Потребление аминокислот некультивируемым
advertisement
Ñèáèðñêèé ýêîëîãè÷åñêèé æóðíàë, 1 (2011) 1321 ÓÄÊ 579.68 Ïîòðåáëåíèå àìèíîêèñëîò íåêóëüòèâèðóåìûì áàêòåðèîïëàíêòîíîì ýâòðîôíîãî âîäîõðàíèëèùà Î. Â. ÊÎËÌÀÊÎÂÀ, Ì. Þ. ÒÐÓÑÎÂÀ* Ñèáèðñêèé ôåäåðàëüíûé óíèâåðñèòåò 660041, Êðàñíîÿðñê, ïðîñï. Ñâîáîäíûé, 79 *Èíñòèòóò áèîôèçèêè ÑÎ ÐÀÍ 660036, Êðàñíîÿðñê, Àêàäåìãîðîäîê E-mail: mtrusova@ibp.krasn.ru ÀÍÍÎÒÀÖÈß Â ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ìèêðîýêîñèñòåìàõ âûÿâëåíû c èñïîëüçîâàíèåì íåñòåðèëüíîãî êóëüòèâèðîâàíèÿ âèäû (êëîíû) áàêòåðèîïëàíêòîíà âîäîõðàíèëèùà, ïèòàþùèåñÿ ëèçèíîì è ãëèöèíîì. Ñòðóêòóðó ñîîáùåñòâà àíàëèçèðîâàëè, ïðèìåíÿÿ ìåòîä ðàçäåëåíèÿ àìïëèôèöèðîâàííûõ ôðàãìåíòîâ ãåíà 16S ðÐÍÊ áàêòåðèé â óñëîâèÿõ äåíàòóðèðóþùåãî ãðàäèåíòíîãî ãåëü-ýëåêòðîôîðåçà. Èäåíòèôèêàöèÿ äîìèíèðóþùèõ âèäîâ (êëîíîâ) áàêòåðèîïëàíêòîíà ïðîâåäåíà ñ èñïîëüçîâàíèåì ìîëåêóëÿðíîãî êëîíèðîâàíèÿ è îïðåäåëåíèÿ íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ó÷àñòêà ãåíà 16S ðèáîñîìàëüíîé ÐÍÊ. Îáíàðóæåíî, ÷òî ãëèöèí îäíà èç ïðåâàëèðóþùèõ àìèíîêèñëîò ýâòðîôíîãî âîäîåìà, è ëèçèí, ÷üå ñîäåðæàíèå â ïðèðîäíîé âîäå áîëåå íèçêîå, ñëóæèëè ïèòàòåëüíûìè ñóáñòðàòàìè äëÿ ðàçíûõ ñóáäîìèíàíòíûõ âèäîâ (êëîíîâ) áàêòåðèîïëàíêòîíà. Òàêèì îáðàçîì, óñòàíîâëåíî, ÷òî âèäû ñâîáîäíîæèâóùåãî áàêòåðèîïëàíêòîíà ÿâëÿþòñÿ óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûìè ïî ïîòðåáëåíèþ îòäåëüíûõ àìèíîêèñëîò. Êëþ÷åâûå ñëîâà: ñâîáîäíîæèâóùèé íåêóëüòèâèðóåìûé áàêòåðèîïëàíêòîí, àìèíîêèñëîòû, ÏÖÐÄÃÃÝ, ìèêðîýêîñèñòåìû, 16S ðèáîñîìàëüíàÿ ÐÍÊ. Âàæíåéøèì òðîôè÷åñêèì çâåíîì ëþáîé ýêîñèñòåìû, êàê èçâåñòíî, ÿâëÿþòñÿ ðåäóöåíòû.  ïåëàãè÷åñêèõ ýêîñèñòåìàõ çâåíî ðåäóöåíòîâ ïðåäñòàâëåíî áàêòåðèîïëàíêòîíîì. Âî ìíîãèõ ìîäåëÿõ êà÷åñòâà ïðèðîäíûõ âîä áàêòåðèîïëàíêòîí îïèñûâàåòñÿ êàê àãðåãèðîâàííàÿ êîìïîíåíòà [1, 2]. Ïðè÷èíîé àãðåãèðîâàíèÿ çàâåäîìî ðàçíûõ âèäîâ áàêòåðèé â îäíî çâåíî ÿâëÿåòñÿ òðóäíîñòü èäåíòèôèêàöèè âèäîâîãî ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà. Îñíîâíûì ìåòîäîì îïðåäåëåíèÿ âèäîâîé ïðèíàäëåæíîñòè áàêòåðèé â òå÷åíèå äëèòåëüíîãî ïåðèîäà áûëî êóëüòèâèðîâàíèå íà òâåðäûõ Êîëìàêîâà Îëåñÿ Âëàäèìèðîâíà Òðóñîâà Ìàðèÿ Þðüåâíà ñåëåêòèâíûõ ñðåäàõ. Îäíàêî, ïîñêîëüêó íà òâåðäûõ ñðåäàõ âûðàñòàåò íå áîëåå 13 % ñâîáîäíîæèâóùèõ ïëàíêòîííûõ áàêòåðèé, îïðåäåëÿåìûõ ïðÿìûì ñ÷åòîì [35], äî íåäàâíåãî âðåìåíè âèäîâîé ñîñòàâ 97 % âèäîâ áàêòåðèé îñòàâàëñÿ íåèçâåñòíûì. Îòñóòñòâèå âèäîâîé èäåíòèôèêàöèè äåëàëî íåâîçìîæíûì îïðåäåëåíèå ôóíêöèîíàëüíîé ðîëè áîëüøèíñòâà âèäîâ íåêóëüòèâèðóåìîãî áàêòåðèîïëàíêòîíà â ýêîñèñòåìå. Êàê ïðàâèëî, âûäåëÿëèñü öåëûå ãðóïïû áàêòåðèé, ïðåäïîëîæèòåëüíî îáúåäèíåííûå îáùåé áèîãåîõèìè÷åñêîé ôóíêöèåé. Ïîäðîáíî èçó÷àëîñü ó÷àñòèå àãðåãèðîâàííûõ ãðóïï âîäíûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ â ïðîöåññàõ ôîòî- è õåìîñèíòåçà è äåñòðóêöèè îðãàíè÷åñêèõ âåùåñòâ ! (óãëåâîäîâ, áåëêîâ, àìèíîêèñëîò, àìèíîñàõàðîâ, àëüãèíîâûõ êèñëîò, óãëåâîäîðîäîâ, ãóìèíîâûõ âåùåñòâ è äð.) â êðóãîâîðîòå àçîòà è äðóãèõ ýëåìåíòîâ [3, 610]. Îäíàêî ðîëü îòäåëüíûõ âèäîâ â äåñòðóêöèè îðãàíè÷åñêèõ âåùåñòâ, â ÷àñòíîñòè àìèíîêèñëîò, äî ñèõ ïîð îñòàåòñÿ íåèçâåñòíîé â ñâÿçè ñ òðóäíîñòÿìè âèäîâîé èäåíòèôèêàöèè áàêòåðèîïëàíêòîíà. Ïðè ýòîì ìíîãèå àâòîðû óêàçûâàþò íà íåîáõîäèìîñòü îïðåäåëåíèÿ ôèëîãåíåòè÷åñêîé ïðèíàäëåæíîñòè áàêòåðèîïëàíêòîíà, ó÷àñòâóþùåãî â òåõ èëè èíûõ áèîãåîõèìè÷åñêèõ ïðîöåññàõ [7, 9]. Òàêóþ âîçìîæíîñòü ïîòåíöèàëüíî ïðåäîñòàâëÿåò ïðèìåíåíèå ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêîãî ìåòîäà îïðåäåëåíèÿ âèäîâîé ïðèíàäëåæíîñòè áàêòåðèé, ïîÿâèâøåãîñÿ â ïîñëåäíèå äâà äåñÿòèëåòèÿ. Öåëü íàøåé ðàáîòû ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêàÿ èäåíòèôèêàöèÿ áàêòåðèîïëàíêòîíà, ïîòðåáëÿþùåãî àìèíîêèñëîòû. ÌÀÒÅÐÈÀË È ÌÅÒÎÄÛ Îïèñàíèå ýêñïåðèìåíòà. Ïðèðîäíóþ âîäó äëÿ ýêñïåðèìåíòîâ îòáèðàëè â ýâòðîôíîì âîäîõðàíèëèùå Áóãà÷. Ïîäðîáíîå îïèñàíèå ýêîñèñòåìû âîäîõðàíèëèùà, âêëþ÷àÿ ñîñòàâ ðàñòâîðåííûõ â âîäå àìèíîêèñëîò, ïðèâåäåíî â ðàáîòàõ [11, 12]. Ýêñïåðèìåíò ïðîâîäèëè ñ 30 èþíÿ ïî 6 èþëÿ â ëàáîðàòîðíûõ ìèêðîýêîñèñòåìàõ (ÌÝÑ) îáúåìîì 10 ë. Ïîäðîáíîå îïèñàíèå ÌÝÑ ïðèâåäåíî â ðàáîòàõ [13, 14]. Ðàíåå óñòàíîâëåíî, ÷òî â ÌÝÑ â òå÷åíèå 710 ñóò ñîõðàíÿåòñÿ è ôóíêöèîíèðóåò åñòåñòâåííîå ïëàíêòîííîå ñîîáùåñòâî, âêëþ÷àþùåå ôèòî-, çîî- è áàêòåðèîïëàíêòîí [15]. Íåñòåðèëüíîå êóëüòèâèðîâàíèå â ÌÝÑ åäèíñòâåííûé ýêñïåðèìåíòàëüíûé ñïîñîá ðàáîòû ñ íåêóëüòèâèðóåìûìè âèäàìè áàêòåðèîïëàíêòîíà, ìíîãèå èç êîòîðûõ íå ñïîñîáíû ñóùåñòâîâàòü âíå ñîîáùåñòâà [5]. Ïðîáû âîäû èç âîäîõðàíèëèùà, ñîäåðæàùèå åñòåñòâåííûé ïëàíêòîí, èíîêóëèðîâàëè â òðè ÌÝÑ.  ÌÝÑ ¹ 1 äîáàâèëè àìèíîêèñëîòó L-ëèçèí (ëèçèíà ìîíîõëîðãèäðàò, Ðåàõèì) â êîíöåíòðàöèè 100 ìã ë1, â ÌÝÑ ¹ 3 L-ãëèöèí (Reanàl) â òîé æå êîíöåíòðàöèè. Ïîñêîëüêó â âîäîõðàíèëèùå Áóãà÷ íàáëþäàåìûå êîíöåíòðàöèè äàííûõ àìèíîêèñëîò ñîñòàâëÿëè ìåíåå 1 ìã ë1 [11], äëÿ îáåñïå÷åíèÿ îòêëèêà áàêòåðèàëüíîãî ñî" îáùåñòâà íà äîáàâëÿåìûé ñóáñòðàò èñïîëüçîâàíû 100-êðàòíûå êîíöåíòðàöèè ãëèöèíà è ëèçèíà. ÌÝÑ ¹ 2 áûëà êîíòðîëüíîé. Òåìïåðàòóðó âîäû â ÌÝÑ ïîääåðæèâàëè íà óðîâíå ëåòíåé â âîäîåìå 22 Ñ. Îñâåùåííîñòü ÌÝÑ áûëà 7,0 Âò/ì2, ôîòîïåðèîä 16 ÷ ñâåò, 8 ÷ òåìíîòà. Ïåðåìåøèâàíèå âîäû â ÌÝÑ ïðîèçâîäèëîñü äâàæäû â ñóòêè ñòåêëÿííûì øïàòåëåì. Ïðîáû âîäû äëÿ îïðåäåëåíèÿ âèäîâîãî ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà â îáúåìå 100 ìë îòîáðàëè ïåðâîíà÷àëüíî èç îáùåé ïðîáû âîäû âîäîõðàíèëèùà ïåðåä çàïîëíåíèåì ÌÝÑ, à çàòåì îòäåëüíî èç êàæäîé ÌÝÑ íà 2, 3, 4, 5 è 6-å ñóò ýêñïåðèìåíòà. Âûäåëåíèå ãåíîìíîé ÄÍÊ. Ïîñëå ïðåäâàðèòåëüíîé ôèëüòðàöèè ÷åðåç êðóïíîïîðèñòûå ìåìáðàííûå ôèëüòðû 2,5 ìêì áàêòåðèîïëàíêòîí êîíöåíòðèðîâàëè èç îáúåìà 100 ìë ôèëüòðîâàíèåì íà ñòåðèëüíûõ áàêòåðèàëüíûõ ôèëüòðàõ 0,22 ìêì. Ãåíîìíóþ ÄÍÊ èç áàêòåðèîïëàíêòîíà, ñêîíöåíòðèðîâàííîãî íà ìåìáðàíàõ, âûäåëÿëè ïî ìåòîäó Áîñòðîìà ñ ñîàâòîðàìè [16]. Äëÿ ýòîãî ìåìáðàíû ðàçðåçàëè íà ÷àñòè, ïîìåùàëè â ñòåðèëüíûå 2 ìë ïëàñòèêîâûå ïðîáèðêè è äîáàâëÿëè 525 ìêë ëèçèðóþùåãî áóôåðà (400 ìÌ NaCl, 750 ìÌ ñàõàðîçà, 20 ìÌ ÝÄÒÀ, 50 ìÌ òðèñHCl pH 9,0) è 11 ìêë ðàñòâîðà ëèçîöèìà (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 1 ìã/ìë), èíêóáèðîâàëè 30 ìèí ïðè 37 Ñ. Çàòåì â ïðîáèðêè äîáàâëÿëè 60 ìêë ðàñòâîðà äîäåöèëñóëüôàòà íàòðèÿ (SDS, êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 1 %) è 3 ìêë ðàñòâîðà ïðîòåèíàçû Ê (êîíå÷íàÿ êîíöåíòðàöèÿ 100 ìêã/ìë) è èíêóáèðîâàëè ïðè 55 Ñ 12 ÷. Ïðîäóêòû ëèçèñà ïåðåíîñèëè â ÷èñòûå ïðîáèðêè, ôèëüòðû äîïîëíèòåëüíî ïðîìûâàëè 500 ìêë ÒÅ áóôåðà (10 ìM òðèñHCl pH 8,0, 2 ìM ÝÄÒÀ), êîòîðûé çàòåì îáúåäèíÿëè ñ ëèçàòàìè. Ê ÄÍÊ-ñîäåðæàùèì ðàñòâîðàì äîáàâëÿëè 1/10 îáúåìà 3 Ì ðàñòâîðà àöåòàòà íàòðèÿ, ïåðåìåøèâàëè è îñàæäàëè ÄÍÊ 2,5 îáúåìàìè 96%-ãî ýòàíîëà ïðè 20 C â òå÷åíèå 1 ÷. Ïðîáèðêè öåíòðèôóãèðîâàëè 20 ìèí ïðè 20000 g è 4 Ñ. Îñàäêè ïðîìûâàëè 70%-ì ýòàíîëîì. Ïîñëå óäàëåíèÿ ýòàíîëà îñàäêè ïîäñóøèâàëè íà âîçäóõå è ðàñòâîðÿëè â 100 ìêë áóôåðà ÒÅ. Êà÷åñòâî è êîëè÷åñòâî âûäåëåííîé âûñîêîìîëåêóëÿðíîé ÄÍÊ àíàëèçèðîâàëè ìåòîäîì ýëåêòðîôîðåçà â 1%-ì àãàðîçíîì ãåëå. Äåíàòóðèðóþùèé ãðàäèåíòíûé ãåëü-ýëåêòðîôîðåç. Ôðàãìåíòû ãåíà 16S ðÐÍÊ äëèíîé 586 ï. í. àìïëèôèöèðîâàëè èç ñóììàðíîé ãåíîìíîé ÄÍÊ áàêòåðèîïëàíêòîíà ñ ïîìîùüþ ïîëèìåðàçíîé öåïíîé ðåàêöèè (ÏÖÐ) ñ óíèâåðñàëüíûìè ïðàéìåðàìè GC-341F (5-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3, íà 5-êîíöå ïðèñîåäèíåí GC-clamp 5CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC C-3) è 926R (5¢-CCG TCA ATT CA/CT TTG AGT TT-3) [17]. Ðåàêöèîííàÿ ñìåñü äëÿ ÏÖÐ îïòèìèçèðîâàíà ïîä äàííóþ ïàðó ïðàéìåðîâ è ñîäåðæàëà 67 ìÌ òðèñ-ÍÑ1, ðÍ 8,8 ïðè 25 Ñ, 0,01 % Tween 20, 16,6 ìÌ (NH4)2SO4, 1,5 ìÌ MgÑ1 2, 3 % äèìåòèëñóëüôîêñèäà (ÄÌÑÎ), 0,2 ìÌ êàæäîãî dNTP, ïî 10 ïìîëåé êàæäîãî ïðàéìåðà, 2,5 åä. àêò. Taq ÄÍÊ ïîëèìåðàçû, 10 íã ÄÍÊ. ÏÖÐ ïðîâîäèëè íà ïðèáîðå Biometra TPersonàl (Biometra, Ãåðìàíèÿ) â ñëåäóþùåì òåìïåðàòóðíî-âðåìåííîì ðåæèìå: ïåðâûé öèêë 94 Ñ, 30 ñ; 65 Ñ, 35 ñ; 72 Ñ, 40 ñ; çàòåì ïîíèæåíèå òåìïåðàòóðû îòæèãà íà 1 Ñ/öèêë â òå÷åíèå 10 öèêëîâ; 20 öèêëîâ 94 Ñ, 30 ñ; 56 Ñ, 35 ñ; 72 Ñ, 40 ñ è îêîí÷àòåëüíàÿ ïîëèìåðèçàöèÿ ïðè 72 Ñ, 5 ìèí. Äëÿ êîíòðîëÿ êîíòàìèíàöèè ñòàâèëè îòðèöàòåëüíóþ êîíòðîëüíóþ ðåàêöèþ, â êîòîðóþ âìåñòî ÄÍÊ-ìàòðèöû äîáàâëÿëè ñòåðèëüíóþ âîäó. Àíàëèç ïðîäóêòîâ ÏÖÐ ïðîâîäèëè ïðè ïîìîùè ýëåêòðîôîðåçà â 1,2 % àãàðîçíîì ãåëå. ÏÖÐ-ïðîäóêòû êîíöåíòðèðîâàëè ñïèðòîâûì ïåðåîñàæäåíèåì è èñïîëüçîâàëè 800 íã ïîëó÷åííîé ÄÍÊ äëÿ àíàëèçà ìåòîäîì ÄÃÃÝ. ÄÃÃÝ âûïîëíÿëè íà ïðèáîðå DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, ÑØÀ) â 6%-ì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå ñ ãðàäèåíòîì äåíàòóðèðóþùåãî ôàêòîðà îò 40 äî 70 % (100%-é äåíàòóðèðóþùèé ôàêòîð ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ñìåñü 7Ì ðàñòâîðà ìî÷åâèíû è 40%-ãî äåèîíèçîâàííîãî ôîðìàìèäà). Ýëåêòðîôîðåç âåëè ïðè 60 Ñ â îäíîêðàòíîì ÒÀÅ áóôåðå ïðè íàïðÿæåíèè 100  â òå÷åíèå 17 ÷. Ïî îêîí÷àíèè ýëåêòðîôîðåçà ãåëü îêðàøèâàëè áðîìèñòûì ýòèäèåì è ïîëó÷àëè öèôðîâûå èçîáðàæåíèÿ â ÓÔ (302 íì) ñâåòå íà ïðèáîðå AlphaImager (Alpha Innotech Corp., ÑØÀ). Ïîëîñû ÄÍÊ, ñîîòâåòñòâóþùèå ñóáäîìèíàíòíûì âèäàì áàêòåðèé, ïîòðåáëÿþùèõ ãëèöèí è ëèçèí, âûðåçàëè èç ãåëÿ ñòåðèëüíûì ñêàëüïåëåì è õðàíèëè â ñòåðèëüíûõ ìèêðîïðîáèðêàõ ïðè 20 Ñ. Êëîíèðîâàíèå. Äëÿ êëîíèðîâàíèÿ ÏÖÐïðîäóêòîâ ãîòîâèëè Ò-âåêòîð [18]. Äëÿ ýòîãî ïëàçìèäó pBluescri pt II (Stratagene, ÑØÀ) îáðàáàòûâàëè ðåñòðèêòàçîé EcoR V (ÑèáÝíçèì, Íîâîñèáèðñê), äîñòðàèâàëè ëèïêèå 3-Ò-êîíöû äâóõ÷àñîâûì èíêóáèðîâàíèåì ïðè 72 Ñ ñ Taq ÄÍÊ ïîëèìåðàçîé è dTTP. Ïîëó÷åííûé Ò-âåêòîð î÷èùàëè ïðåïàðàòèâíûì ýëåêòðîôîðåçîì â 0,8%-ì àãàðîçíîì ãåëå è âûäåëÿëè èç ãåëÿ ñ ïîìîùüþ íàáîðà MinElute Gel Extraction Kit (QIAGen, Ãåðìàíèÿ). Ôðàãìåíòû ãåíà 16S ðÐÍÊ áàêòåðèé è Òâåêòîð ëèãèðîâàëè âûñîêîàêòèâíîé Ò4 ÄÍÊ ëèãàçîé (ÑèáÝíçèì, Íîâîñèáèðñê) ïðè 16 Ñ. Ëèãàçíîé ñìåñüþ òðàíñôîðìèðîâàëè êëåòêè E. coli XL-1 Blue (Stratagene, ÑØÀ). Êîìïåòåíòíûå êëåòêè E. coli ãîòîâèëè ñòàíäàðòíûì ìåòîäîì, èñïîëüçóÿ TFB áóôåð, êàê îïèñàíî ó Ñýìáðóêà è äð. [19]. Êëåòî÷íóþ ñóñïåíçèþ âûñåâàëè íà 1,5%-é LB-àãàð, ñîäåðæàùèé 100 ìêã/ìë àìïèöèëëèíà, 80 ìêã/ìë X-Gal (5-áðîì-4-õëîð-3-èíäîëèë-áåòà-D-ãàëàêòîïèðàíîçèä) è 80 ìêã/ìë ÈÏÒà (èçîïðîïèë-áåòà-D-òèîãàëàêòîïèðàíîçèä). Îòáîð êëîíîâ, ñîäåðæàùèõ âñòàâêó, ïðîâîäèëè ìåòîäîì áåëî-ãîëóáîãî ñêðèíèíãà [19]. Áåëûå êîëîíèè ïåðåíîñèëè â ìèêðîïðîáèðêè, ñîäåðæàùèå 20 ìêë 10 ìÌ òðèñ-ÍÑ1, ðÍ 8,0. Äëÿ àíàëèçà ðàçìåðà âñòàâîê ïðîâîäèëè ÏÖÐ ñ 2 ìêë ñóñïåíçèè êëåòîê â êà÷åñòâå ìàòðèöû, èñïîëüçóÿ ïðàéìåðû, êîìïëåìåíòàðíûå ó÷àñòêàì ïëàçìèäû â ðàéîíå âñòàâêè (Ì13-Up 5-CCT TTG TCG ATA CTG GTA-3, M13Down 5-GTT GTA AAA CGA CGG CCA GTG A-3). Óñëîâèÿ ðåàêöèè: ïåðâûé öèêë 94 Ñ, 2 ìèí; 60 Ñ, 1 ìèí; 72 Ñ, 1 ìèí; 29 öèêëîâ 94 Ñ, 30 ñ; 60 Ñ, 40 ñ; 72 Ñ, 40 ñ è îêîí÷àòåëüíàÿ ïîëèìåðèçàöèÿ 72 Ñ, 5 ìèí. Ïîëó÷åííûå ïðîäóêòû ðåàêöèè àíàëèçèðîâàëè ýëåêòðîôîðåçîì â 1,2%-ì àãàðîçíîì ãåëå. Ïîñëå îêðàøèâàíèÿ ãåëÿ áðîìèñòûì ýòèäèåì ïîëîñû èñêîìîãî ðàçìåðà (1124 ï. í.) âûðåçàëè èç ãåëÿ ïîä äëèííîâîëíîâûì ÓÔ è âûäåëÿëè ÄÍÊ êàê îïèñàíî âûøå. Îïðåäåëåíèå íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè. Íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ïîëó÷åííûõ âñòàâîê îïðåäåëÿëè íà àâòîìàòè÷åñêîì ñåêâåíàòîðå ALFexpress II (Amersham Pharmacia Biotech, ÑØÀ) Öåíòðà êîëëåêòèâíîãî ïîëüçîâàíèÿ ïðèáîðàìè ÍÎÖ Åíèñåé (ÑÔÓ, Êðàñíîÿðñê) ñ ïîìîùüþ íàáîðà # Thermo Sequenàse Cy5 Dye Termin ator Kit (Amersham Pharmacia Biotech, ÑØÀ) ñîãëàñíî ðåêîìåíäàöèÿì ïðîèçâîäèòåëÿ. Äëÿ ñåêâåíèðîâàíèÿ ïðèìåíÿëè óíèâåðñàëüíûå ïëàçìèäíûå ïðàéìåðû Ì13. Ïîëó÷åííûå íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíîâ 16S ðÐÍÊ äåïîíèðîâàíû â áàçå äàííûõ GenBank ïîä íîìåðàìè HM072086 è HM072087, à òàêæå â áàçå EMBL ïîä íîìåðàìè FN773496-FN773499. Ôèëîãåíåòè÷åñêèé àíàëèç. Ïîëó÷åííûå íóêëåîòèäíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíà 16S ðÐÍÊ ñðàâíèâàëè ñ ïîñëåäîâàòåëüíîñòÿìè áàç äàííûõ GenBank è EMBL ñ ïîìîùüþ îíëàéíñåðâèñà BLAST [URL: http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast]. Äàëåå áûëî ïîñòðîåíî ôèëîãåíåòè÷åñêîå äðåâî ñ ïîìîùüþ ïðîãðàììíîãî îáåñïå÷åíèÿ Mega [URL: http://www. megasoftware.net/]. Èñïîëüçîâàëñÿ ìåòîä ïðèñîåäèíåíèÿ áëèæàéøèõ ñîñåäåé ñ 1000 ïîâòîðîâ áóòñòðåï-àíàëèçà.  êà÷åñòâå âíåøíåãî (êîðíåâîãî) âèäà âûáðàíà àðõåÿ Halobacterium sp. ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ È ÈÕ ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ Íà îñíîâàíèè àíàëèçà ÄÃÃÝ-ãåëÿ (ðèñ. 1) â èñõîäíîé ïðîáå (ñì. ðèñ. 1, Èñõ) âûÿâëåíî 25 êëîíîâ (âèäîâ) áàêòåðèé.  êîíòðîëüíîé ÌÝÑ ¹ 2 (ñì. ðèñ. 1, Ê-2 Ê-6) â òå÷åíèå âñåãî ýêñïåðèìåíòà íå ïðîèñõîäèëî ñóùåñòâåííûõ êà÷åñòâåííûõ è êîëè÷åñòâåííûõ èçìåíåíèé ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà ïî ñðàâíåíèþ ñ èñõîäíîé ïðîáîé (ñì. ðèñ. 1, Èñõ). Äàííûé ðåçóëüòàò îçíà÷àåò, ÷òî â êîíòðîëüíîé ÌÝÑ ¹ 2 â òå÷åíèå âñåãî ýêñïåðèìåíòà ôóíêöèîíèðîâàëî åñòåñòâåííîå ñîîáùåñòâî áàêòåðèîïëàíêòîíà âîäîõðàíèëèùà.  ÌÝÑ ¹ 3 ñ äîáàâêîé ãëèöèíà ñîñòàâ áàêòåðèîïëàíêòîíà óæå íà âòîðûå ñóòêè ýêñïåðèìåíòà (ñì. ðèñ. 1, Ã-2) ðåçêî îòëè÷àëñÿ îò èñõîäíîé ïðîáû (ñì. ðèñ. 1, Èñõ). Êëîí Gly1, ïðèñóòñòâîâàâøèé â èñõîäíîé ïðîáå (ñì. ðèñ. 1, Èñõ), âûøåë â äîìèíàíòû óæå íà âòîðûå ñóòêè (ñì. ðèñ. 1, Ã-2) è ïðîäîëæàë äîìèíèðîâàòü äî ÷åòâåðòûõ ñóòîê ýêñïåðèìåíòà (ñì. ðèñ. 1, Ã-2 Ã-4). Íà òðåòüè ñóòêè â ÌÝÑ ¹ 3 ïîÿâèëñÿ ñóáäîìèíàíò Gly2 (ñì. ðèñ. 1, Ã-3). Íà ÷åòâåðòûå ñóòêè ýêñïåðèìåíòà ïðîôèëü ñóùåñòâåííî íå ìåíÿëñÿ, íà÷àëà óâåëè÷èâàòüñÿ äîëÿ âèäà Gly3 (ñì. ðèñ. 1, Ã-4). Íà ïÿòûå ñóòêè âèä Gly1 èñ÷åç èç áàêòåðèàëüíîãî ñîîáùåñòâà ÌÝÑ ¹ 3, îäíàêî ïîÿâèëñÿ íîâûé äîìèíèðóþùèé êëîí Gly4 (ñì. ðèñ. 1, Ã-5).  ïîñëåäíèé äåíü åãî âûòåñíèë äðóãîé íîâûé êëîí Gly5 (ñì. ðèñ. 1, Ã-6).  òå÷åíèå òðåòüèõ ïÿòûõ ñóòîê â ñîîáùåñòâå ÌÝÑ ¹ 3 ïðîèñõîäèëà òàêæå ïîëîæèòåëüíàÿ äèíàìèêà åùå äâóõ âèäîâ, îäíàêî â äîìèíàíòû ê êîíöó ýêñïåðèìåíòà îíè íå âûøëè. Òàêèì îáðàçîì, â áàêòåðèàëüíîì ñîîáùåñòâå ïðè äîáàâëåíèè ãëèöèíà ïðîèçîøëè ðîñò ÷èñëåííîñòè äâóõ èñõîäíî çàìåòíûõ âèäîâ ñ ïîñëåäóþùèì èñ÷åçíîâåíèåì îäíîãî èç íèõ ê êîíöó ýêñïåðèìåíòà è ïðîÿâëåíèå òðåõ íå îáíàðóæèâàåìûõ â èñõîäíîé ïðîáå âèäîâ áàêòåðèé (ñì. ðèñ. 1, Èñõ). Ðèñ. 1. ÏÖÐ-ÄÃÃÝ îáðàçöîâ áàêòåðèîïëàíêòîíà èç ÌÝÑ ¹ 1 (ëèçèí, äîðîæêè Ë-2 Ë-6), ÌÝÑ ¹ 2 (êîíòðîëü, äîðîæêè Ê-2 Ê-6), ÌÝÑ ¹ 3 (ãëèöèí, äîðîæêè Ã-2 Ã-6) è èñõîäíîé ïðîáû (Èñõ). Ñòðåëêè óêàçûâàþò íà ïîëîñû ÄÍÊ, íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîòîðûõ îïðåäåëåíà. Öèôðû ðÿäîì ñî ñòðåëêàìè îáîçíà÷àþò íîìåð êëîíà â òàáëèöå $ Ðèñ. 2. Ôèëîãåíåòè÷åñêîå äðåâî ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé ãåíà 16S ðÐÍÊ ñóáäîìèíàíòíûõ êëîíîâ, âûäåëåííûõ èç ïîëîñ ÄÃÃÝ Â ÌÝÑ ¹ 1 ñ äîáàâêîé ëèçèíà íà âòîðûå ñóòêè ýêñïåðèìåíòà îäíî èç äîìèíèðóþùèõ ïîëîæåíèé çàíÿë âèä Lys1 (ñì. ðèñ. 1, Ë-2), îäíàêî ê êîíöó ýêñïåðèìåíòà åãî äîëÿ óìåíüøèëàñü (ñì. ðèñ. 1, Ë-3 Ë-6). Ê ÷åòâåðòûì ñóòêàì â äîìèíàíòû âûøåë âèä Lys2 (ñì. ðèñ. 1, Ë-3 Ë-4), íî âïîñëåäñòâèè îí òàêæå óñòóïèë ìåñòî äâóì íîâûì âèäàì (ñì. ðèñ. 1, Ë-5 Ë-6). Ïî ðåçóëüòàòàì ôèëîãåíåòè÷åñêîãî àíàëèçà (ðèñ. 2) êëîíû Lys1 è Lys2, äîìèíèðîâàâøèå â òå÷åíèå ïåðâûõ òðåõ ñóòîê â ÌÝÑ ¹ 1 ñ äîáàâêîé ëèçèíà (ñì. ðèñ. 1, Ë-1 Ë-3), ïðèíàäëåæàëè ê ñåìåéñòâó Burkholderiaceae êëàññà Áåòàïðîòåîáàêòåðèé. Áëèæàéøèå ðîäñòâåííèêè êëîíîâ Gly2, Gly4 è Gly5 èç ÌÝÑ ¹ 3 ñ äîáàâêîé ãëèöèíà (ñì. ðèñ. 1, Ã-2 Ã-6) ïðèíàäëåæàëè ê ñåìåéñòâó Comamon adaceae òîãî æå êëàññà. Êëîí Gly5 (ñì. ðèñ. 1, Ã-6) îáðàçîâàë îòäåëüíóþ âåòâü, äàëåêî îòñòîÿùóþ îò âñåõ îñòàëüíûõ ïðåäñòàâèòåëåé ñå- ìåéñòâà Comamonàdaceae (ñì. ðèñ. 2). Êëîí Gly1 (ñì. ðèñ. 1, Ã-2) îêàçàëñÿ íàèáîëåå áëèçîê íåêóëüòèâèðóåìûì êëîíàì êëàññà Chloroflexi (ñì. ðèñ. 2). Íåêóëüòèâèðóåìûå êëîíû ýòîãî êëàññà, âêëþ÷àÿ Gly1, îáðàçóþò îòäåëüíûé êëàñòåð, äàëåêî îòñòîÿùèé îò âñåõ èçâåñòíûõ êóëüòèâèðóåìûõ âèäîâ ýòîãî êëàññà (ñì. ðèñ. 2). Îïðåäåëèòü íóêëåîòèäíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü èññëåäóåìîãî ó÷àñòêà ãåíà 16S ðÐÍÊ êëîíà Gly3 (ñì. ðèñ. 1, Èñõ Ã6) íà äàííûé ìîìåíò íå óäàëîñü. Èòàê, îòäåëüíûå âèäû (êëîíû) íåêóëüòèâèðóåìîãî ñâîáîäíîæèâóùåãî áàêòåðèîïëàíêòîíà îêàçàëèñü óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûìè ïî ñïîñîáíîñòè ê ïîòðåáëåíèþ îòäåëüíûõ àìèíîêèñëîò. Íà äîáàâëåíèå îòäåëüíîé àìèíîêèñëîòû ðåàãèðîâàëî íå âñå áàêòåðèàëüíîå ñîîáùåñòâî, à ëèøü íåáîëüøîå ÷èñëî êëîíîâ, èìåâøèõ â èñõîäíûõ ïðîáàõ ñðàâíèòåëüíî íèçêóþ ÷èñëåííîñòü. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû ïîëíîñòüþ ñîãëàñóþòñÿ ñ ðàíåå ïðîâå% äåííûìè ýêñïåðèìåíòàìè [20], îäíàêî ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷åñêàÿ èäåíòèôèêàöèÿ óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûõ êëîíîâ ïðîâåäåíà âïåðâûå. Ðàíåå íàìè âûäâèíóòî ïðåäïîëîæåíèå, ÷òî â îòëè÷èå îò òðàäèöèîííûõ ïðåäñòàâëåíèé, ñîãëàñíî êîòîðûì ãðóïïû âîäíûõ áàêòåðèé ïîäðàçäåëÿþòñÿ íà ïîòðåáèòåëåé âñåãî êëàññà òåõ èëè èíûõ âåùåñòâ (íàïðèìåð, ëèïèäîâ, ñàõàðîâ, àìèíîêèñëîò), ìàññîâûå âèäû áàêòåðèîïëàíêòîíà ìîãóò îêàçàòüñÿ óçêîñïåöèàëèçèðîâàííûìè, ò. å. ïîòðåáëÿþùèìè ïðåèìóùåñòâåííî îäíî ïðîñòîå âåùåñòâî [20]. Õîðîøî èçâåñòíî, ÷òî îäíè è òå æå êëîíû (âèäû) áàêòåðèîïëàíêòîíà îáíàðóæèâàþòñÿ â àáñîëþòíî ðàçíûõ ýêîñèñòåìàõ, êàðäèíàëüíî îòëè÷àþùèõñÿ ïî ñîñòàâó ïðîäóöåíòîâ è êîíñóìåíòîâ [2123]. Íå èñêëþ÷åíî, ÷òî ïîäîáíûé êîñìîïîëèòèçì (ýâðèòîïíîñòü) ñâèäåòåëüñòâóåò î ïîòðåáëåíèè áàêòåðèîïëàíêòîíîì ïðîñòûõ âåùåñòâ, óíèâåðñàëüíûõ äëÿ âñåõ âîäíûõ ýêîñèñòåì, íàïðèìåð àìèíîêèñëîò. Åñëè áû òå èëè èíûå êëîíû ñâîáîäíîæèâóùèõ ïëàíêòîííûõ áàêòåðèé ïîòðåáëÿëè ñëîæíûå îðãàíè÷åñêèå ìåòàáîëèòû è ïðîäóêòû ðàçëîæåíèÿ äðóãèõ îðãàíèçìîâ, èõ ïðèñóòñòâèå çàâèñåëî áû îò âèäîâîãî ñîñòàâà äðóãèõ ãðóïï ïëàíêòîíà, êàê ýòî ïðîèñõîäèò â ñëó÷àå ïðèêðåïëåííîãî áàêòåðèîïëàíêòîíà [4]. Ïèòàíèå ïðîñòûìè ñóáñòðàòàìè òðåáóåò óçêîé ñïåöèàëèçàöèè ãåòåðîòðîôîâ, èíà÷å íåâîçìîæíûì ñòàíîâèòñÿ äîñòèæåíèå òàêîãî âàæíîãî ôàêòîðà óñòîé÷èâîñòè ñîîáùåñòâ, êàê áèîðàçíîîáðàçèå.  ñâÿçè ñ óïîìÿíóòûì âûøå êîñìîïîëèòèçìîì (ýâðèòîïíîñòüþ) âîçíèêàåò âîïðîñ, äåéñòâèòåëüíî ëè âñå èäåíòèôèöèðîâàííûå êëîíû èçíà÷àëüíî ïðèñóòñòâîâàëè â ïðèðîäíîé âîäå âîäîõðàíèëèùà, à íå áûëè çàíåñåíû ñëó÷àéíî èç âîçäóõà èëè ñ îáîðóäîâàíèÿ ïðè çàâåäîìî íåñòåðèëüíîì êóëüòèâèðîâàíèè? Ïðåæäå âñåãî, îòìåòèì, ÷òî êëîíû Gly1, Gly3, Lys1 è Lys2 ïðèñóòñòâîâàëè êàê â èñõîäíîé ïðîáå èç âîäîõðàíèëèùà, òàê è â êîíòðîëå, íî â çíà÷èòåëüíî ìåíüøåì êîëè÷åñòâå, ÷åì â ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ÌÝÑ ñ ñîîòâåòñòâóþùèìè äîáàâêàìè (ñì. ðèñ. 1). Âåðîÿòíî, Gly2, Gly4 è Gly5 òàêæå ñîäåðæàëèñü â èñõîäíîé ïðîáå èç âîäîõðàíèëèùà, íî íå ïðîÿâëÿëèñü ïðè ÄÃÃÝ-àíàëèçå. Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî ìåòîä ÄÃÃÝ ïîçâîëÿåò îáíàðó& æèòü âèäû, ÷èñëåííîñòü êîòîðûõ â ñîîáùåñòâå ñîñòàâëÿåò áîëåå 12 %, ïîýòîìó ïîÿâëåíèå íîâûõ ïîëîñ ÄÍÊ íà ïðîôèëå ñîîáùåñòâà ñâèäåòåëüñòâóåò, êàê ïðàâèëî, íå î ïîÿâëåíèè íîâîãî âèäà â ýêîñèñòåìå, à îá óâåëè÷åíèè åãî ÷èñëåííîñòè äî îïðåäåëÿåìîé âåëè÷èíû [24]. Âàæíî ïîä÷åðêíóòü, ÷òî â êîíòðîëüíîé ÌÝÑ ¹ 2 (ñì. ðèñ. 1, Ê-2 Ê-6) â òå÷åíèå âñåãî ýêñïåðèìåíòà íå ïðîèñõîäèëî ñóùåñòâåííûõ êà÷åñòâåííûõ è êîëè÷åñòâåííûõ èçìåíåíèé ñîñòàâà áàêòåðèîïëàíêòîíà ïî ñðàâíåíèþ ñ èñõîäíîé ïðîáîé (ñì. ðèñ. 1, Èñõ). Äàííûé ðåçóëüòàò õîðîøî ñîãëàñóåòñÿ ñ ïîëó÷åííûìè ðàíåå äîêàçàòåëüñòâàìè óñòîé÷èâîãî ôóíêöèîíèðîâàíèÿ åñòåñòâåííûõ ïëàíêòîííûõ ñîîáùåñòâ â àíàëîãè÷íûõ ÌÝÑ [15]. Òàêèì îáðàçîì, âñå êëîíû Gly è Lys ïðîÿâëÿëèñü è óâåëè÷èâàëè ÷èñëåííîñòü â ÌÝÑ ñ äîáàâêàìè àìèíîêèñëîò íå â ðåçóëüòàòå àðòåôàêòîâ, ñâÿçàííûõ ñ íåñòåðèëüíûì êóëüòèâèðîâàíèåì, à âñëåäñòâèå äîáàâîê îïðåäåëåííûõ àìèíîêèñëîò. Äîáàâëÿåìûå àìèíîêèñëîòû òàêæå ÿâëÿþòñÿ îáû÷íûìè êîìïîíåíòàìè âîäû âîäîõðàíèëèùà Áóãà÷.  ïðåäûäóùèå ãîäû ãëèöèí îòìå÷åí ñðåäè àìèíîêèñëîò ñ íàèáîëåå âûñîêîé êîíöåíòðàöèåé, åãî ñîäåðæàíèå ñîñòàâëÿëî â ñðåäíåì 7,72 % îò èõ îáùåé ñóììû. Ñîäåðæàíèå ëèçèíà áûëî íåñêîëüêî íèæå (4,46 %), íî ýòà àìèíîêèñëîòà òàêæå ïðèñóòñòâîâàëà â ïðîáàõ â òå÷åíèå âñåãî âåãåòàöèîííîãî ñåçîíà [11]. Õîòÿ ìû ñâÿçûâàåì ïðîÿâëåíèå è äîìèíèðîâàíèå êëîíîâ Gly èìåííî ñ äîáàâêîé ãëèöèíà, íå èñêëþ÷åíî, ÷òî íåïîñðåäñòâåííî ïîòðåáëÿþò ýòó àìèíîêèñëîòó ëèøü êëîíû Gly1 è Gly2. ×èñëåííîñòü ýòèõ êëîíîâ ðåçêî óâåëè÷èëàñü íåïîñðåäñòâåííî ïîñëå äîáàâêè ãëèöèíà, à íà ïÿòûå ñóòêè ðåçêî ñíèçèëàñü (ñì. ðèñ. 1). Ìàëîâåðîÿòíî, ÷òî íà ñíèæåíèå ÷èñëåííîñòè êëîíà Gly1 îêàçàëî âëèÿíèå âûåäàíèå ãëèöèíà, ïîñêîëüêó åãî êîíöåíòðàöèÿ â 100 ðàç ïðåâûøàëà ìàêñèìàëüíóþ, õàðàêòåðíóþ äëÿ âîäîõðàíèëèùà. Âîçìîæíî, â ñíèæåíèè ÷èñëåííîñòè ýòèõ êëîíîâ ñûãðàë ðîëü íåèçâåñòíûé íàì ëèìèòèðóþùèé ôàêòîð. Ïîñëå ñíèæåíèÿ ÷èñëåííîñòè Gly1 äîìèíèðóþùåå ïîëîæåíèå â ÄÃÃÝ-ïðîôèëå áàêòåðèàëüíîãî ñîîáùåñòâà çàíÿëè íåèäåíòèôèöèðîâàííûå êëîíû Gly3, Gly4 è ïîçäíåå Gly5 (ñì. ðèñ. 1). Íå èñêëþ÷åíî, ÷òî êëîíû Ñóáäîìèíàíòíûå êëîíû, âûäåëåííûå èç íàèáîëåå ÿðêèõ ïîëîñ ÄÃÃÝ áàêòåðèàëüíîãî ñîîáùåñòâà ìèêðîýêîñèñòåì â õîäå ýêñïåðèìåíòà ñ äîáàâëåíèåì àìèíîêèñëîò Íîìåð Êëîí äåïîíèðîâàíèÿ Lys-1 HM072087 Äëèíà, ï. í. 584 Áëèæàéøèé ðîäñòâåííèê Uncultured Burkholderiaceae bacterium Ñõîäñòâî, % 100 clone Gap-2-60 (EU642211) Ãðóïïà Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae Lys-2 HM072086 585 Limnobacter thioxidans strain TSWCSN35 99 (GQ284439) Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae Gly-1 FN773496 562 Gly-2 FN773497 585 Uncultured bacterium clone 5C231722 100 Chloroflexi ? 99 Betaproteobacteria; (EU804038) Uncultured bacterium clone H5M13F (EU796063) Burkholderiales; Comamon adaceae Gly-4 FN773498 585 Uncultured Comamonàs sp. clone K11 98 (FN434426) Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamon adaceae Gly-5 FN773499 585 Uncultured Comamonàs sp. clone K7 (FN434424) 96 Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamon adaceae Gly4 è Gly5 ïîòðåáëÿþò íå ñàìó àìèíîêèñëîòó, à îðãàíè÷åñêèå âåùåñòâà ìåðòâûõ êëåòîê êëîíîâ Gly1 è Gly2. Ôèëîãåíåòè÷åñêèé àíàëèç èññëåäîâàííûõ êëîíîâ âûÿâèë ñëåäóþùåå. Gly1 èìåë 100%-þ èäåíòè÷íîñòü àíàëèçèðóåìîãî ó÷àñòêà ãåíà 16S ðÐÍÊ ñ íåêóëüòèâèðóåìûì áàêòåðèàëüíûì êëîíîì, íàèáîëåå áëèçêèì ê îòäåëó Chloroflexi (ñì. ðèñ. 2, òàáëèöó). Äàííûé êëîí îáíàðóæåí â âîäå îçåð Êèòàÿ, Ãðåöèè, Ñåâåðíîé, Öåíòðàëüíîé è Þæíîé Àìåðèêè (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Gly2 îêàçàëñÿ íà 99 % ñõîäåí ñ íåêóëüòèâèðóåìûì êëîíîì èç ñåìåéñòâà Comamonàdaceae êëàññà -ïðîòåîáàêòåðèé, îáíàðóæåííûì â ñòî÷íûõ âîäàõ. Gly4 èìåë 98%-å ñõîäñòâî ñî øòàììàìè Comamonàs testosteroni, âûäåëåííûìè èç ñòî÷íûõ âîä ôàáðèêè, ïðîèçâîäÿùåé òåòðàöèêëèí. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü íóêëåîòèäîâ ïðîàíàëèçèðîâàííîãî ó÷àñòêà ãåíà 16S rRNA êëîíà Gly5 èìåëà ëèøü 96%-å ñõîäñòâî ñ áëèæàéøèìè ðîäñòâåííèêàìè ñåìåéñòâà Comamonàdaceae. Òàêèì îáðàçîì, ñîãëàñíî îáùåïðèíÿòîìó ïðàâèëó 97 % [25], Gly5 ÿâëÿåòñÿ íîâûì, ðàíåå íå îïèñàííûì âèäîì. Ïîñëåäîâàòåëüíîñòü íóêëåîòèäîâ èññëåäîâàííîãî ó÷àñòêà 16S ðÐÍÊ êëîíà Lys1 îêàçàëàñü íà 100 % èäåíòè÷íà íåêóëüòèâèðóåìîìó áàêòåðèàëüíîìó êëîíó ñåìåéñòâà Burkholderiaceae (Polynucleobacter sp.). Ýòîò êëîí îáíàðóæåí â âîäàõ âûñîêîãîðíîãî îçåðà, â îç. Ìè÷èãàí è â ×åñàïèêñêîì çàëèâå (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Lys2 íà 99 % áûë èäåíòè÷åí øòàììó Limnobacter thioxidans, îáíàðóæèâàåìîìó â îñàäî÷íûõ îáðàçöàõ ïðåñíîâîäíîãî ðîäíèêà. Àíàëîãè÷íûå íåêóëüòèâèðóåìûå êëîíû îáíàðóæåíû â ïðîáå àýðîçîëÿ ñ áåðåãîâîé àíòàðêòè÷åñêîé ñòàíöèè Äþìîíò äÓðâèëëü, íà ïîâåðõíîñòè ñíåæíûõ ãëûá â Àíäàõ íà âûñîòå 6350 ì, âî ôüîðäå Àðêòè÷åñêîãî îêåàíà, íàä ìåñòîì âûõîäà ìåòàíà âäîëü êðàÿ Ñåâåðîàìåðèêàíñêîãî êîíòèíåíòà (http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi). Èäåíòèôèêàöèÿ âèäîâ áàêòåðèîïëàíêòîíà âàæíà íå òîëüêî äëÿ ôèëîãåíèè, íî è äëÿ ýêîëîãèè. Ïî îáðàçíîìó âûðàæåíèþ Â. È. Âåðíàäñêîãî [26], êàæäûé áèîëîãè÷åñêèé âèä â ïðèðîäå âûïîëíÿåò óíèêàëüíóþ, òîëüêî åìó ïðèñóùóþ ãåîõèìè÷åñêóþ ðàáîòó, ò. å. ïîòðåáëÿåò îïðåäåëåííûå âèäû ' âåùåñòâà è ýíåðãèè è ñèíòåçèðóåò èç íèõ äðóãèå ñïåöèôè÷åñêèå âåùåñòâà, âêëþ÷àÿ ñîáñòâåííóþ áèîìàññó. Çíàíèÿ î êîíêðåòíûõ âèäàõ è ïîòðåáëÿåìûõ èìè ñóáñòðàòàõ â íàñòîÿùåå âðåìÿ ìîãóò áûòü ôîðìàëèçîâàíû â ìàòåìàòè÷åñêèõ ìîäåëÿõ âîäíûõ ýêîñèñòåì, ïðåäíàçíà÷åííûõ äëÿ ïðîãíîçà è óïðàâëåíèÿ êà÷åñòâîì ïðèðîäíûõ âîä [2, 27]. Òî÷íîñòü ïðîãíîçà è óñïåøíîñòü óïðàâëåíèÿ, íåñîìíåííî, ïîâûñÿòñÿ â ñëó÷àå çàìåíû â ìîäåëÿõ àãðåãèðîâàííîãî áàêòåðèîïëàíêòîíà è àãðåãèðîâàííîãî îðãàíè÷åñêîãî âåùåñòâà íà êîíêðåòíûå âèäû áàêòåðèé è êîíêðåòíûå âèäû óòèëèçèðóåìûõ èìè âåùåñòâ [28]. Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå ÐÔÔÈ, ãðàíò ¹ 09-04-01748. ËÈÒÅÐÀÒÓÐÀ 1. Àäàìîâè÷ Â. Â. Ýêñïåðèìåíòàëüíîå îïðåäåëåíèå ïàðàìåòðîâ ôóíêöèîíèðîâàíèÿ ìèêðîôëîðû Êðàñíîÿðñêîãî âîäîõðàíèëèùà // Âîäíûå ðåñóðñû. 1992. ¹ 2. Ñ. 106114. 2. Ãëàäûøåâ Ì. È. Îñíîâû ýêîëîãè÷åñêîé áèîôèçèêè âîäíûõ ñèñòåì. Íîâîñèáèðñê: Íàóêà. Ñèá. îòä-íèå, 1999. 113 ñ. 3. Ãîðëåíêî Â. Ì., Äóáèíèíà Ã. À., Êóçíåöîâ Ñ. È. Ýêîëîãèÿ âîäíûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ. Ì.: Íàóêà, 1977. 288 ñ. 4. Cole J. J. Interactions between bacteria and algae in aquatic ecosystems // Ann. Rev. Ecol. Syst. 1982. Vol. 13. P. 291314. 5. Amann R., Ludwig W., Schleifer K. H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. Vol. 59, N 1. P. 143169. 6. Weiss M., Simon M. Consumption of labile dissolved organic matter by limnetic bacterioplankton: the relative significance of amino acids and carbohydrates // Aquatic Microbial Ecology. 1999. Vol. 17. P. 1 12. 7. Grover J. P., Chrzanowski T. H. Season al patterns of substrate utilization by bacterioplankton: case studies in four temperate lakes of different latitudes // Ibid. 2000. Vol. 23. P. 4154. 8. Rosenstock B., Simon M. Sources and sinks of dissolved free amino acids and protein in a large and deep mesotrophic lake // Limnol. Oceanogr. 2001. Vol. 46(3). P. 644654. 9. Pérez M. T., Pausz C., Herndl G. J. Major shift in bacterioplankton utilization of en antiomeric amino acids between surface waters and the oceans interior // Ibid. 2003. Vol. 48(2). P. 755763. 10. Zubkov M. V., Tarran G. A., Mary I., Fuchs B. M. Differential microbial uptake of dissolved amino acids and amino sugars in surface waters of the Atlantic Ocean // J. îf Plankton Research. 2008. Vol. 30, N 2. P. 211220. 11. Kalachova G. S., Kolmakova A. A., Gladyshev M. I., Kravchuk E. S., Ivanova E. A. Season al dyn amics of amino acids in two small Siberian reservoirs domin ated by prokaryotic and eukaryotic phytoplankton // Aquat. Ecol. 2004. Vol. 38. P. 315. 12. Gladyshev M. I., Sushchik N. N., Kolmakova, A. A., Kalachova G. S., Kravchuk E. S., Ivanova E. A., Makhutova O. N. Season al correlations of elemental and 3 PUFA composition of seston and domin ant phytoplankton species in a eutrophic Siberian Reservoir // Ibid. 2007. Vol. 41. P. 923. 13. Gladyshev M. I., Sushchik N., Kalachova G. S., Shchur L. A. The effect of algal blooms on the disappearance of phenol in a small forest pond // Water Research. 1998. Vol. 32, N 9. P. 27692775. 14. Ñóùèê Í. Í., Ãëàäûøåâ Ì. È., Êàëà÷åâà Ã. Ñ., Ïëàêñèíà È. Â. Äèíàìèêà áèîìàññû ìèêðîâîäîðîñëåé è ñîñòàâà âíåêëåòî÷íûõ ñâîáîäíûõ æèðíûõ êèñëîò â ýêñïåðèìåíòàëüíûõ ìèêðîýêîñèñòåìàõ // Èçâ. ÐÀÍ. Ñåð. áèîë. íàóê. 1998. ¹ 6. Ñ. 738744. 15. Ãëàäûøåâ Ì. È. Ýêñïåðèìåíòàëüíûå ýêîñèñòåìû è èõ ïðèìåíåíèå äëÿ èçó÷åíèÿ áèîäåãðàäàöèè ëåãêîîêèñëÿåìûõ òîêñèêàíòîâ â ïåëàãèàëè (îáçîð) // Ãèäðîáèîë. æóðí. 1992. Ò. 28, ¹ 5. Ñ. 6877. 16. Bostrom K. H., Simu K., Hagstrom A., Riemann L. Optimization of DNA extraction for quantitative marine bacterioplankton community an alysis // Limnol. Oceanogr.: Methods. 2004. Vol. 2. P. 365373. 17. Schauer M., Massanà R., Pedros-Alio C. Spatial differences in bacterioplankton composition along the Catalan coast (NW Mediterranean) assessed by molecular fingerprinting // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. Vol. 33. P. 5159. 18. Ïðèãîòîâëåíèå Ò-âåêòîðà [Ýëåêòðîííûé ðåñóðñ] // Äàòà ïîñëåäíåé ìîäèôèêàöèè: 14/01/06. Ðåæèì äîñòóïà: http://molbiol.ru/protocol/12_05 (äàòà îáðàùåíèÿ 28.06.2010). 19. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Vol. 2. 20. Òðóñîâà Ì. Þ., Ãëàäûøåâ Ì. È. Ýêñïåðèìåíòàëüíîå îïðåäåëåíèå îðãàíè÷åñêèõ ñóáñòðàòîâ, óòèëèçèðóåìûõ íåêóëüòèâèðóåìûì áàêòåðèîïëàíêòîíîì ýâòðîôíîãî âîäîõðàíèëèùà // Äîêë. ÀÍ. 2006. Ò. 409, ¹ 1. Ñ. 136138. 21. Trusova M. Yu., Gladyshev M. I. Phylogenetic diversity of winter bacterioplankton of eutrophic Siberian reservoirs as revealed by 16S rRNA gene sequences // Microb. Ecol. 2002. Vol. 44. P. 252259. 22. Glöckner F. O., Zaichikov E., Belkova N., Denissova L., Pernthaler J., Pernthaler A., Amann R. Comparative 16S rRNA an alysis of lake bacterioplankton reveals globally distributed phylogenetic clusters including an abundant group of actinobacteria //Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66, N 11. P. 50535065. 23. Pommier T., Canbäck B., Riemann L., Boström K. H., Simu K., Lundberg P., Tunlid A., Hagström A. Global patterns of diversity and community structure in marine bacterioplankton // Mol. Ecol. 2007. Vol. 16, N 4. P. 867880. 24. Muyzer G., de Waal E. C., Uitterlinden A. G. Profiling of complex microbial populations by den aturing gradient gel electrophoresis an alysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59, N 3. P. 695 700. 25. Giovannoni S. J., Stingl U. Molecular diversity and ecology of microbial plankton // Nature. 2005. Vol. 437. P. 343348. 26. Âåðíàäñêèé Â. È. Æèâîå âåùåñòâî. Ì.: Íàóêà, 1978. 358 ñ. 27. Äåãåðìåíäæè À. Ã., Ãëàäûøåâ Ì. È. Ïðèðîäíûå âîäû, ìàòåìàòè÷åñêèå ìîäåëè // Âåñòí. ÐÀÍ. 1995. Ò. 65, ¹ 9. Ñ. 807810. 28. Degermendzhi A. G. // Aquatic Ecology. 2010 (in press). Consumption of Amino Acids by Non-Cultivated Bacterioplankton of an Eutrophic Water Reservoir O. V. KOLMAKOVA, M. Yu. TRUSOVA* Siberian Federal University 660041, Krasnoyarsk, Svobodny ave., 79 *Institute of Biophysics of Siberian Branch RAS 660036, Krasnoyarsk, Akademgorodok E-mail: mtrusova@ibp.krasn.ru Species (clones) of the water-reservoir bacterioplankton living on lysine and glycine were revealed in the experimental microsystems using unsterile cultivation. The structure of the community was anàlyzed using the separation of amplificated fragments of the 16S ðRNA gene of the bacteria under the conditions of denàturating gradient gel electrophoresis. Identification of the domin ant species (clones) of bacterioplankton was carried out using molecular cloning and determin ation of the nucleotide sequence of the region of 16S gene of ribosomal RNA. It was discovered that glycine, one of the prevailing amino acids of an eutrophic water reservoir, and lysine, with its lower content in n atural water, served as nutrition substrates for different subdomin ant species (clones) of bacterioplankton. So, it was established that the species of free-living bacterioplankton are n arrow-specialized with respect to the consumption of separate amino acids. Key words: free-living non-cultivated bacterioplankton, amino acids, PCR-DGGE, microecosystems, 16S ribosomal RNA.
