1 удк 547.964.4:678.745.2 гиперразветвленные полилизины
advertisement
УДК 547.964.4:678.745.2 ГИПЕРРАЗВЕТВЛЕННЫЕ ПОЛИЛИЗИНЫ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ГИСТИДИНОМ И АРГИНИНОМ: ОПТИМИЗАЦИЯ ДНК-КОМПАКТИЗИРУЮЩИХ И ЭНДОСОМОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 2009 г. А. А. Егорова***, А. В. Киселев**,***, И. И. Тарасенко*, П. Л. Ильина***, Г. А. Панкова*, И. Е. Ильина*, В. С. Баранов**, Г. П. Власов*# *Институт высокомолекулярных соединений РАН, 199004, Санкт-Петербург, Большой пр., 31; **Институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН , Санкт-Петербург; ***Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург Поступила в редакцию 29.12.2008 г. Принята к печати 26.01.2009 г. Изучены ДНК-компактизирующие и трансфекционные свойства гиперразветвленных полилизинов, модифицированных по аминогруппам N-концевых лизиновых остатков гистидином и аргинином. Показано, что модифицированные гистидином гиперразветвленные полилизины обеспечивают большую эффективность связывания и трансфекции по сравнению с немодифицированным или аргининсодержащими гиперразветвленными полилизинами, что обусловлено наличием у гистидинмодифицированных полимеров собственной эндосомолитической активности. Обнаружена зависимость между количеством аминокислот, модифицирующих терминальные лизиновые остатки в гиперразветвленных полилизинах, эффективностью связывания ими ДНК и трансфекционной активностью комплексов ДНК с соответствующими носителями. Рассмотрена возможность повышения трансфекционной активности комплексов ДНК с гиперразветвленными полилизинами с помощью глицерина или амфипатического нонадекапептида JTS-1. В то же время найдено, что их одновременное использование приводит к снижению трансфекции. Ключевые слова: гиперразветвленные полилизины; ДНК; комплексообразование; ретардация; трансфекция; лизосомолитическая активность. ВВЕДЕНИЕ Одной из актуальных проблем генной терапии является поиск эффективных методов невирусной доставки генетических использованием синтетических конструкций в клетки и ткани организма полипептидов. К их преимуществам, наряду с со способностью связывать и компактизировать ДНК, относятся биосовместимость и биодеградируемость. Изучение зависимости между их строением и способностью связывать ДНК и эффективностью трансфекции комплексов ДНК с носителями является важным этапом в создании перспективных систем направленного транспорта генетического материала в клетку. Использованы сокращения, рекомендованные номенклатурной комиссией IUPAC-IUB; кроме того: BE – бромистый этидий; Bom – бензилоксиметил; HbpKR и HbpKH – гиперразветвленный (Hb) полилизин (HbpK), модифицированный аргинином и гистидином; Mts – мезитиленсульфо; NCA – N-карбоксиангидрид Nεбензилоксикарбониллизина; Pfp – пентафторфенил; РАМАМ – полиамидоаминный дендример; Polyfect – его коммерческое название. # Автор для связи (факс: (812) 328-68-69; тел.: (812) 323-10-50; эл. почта: gpvlasov@km.ru). 1 Линейный полилизин был одним из первых полимеров, использованных для невирусной доставки ДНК in vivo. Однако этот носитель не обеспечивал высокий уровень трансфекции [1], поэтому с целью усиления его трансфекционной активности была проведена модификация части Nε-аминогрупп полилизина гистидином, что повысило уровень экспрессии репортерного гена [2]. Дальнейшее усиление трансфекционной активности комплексов полилизина с ДНК было достигнуто в результате использования разветвленных вариантов полилизина, таких, как лизиновые дендримеры. Дендримеры – это синтетические макромолекулы, имеющие сферическую структуру и плотное ядро (core) [3]. Комплексы ДНК и лизиновых дендримеров и их производных показали достаточно высокие трансфекционные свойства [4–8], однако синтез дендримеров является длительным, трудоемким процессом и не всегда приводит к цели [9], что потребовало разработки новых вариантов таких носителей. Среди них можно выделить высокомолекулярные лизиновые дендримеры [10], дендриграфты [11] и гиперразветвленные полилизины, синтез которых предложен нами недавно [12, 13]. Мы показали, что их форма приближается к сферической, напоминая форму глобулярных белков и дендримеров [12]. Наличие так называемой «гистоновой мимикрии» данных полимеров определило наш дальнейший интерес к их синтезу, модификации и исследованию в качестве возможных невирусных средств доставки ДНК. Нами был разработан практически одностадийный синтез гиперразветвленных полилизинов, модифицированных по аминогруппам N-концевых лизиновых остатков гистидином, что позволило, с одной стороны, регулировать молекулярный вес полимера и, с другой, значительно усиливать трансфекционную активность комплексов ДНК с их участием [13, 14]. Известна также повышенная способность аргининобогащенных олиголизинов проникать в клетки, что делает перспективным их использование в качестве носителей для доставки ДНК [15]. применения для Поэтому в данном сообщении с целью выяснения возможности целевого транспорта ДНК гиперразветвленных полилизинов, модифицированных гистидином и аргинином, мы приводим сравнительные данные по ДНКкомпактизирующим и трансфекционным свойствам полилизинов, модифицированных по аминогруппам N-концевых остатков лизина гистидином и аргинином, и сравниваем их с теми же свойствами немодифицированного гиперразветвленного полилизина. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Синтез гиперразветвленных полилизинов Синтез гиперразветвленных полилизинов проводили в условиях каталитического восстановительного удаления Nε-бензилоксикарбонильной (Cbz) защитной группы с Nкарбоксиангидрида Nε-бензилоксикарбониллизина (NCA) при действии газообразного 2 водорода в присутствии активированного палладия. При этом в реакционную среду наряду с NCA вводили активированные пентафторфениловые эфиры Nα-трет- бутилоксикарбониламинокислот соответственно – Boc-His(Bom)-OPfp [14] или BocArg(Mts)-OPfp, Nα-Boc-защитная группа которых устойчива в условиях каталитического удаления бензилоксикарбонильной группы. Активированные эфиры гистидина и аргинина выполняли при этом две функции – выступали в качестве прерывателя полимеризации NCA, позволяя регулировать молекулярный вес полимера и одновременно модифицировать аминогруппы его N-концевых аминокислот гистидином и аргинином (схема). Как следует из схемы Nε-аминогруппы лизина, возникшие в ходе каталитического удаления Nε-Cbz-защитной группы с NCA, сразу инициируют полимеризацию новых порций NCA, что ведет к росту олиголизиновых/полилизиновых цепочек, связанных с Nε - аминогруппами NCA. В ходе продолжающегося гидрирования происходит удаление части Cbz-групп с Nε-аминогрупп образовавшихся олигомерных/полимерных цепочек. Эти аминогруппы инициируют полимеризацию новых порций NCA, что ведет, в результате, к ветвлению растущего полимера. В зависимости от использованного соотношения NCA и активированного эфира Nα-Boc-гистидина или Nα-Boc-аргинина последние начинают конкурировать с NСA, модифицируют аминогруппы растущих полимерных цепей Boc- гистидином или Boc-аргинином, прекращая рост полимерных цепей. После выделения конечного продукта, его полного деблокирования и очистки с помощью гельпроникающей хроматографии был получен гиперразветвленный (Hb) полилизин (HbpK), модифицированный по аминогруппам N-концевых остатков лизина гистидином (HbpKH) или аргинином (HbpKR). Аналитическая хроматография полученных соединений на калиброванных по гельпроникающая белкам колонках, заполненных сефадексом G-50 или G-70, позволила определить молекулярные массы полимеров (табл. 1). Из данных табл. 1 следует, что во всех случаях полимеры имеют бимодальное распределение – содержат низкомолекулярную и высокомолекулярную фракции [14], доля которых зависит от выбранного соотношения NCA и обрывателей его полимеризации – активированных эфиров гистидина и аргинина. В смеси преобладает низкомолекулярный полимер при соотношении 1 : 1 или высокомолекулярный полимер при соотношении 10 : 1. Для анализа аминокислотного состава полимеров был использован капиллярный электрофорез, с помощью которого после полного кислотного гидролиза полимеров было определено соотношение в конечных полимерах количества остатков лизина и модифицирующих полимеры аминокислот – гистидина или аргинина. 3 Анализ эффективности образования комплексов полимерных носителей с ДНК Эффективность образования комплексов полилизиновых носителей с плазмидной ДНК определяли по электрофоретической подвижности комплексов, полученных при разных весовых соотношениях ДНК/носитель, в агарозном геле (метод ретардации) [16]. Для визуализации ДНК в геле применили интеркалирующий краситель бромистый этидий. В качестве отрицательного контроля образования комплексов использовали свободную плазмиду (рис. 1). Как следует из рис. 1а, начало связывания ДНК с немодифицированным Hb-полилизином HbpK (1, табл. 1) происходит при весовом соотношении ДНК/ носитель 1 : 0.4 (дорожка 2) и полное связывание практически заканчивалось при соотношении 1 : 0.6 (дорожка 3). Образование комплексов гистидином HbpKH2 (3, табл. 1), ДНК с Hb-полилизином, модифицированным начиналось при том же весовом соотношении ДНК– носитель, как и в случае немодифицированного Hb-полилизина, а именно, при соотношении 1 : 0.4 (рис. 1б, 2) и практически заканчивалось при соотношении 1 : 0.6 (рис. 1б, 3). Образование комплексов ДНК с другим Hb-полилизином, модифицированным гистидином, HbpKH1 (2, табл. 1), начиналось при соотношении ДНК–носитель 1 : 0.6 (рис. 1в, 3), а полное связывание плазмиды заканчивалось при соотношении ДНК–носитель 1 : 0.8 (рис. 1в, 4). Из рассмотрения данных по компактизации ДНК аргининсодержащим Hb- полилизином HbpKR2 (5, табл. 1) следует, что она начинается при соотношении ДНК/носитель 1 : 0.8 (рис. 1г, 4) и заканчивается при соотношении 1 : 1 (рис. 1г, 5). В случае второго аргининмодифицированного Hb-полилизина HbpKR1 (4, табл. 1) компактизация ДНК начинается при еще большем соотношении ДНК/носитель, а именно 1 : 1 (рис. 1д, 5), а полное связывание плазмиды заканчивается при соотношении 1 : 3 (рис. 1д, 6). Из полученных результатов следует, что, во-первых, Hb-полилизины, модифицированные по аминогруппам N-концевых лизиновых остатков гистидином (HbpKH1 и HbpKH2), связывают ДНК лучше, чем аналоги, модифицированные аргинином (HbpKR1 и HbpKR2). Во-вторых, ДНК-связывающая способность носителей зависит от количества введенного в него модификатора. По-видимому, существует определенный оптимум соотношения лизин/модифицирующая аминокислота, по достижении которого введение большего количества модифицирующих аминокислот – гистидина или аргинина – может приводить к снижению ДНК-связывающей способности носителя, что аргининсодержащего Hb-полилизина. Полученные особенно ярко проявляется у нами результаты совпадают с аналогичными данными, полученными для линейного полилизина, модифицированного гистидином по Nε-аминогруппам [2], когда было показано, что ДНК-связывающая активность носителя была оптимальной при содержании гистидина 34–38%. 4 Анализ характера компактизации ДНК в составе ее комплексов с носителями Оценку компактизации плазмидной ДНК в комплексе с носителями изучали методом вытеснения бромистого этидия (BE) (рис. 2а, б, в). За 100% интенсивности флуоресценции принимали свечение BE при интеркаляции его в ДНК в отсутствие носителя. Было показано, что в точке, соответствующей зарядовому соотношению ДНК–немодифицированный гиперразветвленный полилизин HbpK, равному 1 : 0.2 (рис. 2а), начинается падение флуоресценции, что говорит о возрастании плотности формирующихся комплексов. Нарастание плотности комплекса заканчивается при соотношении компонентов комплекса, равном 1 : 0.6, что ведет к полному гашению флуоресценции BE. Для Hb-полилизина, модифицированного гистидином, HbpKH2, постепенное падение интенсивности флуоресценции регистрировали в интервале весовых соотношений ДНК– носитель 1 : 0.4–1 : 0.8 (рис. 2б), в то время, как для второго модифицированного гистидином образца – HbpKH1 (рис. 2б) гашение флуоресценции происходило, начиная уже с соотношения 1 : 0.1, и в интервале весовых соотношений ДНК/носитель 1 : 0.1–1 : 0.6 интенсивность флуоресценции оставалась примерно на модифицированного полилизина HbpKH2, резкое гашение постоянном уровне. Для флуоресценции наблюдали в интервале соотношений 1 : 0.6–1 : 0.8, а для образца HbpKH1, в интервале соотношений 1 : 0.6–1 : 1. При дальнейшем увеличении количества использованного носителя, начиная с весового соотношения 1 : 1, кривая интенсивности флуоресценции выходила на плато. В случае аргининсодержащего гиперразветвленного полилизина, HbpKR2, падение интенсивности флуоресценции регистрировалось в интервале весовых соотношений 1 : 0.2–1 : 1 и проходило достаточно плавно (рис. 2в). Для второго модифицированного аргинином полилизина, HbpKR1, гашение флуоресценции начиналось при соотношении 1 : 0.2 и происходило плавно в интервале соотношений от 1 : 0.4–1 : 2. Из полученных данных следует, что модификация N-концевых остатков лизина Hbполилизина именно гистидином, но не аргинином, приводит к более компактным комплексам, образование которых проходит в более узком интервале отношений ДНК– носитель, при этом компактизация зависит от количества модифицирующей концевые аминогруппы гиперразветвленного полилизина аминокислоты и практически не зависит от молекулярного веса носителя. Трансфецирующая активность комплексов ДНК–носитель в опытах in vitro и ее оптимизация Анализ трансфецирующей активности комплексов ДНК–полимерный носитель с разными соотношениями компонентов проводили на культуре клеток HeLa (табл. 2 и 3). В 5 качестве контрольной плазмиды была использована ДНК-конструкция рСMV-nls-LacZ, содержащая маркерный ген бактериальной β-галактозидазы (LacZ) и сигнал ядерной транслокации (nls-nuclear localization signal). Было найдено, что эффективность трансфекции для комплексов ДНК с немодифицированным гиперразветвленным полилизином (HbpK) была низкой и составила только 0.11% при весовом соотношении 1 : 3 (табл. 2). Низкая эффективнсть трансфекции может быть связана с отсутствием у носителя собственной эндосомолитической активности. Действительно, отсутствие эндосомолитической активности носителя является одной из основных причин низкой трансфекционной активности полилизинов, приводя в результате к деградации ДНК в лизосомах [17]. Было предложено несколько вариантов повышения трансфекционной активности комплексов ДНК–носитель, из которых мы проверили три: 1 – проведение трансфекции в присутствии мембраноактивного агента глицерина, 2 – введение в структуру полилизинового носителя гистидина и 3 – встраивание в комплекс амфипатического лизосоморазрушающего пептида JTS-1. Проведение трансфекции в присутствии мембраноактивного агента глицерина позволило определить, обладает ли немодифицированный гиперразветвленный полилизин HbpK эндосомолитической активностью [18]. Оказалось, что добавление глицерина при проведении трансфекции комплексами ДНК–HbpK приводит к увеличению эффективности трансфекции в 5 раз с 0.11 до 0.52% при весовом соотношении ДНК/носитель, равном 1 : 3, и в 16 раз с 0.06 до 1.00%, при соотношении 1 : 5 (табл. 2), что дает возможность предположить, что этот носитель действительно не обладает эндосомолитической активностью и большая часть комплексов ДНК и гиперразветвленного полилизина при трансфекции без глицерина разрушалась лизосомальными ферментами. Следующий этап исследования включал изучение эффективности трансфекции комплексами ДНК с Hb-полилизинами, модифицированными гистидином, что должно было повысить эндосомолитические свойства носителя. Именно это обстоятельство послужило обоснованием синтеза вариантов гистидин- и аргининмодифицированных Hb-полилизинов HbpKH1, HbpKH2, HbpKR1 и HbpKR2, отличающихся друг от друга содержанием модифицирующей аминокислоты и, в случае HbpKH1 HbpKH2, – молекулярными весами преобладающего компонента. Как следует из данных табл. 2, для носителя HbpKH2 при весовом соотношении ДНК/носитель, равном 1 : 3, получено увеличение эффективности трансфекции в 12 раз по сравнению с носителем, не содержащим гистидина (HbpK), а при соотношении, равном 1 : 5, трансфекционная активность возрастала более чем в 20 раз. Полученные исследованиями в этой серии зарубежных экспериментов авторов, данные изучавших в целом линейные согласуются полимеры с лизина, 6 модифицированные по ε-аминогруппам гистидином. Ими было, в частности, показано, что увеличение доли гистидина в линейном полилизине приводило к возрастанию трансфекционных свойств носителя, но только до достижения определенного максимума, и дальнейший рост содержания гистидина приводил к снижению трансфекционной активности комплекса [19–21]. Причина, вероятно, состоит в том, что имидазольные группы гистидина протонируются при рН ниже 6.0, а при физиологических значениях рН среды он практически не заряжен и не способен образовывать комплексы с ДНК [2]. Рассмотрение полилизинов данных приводит к для выводу, аргининмодифицированных что присутствие гиперразветвленных аргинина мало влияет на трансфекционную активность; эффект наблюдается только в случае HbpKR2 и практически отсутствует для HbpKR1. Обращает на себя внимание тот факт, что аргинин, имеющий в своем составе гуанидиновую группу, кватернизован в широком интервале значений рН и, тем не менее, гиперразветвленный полилизин, модифицированный аргинином, не обеспечивает высокий уровень трансфекции по сравнению даже с немодифицированным полимером. По-видимому, образование комплексов носитель–ДНК не является единственной причиной, обеспечивающей высокий уровень трансфекции. Добавление глицерина в случае Hb-полилизинов, модифицированных гистидином, вновь приводит к заметному повышению трансфекционной активности комплексов ДНК–носитель, в то время как для полилизина, модифицированного аргинином, HbpKR2, в присутствии глицерина наблюдается только небольшое увеличение трансфекционной активности, а при большем содержании аргинина (полимер HbpKR1) глицерин практически не влиял на трансфекционную активность соответствующих комплексов и она оставалась на низком уровне. Следующий этап оптимизации трансфекционной активности комплексов носитель – ДНК состоял в использовании комплексов ДНК с гиперразветвленными полилизинами, в состав которых дополнительно был включен третий компонент – амфипатический нонадекапептид JTS-1 (H-Gly-Leu-Phe-Glu-Ala-Leu-Leu-Glu-Leu-Leu-Glu-Ser-Leu-Trp-GluLeu-Leu-Glu-Ala-OH), обогащенный глутаминовой кислотой и способный разрушать эндосомы и увеличивать трансфекцию комплексов ДНК с поликатионами [22]. Связано это с тем, что при понижененном по сравнению с цитоплазмой рН-уровне в лизосомах (pH 5.0) пептид JTS-1 покидает комплекс ДНК–носитель и начинает встраиваться в мембрану эндосомы, дестабилизируя ее. Ранее было показано, что при значениях рН в эндосоме >5.0 пептид JTS-1 не способен проявлять свои мембранотропные свойства [22, 23]. Таким образом, механизм эндосомолитического действия нонадекапептида JTS-1 отличается от механизма действия глицерина, который дестабилизирует мембраны эндосомы при нейтральных рН [18]. 7 Ранее мы успешно применяли пептид JTS-1 для оптимизации ДНК-трансфецирующих свойств лизиновых дендримеров [6]. Из данных табл. 3 следует, что введение в двойной комплекс ДНК−Hb-полилизин дополнительно нонадекапептида JTS-1 приводит к увеличению трансфекционной активности комплекса, имеющего в своем составе Hisсодержащий полимер (ДНК-HbpKH2, ДНК-HbpKH1), но не Arg-содержащий полилизин (ДНК-HbpKR2 и ДНК-HbpKR1). И вновь мы наблюдали отчетливое влияние на трансфецирующую активность комплексов носитель–ДНК количества модифицирующей полилизин аминокислоты. При меньшем соотношении лизин / гистидин (аргинин) положительное влияние было более отчетливым. Казалось интересным провести совместное использование двух агентов – глицерина и нонадекапептида JTS-1, каждый из которых в отдельности повышает трансфекцию в случае гистидинмодифицированных гиперразветвленных полилизинов. С этой целью были проведены опыты по трансфекции клеток HeLa комплексами, с весовым соотношением ДНК/носитель 1 : 3 с включением в состав сформированных комплексов амфипатического пептида JTS-1 (табл. 3). В сериях опытов проводили анализ эффективности трансфекции комплексами ДНК−носитель−JTS-1 в присутствии и в отсутствие глицерина (табл. 3). В качестве контроля в табл. 3 представлены также данные по трансфекции, полученные при использовании комплексов ДНК с коммерческим носителем на основе PAMAM-дендримера (коммерческое название Polyfect). Было показано, что трансфекционная активность комплексов ДНК–HbpKH2 составляла 1.29% (табл. 2). Включение в состав комплексов эндосомолитического пептида JTS-1 повышает активность трансфекции до 5.28% LacZположительных клеток. В то же время добавление в среду глицерина при трансфекции этими же комплексами (ДНК−HbpKH2−JTS-1) приводило к значительному снижению уровня трансфекционной активности носителя до 0.83% (табл. 3), что достоверно не отличалось от эффективности трансфекции комплексами ДНК−HbpKH2. Аналогично, при включении в состав комплексов ДНК−HbpKH1 пептида JTS-1 эффективность трансфекции возрастала с 0.69 до 2.57% клеток. Добавление глицерина в среду при трансфекции тройным комплексом (ДНК−HbpKH1−JTS-1), так же как в предыдущем случае, приводило к достоверному снижению эффективности трансфекции (табл. 3). Вероятно, глицерин препятствует закислению лизосом и тем самым отменяет проявление эндосомолитических свойств амфипатического анионного нонадекапептида JTS-1. Аналогичные результаты получены на комплексах, имеющих в своем составе гиперразветвленный полилизин, модифицированный аргинином. Использование тройного комплекса ДНК–HbpKR2–JTS-1 приводит к трехкратному повышению числа LacZположительных клеток по сравнению с соответствующим двойным комплексом без JTS-1 (с 0.33 до 1.06%). И снова добавление глицерина уменьшает трансфекционную активность 8 тройных комплексов, состоящих из ДНК, аргининсодержащего носителя и пептида JTS-1. (табл. 3). Заслуживает внимание также тот факт, что включение пептида JTS-1 в состав комплекса с носителем с большим содержанием аргинина ДНК–HbpKR1 снижало трансфекционную активность комплекса до уровня 0.01% (табл. 3), а добавление глицерина приводило к дополнительному снижению активности комплекса. Трансфекционная активность комплексов ДНК с коммерческим носителем на основе дендримера PAMAM (Polyfect) составила 5%, что сопоставимо с трансфекционной активностью комплекса ДНК–HbpK2–JTS-1 в отсутствие глицерина (табл. 3). Выводы Проведено сравнение ДНК-связывающей и трансфецирующей активности комплексов, содержащих в своем составе ДНК и гиперразветвленные полилизины, модифицированные гистидином или аргинином, и не модифицированным этими аминокислотами. Показано, что комплекс ДНК с полилизином, модифицированным гистидином, имеет более компактную структуру и более высокий уровень трансфекционной активности по сравнению с комплексами, в состав которых входит немодифицированный полимер или полимер, содержащий аргинин. Установлено, что активность комплексов ДНК с модифицированными полилизинами зависит преимущественно от количества модифицирующих аминокислотных остатков и в меньшей степени от молекулярного веса полимера. Показано, что добавление к комплексам ДНК−носитель амфипатического пептида JTS-1 приводит к повышению их трансфецирующей активности. Аналогично, добавление глицерина приводит, как правило, к повышению активности тех же комплексов. Эти данные говорят об отсутствии собственной эндосомолитической активности у немодифицированных гиперразветвленных полилизинов. Попытки одновременного использования нонадекапептида JTS-1 и глицерина, каждый из которых повышает уровень трансфекции комплексов, не приводят к соответствующему повышению трансфекции, а даже снижают ее, что связано, несомненно, с особенностями механизма действия отмеченных соединений – глицерина и нонадекапептида JTS-1. Экспериментальная часть Материалы и методы Реактивы. В работе использовали Nε-Cbz-L-лизин, Nα-трет-бутилоксикарбонил(NImбензилоксиметил)-L-гистидин мезитиленсульфо)аргинин (Boc-His(Bom)-OH), (Boc-Arg(Mts)-OH, Nα-трет-бутилоксикарбонил-(NG- трифосген, палладий на угле, трифторуксусную кислоту, трифторметансульфокислоту, тиоанизол, этандитиол (Fluka, Германия). Растворители, полученные из открытого акционерного общества “Вектон” (Санкт-Петербург), очищали и сушили перед использованием. 9 Оборудование. При очистке полимеров с помощью гель-хроматографии использовали колонки, заполненные BioGel P2 (BIORAD Laboratories, США), детекцию проводили на спектрометре 2138 Uvicоrd-S (Прага) при длине волны 230 нм. Aминокислотный анализ выполняли с помощью капиллярного электрофореза на приборе анализатор капиллярный ионный “Нанофор-01” производства Института аналитического приборостроения РАН (Санкт-Петербург, Россия). Синтез реагентов. N-Карбоксиангидрид Nε-бензилоксикарбониллизин (NCA) получали согласно методике [24] из Nε-Cbz-лизина и трифосгена. Синтез гиперразветвленного полилизина и гиперразветвленного полилизина, модифицированного гистидином, описан ранее [12, 14]. Получение пентафторфенилового эфира Boc-Arg(Mts)-OPfp проводили из Boc-Arg(Mts)-OH и пентафторфенола по аналогии с работой [14]. Гиперразветвленный полилизин, модифицированный аргинином при соотношени NCA/BocArg(Mts)-OPfp 10:1), HbpKR2 (5, табл. 1) К раствору 1.4 г NCA и 0.14 г Boc-Arg(Mts)-OPfp в 50 мл диоксана, помещенному в круглодонную трехгорлую колбу с магнитной мешалкой, прибавляли 0.14 г палладия на угле и 2 капли ледяной уксусной кислоты. Гидрирование проводили при пропускании равномерного тока водорода и перемешивании раствора при 40–45оС. Через 4 ч палладий на угле отфильтровывали, промывали 10 мл диоксана и раствор оставляли на 3 сут при 400С. Затем диоксан отгоняли в вакууме до объема раствора 5 мл и продукт высаживали в петролейный эфир. Выпавший полимер отфильтровывали и сушили в эксикаторе. Получили 0.640 г полимера, который был ипользован сразу для полного деблокирования и очистки. Снятие защитных групп с полимера. В круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали 0.640 г полимера, растворенного в 10 мл трифторуксусной кислоты. К раствору прибавляли при перемешивании 0.640 мл трифторметансульфокислоты и 0.640 мл тиоанизола. Смесь перемешивали 0.5 ч при 0оС и затем 1 ч при комнатной температуре. К раствору деблокированного полимера в трифторуксусной кислоте добавляли 100 мл сухого серного эфира. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали эфиром (3 x 20 мл) и сразу подвергали очистке с использованием гель-хроматографии низкого давления. Очистка полимера с использованием гель-хроматографии низкого давления. Полимер растворяли в 4 мл 6% CH3COOH и наносили на колонку (2.5 × 60 см), заполненную сефадексом G-10. В качестве подвижной фазы использовали 6% CH3COOH. Соответствующую фракцию лиофилизовали. Получили 0.04 г полимера HbpKR2 (5, табл. 1). Аналогично из 1.4 г NCA и 1.4 г Boc-Arg(Mts)-OPfp был получен полимер HbpKR1 (4, табл. 1). 10 Аминокислотный состав образцов гиперразветвленного модифицированных гистидином и аргинином, поли-L-лизина, определяли с помощью капиллярного электрофореза по аналогии с работой [14] после гидролиза образцов действием 6 М HCl в течение 24 ч в ампуле при 1100С и упаривания раствора на вакуумном испарителе. Биологическое тестирование носителей Генетическая конструкция. В работе была использована плазмидная ДНКконструкция pCMV-nls-lacZ, содержащая маркерный ген бактериальной β-галактозидазы, модифицированный сигналом ядерной транслокации, предоставленная Б. Шольте из университета г. Роттердама (Голландия) (Dr. B. Scholte, Erazmus University, Rotterdam, Netherlands). Клеточная линия. Эксперименты по трансфекции выполняли на клеточных культурах эпителиальной карциномы человека HeLa-линии (коллекция клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Культивирование осуществляли на среде DMEM (Биолот), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотики – пенициллин и стрептомицин в концентрации 100 ед./ мл каждый. Приготовление комплексов ДНК с носителями. Комплексы формировали при различных весовых соотношениях ДНК/носитель. К серии проб, содержащих 1 мкг плазмидной ДНК, растворенной в 20 мкл дистиллированной воды, добавляли растворы носителя в дистиллированной воде, соответствовавшие различным соотношениям ДНК/носитель в объеме 20 мкл. Полученную смесь интенсивно перемешивали в течение 20 с и оставляли на 30 мин при комнатной температуре для завершения процесса формирования комплексов. Для получения тройных комплексов ДНК–носитель–JTS-1 по истечении указанного времени добавляли эндосомолитический пептид JTS-1 и выдерживали еще 20 мин. Эффективность связывания плазмидной ДНК с носителем анализировали методом ретардации по уменьшению электрофоретической подвижности ДНК в 0.8% агарозном геле. Сборку комплексов ДНК-Polyfect проводили согласно рекомендациям производителя (Quiagen, ФРГ). Для этого к 0.3 мкг ДНК, растворенной в 20 мкл культуральной среды DMEM, добавляли 2.4 мкл раствора Polyfect. После 15 мин инкубации сформированные комплексы использовали для трансфекции. Анализ степени вытеснения бромистого этидия. Опыты проводили в 96-луночных планшетах с плоским дном (Sаrstedt, ФРГ). Конечный объем пробы составлял 100 мкл. До формирования комплексов в каждую лунку планшета вносили раствор BE до конечной концентрации 400 нг/мл. Затем в каждую лунку планшета добавляли дистиллированной воды (100 мкл) и рабочий раствор плазмидной ДНК из расчета 2 мкг на лунку. Последним в лунки 11 вносили раствор носителя. Смесь оставляли при комнатной температуре на 30 мин защищенными от света для окончательного формирования комплексов. Интенсивность флуоресценции измеряли на флуориметре Wallac 1420D при длине волны возбуждения 540 и излучения 590 нм. Время экспозиции составляло 5 с. Оценка эффективности трансфекции клеток HeLa. Для каждого носителя сравнивали эффективность трансфекции комплексов с pCMV-nls-lacZ, различающихся по соотношению плазмидная ДНК/носитель. Клетки культивировали в 24-луночных планшетах за 24 ч до трансфекции из расчета 50000 клеток на лунку, содержащую 1000 мкл культуральной смеси, состоящей из культуральной среды DMEM (Биолот, РФ), 10%-ной сыворотки эмбрионов коров (Биолот, РФ) и гентамицина 0.01 мкг/мл. Перед трансфекцией клетки несколько раз промывали средой DMEM и вносили 1000 мкл среды в лунку. В каждую лунку добавляли суспензию комплексов из расчета 2 мкг ДНК на каждую лунку культурального планшета (объем упаковки составлял 40 мкл на каждый мкг ДНК). При проведении трансфекции в присутствии глицерина до внесения суспензии комплексов ДНК–носитель в лунку вносили 1000 мкл среды DMEM, содержащей 15% глицерин и 1.5% спирт. Время трансфекции составляло 3 ч, после чего проводили замену среды трансфекции на культуральную смесь. Клетки инкубировали 48 ч при +370С в СО2инкубаторе, промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), состава 1.7 мM KH2PO4, 5.2 мM Na2HPO4, 150 мM NaCl; pH 7.5, фиксировали в 0.5% растворе глутарового альдегида в ФСБ, инкубировали в растворе детергента, состава 0.02% Nonidet P40, 2 мМ MgCl2 в 1хФСБ, затем инкубировали 16 ч в смеси 5-бром-4-хлор-3-индолил-D-галактопиранозида (X-gal, 2 мг/мл), 5 мМ К3Fe(CN)6, 5 мM K4Fe(CN)6, 2 мМ MgCl2, 0.02% Nonidet P40 в ФСБ, промывали ФСБ и анализировали на световом микроскопе Opton. Наличие β-галактозидазы в ядрах клеток определяли по специфическому синему окрашиванию. Критерием эффективности трансфекции было число клеток (в процентах), экспрессирующих ядерную β-галактозидазу. Статистические методы Результаты экспериментов представлены с отображением ± S.D. Достоверность различий между контролем и опытом, а также между опытами оценивали при помощи tкритерия Стьюдента (p < 0.05). Благодарности Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов № 04-03-33032 и 07-03-00290) и Фонда гражданских исследований и развития США (Civilian Research and Development Foundation) (код проекта Y3-B12-03). 12 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Wu G.Y., Wu C.H. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 4429–4432. 2. Midoux P., Monsigny M. // Bioconjug. Chem. 1999. V. 10. P. 406–411. 3. Newkome G.R., Moorefield C.N., Vogtle F. // Dendritic Molecules (Concepts, Synthesis, Perspectives). Wienheim–New York–Basel–Cambridge–Tokyo: VCH, 1996. 4. Ohsaki M., Okuda T., Wada A., Hirayama T., Niidome T., Aoyagi H. // Bioconjug. Chem. 2002. V. 13. P. 510–517. 5. Okuda T., Kidoaki S., Ohsaki M., Koyama Y., Yoshikawa K., Niidome T., Aoyagi H. // Biomol. Chem. 2003. V. 1. P. 1270–1273. 6. Vlasov G.P., Korolkov V.I., Pankova G.A., Tarasenko I.I., Baranov A.N., Glazkov P.V., Kiselev A.V., Ostapenko O.V., Lesina E.A., Baranov V.S. // Russ. J. of Bioorgan. Chemistry. 2004. V. 30. P. 12–20 (Власов Г.П., Корольков В.И., Панкова Г.А., Тарасенко И.И., Баранов А.Н., Глазков П.В., Киселев А.В., Остапенко О.В., Лесина Е.А., Баранов В.С. // Биоорган. химия. 2004. Т. 30. С. 15–24). 7. Okuda T., Sugiyama A., Niidome T., Aoyagi H. // Biomaterials. 2004. V. 25. P. 537–544. 8. Vlasov G.P., Lesina E.A., Korol’kov V.I., Gur’yanov I.A., Bayanova N.V., Baranov A.N., Kiselev A.V., Baranov V.S. // Russ. J. of Bioorgan. Chemistry. 2005. V. 31. P. 153–159 (Власов Г.П., Корольков В.И., Гурьянов И.А., Баянова Н. В., Баранов А.Н., Киселев А.В., Лесина Е.А., Баранов В.С. // Биоорган. химия. 2005. Т. 31. С. 167–174). 9. Власов Г.П., Павлов Г.М., Баянова Н.В. Корнеева Е.В., Эбель C., Ходорковский М.А., Артамонова Т.О. //Докл. АН. 2004. Т. 399. С. 366–368. 10. Rodriguez-Hernandes J., Gatti H., Klok H.-A. // Biomacromolecules. 2003. V. 4. P. 249–258. 11. Tsogas I., Theodossiu T., Sideratou Z., Paleos C., Collet H., Rossi J., Romestand B., Commeyras A. // Biomacromolecules. 2007. V. 8. P. 3263–3270. 12. Власов Г.П., Тарасенко И.И., Валуева С.В., Киппер А.И., Тарабукина Е.Б., Филиппов А.П., Скворцова Е.В., Воробьев В.И. // Высокомолек. соед. Сер. А. 2005. Т. 47. C. 731. 13. Vlasov G.P. // Russ. J. of Bioorgan. Chemistry. 2006. V. 32. P. 205–218 (Власов Г.П. // Биоорган. химия. 2006. Т. 32. С. 227–242). 14. Власов Г.П., Филиппов А.П., Тарасенко И.И., Тарабукина Е.Б., Панкова Г.А., Ильина И.Е., Шпырков А.А., Скворцова Е.В., Скворцов А.И., Воробьев В.И. // Высокомолек. соед. Сер. А. 2008. Т. 50. С. 589–598. 15. Gariepy J., Kawamura K. // Trends Biotechnol. 2001. V. 19. Р. 21–28. 16. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. NY.; Cold Spring Harbor Lab. Press, 1982. 17. Pouton C.W., Seymour L.W. // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2001. V. 46. P. 187–203. 18. Zauner W., Kichler A., Schmidt W., Mechtler K., Wagner E. // Exp. Cell Res. 1997. V. 232. P. 137–145. 19. Benns J.M., Choi J.S., Mahato R.I., Park J.S., Kim S.W. // Bioconjug. Chem. 2000. V. 11. P. 637–645. 20. Pichon C., Goncalves C., Midoux P. // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2001. V. 53. P. 75–94. 21. Chen Q.R., Zhang L., Stass S.A., Mixson A.J. // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 1334–1340. 22. Gottschalk S., Sparrow J.T., Hauer J., Mims M.P., Leland F.E., Woo S.L.C., Smith L.C. // Gene Therapy. 1996. V. 3. Р. 448–457. 23. Smith L.C., Duguid J., Wadhwa M.S., Logan M.J., Tung C., Edwards V.V., Sparrow J.T. // Adv. Drug. Deliv. Rev. 1998. V. 30. P. 115–131. 24. Daly W., Poche D. //Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. P. 5859–5862. 13 Таблица 1. Соотношение реагентов при синтезе гиперразветвленных полилизинов и их некоторые свойства Полимер Буквенное обозначение полимера* Mw x 10-3 NCA / Pfp-эфир, по загрузке по данным гельпроникающей хроматографии2* * Мольное отношение Lys/ His (Arg) в полимере4* Лит. источник - [12] 1 HbpK - 95 по данным молекулярной гидродинамики и оптики3* 195 2 HbpKH1 1:1 4.5 / 500 12 / 110 8/1 [14] 3 HbpKH2 10 : 1 500 / 7.5 30 / 600 118 / 1 [14] 4 HbpKR1 1:1 5 / 36 - 2/1 - 5 HbpKR2 10 : 1 4 / 90 6/1 HbpK = hyper branched polyK (K – лизин в однобуквенном коде); HbpKH = hyper branched polyK, модифицированный гистидином - (H – гистидин в однобуквенном коде); HbpКR = hyper branched polyK (R – аргинин в однобуквенном коде). 2* В числителе основной пик, в знаменателе минорный. 3* В числителе значение, найденное методом гидродинамики (WMS); в знаменателе методом светорассеяния (MW). 4* По данным капиллярного электрофореза. 14 Таблица 2. Трансфецирующие свойства двойных комплексов, состоящих из ДНК и Hb-полилизинов, в отсутствие и в присутствии глицерина (Gro) Полилизин (polyK)* Содержание LacZ+-клеток, % - Gro +Gro ДНК / polyK (по весу при загрузке) 1/0.8 0.09±0.055 0.05±0.035 1/3 0.11±0.008 0.52±0.090 1/5 0.06±0.003 1.00±0.441 1/1 1.25±0.105 1.90±0.461 1/3 0.42±0.069 1.10±0.282 1/5 0.27±0.012 0.50±0.192 1/0.8 0.14±0.004 0.31±0.022 1/3 1.29±0.183 0.83±0.414 1/5 1.39±0.120 2.54±0.584 1/1 0.11±0.010 0.23±0.062 1/3 0.06±0.021 0.05±0.018 1/5 0.03±0.013 0.02±0.010 1/1 0.10±0.015 0.27±0.090 1/3 0.15±0.007 0.58±0.154 1/5 0.19±0.043 0.39±0.091 HbpK HbpKH1 HbpKH2 HbpKR1 HbpKR2 *Обозначение см. в табл. 1. Таблица 3. Трансфецирующие свойства тройных комплексов, состоящих из ДНК, Hb-полилизинов и нонадекапептида JTS-1, в отсутствие и в присутствии глицерина при весовом соотношении плазмидной ДНК и носителя, равном 1/3 Содержание LacZ+-клеток, % для комплексов Полимер* ДНК−полимер ДНК−полимер−JTS-1 ДНК−полимер−JTS-1+Gro HbpKH1 0.69±0.160 2.57±0.370 0.20±0.306 HbpKH2 1.26±0.728 5.28±2.255 0.83±0.349 HbpKR1 0.05±0.025 0.07±0.008 0.01±0.008 HbpKR2 0.33 ± 0.043 1.06 ± 0.177 0.12±0.009 Polyfect 5.0 ± 0.9 - - *Обозначение см. в табл. 1. 15 Схема 16 1 (а) 2 3 4 5 2 3 4 5 6 7 1 1 6 7 1 2 2 3 3 (б) 1 2 3 4 1 2 3 4 (г) 4 5 6 4 5 6 7 7 (в) 5 5 6 7 1 6 7 1 2 3 2 3 4 5 4 5 6 7 6 7 (д) Рис.1. Определение методом ретардации эффективности связывания плазмидной ДНК с носителями: HbpK (а), HbpKH2 (б), HbpKH1 (в), HbpKR2 (г), HbpKR1 (д), полученных при разных весовых соотношениях ДНК/носитель: 1 : 0.2 (1); 1 : 0.4 (2); 1 : 0.6 (3); 1 : 0.8 (4); 1 : 1 (5); 1 : 3 (6); некомпактизованная плазмидная ДНК (7). 17 Рис.2. Изменение интенсивности флуоресценции бромистого этидия при увеличении весовых соотношений ДНК/носитель в комплексах ДНК c носителями HbpK (а), HbpKH2, HbpKH1 (б), HbpKR2, HbpKR1 (в). 18
