Software версий V2.7 и V3.0. Первичную аннотацию собранных скаффолдов осуществляли с помощью сервера RAST ((Rapid Annotation using SubsystemTechnology); http://rast.nmpdr.org). Дополнительную аннотацию и поиск консервативных доменов проводили с помощью программной базы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Для предсказания локализации белков A. ruhlandii ST36 использовали следующие интернет-ресурсы: TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (http://www.psort.org/). 103 и программу PSORTb Определение класса бета-лактамаз осуществляли с помощью базы данных CBMAR: Comprehensive Beta-lactamase Molecular Annotation Resource. Результаты и обсуждение. В адаптация к антимикробным препаратам бактериальная клетка использует следующие механизмы:1) инактивацию антимикробного агента с помощью ферментов; 2) модификацию молекулы-мишени, на которую воздействует антимикробный агент; 3) активное выведение из микробной клетки (эффлюкс, efflux) и 4) изменение проницаемости внешней мембраны микробной клетки. В аннотированном протеоме A. ruhlandii ST36 был осуществлен направленный поиск белков, отвечающих за 1 и 3 механизмы. Обнаружены лактамазы 4-х классов: A (2), B (1), C (4), D (1). Лактамазу класса D кодирует ген bla-OXA-258. Этот аллель гена является отличительным признаком вида A. ruhlandii. Лактамазы классаD гидролизуют как бензилпенициллин, так и его производные: оксациллин, клоксациллин, амино- и карбопенициллины, не подвержены ингибированию клавулановой кислотой, тазобактамом и сульбактамом. Кроме того, следует отметить белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам нового поколения: альбицидину, ингибирующему ДНК-гиразу и сульфонамиду пирабактину. Почти четыре десятка генов A. ruhlandii ST36 отвечают за устойчивость бактерии к мышьяку и ионам тяжелых металлов: ртути, кобальту, цинку. При выявлении белков, участвующих в активном транспорте, у 1328 были обнаружены мембранные домены, для 1375 определена локализация на внутренней мембране клетки и только для 136 — на внешней. Эти данные хорошо согласуются с представлением о структуре помпы грамотрицательных бактерий, к которым относится A. ruhlandii ST36. Трехкомпонентные помпы состоят из транспортера; белка- каналообразователя, который пронизывает внешнюю мембрану и осуществляет выброс антимикробных веществ из бактериальной клетки; и линкерного белка, связывающего белок-транспортер с белком-каналообразователем. Линкерный белок располагается в периплазматическом пространстве и играет вспомогательную роль. Проведенная классификация обнаруженных транспортеров показала, что к семейству ABC транспортеров (ATP-binding Cassette) относится 311 белков, MFS (Major Facilitator Superfamily) - 47, RND (Resistance-Nodulation-Division) — 18, MATE (Multidrug And Toxic Compound Extrusion) — 2. Именно RND семейство вносит максимальный вклад в устойчивость A. ruhlandii ST36 к антимикробным препаратам. Выявлено 10 оперонов генов транспортеров: AxyXY-OprZ, отвечающий за формирование устойчивости к аминогликозидам, CmeABC — к ципрофлоксацину 104 и тетрациклину; три оперона транспортеров семейства RND и один семейства ABC, обеспечивающих устойчивости к тяжелым металлам; два оперона транспортеров семейства RND, вовлеченные в устойчивость к акридиновому красителю акрифлавину. В составе оперона arnBCADTEF обнаружены гены белков ArnT и ArnC, которые у родственных A. ruhlandii бактерий Burkholderia cepacia complex участвуют в модификации липолисахарида (ЛПС) и формировании устойчивости к полимиксину. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о значительном адаптивном потенциале A. ruhlandii ST36 к антимикробным препаратам разных классов. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ СЕРЕБРЯНЫХ НАНОЧАСТИЦ БАКТЕРИЯМИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE М. А. Купряшина, Е. П. Ветчинкина, В. Е. Никитина Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Многие микроорганизмы могут поддерживать жизнеспособность при высоких концентрациях ионов металлов в среде обитания (Beveridge et al., 1997). Способность бактерий выживать в подобных условиях связана с конкретными механизмами резистентности, такими как наличие эффлюксных системы, инактивации металлов через комплексообразование, непроницаемости клеточной стенки, а также изменением токсичности с помощью биоредукции. Известно, что почвенные бактерии Azospirillum brasilense, могут поддерживать жизнеспособность при высоких концентрациях ионов металлов (Камнев и др., 2007). Относительно недавно, была обнаружена способность азоспирилл к восстановлению золота из токсичной золотохлористоводородной кислоты до элементного состояния и формированию золотых наночастиц, а также впервые показано участие бактериальных внеклеточных Mn–пероксидаз в данном процессе и предложен гипотетический механизм протекания этой реакции (Купряшина и др., 2014). В научной литературе мы столкнулись с предположением, что подобное свойство к биоредукции токсичных соединений металлов может быть универсально, однако для разных соединений набор белков, участвующих в биовосстановлении может различаться (Duran et al., 2011). На сегодняшний день крайне актуальны исследования биологического, так называемому «зелёного» синтеза наночастиц. Наше внимание привлекли серебряные наночастицы, находящие свое применение в различных областях медицины, биохимии, иммунологии и технологии. Первые свидетельства о способности 105 бактерий к биосинезу серебряных наночастиц обнаружены у штамма Pseudomonas stutzeri AG259 , выделенного из серебряных рудников (Klaus et al., 1999). Большинство авторов полагают, что синтез серебряных наночастиц, связан с действием NADH–зависимых нитратредуктаз. Гипотетическая схема данного процесса была предложена Kalimuthu с соавторами (2008). Однако не было проведено экспериментов на гомогенных ферментативных препаратах. Большинство исследований имеют лишь описательный характер и не затрагивают изучение конкретных ферментных систем. Тем не менее, фактический механизм формирования серебряных наночастиц, до сих пор не известен. Таким образом, вышесказанное определило цель данного исследования: изучить способность бактерий A. brasilense к восстановлению серебра до элементного состояния с образованием наночастиц и определить способность Mn–пероксидазы участвовать в этом процессе. С применением просвечивающей электронной микроскопии было проведено исследование культуральной жидкости и клеток штамма A. brasilense Sp245 выращенных в течение 48 часов в присутствии 1 mM AgNO3. В культуральной жидкости и около бактериальных клеток, наблюдались электронно–плотные образования сферической формы, при этом размеры частиц варьировали. Для подтверждения нашей гипотезы об участии в биовосстановлении серебра бактериальных Mn–пероксидаз, из культуральной жидкости A. brasilense Sp245 был получен электрофоретически гомогенный препарат внеклеточной Mn–пероксидазы. Водный раствор очищенного фермента инкубировали с 1 mМ AgNO3 при 24 °С. Через 12 часов наблюдалось появление бурого окрашивания смеси, что является признаком синтеза и накопления наночастиц серебра. Стоит отметить, что внеклеточные белки азоспирилл, не обладающие фенолоксидазной активностью, например лектины, не восстанавливали серебро до элементного состояния. Для подтверждения того, что суспензия наночастиц, синтезированных в присутствии очищенного препарата Mn–пероксидазы, содержит именно серебро, отфильтрованные и лиофилизованные частицы исследовали с помощью рентгенофлуоресцентного анализа. Наличие серебра было определено по эмиссионным линиям (см. Рис. 1а). 106 (а) (б) Рисунок 1. Серебряные наночастиц, полученные с помощью Mn–пероксидазы A. brasilense Sp245: (а) рентгеновский флуоресцентный анализ; (б) просвечивающая электронная микроскопия. Методом наночастицы, просвечивающей синтезированные электронной в присутствии микроскопии установлено, бактериальной что Mn–пероксидазы представлены наносферами размером от 10 до 50 нм. Размер восстановленных частиц серебра был также оценен методом динамического светорассеяния. Дзета–потенциал коллоидного серебра, биологически синтезированного при инкубировании с Mnпероксидазой в течение 24 часов составлял –8.26 mV. Несмотря на низкие значения дзета– потенциала, полученные коллоиды, были устойчивы, и во временном промежутке более 10 дней не происходило агрегации или флокуляции частиц, и выпадения осадка. Вероятнее всего, определенную роль в стабилизации металлических наночастиц сыграли электростатические взаимодействия с белковым препаратом фермента. Таким образом, в ходе нашей работы впервые установлена способность бактерий A. brasilense к восстановлению Ag3+ до Ag0 с последующим формированием серебряных наночастиц. Нами обнаружено, что биосинтез коллоидного серебра протекает внеклеточно. Впервые на гомогенных препаратах показано, что в редукции AgNO3 участвуют фенолокисляющие ферменты, а именно внеклеточные Mn–пероксидазы. Таким образом, экспериментальные данные, полученные в ходе исследования, подтверждают предположения о полифункциональной протекторной роли Mn–пероксидазы в жизнедеятельности азоспирилл, позволяющей снизить токсичное действие металлов. Доступность, простота и безопасность биосинтеза наночастиц при помощи почвенной бактерии A. brasilense делают этот метод перспективным для экологически чистого получения наночастиц. Однако предстоит особенностей ферментативного синтеза наночастиц. 107 дальнейшее исследование 1. Beveridge T.J., Hughes M.N., Lee H., Leung K.T., Poole R.K., Savvaidis I. Metal– microbe interactions: contemporary approaches // Adv. Microbiol. Physiol. – 1997. – V. 38. – P. 177–243. 2. Камнев А.А., Тугарова А.В., Антонюк Л.П. Эндофитный и эпифитный штаммы Azospirillum brasilense по–разному отвечают на стресс, вызываемый тяжелыми металлами // Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 6. – С. 908–911. 3. Купряшина М.А., Ветчинкина Е.П., Буров А.М., Пономарева Е.Г., Никитина В.Е. Биосинтез золотых наночастиц бактериями Azospirillum brasilense // Микробиология. – 2014. – Т. 83. – № 1. – С. 41–48. 4. Duran N., Marcato P.D., Duran M., Yadav A., Gade A., Rai M. Mechanistic aspects in the biogenic synthesis of extracellular metal nanoparticles by peptides,bacteria,fungi, and plants // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2011. V. 90. P. 1609–1624. 5. Kalimuthu K., Babu S.R., Venkataraman D., Bilal M., Gurunathan S. Biosynthesis of silver nanoparticles by Bacillus licheniformis // Colloids Surfaces. – 2008. – V. 65. – P. 150–153. 6. Klaus T., Joerger R., Olsson E., Granqvist C-G. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1999. – V. 96. P. 13611–13614. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОХИРАЛЬНЫХ СУЛЬФИДОВ В ОПТИЧЕСКИ ЧИСТЫЕ СУЛЬФОКСИДЫ КЛЕТКАМИ GORDONIA TERRAE Т. И. Кылосова 1, А. А. Елькин 2, В. В. Гришко 3, И. Б. Ившина 1,2 1 Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия 2 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия 3 Институт технической химии УрО РАН, Пермь, Россия Хиральные (оптически чистые) сульфоксиды используются в качестве строительных блоков и стереонаправляющих групп в асимметрическом синтезе для получения биологически активных соединений [1]. При синтезе оптически чистых сульфоксидов химическими методами не всегда достигается высокая энантиоселективность реакций. Использование специфических ферментных систем (индивидуальные ферменты, целые микробные клетки) позволяет получать хиральные сульфоксиды с высокой степенью энантио- и региоселективности. Цель настоящей работы — исследование возможности использования коллекционных культур Gordonia spp. в качестве биокатализаторов 108 процесса окисления прохиральных органических сульфидов в оптически чистые сульфоксиды. В работе использовали 85 штаммов из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов, принадлежащих к видам G. rubripertincta (58), G. terrae (26), G. alkanivorans (1) [2]. Гордонии культивировали в жидкой минеральной среде [3] в присутствии 0,1 об.% н-гексадекана в течение 12 сут. В качестве модельного сульфида использовали фенилметиловый сульфид (тиоанизол), инокулята (5,0 ± 0,7 × 106 клеток/мл) — гордонии, предварительно выращенные на мясопептонном агаре в течение 2 сут. Сульфиды (0,5-2,0 г/л), растворенные в изопропаноле (1 : 10), добавляли через 2 сут роста бактериальной культуры. Иммобилизацию проводили путем включения бактериальных клеток в криогель на основе поливинилового спирта (ПВС) согласно методике [4]. Продукты биотрансформации сульфидов экстрагировали этилацетатом, их качественный и количественный состав контролировали методами тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии с помощью газового хроматографа Agilent 6890N (Agilent). Энантиомерный состав полученных сульфоксидов определяли методом хиральной ВЭЖХ с помощью хроматографа LC Prominence (Shimadzu), оборудованного хиральной колонкой Knauer® и диодно-матричным детектором. Установлено, что коллекционные штаммы G. rubripertincta осуществляли 50 % биконверсию тиоанизола с энантиомерным избытком целевого (R)-сульфоксида 17–85 %. Штаммы G. terrae трансформировали от 53 до 99 % фенилметилового сульфида в (R)-сульфоксид с ee 51–93 %. Биотрансформация тиоанизола штаммом G. alkanivorans ИЭГМ 748 приводила к образованию рацемического сульфоксида. Во всех случаях среди продуктов биоконверсии тиоанизола регистрировалось до 15 % сульфона — продукта более глубокого окисления сульфоксида. Использование штамма G. terrae ИЭГМ 136 в дальнейших экспериментах обусловило высокий уровень конверсии и энантиомерного избытка (R)-сульфоксида (93 % ее). По нашим данным, свободные клетки G. terrae ИЭГМ 136 катализировали окисление сульфида в (R)-сульфоксид в концентрации до 0,5 г/л в течение 6 сут. Увеличение количества вносимого тиоанизола не приводило к повышению эффективности процесса. При добавлении 1,0 или 1,5 г/л тиоанизола через 6 сут биоконверсия составляла лишь 34,3 и 30,4 % соответственно (Табл. 1). 109 Таблица 1. Биотрансформация тиоанизола клетками G. terrae ИЭГМ 136 Тиоан изол, г/л 0,5 1,0 1,5 сут Биоконверсия, % Свободные клетки 4 8 сут 10 0 31, 2 28, 5 12 сут Иммобилизованные клетки 2 1 сут 3 сут сут ─ ─ 100 34,3 41,2 66,3 30,4 35,6 26,5 ─ ─ 10 ─ 0 14, 6 100 Известно, что повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды и высокой метаболической активностью характеризуются иммобилизованные клетки [4]. Включение гордоний в криогель на основе ПВС позволило сократить продолжительность процесса биотрансформации 0,5 г/л тиоанизола до 1 сут без образования сульфона. Иммобилизованные клетки эффективно катализировали биотрансформацию до 1,5 г/л сульфида за 3 сут (Табл. 1). При многократном использовании иммобилизованных гордоний высокий энантиомерный избыток (> 95 % ее) сульфоксида регистрировался в течение первых пяти циклов, что позволило проводить биотрансформацию 2,5 г/л тиоанизола одной порцией биокатализатора. Дробное внесение тиоанизола позволило значительно увеличить концентрацию трансформируемого сульфида. При дробном внесении тиоанизола (по 0,75 г/л) общая нагрузка сульфида составила 4,25 г/л, а уровень биоконверсии тиоанизола достигал 97 %. При этом химический выход целевого (R)-сульфоксида составил 85 % с ее 96 %. При увеличении разовой порции сульфида до 1,0 г/л общая нагрузка фенилметилового сульфида составила 5,5 г/л, однако на момент окончания эксперимента в сумме продуктов реакции регистрировалось 25 % остаточного тиоанизола (Рисунок). Дробное внесение (г/л) сульфида по 0,75 (А), 1,0 (В). Изначально внесенная концентрация сульфида – 0,5 г/л. ■ – тиоанизол, ■ – сульфоксид, □ – сульфон, ♦- ее. 110 Иммобилизованные клетки G. terrae ИЭГМ 136 обладали высокой окислительной активностью в отношении сульфидов с различными заместителями. Наибольший уровень биоконверсии (76,3–88,9 %) наблюдался при использовании фенилэтилсульфида и бензилметилсульфида с образованием (R)-cульфоксидов с ее от 77 до 95 % соответственно (Табл. 2). Таблица 2. Биотрансформация арилалкилсульфидов (R1–S–R2) иммобилизованными клетками G. terrae ИЭГМ 136 R1 Ph PhCH2 o-ClPh o-BrPh p-CH3Ph p-CH3OPh R2 C2 H5 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Конверсия, % Конфигурация и ee, % 88,9 (R) (77) 76,3 (R) (83) 62,8 (R) (15) 61,6 (R) (16) 86,8 (R) (95) 63,0 (R) (21) Работа поддержана грантом № 14–04–96006-р_урал_а РФФИ и Министерства образования и науки Пермского края. 1. Wojaczyńska E., Wojaczyński J. Enantioselective synthesis of sulfoxides: 2000–2009 // Chem. Rev. 2010. V.110 P. 4303–4356. 2. Catalogue of Strains of Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms. 2015 (www.iegm.ru/iegmcol/strains/ 31.08.15). 3. Elkin A.A., Grishko V.V., Ivshina I.B. Oxidative biotransformation of thioanisole by Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 cells // Appl. Biochem. Microbiol. 2010. V. 46. P. 586–591. 4. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Gavrin A.Yu., Podorozhko E.A., Lozinsky V.I., Jeffree C.E., Philp J.C. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant // J. Microbiol. Methods. 2006. V. 65. P. 596–603. 111 НОВЫЙ ПОДХОД К ТРАДИЦИОННЫМ БИОЦИДАМ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В КАЧЕСТВЕ АНТИБИОПЛЕНОЧНЫХ АГЕНТОВ М. В. Журина, А. В. Ганнесен, С. В.Мартьянов, Н. А. Тетенева, В. К.Плакунов Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия Биопленки представляют собой преимущественную форму существования микробных популяций в природе, выполняющую, прежде всего, функции защиты от стрессовых воздействий: неблагоприятных физико-химических условий среды и микробиоцидов. Формирование биопленок вызывает большие трудности в ряде технологических процессов из-за обрастания и коррозии технологического оборудования и трубопроводов. Но наибольшая опасность связна с биопленками патогенных микроорганизмов. По данным национального института здоровья США 80 % хронических бактериальных инфекций у человека обусловлены биопленками. Микроорганизмы в биопленках устойчивы к действию большинства современных антибиотиков, а также плохо поддаются воздействию со стороны иммунной системы макроорганизма. С другой стороны, образование биопленок в ряде случаев может быть полезным. Например, в биотехнологических процессах очистки сточных вод основные процессы удаления вредных примесей осуществляют микроорганизмы в составе биопленок. Таким образом, управление формированием биопленок необходимо как для борьбы с биопленками, так и для использования их в биотехнологии. Одним из успешных направлений такой регуляции является использование низкомолекулярных веществ, выполняющих роль ингибиторов или стимуляторов метаболических процессов, определяющих «биопленочный» фенотип. Для борьбы с биопленками широкое распространение получили ингибиторы глобальной регуляторной ауторегуляторных системы сигнальных «quorum молекул sensing», подавляющие (N-ацилгомосеринлактонов и биосинтез др.) или препятствующие их функционированию (Zhurina et al., 2014). Однако многие из этих соединений токсичны для макроорганизма и вряд ли могут найти широкое применение в химиотерапии. 112 Мы считаем более перспективным использование в качестве антибиопленочных агентов тех препаратов, которые уже проверены на токсичность. Примером служит 4-гексилрезорцин, применяемый в качестве консерванта пищевых продуктов. Нами показано, что это вещество, относящееся к ауторегуляторным алкилоксибензолам, способно подавлять являющихся формирование моделями патогенных биопленок многих микроорганизмов, сапротрофных а главное, бактерий, предотвращать стимулирующее действие субингибиторных концентраций антибиотика азитромицина на формирование биопленок (Mart’yanov et al., 2014). Подобное стимулирующее действие низких концентраций многих антибиотиков может существенно осложнять химиотерапию биопленочных инфекций. Другим классом антимикробных препаратов, хорошо проверенных в практике химиотерапии, являются сульфаниламиды. В литературе есть данные, что сульфатиазол (норсульфазол) может ингибировать биосинтез циклического дигуанозинмонофосфата и препятствовать формированию биопленок у Escherichia coli (Antoniani et al., 2010). Мы изучили действие (сульфадиметоксина, сульфатиазола и сульфадимезина, других сульфаниламидных сульгина, фталазола, препаратов стрептоцида) на формирование биопленок у ряда выделенных из пластовых вод нефтяных месторождений и модельных сапротрофных грамположительных и грамотрицательных бактерий (Kocuria rhizophila, Dietzia natronolimnaea, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas chlororaphis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis). Сульфатиазол оказался наиболее активным соединением, вызывая у ряда грамположительных бактерий подавление роста как планктонной культуры, так и биопленок (ИД50 около 25-100 мкг/мл). Грамотрицательный P. chlororaphis оказался менее чувствительным к сульфатиазолу, но, как и в случае 4-гексилрезорцина, сульфатиазол в количестве 300 мкг/мл значительно ослаблял стимулирующее действие низких концентраций азитромицина на рост биопленок этого микроорганизма. Из других сульфаниламидов наибольшую активность обнаружил сульфадиметоксин (ИД50 для планктонной культуры K. rhizophila составляла 50 мкг/мл), однако его действие на формирование биопленок было выражено слабее, чем у сульфатиазола. Тем не менее, в случае S. epidermidis сульфадиметоксин в концентрации 100 мкг/мл подавлял рост биопленок на 50 %. В целом сульфаниламиды нам представляются перспективным классом биоцидов для разработки антибиопленочных агентов, активных в составе бинарных препаратов с антибиотиками. Особый интерес вызывает салициланилидный препарат никлозамид — представитель еще одного класса лекарственных веществ, используемых в настоящее 113 время в качестве антигельминтных средств. Имеются сведения, что никлозамид может подавлять синтез N-ацилгомоцеринлактонов у P. aeruginosa (Imperi et al., 2013). В наших экспериментах никлозамид оказался весьма активным в отношении грамположительных бактерий (K. rhizophila, S. epidermidis), подавляя примерно в равной степени (на 80-90 %) рост планктонной культуры и биопленок в концентрации 0.01-10 мкг/мл. В отношении грамотрицательных бактерий никлозамид на разные микроорганизмы действовал по-разному. В случае P. aeruginosa РАО1 никлозамид в концентрации 5-10 мкг/мл слабо подавлял (на 15-20 %) рост планктонной культуры и на 50 % подавлял рост биопленок. Последний эффект сильнее проявлялся при окрашивании биопленок красителем 1,9-диметилметиленовым синим, специфичным для кислых полисахаридов матрикса. Это может означать, что главной мишенью никлозамида в биопленках данного микроорганизма является биосинтез полисахаридных компонентов. Напротив, в случае Chromobacterium никлозамид violaceum в той же концентрации заметно (на 40-50 %) подавлял рост планктонной культуры и резко (в 2-3 раза) стимулировал рост биопленок, причем этот эффект сильнее проявлялся при окрашивании биопленок 1,9-диметилметиленовым синим. Поскольку аналогичное действие никлозамид оказывал на мутантный штамм C. violaceum CV026, у которого инсерцией транспозона mini-Tn5 инактивирован ген синтазы cviI, отвечающей за синтез N-ацилгомосеринлактонов, можно полагать, что эффект никлозамида в данном случае не связан с воздействием на систему «quorum sensing». Способность никлозамида стимулировать формирование биопленок у C. violaceum может представлять практический интерес, поскольку этот микроорганизм является продуцентом пигмента виолацеина, находящего применение в качестве антипаразитарного и антиопухолевого средства, а биосинтез данного вещества стимулируется в биопленках. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 13-04-01145 1. Zhurina M. V., Gannesen A. V. , Zdorovenko E. L. , Plakunov V. K. Composition and functions of the extracellular polymer matrix of bacterial biofilms. Review // Microbiology. 2014. V. 83. No. 6. P. 713–722. 2. Mart’yanov S. V., Zhurina M. V., El’ Registan G. I., Plakunov V. K. Activation and prevention of formation of bacterial biofilms by azithromycin // Microbiology. 2014. V. 83. No. 6. P. 723–731. 114 3. Ганнесен А.В., Журина М.В., Веселова М.А., Хмель И.А., Плакунов В.К. Регуляция процесса формирования биопленок Pseudomonas chlororaphis в системе in vitro // Микробиология. 2015. Т. 84. № 3. С. 281‒290. 4. Antoniani D., Bocci P., Maciag A., Raffaelli N., Landini P. Monitoring of di-guanylate cyclase activity and of cyclic-di-GMP biosynthesis by whole-cell assays suitable for highthroughput screening of biofilm inhibitors // Appl. Microbiol. Biotechnol, 2010. V. 85. P.1095–1104. 5. Imperi F., Massai F., Pillai C.R., Longo F., Zennaro E., Rampioni G., Visca P., Leoni L. New life for an old drug: the anthelmintic drug niclosamide inhibits Pseudomonas aeruginosa quorum sensing // Antimicrob. Agent. Chemother. 2013. V. 57. P. 996–1005. 115 ВЛИЯНИЕ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО КАТИОННОГО ФЛОКУЛЯНТА НА ПРОЦЕСС АНАЭРОБНОГО СБРАЖИВАНИЯ ОСАДКОВ СТОЧНЫХ ВОД А. А. Никитина, Ю. В. Литти Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва, Россия Утилизация образующихся при очистке сточных вод осадков в настоящее время является актуальной проблемой. До 50 % эксплуатационных затрат очистных сооружений приходится на обработку и вывоз образующихся на разных стадиях очистки первичного осадка и избыточного активного ила. Для изъятия из очищаемой воды и последующего снижения влажности и объема образующихся осадков на очистных сооружениях практикуется применение флокулянтов. Обезвоженные с помощью флокулянтов осадки вывозятся на специальные площадки (чеки) или подвергаются дальнейшей обработке. Анаэробная деградация является одним из наиболее эффективных методов обработки осадков сточных вод (ОСВ). Использование этого метода позволяет существенно снизить содержание легкоразлагаемого сухого вещества (СВ) в ОСВ и получить альтернативный источник энергии в виде биогаза. Кроме того, этот метод наиболее экологичен, т.к. осуществляется в герметичных биореакторах. После сбраживания осадок стабилизируется и уменьшается в объемах, что немаловажно для его использования в качестве биоудобрений или дальнейшей утилизации. Снижение влажности сбраживаемой массы в последнее время является одним из активно исследуемых путей повышения эффективности работы анаэробных биореакторов. Сбраживание высокоуплотненных осадков позволяет уменьшить объем и увеличить производительность реактора, а также снизить энергоемкость процесса. Однако чрезмерное ингибирующих уплотнение активность может анаэробного увеличить концентрации микробного сообщества, соединений, и привести к дестабилизации процесса. Наши исследования процесса анаэробной деградации при разной начальной влажности сбраживаемой смеси (97 до 87 %) показали, что сбраживание ОСВ с влажностью менее 90% характеризуется низкой эффективностью и стабильностью процесса, а также интенсивным выделением молекулярного водорода. Критическое значение для инициации процесса анаэробного сбраживания любых органических отходов имеет начальное соотношение количества инокулята и субстрата (И/С) в сбраживаемой смеси. Активность метаногенного сообщества инокулята должна быть достаточной для разложения образующихся метаболитов, таких как H2 и летучие жирные кислоты (ЛЖК), и предотвращения их накопления и дестабилизации процесса. 116 В предыдущих исследованиях нами было показано, что для пуска и развития стабильного термофильного процесса анаэробной деградации ОСВ доля органического вещества (ОВ) инокулята должна составлять не менее 50 % от общего ОВ смеси. В условиях сниженной влажности смеси подбор оптимального соотношения количества инокулята и субстрата становится еще более важным. Влияние флокулянтов, применяемых для обезвоживания осадков, на процесс анаэробного сбраживания до сих пор остается недостаточно изученным. Ряд исследователей показали ингибирование процесса сбраживания в мезофильных условиях, другие отмечали, что добавление флокулянтов не влияет на процесс сбраживания. Влияние флокулянта на сбраживание в термофильных условиях не изучалось. Таким образом, целью нашей работы было изучение влияния флокулянта на процесс анаэробного сбраживания ОСВ с низкой влажностью в термофильных условиях при различном начальном соотношении количества инокулята и субстрата. В работе использовали катионный полиакриламидный флокулянт Праестол 650, используемый на очистных сооружениях г. Москва. Влияние флокулянта на процесс исследовали при пониженном (40/60) и повышенном (60/40) соотношениях И/С. В качестве субстрата использовали смесь избыточного активного ила и модели первичного осадка, в качестве инокулята использовали сброженный осадок из термофильного метантенка. Влажность сбраживаемой смеси составляла 92-93 % (низкая влажность). Концентрация вносимого флокулянта составляла от 5 до 60 мг/г СВ смеси. Сбраживание проводили при 51 ± 1 оС. В ходе экспериментов регулярно измеряли содержание метана и водорода в газовой фазе, концентрацию ЛЖК в жидкой фазе и рН смеси. Обработка ОСВ флокулянтом Праестол 650 приводила к снижению начальной скорости метаногенеза на 14-40 % в обоих экспериментах. При пониженном соотношении И/С 40/60 наблюдалось накопление большого количества ЛЖК (более 15 г/л), также оказывающего ингибирующий эффект на процесс метаногенеза. Максимальное количество метана при И/С 40/60 составляло около 65 мл/г ОВ (40 мг/г). Для сравнения, выход метана при И/С 60/40 составлял от 83,9 до 160,6 мл/г ОВ сбраживаемой смеси. При повышенном соотношении И/С 60/40 прослеживалась четкая зависимость —чем выше концентрация флокулянта, тем ниже скорость процесса и выход биогаза. При этом процесс развивался стабильно, накопления высоких концентраций ЛЖК и других ингибирующих интермедиатов не происходило. Полученные данные подтверждают критическую важность подбора правильного соотношения количества инокулята и субстрата для пуска процесса анаэробного сбраживания. 117 Интересно, что в экспериментальных образцах И/С 40/60 высокая концентрация флокулянта (40 мг/г СВ) способствовала активации метаногенеза, даже несмотря на ингибирующие концентрации ЛЖК. Вероятно, это связано с особенностями структуры образующихся флоккул, которое достаточно сильно отличалось в зависимости от концентрации флокулянта и соотношения инокулята к субстрату. Чем меньше была концентрация флокулянта в смесях, тем мельче и рыхлее были образующиеся флоккулы. При пониженном соотношении И/С образующиеся флоккулы были крупнее и имели более плотную структуру. Образование наиболее крупных и плотных флоккул наблюдали именно в образцах с соотношением И/С 40/60 и концентрацией флокулянта 40 мг/г СВ. Вероятно, во флоккулах происходило концентрирование биомассы и формирование структурированного метаногенного сообщества, при этом за счет тесного контакта достигалось более эффективное взаимодействие ассоциаций синтрофных бактерий и метаногенных архей и облегчался межвидовой перенос водорода. Кроме того, образовался градиент концентраций метаболитов (ЛЖК и др.), что способствовало поддержанию достаточно низких концентраций ЛЖК во внутренних слоях флоккул для комфортного существования метаногенных микроорганизмов. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при повышенном соотношении И/С наличие флокулянта в сбраживаемой смеси не оказывает существенного влияния на скорость метаногенеза и суммарный выход биогаза при концентрации флокулянта 5–15 мг/г СВ и отрицательно влияет при более высокой концентрации. Наиболее высокая концентрация флокулянта (60 мг/г) снижает эффективность метаногенеза на 48 %. При пониженном соотношении И/С наличие флокулянта снижает начальную скорость процесса во всех образцах, но не влияет на суммарный выход биогаза (кроме образцов с самой высокой концентрацией). Высокая концентрация (40 мг/г СВ) стимулирует метаногенез, даже несмотря на чрезвычайно высокие концентрации ЛЖК в смеси. В связи с этим, добавление флокулянта в высокой концентрации (40 мг/г СВ) можно рекомендовать в качестве одного из способов восстановления метаногенеза в «закисленных» биореакторах. Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки России, идентификационный номер RFMEFI60714X0024. 118 ВОЗБУДИТЕЛЬ КОЛЬЦЕВОЙ ГНИЛИ КАРТОФЕЛЯ CLAVIBACTER MICHIGANENSIS SUBSP. SEPEDONICUS — ХАРАКТЕРИСТИКА, ОПАСНОСТЬ И РЕГУЛИРОВАНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ А. И. Перфильева Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, Россия Бактерия Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) - биотрофный патоген, относящийся к семейству Microbacteriaceae. Cms — неспороносные, неподвижные, палочкообразные грамположительные бактерии, размером 0,5-1,0 мкм, одиночные или соединенные попарно, либо в короткие цепочки [1]. Мицелий и споры не образуют [2]. Бактерии Cms используют аэробный метаболизм, могут медленно расти в анаэробных условиях [1]. Факторами патогенности данного микроорганизма являются две плазмиды pCS1 и pCSL1, кольцевая и линейная, несущие на себе гены Cel-A и pat-1, кодирующие ферменты целлюлазу и сериновую протеазу, позволяющие патогену колонизировать растение и вызывать симптомы заболевания. Также Cms вырабатывает экзополисахариды (ЭПС), состоящие из белков и сахаров (содержат фукозу, маннозу, галактозу и глюкозу), полигалактуроназу, пектинметилэстеразу, ксиланазу, различные целлюлазы и эндоглюконазы. ЭПС, способны образовывать вокруг бактерии, насыщенный водой матрикс, который защищает бактерию от дегидратации, блокируя распознавание Cms растением, а также способствует его прикреплению к растению [1, 2]. Cms распространяется по сосудам ксилемы, нарушая транспорт воды в верхнюю часть стебля и вызывая завядание или вилт, типичный симптом заболевания. Листья желтеют, на них появляются некротические пятна, иногда все растение может погибнуть. Приблизительно через 8 недель бактерии проникают в корни и созревающие клубни, вызывая мацерацию окружающих тканей, что ведет к загниванию клубней и образованию характерного поражения — сосудистого кольца, что и дало данному заболеванию название кольцевая гниль [3]. До 50 % урожая картофеля в странах Северной Европы и Канады теряется в результате заболевания кольцевая гниль картофеля, которая вызывается Сms. В России, в отличие от Европы, Канады и США, данный патоген не является карантинным организмом. Однако, согласно данным Европейской и Средиземноморской организации защиты растений (European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO) кольцевая гниль широко распространена в европейских регионах России, где вызывает потери урожая картофеля до 30 %. Повышение среднегодовой температуры на планете способно привести к распространению как самих 119 патогенов, так и повысить эффективность их проникновения в растение-хозяина [4]. Показано, что повышение среднегодовой температуры способствуют выживанию болезнетворных микроорганизмов зимой, ускоряет их жизненный цикл летом [5, 6]. Ожидается, что ареал обитания патогенных микроорганизмов будет расширяться в Европе [7, 8]. Вероятно, что Cms, также как и другие биотрофоные патогены будет распространяться на восток и на север, заселяя регионы России. На сегодняшний день не существует доступных, эффективных и экологически безопасных способов борьбы с кольцевой гнилью. Мероприятия по ограничению распространения Cms сводятся к обеззараживанию инвентаря, сертификации посадочной продукции и механическому удалению больных растений [9]. Однако отбор больных растений осложняется латентным протеканием заболевания [10], что требует применения специальных методов идентификации возбудителя. По этой же причине не существует сортов картофеля полностью устойчивых к Cms. При отсутствии симптомов заболевания на вегетативной стадии, бактерия способна проникать и колонизировать растение. Поэтому использование относительно устойчивых сортов не рекомендуется, это способствует неконтролируемому распространению заболевания [ 1, 2, 10]. Для решения проблемы регулирования численности Cms нами были исследованы ряд веществ в качестве потенциальных агентов для обеззараживания картофеля от кольцевой гнили. Для этого мы использовали монойодацетат натрия, нанокомпозиты селена химического происхождения, а также нанокомпозиты селена биологического происхождения (бесклеточные экстракты грибов класса базидиомицетов). Монойодацетат натрия (МИА) — ингибитор глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы. Как и многие современные пестициды МИА блокирует деятельность митохондрий, однако в отличие от них МИА слабо персистентен и при повышении температуры до 40оС через 2 ч полностью разлагается на уксусную кислоту и йод [11]. Известно, что обработка сои МИА способствовала повышению содержания фитоаллексинов в ней [12]. Нами было показано, что обработка 1 мМ МИА оказывает ярко выраженный токсический эффект на жизнеспособность клеток Cms и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Следовательно, этот агент обладает бактерицидным и фунгицидным эффектом, его действие усиливается при повышении температуры [13]. В то же время, МИА не оказывал отрицательного влияния на прорастание клубней картофеля. В полевых экспериментах, было показано, что предпосадочная обработка МИА может увеличивать продуктивность картофеля [14]. 120 В настоящее время активно изучаются наноматериалы. Интерес вызывают нанокомпозиты, представляющие собой частицы наноселена, помещенные в матрицу из арабиногалактана. Такое сочетание материалов удобно в использовании, так как токсичные частицы селена плотно упакованы полисахаридом и высвобождаются только после расщепления молекулы арабиногалактана. Таким образом, селенсодержащие нанокомпозиты сохраняют бактерицидное действие селена, но при этом не токсичны для организма, что обуславливает перспективность их исследования для дальнейшего использования на практике. В настоящей работе нами был использован НК (наночастицы селена, стабилизированные (арабиногалактан, арабиногалактаном), а также бис(2фенилэтил)диселенофосфинат его предшественники натрия) разработанные и синтезируемые в Иркутском институте органической химии им. А. Е. Фаворского СО РАН. Все агенты хорошо растворимы в воде и удобны в использовании. Было показано отсутсвие негативного эффекта нанокомпозитов на растения картофеля in vitro (изменение уровня а наличие также активности пероксидазы и бактерицидного влияние на прирост эффекта исследуемых растений), нанокомпозитов на жизнеспособность Cms (путем измерения оптической плотности и методом определения КОЕ) и изменение морфологии клеток бактерий после их инкубации с нанокомпозитами, что возможно, связано с изменением мембранной проницаемости клеток бактерий в результате влияния нанокомпозитов [15, 16]. Также нами были проверены бесклеточные экстракты грибов класса базидиомицетов, способных осуществлять восстановление селенита до элементного селена. Бесклеточная культуральная жидкость, полученная в результате выращивания базидиомицетов в присутствии органического селенида с исходной концентрацией не менее 104 моль/л, представляла собой суспензию in vivo синтезированных частиц красного селена в водном растворе продуктов метаболизма. С использованием метода лунок, определения влияния селеновых экстрактов на оптическую плотность и КОЕ был показан бактерицидный эффект данных агентов на Cms. Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что регулировать численность Cms, не оказывая негативного влияния на растения картофеля, представляется возможным как с использованием агентов химического синтеза (монойодацетат натрия, нанокомопозиты селена), так и путем применения продуктов биологического происхождения (бесклеточные экстракты грибов класса базидиомицетов). 1. Van der Wolf J. M., Elphinstone J. G., Stead D. E., Metzler M., Muller P., Hukkanen A., Karjalainen R. Epidemiology of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in relation 121 to control of bacterial ring rot // Plant Research International B.V. Wageningen Report 95. February 2005. 2. Eichenlaub R., Gartemann K.H. The Clavibacter michiganensis subspecies: molecular investigation of gram-positive bacterial plant pathogens // Annu Rev Phytopathol. 2011. V. 49. P. 445-64. 3. Gartemann K.H, Kirchner O., Engemann J., Gräfen I., Eichenlaub R., Burger A.. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis: first steps in the understanding of virulence of a Gram-positive phytopathogenic bacterium // J. Biotechnol. 2003. V. 106. № 2-3. P. 179-191. 4. Garrett K.A. Climate change effects on plant disease: genomes to ecosystems / K.A. Garrett, S.P. Dendy, E.E. Frank, M.N. Rouse, S.E.Travers // Annu Rev Phytopathol. 2006. - V. 44. - P. 489-509. 5. Harvell HC. Climate warming and disease risks for terrestrial and marine biota / H.C. Harvell, C.E. Mitchell, J.R.Ward, S. Altizer, A.P. Dobson, R.S. Ostfeld, M.D. Samuel // Science. – 2002. V. 296. P.2158-2162. 6. Mina U., Sinha P. Effects of Climate Change on Plant Pathogens / U. Mina, P. Sinha // Environ. News. - 2008. V. 14(4). P. 6-10. 7. Evans N. Range and severity of a plant disease increased by global warming / N. Evans, A. Baierl, A.M. Semenov, P. Gladders, B.D. Fitt // J. R. Soc. Interface. - 2007. V.5. P. 525-531. 8. Salinari F. Downy mildew (Plasmopara viticola) epidemics on grapevine under climate change / F. Salinari, S. Giosue, F.N. Tubiello, A. Rettori, V. Rossi, F. Spanna, C. Rosenzweig, M.L. Gullino // Glob. Change Biol. 2006. V.12. P. 1299-1307. 9. Калач В.И., Жукова М.И., Ильяшенко Д.А., Ерчик В.М., Романович А.С., Криштофик Л.Д. бактериальной Методические указания по локализации и ликвидации кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum (Spieckermann and Kotthoff) Davis et al. Самохваловичи: РУП «Научнопрактический центрНАН Беларусии по картофелеводству и плодоовощеводству», 2010. 12 с. 10. Nelson G.A. Corynebacterium sepedonicum in potato: Effect of inoculum concentration on ring rot symptoms and latent infection //Canadian Journal of Plant Pathology. 1982. V. 4. №. 2. P. 129-133. 11. Webb E.C. Enzyme and metabolic inhibitors. New York, 1963. V. 1. 340 p. 122 12. Keen N.T., Ersek T., Long M., Bruegger B., Holliday M. Inhibition of the hypersensitive reaction of soybean leaves to incompatible Pseudomonas spp. by blasticidin Streptomycin or elevated temperature // Physiology Plant Pathology. 1981. V. 18. P. 325–337. 13. Рымарева Е.В., Рихванов Е.Г., Торгашина М.А., Перфильева А.И., Копытчук В.Н., Варакина Н.Н. Влияние монойодацетата на термотолерантность Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus и дрожжей Sacharomyces сerevisiae // J. of Stress Physiology & Biochemistry. 2008. V. 4. №. 2. P. 4-13. 14. Перфильева А.И., Рымарева Е.В., Рихванов Е.Г. Влияние монойодацетата натрия и тепловой обработки на продуктивность картофеля в вегетационных и полевых опытах // Агрохимия. 2013. № 6. С. 54-60. 15. Папкина А.В., Перфильева А.И., Живетьев М.А., Боровский Г.Б., Граскова И.А., Лесничая М.В., Клименков И.В., Сухов Б.Г., Трофимов Б.А. Влияние нанокомпозита селена и арабиногалактана на жизнеспособность фитопатогена Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus // Доклады академии наук, 2015, том 461, № 2, С. 239-241. 16. Papkina A.V., Perfileva A. I., Zhivet’yev M.A., Borovskii G.B., Graskova I.A., Klimenkov I.V., Lesnichaya M.V., Sukhov B.G., Trofimov B.A. Complex effects of selenium-arabinogalactan nanocomposite on both phytopathogen Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus and potato plants / // Nanotechnologies in Russia, 2015, V. 10, (5-6), P. 484-491. 123 ЛЕТУЧИЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ БАКТЕРИЙ: ВЛИЯНИЕ НА БИОПЛЕНКИ И ИНДУКЦИЮ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В. А. Плюта1, Т. А. Чуприянова2, И. А. Хмель1 1 2 ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия Электронный адрес: plyutaba@gmail.com Тел.: (499) 196-00-16, Факс: (499) 196-02-21 Исследования последнего десятилетия показали, что большинство бактерий (более 99 %) существует в природных экосистемах в виде специфически организованных, прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет сложный, строго регулируемый биологический процесс. Бактерии, живущие внутри биопленок, проявляют более высокую устойчивость к действию антимикробных препаратов и факторов иммунной защиты организма-хозяина. Способность патогенных бактерий формировать биопленки вызывает проблемы в медицине, сельском хозяйстве, микробиологической, пищевой промышленностях и других областях. Образование биопленок может быть полезным, например, при биологической очистке воды. Формирование биопленок бактериями-антагонистами фитопатогенов способствует конкурентной борьбе этих бактерий с микроорганизмами — возбудителями заболеваний растений; этот фактор важен для развития эффективных методов биоконтроля. Поэтому изучение действия на биопленки различных соединений с антибактериальной активностью представляет большой интерес. Бактерии способны синтезировать летучие органические соединения (ЛОС), подавляющие рост различных биологических объектов (бактерий, грибов и др.) и оказывающие модулирующее действие на рост растений. Продукция ЛОС является новым, слабо изученным аспектом конкурентных отношений микроорганизмов и может быть важным фактором биологического контроля защиты растений. ЛОС, синтезируемые ризосферными бактериями и грибами, участвуют в их взаимодействии с патогенными микроорганизмами, а также с растениями-хозяевами и представляют новый источник соединений с антибиотической и стимулирующей рост растений активностями. В связи с этим представляло интерес исследовать, как действуют газовые смеси летучих веществ (общий пул), синтезируемых бактериями, и индивидуальные ЛОС на формирование биопленок и уже образованные биопленки фитопатогенных бактерий, а также изучить механизмы действия данных соединений. 124 В настоящей работе было исследовано действие пула ЛОС, продуцируемых бактериями родов Pseudomonas и Serratia, и конкретных ЛОС (диметилдисульфида, 2-гептанона, 2-нонанона, 2-ундеканона и 1-ундецена) на биопленки бактерий Agrobacterium tumefaciens. Состав ЛОС, выделяемых исследованными бактериями, был определен в совместной работе Лаборатории регуляции экспрессии генов микроорганизмов ИМГ РАН с сотрудниками Иерусалимского Университета (Израиль). В данной работе было показано, что ЛОС бактерий способны подавлять образование биопленок A. tumefaciens и убивать бактерии в зрелых биопленках, причем гибель бактерий, живущих в составе биопленок, происходила при более высоких количествах ЛОС, чем образование биопленок. В настоящее время широкое применение при изучении механизмов действия на клетку различных токсичных веществ, а также для мониторинга окружающей среды находят специфические lux-биосенсоры — бактерии Escherichia coli, содержащие гибридные плазмиды с lux-генами-репортерами, расположенными под индуцируемыми промоторами. Для оценки степени окислительного стресса, вызываемого указанными ЛОС, в настоящей работе использовался специфический lux-биосенсор - E. coli MG1655, содержащий плазмиду pKatG::lux. Штамм E. coli MG1655 (pKatG::lux) является чувствительным и специфическим сенсором на действие гидроперекисных соединений. В качестве положительного контроля в роли индуктора окислительного стресса применялась перекись водорода. Было показано, что ЛОС не вызывают окислительный стресс (индукцию PKatG-промотора). При предварительной обработке культуры биосенсора данными соединениями подавляется последующая индукция окислительного стресса, вызываемая перекисью водорода. 125 ПЕРЕСТРОЙКИ МОРФОЛОГИИ И УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОК НЕКОТОРЫХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ В. Н. Поливцева2, Д. В. Росс2, Н. Е. Сузина2, В. П. Холоденко1 1 2 Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, Пущино, Россия Проведен сравнительный морфометрический анализ модельных коллекционных штаммов ультрамикробактерий (УМБ): грамотрицательных бактерий Kaistia sp., шт. NF1 (Дуда с соавт., 2007), рода Chryseobacterium sp., шт. NF4 (Сузина с соавт., 2011), грамположительной бактерии Microbacterium sp., шт.NF7, а также новой УМБ — штамма AV, выделенного из тундровой глеевой почвы Ямала. В качестве испытуемых были использованы сложные и простые синтетические среды, содержащие в своем составе различные источники С, N и минеральные соединения: 1) триптон-соевую среду 5/5 (разработана в ИБФМ РАН), 2) агаризованную среду LB , 3) среду R2/A, включающую аминокислоты, пептиды, углеводы и витамины; 3) синтетическую среду–М9, содержащую минеральную основу, углеводы и дрожжевой экстракт 0,3 г; 4) почвенный агар (по Никитину). Все среды брались в исходном составе и разбавленные в 5 раз. В ходе работы были получены следующие результаты: 1. Клетки штамма NF1 продуцируют в процессе почкования и деления наиболее мелкие клеточные формы (0,25–0,35 мкм) при росте на среде R2A, разведенной в 5 раз. При этом количество и размеры периплазматических протрузий на поверхности клеток, характерных для этого штамма в 3 раза увеличивается (Рис. 1). 2. Клетки штамма NF7 активно и быстро растут и делятся, продуцируя наиболее мелкие клеточные формы (0,25–0,3 × 0,35–0,4 мкм) при росте на неразбавленной и богатой органикой среде LB. В этих условиях в полярной области цитоплазмы клеток формируются системы внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) в виде множественных сферических везикул, локализованных вблизи цитоплазматической мембраны (Рис. 1). Роль этих индуцируемых факторами среды ВЦМ пока не ясна и требует дальнейшего изучения. 126 Рисунок 1. Электронная микроскопия ультратонкого среза штамма NF1, выращенного на среде R2A/5 и штамма NF7, выращенного на среде LB. Обозначения: Пр–периплазматическая протрузия; НМ–наружная мембрана; КС — клеточная стенка; В — мембранная везикула, ЦМ–цитоплазматическая мембрана. 3. Клетки штамма NF4 продуцируют наиболее мелкие жизнеспособные клетки сферической формы (0,25–0,28 мкм) в экспоненциальной фазе роста на всех исследуемых питательных средах. Наибольший выход ультрамелких форм наблюдался при росте на среде LB, разбавленной в 5 раз (Рис. 2). Клетки этого штамма характеризуются наличием развитой фибриллярной сети с узелками по всей длине фибрилл, которая обнаруживается во всех условиях роста. 4. Клетки штамма AV характеризуются наиболее мелкими размерами кокковидных клеток (0,4–0,45 мкм) на среде R2A и разбавленной в 5 раз среде LB. В этих условиях клетки отличаются характерным для УМБ очень маленьким объемом цитоплазмы (0,03 мкм3) и очень толстой клеточной стенкой, объем которой более чем в два раза превышает объем цитоплазмы (Рис. 2). 127 Рисунок 2. Электронная микроскопия ультратонкого среза штамма NF4, выращенного на среде LB/5 и штамма AV, выращенного на среде R2A. Обозначения: КС - клеточная стенка; ФС — фибриллярная сеть, ЦМ-цитоплазматическая мембрана; D — диаметр клетки; d — диаметр протопласта. Установлено, что объемы и ультраструктурная организация клеток модельных штаммов УМБ индивидуально зависят от состава и концентрации питательных сред. Для всех изученных штаммов УМБ нами определены питательные среды, обеспечивающие образование УМБ наиболее мелких по размерам клеток. 1. Дуда В.И., Сузина Н.Е., Акимов ВН., Вайнштейн М.Б., Дмитриев В.В., Баринова Е.С., Абашина Т.Н., Олейников Р.Р., Есикова Т.З., Боронин А.М. Особенности ультраструктурной организации и цикла развития почвенных ультрамикробактерий, относящихся к классу Alphaproteobacteria // Микробиология. – 2007. – Т.76 – сс. 652-661. 2. Сузина Н.Е., Дуда В.И., Есикова Т.З., Шорохова А.П., Гафаров А.Б., Олейников Р. Р., Акимов В.Н., Абашина Т.Н., Поливцева В.Н., Боронин А.М. Новая ультрамикробактерия из рода Chryseobacterium - факультативный эпибионт Bacillus subtilis // Микробиология. 2011. – Т.80. – №4. – сс. 529-542 128 НЕБЕЛКОВАЯ АМИНОКИСЛОТА ВМАА КАК РЕГУЛЯТОР ОБРАЗОВАНИЯ И РЕПРЕССИИ ГЕТЕРОЦИСТ ЦИАНОБАКТЕРИИ NOSTOC SP. PCC 7120 А. А. Попова 1, Т. Р. Кравцова 2, О. А. Кокшарова 1,2 1 2 Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва, Россия Цианобактерии способны синтезировать цианотоксины, представляющие собой молекулы различной природы. Функциональное значение этих молекул еще недостаточно изучено. Предполагают, что цианотоксины способны оказывать воздействие на природное окружение цианобактерий — представителей фитопланктона, зоопланктона, сопутствующих бактерий в рамках антагонизма, защиты и возможной передачи сигналов. Вероятно, посредством цианотоксинов цианобактерии способны контролировать численность собственной популяции. Есть предположения о том, что эти соединения могут участвовать в регуляции внутриклеточных процессов. Одним из нейротоксичная цианотоксинов, небелковая продуцируемых аминокислота ВМАА цианобактериями, является (бета-метиламино-L-аланин). Накапливаясь в цепях питания и попадая в организм человека, ВМАА приводит к тяжелым нейродегенеративным заболеваниям, вызывая поражение мотонейронов. Роль и значение этой аминокислоты в метаболизме самих цианобактерий остается неясной. В работе Downing S. с соавторами (2011) на примере двух не диазотрофных бактерий Microcystis PCC 7806 и Synechocystis J341 было показано, что клеточный синтез ВМАА происходит в условиях азотного голодания и что предположительная физиологическая роль этого соединения заключается в адаптации этих цианобактерий к нехватке азота в среде. С целью изучения функции ВМАА в метаболизме диазотрофных цианобактерий мы использовали модельный штамм нитчатой цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120. В ходе проведенного нами исследования было показано, что различные концентрации ВМАА приводят к подавлению активности фермента нитрогеназы в уже сформированных гетероцистах культуры Nostoc sp. PCC 7120, растущей в условиях азотфиксации, что согласуется с данными шведских ученых о действии 50 мкМ ВМАА на нитрогеназную активность этой цианобактерии. С помощью методов флуоресцентной микроскопии нами впервые показано, что добавление экзогенного ВМАА приводит к ингибированию формирования гетероцист в условиях голодания по азоту в культуре дикого типа цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120. 129 Мы обнаружиди, что в условиях роста в присутствии нитрата или аммония, препятствующих образованию гетероцист, добавление ВМАА к клеткам цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120, вызывает дерепрессию гетероцист, а именно образование гетероцисто-подобных клеток. С помощью метода восстановления ацетилена мы определили, что эти клетки не обладают нитрогеназной активностью. Таким образом, экзогенно добавленный ВМАА в низких концентрациях (20- 100 мкМ) приводит к изменениям в процессе клеточной дифференцировки нитчатой цианобактерии Nostoc sp. PCC 7120. Мы провели сравнительный анализ действия ВМАА на клетки Nostoc sp. PCC 7120 относительно действия других известных аналогов аминокислот (L-метионинсульфоксимина, 7-азатриптофана, β-2-тиенил-D,L-аланина), индуцирующих дерепрессию гетероцист в культурах азотфиксирующих цианобактерий. Анализ показал, что эффект ВМАА обусловлен, вероятно, уникальным механизмом, отличающимся от механизмов действия этих агентов. Для понимания регуляторного эффекта ВМАА на клеточные процессы азотфиксирующих цианобактерий проводятся исследования экспрессии генов, контролирующих клеточную дифференцировку и активность нитрогеназы, а также новые эксперименты с привлечением методов ТЕМ и протеомики. Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-00656. ФИБРИНОЛИТИЧЕСКАЯ И КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ МИКРОМИЦЕТОВ ASPERGILLUS USTUS И ASPERGILLUS OCHRACEUS Е. А. Попова, А. А. Осмоловский Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия Протеолитические ферменты, обладающие коллагенолитическими и фибринолитическими свойствами востребованы в различных отраслях. В медицине, такие протеиназы используют в составе препаратов для удаления некротизированных тканей, гнойных выделений и кровяных сгустков в открытых ранах [1]. Препараты протеиназ с направленной фибринолитической активностью также перспективны для тромболитической терапии. С другой стороны, коллагенолитические и фибринолитические протеиназы необходимы в кожевенной и пищевой промышленности 130 для обработки шкур и мяса. Наиболее эффективными протеиназами для этих целей являются ферменты, образуемые микроорганизмами, в том числе и микромицетами [2]. Микромицеты рода Aspergillus способны образовывать несколько типов протеиназ направленного действия, что представляет особый интерес при поиске оптимального продуцента [1]. Среди представителей этого рода грибов изучены продуценты как коллагенолитических, так и фибринолитических протеиназ [3, 4]. Однако, в большинстве случаев, такие протеиназы обладали высокой активностью, в том числе в отношении глобулярных белков, что накладывает ограничения на возможности их медицинского применения и снижает их промышленную привлекательность. Поэтому необходим поиск новых продуцентов протеиназ с выраженной активностью к фибриллярным белкам. Важным для оценки эффективности таких протеиназ является соотношение фибринолитической и неспецифической общей протеолитической (казеинолитической) активности (соотношение ФА/ОПА) [12]. Микромицеты Aspergillus ochraceus и Aspergillus ustus, использованные в данной работе, были отобраны в результате предыдущих исследований как перспективные продуценты протеиназ с фибринолитической и коллагенолтической активностью [5]. Целью работы было определение выраженного действия протеиназ A. Ochraceus и A. ustus на фибриллярные белки (фибрин и азоколлаген) при разных значениях рН. В данной работе использовали штаммы A. ochraceus L-1 и A. ustus 1 из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Микромицеты культивировали в глубинных условиях на орбитальной качалке (200 об/мин) в качалочных колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды при 28 °С в течение 2 сут. на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон, после чего часть полученного посевного материала переносили в среду следующего состава (в %) — глюкоза — 3.0, глицерин — 7.0, гидролизат рыбной муки — 0.5, NaNO3 —0.2, KH2PO4 —0.05, MgSO4 —0.05, с последующим культивированием в течение 5 сут. Изучаемые активности —общую протеолитическую, коллагенолитическую и фибринолитическую определяли в культуральной жидкости при разных значениях рН с субстратами — (1 %) казеином, (1 %) фибрином и (0,25 %) азоколлагеном, приготовленными на 0.1 М натрий-ацетатном буфере (рН 5.0 и 6.0) и 0.1 М Трис-HCl буфере (рН 7.0 и 8.0). Активности протеиназ штаммов A. ochraceus L-1 и A. ustus 1 были изучены при значениях рН от 5,0 до 8,0 с интервалом через единицу. В Таблице 1 приведены данные общей протеолитической, фибринолитической и колагенолитической активности A. ochraceus L-1 и A. ustus. 131 Таблица 1. Протеолитическая активность микромицетов A. ochraceus и A. ustus при разных значениях рН Активность Общая протеолитическая, ЕТир/мл Фибринолитическая, ЕТир/мл Коллагенолитическая, ЕАзк/мл × 10-3 рН реакции A. ochraceus A. ustus 5,0 6,0 7,0 8,0 5,0 6,0 7,0 8,0 5,0 6,0 7,0 8,0 0,0 0,1 1,3 2,8 0,0 0,2 5,0 8,5 0,0 14,2 30,3 11,2 0,0 3,4 1,5 0,0 0,0 22,7 18,5 22,1 19,5 107,2 87,3 101,4 Для протеиназ A. ochraceus L-1 максимальные значения общей протеолитической (2,8 ЕТир/мл) и фибринолитической (8,5 ЕТир/мл) активности были показаны при рН 8,0, а коллагенолитической (30,3 ЕАзк/мл × 10-3) — при рН 7,0. Максимальные значения общей протеолитической (3,4 ЕТир/мл), фибринолитической (22,7 ЕТир/мл) и коллагенолитической (107,2 ЕАзк/мл × 10-3) активностей у протеиназ A. ustus 1 приходились на рН 6,0, однако этот штамм был высоко активен и при рН 8,0 в случае с фибринолитической (22,1 ЕТир/мл) и коллагенолитической (87,3 ЕАзк/мл × 10-3) активностью, что может указывать на присутствие в протеолитическом комплексе этого микромицета нескольких ферментов. Протеолитические ферменты обеих культур проявляли слабую активность или были неактивны при рН 5,0. Соотношение фибринолитической и общей протеолитической активностей (соотношение ФА/ОПА) для A. ustus 1 составляет 6,67, что примерно в 2 раза больше, чем для A. ochraceus L-1 —3,03. Это говорит о большей специфичности протеиназ A. ustus 1 к фибриллярным белкам, по сравнению с A. ochraceus L-1. Таким образом, микромицеты A. ochraceus L-1 и A. ustus 1 были изучены в качестве продуцентов протеиназ направленного действия. Показано, что внеклеточные протеиназы, образуемые этими штаммами отличаются по проявлению активности при разных значениях рН и выраженности своего действия на фибриллярные белки. Так, штамм A. ustus 1 практически не проявляет общей протеолитической (казеинолитической) активности и соотношение ФА/ОПА составило 6,67, что делает его перспективным продуцентом фибринолитических и коллагенолитических протеиназ. 132 1. Zanoelo F.F., Giannesi G.C., Cabral H. Proteolytic enzymes: biochemical properties, production and biotechnological application // Fungal enzymes / Ed. Polizeli M.L.T.M., Rai M. Boca Raton: CRC Press, 2013. P. 94-112. 2. Nirmal N.P., Shankar S., Laxman R.S. Fungal Proteases: An Overview // Int. J.Biotech. Biosc., 2011. V. 1. №1. P. 1-40. Сухосырова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Вещикова Е.В., Быков В.А. 3. Характеристика коллагенолитических ферментов, секретируемых дейтеромицетом Aspergillus flavus // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2003. Т. 135. №5. С. 526-531. 4. Barthomeuf C. Pourrat H., Pourrat A. Collagenolytic of a new semi-alkaline protease from Aspergillus niger // J. Ferm. Bioeng. 1992. V. 73. №3. P. 233-236. Попова Е.А., Крейер В.Г., Осмоловский А.А., Егоров Н.С. Получение препарата 5. коллагенолитической протеиназы, образуемой Aspergillus ustus в условиях глубинного и твердофазного культивирования // Усп. мед. микологии. 2014. Т.12. С. 333-335. СОВРЕМЕННЫЕ ДОЛОМИТОВЫЕ СТРОМАТОЛИТЫ ИЗ ПЕТУХОВСКОГО СОДОВОГО ОЗЕРА (АЛТАЙСКИЙ КРАЙ) О. С. Самылина 1,2, Л. В. Зайцева 2, М. А. Синетова 3 1 Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва, Россия 2 3 Палеонтологический институт им. А.А. Борисяка РАН, Москва, Россия Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва, Россия На территории Алтайского края, в Кулундинской степи, сосредоточено огромное количество соляных озер различной минерализации и химического состава, в том числе содовых, для которых характерны стабильно щелочные значения рН около 10 за счет высокого содержания CO32- и HCO3-. Содовые озёра этого региона подвержены циклическим колебаниям температуры, солёности, периодов высыхания и обводнения. Они никогда ранее не исследовались на предмет наличия в них микробиолитов. Данные по минералогическому составу донных отложений содовых озер Кулундинской степи опубликованы только в одной работе за последние годы (Лебедева и др., 2008). В этой публикации отмечено присутствие в Петуховском содовом озере чёрных ноздреватых корочек с доломитом в своем составе. Несмотря на мощные отложения доломита 133 в древних породах его редко удается найти в современных карбонатных осадках и, таким образом, вопрос об его образовании является актуальным. Во время экспедиций на содовое озеро Петуховское (Кулундинская степь) нами были отобраны образцы донных отложений, упоминаемых М.П. Лебедевой с соавт. (2008). При солёностях 100-200 г/л и pH 10 были обнаружены дырчатые и кавернозные корочки небольшого размера: 10-20 см в диаметре и 5-10 мм толщиной (Рис. 1). На их поверхности развивалось фототрофное сообщество, а на поперечном шлифе видно чередование что тонких позволяет минерализованных определить данные слоев различного цвета органо-седиментационные и структуры, образования как современные строматолиты. Методами ИК-спектроскопии и рентгеновской дифрактометрии проведены минералогические исследования. Установлено присутствие Ca-Mg-карбонатов различного состава: стехиометрического доломита, Са-доломита, кальцита, высокомагнезиального кальцита разной степени магнезиальности и низкомагнезиального кальцита. Кроме того, в их составе присутствуют кварц и полевые шпаты. ИК-спектроскопия позволяет предположить также наличие скрытокристаллических форм кремнезема. Рисунок 1. Строматолит из Петуховского содового озера: а) общий вид (поверхность), б) поперечный шлиф. Определены организмы-эдификаторы фототрофного сообщества, развивающегося в озере, и произведена их идентификация в составе минерализованной биоты: цианобактерии Geitlerinema sp. и Nodosilinea sp., бактерии, эукариотическая водоросль Ctenocladus circinnatus, диатомовые водоросли. Циано- и бактериальная компонента этого сообщества выделяет экзополисахариды (ЭПС), которые морфологически представлены в двух видах: либо как околоклеточные структуры (чехлы и слизистые слои), либо как свободный полисахарид, который в виде минерализованного матрикса обнаруживается во всех слоях строматолита. При этом 134 в состав минерализованного ЭПС, как диффузного, так и околоклеточного, входят преимущественно Мg и Si с незначительным содержанием кальция. Электронно-микроскопическое исследование (СЭМ) выявило образование ромбоэдрических кристаллов в контакте с минерализованными чехлами цианобактерий и слизистым слоем бактерий, а также в непосредственном контакте со свободным полисахаридом. Ромбоэдрическая форма кристаллов присуща Ca-Mg-карбонатам. Методом рентгеноспектрального микроанализа (РСМА) определен их состав: обнаружены кристаллы высокомагнезиального кальцита, Са-доломита и стехиометрического доломита. Тот факт, что кристаллы в зоне соприкосновения с ЭПС часто огибают нити цианобактерий и контуры бактериальных скоплений, а также сохраняют связь с ЭПС, позволяет предположить, что рост кристаллов начинается именно при взаимодействии с ЭПС. Высокое содержание стехиометрического доломита в составе строматолита, вероятно, обусловлено специфическим взаимодействием ЭПС с двухвалентными катионами и связано с высокой амплитудностью ежегодных гидрологических колебаний озера. Специфика этого взаимодействия проявляется в том, что первично происходит накопление магния как в околоклеточном, так и в свободном ЭПС, а последующее поступление кальция приводит к образованию Ca-Mg-карбонатов различного состава (в том числе, доломита). На примере минерализованных нитей C. circinnatus описан процесс многоэтапного карбонатонакопления в содовом озере, который приводит к образованию нескольких минеральных слоёв различного состава на нитях водоросли. Таким образом, данные, полученные нами для Петуховского строматолита, свидетельствуют в пользу того, что C. circinnatus, цианобактерии и другие бактерии, входящие в состав фототрофных сообществ содовых озер, являются эффективными агентами для кристаллизации карбонатных минералов различного состава на своей поверхности и способствуют, таким образом, осадконакоплению с формированием доломита в содовых условиях. При этом наиважнейшее значение в процессе минералообразования в Петуховском строматолите играет ЭПС, выделяемый фототрофным сообществом. Работа выполнена при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Эволюция органического мира и планетарных процессов» (подпрограмма II) и поддержана грантами РФФИ № 14-04-00260, 15-04-00774 и научной школой НШ3785.2014.4. Полевые исследования поддержаны грантами РФФИ №№ 11-04-10011 и 12-04-10036 (рук. Сорокин Д. Ю.). 135 Лебедева (Верба) М.П., Лопухина О.В., Калинина Н.В. Особенности химикоминералогического состава солей в соровых солончаках и озёрах Кулундинской степи // Почвоведение. 2008. № 4. С. 467-480. ЦИКЛ МАННИТА ИГРАЕТ ВАЖНУЮ РОЛЬ В АДАПТАЦИИ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA К НИЗКИМ РН СРЕДЫ В. Ю. Секова, И. С. Клемешова ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук, Москва, Россия Введение. Yarrowia lipolytica — полиэкстремофильный вид дрожжей, способный противостоять таким неблагоприятным условиям окружающей среды, как экстремальные значения pH и температуры, высокое осмотическое давление и пониженная активность воды, воздействие ионов тяжелых металлов и др. [1]. Эти уникальные особенности сделали Y. lipolytica поддающимся привлекательным генно-инженерным биотехнологическим манипуляциям и объектом, варьированию хорошо условий культивирования. Уникальная и нехарактерная для большинства дрожжей способность Y. lipolytica развиваться в широком диапазоне pH, в т.ч. в щелочных условиях (до pH 9,5) давно лежит в сфере наших научных интересов и активно изучается [2]. Углеводный состав клеток грибов является крайне важным физиолого-биохимическим параметром, изменяющимся в зависимости от стадии роста культуры и состояния клеток [3, 4]. Ранее нами была проведена работа по изучению углеводного состава клеток Y. lipolytica [5], в которой было показано, что основным углеводом клеток, выращенных как при нормальных, так и при экстремальных (кислых — pH 4.0; и щелочных — pH 9.0) условиях является маннит. Исходя из этого, нами было сделано предположение, что конститутивно высокое содержание маннита в клетках Y. lipolytica придаёт им повышенную устойчивость к стрессовым условиям. Как известно, любое стрессовое воздействие на клетку приводит в конечном счете к развитию окислительного стресса — критического дисбаланса между генерацией и инактивацией активных форм кислорода (АФК). Предотвратить или отсрочить наступление окислительного стресса позволяет высокое содержание антиоксидантных компонентов различной природы [6]. Маннит широко применяется в лабораторной практике 136 как гаситель АФК. Была также показана способность маннита защищать клетки патогенов животных и растений от АФК, генерируемых в ходе ответной реакции организма-хозяина [7, 8]. Для проверки нашего предположения мы провели ряд экспериментов по установлению некоторых физиолого-биохимических параметров клеток Y. lipolytica, выращенных при различных значениях pH (4.0, 5.5, 9.0) в присутствии ингибитора синтеза маннита — нитрофенида. Метаболизм маннита был описан Хальтом и Гатенбеком в 1978 г. [9] при изучении образования поликетидов у Alternaria alternata. Цикл содержит 4 фермента: маннитол-1-фосфатдегидрогеназу (МФД, М1ФДГ), НАДФ+-маннитол-2дегидрогеназу (МДГ), маннитол-1-фосфат фосфатазу и (МФФ) и гексокиназу (ГК) [3]. Цикл маннита ответвляется от пути гликолиза на стадии фруктозо-6-фосфата. Обычно под биосинтезом маннита понимают дефосфорилирование маннитол-1-фосфата. Образующийся при этом маннит далее окисляется до фруктозы, замыкая таким образом цикл [10, 11]. Нитрофенид (бис-пара-нитрофенилдисульфид), известный под коммерческим названием «Мегасул», широко используется в ветеринарии для лечения животных от кишечных паразитов, так как это вещество ингибирует маннитол-1фосфатдегидрогеназу (М1ФДГ), блокируя таким образом цикл синтеза маннита — основного запасного углевода кишечных паразитов [12]. Материалы и методы. В качестве предмета исследования мы использовали штамм Y. lipolytica W29 (дикий тип) Выращивание производилось согласно работе [13]. Выращивание культур до стационарной фазы роста (ОП490 = 9,0) производилось на термостатируемой качалке при температуре + 28°С в течение 24 часов. При проведении экспериментов с нитрофенидом («Реахим», СССР) стоковый раствор ингибитора (0,1 М) вносили через 18 часов культивирования (переход в стационарную стадию роста культуры), при этом в культуральных средах достигались конечные концентрации 1,5 μМ и 2 μМ. Непосредственно после внесения, а также через 3 и 6 часов после добавления нитрофенида стерильно отбирались пробы культур для измерения оптической плотности культур и выживаемости клеток методом Коха. Для каждой экспериментальной точки был сделан контроль (культура клеток, выращенная до той же стадии роста и в тех же условиях, но без добавления ингибитора). Для исследования выживаемости клеток применяли метод Коха [14]. Для каждой экспериментальной и каждой контрольной точки посев выполнялся в трех повторностях. Чашки термостатировались при + 28 °С в течение 24 ч, после чего производился подсчет колоний. Результаты. Оптическая плотность культуры измерялась у клеток, обработанных нитрофенидом в концентрации 2 μМ. У культур, выращенных при pH 9.0, оптическая 137 плотность возрастала с течением времени, как в опыте, так и в контроле. У клеток, выращенных при pH 4.0 и 5.5, оптическая плотность в опыте значительно не изменялась с течением времени, в то время как у контрольных культур она прогрессивно увеличивалась, и к 24 ч достигала контрольных значений, соответствующих стационарной стадии роста (Рис. 1). Рисунок 1. Оптическая плотность культур Y. lipolytica, выращенных при различных pH и концентрации нитрофенида 2 μМ. Рисунок 2. Выживаемость клеток Y. lipolytica при обработке нитрофенидом. Выживаемость клеток, выращенных при различных значениях pH, также сильно варьировала. При обработке нитрофенидом в концентрации 2 μМ выживаемость клеток, выращенных при pH 5.5, снижалась по отношению к контролю до 81 % за 3 часа и на 27 % за 6 часов; при pH 4.0 — до 20 % и до 10 % соответственно; при pH 9.0 — до 88 % и 86 % соответственно. При обработке нитрофенидом в концентрации 1,5 μМ выживаемость клеток, выращенных при pH 4,0, снижалась по отношению к контролю за 3 часа и 6 часов до 45 % и 10 % соответственно. Выживаемость клеток, выращенных при pH 9,0 по отношению к контролю в данных условиях не снижалась (Рис. 2). Кроме того, в ходе эксперимента было сделано следующее наблюдение: после внесения ингибитора в клеточные культуры в них развивалась интенсивная желто-оранжевая окраска, что могло свидетельствовать о восстановлении -S-S-связи в структуре нитрофенида с образованием окрашенных продуктов при участии восстановленного глутатиона. При этом у культур, выращенных при pH 5.5 и 4.0, эта окраска сохранялась неизменной в течение опыта. У дрожжей, выращенных при pH 9.0, к концу культивирования окраска пропадала, что могло косвенно свидетельствовать о расходовании восстановленного глутатиона и высокий вклад глутатионовой системы в адаптационный потенциал Y. lipolytica. 138 Вывод. Таким образом, на данном этапе работы можно сделать вывод о том, что маннит играет важнейшую роль для поддержания жизнеспособности клеток Y. lipolytica нормальных и кислых условиях. В щелочных условиях метаболизм клеток подвергается значительным изменениям, где наиболее важную роль приобретает комплекс антиоксидантных ферментов и, как мы предполагаем, глутатионовая система антиоксидантной защиты клеток. 1. Coelho M.A.Z., Amaral P.F.F., Belo I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. / Ed. Mendes-Vilas A. Bandajos: FORMATEX RC, 2010. P.930 – 944. 2. Epova E., Guseva M., Kovalyov L., Isakova E., Deryabina Y.,Belyakova A., Zylkova M., Shevelev A. Identification of proteins involved in pH adaptation in extremophile yeast Yarrowia lipolytica. / Ed. Heazlewood J.L. Petzold C.J., Man T.-K. Flores R.J. Rijeka: INTECH, 2012. P. 209 – 224. 3. Solomon S.P., Waters O.D.C., Oliver R.P. // TRENDS in Microbiology. 2007. V. 15. N. 6. P. 257 – 262. 4. Феофилова Е.П., Усов А.И., Мысякина И.С., Кочкина Г.А. // Микробиология. 2014. Т. 83. № 3. С. 271 – 283. 5. Sekova V., Isakova E.P., Deryabina Y. I. Mannitol Protects Alkalophillic Yeast of Yarrowia lipolytica against Unfavourable Conditions (постерная сессия – постер P190) 10th International Congress on Extremophiles, Saint Petersburg, Russia, September 7-11, 2014, P. 329 6. Гесслер Н.Н., Аверьяноа А.А., Белозерская Т.А. // Биохимия. 2007. Т. 72. В. 10. С. 1342 – 1364. 7. Smirnoff N., Cumbes Q.J. // Phytochemistry. 1989. V. 28 P. 1057 – 1060. 8. Аверьянов А.А., Лапикова В. П. // Биохимия. 1989. Т. 54. В. 10. С. 1646 – 1651. 9. Hult K., Gatenbeck S. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 88. P. 607 – 612. 10. Jennings D.H. // Adv. Microb. Physiol. 1984. V. 25, 149 – 193. 11. Schmatz D.M. // Parasitol Today. 1989. V.5. N. 7. P. 205 – 208. 12. Allocco J.J., Nare B., Myers R.W., Feiglin M., Schmatz D.M., Profous-Juchelka H. // J. Parasitol. 2001. V. 87. N. 6. P. 1441 – 1448. 13. Секова В.Ю., Гесслер Н.Н., Исакова Е.П., Антипов А.Н., Дергачева Д.И., Днрябина Ю. И., Трубникова Е.В. // ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ. 2015. Т. 51. № 6. С. 1 – 8. 14. Бирюкова Е.Н., Меденцев А. Г., Аринбасарова А. Ю., Акименко В. К. // Микробиология. 2007. Т. 76, N 2. С. 184 – 190. 139 ДЕЙСТВИЕ ЗЕЛЕНОГО СВЕТА НА ОБРАЗОВАНИЕ БИОМАССЫ И ФЕРМЕНТОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫМИ ГРИБАМИ Л. О. Соколянская, Л. Б. Глухова, Е. В. Плотников, О. В. Карначук, H. Vélëz, Р. А. Карначук Национальный исследовательский Томский государственный университет, Томск, Россия Грибы являются важными биотехнологическими агентами. Культивирование съедобных грибов представляет значительный сектор особенно в экономике стран Азии. Различные группы грибов используют как продуценты лекарственных препаратов, ферментов, а также для биоремедиации и проведения биогеотехнологических процессов. Хорошо известно, что свет различной длины волны может контролировать процессы роста и развития у растений. Присутствие рецепторов синего и красного света было показано и для различных таксонов грибов. В настоящее время из литературы известно о попытках использовать свет различной длины волны для увеличения биомассы грибов-продуцентов. Традиционно, основное внимание уделяют синему и красному спектрам. Наши исследования посвящены изучению влияния зеленого света на рост и образование ферментов различными грибами, имеющими потенциал для использования в биотехнологиях. В данном сообщении будут представлены результаты изучения влияния зеленого света на базидиомицеты: Lentimua edodes W4, Ganoderma lucidum 34D и Grifola frondosa PA-oak, используемым в пищевой промышленности и традиционной медицине в Азии, а также ацидофильным, металл-толерантным аскомицетом Penicillium sp. ShG4. Последний был выделен из отходов добычи полиметаллических руд и является перспективным агентом получения соединений меди. В качестве источника света использовали не только люминесцентные лампы и светодиоды, но и узкополосный лазер с длиной волны 532 нм. Скорость образования биомассы была изучена как при поверхностном, так и при глубинном культивировании. Объектом исследования также служили экстрацеллюлярные лигнолитические полифенолоксидазы, включая лакказы (Lcc, EC 1.10.3.2) и пероксидазы (Per, EC 1.11.17 и MnP, EC 1.11.1.13). Наши результаты свидетельствуют, что зеленый свет может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие на образование биомассы грибами. Действие света видоспецифично и зависит от продолжительности экспозиции. В отличие от синего света, зеленый свет не влиял на активность марганецпероксидаз и ингибировал лакказы. Импульсный свет также может стимулировать и образование биомассы. 140 Для определения механизмов действия света нами предприняты попытки получения мутантных линий L. edodes с использованием Agrobactreium tumefaciens. Хотя геном L. edodes до сих пор не доступен в базах данных, однако наличие транскриптомов позволит локализацию возможных механизмов, связанных с влиянием света на нокаутные мутанты. Исследование выполнено за счет средств гранта Правительства РФ, № договора 14.Z50.31.0011. ХАРАКТЕРИСТИКА И РОЛЬ ГЛЮКОКИНАЗЫ ИЗ ОБЛИГАТНОГО МЕТАНОТРОФА METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z Н. П. Солнцева, О. Н. Розова, И. И.Мустахимов, В. Н.Хмеленина, Ю. А.Троценко Лаборатория радиоактивных изотопов Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия e-mail:natalia.solntseva.nn@gmail.com Галотолерантный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z ассимилирует углерод метана через рибулозомонофосфатный (РМФ) путь и накапливает в качестве одного из осмопротекторов сахарозу. Первичным продуктом в РМФ пути является фруктозо-6-фосфат, который включается в дальнейший метаболизм посредством гликолиза и/или пути Энтнера-Дудорова. Поскольку облигатные метанотрофы не растут на сахарах, первая реакция классических путей Энтнера-Дудорова и Эмбдена-МейергофаПарнаса – фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата, катализируемая глюкокиназой и/или гексокиназой, не является необходимой. Тем не менее, анализ аннотированного генома выявил присутствие гена glu, кодирующего предполагаемую глюкокиназу (ГК) у M. alcaliphilum 20Z и других метанотрофов I типа. Целью данной работы явилось получение и изучение свойств рекомбинантной глюкокиназы из облигатного метанотрофа M. alcaliphilum 20Z. Ген glu M. alcaliphilum 20Z был клонирован в вектор pET22b+ и экспрессирован в E. coli BL21(DE3). Рекомбинантная глюкокиназа очищена аффинной металл-хелатной хроматографией на колонке с Ni2+-NTA-агарозой до электрофоретически гомогенного состояния. Глюкокиназа M. alcaliphilum 20Z — гомодимер с молекулярной массой 141 субъединицы ~ 35 кДа, имеет оптимумы активности при рН 9,5–10,0 и температуре 60 °С. Фермент строго специфичен к АТФ как донору и глюкозе как акцептору фосфатной группы. (Ki для Продукт реакции АДФ = 2,34 ± 0,56 мМ); АДФ такие ингибировал метаболиты, как его активность фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-бисфосфат, эритрозо-4-фосфат, рибозо-5-фосфат, ФЕП, пируват, АМФ, ФФн, Фн, цитрат, глицерат, лактат, малат, оксалоацетат не оказывали значительного влияния на активность глюкокиназы. Активность фермента зависела от ионов Mg2+ (Кm = 0,38) или Mn2+ (Кm = 0,40), однако катионы Na+, Co2+, Ba2+, Ca2+, Zn2+ или Cu2+ не оказывали существенного влияния. Активность глюкокиназы подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен (Km для глюкозы = 0,21 ± 0,02 мМ, для АТФ = 0,3 ± 0,05 мМ). Максимальная скорость реакции Vmax составила 131 Е/мг белка. В присутствии АДФ Vmax = 129 Е/мг белка, Km для АТФ = 0,56 мМ. Филогенетический анализ выявил, что глюкокиназа M. alcaliphilum 20Z относится к группе A семейства гексокиназ и проявляет 60 % идентичности транслированных аминокислотных последовательностей с ферментами бактерий рода Methylomonas, а также Methylovulum miyakonense, Methylobacter tundripaludum, Methyloglobulus morosus, Thiothrix nivea и Thiomicrospira kuenenii, и менее 50 % с глюкокиназами из других гаммапротеобактерий. Примечательно, что нокаут-мутанты по гену glu имели меньшую скорость роста в сравнении с диким типом, особенно при росте на метаноле. После нескольких пересевов мутанты гибли, что свидетельствует о важной роли глюкокиназы в метаболизме M. alcaliphilum 20Z. Метанотрофы ассимилируют углерод на уровне окисленности формальдегида. При использовании метанола в качестве субстрата лимитирующая стадия роста — окисление СН4 метанмонооксигеназой, отсутствует, что, в свою очередь, приводит к избытку углерода и цитотоксичного формальдегида, а также сопровождается активным синтезом сахарозы. Недавно было показано, что помимо ферментов синтеза сахарозы у M. alcaliphilum функционирует амилосахараза, расщепляющая сахарозу до фруктозы и глюкозы. Фруктоза далее метаболизируется с участием ранее изученной фруктокиназы (Бут с соавт., 2012), а глюкоза вовлекается в дальнейший метаболизм посредством фосфорилирования глюкокиназой. Таким образом, можно полагать, что в клетках метанотрофа функционирует путь реутилизации сахарозы, в котором глюкокиназа играет важную роль, обеспечивая устойчивость к метанолу. Работа поддержана грантами РНФ №14-14-01045 и РФФИ №13-04-01119-а. 142 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФАГОВОЙ ИНФЕКЦИИ В УСЛОВИЯХ ПРОТИВОДЕЙСТВИЯ CRISPR-CAS СИСТЕМОЙ А. В. Строцкая 1, Е. Е. Савицкая 2, К. В. Северинов 1,2 1 2 Институт молекулярной генетики РАН, Москва, Россия Сколковский институт науки и технологий, Москва, Россия CRISPR-Cas-системы (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins) представляют собой адаптивный защитный механизм прокариот, направленный против чужеродных ДНК и РНК, в частности, бактериофагов и плазмид. Основу данных систем составляют CRISPR-кассеты ДНК и находящиеся в непосредственной близости от них cas-гены. CRISPR-кассеты состоят из повторов длиной от 21 до 48 п.о., разделенных различающимися участками (спейсерами) сходной длины. CRISPR-кассета транскрибируется, а затем транскрипт-предшественник процессируется с образованием коротких крРНК, каждая из которых содержит один спейсер и фрагменты фланкирующих повторов. Последовательность многих спейсеров комплементарна фрагментам чужеродной ДНК или РНК. В ходе защитной реакции (CRISPR-интерференции) комплекс Cas белков вместе с крРНК узнает комплементарный спейсеру участок чужеродной ДНК (так называемый протоспейсер), что вызывает ее деградацию. CRISPR-система также обладает способностью направленного включения в CRISPR-кассету фрагментов чужеродного генетического материала, становящихся новыми спейсерами (CRISPR адаптация). В данной работе было проведено изучение модельных систем бактерияхозяин/бактериофаг-паразит с применением современных междисциплинарных методов анализа, таких как высокоэффективное секвенирование, биоинформатика, Нами был разработан и апробирован метод, с помощью которого можно в ходе одноступенчатого эксперимента получить новые штаммы E. coli, CRISPR-кассеты которых содержат спейсеры из интересующего участка генома конкретного фага. Наличие такой системы позволило создавать штаммы, способные осуществлять CRISPRинтерференцию против самых разных мобильных генетических элементов не прибегая к технически сложному и длительному методу рекомбиниринга. В ходе работы с использованием описанного метода на базе штамма E. сoli KD263 был получен набор штаммов, способных к индуцибельной экспрессии cas генов и содержащих CRISPR-спейсеры, соответствующие протоспейсерам в различных местах геномов бактериофагов Т4 (16 штаммов), λ (9 штаммов) и Т5 (20 штаммов). 143 Сравнительная характеристика эффективности CRISPR-интерференции и CRISPR-адаптации созданных штаммов, специфичных к различным фагам показала: при заражении бактериофагом Т4 выявлен невысокий уровень 1) а CRISPR-интерференции, таргетирующих не (т. е. среди бляшек, имеющих обнаруживалось образуемых фагом соответствующий бляшек фагов-эскейпов, на спейсер) т. е. с газонах клеток, мутациями в последовательностях протоспейсеров, соответствующих CRISPR-спейсерам или прилегающих к ним последовательностям PAM. при заражении фагом λ наблюдался высокий уровень CRISPR- 2) интерференции для всех штаммов с соответствующими спейсерами. В случае двух из семи таргетирующих штаммов были обнаружены бляшки фагов-эскейпов, имеющие нуклеотидные протоспейсеров. При CRISPR-адаптацию. замены в заражении Анализ последовательностях этими мутантными удлиненной соответствующих фагами наблюдали CRISPR-кассеты методом высоко-эффективного секвенирования показал, что эффективность встраивания новых спейсеров постепенно падает при удалении от протоспейсера, причем градиент несимметричный: перед протоспейсером он угасает медленнее, чем после него. 3) для фага Т5 были получены штаммы со спейсерами против различных областей генома: предранних (9 штаммов), ранних (5 штаммов) и поздних (6 штаммов). Особенностью фага Т5 является двуступенчатый ввод ДНК внутрь заражаемой клетки. После инъекции первых 10 т.п.о. генома, содержащих предранние гены, наступает пауза, после которой на второй фазе инфекции в зараженную клетку входит оставшаяся часть генома фага. После синтеза и накопления предранних белков ДНК хозяина деградирует. Можно предположить, что в штаммах со спейсерами против ранних и поздних генов Т5 фага CRISPR-ответ будет неэффективен, так как зараженная клетка не выживет даже в случае подавления инфекции. Действительно, в штаммах, несущих спейсеры из ранней и поздней областей генома фага, CRISPR-интерференции не наблюдалось. Однако, эффективную CRISPR-интерференцию наблюдали для штаммов, несущих спейсеры против предранней области. Среди отобранных 11 клонов бактериофагов-эскейпов с единичными мутациями в протопейсерах в предранней области один был способен вызывать адаптацию в зараженных клетках. Полученные в результате CRISPR-адаптации в культуре при заражении Т5-эскейпом новые спейсеры 144 были проанализированы методом высоко-эффективного секвенирования. Были определены позиции протоспейсеров, давших начало новым спейсерам. Оказалось, что новые спейсеры, расположенные после праймирующего протоспейсера, приобретались из той же цепи, на которой располагался праймирующий протоспейсер, а большинство спейсеров, лежащих до него, приобретались из противоположной цепи. При этом количество приобретенных новых спейсеров при удалении в обе стороны от праймирующего протоспейсера снижалось. Таким образом, адаптация происходила по «праймированному механизму». Интересно, что все приобретенные спейсеры происходили из участка генома, который вводится в клетку на первой стадии инфекции, еще раз подтверждая сделанное выше предположение о неэффективности CRISPR-защиты против средних и поздних генов Т5. Участок, из которого приобретались новые спейсеры из ДНК Т5 фага гораздо короче, чем соответствующий участок в случае адаптации при заражении фагом λ таргетирующих его клеток. Скорее всего, эта разница связана с ограниченным временем первой стадии инфекции Т5, после которой действие CRISPR-Cas-системы прекращается из-за разрушения клеточной ДНК. Таким образом, в ходе данной работы был успешно апробирован новый метод быстрого получения штаммов с CRISPR-спейсерaми, специфичными к различным участкам чужеродной ДНК, определены особенности СRISPR-интерференции и СRISPR-адаптации в зависимости от конкретных бактериофагов с индивидуальными стратегиями развития, что создает базу для дальнейшего изучения влияния CRISPR-Cas-системы на взаимодействие клеток E. coli с самыми разными мобильными генетическими элементами. 145 АНТИБИОТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ИНА-№1149: ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ М. А. Суконников 4, О. А. Лапчинская 1, А. В. Тимофеева 2, П. В. Кудан 5, Л. Г. Стоянова 3, В. Н. Ташлицкий 4 1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе», Москва, Россия 2 3 НИИ ФХБ имени А. Н. Белозерского МГУ, Москва, Россия Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова, Москва, Россия 4 Химический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова, Москва, Россия 5 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт питания», Москва, Россия. Открытие в середине прошлого столетия антибиотиков, обладающих высокой антимикробной активностью, стало одним из важнейших событий XX столетия. Однако на сегодняшний день все нарастающая проблема антибиотикорезистентности — устойчивости бактерий ко многим известным и широко используемым в клиниках антибиотикам вызывает огромные опасения в мировом сообществе ученых. Решением данной проблемы является поиск новых природных антибиотиков обладающих высокой антимикробной активностью в отношении устойчивых штаммов микроорганизмов. Одним из таких новых антибиотиков, скрининг, которого был проведен в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе, является антибиотический комплекс № 1149. Он образуется в культуральной жидкости (КЖ) мутантного штамма-продуцента Streptomyces sp. № 1149 [1]. Настоящая работа посвящена исследованию компонентного состава субстанции, выделенной из КЖ штамма-продуцента Streptomyces sp. и именуемой антибиотический комплекс № 1149, а также определению антимикробной активности входящих в его состав индивидуальных компонентов. С помощью специализированной программы AutoChrom (ACD/Labs) смесь антибиотического комплекса №1149 удалось в оптимизированных изократических условиях [2]. 146 разделить методом ОФ ВЭЖХ Trace, 363 nm 1149-1 1149-1 40 35 30 1149-3 1149-3 15 10 1149-6 1149-6 20 1149-4 1149-4 1149-5 1149-5 1149-2 1149-2 25 5 363nm 0 260nm -5 -10 214nm -15 -20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Retention Time (min) Рисунок 1. Хроматограмма разделения на фракции анабиотического комплекса №1149. Изократические условия: элюент — 0.05 % ТФУ в 30 % ацетонитриле, колонка Luna C18(2) 4.6*250 mm (5 um), скорость потока 1 мл/мин, температура 25 °С. Объем инжекции: 50 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл. Методом MALDI-TOF (1) в режиме положительных ионов (М+Н)+ определены массы компонентов содержащихся в составе выделенных с помощью ВЭЖХ 6 фракций (см. Таблица 1). При масс-спектрометрическом исследовании исходной смеси антибиотика № 1149 методом ESI-MSn высокого разрешения (2) были выявлены 8 компонентов, которые с целочисленными содержат, массами в 14 а.е.м., разных вариантах, 71 а.е.м.,132 а.е.м., три заместителя соответствующими: CH2-метильной группе, C3H5ON- остатку аминокислоты (наиболее вероятно — аланину), C5H8O4 — остатку углевода (пентозы). Предполагаемые структуры компонентов (представленные в виде условных обозначений) и полученные их моноизотопные массы представлены в Таблице 1. 147 Таблица 1. Результаты, полученные методами MALDI-TOF (1) и ESI-MSn (2) № фракции (1) Наблюдаемые ионы (М+Н) компонентов в пиках в порядке убывания интенсивности пиков, Да 1 1917.6 2 1846.7 3 1785.5 1931.7 1799.5 4 1931.4 1714.4 5 1714.4 1945.4 6 1860.4 1728.4 1903.0 (2) Предполагаемые структуры* и их массы, Да 132-X71 1916,82587 132-X 1845,78837 71-X 132-X(14)-71 1784,78287 X 132-X14 1713,74533 1931.5 1945.4 1799.5 1860.4 1992.4 X-(14)71 1798,79779 X-14 1727,76003 1930,83979 1859,80353 *Х условное обозначение молекулы компонента, не содержащего выявленных заместителей (СН2-, С3Н5ОN-, C5H8O4), а численные значения (14, 71, 132) — молекулярную массу заместителей, присутствующих в данном компоненте. Как видно из данных, представленных в Таблице 1, предполагаемые структуры, выявленные методом (2) объясняют большую часть массовых пиков установленных методом (1). Исследование антимикробной активности исходной смеси антибиотического комплекса №1149 и выделенных 6-ти фракций показало, что смесь и все 6 фракций обладали активностью как в отношении грам-положительной бактерии Micrococcus flavus NCTC 8340 (диаметр зоны подавления роста 8-18 мм), так и в отношении грам-отрицательной Proteus vulgaris 206 (диаметр зоны подавления роста 7-15 мм). Антибиотик не проявляет антифунгальной активности в отношении Aspergillus niger INA 00760 и Candida albicans INA 00763. Таким образом, наиболее перспективной для дальнейшего исследования структуры нового антибиотика является фракция №2, в состав которой входит только один компонент имеющей структуру, обозначенную как 132-Х; активный в отношении бактерии Micrococcus flavus (диаметр зоны подавления роста 10 мм) и менее активный по отношению Proteus vulgaris (диаметр зоны подавления роста менее 7 мм). 1. А.В.Тимофеева, О.А.Лапчинская, Е.А.Степашкина, Е.Г.Гладких, В.В.Погожева, Л.А.Баратова, Г.С.Катруха // Биотехнология – 2012 - №4 – с.1–7. 2. В.Н.Ташлицкий, Д.А.Царев, Э.М.Казьмина лекарственных средств – 2013 – №1(2) - с. 38-44 148 // Разработка и регистрация ПОЛИФАЗНЫЙ ПОДХОД К СИСТЕМАТИКЕ ПРОТОСИФОНАЛЬНЫХ ЗЕЛЕНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ А. Д. Темралеева 1,2, С. В. Москаленко 1, С. А. Дронова 1,2, Ю. М. Бачура 3, Ю. С. Букин 4 1 Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия 2 Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, Россия 3 Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины, Гомель, Белоруссия 4 Лимнологический институт РАН, Иркутск, Россия Согласно современным представлениям для идентификации водорослей необходимо использовать полифазный подход, который наряду с молекулярно-генетическим данными учитывает морфологические, экологические и другие характеристики (Pröschold, Leliaert, 2007). Благодаря такому подходу за последнее время была не только выявлена полифилия ряда крупных родов зеленых водорослей (Bracteacoccus, Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Chlorosarcinopsis, Tetracystis и др.), но и описаны новые таксоны (Bracteamorpha, Chloroidium, Desertella, Eremochloris, Polulichloris, Rotundella, Tumidella, Xerochlorella, Xylochloris и др.). Порядок Protosiphonales Ettl et Komarek (1982) в расширенной трактовке И.Ю. Костикова с соавт. (2001) объединяет зеленые микроводоросли, преимущественно обитающие в почвах. С точки зрения молекулярной систематики все представители порядка объединены в кладу Stephanosphaerinia внутри класса Chlorophyceae (Nakada et al., 2008). Для них характерно бесполое размножение голыми или покрытыми жесткой клеточной стенкой зооспорами с двумя жгутиками равной длины, гиперсинтез вторичных каротиноидов, различные типы организации таллома, хлоропластов и пиреноидов, а также одноядерные и многоядерные вегетативные клетки. Таким образом, данная группа является морфологически разнообразной и широко распространенной в наземных экосистемах. Слабая разработанность систематики группы и трудность идентификации ее представителей определила интерес к данному исследованию, целью которого являлось описание и классификация зеленых микроводорослей порядка Protosiphonales на основе полифазного подхода. Объекты и методы. В работу были включены аутентичные и дикие штаммы протосифональных зеленых водорослей, полученные из альгологической коллекции ACKU (Киев, Украина) и выделенные из серой лесной и каштановой почвы территории 149 России. Выделение водорослей из почвы и дальнейшее культивирование проводили на среде BG11 с азотом (1 % агар, pH = 7.0) в климатостате при температуре + 23-25 °С, освещенности 2000 Лк и световом режиме 12 : 12 ч. Изучение морфологии и жизненного цикла штаммов проводили методами световой микроскопии (светлое поле и интерференционный контраст) с помощью микроскопов Leica DM750 и Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия). Сроки наблюдения составляли от 12 часов до 6 месяцев. ДНК выделяли из альгологически чистых культур с помощью коммерческого набора для колоночного выделения ДНК из растений «DNeasy Plant Mini Kit» (Qiagen, США). ПЦР проводили, используя коммерческие готовые смеси ScreenMix-HS и набор реактивов «Encyclo Plus PCR kit» (Евроген, Россия). Праймеры и условия ПЦР для амплификации фрагментов ядерного гена 18S рРНК и хлоропластного гена rbcL использовали из работ Катана с соавт. (Katana et al., 2001) и Макманус и Левис (McManus, Lewis, 2011), соответственно. Детекцию ПЦР-продуктов проводили методом гель-электрофореза (1 %-ный агарозный гель) с дальнейшей очисткой с помощью колоночного набора Cleanup Mini (Евроген, Россия). Секвенирование нуклеотидных последовательностей осуществляли в компании «Синтол» (Москва, Россия). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполняли по алгоритму ClustalW (BioEdit), для выбора модели нуклеотидных замен использовали программу jModelTest. Филогенетические деревья на основе расшифрованных последовательностей ДНК реконструировали методом максимального правдоподобия (phyML) и баесовским методом (Mr. Bayes 3.1). Для оценки достоверности топологии деревьев применяли бустсреп-анализ (1000 повторностей) и расчет апостериорных вероятностей, соответственно. Кроме того, для построения опубликованные классификационной данные последовательности в (статьи GenBank) с и системы дополнительно первоописанием собственные таксонов, наблюдения за использовали нуклеотидные морфологией 4-х аутентичных штаммов: Chlorococcum oleofaciens ACKU 542-06, Chlorococcum sphacosum ACKU 673-06, Neospongiococcum gelatinosum ACKU 631-06, Spongiochloris spongiosa ACKU 649-06. Результаты и обсуждение. На основе полифазного подхода, используя молекулярногенетический, морфологический и экологический анализы, мы выделили в порядке Protosiphonales (= клада Stephanosphaerinia) две клады, которые могут соответствовать семействам в традиционной систематике. В первую кладу входят представители зеленых протосифональных водорослей, зооспоры которых имеют жесткую оболочку и не изменяют свою форму после остановки. К ним относятся Chlamydopodium vacuolatum, C. starrii, Neospongiococcum gelatinosum, N. sp., Chlorococcum oleofaciens, 150 Ch. sphacosum, Ch. robustum, Ch. ellipsoideum, Pleurastrum insigne, Nautococcus minutus, N. solutus, Stephanosphaera pluvialis. Они обладают следующими морфологическими характеристиками: одиночные или колониальные водоросли с коккоидной, монадной или гемимонадной организацией таллома. Хлоропласт один, пристенный (мантиевидный, полый шаровидный, чашевидный, лопастной) или центральный (сетчатый или массивный). Пиреноид один со сплошной крахмальной обверткой. Клетки одноядерные. Оболочка способна утолщаться с возрастом культуры, приобретать концентрическую слоистость, у некоторых видов образует ножку или слизистый колпачок. Зооспоры с жесткой оболочкой, неметаболичные. Данные о способности к синтезу вторичных каротиноидов для большинства видов отсутствуют. Морфологическое разделение родов внутри клады может быть основано на типе хлоропласта, форме вегетативных клеток; видов — на размерах вегетативных клеток или зооспор, толщине слизистой оболочки. Во вторую кладу порядка вошли представители зеленых протосифональных водорослей, зооспоры которых «голые», т. е. не имеют жесткой оболочки, после прекращения движения Chlorosphaeropsis округляются. alveolata, К Spongiochloris ним относятся spongiosa, Protosiphon botryoides, Chlorosarcinopsis aggregata, C. bastropiensis, C. dissociata, Chlorochytrium lemnae, Ch. hypanicus, Spongiosarcinopsis terrestris gen. et sp. nov. (новый таксон, выделенный авторами из серой лесной почвы и описанных на основе данных морфологии, экологии, 18S рРНК и rbcL). Они обладают следующими морфологическими признаками: одиночные водоросли с сифональным, сарциноидным одно- и или коккоидным многоядерные. типом Хлоропласт организации один, таллома. пристенный Зрелые (полый клетки шаровидный) или центральный (сетчатый или губчатый). Пиреноид один со сплошной крахмальной обверткой или много с фрагментированными крахмальными обвертками. Зооспоры голые, метаболичные. У большинства видов описан гиперсинтез вторичных каротиноидов. Морфологическое разделение родов внутри клады может быть основано на типе организации таллома, типе хлоропласта, количестве ядер; видов — на размерах зооспор. Виды Chlorococcum diplobionticum, Deasonia multinucleata и Tetracystis tetraspora, были отнесены нами к группе Protosiphonales incertae sedis, т.к. имеют неопределенное и неустойчивое положение на филогенетическом дереве. Видовая идентификация Chloromonas perforata, Chlorosarcinopsis minor и Gongrosira papuasica, нуклеотидные последовательности генов которых были взяты нами из GenBank, сомнительна. Для уточнения данных молекулярно-генетических и вопросов требуется морфологических 151 проведение исследований. дальнейших Таким образом, в результате исследования были изучены члены порядка Protosiphonales, описан новый для науки род зеленых водорослей — Spongiosarcinopsis terrestris, осуществлен поиск и анализ новых морфологических признаков, ранее не применявшихся в систематике изучаемой группы. Благодарности. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15-54-04002 бел_мол_а. ВЛИЯНИЕ ТРИС(ГИДРОКСИМЕТИЛ)АМИНОМЕТАНА И ИОННОГО СОСТАВА СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ Е. О. Титанова 1, Г. Л. Бурыгин 2 1 Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия 2 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) компонент буферных систем, широко применяемых в биохимических и микробиологических исследованиях для стабилизации pH растворов и сред в диапазоне значений от 7,0 до 9,0 (Gomori, 1955; Leivy et al., 1968). При этом Трис не является инертным соединением по отношению к клеткам и их метаболитам. Например, Трис может взаимодействовать с ферментами, снижая их активность (Ghalanbor et al., 2008); влиять на проницаемость мембран, нарушая ионные взаимодействия (Irvin et al., 1981) и пр. Ранее нами было показано, что добавление Трис в среду культивирования бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Km018 приводит к снижению (для Sp245) или почти полному прекращению (для Km018) взаимодействия их липополисахаридов (ЛПС) с антителами к О-антигену штамма A. brasilense Sp245, при сохранении неизменным продукции антигенов и их моносахаридного состава (Бурыгин с соавт., 2002). Данная работа была посвящена поиску причин изменения антигенности ЛПС штамма Km018 под действием Трис. ЛПС — основной компонент внешней стороны наружной мембраны грам-отрицательных бактерий, состоящий из трёх составных частей: липида А, олигосахаридного кора и О-специфического полисахарида (ОПС). Каждый из компонентов такой макромолекулы в процессе биосинтеза может модифицироваться. Например, липид А и моносахаридные остатки кора часто фосфорилированы, а отдельные моносахаридные остатки ОПС могут метилироваться, ацетилироваться или подвергаться 152 другим изменениям. Имеется информация о присутствии в ЛПС некоторых штаммов азоспирилл сульфатных остатков (Vanbleu et al., 2005). Антигенные свойства ЛПС определяются структурой ОПС и, намного реже, кора. При этом любые модификации компонентов, входящих в состав антигенных детерминант, кардинальным образом сказываются на способности взаимодействовать со специфическими антителами. В связи с тем, что Трис в среде культивирования бактерий является катионом, способным связываться с компонентами среды, диссоциирующими с образованием анионов, нами было исследовано влияние на антигенные свойства бактерий удаление из среды или, наоборот, значительное повышение содержания сульфат-ионов и фосфатионов. Культура штамма A. brasilense Km018 культивировалась 18 часов в соответствующих жидких питательных средах с последующим анализом антигенных свойств клеток и ЛПС методами иммуноферментного и иммунодиффузионного анализов. При культивировании бактерий на средах с различным ионным составом было установлено полное ингибирование в присутствии Трис роста культуры только в варианте с дефицитом фосфат-ионов. Данный эффект может быть связан с взаимодействием Трис с фосфатами, приводящим к исчезновению доступного для бактерий фосфора, необходимого для их жизнедеятельности. На среде без Трис и без фосфатов наблюдался сниженный рост культуры (за счёт фосфатов, внесённых с инокулятом). При этом в иммунодиффузионном анализе ЛПС клеток из этого варианта с антителами выявлено значительное снижение интенсивности полосы преципитации. В средах, содержащих Трис, незначительное повышение содержания фосфатов приводит к возобновлению роста культуры бактерий, а значительное увеличение концентрации фосфат-ионов (двукратное) к нивелированию действия Трис по снижению антигенных свойств клеток. Изменение содержания сульфат-иона в средах культивирования бактерий оказывало подобное фосфатам, но менее значительное влияние на антигенные свойства клеток, детектируемое в иммуноферментном анализе, но не в иммунодиффузии. В результате проведённых исследований сделан вывод об активном влиянии Трис на процессы фосфатирования (и возможно, сульфатирования) поверхностных антигенов бактерий, что необходимо учитывать при изучении этих и при культивировании микроорганизмов в средах, содержащих Трис. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Бурыгин с соавт. (2002) Прикл биохим микробиол, 38 (3): 292-294. Ghalanbor et al. (2008). Protein Peptide Lett, 15(2): 212-214. Gomori (1955). Method Enzymol, 1: 138-146. Irvin et al. (1981). J Bacteriol, 145: 1397-1403. Leive et al. (1968). J Biol Chem, 243: 6384-6391. Vanbleu et al. (2005). Environ Microbiol 7(11): 1769-1774. 153 процессов ВЫДЕЛЕНИЕ НОВОГО АЦИДОФИЛЬНОГО САХАРОЛИТИЧЕСКОГО DESULFOSPOROSINUS, РАСТУЩЕГО В МИКРОАЭРОФИЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ Т. С. Фёдорова, А. А. Захарова, Д. А. Ивасенко, А. Л. Герасимчук, М. Р. Авакян, О. В. Карначук Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томский государственный университет, Томск, Россия Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) известны как группа микроорганизмов перспективная для осаждения металлов. Промышленные стоки, содержащие тяжелые металлы, часто характеризуются низким рН. Причиной высокой концентрации протонов служат процессы окисления остаточных сульфидов в отходах добычи металлов. Это явление известно под названием кислого шахтного дренажа. К настоящему времени валидно описано только два ацидофильных СРБ. Оба принадлежат к роду Desulfosporosinus. Несколько не идентифицированных ацидофильных СРБ, относящихся к этому роду, было описано нашей группой (Karnachuk et al., 2009; Карначук и др., 2015). Ацидофильный Desulfosporosinus sp. OT был первым видом рода, для которого была определена последовательность генома (Abicht et al., 2011). Характерной особенностью Desulfosporosinus является их нестабильный рост. Несмотря на то, что в нашей лаборатории выделено и на протяжении многих лет поддерживается несколько ацидофилов из этой группы, ни один из этих организмов не удавалось вырастить в биореакторе. Одной из возможных причин может также быть строго анаэробный характер роста известный для всех описанных к настоящему времени Desulfosporosinus. Наши поиски были направлены на выделение менее чувствительного к кислороду воздуха изолята ацидофильного СРБ. Для выделения были использованы пробы воды из карьера по добыче сульфидных руд на месторождении Шерловая Гора в Забайкальском крае. С 1932 г. здесь добывали оловянную руду (кассетирит). В 1995 г. в связи с истощением месторождения Шерловогорский ГОК был закрыт. На террасах бывшего открытого карьера остались неглубокие взрывные скважины (7-12 м), где накапливается вода. Исследование физикохимических параметров воды в скважинах показало, что в воде происходили активные процессы окисления остаточных сульфидов. Концентрация растворенного железа достигала 1916 мг/л, а рН = 2.58. Содержание многих металлов также было высоким (Cu — 98, Zn — 3185, Cd — 18 мг/л). Окислительно-восстановительный потенциал (Eh = +494) свидетельствовал о высоко-окисленных условиях в воде скважины. 50 мл 154 воды из скважины было профильтровано для получения накопительных культур. После отбора проб фильтр хранили в холодильнике в атмосфере воздуха. Накопительная культура СРБ была получена при посеве фильтра на пресноводную среду Видделя (Widdel, Bak, 1992) с использованием фруктозы в качестве донора электронов и рН=2.0. Образование сероводорода и связанное с ним почернение среды наблюдали на 19 сутки культивирования при температуре 28 °С. Чистая культура, была получена при 85 °С на водяной бане в течение 30 минут, с последующим посевом на разведения. В результате была получена морфологически однородная культура, обозначенная как штамм NP. Чистота культуры была подтверждена наблюдением под микроскопом, отсутствием роста на Plate Count Agar и Anaerobic Agar, а также методом разделения ПЦР-амплифицированного фрагмента гена 16S рРНК методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях (PCR-DGGE). Культура представлена подвижными, слегка изогнутыми палочками с округлыми концами размером 2,5 мкм (Рис. 1). Штамм образует овальные споры паратерминально. Минимальный рН, позволяющий рост культуры, составлял 1.28. При этом лаг-фаза увеличивалась до 19 дней по сравнению с 15 сутками на рН = 2.0. Важным свойством штамма был микроаэрофильный рост во флаконах, заполненных средой на 50 % объема с воздушной газовой фазой. Штамм использовал ограниченный спектр доноров электронов. Наиболее интенсивный рост наблюдали на фруктозе и лактате. Меньшая продукцию биомассы была отмечена при добавлении глюкозы, сахарозы и этанола. Штамм не использовал формиат, ацетат, цитрат, сукцинат, бутират, фумарат, пальмитат, глицерол, никотиновую кислоту, пептон, целлюлозу. Анализ последовательности гена 16S рРНК близкой к полной (1446 п.о.) показал, что выделенный штамм относится к филуму Firmicutes, классу Peptococcaceae, роду Desulfosporosinus (Рис. 2). Ближайшим родственником штамма NP был Desulfosporosinus sp. DB, выделенный нами ранее из кислых шахтных дренажей в Кузбассе (Карначук и др., 2009). Штамм показал 97 % сходства последовательности сразу с несколькими валидно описанными Desulfosporosinus, включая D. meridiei, D. orientis, D. Auripigmenti и D. acidiphilus. По сравнению с другими представителями Desulfosporosinus, выделенными ранее из экосистем, связанных с добычей сульфидных руд, штамм NP обладал более низкой устойчивостью к тяжелым металлам. Максимальные концентрации двухвалентных металлов, 175 мг/л Ni2+, 100 мг/л Cd2+ и 100 мг/л Co2+. При этом продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 57 суток на кобальте и до 45 суток на кадмии. Несмотря на относительно невысокую устойчивость 155 к металлам, ацидофильный штамм Desulfosporosinus sp. NP может иметь перспективы для применения в биотехнологиях за счет возможности микроаэрофильного роста и использования сахаров в качестве субстрата. Рисунок 1. Микрофотография тонких срезов клеток Desulfosporosinus sp NP, трансмиссионный электронный микроскоп. Рисунок 2. Филогенетическое положение штамма NP (joining). Узлы дерева, обозначенные кружками, характеризуются значениями бутстреппинга выше 70 %. Исследование было поддержано грантом ФЦП, соглашение № 14.575.21.0067 от 07.08.2014г. Уникальный идентификатор прикладных научных исследований (проекта) RFMEFI57514X0067. 1. Abicht H.K., Mancini S., Karnachuk O.V., Solioz M., // Genome sequence of Desulfosporosinus sp. OT, an acidophilic sulfate-reducing bacterium from copper mining waste in Norilsk, Northern Siberia, J Bacteriol. № 193(21) – 2011 – P. 6104-5. 156 2. Karnachuk O.V., Gerasimchuk A.L., Banks D., Frengstad B., Stykon G.A., Kaksonen A.H., Puhakka J, Ianenko A.S., Pimenov N.V, //. Sulfur metabolite bacteria from waste water of gold miner tale-depot in Kuzbass, Mikrobiologiia. № 78(4) – 2009 – P. 535-44. 3. Karnachuk O.V., Mardanov A.V., Avakyan M.R., Kadnikov V.V., Vlasova M., Beletsky A.V.,Gerasimchuk A.L., Ravin N.V., // Draft genome sequence of the first acid-tolerant sulfate-reducing deltaproteobacterium Desulfovibrio sp. TomC having potential for minewater treatment, FEMS MicrobiolLett. – № 362(4) – 2015. 4. Widdel, F. and F. Bak, F. Chapter 183. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria / Widdel, F. and F. Bak, F. [et al.] // In: The Prokaryotes. – 1992. – № 6. – P. 3352-78. ОБРАЗОВАНИЕ СУЛЬФИДОВ МЕТАЛЛОВ НОВЫМ ТЕРМОФИЛЬНЫМ THERMODESULFOVIBRIO ИЗ ПОДЗЕМНОЙ БИОСФЕРЫ Ю. А. Франк, А. П. Лукина, О. П. Иккерт, М. Р. Авакян, О. В. Карначук Томский государственный университет, Томск, Россия По современным представлениям микроорганизмы глубинной биосферы могут составлять до 19 % общей биомассы Земли (McMahon & Parnell, 2014). Такое многочисленное население глубинных горизонтов под ложем океана и под поверхностью суши должно оставлять заметные геохимические последствия. Микробная сульфатредукция в наземных экосистемах связана с выведением металлов из круговорота за счет образования сульфидов с низкой растворимостью. Учитывая многочисленные сообщения о присутствии сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) в подземной биосфере, можно ожидать формирование биогенных сульфидов металлов и в глубинных экосистемах. Целью настоящего исследования было выделение термофильной СРБ из глубинного водоносного горизонта и изучение ее взаимодействия с металлами. Источником для выделения нового микроорганизма стала подземная термальная вода из водоносного горизонта, сформированного нижнемеловыми отложениями и вскрытого нефтепоисковой скважиной в Томской области на глубине около 2 км. Температура воды на устье скважины составляла 40-43 °С. Первоначально из подземной воды была получена накопительная культура на среде Видделя (Widdel, Bak, 1992) с желатином при 50 °С. После пересева на среду с лактатом и повышения температуры до 70 °С в культуре стали преобладать вибрионы. Для выделения чистой культуры многократно повторяли 157 изолирование отдельно лежащей колонии из столбика плотной питательной среды. Морфологически однородная культура, обозначенная N1, была представлен подвижными вибрионами шириной 0.4 мкм и длиной 1,5-2 мкм. Наиболее активный рост был зафиксирован при температуре 70 °С, менее активный рост - при температуре 50 °С. При 37 °С и при 80 °С рост отсутствовал. Оптимальный рН для роста штамма N1 был сдвинут в щелочную сторону и составлял 8,2-8,5. Для определения филогенетического положения штамма N1 была определена близкая к полной последовательность гена 16S рРНК длиной 1386 пар нуклеотидов. На основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК выделенный штамм отнесен к роду Thermodesulfovibrio из филума Nitrospirae. Ближайшим родственником изолята N1 был Thermodesulfovibrio aggregans со сходством последовательностей 97 % (Рис. 1). К настоящему времени валидно описано 5 видов рода Thermodesulfovibrio (Рис. 1). Все представители выделены из термальных местообитаний, включая ближайшего родственника штамма N1 T. aggregans (Sekiguchi et al., 2008). Рисунок 1. Филогенетическое положение штамма N1 на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК методом neighbor-joining. Точками показаны величины бутстреппинга выше 70 %. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Для оценки устойчивости Thermodesulfovibrio sp. N1 определяли максимальные начальные концентрации ионов двухвалентных металлов и мышьяка, при которых возможен рост штамма. Максимальные концентрации Cd2+, Co2+ и Ni2+, позволяющие рост, не превышали 100, 125 и 175 мг/л соответственно (Таблица 1). Максимальная концентрация меди, 50 мг/л, была ниже, чем известная для модельных СРБ из родов Desulfovibrio и Desulfotomaculum (Karnachuk et al., 2003). Зафиксирован рост исследуемого штамма в присутствии ионов As3- в концентрации 50 мг/л. Устойчивость представителей 158 рода Thermodesulfovibrio к ионам металлов и металлоидов до сих пор не исследовали. Однако известно, что T. hydrogeniphilus может использовать 1 mM арсенат натрия (75 мг/л мышьяка) в качестве акцептора электрона в отсутствие сульфата (Haoari et al., 2008). Для изучения возможной геохимической деятельности Thermodesulfovibrio sp. N1 исследовали осадки, образованные чистой культурой на среде с добавлением кобальта (100 мг/л), никеля (100 мг/л), меди (10 мг/л) и мышьяка (25 мг/л). Образование сульфидов при температуре 70 ºС изучали в различные периоды времени, составлявшие 16-17 и 26-27 суток. Осадки анализировали с использованием сканирующей электронной микроскопии с энергодисперсионным анализом (SEM-EDS) и дифракционного анализа (XRD). Результаты экспериментов показали, что единственными кристаллическими сульфидами, образуемыми штаммом N1, были сульфид меди, халькопирит (CuFeS2) (Рис. 2А) и сульфид мышьяка (Рис. 2В). Интересно отметить, что штамм не образовывал моносульфидов меди, ковеллита и халькоцита, образование которых было показано для Desulfovibrio, устойчивых к меди (Karnachuk et al., 2008). А образование халькопирита требовало более длительного периода времени. Мы не обнаружили кристаллические сульфиды никеля или кобальта, хотя SEM-EDS показал присутствие Co, Ni и S в биогенных осадках. Вероятно, эти сульфиды присутствовали в аморфном состоянии. Таблица 1 Максимальные начальные концентрации металлов и мышьяка для роста Thermodesulfovbirio sp.N1 на среде Видделя с лактатом, 70 °С Металл Предельная концентрация, мг/л Лаг-фаза, сутки Сd2+ 100 18 Co2+ 125 10 Ni2+ > 175 28 Cu2+ 50 14 As3- 50 14 159 А В Рисунок 2. Дифрактограммы осадков, образованных Thermodesulfovibrio sp. N1: (А) на среде с ионами меди (10 мг/л) в течение 16 суток (1) и 26 суток (2); (B) на среде с ионами мышьяка (25 мг/л) в течение 17 суток (1) и 27 суток (2). Обозначения на дифрактограмме: Ch — халькопирит, CuFeS2, As — сульфид мышьяка, AsS, Viv — вивианит, Fe3(PO4)2*8H2O. Исследование поддержано грантом Российского научного фонда (соглашение №1414-00427 от 14.07.2014 г.) ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ БОБОВЫХ КУЛЬТУР В АГРОЦЕНОЗАХ КРЫМА С. А. Хапчаева 1, В. С. Зотов 1, С. В. Дидович 2 1 2 Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва, Россия Научно-исследовательский Институт сельского хозяйства Крыма, Симферополь, Россия Одной из главных теоретических и практических задач почвенной микробиологии является поиск путей направленного функционирования микробиоценоза для повышения плодородия почв. Для этого необходимо знание связей и закономерностей, проявляющихся в различных условиях среды между микробным сообществом, физикохимическими и другими свойствами почвы, а также особенностями возделываемых сельскохозяйственных биохимических растений. процессов, Однако гетерогенность высокая и сложная динамичность почвенных структурная организация микробного сообщества, влияние растений и почвенно-климатические условия вызывают 160 определенные трудности изучения вопросов почвенного плодородия, урожайности с/х культур, рационального использования возобновляемого ресурса и экологизации земледелия. Анализ современного отечественного и мирового опыта применения полезных микроорганизмов продуктивных в агробиотехнологиях растительно-микробных подтверждает ассоциативных и возможность симбиотических создания систем и указывает на необходимость изучения условий для их эффективного функционирования в агроценозах. Управление биологическими процессами в агроценозах возможно через интродукцию агрономически полезных штаммов микроорганизмов в ризосферу растений. При этом усиливается положительный эффект и ослабляется либо ликвидируется отрицательное влияние нежелательных факторов, воздействующих на потенциал растительно-микробного взаимодействия. В агроценозах бобовых культур симбиотические бобово-ризобиальные взаимодействия отличаются как специфичностью по широте круга растений-хозяев, так и разнообразием бактериальных видов, образующих клубеньки на данных растениях. Взаимодействия между растениями трибы Vicieae (Vicia, Pisum, Lens, Lathyrus) и клубеньковыми бактериями рода Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) считаются одними из наиболее специфичных. Клубеньковые изоляты растений гороха, бобов, чины и чечевицы классифицированы в биовар (bv.) viciae вида R. leguminosarum. Штаммы внутри данного биовара способны к перекрёстной инокуляции представленных растений-хозяев, образующих группу перекрестной инокуляции (ГПИ). Раннее нами была показана специфичность во взаимодействии между растениями родов Pisum satіvum и Vicia faba и ризобиями различных генотипов по хромосомному маркеру hin-региону (Zotov et al., 2012). Также были выявлены различия в морфогенезе клубеньков в зависимости от генотипа штамма, входящего в состав инокулята в рамках лабораторного опыта (Khapchaeva et al., 2013). В данной работе нами проведена молекулярно-генетическая оценка полиморфизма и специфичности клубенькообразования в бобово-ризобиальной системе гороха, бобов, чины и чечевицы посредством скрининга клубенёк образующих единиц (КОЕ) растений ГПИ с использованием фингерпринтинга hin-регион ПЦР и RFLP симбиотического nodDгена. Был спланирован полевой вегетационный опыт: проведена предпосевная обработка семян растений ГПИ суспензиями ризобиальных штаммов Rlv (У-2, У-7, 65 и Б-25) различных генотипов. Отбор клубеньков был проведен через 7 недель в фазе активного цветения. 161 Идентификация нуклеотидных КОЕ осуществлялась последовательностей путём гена сравнительного β-субъединицы анализа ДНК-зависимой РНК полимеразы (rpoB-ген), в результате которой образцы КОЕ были отнесены к виду Rhizobium leguminosarum, при этом выявлено 8 генотипов ризобий — симбионтов растений ГПИ. Наиболее распространёнными среди КОЕ в нашем опыте оказались ризобии, сходные по генотипу с интродуцированными штаммами-инокулянтами из первой группы, существенно меньше — из второй. Представители других групп КОЕ оказались менее конкурентоспособными и составляли минорную часть ризобий, распределение которых в клубеньках носило, вероятно, случайный характер. Для определения sym-генотипа был использован метод рестрикционного анализа nodD-гена с применением MspI-рестриктазы. По результатам электрофоретического разделения продуктов рестрикции для всех растений ГПИ выявлено 4 симбиотипа КОЕ. Выявлена корреляция между отдельными видами растений и sym-генотипом клубеньковых бактерий, а именно между Vicia faba и четвёртым симбиотипом, а также Pisum sativum и вторым симбиотипом ризобий. Для наиболее расходящихся симбиотипов КОЕ были получены нуклеотидные последовательности nodD-гена, построено филогенетическое дерево и проведен факторный анализ на выборке из 58 нуклеотидных последовательностей фрагмента nodD гена длинной 659 п. о. Был использовали метод hin-регион фингерпринтинга для оценки внутривидового разнообразия КОЕ. Штаммы, используемые в качестве инокулятов, по данному маркеру ранее были отнесены к двум генотипам: I/A и I/B, причём для изолятов ризобий бобов в подавляющем большинстве случаев характерен I/B, а у изолятов гороха преобладает I/А генотипы (Пунина с соавт., 2013; Khapchaeva et al., 2013). При проведении скрининга КОЕ в настоящем опыте было выявлено 4 генетических профиля: I/A, I/B и два новых — Ia и HF /Heavy Fragment/. Данные hin-регион генотипы были выявлены в варианте работы с тотальной ДНК клубеньков. Для наиболее расходящихся КОЕ были получены нуклеотидные последовательности и построено филогенетическое дерево. Полученные данные молекулярно-генетического анализа КОЕ растений ГПИ свидетельствовали о сцепленности (парной предпочтительности) хромосомного (hin-регион) и симбиотического маркеров (nodD-ген). Симбиотические плазмиды четвёртого типа были обнаружены у всех КОЕ Ia- и большинства I/B-генотипов по hin-региону. Sym-плазмиды второго типа присутствовали в большинстве КОЕ I/A- генотипа по hin-региону. Для растений бобов (Vicia faba) характерна сцепленность хромосомного hin-маркера Ia- (250 bp) и I/B-генотипов с четвёртой группой 162 по симбиотическому nodD-гену. Для растений гороха (Pisum sativum) наблюдается корреляция I/A-генотипа со второй группой sym-генотипа по nodD-гену. Хромосомной ризобиальной предпочтительности у растений чины и чечевицы не наблюдалось. Структура hin-региона, а также его сцепленность с nodD-геном даёт основание предположить, что вышеупомянутые новые генотипы Ia и HF возникают в случае, когда клубенёк у растений ГПИ в своём составе несёт «неблагоприятную» (sym-1 и sym-3) плазмиду. Данная работа проводилась в рамках договора о научном сотрудничестве между Институтом биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ Биотехнологии РАН и отделом микробиологии Института сельского хозяйства Крыма при финансовой поддержке программы «УМНИК» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научнотехнической сфере (№1374ГУ1/2014) и грантов РФФИ (14-44-01621 р_юг_а, 15-29-01272 офи_м). 163 ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ — ГИДРОЛАЗ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА Л. М. Хасанова, А. В. Ильина, В. П. Варламов Институт биоинженерии, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва, Россия Хитин — природный полисахарид, состоящий из остатков глюкозамина (ГА) и Nацетил-глюкозамина (АГА), связанных между собой β (1→4) гликозидной связью (ГА < АГА). По химической структуре хитин близок к целлюлозе, занимает второе место по распространенности в природе. Основным производным хитина является хитозан (ГА > АГА). Хитозан благодаря биодеградируемости, биосовместимости, низкой токсичности, гипоаллергенности, а также мукозоадгезивности широко исследуется в области биомедицины, биотехнологии, пищевой, косметической, сельской и в других отраслях. Основным ограничением применения/исследования биополимера является практическое отсутствие растворимости при нейтральных значениях pH в водных растворах. Для преодоления этого недостатка возможно получение производных хитозана путем введения ионогенных групп, а также деполимеризация биополимера до олигосахаридов. Производные хитина/хитозана представляют интерес также в связи с возможностью получения олигосахаридов, обладающих противомикробной, противоопухолевой, антиоксидантной, генопротекторной и др. активностями. Для получения олигосахаридов существует несколько способов гидролиза: химический, физический и ферментативный. Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки. Ферментативный метод деполимеризации обладает рядом преимуществ, среди которых следует выделить мягкие условия проведения самого процесса, отсутствие агрессивных токсичных реактивов, а также сохранение структуры биополимера. Недостатком метода является отсутствие коммерчески доступных ферментных препаратов (ФП). Обширную группу ферментов, катализирующих гликолитическое расщепление O-гликозидной связи, составляют гликозил-гидролазы (гликозидазы или карбогидразы; К.Ф. 3.2.1). Известно, что получение олигомеров хитозана с узкой степенью полидисперсности возможно при использовании специфических хитиназ и хитозаназ, или их комбинаций. Однако, для масштабного получения олигомеров хитозана применение индивидуальных ферментов не целесообразно с экономической точки зрения. В последние годы более активно исследуются перспективы применения неспецифических 164 по отношению к хитину и хитозану ферментов или ферментных препаратов (ФП). Среди промышленных ФП можно выделить ряд карбогидраз (КФ 3.2.1.х): целлюлазу, α-амилазу, глюкозоаминидазу, пектиназу, некоторые протеазы (КФ 3.4.х.х): пепсин, папаин, бромелаин, фицин, а также липазы (КФ 3.1.1.х). Нами было показано, что низкомолекулярные образцы хитозана с ММ 8–24 кДа, с одинаковой степенью дезацетилирования, с одинаковым индексом полидисперсности, растворимые при рН 5–7 получены при использовании ферментного комплекса, продуцируемого мицелиальным грибом Myceliophthora fergusii. Установлено, что ФП в течение 15 мин позволяет снижать динамическую и характеристическую вязкости высокомолекулярного хитозана в 25 и 20 раз, соответственно. Индекс полидисперсности (ИП) полученных образцов составлял 2.7–3.0. При этом содержание белка в продуктах гидролиза менее 0.1 %, что позволяет использовать получаемые низкомолекулярные образцы в биомедицинских исследованиях. К недостаткам использования большинства неспецифических ФП относится относительно высокий индекс полидисперсности получаемых образцов хитозана (ИП 2-5). Поэтому поиск новых коммерчески доступных ФП из различных источников для получения узко дисперсных низкомолекулярных образцов и олигомеров хитозана представляет собой важную фундаментальную и практическую задачу. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИХ МОДИФИКАЦИЕЙ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Д. И. Хватов 1, О. И. Верная 2, В. П. Шабатин 2, А. М. Семенов 1, Т. И. Шабатина 2 1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва, Россия 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, Москва, Россия Широкое и не всегда обоснованное использование антибиотиков и других антимикробных препаратов в медицине и ветеринарии привело к возникновению большого числа резистентных штаммов микроорганизмов. Пути решения этой проблемы — получения все новых лекарственных препаратов (ЛП) или модифицирование имеющихся, способных подавлять патогенные 165 микроорганизмы с не меньшей эффективностью. Одним из современных путей модифицирования ЛП является получение гибридных форм антибактериальных препаратов с наночастицами металлов. В рамках настоящей работы с помощью разработанных в лаборатории Химии низких температур Химического факультета МГУ новых методов криохимической размерной и структурной модификации лекарственных веществ получена стабильная гибридная наноформа β-модификации 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N'-диоксида (диоксидина) с наночастицами серебра. Для подтверждения состава и определения антибактериальной активности полученной гибридной наноформы β-модификации диоксидина с наночастицами серебра был проведен комплекс физико-химических и биологических методов анализа. Физико-химические методы включали газовую хроматографию, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), рентгенофазовый анализ (РФА), ИК-спектроскопию, определение удельной поверхности методом низкотемпературной десорбции аргона. Рентгеновская дифрактограмма и ИК-спектры полученной гибридной наноформы свидетельствуют о том, что, в пределах ошибки определения, полученная композиция содержит кристаллическую β-модификацию В поглощения УФ-спектрах 2,3-бис-(гидроксиметил)хиноксалин-N,N'-диоксида. гибридной наноформы β-модификации диоксидина с наночастицами серебра в видимой области присутствует двойное поглощение в области 380 нм, характерное для диоксидина и интенсивное плазмонное поглощение при λ = 410 нм, характерное для наночастиц серебра. Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии диаметр частиц β-модификации диоксидина составил 0,1-0,8 мкм, диаметр включенных наночастиц серебра составил 3-30 нм. Размер частиц исходного диоксидина составил 4-8 мкн. Антибактериальную активность лекарственных препаратов, полученных их модификацией, тестировали используя штамм бактерий Pseudomonas eruginosa 47 методами: диско-диффузионным, аппликацией таблеток с ЛП и методом острых опытов (кинетический метод). Результаты показали, что при аппликации таблеток с ЛП зоны подавления роста бактерий проявляются наиболее значимо, чем в диско-диффузионным методе. Наиболее точным методом является метод острых опытов, позволяя получить константы ингибирования бактерий, проверяемым ЛП. Используемые методы по их точности и значимости получаемых результатов можно расположить в ряду: метод острых опытов (кинетический метод) > аппликации таблеток > диско-диффузионный. 166 РАЗЛИЧИЯ В СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МЕМБРАН ЭУБАКТЕРИЙ И АРХЕЙ А. О. Чугунов*, Р. Г. Ефремов Институт биоорганической химии им. М.М, Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия * Е-мейл: batch2k@yandex.ru Motivation and aim. Each domain of life possesses individual lipid composition of plasma membranes. Bacteria and Eucaryota feature zwitterionic and anionic phospholipids (PLs), respectively, organized in the bilayer manner. Archaea exhibit “bolalipid” monolayer membrane with each molecule possessing two O- or Θ-linked isoprenoid chains and two polar “heads” that form opposite hydrophilic membrane surfaces. Most probably, individual structural plan of the membrane determines unique ecological portrait of Archaea, which are extremophiles, and plays an important role in growth and division of Bacteria. Procaryotic membranes appear to be a unique target for antibacterials, in case of pathogenic bacterial strains, and promising bionanotechnological material, in case of Archaea. Here, we study the fine dynamic organization of bacterial and archaeal membranes with their microenvironment using high-performance molecular dynamics (MD) simulations. Methods and Algorithms. The typical size of MD cell is ≈15×15×15 nm3, which contains ≈5–20×104 atoms of lipids (, protein) and solvent. Accessible simulation time for common supercomputers is 0.5–1 μs, which is already long enough for model biomembranes to express their dynamic features. Our “bacterial” membrane was anionic and consisted of 75% POPG and 25% POPE PLs, with additional lipid-II molecule, which is the key player in bacterial cell wall synthesis and stands for promising target for novel antibacterial therapy. “Archaeal” membrane was built of a series of bolalipid “mimetics” with two hydrophobic chains, connected to polar “heads” at each end. In this series, acyl chains contained different number of characteristic for Archaea methyl or cyclopentanyl groups. Analysis of MD trajectories revealed local heterogeneities in bacterial membrane with lipid-II and complex phase behavior of archaeal membranes. Results. For bacterial membrane, our analysis revealed that lipid-II molecule substantially disturbs lipid bilayer (as compared to the membrane without lipid-II) and introduces unique amphiphilic pattern into the membrane surface. Potentially, this complex pattern constitutes the “moving target” for many natural antibiotics, and may be employed in design and/or discovery of novel antibiotics against drug-resistant pathogenic strains. 167 For archaeal membranes, MD uncovered the role of “side” groups in bolalipids’ hydrophobic chains: “straight” acyl tails form completely rigid “gel” phase, which is incompatible with life. Introduction of “side” groups gradually “melts” the membrane, finally arriving to “liquid crystal” state, which is believed to be native for the membrane. Such membrane composition may have adjusted Archaea’s ecological favor and evolutionary fate. Conclusion. Molecular modeling is a powerful experimental toolbox for study of innermost details of biological systems, and its capabilities and role in near future will continue to increase. It fruitfully supplements traditional biophysical methods of research. Acknowledgements. Supported by 13-04-40326-Н and 14-04-3163414 RFBR grants. ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗАНА НА АНТИБАКТЕРИАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСТАФИНА И ВАРНЕРИНА Б. Ц. Шагдарова 1, С. Н. Куликов 2 1 2 ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва, Россия Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань, Россия Известно, что при совместном использовании ферментов, белков, антимикробных пептидов с антибиотиками, обнаруживается синергетический эффект. В данной работе в качестве антимикробных препаратов были исследованы лизостафин и варнерин. Лизостафин — внеклеточная штаммом-продуцентом цинк-содержащая которой является глицил-глициновая Staphylococcus эндопептидаза, simulans biovar staphylolyticuS. Проявлением его ферментативной активности является разрушение клеточных стенок микроорганизмов рода Staphylococcus посредством гидролиза полиглициновых межпептидных мостиков в пептидогликане, которые встречаются только в клеточной стенке стафилококков. Варнерин — низкомолекулярное пептидное соединение, выделенное из среды культивирования бактерий Staphylococcus warneri IEGM KL-1, в составе которого обнаружено значительное количество остатков катионных и гидрофобных аминокислот, а также необычной аминокислоты лантионина. Бактерицидное действие пептида на клетки S. epidermidis проявляется в широком диапазоне рН и сохраняется после температурной обработки [1]. Для увеличения антибактериальной активности лизостафина и варнерина, путем достижения синергетического эффекта выбрали ряд модифицированных образцов хитозана, которые 168 содержали четвертичную аммониевую группу. Производные обладали большей, чем исходный хитозан растворимостью и бактерицидными свойствами. Целью работы является исследование антибактериальной активности лизостафина и варнерина в присутствии производных хитозана. Для этого в нашей работе были использованы синтезированные на основе хитозана с молекулярной массой (ММ) 20 кДа и степенью дезацетилирования (СД) 98 %, алкилированные (кватернизированные) производные хитозана со степенью замещения (СЗ) 9, 40, 58, 98 %. Использовали лизостафин из S. staphylolyticus («Sigma», США), содержащий 60 % белка со специфической активностью 500 Е\мг белка. Гомогенный препарат варнерин, использованный в работе, предварительно очищали при помощи методов гель-фильтрации, ионообменной и обращенно-фазовой хроматографии. В качестве тест-штаммов были использованы S. aureus ATCC 35591 и S. epidermidiS. Антибактериальное действие лизостафина изучалось на S. aureus, а действие варнерина на S. epidermidis, ввиду специфичности взаимодействия изучаемых объектов для этих видов бактерий. Оценку лизирующей активности лизостафина и влияние на этот процесс производных хитозана проводили в соответствии с модифицированным методом [2]. В 96-луночном плоскодонном планшете готовили различные концентрации производных хитозана, методом двойных разведений и в каждую лунку добавляли в качестве субстрата суспензию живых клеток S. aureus, оптическая плотность которых при 620 нм равнялась 0.300 (8 × 107 КОЕ/мл) и лизостафин до конечной концентрации 1Е/мл. Полученную смесь инкубировали в термошейкере при 350 об/мин и 37 °С в течении 15 мин, далее измеряли оптическую плотность при 620 нм. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что в присутствии кватернизированных производных хитозана действие лизостафина усиливалось. Снижение оптической плотности бактериальной суспензии зависело от концентрации вносимых в лунку полимеров. В присутствии 25 мкг/мл производных хитозана со СЗ 9, 40, 58 % лизис клеток усиливался, достигая максимума при их концентрации 3 мкг/мл. Стоит отметить, что СЗ четвертичными аммониевыми группами в структуре биополимера влияет на совместное действие изучаемых объектов, производные хитозана замещенные на 9, 40, 58 % проявили гораздо большую активность, в отличии от производного максимально замещенного. Чем выше СЗ, тем выше плотность положительного заряда производных хитозана, которая может препятствовать работе фермента ввиду стерических затруднений и электростатического отталкивания. Оценку лизирующей активности варнерина и влияние на этот процесс кватернизированного производного хитозана со СЗ 98 %, проводили методом, аналогичным измерению 169 активности лизостафина, используя суспензию клеток S.epidermidiS. В отличии от лизостафина, являющегося быстродействующим ферментом, варнерин действует медленнее. Синергетический эффект относительно эпидермального стафилококка для производного замещенного максимально варнерина наблюдался при 60 мин инкубирования, в концентрации от 6 до 1.6 мкг/мл. Работа поддержана грантами РФФИ 15-34-50158 мол_нр, 14-04-00687 А. 1. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Акименко В.К. Выделение и характеристика нового низкомолекулярного антибактериального пептида семейства лантибиотиков // Микробиология. 2010. Т.79, №2, С. 228-238. 2. Куликов С.Н., Шумкова Ю.А. Влияние хитозана на лизис клеток стафилококков лизостафином // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. № 2. С.207-210. ИЗМЕНЕНИЕ МИКРОБНОГО КОМПЛЕКСА ЛИСТВЕННОЙ ПОДСТИЛКИ ПРИ ПАССАЖЕ ЧЕРЕЗ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫЙ ТРАКТ ДВУПАРНОНОГИХ МНОГОНОЖЕК-КИВСЯКОВ А. В. Якушев, О. А. Фролов, К. К. Соболева Факультет почвоведения МГУ, Москва, Россия Важнейшее свойство почвы — её плодородие зависит от содержания и состава гумуса, образующегося в ходе разложения органических остатков почвенными беспозвоночными животными при помощи гидролитических микроорганизмов. Одна из лимитирующих этот интенсифицируется в процесс стадий — желудочно-кишечном разложение тракте полимеров, почвенной которое сапрофагической мезофауны, среди представителей которой большую роль в природе выполняют двупарноногие многоножки. Новизна работы заключается в попытке связать изменение физиологического разнообразия гидролитического бактериального блока при пассаже через кишечник с изменением доминирующей экологической стратегии среди его членов и их физиологического состояния, путём расчёта кинетических параметров инициированных микробных сообществ. Практическая значимость работы связана с разработкой на основе физиологических параметров инициированных микробных сообществ критериев оценки последствий влияние присутствия беспозвоночных на 170 микробное сообщество, что важно для экологической оценки состояния микробного сообщества при зоомелиорации почв. Дальнейшая отработка методики выделения микроорганизмов инициированных микробных сообществ, образовавшихся из исходного кишечного сообщества будет полезна при поиске микроорганизмов потенциальных компонентов препаратов пробиотиков для животных и устойчивых бактериальных ассоциаций способных к разложению определенных веществ. Цель работы — изучение транзитных бактериальных и грибных комплексов кишечника Pachyiulus flavipes и Cylindroiulus caeruleocinctus: сравнение в корме и экскрементах преобладающей среди членов сообщества экологической стратегии роста, физиологического разнообразия, состава и физиологического состояния его членов. Расширение урбанизированных территорий, происходит значительная перестройка в комплексе почвенной сапрофагической мезофауны, играющей важную роль в разложении биополимеров опада, из которого формируется почвенный гумус, определяющий плодородие городских почв. В парках и скверах городов в отсутствии хищников, массово размножаются синантропные двупарноногие многоножки — сапрофаги из сем. настоящих кивсяков (Julidae), обильно заселяющие урбанизированные территории Средиземноморья (Pachyilys flavipes) и умеренной зоны Европы (Сilindroiulus caeroleocinctus), становясь чуть ли не самыми обильными представителями почвенной сапрофагической мезофауны. Определяющий во много разложение подстилки комплекс сапротрофных грибов в скверах, испытывает интенсивное воздействие этих животных. Этим фактом объясняется выбор данных многоножек в качестве объектов исследования. Задачи исследования: 1. сбор многоножек в природе, содержание в условиях почвенных микрокосмов (на родной почвенной подстилке) и получение свежих экскрементов; 2.сравнение комплексным структурно-функциональным методом физиологического разнообразия в гидролитическом микробном блоке в корме и экскрементах двух различных многоножек; 3. сравнение физиологического состояния микроорганизмов; 4. сравнение преобладающей среди членов бактериального блока экологической стратегии; 5. анализ полученных результатов многомерными методами статистического анализа данных (кластерным, факторным, дискриминантным). Исследование бактериального и грибного гидролитического комплекса проводилось комплексным структурно-функциональным методом [1]. Водная суспензия исследуемых образцов вносилась в ячейки культуральной 96-луночной планшеты, с внесёнными в них жидкими питательными средами с биополимерами животного (казеин, кератин, хитин), растительного (крахмал, ксилан, пектин, целлюлоза и микробного происхождения (декстран, хитин). Одновременно определялось обилие микроорганизмов в исходной 171 суспензии чашечным методом. Помимо простого подсчета количества КОЕ, проводилось исследование динамики экспериментальных появления данных новой колоний микроорганизмов. математической моделью С описанием [1]. Планшета инкубировалась при постоянной температуре в иммуноферментном анализаторе Sunrise, рост грибов регистрировался по оптической плотности суспензий. Состав микробных ассоциаций, развившихся на полимерах, был определен чашечным методом высевом на ГПД среду. Кинетика роста смешанных ассоциаций микроорганизмов в ячейках была описана математической моделью периодической культуры [1]. В данной работе теоретически интерпретировался только участок подготовки ассоциаций микроорганизмов к росту (лаг-фаза) и фаза экспоненциального роста на основе комплексной модели периодической культуры А.В. Якушева [1], которая для этих стадий роста очень близка к синтетической хемостатной модели Н.С. Паникова. Эта модель имеет вид: x(t ) x0 (1 0 0e mt ) . В модели x - концентрация клеток в среде, x0 — исходная концентрация в суспензии культивируемых бактерий, t — время, μm — максимальная удельная скорость роста. ρ0 — начальное значение функции физиологического состояние растущей культуры, отражающее отличие μ от μm в лаг-фазе. Наша гипотеза состоит в том, что доля метаболически готовых к росту на полимерах ассоциаций (воспринимаемые нами как целое), оцененная по ρ0, отражает действительную метаболическую готовность к потреблению полимеров in situ; а доля быстрорастущих ассоциаций (оцененных по μm) отражает долю быстрорастущих бактерий (r-стратегов) в сообществе корма и экскрементов. Основные выводы и результаты: 1. Физиологическое разнообразие гидролитического комплекса бактерий для кивсяков снижается в экскрементах (доля потребляемых сред с полимерами снижается с 93 % до 79 %). 2. Дискриминантный анализ параметра «максимальная удельная скорость роста бактериальных ассоциаций» показал, что при пассаже наблюдается изменение преобладающей экологической стратегии среди членов бактериального комплекса и выражается в том, что доля быстрорастущих членов бактериального сообщества снижается в экскрементах кивсяков Cylindroiulus caeruleocinctus. 3. Реакция грибного сообщества на пассаж через кишечник диплопод зависит от физиологического состояния грибов в корме. 4. Многомерные методы статистики показали, что эффект от физиологического состояния грибов сильнее, чем различие пищеварительных систем разных родов кивсяков 5. Сильней реагируют на кишечную среду грибы в свежей подстилке, при этом при пассаже снижается метаболическая готовность к росту, физиологическое разнообразие, снижается обилие 172 грибов, но возрастает скорость выхода из лаг-фазы. 6. Многомерные методыстатистики показали, что экологическая стратегия грибного сообщества сильно зависит от природы субстрата изменение экологической стратегии при пассаже более четко прослеживается при питании кивсяков более разложившейся подстилкой. 7. Для образцов корма и экскрементов Сilindroiulus caeroleocinctus методом посева при одинаковой по объёму выборки посевов было выделено из корма 6 видов грибов, из экскрементов 4, всего было выделено 7 видов, также был выделен 1 вид дрожжей как из корма, так и из экскрементов. Примерно 40 % общие. Из ячеек мы выделили 40 видов грибов, где примерно четверть общие. При этом в первой серии экспериментов (октябрь) Trichoderma выделялась только из экскрементов, а во второй (декабрь) как из корма, так и из экскрементов. Благодарим за предоставление крымских кивсяков д.б.н. Б. А. Бызова, за помощью в работе д.б.н. С. И. Головача и к. б. н. И. И. Семенюк, аспирантку А. Данилогорскую. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №14-50-00029. 1. Якушев А.В. Комплексный структурно-функциональный метод характеристики микробных популяций //Почвоведение. 2015. № 4. с. 429-446. 173
