3. Шумаев К.Б., Губкин А.А., Космачевская О.В., Топунов А.Ф

1
УДК 547.915
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА С
ИНТЕРМЕДИАТАМИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
К.Б. Шумаев, А.А. Губкин*, О.В. Космачевская, А.Ф. Топунов,
А.Ф. Ванин**, Э.К. Рууге*
Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33
*Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава
РФ, 121552 Москва, 3-я Черепковская 15А,
**Институт химической физики РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина 4
Основной причиной окислительного стресса, возникающего при ишемии и
последующей реперфузии ткани миокарда, считается усиление генерации активных
форм кислорода и азота и изменение баланса прооксидантных и антиоксидантных
реакций в кардиомиоцитах [1-4]. В то же время супероксид (О2•-), пероксид водорода
(Н2О2) и оксид азота (NO) являются “сигнальными молекулами”, участвующими в
регуляции многих нормальных и патологических процессов в организме [4-7].
Известно,
что
прооксидантное
действие
О2•-
усиливается
благодаря
его
взаимодействию с ионами железа и NO [7-9]. Ионы «свободного» железа и их редоксактивные комплексы катализируют образование H2O2 и гидроксильного радикала
(ОН•) в ходе реакций Фентона и Хабера-Вайса:
Fe2+ + O2 → Fe3+ + О2•Fe2+ + О2•- + 2Н+ → Fe3+ + Н2О2
Fe2++ Н2О2 → Fe3+ + •OН.+ ОНВ ходе взаимодействия железопорфирина (гема) с Н2О2 образуется оксоферрилгем
являющийся столь же сильным окислителем как ОН• [10]:
порфирин-FeIII + H2O2 → •порфирин-FeIV=O + H2O
В реакции супероксида с NO образуется еще один сильный цитотоксический
окислитель – пероксинитрит:
NO + О2•– → ONOO–
2
В то же время в различных модельных системах установлено, что сам NO, Sнитрозотиолы, мононитрозильные и динитрозильные комплексы железа обладают
антиоксидантными свойствами [10-18]. Антиоксидантное действие оксида азота
связывают с взаимодействием между NO и липидными радикалами, а также с
восстановлением оксоферрилформы гемопротеидов [10-15, 19]. Высказана также
гипотеза, о том что NO, образуя динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ)
исключает последнее из редокс-цикла реакций свободнорадикального окисления [10].
В настоящее время считается, что ДНКЖ, включающие оксид азота в виде иона
нитрозония (NO+), могут быть ответственны за многие биологические функции NO
[20-22].
В
связи
с
этим
несомненный
интерес
представляет
взаимодействия динитрозильных комплексов железа с О2•-
и
исследование
редокс-активными
интермедиатами возникающими в реакциях гема с Н2О2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали восстановленный глутатион, гемин, ксантин,
ксантиноксидазу,
супероксиддисмутазу,
(диэтилентриаминопентауксусную
кислоту)
каталазу,
и
TIRON
HEPES,
ДТПА
(4,5-диоксибензол-1,3-
дисульфонат натрия) (Sigma, США), пробукол (отечественного производства) .
Динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с глутатионом или цистеином в
диамагнитной димерной форме получали, как описано ранее [19], смешивая
растворы FeSO4 с восстановленым глутатионом (GSH) или цистеином в молярном
соотношении 1:2 в сосуде Тунберга в атмосфере NO. ДНКЖ хранили при –200С.
Концентрацию ДНКЖ определяли методом спектроскопии ЭПР. Поскольку
использованная димерная форма ДНКЖ не обнаруживается методом ЭПР, ее
переводили в мономерную ЭПР-детектируемую форму. Для этого в реакционную
среду добавляли цистеин или GSH в молярном отношении к ДНКЖ 1:25, что
приводило к образованию парамагнитных мономерных ДНКЖ.
Выделение митохондрий из сердца крыс проводили, как описано в работе [23].
Для оценки генерации радикалов супероксида (О2•–) митохондриями использовали
спиновую ловушку TIRON (4,5-диоксибензол-1,3-дисульфонат натрия). Для генерации
О2•–
использовали
также
ферментативную
систему
ксантин-ксантиоксидаза.
3
Концентрация митохондрий в среде инкубации составляла 2 мг белка на мл. Белок
определяли модифицированным методом Лоури [3].
Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре E-109Е фирмы Varian (США),
при комнатной температуре (~25°C). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧ
мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТл для TIRON
и СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,4 мТл для ДНКЖ. Спектры
феноксильного радикала пробукола регистрировали при СВЧ мощности 50 мВт. В
экспериментах с генерацией О2•- образцы помещали в газопроницаемые тефлоновые
капилляры фирмы PTFE 22 (Zeus Industrial Products, Inc. США), а запись спектров
проводили при непрерывной продувке воздухом. В остальных случаях образцы
помешались в стеклянные капилляры.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В большом числе исследований показано, что основным источником О2•- и
других активных форм кислорода внутри клетки являются митохондрии [1, 3, 5, 23, 24],
причем генерация этих токсических интермедиатов усиливается в ишемизированных
органах и тканях. Известно, что генерация О2•- сильно возрастает в присутствии
антимицина A – ингибитора bc1 сегмента (комплекса III) митохондриальной
дыхательной цепи, блокирующего перенос электрона от цитохрома b566 на окисленный
коэнзим Q [3, 23, 24]. Действительно, деструкция ДНКЖ наблюдалась при их инкубации
с митохондриями из сердечной мышцы крыс в присутствии сукцината в качестве
субстрата и антимицина А (рис.1А, кривая 1). Именно в этих условиях с использованием
спиновой ловушки TIRON зафиксирована генерация О2•- (рис.1 Б, спектр 1). Еще одним
хорошо известным источником О2•- в организме человека и животных является
одноэлектронное восстановление кислорода в ходе ферментативного окисления ксантина
[25]. На рис. 2. представлены кинетики деструкции ДНКЖ при генерации О2•- в
системе ксантин-ксантиоксидаза. То, что в используемых системах генерации О2•супероксиддисмутаза и каталаза снижали скорость распада ДНКЖ является
убедительным доказательством участия в этом процессе супероксида и образующихся с
его участием H2O2 и ОН• (рис. 1А, кривая 2 и рис. 2, кривые 2 и 3). Заметное защитное
действие каталазы (рис.2, кривая 2), вероятно, связано с предотвращением образования
4
ОН•, возникающего в реакции между ионами Fe2+ и H2O2 (реакция Фентона). В наших
экспериментальных условиях H2O2 образуется при дисмутации О2•-, а ионы железа могут
высвобождаться в ходе деструкции ДНКЖ. Можно предположить, что сами ДНКЖ
также могут взаимодействовать с H2O2. Действительно смешивание H2O2 с ДНКЖ
приводит к драматическому снижению концентрации последних (рис. 3А). Тем не
менее в присутствии ДТПА добавление H2O2 к ДНКЖ не вызывает деструкции
последних (рис. 3Б). Так как, ДТПА образует с ионами свободного железа комплекс не
участвующий в реакциях Фентона и Хабера-Вайса, вероятнее всего, динитрозильные
комплексы железа прямо не реагируют с пероксидом водорода. В отсутствии ДТПА
зависимая от H2O2 деструкция ДНКЖ, по-видимому, катализируется примесным железом.
Наряду с ионами свободного железа и их низкомолекулярными комплексами,
важнейшую роль в развитии окислительного стресса в организме человека и животных
играют гемопротеиды. Миоглобин и гемоглобин, в отличие от каталазы и
гемсодержащих пероксидаз, стимулируют процессы перекисного окисления. В ряде
исследований показано, что при взаимодействии миоглобина и гемоглобина с H2O2 и
органическими гидропероксидами образуются оксоферрил- и перферрил формы гема
способные окислять как белковую часть этих гемопротеидов, так и другие
биомолекулы [10, 12, 14, 26]. В последней работе Кагана с соавторами установлено,
что в присутствии H2O2 цитохром с может специфически окислять кардиолипин [27].
В качестве аналога гемопротеидов, способного стимулировать свободнорадикальное
перекисное окисление липидов и вызывать образование радикальных форм фенольных
антиоксидантов, мы использовали гемин [28]. Антиоксидантное действие ДНКЖ
оценивали по ингибированию образования в системе гемин/H2O2 феноксильного
радикала пробукола. Последний является синтетическим антиоксидантом близким по
структуре и механизму действия к α-токоферолу. Из рис. 4 видно, что ДНКЖ как с
глутатионовыми так и с цистеиновыми лигандами, в молярных соотношениях сравнимых
с H2O2 и гемином, более чем на 70% ингибируют образование радикала пробукола.
Динитрозильные комплексы с фосфатными лигандами были несколько менее
эффективны (~50% ингибирования) (рис 4 г). Таким образом, как тиольные лиганды,
так и другие компоненты ДНКЖ (NO+, ионы железа), вносят вклад в снижение
концентрации радикала пробукола. Образование феноксильного радикала может
происходить при одноэлектронном окислении пробукола оксоферрилформой гемина или
5
гидроксильным радикалом (схема 1). Представляется вероятным, что эти активные
окислители, образующиеся при взаимодействии гемина с H2O2, перехватываются и
нейтрализуются ДНКЖ. Такой эффект ДНКЖ согласуется с полученными нами ранее
данными
о
восстановление
этими
комплексами
оксоферрилмиоглобина
до
метмиоглобина [19]. Нельзя исключить, что снижение концентрации радикала пробукола
связано с его восстановлением под действием ДНКЖ. Однако динитрозильные
комплексы железа с различными лигандами, практически не влияют на концентрацию
уже образовавшегося феноксильного радикала пробукола (данные не приведены).
Полученные
результаты
позволяют
утверждать,
что
хотя
ДНКЖ
взаимодействуют с О2•-, кинетика этой реакции, несомненно, отличается от
диффузноконтролируемой реакции NO с супероксидом. В то же время деструкция
ДНКЖ в условиях генерации О2•- митохондриальной дыхательной цепью и другими
ферментативными системами, может быть механизмом регуляции концентрации NO и
соответственно влиять на многочисленные биологические функции этого соединения.
Такой механизм регуляции действия NO более физиологичен, в сравнении с прямым
взаимодействием О2•- и оксида азота, так как при этом, по-видимому, не происходит
образования интермедиатов с прооксидантными свойствами. Одной из собственных
функций ДНКЖ может быть антиоксидантная, причем в случае с тиолсодержащими
динитрозильными комплексами железа возможен как минимум кумулятивный
антиоксидантный эффект различных компонентов этих комплексов. Ранее нами было
показано, что содержащие глутатион динитрозильные комплексы железа ингибируют
инициированное миоглобином и гидропероксидом трет-бутила окисление препарата
митохондрий из сердца крысы [18]. В то же время в условиях ишемии и последующей
реперфузии основную опасность представляют активные формы кислорода. Таким
образом, обнаруженное нами взаимодействие ДНКЖ с О2•- и ОН• и связанная с этим
способность предотвращать свободнорадикальное окисление других молекул может
играть решающую роль для выживании клетки в условиях окислительного стресса.
6
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lucas D.T. & Szweda L.I. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P.510-514.
2. Ma X.L., Gao F., Liu G.-L., Lopez B.L., Christopher T.A., Fukuto J.M., Wink D.A. &
Feelish M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.V. 96. P.14617-14622.
3. Ruuge E.K., Zabbarova I.V., Korkina O.V., Khatkevich A.N., Lakomkin V.L., Timoshin
A.A.. // Current Topics in Biophysics. 2002. V. 26 (1). P. 145-155.
4. Schulz R., Kelm M. & Heusch G. // Cardiovascular Research. 2004. V.61. V. 402-413.
5. Brookes P.S., Levonen A.-L., Shiva S., Sarti P. & Darley-Usmar V.M. // Free Rad. Biol.
Med. 2002. V.33. P. 755-764.
6. Droge W. // Physiol. Rev. 2003. V. 82. 47-95.
7. Leonard S.S., Harris G.K. & Shi X. Free Rad. Biol. Med. 2004. V. 37. P.1921-1942.
8. Koppenol W.N. // Redox. Rep. 2001. V. 6. P. 229-234.
9. Valdez L.B., Alvarez S., Arnaiz S.L., Schopfer., Carreras M.C., Poderoso J.J. & Boveris
A. // Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29. P. 349-356.
10. Yalowich J.C., Gorbunov N.V., Kozlov A.V., Allan V., Kagan V.E. // Biochemistry. 1999.
V.38. P. 10691-10698.
11. Rubbo H., Radi R., Trujillo M., Telleri R., Kalyanaraman B., Barnes S., Kirk M.,
Freeman B.A. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 26066-26075.
12. Kagan V.E. , Kozlov A.V., Tyurina Y.Y., Shvedova A.A., Yalowich J.C. // Antiox. &
Redox Signaling. 2001. V. 3. P.189-202.
13. Vanin A.F., Huisman A., Stroes E.S.G., de Ruijter-Heijstek F.C., Rabelink T.J., Faassen
E.E. // Free Rad. Biol. Med. 2001. V. 30. P. 813-824.
14. Herold, S., and Rehmann, F.-J. K. // Free Rad. Biol. Med. 2002. V. 34. P. 531-545.
15. Shafer F.Q., Wang P.H., Kelley E.E., Cueno K.L., Martin S.M. & Buetter G.R. //
J. Biol. Chem. 2002. V. 383. P.671-681.
16. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Ланкин В.З., Ванин А.Ф., Гомбоева С.Б. Беленков Ю.Н.//
Докл. РАН. 2001. Т. 379. С. 702-704.
17. Шумаев К.Б., Заббарова И.В., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. // Биофизика. 2003. Т. 48. С. 5-10.
18. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин А.А., Петрова Н.Э. Рууге Э.К., //
Биофизика. 2004. Т. 49. С. 659-665.
19. Шумаев К.Б, Петрова Н.Э., Заббарова И.В., Ванин А.Ф.,Топунов А.Ф., Ланкин В.З.,
Рууге Э.К. // Биохимия. 2004. Т.69. С. 699-705.
7
20. Vanin A.F., Stukan R.A. & Manukhina E.B. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1295.
P. 5-12.
21. Watts R.N., Richardson D.R. // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 3383-3392.
22. Ueno T., Suzuki Y., Fujii S., Vanin A.F. & Yoshimura T. // Biochem. Pharmacol. 2002. V.
63. P. 485-493.
23. Коркина О.В., Рууге Э.К. // Биофизика. 2000. Т.45. С. 695-699.
24. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (38).
P. 36027-36031.
25. Bulkley J.B.// Br.J.Surg. 1993. V. 80. P.684-686.
26. McLeod L.L., Alayach A.I. // Am. J. Physiol. 1999. V. 277 (1 Pt. 2). P. H92-H99.
27. Kagan V.E. , Tyurin V.A. Jiang J., Tyurina Y.Y., Ritov V.B., Amoscato A.A., Osipov A.N.,
Belikova N.A., Kapralov A.A., Kini V., Vlasova I.I., Zhao Q., Zou M., Di P., Svistunenko
D.A., Kurnikov I. V., Borisenko G.G. // Nature Chemical Biology . 2005. V. 1. P. 223-232.
28. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Дмитровский А.А., Быховский В.Я., Кухарчук В.В. //
Биохимияю 1997. Т.62. С.769-773.
8
ПОДПИСИ К РИСУНКАМ
Рис. 1. Деструкция динитрозильных комплексов с глутатионовыми лигандами
при генерации супероксида митохондриями из сердца крысы. Инкубационная среда
содержала: 250 мM сахарозы, 20 мM HEPES (рН 7,4), 4 мM KH2PO4 и митохондрии (2
мг белка на мл). А – инкубационной среда + 0,2 мМ ДНКЖ + 1 мкг/мл антимицина А и
5 мМ сукцината (1); то же что и 1 + СОД (150 ед/мл) и каталаза (400 ед/мл) (2). Б –
Спектры ЭПР TIRON после 10 мин инкубации с митохондриями в присутствии
антимицина А и сукцината (1) ; 10 мин инкубации с митохондриями без добавок (2).
Концентрация TIRON составляла 10 мМ.
Рис.2. Кинетики деструкции ДНКЖ в ходе ферментативной генерации супероксида
Состав реакционной среды: 1- 0,1 М K,Na-фосфатного буфера, (pH 7.4), 0,25 мМ
ДНКЖ, ксантиноксидаза (0,2 ед/мл), 1 мМ ксантина; 2- то же что 1 + каталаза (600
ед./мл); 3- 1 + каталаза (600 ед./мл) и супероксиддисмутаза (150 ед./мл).
Рис.3. Деструкция динитрозилных комплексов с глутатионовыми лигандами под
действием пероксида водорода. А- спектр ЭПР 0,2 мМ ДНКЖ в 0,2 М HEPES-буфере
(рН 7,4) (1), то же через 8 мин (2) и 16 мин (3) после добавления 0,4 мМ Н2О2. Б –
спектр ЭПР ДНКЖ в реакционной среде содержавшей 0,5 мМ ДТПА (1), то же через
16 мин после добавления 0,4 мМ Н2О2 (2).
Рис. 4. Влияние динитрозильных комплексов с различными лигандами на образование
радикала пробукола. Реакционная смесь содержала: изопропанол/K,Na-фосфатный
буфер, 1,5 мМ пробукола и 0,25 мМ гемина. Спектр ЭПР феноксильного радикала
пробукола образовавшегося после добавления в реакционную среду 2 мМ Н2О2 (а); то
же что и а + 0,5 мМ ДНКЖ содержащих цистеин (б); то же что и а + 0,5 мМ ДНКЖ
содержащих глутатион (в), то же что и а + 0,5 мМ ДНКЖ с фосфат-анионом в качестве
лиганда (г).
Схема 1. Предполагаемый механизм ингибирования образования феноксильного
радикала пробукола под действием ДНКЖ.
9
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА С
ИНТЕРМЕДИАТАМИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
К.Б. Шумаев, А.А. Губкин*, О.В. Космачевская, А.Ф. Топунов,
А.Ф. Ванин**, Э.К. Рууге*
Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33
*Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава
РФ, 121552 Москва, 3-я Черепковская 15А,
**Институт химической физики РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина 4
Исследовано взаимодействие тиол-содержащих динитрозильных комплексов
железа (ДНКЖ) с супероксидным радикалом в условиях генерации последнего
митохондриями и в системе ксанти-ксантиноксидаза. Показано, что в деструкции ДНКЖ
в этих условиях участвует как супероксидный так и гидроксильный радикал. В то же
время, железо в составе ДНКЖ, по-видимому, не катализирует декомпозицию пероксида
водорода с образованием гидроксильного радикала.
Обнаружено, что ДНКЖ с
различными лигандами эффективно ингибируют образование феноксильного радикала
пробукола в системе гемин/H2O2. При этом в антиоксидантном действие ДНКЖ
участвуют различные компоненты этих комплексов.
Ключевые
слова:
нитрозильные
комплексы
железа,
супероксид, гидроксильный радикал, митохондрии, оксоферрилгем.
оксид
азота,
10
1000
Б
А
Сигнал ЭПР, отн. ед.
800
1
2
600
400
2
1
200
0
0
4
8
12
Время, мин
16
326,0
326,2
326,4
326,6
326,8
327,0
Магнитное поле, мТл
Рис. 1. Деструкция динитрозильных комплексов с глутатионовыми лигандами при
генерации супероксида митохондриями из сердца крысы.
Инкубационная среда
содержала: 250 мM сахарозы, 20 мM HEPES (рН 7,4), 4 мM KH2PO4 и митохондрии (2
мг белка на мл). А – инкубационной среда + 0,2 мМ ДНКЖ + 1 мкг/мл антимицина А и
5 мМ сукцината (1); то же что и 1 + СОД (150 ед/мл) и каталаза (400 ед/мл) (2). Б –
Спектры ЭПР TIRON после 10 мин инкубации с митохондриями в присутствии
антимицина А и сукцината (1) ; 10 мин инкубации с митохондриями без добавок (2).
Концентрация TIRON составляла 10 мМ.
11
Сигнал ЭПР ДНКЖ, отн.ед.
1000
800
3
600
2
400
200
1
0
0
4
8
12
Время, мин
Рис.2. Кинетики деструкции ДНКЖ в ходе ферментативной генерации супероксида
Состав реакционной среды: 1- 0,1 М K,Na-фосфатного буфера, (pH 7.4), 0,25 мМ
ДНКЖ, ксантиноксидаза (0,2 ед/мл), 1 мМ ксантина; 2- то же что 1 + каталаза (600
ед./мл); 3- 1 + каталаза (600 ед./мл) и супероксиддисмутаза (150 ед./мл).
12
Б
А
g=2,034
1
1
2
2
3
317
322
327
316
320
324
328
Магнитное поле, мТл
Рис.3. Деструкция динитрозилных комплексов с глутатионовыми лигандами под
действием пероксида водорода. А- спектр ЭПР 0,2 мМ ДНКЖ в 0,2 М HEPES-буфере
(рН 7,4) (1), то же через 8 мин (2) и 16 мин (3) после добавления 0,4 мМ Н2О2. Б –
спектр ЭПР ДНКЖ в реакционной среде содержавшей 0,5 мМ ДТПА (1), то же через
16 мин после добавления 0,4 мМ Н2О2 (2).
13
g=2,003
а
б
в
г
324
325
326
327
328
329
Магнитное
поле,с мТл
Рис. 4. Влияние динитрозильных
комплексов
различными лигандами на образование
радикала пробукола. Реакционная смесь содержала: изопропанол/K,Na-фосфатный
буфер, 1,5 мМ пробукола и 0,25 мМ гемина. Спектр ЭПР феноксильного радикала
пробукола образовавшегося после добавления в реакционную среду 2 мМ Н2О2 (а); то
же что и а + 0,5 мМ ДНКЖ содержащих цистеин (б); то же что и а + 0,5 мМ ДНКЖ
содержащих глутатион (в), то же что и а + 0,5 мМ ДНКЖ с фосфат-анионом в качестве
лиганда (г).
14
(CH3)3
Пробукол
(CH3)3
CH3
HO
S
OH
S
CH3
(CH3)3
.
OH ,
IV
Fe =
(CH3)3
ДНКЖ
,
(CH3)3
(CH3)3
CH3
HO
(CH3)3
S
S
CH3
O
(CH3)3
Радикал пробукола
Схема 1. Предполагаемый механизм ингибирования образования феноксильного
радикала пробукола под действием ДНКЖ.