Решеточные модели белков с усложненным механизмом
advertisement
На правах рукописи Пальянов Андрей Юрьевич РЕШЕТОЧНЫЕ МОДЕЛИ БЕЛКОВ С УСЛОЖНЕННЫМ МЕХАНИЗМОМ УКЛАДКИ, ИХ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ПОВЕРХНОСТИ И КИНЕТИКА УКЛАДКИ 01.04.17 – химическая физика, в том числе физика горения и взрыва АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Новосибирск – 2008 Работа выполнена в Институте теплофизики им. С.С. Кутателадзе Сибирского отделения РАН (г. Новосибирск) Научные руководители: доктор физико-математических наук, профессор Чекмарев Сергей Федорович кандидат физико-математических наук, Титов Игорь Иванович Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, Воробьев Юрий Николаевич доктор биологических наук, Омельянчук Леонид Владимирович Ведущая организация: Институт белка РАН, г. Пущино, Московская область Защита состоится « » 2008 г. в час мин на заседании диссертационного совета Д 003.014.01 при Институте химической кинетики и горения СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, ул. Институтская, 3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТ СО РАН. Автореферат разослан «___»_________ 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, д.х.н. Онищук А.А. 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Белки представляют собой широкий класс биологических макромолекул, интерес к которым вызван как изучением процессов жизнедеятельности организмов и растений, так и большой практической важностью при решении задач, связанных с биотехнологиями и медициной. Диссертационная работа посвящена исследованию укладки белка актуальной проблеме молекулярной биологии, привлекающей внимание специалистов из различных областей науки - биологии, физики, химии более 4-х десятилетий. Укладка – сворачивание белковой цепи из развернутого состояния в нативную структуру, обладающую биологической активностью. Укладка происходит в живой клетке, но при всем разнообразии механизмов укладки, подчиняется общему принципу – нативная структура белка определяется его аминокислотной последовательностью (Анфинсен, 1973). Хотя общие принципы уже достаточно хорошо известны (Финкельштейн, Птицын, 2002; Whitford, 2005), сценарии укладки конкретных белков варьируются в широких пределах: от простого процесса «ничего/все» до гораздо более сложного поведения, связанного с усложненной конформацией нативного состояния и/или наличием метастабильных промежуточных состояний (интермедиатов). В последние годы были обнаружены два новых класса белков: белки, содержащие узлы в составе нативной структуры (Taylor, 2000; Ahn et al., 2003; Virnau et al., 2006) и белки, обладающие помимо нативного конкурирующим латентным состоянием, в частности, прионы (Prusiner, 1996). Диссертация посвящена исследованию укладки этих двух типов белков с помощью компьютерного моделирования. Поскольку современные компьютеры не позволяют решить данную задачу на атомном уровне разрешения, для моделирования используется простейшее приближение – белок представляется в виде последовательности мономеров, моделирующих аминокислоты, которые размещены в узлах кубической решетки, а взаимодействие между мономерами определяется конфигурацией нативного (и латентного) состояния с помощью модели Го (Go, 1983). Хотя такое приближение является весьма грубым, оно хорошо себя зарекомендовало для выявления общих закономерностей укладки белков в ходе многочисленных исследований за последние 20 лет (Dill, 1985; Sali et al., 1994; Onuchic et al., 1996; Gutin et al., 1998; Pande, Rokhsar, 1999; Borrero, Escobedo, 2006), и, посуществу, является единственно возможным приближением, которое позволяет получить статистически значимые результаты по кинетике укладки за разумное время моделирования. 3 Цель работы состоит в изучении механизмов укладки узельного и прионоподобного белков и включает следующие задачи: 1. Дизайн решеточных моделей узельного и прионоподобного белков. 2. Разработка компьютерной программы для моделирования и визуализации укладки решеточных белков. 3. Изучение процесса укладки и определение механизма заузливания для узельного белка. 4. Изучение укладки прионоподобного белка с акцентом на оценку критических моментов и факторов, влияющих на выбор между нативной и латентной конформациями. 5. Разработка «гидродинамического» подхода, дающего дополнительную информацию о процессе укладки белка на основе рассмотрения распределения потоков изображающих точек системы в конформационном пространстве. Основные защищаемые положения 1. Анализ моделей узельного белка, содержащих узлы различной степени сложности, зависимость поверхности свободной энергии (ПСЭ) и среднего времени укладки (СВУ) от сложности узла. 2. Модели белков с латентными состояниями - простая модель (27 мономеров) и более реалистичная (70 мономеров), содержащая структурные элементы, присущие природному прионовому белку. Карты контактов и ландшафт ПСЭ, обнаружение бифуркационного бассейна, представляющего собой область притяжения, в которой происходит выбор дальнейшего пути укладки между нативным и латентным состояниями. Кинетика укладки, модель переходов между бассейнами, вычисление констант переходов. 3. Влияние энергии латентных контактов на время укладки в нативное состояние, эффект ускорения укладки в присутствии латентного состояния, изменение вероятности укладки в нативное состояние под действием точечных мутаций. 4. «Гидродинамический» подход к анализу кинетики укладки белков и его иллюстрация на примере решеточной альфа-шпильки, анализ потоков изображающих точек системы в конформационном пространстве, обнаружение «вихревой» зоны, представляющей собой новый тип тупикового интермедиата. Научная новизна. Для изучения механизма укладки недавно обнаруженного узельного белка (Taylor, 2000) впервые предложено несколько решеточных моделей, содержащих узлы разной сложности в составе нативных структур, и исследована зависимость времени укладки от сложности узла. Впервые проведено исследование укладки прионоподобного белка с учетом структурных особенностей природного белка. Обнаружено наличие неизвестного ранее бифуркационного бассейна – области притяжения на поверхности свободной энергии, в которой происходит выбор путей в нативную и латентную структуры. Установлена зависимость СВУ в нативное 4 состояние от энергии латентных контактов, показывающая, что примесь латентной структуры может не только замедлять укладку, но и наоборот, в определенном интервале значений энергии латентных контактов, значительно ускорять ее; предложен механизм, объясняющий природу данного эффекта. Впервые введен и апробирован на примере решеточной модели альфашпильки «гидродинамический» подход к анализу кинетики укладки белков, показавший, что распределение потоков изображающих точек системы в ходе укладки может существенно отличаться от того, что ожидается из ландшафта ПСЭ, вплоть до появления «вихревых» тупиков, не видимых на ПСЭ. Практическая значимость. Выявленные закономерности в механизмах поведения заузленного и прионоподобного белков могут представлять интерес для разработки лекарств на основе искусственно создаваемых белков с заданными свойствами, а также для выявления механизмов, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний человека и животных (болезнь Альцгеймера, губчатые энцефалопатии и др.). В частности, наличие бифуркационного бассейна в прионоподобном белке быть использовано для разработки методов управления процессом укладки путем внесения мутаций. «Гидродинамический» подход дает более детальную картину укладки и, соответственно, возможность выявить скрытые процессы, не видимые в рамках стандартного анализа на основе рассмотрения ПСЭ. Личный вклад автора. Методическая часть работы: создание решеточных моделей белков (узельного белка и белков с латентными состояниями), разработка и реализация алгоритмов для моделирования укладки белков и визуализации процесса укладки, обобщение кинетической схемы укладки на случай белков с латентными состояниями и расчет констант скоростей переходов. Исследовательская часть: обработка и анализ результатов моделирования всех рассмотренных систем, в частности, обнаружение бифуркационного бассейна на поверхности свободной энергии прионоподобного белка и эффекта ускорения укладки в присутствии латентного состояния; выявление роли мутаций и их влияния на вероятность укладки в нативное состояние; объяснение механизма формирования «вихря» при гидродинамическом описании укладки. Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих совещаниях и конференциях: Международная Научная Студенческая конференция (Новосибирск, 2002, 2003, 2004, 2005), Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, 2002, 2004, 2006), Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow 2003, 2005, 2007), PanREC-conference - All-Rec Meeting, Kazan, 2004 (CRDF), Международная молодежная школа-конференция по актуальным проблемам 5 химиии и биологии (Владивосток, 2005), the 21 Symposium of the Protein Society (Boston, 2007). По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах. Работа выполнена в рамках государственной целевой программы (гос. рег. 01.2.007 05696), а так же грантов РФФИ (02-03-32048, 06-04-48587), INTAS (2001-2126) и CRDF (RUP2-2629-NO-04). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения и списка литературы из 143 наименований. В ней 93 страницы и 41 рисунок. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ: Во введении обоснована актуальность исследования укладки белков с помощью компьютерного моделирования и аргументирован выбор решеточной модели, являющейся компромиссом между детализацией описания белков и вычислительными затратами, сформулированы цели и задачи работы, приведены положения, выносимые на защиту и дана краткая аннотация диссертационной работы. В первой главе обсуждается проблема укладки белков, ее роль в молекулярной биологии, актуальные задачи и объекты в этой области, а также существующие подходы к данной проблеме, основанные на методах компьютерного моделирования. П 1.1 представляет собой введение в проблему укладки белков, ее роль в молекулярной биологии. Интерес к проблеме вызван тем, что белки являются одним из основных компонентов всех живых организмов и растений. Они выполняют в клетке и в организме самые разнообразные функции – строительные, транспортные, каталитические, регуляторные, двигательные, сигнальные и т. д. Белок является гетерополимером, звеньями которого служат аминокислоты. Последовательность аминокислот в цепи и ее длина кодируется генами. В процессе укладки белок сворачивается в уникальную третичную структуру, называемую нативной, которая обеспечивает его биологическую функциональность. Несмотря на то, что существует много факторов, влияющих на процесс укладки белковой, можно считать установленным, что нативная структура белка определяется его аминокислотной последовательностью. Впервые это было продемонстрировано в работах Анфинсена, показавшего экспериментально (Anfinsen, 1973), что укладка может идти и при "ренатурации" - сворачивании развернутой белковой цепи in vitro (в пробирке), причем идти самостоятельно, т.е. без помощи других макромолекул, что позволило рассматривать укладку отдельно от остальных процессов. 6 В п. 1.2 описывается общее современное состояние проблемы изучения укладки белков, а в последующих более подробно рассматриваются наиболее важные моменты. В п. 1.3 описывается так называемый парадокс Левинталя, суть которого состоит в том, что число возможных конформаций, которые может формировать белок, настолько велико, что время, которое понадобилось бы для поиска нативной структуры методом прямого перебора, на много порядков превышает возраст вселенной, в то время как в природе процесс укладки происходит за времена в интервале микросекунд- секунд. П. 1.4 посвящен описанию парадигмы энергетического ландшафта в теории укладки белков. Рассматриваются поверхности потенциальной энергии (ППЭ) и свободной энергии (ПСЭ) белка. Чтобы построить эти поверхности, многомерное конформационное пространство белка обычно сводится к небольшому числу переменных (параметров порядка), которые, предположительно, удовлетворительно характеризуют состояние белка; в качестве таковых используются радиус инерции, число нативных контактов и др. Локальное значение свободной энергии белка определяется как Fi = U i - T ⋅ Si , где Т – температура, а Ui и Si – средняя внутренняя энергия и энтропия при значениях параметров порядка, отвечающих данной точке i сокращенного конформационного пространства, при этом энтропия характеризует число микроскопических состояний, которые реализуют состояние белка при данных значениях параметров порядка. Таким образом, минимумы на ПСЭ показывают (мета-) стабильные характеристические состояния, в которых система может быть обнаружена с высокой вероятностью. В п. 1.5 рассматривается модель энергетической воронки – характерной формы поверхности свободной энергии белков, способных к упаковке. Среди множества возможных аминокислотных последовательностей те, что соответствуют природным белкам, имеют характерные особенности, позволяющие молекуле укладываться в нативную структуру. Для них, по мере того, как структура увеличивает свое сходство с нативной, уменьшается и потенциальная энергия. Эта корреляция энергии и структуры приводит к направленному движению в сторону нативного состояния (Рис. 1.1б), что и позволяет разрешить парадокс Левинталя для природных белков. Случайная последовательность не обнаруживает такой корреляции между энергией и структурой; соответствующая поверхность будет содержать лишь случайные неровности, а систематический сдвиг в сторону нативной структуры будет отсутствовать (Рис. 1.1а) (Nymeyer et al., 1998). 7 Рис.1.1. Иллюстрация различий между случайной аминокислотной последовательностью (а) и последовательность, соответствующей природному белку, способному к укладке (б). Далее, в п. 1.6, рассматривается термодинамика и кинетика укладки системы с двумя стабильными состояниями, которые соответствуют нативному бассейну и бассейну полукомпактной глобулы на ПСЭ, а также природа и свойства барьера свободной энергии, который их разделяет. В п. 1.7 обсуждается ансамбль переходных состояний, в п. 1.8 - сворачивание белков через образование промежуточных состояний, в п. 1.9 - переходное состояния и ядро укладки. П. 1.10 посвящен представлению белка при разных уровнях детализации, от решеточных моделей до полноатомных, п. 1.11 - современным методам компьютерного моделирования укладки белков - молекулярной динамике (МД), п. 1.11.1, и методу Монте-Карло (МК), п. 1.11.2. Несмотря на то, что вычислительные мощности компьютеров постоянно растут, даже для малых белков до сих очень трудно исследовать укладку на атомном уровне разрешения, используя известные пакеты для моделирования белков, например, CHARMM (Brooks et al., 1983) или GROMACS (Lindahl et al., 2001). Характерным примером является работа (Duan and Kollman, 2001), в которой для моделирования одной короткой (1 мкс) траектории укладки фрагмента из 36 остатков (a villin headpiece sub-domain) на атомном уровне разрешения потребовалось 2 месяца вычислений на 256-процессорном CRAY'е. Многочисленные попытки ускорить вычисления путем деформации поверхности потенциальной энергии и повышения температуры (umbrella potentials, multicanonical sampling, hyperdynamics, jump-walking и др., Wales, 2004) не привели к радикальному изменению ситуации. Более многообещающими, по своим потенциальным возможностям, являются недавно разработанные методы «отбора пути реакции» (transition path sampling) (Dellago et al., 1964) и его обобщения, например (Allen et al., 2005), и запирания траектории в бассейны притяжения на поверхности потенциальной энергии (Chekmarev, 2001; Krivov et al., 2002). Первый ускоряет вычисление скорости перехода между бассейнами притяжения за счет следования пути реакции, а второй - за счет "шлюзования" системы по бассейнам. Однако, и тот и другой также не дают общего решения проблемы, 8 оставаясь слишком "дорогими" с вычислительной точки зрения; они могут быть использованы только как полезные компоненты более комплексного подхода. Общего решения проблемы не дают и распределенные вычисления методом параллельных копий (Voter, 1998, Shirts and Pande, 2001; проект Folding@Home), поскольку данный метод пригоден только для исследования простейшей («все/ничего») кинетики. Расчет по методу МК состоит в построении последовательности конформаций белка путем их случайного изменения. Каждая новая конформация принимается или отвергается в зависимости от вероятности ее появления по распределению Больцмана (схема Метрополиса, 1953). Метод МК гораздо более экономичен, чем МД, поскольку не требует вычисления сил, однако он не воспроизводит динамические траектории системы, давая только приближенное описание кинетики в рамках статистического ансамбля. Заключительный п. 1.12 описывает белки с усложненным механизмом укладки, которые являются объектом изучения в рамках данной работы: 1. Белок, образующий узел в составе нативной структуры. Это является довольно необычным явлением, поскольку образование узла сопряжено с преодолением большого энтропийного барьера, обусловленного малым числом состояний, через которые может осуществиться такой процесс. 2. Прионовый белок, обладающий наряду с нативным конкурирующим (латентным) состоянием. Нативное состояние преимущественно состоит из альфа-спиралей, а латентное содержит значительную долю бета-тяжей. В латентном состоянии белок склонен к агрегации с образованием амилоидных фибрилл, вызывая нейродегенеративные заболевания, такие, как болезни Альцгеймера, Паркинсона и т.д. (Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink, 1998; Uversky et al., 1999). Эти болезни, как правило, развиваются в случае, когда защитные системы клеток и организма в целом не справляются с функцией ликвидации неправильно свернутых белков, либо при мутациях, увеличивающих вероятность укладки в латентное состояние. Во второй главе описываются применяемые методы. Для исследования использовалось «минималистское» описание белка, при котором аминокислоты представляются мономерами, расположенными в узлах кубической решетки (п. 2.1). В качестве энергетической модели (п. 2.2) использовалась модель Го (Gō, 1983), в которой мономеры, находящиеся в контакте в нативной (и латентной) структуре, взаимодействуют с притяжением, а все остальные не взаимодействуют вообще. Считается, что два мономера находятся в контакте, если они расположены в соседних по одной из координат узлах решетки В отличие от «минималистских» вне-решеточных моделей, в которых допускается непрерывное смещение мономеров, решеточная модель позволяет получать результаты с высокой статистической достоверностью за разумное вычислительное время. Как уже отмечалось, такое приближение 9 является весьма грубым, однако оно хорошо себя зарекомендовало для выявления общих закономерностей укладки белков в ходе многочисленных исследований за последние 15 лет. В п. 2.3 рассматривается проблема кодирования структуры белка, возникающая в связи с необходимостью идентификации и сравнения структур. В рамках данной работы был предложен вариант кодирования инвариантный к сдвигам и поворотам, позволяющий сократить вычислительные затраты на эту процедуру на порядок. В основе предложенного способа лежит кодировка смещения каждого последующего по цепи мономера относительно предыдущего цифрой от 0 до 5, кодирующей соответствующий вектор смещения. Для обеспечения инвариантности к сдвигам и поворотам система векторов смещения выбирается путем привязки к структуре (берутся три первых ортогональных вектора, найденных вдоль цепи), а не к пространству. Такая кодировка значительно сокращает объем памяти, который необходим для хранения структур белка, найденных в процессе укладки. Моделирование укладки (п. 2.4) производилось методом МК с помощью алгоритма Метрополиса (Metropolis et al., 1953). На каждом шаге по имеющейся конформации строится следующая, для чего используется одно из общепринятых элементарных движений (Sali et al., 1994), показанных на Рис.2.1. Рис. 2.1. Движения, разрешенные для переходов между конформациями: а) поворот концевого мономера, б) перескок углового мономера и в) коленваловое вращение 2-х мономеров. Новая конформация принимается с вероятностью, равной отношению больцмановских весов новой и старой конфигураций pi →i +1 = exp[-( Ei +1 − Ei ) / kBT ] при Ei +1 > Ei pi→i +1 = 1 при Ei +1 ≤ Ei где T- температура (для всех систем, рассматриваемых в данной работе, она измерялась в единицах энергий контактов, т. е. постоянная Больцмана kB принималась равной 1), а Ei и Ei+1 - энергии старой и новой конформаций, соответственно. Если новая конформация не принимается, то система остается в старой конформации. В асимптотическом пределе частота пребывания системы в данном состоянии (конформации) соответствует каноническому распределению при данной температуре. Далее следует описание процедуры генерации матриц энергий контактов в случае присутствия только нативной структуры, а так же при наличии латентной (п. 2.5). В п. 2.6-2.7 рассмотрены методы построения поверхностей 10 свободной энергии (ПСЭ) для процесса укладки, в том числе в случае присутствия латентного состояния. П. 2.8 посвящен проблеме идентификации бассейнов притяжения на ПСЭ и перевальных точек между ними. В работе предложен подход, позволяющий решить эту задачу для коротких модельных белков. Для этого осуществляется перебор состояний, начиная со дна нативного или латентного бассейна и поднимаясь последовательно выше по свободной энергии. Для каждого состояния определяется, принадлежит ли оно данному бассейну (переходы без повышения свободной энергии из него возможны только в этот бассейн) или границе бассейна (возможны переходы в другие бассейны без повышения свободной энергии). Поиск продолжается до тех пор, пока при очередном повышении уровня свободной энергии не будет найдено новых состояний, принадлежащих данному бассейну. При этом нативный бассейн будет окружен множеством граничных точек, т. е. все возможные переходы из данного бассейна в другой будут проходить через найденное множество граничных точек. Следует отметить, что найденные состояния не исчерпывают все множества состояний в бассейнах и на границах. Однако, как показали расчеты с увеличенной длиной траектории, на больших временах числа состояний растут приближенно пропорционально длине траектории. Поэтому можно полагать, что приведенные числа правильно отражают относительные свободные энергии нативного и латентного бассейнов и переходных состояний. В третьей главе рассматривается укладка узельного белка. Фрагмент природного белка 1YVE (Рис.3.1) содержит в составе нативной структуры узел-восьмерку (Taylor, 2000). Рис.3.1. Фрагмент природного белка 1YVE (Acetohydroxy Acid Isomeroreductase), содержащий узел-восьмерку. В диссертационной работе предложена простейшая решеточная модель структуры, содержащей узел, изоморфный оригиналу (Рис. 3.2a). Для исследования вопроса о том, как сложность узла влияет на скорость укладки в заузленную нативную структуру, мы рассматриваем еще две структуры модификации данной модели, в которых мономеры занимают те же точки пространства. Одна из них имеет более простой узел (Рис. 3.2б), а вторая вообще не содержит узла (Рис. 3.2в). Для каждой из этих трех моделей была построена соответствующая матрица энергий взаимодействия по модели Го. 11 (a) структура с узлом-восьмеркой (б) структура с более простым узлом (в) структура без узла Рис.3.2. Нативные структуры для модели белка с узлом-восьмеркой (а), и моделей с более простым узлом (b) и без узла (с). Энергии этих трех структур равны между собой и составляют -21.0. Расчеты показали, что белок успешно сворачивается во все три структуры, включая узел-восьмерку. Для каждой из трех структур была рассчитана зависимость среднего времени укладки (СВУ) от температуры. Все три кривые имеют характерную U-образную зависимость от температуры, что типично для белков (Galzitskaya, Finkelstein, 1995), однако, несмотря на равные значения энергии нативных состояний, «оптимальные» температуры укладки Tf, т.е. температур, при которых СВУ минимальны, для них различаются. Для узла-восьмерки Tf составила 0.5, для простого узла - 0.475 и для безузельного белка - 0.425, т.е. она уменьшается по мере уменьшения сложности узла. Минимальные значения СВУ составили ≈ 2.17·105 шагов Монте-Карло для узла-восьмерки и ≈ 1.49·105 для структур с простым узлом и без узла. Таким образом, белок с узлом-восьмеркой укладывается дольше, чем два остальных белка. Рассмотрение поверхностей свободной энергии показало, что уменьшение времени укладки для белка с узлом-восьмеркой обусловлено появлением выраженного энтропийного барьера между бассейном полукомпактных состояний и нативной структурой, который является следствием структурных ограничений при формировании узла. В четвертой главе рассматривается простая модель белка с нативным и латентным состояниями - решеточный гетерополимер, состоящий из 27 мономеров (Рис. 4.1). Система сконструирована таким образом, что имеются две минимальные и равные по энергии компактные структуры, значительно различающиеся по геометрии. Система оказалась способной сворачиваться в обе структуры, при этом минимальные СВУ оказались практически равными и составили ≈ 3.9·105 МК шагов, но вероятность укладки в одну из них (Рис. 4.1б) была в 1.56 раз выше, чем в другую (Рис. 4.1а). Соответственно, первая структура рассматривалась как нативная. 12 Рис. 4.1. Простая решеточная модель белка (27-мер) с латентным (а) и нативным (б) состояниями. Мономеры, изображенные темно-серым цветом, отвечают фрагменту цепи, общему для обеих конформаций. В п. 4.1. описано построение и анализ поверхности свободной энергии, а в п. 4.2 – поверхности вероятности укладки. В качестве коллективных переменных (параметров порядка), характеризующих конформационное пространство системы, использовались числа нативных и латентных контактов. Было выяснено, что поверхность свободной энергии состоит из трех широких бассейнов – для полукомпактной глобулы, нативного и латентного состояний. Поверхность вероятности укладки, показывающая вероятность достижения нативного и латентного состояний из различных областей конформационного пространства, также состоит из 3-х характерных областей: в 2-х областях доминируют вероятности укладки в нативное и латентное состояния, а в 3-ей - вероятности укладки в нативное и латентное состояние примерно равны. Эта последняя область представляет собой область бифуркаций траекторий укладки, и на ПСЭ она лежит на границе между бассейнами для полукомпактной глобулы и нативного и латентного состояний. Область, где доминирую переходы в нативное состояние гораздо шире, чем соответствующая область переходов в латентное состояние. Определив границы бассейнов (п. 4.3) с помощью алгоритма, описанного в п.2.8, и отслеживая в ходе траекторий укладки перемещение системы, были подсчитаны времена пребывания в бассейнах и частоты переходов между ними. В результате была построена матрица скоростей переходов между бассейнами (п. 4.4). Наряду с численным моделированием было проведено теоретическое исследование кинетики укладки. Для этого была использована система линейных кинетических уравнений (п. 4.5), описывающая переходы между характеристическими состояниями системы по схеме N ↔ NG ↔ G ↔ GL ↔ L : 13 dnN = k NG → N nNG − k N → NG nN dt dnNG = k N→ NG nN − ( k NG →G + k NG → N ) nNG dt dnG = k NG →G nNG + kGL→G nGL − ( kG → NG + kG →GL ) nG dt dnGL = kL→GL nL − ( kGL→G + kGL→L ) nGL dt dnL = kGL→L nLG − kL→GL nL dt (1) где N - нативное состояние, L – латентное, G - полукомпактная глобула, NG и GL – соответствующие переходные состояния между ними, а nα(t)заселенности данных состояний в зависимости от времени (α = N, G, L, NG, GL). Чтобы вычислить константы скоростей, входящие в систему уравнений (1), было проведено численное моделирование установления равновесного состояния в системе (Рис. 4.2). После чего, сравнивая решение системы уравнений (1) с результатами численного моделирования (Рис. 4.2) и минимизируя среднеквадратичное отклонение между распределениями, были вычислены константы скоростей kα→β. Рис. 4.2. Зависимость заселенностей нативного (N), латентного (L) и глобулярного (G) состояний от времени при установлении равновесия в системе, T = 0.6. Пунктирные линии - данные прямого моделирования, сплошные - расчет по кинетической модели. Зная константы скоростей и используя систему уравнений (1), можно рассчитать поведение системы в интересующих условиях. В частности, можно вычислить распределение времен укладки в неравновесных условиях, когда траектория системы стартует из развернутого состояния и прерывается при достижении нативного. Оно определяется как pf(t) = dnN(t)/dt, при этом при вычислении nN(t) константа kN→NG в первом уравнении системы (1) полагается равной нулю. На Рис. 4.3 представлен такой расчет в сравнении с результатами прямого численного моделирования. Согласие распределений времен укладки свидетельствует о том, что описанный метод оценки 14 констант скоростей вполне работоспособен. В качестве исходных зависимостей nα(t) можно использовать и зависимости, получаемые в эксперименте (например, Gruebele, 2002; Chekmarev et al., 2005). Это открывает возможность вычисления констант скоростей основных каналов конформационных превращений для сложных систем, представляющих практический интерес. Рис. 4.3 Распределение времен укладки, T = 0.6. Крестики – данные прямого моделирования, сплошная кривая – расчет по кинетической модели. В п. 4.6. приводятся результаты мутационного анализа - изменение времени и вероятности укладки в нативную структуру при точечных заменах в матрице энергий контактов в различных позициях. Мутации вводились путем «выключения» энергии взаимодействия в заданной паре мономеров. Расчеты показали, что мутации в нативных контактах незначительно увеличивают время и уменьшают вероятность укладки в нативное состояние, мутации в латентных контактах приводят к таким же изменениям для укладки в латентное состояние, а мутации в общих контактах практически не влияют на вероятности, но существенно замедляют время укладки как в нативное, так и в латентное состояние. Пятая глава посвящена исследованию более сложной и реалистичной модели белка с латентным состоянием. В качестве прототипа был взят прионовый белок PrP. Модельный решеточный белок состоит из 70 мономеров и имитирует, насколько это возможно в рамках решеточной модели, конформационные различия между нормальной (PrPC) и патогенной (PrPSc) изоформами PrP; они ассоциируются с нативным и латентным состояниями системы, соответственно. Как нативная, так и латентная, структуры состоят из двух слоев мономеров (Рис. 5.1). Нижний слой, общий для обеих структур, представлен двумя «альфа-спиралями», а верхние слои различаются. Для нативной структуры верхний слой состоит из одной «альфа-спирали» и двух коротких «бета-тяжей», а для латентной представлен четырьмя «бета-тяжами». Значения энергий контактов были выбраны следующим образом: энергии нативных контактов unat = -1.025, 15 энергии латентных ulat = -0.975 и энергии общих ucom = -1.0; соответственно, энергии нативной и латентной структуры составили Unat = -77.875 и Ulat = 74.175. Рис. 5.1. Нативная (а) и латентная (б) структуры. Светло-серые мономеры представляют «альфа-спирали», общие для нативного и латентного состояний, а темно-серые – «альфа-спираль» и два коротких «бета-тяжа», специфических для нативного состояния. Номера 1 и 70 показывают начало и конец белковой цепи. В п. 5.2 рассматривается построение поверхностей свободной энергии. Как и раньше, в качестве коллективных переменных использовались числа нативных (Nnat) и латентных (Nlat) контактов. Три бассейна притяжения, ожидаемые в соответствии с опытом изучения предыдущей системы, присутствуют и на Рис. 5.2. Они ассоциируются с полукомпактной глобулой, нативным и латентным состояниями, и обозначены на Рис. 5.2 метками a, f и e, соответственно. Рис. 5.2. Равновесная поверхность температуре укладки Tf = 0.6725. свободной энергии при «оптимальной» Здесь, однако, присутствует и хорошо выраженный четвертый бассейн (b), соединяющий бассейн глобулы с нативным и латентным бассейном. Траектории укладки раздваиваются в этом бассейне, и затем следуют либо в 16 нативный, либо в латентный. Появление такого «бифуркационного» бассейна не было зарегистрировано в предыдущих исследованиях ”kinetic partitioning” (разделения кинетических путей, Jimenez et al., 1999; Guo, Thirumalai, 1995; Abkevich et al., 1998), а так же при исследовании 27-мера в Главе 4, вероятно потому, что нативное и латентное состояния не имели значительной общей части структур. Для определения связи между конкретными точками поверхности (Nnat,Nlat) и соответствующими им структурами были построены карты контактов (п. 5.3). В результате была получена информация об особенностях структуры белка в ключевых областях поверхности, в частности, выявлено, что в бифуркационном бассейне общая для нативной и латентной структур часть практически полностью сформирована, а остальная – нет, оставляя возможность перехода в нативное и латентное состояния. Затем были рассчитаны вероятности укладки в нативное и латентное состояния (п. 5.4) в зависимости от температуры, которые составили для нативного 0.45 при T = 0.65, 0.44 при T = 0.6725 и 0.5 при T = 0.695 (вероятности укладки в латентное состояние 0.55, 0.56 и 0.5, соответственно), т.е. вероятности укладки в нативное и латентное состояния оказались примерно равными. Однако времена пребывания в этих состояниях оказались существенно разными. При T = 0.65, T = 0.6725 и T = 0.695 время пребывания в нативном было в 12.2, 11.7 и 7.8 раз больше, чем в латентном. В п. 5.5, аналогично тому как для предыдущей системы (27-мера), было проведено численное моделирование установления равновесного состояния в системе, которое затем было использовано для вычисления констант скоростей. При расчете выхода на равновесие в качестве стартового состояния системы было использовано латентное, чтобы моделировать процесс, не эквивалентный укладке в нативное. В п. 5.6 описана кинетическая модель процесса и процедура вычисления констант скоростей. Временная зависимость заселенностей состояний в данном случае описывалась системой линейных уравнений: dnG dt dnB dt dnL dt dnN dt = kGB nB − kBG nG = kBG nG + kBL nL + kBN k N − ( kGB + k NB + kLB ) nB (2) = kLB nB − kBL nL = k NB nB − kBN nN где nα= nα(t) – заселенности данных состояний в зависимости от времени, kji – константы скоростей для переходов из состояния i в состояние j, индексы G, B, N и L отвечают полукомпактной глобуле, бифуркационному, нативному и латентному бассейнам, соответственно. Для получения констант скоростей мы минимизировали отклонения распределений, получаемых численным решением системы уравнений (2) от соответствующих распределений, 17 полученных в результате моделирования. Константы скоростей представлены в Таблице 2, а соответствующие им распределения при T = 0.65 на Рис 5.3,a. T 0.65 0.6725 0.695 kBG 2.8·10-8 2.5·10-8 2.0·10-8 kGB 7.3·10-8 2.5·10-7 7.1·10-7 kNB 2.3·10-7 2.2·10-7 2.5·10-7 kBN 4.1·10-10 1.2·10-9 4.9·10-9 kLB 2.7·10-7 2.2·10-7 1.8·10-7 kBL 5.0·10-9 1.4·10-8 3.8·10-8 Таблица 2. Значения подогнанных констант скоростей при различных температурах. Полученные константы скоростей были использованы для вычисления распределения времени первого достижения нативного состояния pN (t ) = dnN / dt (п. 5.7). При этом в системе уравнений (2) kBN полагалась равной нулю и система стартовала из состояния, соответствующего глобуле. Результаты расчета показаны на Рис. 5.3б. Видно хорошее согласие результатов. Рис. 5.3. (a) Установление равновесных заселенностей нативного, латентного, бифуркационного бассейнов и бассейна полукомпактной глобулы (N, L, B и G соответственно), T = 0.65. Сплошные линии – результаты моделирования, пунктир – подогнанные распределения. (б) Распределение времен укладки. Крестики – результаты моделирования, сплошная линия – расчет на основе системы уравнений с константами из Таблицы 2. Важно отметить, что последовательность событий для регистрации времени первого достижения нативного состояния (Рис. 5.3б) отличается от той, для которой траектории начинались в латентном состоянии (Рис. 5.3a). Следовательно, тот факт, что константы скоростей, определенные в последнем случае, описывают распределения времени первого достижения нативного состояния из развернутого, свидетельствует, что четыре характеристических состояния белка (полукомпактная глобула, бифуркационный бассейн, нативное и латентное состояния) необходимы и достаточны для описания кинетики укладки рассматриваемого модельного белка. В шестой главе рассматривается влияние энергии латентных контактов ulat (в интервале от 0 до -1.3) в прионоподобном белке на процесс укладки. Было бы естественным ожидать, что минимальные значения СВУ будут 18 монотонно уменьшаться по мере уменьшения энергии латентных контактов, поскольку система с более слабыми латентными контактами будет проводить меньше времени в латентном состоянии, посещение которого значительно увеличивает время укладки по сравнению с прямым переходом в нативное (п.6.2). Для большинства случаев это оказывается верным, однако, например при «оптимальной» температуре укладки TF = 0.6725 в интервале ulat = 0.70…-0.78 минимальное время укладки оказывается заметно меньше, чем для системы без примеси латентных контактов. Таким образом, оказывается, что наличие латентного состояния может способствовать более быстрому сворачиванию в нативное. Для детализации роли латентных контактов, они были разделены на две группы - соответствующие связям в латентной части структуры (11 контактов, группа 1), и связям между латентной и общей частями (22 контакта, группа 2). При оптимальной температуре укладки, равной 0.6725, были рассчитаны зависимости СВУ от энергии латентных контактов (Рис. 6.1) и определены минимальные значения СВУ для ряда случаев. Эти СВУ получились следующими: 1.70·107, когда все латентные контакты равны ulat=0.76; 2.0·107, когда контакты группы 1 равны ulat=-0.4, а для группы 2 равны нулю, и 1.57·107, когда контакты группы 2 равны ulat=-1.04, а для группы 1 равны нулю. Для системы, в которой все латентные контакты равны 0, СВУ составляет 2.04·107. Оказалось, что вторая группа из 11 контактов практически не влияет на СВУ, а первая, из 22 контактов, отвечающих связям между нативной и общей частями структуры, вызывает больший эффект, чем все латентные контакты вместе (1.57·107 в сравнении с 1.70·107). Рис. 6.1. Зависимость среднего времени укладки в нативное состояние от энергии латентных контактов для трех различных случаев а) Контакты между мономерами латентной структуры равны ulat, остальные = 0; b) Контакты между латентной и нативной частями структуры равны ulat, остальные = 0, с) Все латентные контакты равны ulat. T = 0.6725. Предполагаемое объяснение состоит в следующем. Включение части латентных контактов, связывающих мономеры латентной части структуры с общей частью, приводит к тому, что часть структуры, различная для 19 нативного и латентного состояний, компактизуется при уже сформировавшейся общей части (в ней энергия контактов больше по модулю, ucom = -1.0). При этом энергии -0.7 не хватает на формирование долгоживущих контактов, характерных для латентной структуры, но достаточно для того, чтобы оставшаяся часть белка собралась в полукомпактном состоянии рядом с уже сформированной общей частью, и тем самым, ускорила формирование нативной структуры. Таким образом, группа 1 лишь немного способствует формированию латентной части, а группа 2 не только увеличивает вероятность формирования контактов между общей и латентной частью, но и попутно приводит к компактизации структуры, облегчая укладку в нативное состояние. Обнаруженный эффект ускорения укладки за счет присутствия латентного состояния находится в согласии с результатами недавней работы (Diannan et al., 2007), где исследовалась укладка белка, обвитого полимером с изменяемой гидрофобностью. В седьмой главе рассматривается гидродинамическое описание укладки белка. Оно иллюстрируется укладкой решеточной модели белка, имеющей поверхность свободной энергии, типичную для белков с одностадийной кинетикой. ПСЭ не в полной мере определяет динамику укладки, поскольку одни и те же значения свободной энергии могут относиться к конформациям, из которых система следует в нативное состояние, как и к конформациям, которые не лежат на пути из развернутого состояния в нативное. Поэтому представляется полезным выяснить, каким образом распределен по ПСЭ поток изображающих точек системы. Как показано в данной главе, это может быть достигнуто с помощью гидродинамической интерпретации процесса укладки. Введем векторы вероятностей переходов j = (jq,jr) между точками конформационного пространства, где q – доля нативных контактов, r – радиус инерции. Компонента q данного вектора в точке (q,r) определяется как: jq ( q, r ) = [ r ⊂ r * ;q′′− q′>0 ∑ n( q′′, r ′′; q′, r ′) − q′,r ′,q′′,r ′′ r ⊂ r * ;q′′− q′<0 ∑ n( q′′, r ′′; q′, r ′)] / N (3) q′,r ′,q′′,r ′′ где n(q'',r'',q',r') – число переходов из состояния (q',r') в (q'',r'') за один МК * шаг, N – число траекторий укладки, а r ⊂ r - символическое обозначение условия, что переходы, включенные в сумму, лежат на прямой линии между точками (q',r') и (q'',r''), которая пересекает линию q = const между точками rdr/2 и r+dr/2 (dr = 0.1). Компонента r вектора j определяется аналогично, с той разницей, что рассматриваются переходы между точками q-dq/2 и q+dq/2 (dq ≈ 0.24), пересекающие линию r = const. Вектор j = (jq,jr) представляет собой разницу числа переходов в двух направлениях (вперед и назад), усредненную по траекториям укладки. 20 Поэтому малое значение вектора потока может быть результатом малого числа переходов в данной области и/или, что представляется более интересным, следствием малой разницы между числом прямых и обратных переходов. Зная вектора потоков, можно рассчитать «функцию потока» Ψ(q,r), как это делается в гидродинамике (Ландау, Лифшиц, 1986). Поскольку полный поток направлен из развернутого состояния (q = 0) в нативное состояние (q = 1), Ψ ( q, r ) вычисляется через q-компоненту j как: Ψ (q, r ) = r ′= r ∑ r ′= 0 jq ( q, r ′) (4) Равенство Ψ ( q, r ) =const задает “линию тока”, направление которой в данной точке плоскости (q,r) совпадает с направлением вектора потока j = (jq,jr). Соответственно, две линии тока, определяемые уравнениями Ψ ( q, r ) =С1 и Ψ ( q, r ) =С2, (С2 > С1), задают трубку тока, которая содержит С2 - С1 долю полного потока. Хотя поток поперек линии тока равен нулю в соответствии с определением линии тока, это требование не означает, что отсутствуют элементарные переходы через линию тока; скорее, «микроскопические» потоки с двух сторон от линии тока компенсируют друг друга, аналогично потокам молекул поперек линии тока в потоке газа. Чтобы выяснить возможности данного «гидродинамического» подхода, рассматривается решеточный белок, нативное состояние которого имитирует альфа-спиральную шпильку (Рис. 7.1) - структурный мотив, часто присутствующий в белках (Kohn et al., 1997). Рис. 7.1. Нативная структура модельного двухспирального решеточного белка. Эта модель белка имеет очень простую, но типичную ПСЭ (Рис. 7.2.б) и кинетику укладки, благодаря которой разница между стандартной и “гидродинамической” картинами укладки не усложнена побочными эффектами, такими как, например, присутствие интермедиатов, формирующих локальные минимумы на ПСЭ. Карта векторов потоков и соответствующие линии тока показаны на Рис. 7.2a и Рис. 7.2б, соответственно. Для получения числа переходов n(q'',r'',q',r') использовался тот же ансамбль траекторий укладки, что и для построения ПСЭ (Рис. 7.2б). 21 Рис. 7.2. Карты векторов потоков (a) и поверхность свободной энергии + нанесенные на нее линиями тока. Черные сплошные линии тока ведут из развернутого состояния в нативное, белая линия соответствует «вихрю» (б). Видно, что локальные потоки распределены по пространству (q,r) не так, как можно было ожидать исходя из ландшафта ПСЭ, т.е. они не пропорциональны вероятностям посещений точек (q,r). 80% потока сосредоточено в узкой области ПСЭ, формируя «пучок» линий тока, ведущий к нативному состоянию (Рис. 7.1б). «Пучок» пересекает область полукомпактной глобулы не в минимуме бассейна притяжения для глобулы, как можно было бы ожидать, а в области, соответствующей более компактным конформациям с более высокой свободной энергией. Остальная область бассейна (q ≈ 0.45…0.7 и r ≈ 0.23…0.37) занята «вихрем» потока, который показан на Рис. 7.1 замкнутой белой линией с Ψ ( q, r ) =1.01. «Вихрь» образуется, поскольку jq(q,r) имеют разные знаки в соседних точках по r (Рис. 7.2a); т.е. движения большого масштаба («макроскопические») в одном направлении сосуществуют с крупномасштабным движением в обратном направлении. Анализ показал, что «вихревое» движение на Рис. 7.2б направлено против часовой стрелки. Отметим, что «вихрь» не является источником или стоком для траекторий, т.к. каждая траектория начинается в развернутом состоянии и заканчивается в нативном. Рассмотрение траекторий укладки показывает, что в области «вихря» (q ≈ 0.45…0.7 и r ≈ 0.23…0.37, Рис. 7.2a) система многократно предпринимает попытку увеличения числа нативных контактов без существенного уменьшения радиуса инерции, но терпит неудачу и вынуждена возвращаться к полукомпактному состоянию, чтобы повторить попытку. Эти попытки порождают обратно направленные потоки jq(q,r) в соседних точках, и соответственно, «вихревое» движение. Таким образом, область «вихря» представляет собой «тупик» на ПСЭ, типа отражения от стенки. В отличие от хорошо известных в теории укладки белков «тупиков» (например, Sali et al., 1994; Wolynes et al., 1995), которые ассоциируются с локальными минимумами на ПСЭ, «вихревой тупик» не оставляет следов на ПСЭ, и таким 22 образом не может быть обнаружен путем исследования ПСЭ. Поэтому данный подход может служить полезным дополнением к стандартному анализу кинетики укладки, основанному на исследовании ландшафта ПСЭ. Основные результаты диссертационной работы: 1. Исследована укладка узельного белка с узлом-восьмеркой, моделирующего узел, найденный в природном белке (Taylor, 2000). Показано, что в отличие от незаузленной и слабо заузленной структур формирование узла в виде восьмерки ведет к появлению энтропийного барьера между полукомпактным и нативным состояниями белка, и тем самым, существенно замедляет укладку. 2. Исследована укладка гетерополимера (27-мер) с двумя компактными стабильными состояниями, близкими по энергии, но существенно различными по морфологии. Предложен метод, позволивший разделить поверхность свободной энергии на бассейны притяжения для нативного, латентного и глобулярного состояний и оценить константы скоростей переходов между ними. Сформулирована система кинетических уравнений, описывающих процесс укладки, и показано, что она хорошо предсказывает распределения времен укладки на базе упомянутых констант скоростей переходов. 3. Впервые предложена решеточная модель (70-мер), воспроизводящая характерные особенности прионоподобного белка: элементы вторичной структуры, их взаимное расположение в нативном и латентном состояниях и наличие значительной части структуры, общей для обоих состояний. Показано, что белок сворачивается как в нативную, так и в латентную структуру, и проведено детальное исследование стабильности этих структур и кинетики укладки. Впервые для белков с латентными структурами обнаружен бассейн притяжения, в котором траектории укладки испытывают бифуркацию, следуя в нативное/латентное состояние. Анализ карт контактов показал, что в нем формируется часть структуры, общая для нативного и латентного состояний. Сформулирована система кинетических уравнений, описывающих процесс укладки, и определены константы скоростей переходов между характеристическими состояниями. Адекватность модели подтверждена хорошим согласием распределений времен укладки по кинетической модели и данным прямого моделирования. Обнаружено, что время укладки в нативное состояние достигает минимального значения не в отсутствии, а при конечных значениях энергий латентных контактов, т.е. латентное состояние может увеличивать скорость укладки. Предложен механизм, объясняющий данный эффект. Показано, что внесение точечных мутаций в белок в латентной части структуры проявляется не раньше, чем на стадии бифуркации, и может существенно уменьшать вероятность неправильной укладки. 4. Предложено и проиллюстрировано на решеточной модели альфашпильки «гидродинамическое» описание укладки белка. Показано, что 23 средние потоки переходов из развернутого состояния в нативное сконцентрированы в узкой области поверхности свободной энергии (ПСЭ), при этом значительная ее часть занята “вихрем”, не ведущим в нативное состояние. В отличие от известных интермедиатов, ассоциирующихся с локальными минимумами на ПСЭ, «вихрь» не оставляет на ней следов. Таким образом, гидродинамическая интерпретация служит полезным дополнением к стандартному методу анализа кинетики укладки белков, базирующемуся на исследовании ПСЭ. Основные результаты диссертации опубликованы в работах: 1. Titov I.I., Palyanov A.Yu., Ivanisenko V.A. Design of a Knotted Cubic-Lattice Protein // Proc. Conf. Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRS), 2002, vol. 3, p. 86. 2. Palyanov A.Yu., Titov I.I. Computational Evolution for Biopolymer Structure Design. // Proc. Int. Moscow Conf. on Computational Biology (MCCMB), 2003, p. 180-181. 3. Титов И.И., Пальянов А.Ю. Как белок формирует узел: моделирование фолдинга решеточных белков // Биофизика (Москва), 2003, том 48, приложение 1, c. 133-140. 4. А. Ю. Пальянов - Дизайн и кинетика решеточных белков. // Материалы XLI Международной Научной Студенческой Конференции (МНСК), 2003, секция «Физика», с. 80. 5. Palyanov A.Yu. and Titov I.I. Structural Memory of a Lattice Protein // Proc. Conf. Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk), 2004, p. 330-332. 6. A.Yu. Palyanov, S.V. Krivov, M. Karplus, S.F. Chekmarev. Folding and stability of a prion-like lattice protein. // Proc. MCCMB, 2005, p. 279-281. 7. Пальянов А. Ю. Фолдинг прионового белка: исследование в рамках решеточной модели // Материалы XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Молекулярный дизайн и экологически безопасные технологии. Новосиб. гос. ун-т., Новосибирск, 2005, c. 44-45. 8. A.Yu. Palyanov, S.V. Krivov, M. Karplus, S.F. Chekmarev. A Lattice Protein with an Amyloidogenic Latent State: Stability and Folding Kinetics // Journal of Physical Chemistry B, 2007, vol. 111(10), p. 2675-2687. 9. S.F. Chekmarev, A.Yu. Palyanov, M. Karplus. A Hydrodynamic View of Protein Folding. // Proc. MCCMB, 2007, p. 61-62. 10. S.F. Chekmarev, A.Yu. Palyanov, M. Karplus. “Hydrodynamics” of Protein Folding. // The 21st Symposium of The Protein Society, Boston, Massachusetts, 2007, vol. 16, Suppl. 1, p. 247-248. 11. S. F. Chekmarev, A. Yu. Palyanov, and M. Karplus. Hydrodynamic Description of Protein Folding. // Physical Review Letters, 2008, vol. 100, p. 018107-(1-4). 24
