На правах рукописи Горячковская Татьяна Николаевна Метод
advertisement
На правах рукописи Горячковская Татьяна Николаевна Метод десорбции ДНК для молекулярных и генетических исследований с помощью лазерного излучения терагерцового диапазона 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2011 Работа выполнена в лаборатории молекулярных биотехнологий Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: кандидат биологических наук, С.Е.Пельтек Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Т.И.Меркулова Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск кандидат биологических наук, Е.С. Филоненко Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», г. Москва Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики РАН, г. Москва Защита диссертации состоится ______________________ 2012 года на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru, тел.: (383)3634906 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан "_____" 20__ г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Для исследования молекул ДНК существует мощный арсенал методов, позволяющих характеризовать как их физико-химические, так и молекулярногенетические свойства. Современные тенденции использования ДНК в нано- и биотехнологиях ставят задачу разработки новых методов анализа молекул ДНК на основе развивающейся приборной базы. К таким методам, позволившим получить новые знания о молекулах ДНК, относятся в частности атомно-силовая микроскопия и манипулирование единичными молекулами ДНК с помощью лазерного пинцета [Conwell C.C., et al., 2003, Terao K, et al., 2008, Lyubchenko Y.L., Shlyakhtenko L.S., 2009]. Настоящая работа посвящена разработке метода десорбции молекул ДНК с твердых подложек и из жидкой фазы с помощью терагерцового излучения. Перевод ДНК в газовую фазу позволит расширить спектр методов анализа этого биополимера. С молекулами и молекулярными ионами в газовой фазе оперируют методы масс-спектрометрии, спектроскопии, физики аэрозоллей, нанотехнологии. Масс-спектрометрия для анализа ДНК используется значительно меньше, чем для анализа белков, как раз в силу сложности получения молекулярных ионов ДНК в газовой фазе. Использование терагерцового излучения для десорбции ДНК позволит переводить в газовую фазу достаточно большие фрагменты, что расширит возможности масс-спектрометрии ДНК. Одним из самых мощных источников терагерцового излучения является Новосибирский лазер на свободных электронах (ЛСЭ) [Gavrilov N.G. et al., 2007, Shon W.-Y. et al., 2008]. Характеристики Новосибирского ЛСЭ позволяют проводить уникальные эксперименты по применению терагерцового излучения в научных исследованиях, в том числе и для перевода в газовую фазу и получения молекулярных ионов ДНК. Цель и задачи работы. Цель данной работы заключалась в разработке метода перевода в газовую фазу двухцепочечных молекул ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более) и одноцепочечных молекул ДНК, гибридизованных с олигонуклеотидами на поверхности модельного биочипа, без нарушения их первичной структуры под действием терагерцового излучения для молекулярно-генетического анализа и экспериментов с ДНК в газовой фазе. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: модернизировать рабочую станцию («Станция физико-химических и биологических исследований воздействия терагерцового излучения на вещества») на Новосибирском лазере на свободных электронах для работы с молекулярно-генетическими объектами, 1 подобрать параметры излучения и разработать методы пробоподготовки молекул ДНК для перевода в газовую фазу; с помощью терагерцового излучения перевести в газовую фазу молекулы ДНК плазмиды pUC18, изучить их биологические свойства стандартными методами молекулярной биологии, проверить способность к передаче наследственной информации; провести десорбцию ДНК с помощью терагерцового излучения, измерить с помощью диффузионного спектрометра аэрозолей размеры частиц, образуемых молекулами ДНК фагов Т7 и λ, плазмиды pUC18, а также фрагментами ДНК фага λ, полученными при гидролизе ферментами HindIII и BssT1I, провести анализ состава десорбированного материала с помощью атомно-силовой микроскопии; разработать модель ячейки биочипа на кремниевой основе, изучить возможность десорбции целевой ДНК с модельного биочипа с помощью терагерцового излучения. Научная новизна работы. Впервые для исследования ДНК использовано терагерцовое излучение лазера на свободных электронах. Проведённое исследование доказывает сохранение способности к передаче наследственной информации, структуры и молекулярногенетических свойств ДНК после перевода их в газовую фазу с помощью разработанного метода. Впервые показана возможность применения метода для десорбции одноцепочечной целевой ДНК, гибридизованной на модели биочипа. Под действием терагерцового излучения впервые осуществлен перевод различных макромолекул ДНК в газовую фазу, в том числе ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более). На примере плазмиды pUC18 показано сохранение структуры и молекулярно-генетических свойств ДНК, в том числе способности к трансформации клеток E. coli и репликации своего генома. Таким образом, доказан неразрушающий характер процесса десорбции ДНК с твердых подложек под действием терагерцового излучения с длиной волны 130 мкм, показана применимость метода для десорбции одноцепочечной целевой ДНК, гибридизованной на модели биочипа. Впервые проведены измерения размеров частиц, образуемых молекулами ДНК в газовой фазе. Установлена зависимость размеров частиц ДНК в газовой фазе от длины взятой ДНК. В диапазоне длин от 6 500 п.н. до 40 000 п.н. получено соответствие размеров частиц ДНК размерам, полученным с помощью теоретического моделирования процесса конденсации и формирования глобулы ДНК [Хохлов А.Р., Кучанов С.И., 2000, Флори П.Д,, 1971, Тейф В.Б., Ландо Д. Ю., 2001]. 2 Перевод ДНК с помощью терагерцового излучения в газовую фазу назван методом мягкой неразрушающей абляции. Метод разработан коллективом сотрудников институтов СО РАН, в числе которых состоял и автор диссертации [Петров А.К. и др., 2005]. Открытие явления мягкой неразрушающей абляции признано достижением РАН за 2006 г. Положения, выносимые на защиту. 1. Разработан метод перевода молекул ДНК в газовую фазу с помощью терагерцового излучения с длиной волны 130 мкм без изменения их первичной структуры с сохранением способности передавать наследственную информацию. Метод применим для получения в газовой фазе ДНК больших размеров (три тысячи пар оснований и более), в виде, пригодном для молекулярно-генетических исследований, в частности масс-спектрометрии ДНК и анализа целевой ДНК, гибридизованной на биочипах. 2. Линейные молекулы ДНК в газовой фазе образуют частицы глобулярной формы, причем размеры структур зависят от длины цепи ДНК. Практическая и теоретическая значимость. Разработан метод, позволяющий переводить в газовую фазу рекордно большие молекулы ДНК, вплоть до генома фага λ (48 500 п.н.), что открывает широкие возможности для определения размеров и масс ДНК. Созданный в результате работы способ десорбции молекул ДНК может быть использован как для разработки методов масс-спектрометрического анализа генетических макромолекул, так и для применения стандартных методов анализа в газовой фазе к исследованию ДНК. Разработанные в диссертации теоретические и методические положения, могут найти применение в исследовании фундаментальных свойств генетических макромолекул – энергетики взаимодействий ДНК-ДНК, ДНК-РНК, ДНК-белок и РНК-белок. Исследование конформационных состояний генетических макромолекул в газовой фазе позволит расширить знания о закономерностях компактизации ДНК в естественных и искусственных условиях. На основании проведенных исследований, разработаны методические основы анализа целевых ДНК биочипов с помощью метода мягкой неразрушающей абляции. Такая задача представляет интерес с точки зрения совершенствования технологии производства биочипов. В последние годы лавинообразно возросло количество исследований с использованием методов ДНК-биочипов. Однако, сходимость профилей экспрессии, получаемых с использованием биочипов производителей, составляет одной менее направленности 30%. различных Принципиальная ведущих возможность мировых изучать непосредственно результаты гибридизации зондов и мишеней позволила бы получать 3 достоверную информацию о продуктах гибридизации независимым способом. На основе явления мягкой неразрушающей абляции был разработан метод разрушения под действием терагерцовым излучением ДНК-ДНК гибридов на модельной ячейке биочипа и сбора целевой ДНК для последующего анализа. Апробация работы. Результаты работы использованы и опубликованы в отчете по государственному контракту «Диагностика ДНК-биочипов при помощи терагерцового излучения» от 27 февраля 2007 г. № 02.512.11.2068. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на российских и международных конференциях, в том числе: 2nd International THz-Bio Workshop 2011, Seoul, Korea, Topical problems of biophotonics, Нижний Новгород, 2009, «Химическая биология – Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» Новосибирск, 2009, XVII International Synchrotron Radiation Conference "SR-2008", Новосибирск, 2008, BGRS 2008, Novosibirsk, 2008, 29th International free electron laser conference: FEL-2007, Novosibirsk, 2007, IRMMWTHz 2005, Williamsburg, Virginia, USA, 2005. Публикации. По теме диссертации опубликовано три статьи в рецензируемых журналах списка ВАК. Более десяти работ опубликовано в тезисах российских и международных конференций, получен патент РФ. Вклад автора в исследование проблемы. Автор принимал участие, как в планировании экспериментов, так и в их проведении. Большая часть экспериментальной работы выполнена лично автором. Исследования проводились на базе лазера на свободных электронах (ЛСЭ) терагерцового диапазона, разработанного и созданного в ИЯФ СО РАН [Gavrilov N.G. et al., 2007]. Для проведения экспериментов была оборудована «Станции исследований химико-физических и биологических свойств продуктов воздействия терагерцового излучения на вещества» в Сибирском центре синхротронного и терагерцового излучения СО РАН. Автор принимал непосредственное участие в планировании станции и её оснащении. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (первая глава), описания приборной базы, материалов и методов (вторая глава), двух глав, содержащих результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах, содержит 6 таблиц, 46 рисунков и 200 литературных источников. Благодарности. Автор выражает благодарность сотрудникам ИЯФ СО РАН и ИХКиГ СО РАН: коллективу операторов ЛСЭ и лично В.М.Попику и М.А.Щеглову за организацию 4 пользовательских станций, настройку параметров и поддержание режимов работы ЛСЭ. В.В.Кубареву, А.С.Козлову и Е.Н.Чеснокову за проведение измерений на фурьеспектрометре. С.Б. Малышкину и А. Уницыну за помощь в измерении размеров аэрозольных частиц. Сотрудникам ИЦиГ СО РАН: С.И. Байбородину за помощь в проведении электронной микроскопии, Т.Н. Кузнецовой за изготовление модельного биочипа, коллективу лаборатории молекулярных биотехнологий за помощь и поддержку. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 Обзор литературы В обзоре литературы рассмотрены способы использования терагерцового излучения в молекулярно-биологических исследованиях, сделан обзор методов измерения размеров наночастиц различной природы, приведены характеристики уникальной установки, использованной в работе, - Новосибирского лазера на свободных электронах (ЛСЭ). В разделе 1.4 обсуждаются существующие теории механизмов абляции. Обзору измерений физических размеров ДНК на разных стадиях конденсации молекулы посвящен раздел 1.5, обсуждаются теоретические модели процесса конденсации. Глава 2 Приборная база, материалы и методы В главе 2 приведены краткие характеристики приборов, использованных в работе, содержится описание использованных материалов и методов исследований. Глава 3 Результаты Раздел 3.1 посвящен описанию экспериментов по десорбции ДНК больших размеров. Для проведения экспериментов была проведена модернизация рабочей станции на Новосибирском ЛСЭ, подобраны параметры излучения Новосибирского ЛСЭ для абляции ДНК, не приводящие к термическому разрушению материала. Были проведены эксперименты с ДНК плазмиды pUC18 (2686 п.н.), ДНК фага Т7 (39936 п.н.), фага λ (48502 п.н.) и фрагментами ДНК фага λ. Основным доказательством неразрушающего характера мягкой абляции под воздействием терагерцового излучения стал анализ молекулярно-генетических свойств десорбированной ДНК (раздел 3.2). Для этого использовали ДНК плазмиды pUC18. Аблированную плазмиду собирали на фильтр, элюировали с поверхности фильтра и трансформировали ею компетентные клетки 5 E.coli. Методами клонирования и рестрикционного анализа показано, что в десорбированном материале присутствуют молекулы плазмиды pUC18 сохранившие способность к передаче наследственной информации, обеспечивая устойчивость клеток E.coli к ампициллину. Был проведен гидролиз клонированной после абляции плазмиды ферментами рестрикции EcoR1, Hinf1 и Alw441. Рестрикционный анализ показал, что сайты рестрикции ферментов сохранили свое взаимное расположение и способность связывать фермент рестрикции. На рисунке 1 приведена электрофореграмма гидролизата аблированной плазмиды рестриктазой Alw441. На основании этих данных было сделано предположение, что в результате десорбции методом мягкой неразрушающей абляции ДНК плазмиды pUC18 переходит в аэрозольную фазу, не теряя при этом своих молекулярно-генетических свойств. Для доказательства этого предположения было проведено сравнение последовательностей ДНК нативной pUC18 и ДНК pUC18 после абляции. Рисунок 1. Электрофореграмма плазмиды pUC18 и ее Alw441 гидролизата: 1- 1Kb ДНК маркёр; 2,4 - Alw441 гидролизат плазмиды, выделенной из клеток E.coli, трансформированных аблированной плазмидой; 3,5 – плазмида, выделенная из клеток E.coli, трансформированных аблированной плазмидой; 6 - Alw441 гидролизат исходной плазмиды; 7 - исходная плазмида. Были получены четыре ампликона размерами 517, 971, 1448 и 1510 нуклеотидов с частично перекрывающимися последовательностями с одного клона нативной плазмиды и двух клонов, полученных после абляции. Полученные ампликоны использовали в качестве матриц для секвенирования с прямым и обратным праймерами. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН. В результате секвенирования была полностью прочитана последовательность контрольной и аблированной (прошедшей через аэрозольную фазу) плазмиды pUC18. Секвенирование продемонстрировало отсутствие различий между нативной и аблированной плазмидой pUC18. Последовательности исходной плазмиды и плазмиды после абляции совпали на 100%. 6 Полученные данные свидетельствуют о том, что метод мягкой неразрушающей абляции применим для перевода в газовую (аэрозольную) фазу таких нестабильных биополимеров, как ДНК. Для визуализации изменений, происходящих с молекулами ДНК в аэрозоле, была проведена атомно-силовая микроскопия (АСМ) препарата ДНК pUC18 до абляции и частиц ДНК, собранных из аэрозоля. По данным АСМ молекулы плазмиды приобрели компактную упорядоченную структуру (рис. 2). С помощью диффузионного спектрометра аэрозолей (ДСА) были проведены измерения размеров частиц, получаемых в газовой фазе при десорбции препарата ДНК pUC18. Размер частиц по данныи ДСА составил 20,7 нм. Сопоставление измерений диффузионных размеров аэрозольных частиц плазмиды pUC18 и измерений с помощью АСМ дают основания предполагать, что в аэрозольной фазе происходит процесс конденсации молекул ДНК. На препаратах (рис. 2) видно, что диаметр структур составляет порядка 200 нм, а высота около 10 нм. В газовой фазе наиболее вероятной формой ДНК является глобула. При осаждении частиц ДНК на слюде с помощью вакуумного пробоотборника происходит «распластывание» глобулы по поверхности, поэтому размеры структур на слюде не совпадают с размерами частиц ДНК в газовой фазе. Заметное упорядочивание структуры косвенно свидетельствует в пользу того, что в газовой фазе происходит конденсация ДНК. Рисунок 2. Атомно-силовая микроскопия препарата плазмиды pUC18 осажденного на слюду из газовой фазы после абляции. Измерения проводили в полуконтактном режиме. 7 В литературе не описано конформационных изменений структуры ДНК или белков под действием электромагнитного излучения в диапазоне 120-235 мкм, однако известно, что, третичная структура молекул в газовой фазе несколько другая, чем в растворах. Согласно закономерностям, предложенным современными моделями процесса конденсации ДНК и формирования глобулы, расчет размеров глобулярной частицы, формируемой линейным полимером приблизительно описывается следующей функцией: Где R –диаметр глобулы, N - количество звеньев цепи, U – длина звена, на котором отсутствует гибкость цепи (сегмент Куна) [Хохлов А.Р., Кучанов С.И., 2000, Флори П.Д,, 1971, Тейф В.Б., Ландо Д. Ю., 2001]. В случае, когда рассматриваемым полимером является ДНК, минимальный размер сегмента Куна равен длине одной пары оснований, что составляет около 0,35 нм. С увеличением изгибной жёсткости ДНК будет увеличиваться длина куновского сегмента (U) и уменьшаться количество звеньев цепи (N). В случае, когда сегмент Куна содержит n нуклеотидных пар, U = 0.35n (нм), а количество звеньев цепи уменьшится в n раз: N=L/n, где L – длина цепи в нуклеотидных парах. Подставив эти выражения в (1) получим следующую формулу для оценки размеров глобулы: R = √L/n ·0,35n (2) Жёсткость молекулы определяется параметром n, с увеличением которого растет размер куновского сегмента и персистентная длина, а количество независимых звеньев уменьшается. Для различных по жёсткости молекул (т.е. при разных значениях n) наклон теоретической кривой будет разным. С увеличением n наклон кривой уменьшается. На рисунке 3 приведен график зависимости размеров глобулы ДНК от длины цепи при значении n равном 3. Точками на рисунке отмечены значения, полученные экспериментально. Для получения экспериментальных точек электрофоретическим методом из коммерчески доступных препаратов ДНК фага λ, гидролизованной рестриктазами HindIII и BssT1I, были препаративно выделены отдельные фрагменты ДНК-гидролизатов (таблица 1) и проведена мягкая абляция фрагментов ДНК. Каждый фрагмент и ДНК фагов облучали отдельно терагерцовым излучением с длиной волны 128 мкм. С помощью ДСА были проведены измерения размеров частиц, получаемых в газовой фазе при десорбции препаратов ДНК. Как видно из рисунка 3, четыре экспериментальные точки соответствуют n равному 3. ДНК фага λ формирует глобулу размером меньше теоретически предсказываемого. 8 Рисунок 3. Зависимость размеров аэрозольных частиц, образуемых молекулами ДНК от длины последовательности. Линией представлены теоретические данные, построенные по формуле (2), точками – экспериментальные измерения. Теоретический расчет проведен для n = 3. Также в меньшую сторону размеры частиц, отклоняются Таблица 1. Размеры фрагментов ДНК и рестриктазы, использованные для гидролиза ДНК фага λ. Длина ДНК, п.н. рестриктаза пар 1489 BssT1I оснований. Вероятными причинами 2027 HindIII 2322 HindIII 3472 BssT1I 4361 HindIII 6557 HindIII 9416 HindIII 23130 HindIII образованных фрагментами ДНК размерами 1500 – 3500 этих отклонений может быть как несовершенство формулы, так предложенной и различия в нуклеотидном составе. Таким образом, экспериментально оцененная длина сегмента Куна для ДНК в газовой фазе составляет около 1 нм, что соответствует персистентной длине 0,5 нм. По литературным данным персистентная длина, измеренная для различных растворов, варьирует от нескольких нанометров до контурной длины ДНК (полностью жёсткая «палка») и определяется поверхностным отрицательным зарядом, распределённым по цепи ДНК. В присутствии катионов отрицательные заряды нейтрализуются, и молекула становится более гибкой. По проведенным нами выше оценкам в газовой фазе персистентная длина ДНК составляет менее 1 нм, что свидетельствует об отсутствии распределённого заряда на поверхности ДНК в газовой фазе и хорошо согласуется с предположением о неионизирующем характере терагерцового излучения. 9 Полученный результат позволяет сделать два принципиальных вывода. Во-первых, увеличение размеров частиц с увеличением длины, взятой в эксперимент ДНК, свидетельствует о том, что отдельные частицы в аэрозоле соответствуют отдельным молекулам ДНК. Если бы аэрозольные частицы формировались из нескольких цепей ДНК, при определении размеров выявлялись бы частицы, различающиеся в разы: одна молекула ДНК, две, три и т.д. В случае фрагментации молекул не было бы зависимости от длины исходной цепи ДНК. Во-вторых, полученный результат свидетельствует о неразрушающем характере абляции. Новый способ десорбции ДНК методом мягкой неразрушающей абляции был применён для перевода в газовую фазу синтетической целевой ДНК, связанной на модельной ячейке биочипа (раздел 3.2.2). В качестве модели ячейки биочипа использовали круглую пластину кристаллического кремния диаметром 20 мм и толщиной 1 мм с ковалентно пришитыми на поверхность зондами одной и той же структуры (далее – чип). Принципиальная схема проведения абляции целевой ДНК с гибридизованного чипа под действием излучения ЛСЭ приведена на рисунке 4. Чип, представляющий собой кремниевую пластинку с иммобилизованным олигонуклеотидом (ДНК-зонд) длиной 17 нуклеотидов, гибридизованным с нуклеотидом-образцом (целевой ДНК) длиной 90 нуклеотидов, помещали в стеклянную камеру (А), имеющую три отверстия. Первые два использовались для создания протока транспортёрного газа (сухого азота) через камеру для удаления аблированных частиц и их последующего анализа. Третье отверстие использовали для облучения поверхности чипа терагерцовым излучением. А Излучение ЛСЭ ДНК в токе азота N2 чип Целевая ДНК в аэрозоле Воздействие излучения ЛСЭ на ДНК пробу, гибридизованную с целевой ДНК Рисунок 4. Схема проведения эксперимента. А) Схема кюветы, Б) Принципиальная схема абляции целевой ДНК под действием излучения ЛСЭ. Б ДНК проба на поверхности чипа Кремниевая поверхность 10 ДНК, аблированную с чипа, собирали на отдельные фильтры. В каждом случае на фильтр было собрано около 105-106 частиц. На рисунке 5 представлены результаты анализа амплификатов ДНК, собранной из газовой фазы. Для контроля чистоты абляции все процедуры облучения образца, сбора на фильтр, последующей элюции и амплификации были повторены с пустой кремниевой пластиной в качестве образца. На электрофореграмме (рисунок 5) каждый экспериментальный образец и контроль абляции нанесены на две дорожки. Видно, что как при длине волны излучения 126 мкм, так и при длине волны излучения 129,5 мкм перевод молекул целевой ДНК размером 90 нуклеотидов в газовую фазу прошел успешно. Было проведено секвенирование амплификата аблированной ДНК с использованием Big Dye®-технологии (Applied Biosystems) в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН. Сравнение исходной ДНК до гибридизации и после снятия её с гибридизованного чипа методом мягкой неразрушающей абляции показало полную идентичность последовательностей. Рисунок 5. Электрофореграмма амплификатов ДНК после абляции. 90 п.н. – целевая ДНК, 287 п.н. – соосадитель. Дорожки 2, 9 и 11 – пустые. 1 – положительный контроль ПЦР; 3 – результаты абляции при длине волны 126 мкм; 4 – результаты абляции при длине волны 129,5 мкм; 5 – отрицательный контроль абляции; 6 – результаты абляции при длине волны 129,5 мкм; 7 – результаты абляции при длине волны 126 мкм; 8 – контроль абляции; 10 - положительный контроль переосаждения; 12 - отрицательный контроль переосаждения; Результаты эксперимента окончательно доказывают возможность разрушения ДНКДНК гибридов на поверхности биочипа и перевода целевых молекул ДНК в газовую фазу. Таким образом, показана принципиальная возможность снятия целевой ДНК с ячеек реальных биочипов на кремниевой основе. 11 Глава 4 Обсуждение результатов Водородные связи относят к числу слабых химических взаимодействий, для них характерна сравнительно низкая прочность: энергия водородной связи в 5–10 раз ниже, чем энергия химической связи. По энергии водородные связи занимают промежуточное положение между химическими связями и Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями. Терагерцовое излучение по энергии кванта лежит в области энергий водородных и Ван-дерваальсовых связей (Таблица 2). Энергия одного кванта излучения на порядки меньше энергии химических связей в молекуле, следовательно, энергии терагерцового кванта недостаточно для разрыва ковалентной связи в молекуле, а для разрыва водородной связи достаточно энергии 10 - 100 квантов. Поскольку энергия терагерцового кванта мала, можно ожидать, что в процессе десорбции в газовую фазу будут переходить молекулы, сохранившие ковалентные связи. Такой процесс был действительно обнаружен и назван мягкой неразрушающей абляцией. Таблица 2. Энергии разных типов связей в молекуле в сравнении с энергиями квантов лазерного излучения различной длины волны. Тип связи Энергия связи Энергия связи (на моль вещества) (на одну молекулу вещества) Ван-дер-ваальсовы взаимодействия 0,05-1,2 ккал/моль 0.3-7.5 10-24 ккал Водородная связь 1- 12 ккал/моль 6.3-75 10-24 ккал Ковалентная связь 23.8 -95 ккал/моль 5.7- 0. 29 10-23 ккал Квант терагерцового излучения ЛСЭ 3,6 х 10 -25 ккал (λ=130 мкм) 4,9 х 10 -24 ккал Квант CO2 лазера (λ= 9600 нм) Квант HeNe лазера (λ=633нм) 7,5 х 10 -23 ккал Доказательство неразрушающего характера мягкой абляции ДНК проводили на основе анализа структурных и функциональных характеристик десорбируемого материала. Для этого были использованы три подхода: (1) измерение размеров частиц с помощью ДСА, (2) изучение продуктов абляции методами рестрикционного анализа и секвенирования и (3) визуализация изменений, происходящих с молекулами ДНК в процессе мягкой неразрушающей абляции с помощью атомно-силовой микроскопии. В качестве основного доказательства неразрушающего характера процесса абляции проведено полное секвенирование ДНК плазмиды pUC18. Показало совпадение последовательностей исходной и аблированной ДНК на 100%. Измерение размеров ДНК в газовой фазе представляет самостоятельный интерес, поскольку проведено впервые и позволило оценить персистентную длину ДНК в новых 12 условиях. До сих пор такие оценки проводились на основании измерений характеристик молекул, зависящих от их конформации в растворе или с помощью атомно-силовой микроскопии препаратов ДНК на плоскости. В экспериментах были получены частицы ДНК длиной от 1400 п.н. до 48500 п.н. Размеры частиц варьировали от 20 нм до 130 нм. Экспериментально полученные измерения были сопоставлены с моделью ЛифшицаГросберга-Хохлова. В диапазоне длин ДНК от 6 500 п.н. до 40 000 п.н. экспериментальные точки совпали с теоретическим расчетом. Совпадение расчетных и экспериментальных значений подтвердило правильность исходного предположения о том, что в газовой фазе при использовании для десорбции терагерцового лазера с низкой энергией кванта будут преобладать целые молекулы. Разрушение ДНК-гибрида на поверхности модельного биочипа и десорбция целевых ДНК позволили получить ещё одно доказательство неразрушающего характера процесса. Кроме того, эксперимент с модельным биочипом показал принципиальную возможность использования нового метода для снятия целевой ДНК, гибридизованной на биочипе. Возросшее в последние годы количество производителей и методов производства биочипов приводит к необходимости сравнивать результаты анализа, полученные с использованием разных платформ. В связи с этим в последнее десятилетие опубликовано значительное количество работ, посвященных анализу результатов применения биочипов различных производителей на идентичных смесях нуклеиновых кислот [Larkin J.E. et al., 2005, Lee J.K. et al., 2003, Mecham B.H. et al., 2004, Barnes M. et al., 2005, Harbig J et al., 2005]. Вопрос о том, что же за последовательность на самом деле гибридизуется на чипе все также является актуальной, в особенности, учитывая постоянно растущий рынок производства и применения биочипов. Отсоединение и десорбция целевых ДНК с помощью терагерцового излучения дает возможность для разработки методов анализа целевой ДНК, связавшейся на реальном биочипе. Перевод ДНК в газовую фазу также расширяет спектр методов анализа этого биополимера, в частности, возможности масс-спектрометрии ДНК. Таким образом, основным результатом работы является разработка нового метода перевода в газовую фазу молекул ДНК и доказательство того, что при таком переводе в газовой фазе образуются частицы из единичных молекул ДНК, сохранивших свою первичную структуру и способные к передаче наследственной информации. Предложен ряд направлений практического применения нового метода для молекулярно-генетических исследований: для совершенствования технологии 13 производства биочипов, масс- спектрометрии ДНК и спектроскопии ДНК в газовой фазе. В диссертации обсуждаются конкретные пути методической доработки предложенных применений. ВЫВОДЫ 1. Разработан метод перевода молекул ДНК в газовую фазу под действием терагерцового излучения ЛСЭ длиной волны 130 мкм. На примере ДНК плазмиды pUC18, фрагментов ДНК фага и ДНК фагов и Т7 показано, что в результате мягкой неразрушающей абляции происходит перевод молекул ДНК в газовую фазу в виде компактизованных структур, причём молекулы ДНК, после пребывания в аэрозоле сохраняют способность передачи наследственной информации. 2. На примере pUC18, показано, что аблированная плазмида сохранила способность к трансформации клеток E. coli и репликации своего генома. Методом секвенирования показана полная идентичность последовательности ДНК плазмиды до и после абляции. Таким образом, доказано, что абляция ДНК под воздействием терагерцового излучения длиной волны 130 мкм носит неразрушающий характер. 3. В газовой фазе измерены размеры частиц, образуемых молекулами ДНК. Установлено, что во время пребывания в газовой фазе происходит конденсация ДНК. C помощью спектрометра аэрозолей определено, что диаметр глобулярных структур, образуемых молекулами ДНК в аэрозоле зависит от длины молекулы. Определена персистентная длина ДНК в газовой фазе, которая составила менее 1 нм. 4. Проведена мягкая неразрушающая абляция синтетической ДНК длиной 90 нуклеотидов, гибридизованной с комплиментарным олигонуклеотидом длиной 17 нуклеотидов, иммобилизованным на поверхности модельной ячейки биочипа. Методом секвенирования показана идентичность последовательности до и после абляции. Таким образом, доказана принципиальная возможность плавления ДНК-гибридов и снятия целевой ДНК с ячеек реальных биочипов на кремниевой основе. 14 Публикации 1. Petrov A.K., Kozlov A.S., Malyshkin S.B., Taraban M.B., Popik V.M., Scheglov M.A., Goriachkovskaya T.N., Peltek S.E. Nondestructive transfer of complex molecular systems of various origins into aerosol phase by means of submillimeter irradiation of free-electron laser (FEL) in the Siberian center for photochemical research // Nuclear instruments and methods in physics research. Sec. A. – 2007. – V. 575, No 1/2. – P. 68-71. 2. Петров А.К., Козлов А.С., Тарабан М.Б., Горячковская Т.Н., Малышкин С.Б., Попик В.М., Пельтек С.Е. Мягкая абляция биологических объектов под воздействием субмиллиметрового излучения лазера на свободных электронах. // ДАН, 2005. – Т. 404. - № 5. - С. 698-700. 3. Вагин М.С., Уницын А.С., Петров А.К., Козлов А.С., Малышкин С.Б., Попик В.М., Горячковская Т.Н., Пельтек С.Е. Исследование возможности определения масс биологических нанообъектов методом терагерцовой лазерной абляции // Вестник НГУ. Серия: Физика. 2009. - Т. 4, - вып. 3. - С. 74-77 4. Пельтек С.Е., Попик В.М., Горячковская Т.Н., Мордвинов В.А., Петров А.К. Способ абляции целевой ДНК с поверхности ДНК-биочипов. Патент РФ № 2410439. 2009. 5. Peltek S.E., Demidov E.A., Demidova E.V., Goryachkovskaya T.N., Kolchanov N.A., Kulipanov G.N., Mesheryakova I.A., Popik V.M., Scheglov M.A., Vinokurov N.A. Novosibirsk FEL terahertz emission for biological application (plenary) // 2nd International THz-Bio Workshop 2011.01.1920, - Seul National University, Seoul, Korea. 2011 – P. 37 6. Peltek S.E., Goryachkovskaya T.N., Kozlov A.S., Petrov A.K., Scheglov M.A., Mordvinov V.A., Popik V.M. FEL radiation use for large biomolecules ablation // II International symposium: Topical problems of biophotonics: TPB 2009: Proceedings, 19-24 July, 2009, Nizhny Novgorod – Samara – Nizhny Novgorod, Russia. - Nizhny Novgorod: Inst. of appl. Physics, 2009. – C. 304. 7. Пельтек С.Е., Попик В.М., Колчанов Н.А., Кулипанов Г.Н., Петров А.К., Горячковская Т.Н., Козлов А.С., Мордвинов В.А., Банникова С.В., Малуп Т.К., Демидов Е.А., Дужак Т.Г., Щеглов М.А. Терагерцовое излучение: проблемы и перспективы применения в биологии. // Сборник трудов конференции «Химическая биология – Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» - Новосибирск, 2009 – С. 44. 8. Peltek S.E., Goryachkovskaya T.N., Dujak T.G., Mordvinov V.A., Popik V.M., Scheglov M.A., Kozlov A.S., Malyshkin S.B., Petrov A.K. FEL Radiation Use for Large Biomacromolecules Ablation. // XVII International Synchrotron Radiation Conference "SR-2008", Новосибирск, 2008. P. 19. - Abstract MOPPH029. 9. Peltek S.E., Goryachkovskaya T.N., Dujak T.G., Mordvinov V.A., Kolchanov N.A., Popik V.M., Scheglov M.A., Kozlov A.S., Malyshkin S.B., Petrov A.K. FEL radiation use for large biomacromolecules ablation // BGRS 2008, Novosibirsk, 2008. – P. 181. 10. Peltek S.E., Goryachkovskaya T.N., Kusnetsova T.N., Mordvinov V.A., Popik V.M., Scheglov M.A., Kozlov A.S., Malyshkin S.B., Petrov A.K. FEL Irradiation Use for the Biochip Production Standardization // 29th Intern. Free Electron Laser Conference, Aug 26–31, 2007, Budker INP, Novosibirsk, Russia. 11. Kozlov A.S., Petrov A.K., Malyshkin S.B., Taraban M.B., Popik V.M., Scheglov M.A., Goriachkovskaya T.N., Peltek S.E. Nondestructive transfer of complex molecular systems of various origin into aerosol phase by means of submillimeter irradiation of free electron laser (fFEL) of the Siberian center for photochemical research // Conference digest of the 2006 Joint 31st International conference on infrared and millimeter waves and 14th International conference on terahertz electronics: IRMMW – THz 2006, Sept. 18-22, 2006, Shanghai, China/ Eds: Xue Chu Shen e.a. – S.l., 2006. – P. 557. 15 12. Petrov A.K., Kozlov A.S., Taraban M.B., Goryachkovskaya T.N., Malyshkin S.B., Popik V.M., Peltek S.E. Mild ablation of biological objects under submillimeter radiation of the free electron laser //The Joint 30th International conference on infrared and millimeter waves and 13 th International conference on terahertz electronics: IRMMW-THz2005, Williamsburg, Virginia, USA, Sept. 19 – 23, 2005. – Piscataway: IEEE, vol. 1. P. 303-304. 16