удк 577.21 протеомные исследования белок

УДК 577.21
ПРОТЕОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1
ЧЕЛОВЕКА
Тарлыков П.В.1 , Огрызько В.В.2
1
Евразийский Национальный Университет им. Л.Н.Гумилева, Астана, Казахстан.
2
Institut Gustave Roussy, Villejuif, France.
pavel.tarlykov@gmail.com
Научный руководитель – PhD, Раманкулов Е.М.
Апуриновая/апиримидиновая
эндонуклеаза
1
человека
(АРЕ1)
–
полифункциональный фермент, который помимо основной активности, расщепляющей
ДНК с 5'-конца сайта рестрикции, обладает другими более слабо выраженными
свойствами[1]. Среди них – 3'-5'-экзонуклеазная, которая проявляется более эффективно
на ДНК-дуплексах, содержащих на 3'-конце праймерной цепи модифицированные или
неправильно спаренные нуклеотиды. Существует предположение, что за счет своей
экзонуклеазной активности АРЕ1 может служить корректором синтеза ДНК,
катализируемого ДНК-полимеразой β, в ходе эксцизионной репарации оснований ДНК.
Так как белок APE1 выполняет важную функцию в репарации ДНК, он является
перспективной мишенью для предотвращения выживания раковых клеток после
химиотерапии. Рост данных свидетельствует о том, что несбалансированная репарация
ДНК может быть одним из факторов развития рака[2]. Также APE1 имеет окислительновосстановительные функции и способствует активации других ферментов, участвующих в
репарации ДНК. Таким образом, выключение APE1 может привести к чувствительности
опухолевых клеток, предотвращая выживание раковых клеток от химиотерапии [3].
В настоящей работе особенное внимание было уделено апуриновой/апиримидиновой
эндонуклеазе 1 с целью изучения новых механизмов репарации и эпигенетического
перепрограммирования человеческого генома, так как предполагается, что помимо уже
известной каталитической активности, APE1 играет важную роль в эпигенетических
процессах. Изучение взаимодействия между интересующим нас белком и его партнерами
является проверенным методом для выяснения функций белка. Анализ мультибелковых
комплексов, очищенных напрямую из клето к дает возможность получить наиболее
существенную информацию о белок-белковых взаимодействиях. С этой целью нами был
очищен белковый комплекс апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека и с
помощью масс-спектрометрии были определены индивидуальные компоненты этого
комплекса.
Первым шагом в данной работе являлось получение векторной конструкции,
экспрессирующей APE1. Далее проводилась котрансфекция клеток HEK293T с
полученными плазмидами. Затем клетки были собраны и подвергнуты процедуре
криодеструкции, что позволило максимально сохранить нативную структуру белокбелковых комплексов. Партнеры по белок-белковым взаимодействиям белка APE1 были
выделены с помощью ко-иммунопреципитации (Co-IP).Очищенные комплексы
анализировались посредством Gel-LC-MS/MS. В качестве отрицательного контроля та же
процедура была выполнена с клетками HEK293T экспрессирующими белок GFP. Затем
проводилась идентификация белков, и их отсутствие в контрольном образце
подтверждалось путем мониторинга множественных реакций (Multiple Reaction
Monitoring - MRM).
В итоге были идентифицированы несколько белков, которые могут быть
задействованы в процессе регулирования функций APE1 в клетках.В таблице 1
представлены партнеры белок-белковых взаимодействий APE1, причем жирным шрифтом
отмечены белки-компоненты SFPQ-NONO комплекса, участвующего в репарации ДНК.
Accession #
O75970
P05386
P06748
P07910
P09651
P09874
P10809
P10909
P22626
P23246
P23588
P29508
P31944
P38159
P53999
P67809
Q00839
Q08050
Q15233
Q86YZ3
Q8TDY2
Q8WXF1
Q9H583
Таблица
Mill score)
Названиебелка
MSscore
Multiple PDZ domain protein
20.11
60S acidic ribosomal protein P1
15.29
Nucleophosmin
64.96
Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2
148.12
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1
73.41
Poly [ADP-ribose] polymerase 1
73.93
60 kDa heat shock protein, mitochondrial
55.64
Clusterin
13.39
Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1
88.88
Splicing factor, proline- and glutamine-rich
221.92
Eukaryotic translation initiation factor 4B
161.16
Serpin B3
195.03
Caspase-14
109.73
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G
29.58
Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15
13.62
Nuclease-sensitive element-binding protein 1
21.54
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U
60.31
Forkhead box protein M1
25.96
Non-POU domain-containing octamer-binding protein
188.97
Hornerin
44.99
RB1- inducible coiled-coil protein 1
13.19
Paraspeckle component 1
43.01
HEATrepeat-containingprotein 1
35.31
1. Партнеры белок-белковых взаимодействий APE1 и их MSscore (Spectrum
Таким образом, в ходе работы были охарактеризованы белковые комплексы APE1
у контрольной и экспериментальной группы клеток с использованием протеомных
методов анализа. Компоненты данных комплексов идентифицированыс помощью масс
спектрометрии. Дальнейшей целью является проведение биоинформатического анализа
идентифицированных белков и партнеров их белок-белковых взаимодействий. Результаты
данной работы в перспективе могут пролить свет на новые клеточные функции этого
важного белка, а также иметь фундаментальное значение для понимания механизмов
репарации и эпигенетического перепрограммирования человеческого генома.
Список использованных источников:
1. Tell, G., Quadrifoglio, F., Tiribelli, C. & Kelley, M. R. (2009) The many functions of
APE1/Ref-1: not only a DNA repair enzyme, Antioxid Redox Signal. 11, 601-20.
2. Tell, G., Fantini, D. &Quadrifoglio, F. (2010) Understanding different functions of
mammalian AP endonuclease (APE1) as a promising tool for cancer treatment, Cellular and
Molecular Life Sciences. 67, 3589-3608.
3. Luo, M., Delaplane, S., Jiang, A., Reed, A., He, Y., Fishel, M., Nyland, R. L., II, Borch, R. F.,
Qiao, X., Georgiadis, M. M. & Kelley, M. R. (2008) Role of the multifunctional DNA repair
and redox signaling protein Ape1/Ref-1 in cancer and endothelial cells: Small- molecule
inhibition of the redox function of Ape1, Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1853-1867.