Глава 1. Обзор литературы 1.1. Сериновые протеазы. Механизм
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ЦЕНТР ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИИ РАН ______________________________________________________________________ На правах рукописи КОРНЕЕВА Вера Анатольевна Инактивация фактора свертывания крови XIIA ингибитором трипсина из кукурузы Специальность 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор М.А. Пантелеев Москва, 2015 2 Оглавление ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................. 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 8 1.1. Сериновые протеазы. Механизм действия сериновых протеаз ....................... 8 1.2. Контактный путь активации свертывания ...................................................... 11 1.2.1. Активация фактора XII ................................................................................. 11 1.2.2. Физиологическая роль фXII ......................................................................... 14 1.2.3. Роль контактной активации в патологии ..................................................... 17 1.3. Ингибиторы контактной активации ................................................................ 18 1.3.1. Плазменные ингибиторы фXIIa .................................................................... 18 1.3.2. Белковые ингибиторы фXIIa неплазменного происхождения.................... 20 1.3.3. Стандартный механизм ингибирования сериновых протеаз ...................... 22 1.4. Ингибитор трипсина из кукурузы ................................................................... 26 ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ....................................................................................... 28 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................ 30 2.1. Используемые реактивы ............................................................................... 30 2.2. Подбор праймеров, полимеразная цепная реакция и сайт-направленный мутагенез .............................................................................................................. 34 2.3. Трансформация клеток штамма-продуцента плазмидными конструкциями ............................................................................................................................... 35 2.4. Экспрессия и детекция рекомбинантных ингибиторов .............................. 36 2.5. Очистка рекомбинантных ингибиторов ....................................................... 37 2.6. Измерение ингибирующей активности ........................................................ 38 2.7. Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга ............................................................................................. 40 2.8. Молекулярная динамика ............................................................................... 41 2.9. Подготовка модельной структуры фактора XIIa на основе гомологии ..... 42 3 2.10. Белок-белковый докинг .............................................................................. 43 2.11. Статистический анализ ............................................................................... 44 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ....................................................................................... 45 3.1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного CHFI................... 45 3.2. Измерение ингибирующей активности ........................................................ 51 3.3. Моделирование взаимодействия протеаза-связывающей петли CHFI с ингибируемыми протеазами ................................................................................ 56 3.3.1. Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга ............................................................................................. 56 3.3.2. Моделирование структуры фXIIa. Докинг ............................................... 59 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ..................................................................................... 67 ВЫВОДЫ .................................................................................................................. 73 Благодарности ...................................................................................................... 74 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 75 4 Введение Сериновые протеазы широко распространены в природе и составляют около трети всех известных протеолитических ферментов. К ним относят как эндо-, так и экзопептидазы, принадлежащие к различным семействам белков. Эти ферменты участвуют в различных процессах, таких как пищеварение, оплодотворения, активации комплемента, апоптоз, иммунный ответ и т.д. [1]. Плазменное звено свертывания крови также находится под управлением каскада сериновых протеаз, активирующих друг друга путем протеолитического расщепления. Плазменное свертывание может активироваться по двум путям: внешнему или пути тканевого фактора и внутреннему или контактному пути. Внешний путь активируется в результате попадания трансмембранного белка – тканевого фактора в кровоток в месте повреждения сосуда. Такая активация является физиологической и обеспечивает остановку кровотечений. Активация плазменного свертывания по контактному пути начинается с автоактивации фактора XII (фXII) при взаимодействии с отрицательнозаряженными поверхностями: in vivo - при контакте поверхностью активированного тромбоцита или бактериальной клетки [2–4], внеклеточными нуклеиновыми кислотами и т.д., ex vivo - от контакта со стентами, катетерами и элементами сердечно-легочного шунтирования и in vitro - при заборе крови в результате контакта со стенками пластиковых и стеклянных пробирок [5,6]. Участие фXII в поддержании гемостаза на сегодняшний день не вполне ясно, а его вклад в патологическое тромбообразование был показан экспериментально на животных моделях FeCl3-индуцированного тромбоза [7], коллаген-индуцированной тромбоэмболии легочной артерии, лигирования аорты [7,8] и острого ишемического инсульта [9]. Таким образом, активный фактор XII (фXIIa) представляет собой многообещающую мишень для создания новых антитромботических препаратов, т.к. подавление работы данного фактора не сказывается на поддержании 5 гемостаза, но позволяет предотвратить патологическое тромбообразование при гиперкоагуляционных состояниях. Следовательно, исследование механизмов ингибирования фактора XIIa и особенностей взаимодействия данной протеазы с лучшими из существующими ингибиторов – очевидный и необходимый шаг на пути создания новых антитромботических препаратов. Ингибитора трипсина из кукурузы (corn trypsin/factor XIIa inhibitor, CHFI) – канонический ингибитор сериновых протеаз, широко применяемый для подавления контактной активации свертывания. В данной работе будет исследована роль протеаза-связывающей петли данного ингибитора в специфическом взаимодействии с активированным фактором свертывания XII. Целью данной работы было выявление роли протеазы-связывающей петли CHFI и его непетельных участков во взаимодействии с фXIIa. В задачи исследования входило 1. получить рекомбинантный CHFI и серию его укороченных мутантов; разработать протокол экспрессии CHFI и его мутантов в E. coli в растворимой форме для последующей однофазной очистки; 2. измерить константы ингибирования полученных мутантов по отношению к фXIIa; 3. построить модельную структуру фXIIa на основе гомологии; 4. на основе известной рентгеновской структуры CHFI построить модельные структуры мутантов CHFI методом молекулярной динамики; 5. провести моделирование взаимодействия CHFI и его мутантов с трипсином, фXIIa и фXIa методом докинга. Научная новизна. В работе обнаружено, что изолированная протеазасвязывающая петля CHFI (синтетический пептид, С- и N-концы которого соединены дисульфидной связью) не может подавлять активность фактора XIIa, 6 сохраняя при этом способность ингибировать фактор XIa и трипсин. Таким образом, было показано, что изолированная протеаза-связывающая петля CHFI способна действовать как независимый структурный элемент и подавлять активность некоторых протеаз (фактор XIa и трипсин). В работе было также показано, что минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фXIIa, содержит аминокислотные остатки 12-108 (код 1BEA в базе данных PDB). Полученные результаты позволили сделать предположения о механизме ингибирования фактора XIIa CHFI: ингибирование происходит по стандартному механизму [10], но с обязательным участием некоторых участков CHFI вне протеаза-связывающей петли. Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание взаимодействия ингибиторов сериновых протеаз с подавляемыми ферментами и механизма ингибирования фактора XIIa ингибитором трипсина из кукурузы (CHFI) в частности. Разработанный в ходе данной работы протокол получения рекомбинантного CHFI (глобулярный белок, массой 14 кДа, содержащий 5 дисульфидных связей) в растворимой форме в культуре Escherichia coli. также имеет научно-практическое значение. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых ингибиторов фXIIa и других сериновых протеаз. 7 Положения, выносимые на защиту: 1. Минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в отношении фXIIa, содержит аминокислотные остатки 12-108 (1BEA, PDB). 2. Протеаза-связывающая петля CHFI принимает участие во взаимодействии с фXIIa, но не полностью определяет ингибирующую активность в отношении этого фактора свертывания. 3. Изолированная протеаза-связывающая петля CHFI действует как независимый структурный элемент и ингибирует некоторые сериновые протеазы - трипсин и фXIa. 4. Разработанный нами протокол экспрессии CHFI и его мутантов в E.coli впервые позволяет получать функционально активной форме. данный рекомбинантный ингибитор в 8 Глава 1. Обзор литературы 1.1. Сериновые протеазы. Механизм действия сериновых протеаз Сериновые протеазы - одна из наиболее распространенных групп протеолитических ферментов. Название "сериновые» данное семейство протеаз получило вследствие того, что аминокислотный остаток серина входит в состав активного центра данных протеаз и принимает непосредственное участие в расщеплении субстрата. Сериновые протеазы обнаружены у представителей всех царств живых организмов. Данные ферменты могут выполнять множество различных функций, как в эу-, так и прокариотах, участвуют в процессах метаболизма, клеточной сигнализации и т.д [1]. Каскад сериновых протеаз, активирующих друг друга путем протеолитического расщепления контролирует свертывание крови и систему комплемента. Сериновые протеазы расщепляют субстрат специфически: по определенным аминокислотам. Активный сайт сериновой протезазы имеет форму щели, в которую заходит субстрат. Согласно [11] аминокислотные остатки в активном сайте протеазы, с которыми связывается субстрат, обозначают (Si,..., S3, S2, S1, S1', S2', S3',..., Sj). Аминокислотные остатки субстрата обозначаются (P i, ..., P3, P2, P1, P1', P2', P3', ..., Pj); нумерация производится в направлении от N- к С-концу субстрата (рис. 1). Расщепляемая связь в субстрате находится между P 1 и P1'. Типичная каталитическая триада сериновой протеазы формируется боковыми цепями серина, гистидина и аспартата. 9 Рисунок 1. Схема связывания субстрата с сериновой протеазой. Протеаза показана светло коричневым цветом, а аминокислотные остатки субстрата – оливковым, по [12] с незначительными изменениями. Механизм действия сериновых протеаз представляет собой ковалентный катализ, где ковалентная связь формируется между субстратом и аминокислотным остатком серина каталитической триады протеазы. Протеолиз проходит в два этапа (рис. 2). Рисунок 2. Механизм действия сериновых протеаз. Протеолиз осуществляется в два этапа. Воспроизведено из [13]. На первом этапе реакции каталитический остаток серина производит нуклеофильную атаку карбонильного атома углерода P1-аминокислотного остатка 10 субстрата. Происходит образование промежуточного продукта – ацил-фермента и формируется новый N-конец субстрата на Р1 '-аминокислотном остатке субстрата. На втором этапе реакции молекула воды проводит вторую нуклеофильную атаку: происходит гидролиз ацил-фермента. Каталитический серин приходит в первоначальное состояние (происходит регенерация свободной сериновой протеазы, а на P1-аминокислотном остатке субстрата формируется новый С-конец [11]. Каталитические аспартат и гистидин так же участвуют в процессе протеолиза [14]. Под действием гистидина из молекулы воды формируется гидроксид-анион, который проводит вторую нуклеофильную атаку, а также гистидин выступает в роли кислоты переносящей протон на отделяющуюся группу на обоих этапах реакции. Предполагают, что боковая цепь аспартата стабилизирует протеонированный остаток гистидина, однако детали данного взаимодействия все еще не вполне ясны [15,16]. 11 1.2. Контактный путь активации свертывания 1.2.1. Активация фактора XII Активация плазменного свертывания по контактному пути начинается с автоактивации фактора XII (фXII) при взаимодействии с отрицательнозаряженными поверхностями. Это может иметь место, как in vitro - при заборе крови в результате контакта со стенками пластиковых и стеклянных пробирок, так и ex vivo - от контакта со стентами, катетерами и элементами сердечнолегочного шунтирования [5,6], а также in vivo при контакте поверхностью активированного тромбоцита или бактериальной клетки, глюкозоаминогликанами, коллагеном, внеклеточными нуклеиновыми кислотами, полифосфатами и т.д [2–4]. ФXII также может быть активирован высокомолекулярным кининогеном (HMWK) [17], [18]. Положительно заряженный гистидин-богатый домен HMWK в присутствии ионов цинка опосредует связывание комплекса HMWK-фXII с поверхностью [19,20]. Плазменная концентрация неактивного фXII составляет около 0,3 мкМ. В неактивной форме фXII представляет собой одноцепочечный пептид массой 80 кДа. ФXII состоит из нескольких доменов (рис. 3). Домен, обеспечивающий связывание с отрицательно заряженной поверхностью, а также регуляторные домены расположены на N-конце фактора (52 кДа), а каталитический домен (28 кДа) – на С-конце. 12 Рисунок 3. Доменная структура фXIIа. Схема доменной структуры фXIIа построена исходя из гомологии аминокослотной последовательности с эпидермальным фактором роста (EGF): эпидермальный фактор роста; тип I и тип II домены, гомологичные доменам фибронектина; крингл-домен, аналогичный подобному домену фибронектина. Расщепление фXII в результате активации калликреином или автоактивации переводит его в протеолитически активную форму, для которой фXI и прекалликреин являются субстратами. С NH2-концом фXII могут связываться как эндогенные, так и экзогенные отрицательно заряженные вещества (поверхности). Независимо от способа активации переход неактивного фактора XII в активный (активированный фактор XII – фXIIa) осуществляется посредством гидролиза пептидной связи между аминокислотными остатками Арг 353 и Вал 354. В результате чего белок разделяется на тяжелую и легкую цепи длиной 353 и 243 аминокислотных остатка, соответственно. Тяжелая и легкая цепи остаются связанными посредством дисульфидной связи между цистеинами 359 и 486 [21]. Так происходит образование альфа-фXIIa, который, в свою очередь, связывается с отрицательно заряженной поверхностью и активирует фактор XI (фXI), а также переводит прекалликреин в калликреин (активная форма). Образовавшийся калликреин активирует фXII c получением альфа-формы, а также переводит альфа- фXII в бета-форму (28 кДа каталитический домен) путем 13 протеолитического расщепления. Бета-фXIIа не способен активировать фактор XI (следующий фактор в каскаде ферментативных реакций плазменного свертывания), но сохраняет способность активировать калликреин [18]. Увеличение концентрации активных фXII и калликреина происходит экспоненциально и сдерживается плазменными ингибиторами, такими как С-1 ингибитор [22,23]. 14 1.2.2. Физиологическая роль фXII Образовавшийся в результате активности альфа-фXIIa активный фактор XI (фXIa) опосредует активацию следующих протеаз в каскаде плазменного свертывания (фактор IX, фактор X и тромбин [24,25]), начиная с фактора IX (фIX) (рис. 4). Тромбин расщепляет растворимый плазменный белок фибриноген с образованием фибрина и переводит в активную форму фактор XIII (фXIII). Фибрин полимеризуется с образованием длинных белковых нитей - фибрилл, которые ковалентными сшивками соединяются в сеть активным фXIII. Благодаря формированию пространственной сети фибриновых фибрилл и образуется гелеобразный сгусток [26]. Тем не менее, при повреждении кровеносного сосуда, т.е. в «физиологических» условиях, активация плазменного свертывания происходит по пути тканевого фактора (ТФ) (рис. 4, справа). ТФ или тромбопластин – это трансмембранный гликопротеин, который присутствует на поверхности всех клеток, за исключением клеток крови и эндотелиальных клеток. Таким образом, при повреждении сосуда кровь приходит в контакт с ТФ. Образуется комплекс внешней теназы - ТФ-активный фактор VII (фактор VII (фVII) автоактивируется при взаимодействии с ТФ), который далее активирует факторы IX и X, в результате чего в месте повреждения сосуда формируется фибриновый сгусток [27,28]. 15 Рисунок 4. Схема каскада плазменного свертывания. Слева путь контактной активации (желтые стрелки), справа – путь тканевого фактора (оливковые стрелки), общая часть каскада (зеленые стрелки) по [29] с небольшими изменениями. Связь между двумя путями запуска плазменного свертывания (контактным путем и путем тканевого фактора) осуществляется через способность альфа- и бета-формы фXIIа активировать фVII [30,31]. При физиологических температурах (около 37 °С) такая активация предотвращается плазменным С1-ингибитором (C1INH), который теряет активность вблизи 0 °С. Это объясняет эффект «холодовой» активации свертывания при пониженных температурах. 16 Еще одна физиологическая роль фXIIa заключается в его влиянии на плотность сгустка. Альфа-фXIIa может изменять структуру фибринового сгустка, связываясь с фибрином своей тяжелой цепью, что приводит к образованию более плотного сгустка, защищенного от фибринолиза [32]. Кроме того, фXIIa опосредованно принимает участие в фибринолизе – процессе деградации фибринового сгустка. Обе (альфа и бета) формы активного фXII способны активировать плазминоген с образованием плазмина – ключевого фермента системы фибринолиза. Плазминоген протеолитически расщепляет фибриновые нити сгустка, что приводит его к деградации [33]. ФXII также вовлечен в ангиогенез – процесс образования новых сосудов. Nконцевой домен фXII и альфа-фXIIа может связываться с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), что приводит к его активации и, как следствие, к стимуляции роста эндотелиальных клеток [20]. Вклад контактной активации в поддержании плазменного гемостаза до сих пор не вполне ясен. Дефицит фXII впервые был обнаружен Ратноффом и Колопи в 1955 г в крови Джона Хагемана (в честь которого фXII также называют фактором Хагемана), которая не сворачивалась в стеклянной пробирке [34]. Однако, дефицит фXII не оказывает заметного влияния на гемостаз, а пациенты и экспериментальные животные с дефицитом фXII не страдают от кровотечений [7,35]. 17 1.2.3. Роль контактной активации в патологии Если участие фXII в поддержании гемостаза на сегодняшний день не вполне ясна, то его участие в патологическом тромбообразовании было показано экспериментально на животных моделях FeCl3-индуцированного тромбоза [7], коллаген-индуцированной тромбоэмболии легочной артерии, лигирования аорты [7,8] и острого ишемического инсульта [9]. Мыши с дефицитом фXII (нок-аут по соответствующему гену или животные дикого типа после введения ингибитора фXII) по результатам ногтевого и хвостового кровотечения не отличались от контрольных животных дикого типа, что говорит об отсутствии нарушений гемостаза. В то же время в экспериментах с индуцированным тромбозом мыши, дефицитные по фXII, были частично защищены от развития тромбоза: размер тромба, объем ткани, поврежденной вследствие тромбоза, и смертность были значительно ниже, чем у животных контрольной группы. Повышение концентрации фXII в плазме экспериментальных животных до типичных значений приводило к развитию обширного тромбоза [7]. Выше описанные эксперименты позволяют говорить об участии фXII в патологическом формировании тромбов при гиперкоагуляционных состояниях системы гемостаза [4]. 18 1.3. Ингибиторы контактной активации 1.3.1. Плазменные ингибиторы фXIIa Контактная активация свертывания в кровеносном русле блокируется рядом ингибиторов. К ним относятся С1-ингибитор (C1INH) [23,36], антитромбин (AT), α2-антитромбин, α2-макроглобулин [37] и гистидин-богатый гликопротеин [38,39]. Антитромбин и C1-ингибитор представляют собой серпины, относящиеся к семейству I04.001 α-1- ингибиторов протеаз [40]. Ингибирование сериновых протеаз серпинами необратимо и происходит с изменением конформации как ингибитора, так и протеазы. N-концевая петля ингибитора заходит в активный сайт протеазы. Далее происходит протеолитический гидролиз пептидной связи в петле ингибитора, что вызывает резкое изменение конформации ингибитора. Такое конформационное изменение приводит к изменению структуры активного центра протеазы, как следствие, гидролиз ацил-фермента не происходит, а ингибитор с протеазой остаются ковалентно связанными [41]. В отличие от C1INH антитромбину для ингибирования фXIIa требуется присутствие кофактора – гепарина [22]. Гепарин - отрицательно заряженный сульфатированный глюкозаминогликан, имеющий специфические АТ-связывающие сайты [42]. Несвязанный с антитромбином гепарин напротив – провоцирует автоактивацию фXII [43]. В экспериментах было показано, C1INH подавляет активность фXIIa при т.н. поверхностной активации каолином или стеклом [44]. Если фXII связывается с поверхностью активированных тромбоцитов (что также вызывает его автоактивацию) или клетками эндотелия, это защищает фXII от ингибирования С1-ингибитором, но не антитромбином [45]. Гистидин-богатый гликопротеин (HRG), подавляя контактную активацию, действует, предположительно, по другому механизму. Полагают [20,46], что HRG ингибирует альфа-фXIIа через связывание с экзосайтом на его поверхности. Т.к., с одной стороны, связывание гистидин богатого гликопротеина с фXIIа в 19 присутствии ионов Zn2+ улучшается на 3 порядка, а с другой стороны, HRG не проявляет ингибирующей активности в отношении фXIIа при отсутствии гепарина [39], данное взаимодействие, вероятно, как и в случае гепаран-сульфата, происходит через N-концевой цистатин-домен [20,46]. Это подавляет активность альфа-фXIIа в отношении макромолекулярных субстратов, таких как фXII и фXI, но не хромогенного субстрата (олигопептид) [39]. 20 1.3.2. Белковые ингибиторы фXIIa неплазменного происхождения Сериновые протеазы широко распространены в природе и составляют около трети всех известных протеолитических ферментов. К сериновым протеазам относят как эндо-, так и экзопептидазы, принадлежащие к различным семействам белков. На данный момент в базе данных «MEROPS» зарегистрировано более 50 семейств сериновых протеаз [47]. Эти ферменты участвуют в различных процессах, таких как пищеварение, свертывания крови, оплодотворения, активации комплемента, апоптоз, иммунный ответ и т.д [1]. В частности было показано, что протеазы играют важную роль в приспособительных реакций прокариот к изменениям во внеклеточной среде [1], в питании и проникновение бактерий в клетку-хозяина (инвазии) [48]. Вирулентность многих патогенных бактерий также обеспечивается сериновыми протеазами [49,50]. Вероятно, этим может объясняться такое же широкое распространение ингибиторов сериновых протеаз в природе. Так в базе данных «MEROPS» [47] насчитывается 38 семейств ингибиторов сериновых протеаз, принадлежащих к 20 кланам. Сходство же каталитических сайтов сериновых протеаз позволяет находить ингибиторы факторов свертывания и фXIIa в частности в природных источниках: животных, растительных и бактериальных [51–57]. На данный момент описано 12 неплазменных ингибитора фXIIa, принадлежащие к 5 различным семействам ингибиторов, из которых только один очевидно связан с подавлением свертывания крови – четвертый домен белка инфестин (инфестин 4) из желудка кровососущего насекомого Triatoma infestans [52]. Другие ингибиторы в естественной ситуации (в природе) не оказываются в контакте с кровью человека. Природные белковые ингибиторы фXIIa представляют собой небольшие глобулярные белки с молекулярным весом от 3 до 16 кДа. Т.к. эволюционно данные ингибиторы появились не для выполнения функции подавления свертывания, их селективность по отношению к фXIIa не высока, они также подавляют активность других плазменных протез: фXIa, фXa, фIXa и тромбин. 21 Таким образом, из 12 неплазменных ингибиторов селективно подавляют активность фXIIa только ингибитор трипсина из кукурузы (corn Hageman factor inhibitor, CHFI) и инфестин 4 с константами ингибирования 2,5 нМ [58] и 78 пМ [52], соответственно. Данные ингибиторы подавляют активность протеаз по стандартному механизму [10], который будет рассмотрен подробнее. 22 1.3.3. Стандартный механизм ингибирования сериновых протеаз Канонические ингибиторы сериновых протеаз, такие как CHFI и инфестин4, действуют по стандартному механизму [10]. При этом ингибитор входит в протеазу, как ключ в замок (рис. 5). Канонические ингибиторы взаимодействуют с протеазой своей протеаза связывающей петлей. Петля входит в каталитический сайт протеазы, подобно субстрату и связывается там с теми же субсайтами (Si, …,S3, S2, S1, S1’, S2’, S3’, … Sj’), что и субстрат (рис. 1). Аминокислотные остатки ингибитора, которые связываются с субсайтами, обозначают так же, как и у субстрата (Pi, …,P3, P2, P1, P1’, P2’, P3’, … Pj’) [11]. Рисунок 5. Схема связывания канонического ингибитора с сериновой протеазой. Ингибитор связывается с активным сайтом фермента в субстратподобным образом. Боковые цепи аминокислотных остатков выступающей петли ингибитора связываются с субсайтами и каталитическим серином в активном сайте ингибитора. По [12] с незначительными изменениями. Когда канонический ингибитор связывается с сериновой протеазой, а его петля заходит в каталитический сайт, связь P1-P1’ подвергается гидролизу. Однако, гидролиз проходит очень медленно, а продукты реакции не 23 высвобождаются, в результате пептидная связь P1-P1’ в петле ингибитора может быть восстановлена [13,59]. Важно отметить, что и гидролизованный (двухцепочечный) канонический ингибитор способен подавлять активность сериновой протеазы [10]. Рассмотрим подробнее строение протеаза связывающей петли. У канонических ингибиторов она значительно выступает из белкового скаффолда и представляет собой довольно простой мотив. Собственно эпитоп формируется шестью аминокислотными остатками P3 - P3’, которые и связываются с активным сайтом протеазы. Аминокислотные остатки, более удаленные от расщепляемой связи P1- P1’ (P6 – P4 и P4’– P6’) могут формировать т.н. контактный регион, который также может вносить значительный вклад в энергию связывания ингибитора с протеазой [60–62]. Важно подчеркнуть, что у канонических ингибиторов, в отличие от ингибиторов сериновых протеаз другого типа: неканонических и серпинов (механизм работы серпинов описан в разделе 1.3.1.),- взаимодействие с протеазой происходит только через протеаза-связывающую петлю, при этом вторичные сайты связывания за пределами каталитического сайта протеазы не формируются (рис.6). Интересно, что ингибиторы Казаля с нарушенной конформацией протеаза-связывающей петли связываются с протеазой так же, как неканонические ингибиторы: связываются с каталитическим сайтом, но при этом формируют дополнительные сайты связывания с другими частями протеазы. Этими вторичными сайтами во многом определяется энергия связывания и специфичность данных ингибиторов [63]. 24 Рисунок 6. Примеры комплексов "сериновая протеаза:ингибитор" для ингибиторов различных типов: канонический, неканонический и серпин. Протеаза-связывающая петля и боковая цепь Р1-аминокислотного остатка CMTI и альфа-1-антитрипсина, а также N-конец орнитодорина показаны красным цветом, вторичные сайты связывания орнитодорина – оранжевым. Элементы вторичной структуры окрашены синим (бета-слои) и зеленым (альфа-спирали). По [63] с незначительными изменениями Аминокислотные канонических последовательности ингибиторов значительно протеаза-связывающих варьируют, за петель исключением представителей двух семейств [64,65], однако при этом конформация петли остается канонической (рис. 7). 25 Рисунок 7. Суперпозиция основной цепи протеаза-связывающих петель (участок Р3-Р3’) [63]: OMSVP3 (PDB: 2OVO) – светло-серый; SSI (3SSI) – серый и BPTI (PDB: 5PTI) – темно-серый. Даже после расщепления конформация протеаза-связывающей петли остается практически неизменной, за исключением локальных структурных изменений около разрушенной пептидной связи P1 - P1’ [66,67]. Подвижность расщепленной петли также повышается, однако структура белка в целом остается неизменной [68,69]. 26 1.4. Ингибитор трипсина из кукурузы Ингибитор трипсина из кукурузы (corn trypsin inhibitor / Corn Hageman factor inhibitor, CHFI) –канонический ингибитор сериновых протеаз с молекулярным весом 14 кДа. CHFI принадлежит к семейству злаковых ингибиторов сериновых протеаз I6, согласно классификации «MEROPS» [47]. Зрелый белок состоит из 127 аминокислотных остатков. Как и другие канонические ингибиторы, CHFI взаимодействует с протеазами посредством выступающей протеаза-связывающей петли. Пептидная связь Р1-Р1’ у данного ингибитора находится междуАрг34 и Лей35 [70]. Согласно данным рентгенно-структурного анализа [71], CHFI имеет протеаза-связывающую петлю типичной формы, замкнутую дисульфидной связью между цистеинами 20 и 44 (рис. 8 ). Рисунок 8. Структура CHFI. Альфа спирали показаны зеленым, бета слои – коричневым, дисульфидные связи – розовым, пептидная связь Р1-Р1’ междуАрг34 и Лей35 – желтым цветом. Визуализация выполнена в программе «Cn3d» [72]. 27 Известно, что CHFI ингибирует фXIIa [73], оказывая при этом минимальное влияние на другие факторы свертывания. В настоящий момент не существует кристаллической структуры комплекса фXIIa-CHFI, однако экспериментальные данные указывают на то, что ингибирование происходит по стандартному механизму [10]. Было показано, что CHFI сохраняет ингибирующую активность в отношении трипсина [74,75] и фXIIa [73,76], как в интактной (одноцепочечной) форме, так и с расщепленной Р1-Р1’ пептидной связью (двуцепочечная форма). Двуцепочечная форма ингибитора сохраняет 20-25% ингибирующей активность интактной. 28 Постановка задачи Активация по внутреннему пути начинается с автоактивации фактора XII (фXII) при его взаимодействии с отрицательно заряженными поверхностями. В норме данный путь не является значимым этапом в поддержании гемостаза, однако может приводить к патологическому формированию тромбов при гиперкоагуляционных состояниях. Предотвращение активации фXII или ингибирование активированной формы фXII (фXIIа) также необходимо при любых манипуляциях, приводящих кровь или плазму в контакт с чужеродными поверхностями как in vivo, так и in vitro. Ингибитор трипсина из кукурузы (Corn Hageman Factor Inhibitor, CHFI) избирательно подавляет активность фXIIа, оказывая при этом незначительное воздействие на работу других факторов свертывания. CHFI – это канонический ингибитор сериновых протеаз (фXIIа – сериновая протеаза). Для ингибиторов данного типа характерно наличие протеаза-связывающей петли, выступающей на поверхности белковой глобулы и взаимодействующей непосредственно с каталитическими аминокислотными остатками в кармане протеазы. Такая протеаза-связывающая петля может действовать как независимый структурный элемент, сохраняя ингибирующую активность в отношении протеазы, что было показано в экспериментах с синтетическими пептидами и природными пептидными ингибиторами из слизи лягушки Odorrana grahami [77,78]. Таким образом, исследование ингибитора трипсина из кукурузы роли протеаза-связывающей в специфическом петли взаимодействии с активированный фактор свертывания XII и поиск минимального фрагмента данного ингибитора, способного подавлять протеолитическую активность фXIIa, являются совершенно необходимыми для понимания механизмов ингибирования контактной активации и разработки новых высоко селективных ингибиторов. 29 Принято считать, что канонические ингибиторы сериновых протеаз действуют по субстрат – подобному механизму, взаимодействуя с активным сайтом фермента своей протеаза-связывающей петлей. В данной работе мы исследовали роль протеаза-связывающей trypsin/factor XIIa петли inhibitor, ингибитора CHFI) в трипсина из специфическом кукурузы (corn взаимодействии с активированный фактор свертывания XII (фXIIa). Целью данной работы было выявление роли протеаза-связывающей петли CHFI и его внепетельных участков во взаимодействии с фXIIa. В задачи исследования входило 1. получить рекомбинантный CHFI и серию его укороченных мутантов; разработать протокол экспрессии CHFI и его мутантов в Escherichia сoli в растворимой форме для последующей однофазной очистки; 2. измерить константы ингибирования полученных мутантов по отношению к фXIIa; 3. построить модельную структуру фXIIa на основе гомологии с активатором фактора роста гепатоцитов; 4. на основе известной рентгеновской структуры CHFI построить модельные структуры мутантов CHFI методом молекулярной динамики; 5. провести моделирование взаимодействия CHFI и его мутантов с трипсином, фXIIa и фXIa методом докинга. 30 Глава 2. Материалы и методы 2.1. Используемые реактивы В работе были использованы следующие реактивы: альфа-фXIIa (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США); фXIa (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT, США); хромогенные субстраты S2302 (для фXIIa), S2765 (для трипсина) и S2366 (для фXIa) ( Chromogenix, США); 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол (ТРИС) (Sigma, St Louis, MO, США); бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, St Louis, MO, США); фосфатный буфер (PBS) (Sigma, St Louis, MO, США); Ni-NTA (никель-нитрилоуксусная кислота)-агароза (QIAGEN, Германия) уксусная кислота (Sigma, St Louis, MO, США); соляная кислота (Sigma, St Louis, MO, США); акриламид / бис-акриламид (37:1) (Sigma, St Louis, MO, США); имидазол (Sigma, St Louis, MO, США); хлорид натрия (Sigma, St Louis, MO, США); гидроксид натрия (Sigma, St Louis, MO, США); тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) (Sigma, St Louis, MO, США); глицерин (Sigma, St Louis, MO, США); Кумасси бриллиантовый синий (R-250) (Sigma, St Louis, MO, США); агароза (Sigma, St Louis, MO, США); пептон (BD Biosciences, San Jose, CA, США); дрожжевой экстракт (BD Biosciences, San Jose, CA, США); агар (BD Biosciences, San Jose, CA, США); трипсин из бычьей поджелудочной железы (Sigma, St Louis, MO, США); GmbH, 31 додецилсульфат натрия (SDS) (Sigma, St Louis, MO, США); бромистый этидий (BrEt) (Sigma, St Louis, MO, США); меркаптоэтанол (Sigma, St Louis, MO, США); этанол (Sigma, St Louis, MO, США); бромфеноловый синий (Amerco, США) ксиленцианол (Amerco, США) глицин (Sigma, St Louis, MO, США); изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) (Sigma, St Louis, MO, США); персульфат аммония (Sigma, St Louis, MO, США); фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Thermo Fisher Scientific Inc, США); эндонуклеазы рестрикции BamHI и HindIII (New England Biolabs, США); T4 ДНК-лигаза (New England Biolabs, США); ДНК-полимераза «Vent® DNA-polymerase» (New England Biolabs, США); ингибитор трипсина из кукурузы (corn trypsin inhibitor, CHFI) (Enzyme Research Laboratories, США). Циклический синтетический пептид CHFI-2 (Цис-Арг-Три-Тир-Вал-Три-СерАрг-Три-Асп-Гли-Иле-Гли-Про-Арг-Иле-Про-Три-Про-Глу-Лей-Лиз-Арг-АргЦис), представляющий собой изолированную протеаза-связывающую петлю CHFI был синтезирован в ООО «Синэйро» (Москва, Россия) по нашему заказу. Плазмида, содержащая синтетический ген CHFI была любезно предоставлена д.б.н. В.Г. Луниным (Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук). Прочие реагенты были приобретены у фирмы Sigma-Aldrich (St Louis, MO, США). 32 В работе были использованы следующие буферные растворы: буфер лизирования клеток E. coli при выделении белка (Буфер Л): 25мМ ТРИС-HCl, pH=8.0, 300 мМ NaCl, лизоцим 1мг/мл, 10 мМ имидазол и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF); буфер для промывания Ni-NTA колонки (Буфер К): 25мМ ТРИС-HCl, pH=8.0, 300 мМ NaCl, лизоцим 1мг/мл, 50 мМ имидазол и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF); буфер для элюции белка с Ni-NTA колонки (Буфер Э): 25мМ ТРИС-HCl, pH=8.0, 300 мМ NaCl, лизоцим 1мг/мл, 200 мМ имидазол и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF); буфер для хранения рекомбинантных белков (Буфер Х): 110 мМ ТРИС-HCl, pH=8.0, 250 мМ NaCl и 4 мМ имидазол; буфер для проведения хромогенного теста ингибирования фXIIа, фXIa и трипсина (Буфер ХТ): 110 мМ ТРИС-HCl, pH=8.0, 250 мМ NaCl и 1% БСА). буфер Лэммли: ТРИС 30 г/л, SDS 10 г/л, глицин 144 г/л; буфер ТАЕ: ТРИС 40мМ, ЭДТА 1мМ, уксусная кислота - до достижения рН 7,6; буфер для внесения образцов в ПААГ (Буфер В): Буфер для внесения образцов в агарозный гель GelPilot DNA Loading Dye (QIAGEN, GmbH, Германия). Штаммы Escherichia coli (E. coli): Rosetta-gami 2 (DE3) ( EMD Millipore, Darmstadt, Германия) был использован для экспрессии рекомбинантных белков. Генотип Rosetta-gami 2 (DE3): Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3) F′ [lac+ lacIq pro] gor522::Tn 10 trxB pRARE2 (CamR, StrR, TetR). Данный штамм является лизогеном λDE3 и имеет хромосомную копию гена Т7 РНК-полимеразы, находящегося под контролем lacUV5 промотора. Использованный штамм-продуцент позволяет 33 проводить индуцировать экспрессию гетерологичного белка добавлением ИПТГ в питательную среду. 34 2.2. Подбор праймеров, полимеразная цепная реакция и сайтнаправленный мутагенез Плазмида pLA-TA, содержащая ген CHFI была использована в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации целевого гена и последующего создания экспрессионного вектора на базе коммерческой плазмиды pET28a. Прямой и обратный праймеры, использованные в работе, 5′-TGCGGATCCTCTGCTGGTACCAGCTG-3′ и 5′-TGCAAGCTTAGATCTGCTCGGCATGG-3′ дополнительно вносили в ПЦРпродукт сайты распознавания для эндонуклеаз рестрикции BamHI и HindIII (прямой и обратный праймер, соответственно). Специальные праймеры были сконструированы для проведения сайт-направленного мутагенеза (замены нуклеотидов в триплете, кодирующем неспаренный цистеин) для каждого рекомбинантного ингибитора. ПЦР-сшивку фрагментов после сайт- направленного мутагенеза проводили по методу [79], используя прямой и обратный праймеры, а так же два специальных праймера, специфических для каждой конструкции (табл. 1). Таблица 1. Праймеры для сайт-направленного мутагенеза. Конструкция CHFI-1234 CHFI-2345 CHFI-234 CHFI-123 CHFI-1245 праймеры, 5’ – 3’ прямой GGATCCTCTGCT GGTACCAGCTG CGTTCCGG GAATTCATCCCG CACAACCCGCT G GAATTCATCCCG CACAACCCGCT G GAATTCTCTGCT GGTACCAGCTG C GAATTCTCTGCT GGTACCAGCTG C праймер для мутагенеза №1 праймер для мутагенеза №2 CAGGATAGACAGAGC GGTGTTACGGCAGTA AGCCGG GATGTC GGTGCAACGGTCGTA AGCCGGGATGTCAGC CAGTTCA GTGTTACGGTCGTAAG CCGGGATGTCAGCC TCCCGGCTTACTGCCG TAACACCGCTCTGTCT ATCCTGATG CCGGCTTACGACCGTT GCACCGCTCTG GATGTCAGCCAGTTCA CGGTCGCAACGACGTT TCAGTTCC TCCAGAACCGACGGA ATCGG ATCCCGGCTTACTGCC GTGACACCGCTCTGTC TATCCTG ACCGATTCCGTCGGTT CTGG GCTGACATCCCGGCTT ACGACCGTAACAC обратный AAGCTTTTAGGTA GCTAAGTTGCATT CAG AAGCTTAGATCTG CTCGGCATGGTAC CACCA AAGCTTGGTAGCT AAGTTGCATTCAG CTTC AAGCTTACCACG CTGAACTTCTCTC AAGCTTAGATCTG CTCGGCATGGTAC CACCA 35 2.3. Трансформация клеток штамма-продуцента плазмидными конструкциями Штамм-продуцент E. coli Rosetta-Gami 2 DE3 был использован для экспрессии рекомбинантных ингибиторов. Трансформацию проводили методом теплового шока с [80] незначительными модификациями. Химически компетентные клетки инкубировали на льду в течении 20 мин, затем в стерильных условиях к клеткам добавляли 5 мкл лигазной смеси, содержащей соответствующий экспрессионный вектор и инкубировали на льду 30 мин. Тепловой шок проводили в водяной бане при температуре 40 °С в течение 20 с. После теплового шока клетки немедленно переносили на лед. На следующем этапе каждую аликвоту клеток переносили в 0,5 мл питательной среды SOC. Инкубировали при 37 °С в течение 1 ч со встряхиванием на шейкере. Далее проводили селекцию трансформантов на твердой агаризованной среде, содержащей 25 мг/мл канамицина, в чашках Петри. Потенциальных продуценты отбирались по результатам пробной индукции в 4 мл питательной среды LB; экспрессию инициировали добавлением 1мМ ИПТГ. Наработку белка проводили в течение 2,5 ч при 37 °С. Наличие вставки подтверждали целевого гена секвенированием. В у положительных трансформантов качестве сиквенсовых праймеров использовались, комплиментарные к вектору pET28a, стандартные Т7 праймеры прямой 5’- TAATACGACTCACTATAGGG-3’ 5’- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’. и обратный 36 2.4. Экспрессия и детекция рекомбинантных ингибиторов Рекомбинантные ингибиторы производили путем индукции экспрессии целевого белка в соответствующем штамме-продуценте. Клетки штаммапродуцента E. coli Rosetta-Gami 2 DE3 каждого ингибитора рассевали из музея на твердую агаризованную питательную среду, содержащую 25 мг/мл канамицина, в чашки Петри для получения единичных колоний. Единичную колонию клеток использовали для инокуляции 4 мл жидкой питательной среды LB, содержащей 25 мг/мл канамицина, и культивировали в течение ночи при 37 °C. Полученную культуру использовали в качестве инокулята (инокулят разводили в 50 раз) для 1,5 л жидкой среды LB, содержащей 25 мг/мл канамицина. Клетки культивировали при 37 °C до достижения оптической плотности культуры 0,6-0,7 на длине волны 600 нм. Экспрессию индуцировали добавлением ИПТГ в питательную среду до достижения конечной концентрации 0,02 мМ, после чего культивирование продолжали при 25 °C в течение 20 ч. Образцы культуры центрифугировали при 3000×g, надосадочную жидкость декантировали, а клеточный осадок ресуспензировали в буфере В и инкубировали 10 мин при 95 °C. Затем наличие целевого белка в клеточном лизате проверяли методом денатурирующего электрофореза в 12% акриламидном геле по Лэммли в камере «MiniProteanTetra» (BioRad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Прописи использованных растворов приведены в разделе «2.1. Используемые реактивы». Окрашивание гелей проводили в Кумасси R-250. 37 2.5. Очистка рекомбинантных ингибиторов Все рекомбинантные белки были клонированы так, что на N- и/или С- конце несли гексагистидиновый таг для очистки, что позволило использовать для очистки ингибиторов никель-афинную хроматографию. Биомассу продуцентов после индукции получали в виде осадка клеток центрифугированием культуры в течение 20 мин при 5000 × g при температуре 4 °C. Затем клетки лизировали в буфере Л в течение 30 мин на льду с последующим разрушением клеток ультразвуком при помощи погружного соникатора. Клеточный дебрис удаляли из лизатов центрифугированием в течение 40 мин при 10000 × g при температуре 4 °C. Полученные супернатанты пропускали через 0,2-мкм фильтр с ацетат-целлюлозной мембраной (EMD Millipore) и проводили очистку на Ni2+-агарозной колонке (Qiagen). Колонку промывали пятикратным объемом буфера К. Элюцию ингибиторов проводили в буфере Э. Концентрацию белка в элюатах определяли спектрофотометрически: по поглощению на рекомбинантных длине волны ингибиторов 280 был нм. Коэффициент рассчитан по экстинкции для аминокислотной последовательности при помощи программы Vector NTI® Advance (Invitrogen). Для расчета концентрации использовали формулу (1): С= А280/КЭ, (1) где С – концентрация в молях, А280 – поглощение на длине волны 280 нм, КЭ – коэффициент экстинкции; оптический путь 1см. 38 2.6. Измерение ингибирующей активности Рекомбинантные ингибиторы перед исследованием ингибирующей активности перевели из буфера Э в буфер Х. Замену буфера проводили на 3-кДa центрифужных фильтрах (Amicon Ultra 15 3kDa), согласно рекомендациям производителя (Millipore). Хромогенные тесты проводили в соответствии с рекомендациями производителя субстрата (Chromogenix, США) с незначительными изменениями. В качестве отрицательного контроля ингибирования во всех хромогенных тестах использовался рекомбинантный EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), полученный в тех же условиях, что и рекомбинантные ингибиторы (вектор, штамм-продуцент, протокол очистки). В тесте ингибирования фXIIa использовался хромогенный субстрат S2302, в тесте ингибирования фXIa - S2366, а в тесте ингибирования трипсина - S2765. Измерение активности (скорости расщепления соответствующего хромогенного субстрата) в тестах ингибирования фXIIa, фXIa и трипсина проводили при 37 °С в буфере ХТ в 96-луночном планшете с плоским дном (Corning Inc., США). Скорость расщепления хромогенного субстрата измеряли на спектрофотометре «Sunrise microplate spectrophotometer» (Tecan Group AG, Австрия) на длине волны 405 нм. Конечная концентрация ферментов в реакционной смеси составляла 1 нМ для фXIIa, 200 пM для фXIa и 1 нМ для трипсина, а все хромогенные субстраты использовались в концентрации 500 мкМ. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Расчет констант ингибирования (Ki) проводился по остаточной активности ферментов. Скорость гидролиза субстрата при 405 нм (V) наносили на график против концентрации ингибитора в обращенных координатах, получая 1/V (S × OD405-1), которая зависит от C (нМ или мкМ). Проводили линейную аппроксимацию и получали параметры: а - отрезок, отсекаемый на координатной оси ординат, и b – тангенс угла наклона. Константы ингибирования вычисляли по 39 формуле (2), представляющую собой преобразованное уравнение МихаэлисаМентена, где Km – константа Михаэлиса (в соответствии с инструкциями производителя хромогенного субстрата), а [S] – концентрация субстрата в эксперименте. (2) 40 2.7. Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга Для проведения расчетов использовалась кристаллическая структура CHFI с разрешением 1.95 Å, опубликованная в базе данных Protein Data Bank (PDB) [81] под номером 1BEA [71]. При моделировании мутанта CHFI-1245 Цис29 был вручную заменен на Асп. Для подготовки структуры CHFI-2 (изолированной протеаза-связывающей петли) аминокислотные остатки за пределами исследуемого интервала Цис20-Цис44 из структуры 1BEA были удалены. Программа VMD (visual molecular dynamics) [82] применялась для подготовки модельных систем и дальнейшего анализа молекулярно-динамических (МД) траекторий [83]. В модель CHFI-12345 были добавлены недостающие атомы водорода, а также включены молекулы воды, присутствовавшие к кристаллической структуре 1BEA. Все три модельные структуры (CHFI и его укороченные мутанты) были окружены TIP3P-молекулами воды, образовывавшими куб, грани которого были удалены от исследуемой структуры не менее, чем на 10Å. Также в систему были добавлены ионы натрия и хлора до конечной концентрации 0,15 М. Расчеты проводились при помощи программного обеспечения NAMD 2.9 [84] с использованием силового поля CHARMM36 [85]. Минимизация энергии атомов водорода, ионов натрия и хлора и молекул воды, добавленных в систему CHFI-12345, а также боковые цепи мутированных аминокислотных остатков CHFI-1245 и CHFI-2 была достигнута за 1000 шагов. Координаты атомов, описанные в рентгенно-структурных данных, были сохранены. Полученные структуры были как непосредственно использованы для проведения докинга с протеазами, так и дополнительно минимизированы методом молекулярной динамики. 41 2.8. Молекулярная динамика Водный куб с подготовленной и оптимизированной системой (для каждого ингибитора) был уравновешен в течение 1-нс МД-симуляции, все координаты CHFI были фиксированы (NPT ансамбль, 298 К, 1атм, периодические граничные условия). Параметры модельных систем приведены в таблице (табл. 2). Таблица 2. Основные параметры модельных систем, использованные для МД-симуляции. Ингибитор Общее количество атомов CHFI-12345 19090 CHFI-1245 19613 CHFI-2 7429 Во время Количество молекул воды 5782 5805 2332 предварительной подготовки Размер системы 50.0Å × 61.0Å × 61.3Å 50.0Å × 61.0Å × 61.4Å 36.4Å × 44.4Å × 44.7Å системы были полностью энергетически минимизированы за 5000 шагов. Затем была проведена 50-нс МДсимуляция при 298 К с теми же параметрами, которые использовались на этапе подготовки. Все атомы были подвижными. Полученные 50-нс траектории использовались для анализа конформационных изменений. Чтобы получить стабильные конформации мутантов CHFI для последующего докинга с протеазами, системы, полученные в результате МД-симуляции при 298 К, затем были медленно охлаждены до 4 К при скорости изменения температуры 1 К/нс. МД-симуляции проводились с использованием суперкомпьютера Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова [86]. 42 2.9. Подготовка модельной структуры фактора XIIa на основе гомологии Поскольку в настоящий момент кристаллическая структура каталитического домена фXIIa еще не получена, для проведения наших расчетов была построена модельная структура фXIIa на основании аминокислотной последовательности данного домена (номер по базе данных «UniProt» - P00748). Поиск гомологичного белка для построения модельной структуры проводили с помочью алгоритма BLAST [87] на сервере «UniProt» [88]. Наибольшее сходство среди белков, для которых имеется опубликованная кристаллическая структура, было обнаружено с активатором фактора роста гепатоцитов (номер по базе данных «UniProt» - Q04756) и составило 47%. Для каталитического домена данного белка в базе данных «PDB» доступно несколько структур, лучшая из которых (код в базе данных «PDB» - 2R0L) имела разрешение 2,20 Å [89]. Данная структура и была использована при построении модели фXIIa с помощью программы «Modeler 9v12» [90]. Валидность полученной модели фXIIa проверяли докингом трипептида D-Про-Фен-Арг, аналогичного коммерческому хромогенному субстрату S2302 (D-Про-Фен-Арг-паранитроанилин, Chromogenix), специфическому для данной протеазы. Начальная позиция белка и пептида была рассчитана при помощи сервера «ClusPro» [91,92] и уточнена с использованием «Rosetta FlexPepDock» [93,94]. 43 2.10. Белок-белковый докинг Докинг CHFI и его мутантов с модельной структурой фXIIa, а также с кристаллическими структурами трипсина (номер по базе данных «PDB» - 2O9Q, разрешение 1,70 Å) и фXIa (номер по базе данных «PDB» - 3SOR, разрешение 1,70 Å) [95] проводили с использованием веб-серверов «ClusPro» [91,92,96,97] «pyDock» [98,99]. Для проведения докинга при помощи сервера «pyDock», вводились ограничения каталитического протеаз. (при взаимодействии) Арг34 ингибитора и 44 2.11. Статистический анализ Статистический анализ методом неспаренного t-теста производился в программе «GraphPad Prism» (GraphPad Software, США). Эксперименты проводились в трехкратной повторности. Значения р для конкретного случая приведены на картинках и в тексте. Различие считалось статистически значимым при P < 0,05. Представлены усредненные величины ± стандартные ошибки среднего, если не указано иное. 45 Глава 3. Результаты 3.1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантного CHFI Для исследования роли различных участков CHFI, расположенных вне ингибирующей петли, во взаимодействии с фXIIa был создан ряд укороченных мутантов. Исходя из опубликованной пространственной структуры CHFI (PDB 1BEA) [71], мы создали 5 укороченных рекомбинантных вариантов ингибитора, (а так же в работе исследован 1 синтетический пептид), таких, что в них отсутствуют N- и/или С-концевые участки и некоторые дисульфидные связи (рис. 9). В интересах удобства в названиях рекомбинантных ингибиторов отмечены присутствующие в белке дисульфидные связи (например, в CHFI-234 сохранены вторая, третья и четвертая дисульфидные связи). CHFI-12345 – это полноразмерный рекомбинантный CHFI без внесения изменений. В мутанте CHFI-2345 отсутствуют 11 N-концевых аминокислотных остатков, а также первая дисульфидная связь; цистеин 55 заменен на аспарагиновую кислоту. Данный мутант повторяет опубликованный ранее вариант CHFI, за исключением замены неспаренного цистеина [58]. Мутант CHFI-1234 укорочен на 24 аминокислотных остатка с С-конца, в нем также разрушена пятая дисульфидная связь; цистеин 57 заменен на аспарагиновую кислоту. CHFI-234 представляет собой комбинацию первых двух вариантов: мутант укорочен на 11 N-концевых и 24 С-концевых аминокислотных остатка, Цис 55 и 57 заменены на аспарагиновую кислоту. Для исследования роли участка CHFI между третьей и четвертой дисульфидной связями, а также наличия четвертой дисульфидной связи, был создан мутант CHFI-123, укороченный с С-конца на 34 аминокислотных остатка. Неспаренные цистеины 45 и 57 в данном мутанте также заменены на аспарагиновую кислоту. 46 47 Рисунок 9. CHFI и его мутанты. Схемы вторичной структуры. Позиции цистеинов подписаны под каждой схемой. Квадратные скобки обозначают дисульфидные связи, треугольником отмечено положение пептидной связи Р1-Р1’. Замены цистеина на аспарагиновую кислоту отмечены крестиком, овалом отмечен неспаренный цистеин 86 (А). Предполагаемые конформации CHFI и его мутантов. Альфа-спирали окрашены красным, дисульфидные связи – желтым. Ингибирующая петля повернута вверх. Визуализация выполнена при помощи программы «Discovery Studio software» (Accelrys, Inc., США). Все рекомбинантные белки были клонированы так, что на N- и/или С- конце несли гексагистидиновый таг для очистки, а также несколько дополнительных аминокислот (рис. 11). Этот прием мы использовали для увеличения рекомбинантных ингибиторов в размере, т.к. известно, что белки с молекулярным весом менее 10 кДа плохо экспрессируются в прокариотических системах [100]. Чтобы исключить влияние внепетельных участков CHFI на взаимодействие его протеаза связывающей петли с фXIIa, был использован синтетический циклический 25-аминокислотный изолированную пептид протеаза-связывающую CHFI-2, петлю. представляющий Данный пептид собой содержит аминокислотные остатки CHFI с 20го по 45й и замыкается в кольцо дисульфидной связью между цистеинами на его N- и С-концах. Цистеин 29, который, оставаясь неспаренным, мог бы приводить к образованию дисульфидной связи между пептидами, также как и в случае других мутантов заменен на аспарагиновую кислоту. В качестве контроля влияния замены цис29 в изолированной рекомбинантный протеаза-связывающей мутант CHFI-1245, полноразмерный CHFI с заменой цис29асп. петле (CHFI-2) который был использован представляет собой 48 ДНК-последовательности, кодирующие CHFI-12345, CHFI-1234, CHFI-2345, CHFI-234, и CHFI-1245, CHFI-123 были получены методом ПЦР с использованием синтетического гена CHFI в качестве матрицы. При помощи праймеров (таблица. 1) в последовательности были внесены мутации (замена цистеина на аспарагин) в соответствующих позициях, а также добавлены сайте распознавания для последовательности эндонуклеаз мутантов рестрикции CHFI-12345 и BamHI и CHFI-1234 HindIII. был В внесен дополнительный стоп-кодон перед сайтом рестрикции HindIII, поэтому в эти два рекомбинантных ингибитора имеют только N-концевой гексагистидиновый таг (рис. 11). Полученные гены ингибитора и его мутантов были клонированы в экспрессионный вектор pET28a. Экспрессионные вектора трансформировали в клетки штамм-продуцента E. coli Rosetta-gami2 DE3. Рекомбинантный ингибиторы частично экспрессировались в растворимой форме. Благодаря наличию гексагистидиновых тагов на N- и/или С-конце белков, очищенные препараты ингибиторов (рис. одностадийной никель-афинной хроматографии. 10) были получены путем 49 Рисунок 10. Препараты, очищенных рекомбинантных ингибиторов (результаты денатурирующего гель-электрофореза в 12% ПААГ). М/В – маркер молекулярного веса; CHFI-ER - нативный CHFI из зерна Zea mays); рекомбинантные ингибиторы: CHFI-12345, CHFI-1245, CHFI-2345, CHFI1234, CHFI-234 и CHFI-123 (2мкг на дорожку); EGFP – отрицательный контроль для тестов ингибирования (10 мкг на дорожку). Теоретический молекулярный вес рекомбинантных ингибиторов вместе с гексагистидиновыми тагами (молекулярный вес N- и/или C-концевой тагов (а) составляет 3,8 кДа или 1,5 кДа, соответственно) был рассчитан при помощи программы Vector NTA и составил 17.5 кДА для CHFI-12345, 19 кДА для CHFI1245, 15.2 кДА для CHFI-1234, 18 кДА для CHFI-2345, 16 кДА для CHFI-234 и 15.5 кДА для CHFI-123. Молекулярный вес CHFI дикого типа, рассчитанный тем же способом, составил 13,6 кДа. 50 Разница в весе CHFI из зерна Z. mays и рекомбинантного CHFI-12345 объясняется наличием N-концевого гексагистидинового тага (рис. 11). Рисунок 11. Выравнивание аминокислотных последовательностей рекомбинантного CHFI и его мутантов, построенное при помощи программы «ClustalW» [87]. Цистеины помечены голубыми рамками, мутированные позиции отмечены красным цветом. Серым выделены таги для очистки рекомбинантных ингибиторов. Числа в верхней строке обозначают позиции цистеинов, а так же первый и последний аминокислотный остаток ингибитора (нумерация согласно структуре CHFI 1BEA, опубликованной в базе данных «PDB»). Приблизительный выход рекомбинантных ингибиторов варьировал между мутантами от 2,5 до 75 мг очищенного белка на литр культуры. В качестве контрольного белка во ингибиторов использовали всех экспериментах по рекомбинантный EGFP измерению активности (улучшенный зеленый флуоресцирующий белок), экспрессированный в тех же условиях (вектор и штамм-продуцент), что и рекомбинантные ингибиторы. 51 3.2. Измерение ингибирующей активности Для исследования ингибирующей активности рекомбинантного CHFI и его мутантов в отношении фXIIa, фXIa и трипсина, очищенные препараты белка проверяли в хромогенном тесте. При ингибировании фXIIa отличий между рекомбинантным полноразмерным ингибитором (CHFI-12345) и CHFI, выделенным из кукурузных зерен не Рисунок 12. Сравнение констант ингибирования (Ki) фXIIa рекомбинантного CHFI (CHFI-12345) и его укороченных мутантов. Н/з – различие не значимо. Изолированная протеаза-связывающая петля CHFI-2 не ингибировала фXIIa в хромогенном тесте. Положительный нативный CHFI-ER из зерна Zea mays. контроль - полноразмерный 52 выявлено. Этот факт также показывает, что наличие гексагистидинового тага не влияет на способность ингибитора трипсина из кукурузы подавлять активность фXIIa (рис. 12). Мутанты, укороченные на одну дисульфидную связь на N- (CHFI-2345) или С-конце (CHFI-1234), ингибировали фXIIa с той же активностью, что и полноразмерный CHFI. Объединение этих двух мутаций (одновременное укорочение с N- и С-конца, мутант CHFI-234) привело к небольшому снижению ингибирующей активности: Ki = 3.2 ± 0.4 нM при Ki полноразмерного ингибитора равной 1,0 ± 0,1 нM; уровень значимости р < 0,05 (рис. 12). Одновременное разрушение четвертой и пятой дисульфидной связи и удаление соответствующих участков белка у мутанта CHFI-123 приводит к значительному снижению ингибирующей активности (Ki = 116 ± 16 нM, уровень значимости р < 0,001) по сравнению с диким типом. Мутант CHFI-1245, представляющий собой полноразмерный CHFI с разрушенной третьей дисульфидной связью также проявлял сниженную ингибирующую активность в отношении фXIIa (Ki = 50 ± 8 нM, уровень значимости p < 0.05). Изолированная протеаза-связывающая петля CHFI (циклический пептид CHFI-2) не ингибировала фXIIa в концентрации до 1мМ (рис. 12, табл. 3). Таким образом, мутанты сохраняли ингибирующую активность в том случае, если третья и четвертая дисульфидная связь сохранялись в молекуле. Драматическое ингибирующей активности наблюдалось уже у CHFI-123. снижение 53 Таблица 3. Ki фXIIa и трипсина. Ингибитор CHFI-ER CHFI-12345 CHFI-2345 CHFI-1234 CHFI-234 CHFI-1245 CHFI-123 CHFI-2 Кi XIIa, нM 1,0 ± 0,1 1,1 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,3 3,2 ± 0,4 50 ± 8 116 ± 16 н/о* Кi трипсин, нM 2,1 ± 0,6 1,3 ± 0,2 2,9 ± 0,5 1,0 ± 0,6 2,2 ± 1,1 250 ± 20 н/о** 11700 ± 1200 * не определено: CHFI-2 не ингибировал фXIIa в концентрации до 1мM. ** не определено: CHFI-123 не ингибировал трипсин в концентрации до 75 мкM. Поскольку изолированная протеаза-связывающая петля CHFI-2 не ингибировала фXIIa, этот пептид и другие мутанты были также проверены в тесте ингибирования трипсина (рис. 13, табл. 3). Наблюдаемая ингибирующая активность мутантных была сходной по порядку величин: от Ki = 1,0 ± 0,6 нM (CHFI-1234) до Ki = 2,9 ± 0,5 нM (CHFI-2345), - до тех пор, пока в молекуле ингибитора сохранялись вторая, третья и четвертая дисульфидные связи. CHFI1245 показал значительно пониженную активность в отношении трипсина (Ki=250 ± 70 нM), так же как и пептид CHFI-2 (Ki=12 ± 2 мкM). CHFI-123 не проявил ингибирующей активности в отношении трипсина в концентрации до 75 мкM. Поскольку CHFI-2 частично сохранил ингибирующую активность в отношении трипсина, изолированная протеаза-связывающая вероятно, находилась в функционально активной конформации. петля CHFI, 54 Рисунок Сравнение 13. рекомбинантного CHFI констант (CHFI-12345) ингибирования и его (Ki) трипсина укороченных мутантов. Н/з – различие не значимо. CHFI-123 не ингибировал фXIIa в хромогенном тесте. Положительный контроль - полноразмерный нативный CHFI-ER из зерна Zea mays. Чтобы проверить, как изменилась ингибирующая активность изолированной протеаза-связывающей петли в отношении протеазы, которую CHFI ингибирует слабо - фXIa (Ki = 5,4 ± 0,2 мкM), был также проведен тест фXIa. В качестве контрольного белка для оценки влияния замены Цис29Асп был использован мутант CHFI-1245 – полноразмерный CHFI с разрушенной третьей дисульфидной связью. CHFI-2 ингибировал фXIa c Ki== 94 ± 11 мкM. Таким образом, изолированная протеаза-связывающая петля ингибировала фXIa значительно слабее, по сравнению с полноразмерным белком. Неожиданно CHFI1234 не показал ингибирующей активности в отношении фXIa (рис. 14, табл. 4). 55 Рисунок 14. Константа ингибирования (Ki) фXIa изолированной протеазасвязывающей петлей CHFI-2 в сравнении с мутантом CHFI-1245 (контроль замены Цис29Арг) и полноразмерным нативным CHFI-ER из зерна Zea mays. Таблица 4. Константы ингибирования фXIa. Ингибитор CHFI-ER CHFI-2 CHFI-1245 Кi XIa, мкM 5,4 ± 0,2 94 ± 11 490 ± 110 56 3.3. Моделирование взаимодействия протеаза-связывающей петли CHFI с ингибируемыми протеазами Для выявления возможных причин неактивности CHFI-2 в отношении фXIIa, к.х.н. старшим научным сотрудником Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН Софьей Владимировной Лущекиной было проведено моделирование взаимодействия CHFI-2, и CHFI-1245 CHFI-12345 (полноразмерный ингибитор) с фXIIa, фXIa и трипсином. Результаты модельных экспериментов были опубликованы в совместной статье (Korneeva et.al., 2014). За неимением опубликованной полной рентгеновской структуры фXIIa, была подготовлена модельная структура данной протеазы, которая и использовалась в дальнейшем для докинга с CHFI и его мутантами. Структуры мутантов CHFI, использованные в экспериментах были получены из опубликованной структуры CHFI (1BEA в базе данных «PDB», [71]) методом молекулярной динамики (МД). 3.3.1. Подготовка пространственных структур CHFI и его мутантов для проведения докинга Чтобы выяснить и при необходимости учесть конформационные изменения изолированной протеаза-связывающей петли CHFI-2 и CHFI-1245 (CHFI с заменой Цис29Асп), были проведены расчеты молекулярной динамики. В результате проведения 50-наносекундной симуляции с последующим охлаждением системы были получены структуры всех трех ингибиторов, стабильные в водном окружении. Положение боковой цепи Арг34 представляет особый интерес, т.к. связь между Арг34 и Лей35 гидролизуется во время взаимодействия CHFI с протеазой. Во время МД-симуляции с CHFI-12345, CHFI-1245 и CHFI-2 не происходило серьезных конформационных изменений. После охлаждения системы положение боковой цепи Арг34 в CHFI-12345 отличалось от состояния в кристаллической структуре 1BEA. В CHFI-1245 и CHFI-2 Арг-34 сходным 57 образом приближен к остову. Однако, в CHFI-1245 (мутант с заменой Цис29Асп) Арг34 формирует стабильный солевой мостик с Асп29 (рис. 15 А), что несколько изменяет форму протеаза-связывающей петли (рис. 15 Б). В CHFI-2 угол между двумя альфа-спиралями несколько отличался от угла между соответствующими спиралями в исходной рентгеновской структуре CHFI (рис. 15 В). Данное изменение конформации привело к тому, что изолированная протеаза- связывающая петля имела более жесткую конформацию по сравнению с петлей, находящейся в составе ингибитора. Арг34 и Асп29 при этом находились в пептиде на расстоянии 7 Å, что не позволяло им сформировать солевой мостик. Рисунок 15. Конформация протеаза-связывающей петли CHFI, нативной и мутированной (с заменой Цис 29 Арг). А и Б – конформация петли CHFI-1245 с заменой Цис 29 Асп (результат МД-симуляции). А – мутированная протеаза-связывающая петля CHFI-1245 с заменой Цис 29 Арг. Солевой мостик между Арг34 (R34) и Асп29 (D29) (А) показан точечной линией. Боковые цепи Арг34 (R34), Асп29 (D29) и неспаренным Цис29 (С29) показаны шариками и палочками. Б - наложение протеаза-связывающих петель нативного CHFI (CHFI-12345, синего цвета) и мутантной у CHFI-1245 (красная) по результатам МД-симуляции. В – угол между альфа-спиралями оказался несколько различным у пептида CHFI-2 (синий) и нативного CHFI12345 (красный) по результатам МД-симуляции. Визуализация структур выполнена при помощи плагина «Bendix» [101] для программы «VMD». 58 Так как между известной рентгеновской структурой CHFI и структурой после оптимизации, проведенной методом МД наблюдались различия в положении Арг34, для дальнейших экспериментов (докинг) использовались оба варианта структуры для каждого из ингибиторов: рентгеновская структура после минимизации мутированных участков и стабилизированные в водной среде и структуры после 50 нс МД при 298 К и медленного охлаждения системы до 4 К. 59 3.3.2. Моделирование структуры фXIIa. Докинг Модельная структура фXIIa построенная на основе гомологии с каталитической триадой серин-гистидин-аспарагиновая кислота, расположенной в щели на поверхности фермента и находящейся в положении, позволяющем производить каталитической расщепление субстрата представлена на рисунке 16 (рис. 16 А). Оценку пригодности модельной структуры фXIIa проводили путем докинга с трипептидом, аналогичным специфическому коммерческому хромогенному субстрату S2302 гидрохлорид). (H-D-пропил-L-фенилаланил-L-аргинин-паранитроанилина Позиция пептида, рассчитанная при помощи веб-сервера «ClusPro», была использована в качестве стартовой точки для более точного моделирования при помощи веб-сервера «Rosetta FlexPepDock» [93,94]. Для повышения точности расчетов пептид считался гибким. По результатам расчетов трипептид был локализован в активном сайте фXIIa (рис. 16 Б), так что расщепляемая пептидная связь находилась между фенилаланином и аргинином протеазы. Положение трипептида дополнительно стабилизировалось взаимодействием между аргинином субстрата и остатком Асп141 фактора XIIa. Таким образом, полученная модельная структура была признана годной для проведения дальнейших экспериментов. 60 Рисунок 16. Модельная структура фXIIa. А - модельная структура фXIIa, боковые цепи аминокислотных остатков каталитической триады показаны шариками и палочками и подписаны, альфа-спирали окрашены красным, а бета-слои – голубым цветом. Б. Результаты докинга трипептида Про-ФенАрг (аналог хромошенного субстрата S2302, который использовался в экспериментах). протеазы. Пептид ФXIIa (сине-голубой) (серый). Боковые находится цепи в активном аминокислотных сайте остатков 61 каталитической триады фXIIa показаны шариками и палочками и подписаны. В большинстве случаев, наиболее выгодное значение энергетической функции для комплекса протеаза-ингибитор было получено при использовании структур CHFI и его мутантов (CHFI-1245 и CHFI-2), оптимизированных методом молекулярной динамики (табл. 5). Это позволяет предположить, что конформации ингибиторов, полученные в ходе МД-симуляции лучше подходят для ингибирования целевых протеаз, чем минимизированные кристаллические структуры. Результаты докинга оптимизированных структур ингибиторов с протеазами не противоречили экспериментальным данным. Как CHFI, так и мутанты CHFI-2 и CHFI-1245 связывались с активным сайтом трипсина в позиции, пригодной для расщепления связи между Арг34 и Лей35 ингибитора (рис. 17), однако пептид CHFI-2 связывался слабее по сравнению с CHFI и мутантом CHFI-1245. Это согласовывалось с экспериментальными данными, полученными в хромогенном тесте (табл. 3, рис. 13). 62 Таблица 5. Белок-белковый докинг CHFI и его мутантов с трипсином, фXIa и фXIIa, выполненный при помощи сервера «pyDock». Трипсин Кристалличе ская Результат МДсимуляци и Кристаллическая Минимиз ированная Энергетич еская функция Позиция ингибитора ФXIa Энергети ческая функция ФXIIa Позиция Энергетич ингибитора еская функция Позиция ингибитора -111,794 Вблизи активного сайта; каталитическая триада открыта -111,343 Вблизи -115,585 активного сайта; каталитическая триада открыта Вблизи активного сайта; каталитическая триада открыта -121,355 Водородные связи с каталитической триадой -102,767 Арг34 в -126,167 активном сайте вблизи Асп480 Арг34 в активном сайте протеазы -109,923 Вблизи активного сайта; каталитическая триада открыта -117,278 Арг34 в активном сайте протеазы Вблизи активного сайта; каталитическая триада открыта А -119,760 Арг34 в активном -114,151 сайте протеазы Далеко от -120,005 активного сайта Арг34 в активном сайте протеазы -113,482 Вблизи активного сайта; каталитическая триада открыта -113,956 Вблизи -122,335 активного сайта; каталитическая триада открыта Вблизи активного сайта; каталитическая триада открыта -112,049 Арг34 в активном -114,054 сайте протеазы Арг34 в -131,186 активном сайте протеазы Далеко от активного сайта Результат МДсимуляции Кристаллическая Минимизиро ванная Результат МДсимуляци и CHFI-2 CHFI-1245 (Цис29Асп) CHFI-12345 Ингибитор -117,116 63 Рисунок 17. Комплексы трипсина с ингибиторами, полученные в результате белок-белкового докинга. А - комплекс с CHFI-12345; Б - комплекс с CHFI-2; В - комплекс с CHFI-1245. Структуры ингибиторов получены в результате МД-симуляции. Взаимодействующие боковые цепи аминокислотных остатков трипсина (зеленый) и ингибиторов (голубые) показаны шариками и палочками. При моделировании взаимодействия CHFI с фXIa Арг34 ингибитора также оказался в активном сайте протеазы, но сравнительно далеко от каталитического серина. Кроме того, значение энергетической функции было также ниже, по сравнению со значениями, полученными для комплекса CHFI-трипсин. Этим, вероятно, может объясняться увеличение константы ингибирования фактора XIa СHFI (5.4 ± 0.2 мкМ) на три порядка, по сравнению с Ki трипсина (1.3 ± 0.2 нМ). В случае взаимодействия CHFI-1245 с фXIa рассчитанное положение ингибитора было далеко от активного сайта протеазы и дополнительно 64 стабилизировалось солевыми мостиками (рис. 18 Б). Существование альтернативного сайта связывания CHFI-1245 на поверхности фXIa может служить объяснением отсутствия ингибирующей активности CHFI-1245 в отношении фXIa в хромогенном тесте (табл. 4, рис. 14). Взаимодействие изолированной протеаза-связывающей петли (пептид CHFI-2) c фXIa было сходным со случаем взаимодействия с трипсином. Пептид занял позицию в активном сайте фактора (рис.18 В). Комплексы CHFI-фXIIa и CHFI-1245 (мутант с заменой Цис29Асп)-фXIIa также были сходными с их комплексами с трипсином (рис. 18 Г, Д): протеаза связывающая петля ингибиторов оказывалась в каталитическом сайте фXIIa. При моделировании комплекса CHFI-2-фXIIa позиция пептида была вне активного сайта фактора и была стабилизирована гидрофобными взаимодействиями (рис. 18 Е). 65 Рисунок 18. Комплексы фXIa (А, Б и В) и фXIIa (Г, Д и Е) с ингибиторами (CHFI-12345 – А, Г; CHFI-1245 – Б, Д; CHFI-2 – В, Е), полученные в результате белок-белкового докинга. Структуры ингибиторов получены в результате МД-симуляции. Взаимодействующие боковые цепи 66 аминокислотных остатков трипсина (зеленый) и показаны шариками и палочками. ингибиторов (голубые) 67 Глава 4. Обсуждение В данной работе мы показали, что при образовании комплекса CHFI-фXIIa взаимодействия между участками белков, не относящимися к протеазасвязывающей петле и каталитическому центру, возможно, вносят вклад в специфичность и силу связывания. Таким образом, CHFI, вероятно, первый канонический ингибитор, протеаза-связывающей петли которого не достаточно для ингибирования целевой протеазы: по нашим данным, циклический пептид CHFI-2 не проявляет ингибирующей активности в отношении фXIIa. Более того, результаты докинга CHFI-2 и фXIIa показали, что пептид, вероятно, связывается не с активным сайтом протеазы. Это неожиданный результат для канонического ингибитора, т.к. известно, что изолированные протеаза-связывающие петли таких ингибиторов действуют обуславливают циклический как независимые взаимодействие пептид, с структурные ингибируемой представляющий собой элементы протеазой. и Например, изолированную протеаза- связывающую петлю SFTI-1 не только сохраняет ингибирующую активность в отношении трипсина (Ki=0,5 нМ), но и превосходит по активности полноразмерный ингибитор (Ki=19 нМ) [102]. CHFI-2 (изолированная протеаза-связывающая петля CHFI) богата пролином и, поэтому обладает жесткой конформацией. Нашей начальной гипотезой было то, что несмотря на наличие трех пролинов, изолированная петля могла бы оказаться излишне гибкой, по сравнению с соответствующим участком полноразмерного ингибитора. Подобная конформационная подвижность могла бы отразиться на взаимодействии с фXIIa (более тесном, т.к. Ki=1,1 ± 0,2 нМ) и, предположительно, должна была бы меньше повлиять на слабое взаимодействие с фXIa (5,4 ± 0,2 мкМ). Поэтому нами была проверена ингибирующая активность CHFI-2 в отношении протеаз, которые специфически ингибируются CHFI (трипсин и фXIIa) и фXIa, ингибирующая активность в отношении которого значительно ниже. Для предсказания характера взаимодействия CHFI-2 с этими протеазами были использованы вычислительные методы: МД и докинг. 68 По результатам МД-симуляции наша гипотеза об излишней гибкости изолированной протеаза-связывающей петли не подтвердилась, напротив, по расчетам, структура пептида должна быть жесткой и не имеет серьезных отличий от петли в нативном ингибиторе. Единственным небольшим изменением, по результатам МД расчетов, было небольшое изменение угла между альфаспиралями, фланкирующими петлю, по сравнению с положением соответствующих спиралей в полноразмерном CHFI (рис. 15 В). Таким образом, результаты расчетов не подтвердили нашу гипотезу об избыточной гибкости изолированной протеаза-связывающей петли. Результаты измерения ингибирующей активности пептида CHFI-2 согласуются с литературными данными об изолированных протеаза-связывающих петлях канонических ингибиторов [102,103]. Наши экспериментальные данные позволяют заключить, что изолированная протеаза-связывающая петля CHFI частично сохраняет ингибирующую активность и может действовать как независимый структурный элемент. CHFI-2 сохраняет ингибирующую активность в отношении фXIa, хотя константа ингибирования (94 ± 11 мкМ) и возросла, примерно, в 20 раз, по сравнению с полноразмерным CHFI (Ki=5,4 ± 0,2 мкМ). CHFI-2 также сохранил способность ингибировать трипсин, однако различие в константах ингибирования изолированной петли и полноразмерного ингибитора оказалось даже выше, чем в случае фXIa (12 ± 2 мкM и 1,3 ± 0,2 нM, соответственно). Если рассмотреть экспериментальные данные и результаты МДсимуляции в комплексе, по можно предположить, что изолированная протеазасвязывающая петля находилась в активной конформации, т.к. CHFI-2 ингибировал трипсин и фXIa в хромогенном тесте. Результаты докинга согласуются с экспериментальными данными , поскольку расщепляемая пептидная связь (между Арг34 и Лей35) находилась в каталитическом сайте как при взаимодействии с трипсином, так и с фXIa. Неожиданным результатом явилось то, что CHFI-2 не ингибировал фXIIa в хромогенном тесте. Поскольку пептид, предположительно, находился в активной 69 конформации, отсутствие ингибирования может объясняться некорректным положением расщепляемой пептидной связи протеаза-связывающей петли относительно активного сайта фXIIa. Мы предполагаем, что корректное положение протеаза-связывающей петли CHFI в щели активного сайта фXIIa обеспечивается взаимодействиями непетельных участков ингибитора с фXIIa за пределами его активного сайта. С данной гипотезой согласуются с результатами докинга CHFI-2 и фXIIa. Наиболее энергетически выгодная позиция пептида находилась вне активного сайта модельной структуры фXIIa (рис. 18 Е). Однако, с другой стороны, непропорциональная потеря ингибирующей активности изолированной протеаза-связывающей петли в отношении фXIIa по сравнению с трипсином и фXIa может также частично обуславливаться заменой Цис29 на Асп, а также отсутствием стабилизации за счет взаимодействия петли с другими частями ингибитора. Для прояснения возможных причин отсутствия ингибирующей активности CHFI-2 в отношении фXIIa, вклад стабилизации протеаза-связывающей петли CHFI за счет третьей дисульфидной связи был исследован экспериментально в хромогенных тестах активности фXIIa, фXIa и трипсина в присутствии мутанта CHFI-1245 (полноразмерный ингибитор с заменой Цис29Асп и, как следствие, разрушенной третьей дисульфидной связью). Данный мутант также является контролем для замены Цис29Асп в пептиде CHFI-2. CHFI-1245 показал сниженную способность ингибировать фXIIa и трипсин (Ki = 50 ± 8 и 250 ± 20 нM, соответственно) по сравнению с полноразмерным ингибитором (Ki = 1,0 ± 0,1 и 1,3 ± 0,2 нM, соответственно). Неожиданным результатом стало то, что CHFI-1245 практически не ингибировал фXIa (Ki = 490 ± 110 мкМ). Результаты докинга позволяют объяснить это наличием альтернативного (вне каталитического сайта) сайта связывания CHFI-1245на поверхности фXIa (рис. 18 Б). Тем не менее, сохраняющаяся пониженная ингибирующая активность CHFI-1245 в отношении фXIIa и трипсина позволяет предположить, что стабилизация протеаза-связывающей петли за счет третьей дисульфидной связи 70 вносит вклад во взаимодействие CHFI с активным сайтом фXIIa, но в то же время замена Цис29Асп не может расцениваться как единственная причина потери ингибирующей активности CHFI-2 в отношении фXIIa. Данные ферментативной кинетики позволяют предположить, что либо участок CHFI между Гли39 и Тре108 участвует во взаимодействии с фXIIa, либо четвертая дисульфидная связь важна для формирования третичной структуры CHFI. Разрушение первой и пятой дисульфидной связи (и удаление соответствующих участков белка) не влияет на взаимодействие укороченного ингибитора с фXIIa. Используя конформационный подход к изучению связи структуры ингибитора и его ингибирующей активности [104], а также данные о сохранении ингибирующей активности у ранее описанный мутанте CHFI, укороченном на 11 аминокислотных остатков с мы создали N-конца [58], и исследовали ингибирующую активность четырех укороченных мутантов CHFI в сравнении с ингибитором дикого типа. Укороченные мутанты CHFI-1234 (Ki = 1,0 ± 0,3 нМ в отношении FXIIa) и CHFI-2345 (Ki = 1,0 ± 0,2 нМ) сохраняют ингибирующую активность на уровне полноразмерного CHFI (Ki = 1,0 ± 0,1 нМ); что согласуется с данными о первом укороченном мутанте CHFI [58]. Мутант CHFI-234 представляет собой объединений изменений, внесенных в CHFI-1234 и CHFI-2345. Данный мутант имеет константу ингибирования фXIIa 3,2 ± 0,4 нМ, что статистически не значимо отличается от Ki CHFI-1234, CHFI12345 и CHFI-2345 при уровне значимости р< 0,01(p = 0,0013; рис. 12). Сходные результаты были получены для этого мутанта и в хромогенном тесте ингибирования трипсина (табл. 3 и рис. 13). Взятые вместе эти данные позволяют заключить, что первые 11 N-концевые и 24 последние С-концевые аминокислотные остатки CHFI, а также первая и пятая дисульфидные связи не участвуют во взаимодействии с фXIIa и трипсином. Следовательно, CHFI-234 – это минимальный фрагмент CHFI, сохраняющий ингибирующую активность в 71 отношении фXIIa, а CHFI-2 может действовать как независимый структурный элемент, способный ингибировать трипсин и фXIa. Технической, но, тем не менее, критически важной частью данного исследования было получить функционально активный рекомбинатный CHFI и его мутантные варианты в E. coli. Описанные в литературе подходы к получению рекомбинантного CHFI в прокариотической экспрессионной системе (E. coli) не позволяли получать функционально активный ингибитор, т.к. ходе экспрессии формировались тельца включения дисульфидных связей [71], для [58,105]. его Т.к. корректного CHFI содержит фолдинга пять требуется окислительная среда [106], в то время как в цитоплазме E. coli среда восстановительная [107]. Традиционно используемые экспрессионные штаммы E. coli, например, BL21 DE3, которые ранее был использован для получения рекомбинантного CHFI [58,105] не обеспечивают оптимальных условий для формирования дисульфидных связей вследствие работы системы поддержания клеточного редокс-гомеостаза тиоредоксинами [107]. Чтобы преодолеть данное ограничение для экспрессии CHFI и его мутантов нами был выбран штаммпродуцент E. coli Rosetta-gami 2 DE3, с измененной активностью тиоредоксин- и глюторедоксин-зависимых систем поддержания редокс-гомеостаза [108]. Таким образом, растворимая экспрессия CHFI и его мутантов, которой нам удалось добиться в экспериментах согласуется с литературными данными о применимости штамма E. coli Rosetta-gami 2 DE3 [109]. Подводя итог обсуждения наших результатов, мы приходим к следующему. Взаимодействия вне активного сайта фXIIa и протеаза-связывающей петли CHFI вносят вклад в силу и специфичность связывания, поскольку изолированная протеаза-связывающая петля не ингибирует фXIIa, но сохраняет частичную активность в отношении других протеаз, таких как фXIa и трипсин. Полученные данные позволяют предположить, что ингибирования фактора XIIa CHFI происходит по стандартному механизму [10], но с обязательным участием некоторых участков CHFI вне протеаза-связывающей петли. Однако с трипсином 72 и фXIa CHFI взаимодействует по стандартному механизму, в котором протеазасвязывающая петля играет ключевую роль. 73 Выводы 1. Разработанный нами протокол экспрессии CHFI и его мутантов в E. coli штамм Rosetta-gami 2 DE3 при температуре 25 °С позволяет получить данный рекомбинантный ингибитор в частично растворимой, функционально активной форме и выделить после однофазной очистки препараты белков с чистотой выше 99% по электрофорезу CHFI действует в полиакриламидном геле. 2. Изолированная протеаза-связывающая петля как независимый структурный элемент и ингибирует сериновые протеазы трипсин и фXIa. ингибирующую Минимальный активность в фрагмент отношении CHFI, фXIIa, сохраняющий образован аминокислотными остатками 12-108 (1BEA, PDB). 3. Протеаза-связывающая петля CHFI принимает участие во взаимодействии с сериновыми протеазами, но не обуславливает ингибирующую активность CHFI в отношении фXIIa. 74 Благодарности Я глубоко признательна моему научному руководителю Михаилу Александровичу Пантелееву и директору Центра теоретических проблем физикохимической фармакологии РАН Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову, а также д. б.н. Владимиру Глебовичу Лунину за любезно предоставленную плазмиду с последовательностью гена CHFI, а так же Алене Викторовне Коршуновой и коллективам лабораторий физической биохимии крови Гематологического научного центра, биофизики и клеточного гемостаза и тромбоза Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева за всестороннюю методическую поддержку. 75 Список литературы 1. Tripathi L.P., Sowdhamini R. Genome-wide survey of prokaryotic serine proteases: analysis of distribution and domain architectures of five serine protease families in prokaryotes. // BMC Genomics. 2008. Vol. 9. P. 549. 2. Smith S.A. et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. Vol. 103, № 4. P. 903–908. 3. Kannemeier C. et al. Extracellular RNA constitutes a natural procoagulant cofactor in blood coagulation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. Vol. 104, № 15. P. 6388–6393. 4. Renné T. The procoagulant and proinflammatory plasma contact system. // Semin. Immunopathol. 2012. Vol. 34, № 1. P. 31–41. 5. Nossel H.L. et al. Inhibition of Hageman factor activation. // J. Clin. Invest. 1968. Vol. 47, № 5. P. 1172–1180. 6. Hsu L.C. Heparin-coated cardiopulmonary bypass circuits: current status. // Perfusion. 2001. Vol. 16, № 5. P. 417–428. 7. Renné T. et al. Defective thrombus formation in mice lacking coagulation factor XII. // J. Exp. Med. 2005. Vol. 202, № 2. P. 271–281. 8. Yau J.W. et al. Selective depletion of factor XI or factor XII with antisense oligonucleotides attenuates catheter thrombosis in rabbits. // Blood. 2014. 9. Leung P.Y. et al. Inhibition of Factor XII-Mediated Activation of Factor XI Provides Protection Against Experimental Acute Ischemic Stroke in Mice. // Transl. Stroke Res. 2012. Vol. 3, № 3. P. 381–389. 10. Laskowski Jr. M., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Annu Rev Biochem. 1980/01/01 ed. 1980. Vol. 49. P. 593–626. 11. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. Vol. 27, № 2. P. 157–162. 12. Farady C.J., Craik C.S. Mechanisms of macromolecular protease inhibitors. // Chembiochem. 2010. Vol. 11, № 17. P. 2341–2346. 76 13. Zakharova E., Horvath M.P., Goldenberg D.P. Structure of a serine protease poised to resynthesize a peptide bond. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 27. P. 11034–11039. 14. Dodson G. Catalytic triads and their relatives // Trends Biochem. Sci. 1998. Vol. 23, № 9. P. 347–352. 15. Frey P., Whitt S., Tobin J. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases // Science (80-. ). 1994. Vol. 264, № 5167. P. 1927–1930. 16. Warshel A., Papazyan A. Energy considerations show that low-barrier hydrogen bonds do not offer a catalytic advantage over ordinary hydrogen bonds. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. Vol. 93, № 24. P. 13665–13670. 17. Ratnoff O.D., Davie E.W., Mallett D.L. Studies on the action of Hageman factor: evidence that activated Hageman factor in turn activates plasma thromboplastin antecedent. // J. Clin. Invest. 1961. Vol. 40, № 15. P. 803–819. 18. Fuhrer G. et al. FXII. // Blut. 1990. Vol. 61, № 5. P. 258–266. 19. Mutch N.J., Waters E.K., Morrissey J.H. Immobilized transition metal ions stimulate contact activation and drive factor XII-mediated coagulation. // J. Thromb. Haemost. 2012. Vol. 10, № 10. P. 2108–2115. 20. Vanwildemeersch M. et al. The anti-angiogenic His/Pro-rich fragment of histidine-rich glycoprotein binds to endothelial cell heparan sulfate in a Zn2+dependent manner. // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 15. P. 10298–10304. 21. McMullen B.A., Fujikawa K. Amino acid sequence of the heavy chain of human alpha-factor XIIa (activated Hageman factor). // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, № 9. P. 5328–5341. 22. Ratnoff O.D. Studies on the inhibition of ellagic acid-activated Hageman factor (factor XII) and Hageman factor fragments. // Blood. 1981. Vol. 57, № 1. P. 55– 58. 23. De Agostini A. et al. Inactivation of factor XII active fragment in normal plasma. Predominant role of C-1-inhibitor. // J. Clin. Invest. 1984. Vol. 73, № 6. P. 1542– 1549. 24. Akiyama H. et al. Mechanism of activation of coagulation factor XI by factor XIIa studied with monoclonal antibodies. // J. Clin. Invest. 1986. Vol. 78, № 6. P. 1631–1637. 77 25. Di Scipio R.G., Kurachi K., Davie E.W. Activation of human factor IX (Christmas factor). // J. Clin. Invest. 1978. Vol. 61, № 6. P. 1528–1538. 26. Muszbek L. et al. Factor XIII: a coagulation factor with multiple plasmatic and cellular functions. // Physiol. Rev. 2011. Vol. 91, № 3. P. 931–972. 27. Hoffman M., Monroe D.M. A cell-based model of hemostasis. // Thromb. Haemost. 2001. Vol. 85, № 6. P. 958–965. 28. Davie E.W., Fujikawa K. Basic mechanisms in blood coagulation. // Annu. Rev. Biochem. 1975. Vol. 44. P. 799–829. 29. Anisuzzaman et al. Longistatin, a plasminogen activator, is key to the availability of blood-meals for ixodid ticks. // PLoS Pathog. 2011. Vol. 7, № 3. P. e1001312. 30. Stormorken H., Gjoennaess H., Laake K. Interrelations between the clotting and kinin systems. Activation of factor VII involving prekallikrein-kallikrein. A review. // Haemostasis. 1973. Vol. 2, № 6. P. 245–252. 31. Suontaka A.M. et al. Occurrence of cold activation of transfusion plasma during storage at +4 degrees C. // Vox Sang. 2005. Vol. 88, № 3. P. 172–180. 32. Konings J. et al. Factor XIIa regulates the structure of the fibrin clot independently of thrombin generation through direct interaction with fibrin. // Blood. 2011. Vol. 118, № 14. P. 3942–3951. 33. Ichinose A., Fujikawa K., Suyama T. The Activation of Pro-urokinase by Plasma Kallikrein and Its Inactivation by Thrombin // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261. P. 3486–3489. 34. Ratnoff O.D., Colopy J.E. A familial hemorrhagic trait associated with a deficiency of a clot-promoting fraction of plasma. // J. Clin. Invest. 1955. Vol. 34, № 4. P. 602–613. 35. Lämmle B. et al. Thromboembolism and bleeding tendency in congenital factor XII deficiency--a study on 74 subjects from 14 Swiss families. // Thromb. Haemost. 1991. Vol. 65, № 2. P. 117–121. 36. Wagenaar-Bos I.G. a, Hack C.E. Structure and function of C1-inhibitor. // Immunol. Allergy Clin. North Am. 2006. Vol. 26, № 4. P. 615–632. 37. Pixley R. a, Schapira M., Colman R.W. The regulation of human factor XIIa by plasma proteinase inhibitors. // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260, № 3. P. 1723–1729. 78 38. Vestergaard A.B. et al. Histidine-rich glycoprotein inhibits contact activation of blood coagulation. // Thromb. Res. 1990. Vol. 60, № 5. P. 385–396. 39. MacQuarrie J.L. et al. Histidine-rich glycoprotein binds factor XIIa with high affinity and inhibits contact-initiated coagulation. // Blood. 2011. Vol. 117, № 15. P. 4134–4141. 40. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № Database issue. P. D343–D350. 41. Huntington J. a, Read R.J., Carrell R.W. Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation. // Nature. 2000. Vol. 407, № 6806. P. 923–926. 42. Sanchez J. et al. Control of contact activation on end-point immobilized heparin: the role of antithrombin and the specific antithrombin-binding sequence. // J. Biomed. Mater. Res. 1995. Vol. 29, № 5. P. 655–661. 43. Sanchez J. et al. Studies of adsorption, activation, and inhibition of factor XII on immobilized heparin. // Thromb. Res. 1998. Vol. 89, № 1. P. 41–50. 44. Bäck J. et al. Distinctive regulation of contact activation by antithrombin and C1inhibitor on activated platelets and material surfaces. // Biomaterials. 2009. Vol. 30, № 34. P. 6573–6580. 45. Schousboe I. Binding of activated Factor XII to endothelial cells affects its inactivation by the C1-esterase inhibitor. // Eur. J. Biochem. 2003. Vol. 270, № 1. P. 111–118. 46. Simantov R. et al. Histidine-rich glycoprotein inhibits the antiangiogenic effect of thrombospondin-1. // J. Clin. Invest. 2001. Vol. 107, № 1. P. 45–52. 47. Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors // Nucleic Acids Res. 2011/11/17 ed. 2012. Vol. 40, № Database issue. P. D343–D350. 48. Cheng Q. The Group B Streptococcal C5a Peptidase Is Both a Specific Protease and an Invasin // Infect. Immun. 2002. Vol. 70, № 5. P. 2408–2413. 49. Makinoshima H., Glickman M.S. Site-2 proteases in prokaryotes: regulated intramembrane proteolysis expands to microbial pathogenesis. // Microbes Infect. 2006. Vol. 8, № 7. P. 1882–1888. 79 50. Carruthers V.B., Blackman M.J. A new release on life: emerging concepts in proteolysis and parasite invasion. // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 55, № 6. P. 1617– 1630. 51. Krishnamoorthi R., Gong Y.X., Richardson M. A new protein inhibitor of trypsin and activated Hageman factor from pumpkin (Cucurbita maxima) seeds. // FEBS Lett. 1990. Vol. 273, № 1-2. P. 163–167. 52. Campos I.T.N. et al. Infestin, a thrombin inhibitor presents in Triatoma infestans midgut, a Chagas’ disease vector: gene cloning, expression and characterization of the inhibitor. // Insect Biochem. Mol. Biol. 2002. Vol. 32, № 9. P. 991–997. 53. Delaria K.A. et al. Characterization of placental bikunin, a novel human serine protease inhibitor. // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, № 18. P. 12209–12214. 54. Earl S.T.H. et al. Identification and characterisation of Kunitz-type plasma kallikrein inhibitors unique to Oxyuranus sp. snake venoms. // Biochimie. 2012. Vol. 94, № 2. P. 365–373. 55. Oliva M.L. et al. Leucaena leucocephala serine proteinase inhibitor: primary structure and action on blood coagulation, kinin release and rat paw edema. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1477, № 1-2. P. 64–74. 56. Hayashi K. et al. Inhibition of serine proteases of the blood coagulation system by squash family protease inhibitors. // J. Biochem. 1994. Vol. 116, № 5. P. 1013– 1018. 57. Ulmer J.S. et al. Ecotin is a potent inhibitor of the contact system proteases factor XIIa and plasma kallikrein. // FEBS Lett. 1995. Vol. 365, № 2-3. P. 159–163. 58. Hazegh-Azam M. et al. The corn inhibitor of activated Hageman factor: purification and properties of two recombinant forms of the protein. // Protein Expr. Purif. 1998. Vol. 13, № 2. P. 143–149. 59. Luthy J.A. et al. Detailed mechanism of interaction of bovine -trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz). I. Stopped flow measurements. // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, № 5. P. 1760–1771. 60. Buczek O. et al. Analysis of serine proteinase-inhibitor interaction by alanine shaving. // Protein Sci. 2002. Vol. 11, № 4. P. 806–819. 61. Laskowski M., Qasim M.A. What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes? // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1477, № 1-2. P. 324–337. 80 62. Ardelt W., Laskowski M. Effect of single amino acid replacements on the thermodynamics of the reactive site peptide bond hydrolysis in ovomucoid third domain. // J. Mol. Biol. 1991. Vol. 220, № 4. P. 1041–1053. 63. Krowarsch D. et al. Canonical protein inhibitors of serine proteases // Cell Mol Life Sci. 2003/11/20 ed. 2003. Vol. 60, № 11. P. 2427–2444. 64. Nielsen K.J. et al. An 1H NMR determination of the three-dimensional structures of mirror-image forms of a Leu-5 variant of the trypsin inhibitor from Ecballium elaterium (EETI-II). // Protein Sci. 1994. Vol. 3, № 2. P. 291–302. 65. Beuning L.L., Spriggs T.W., Christeller J.T. Evolution of the proteinase inhibitor I family and apparent lack of hypervariability in the proteinase contact loop. // J. Mol. Evol. 1994. Vol. 39, № 6. P. 644–654. 66. Betzel C. et al. Structure of the proteinase inhibitor eglin c with hydrolysed reactive centre at 2.0 A resolution. // FEBS Lett. 1993. Vol. 317, № 3. P. 185–188. 67. Shaw G.L. et al. Backbone dynamics of chymotrypsin inhibitor 2: effect of breaking the active site bond and its implications for the mechanism of inhibition of serine proteases. // Biochemistry. 1995. Vol. 34, № 7. P. 2225–2233. 68. Liu J. et al. Internal mobility of reactive-site-hydrolyzed recombinant Cucurbita maxima trypsin inhibitor-V characterized by NMR spectroscopy: evidence for differential stabilization of newly formed C- and N-termini. // Biochemistry. 1996. Vol. 35, № 38. P. 12503–12510. 69. Krishnamoorthi R., Lin C.L., VanderVelde D. Structural consequences of the natural substitution, E9K, on reactive-site-hydrolyzed squash (Cucurbita maxima) trypsin inhibitor (CMTI), as studied by two-dimensional NMR. // Biochemistry. 1992. Vol. 31, № 21. P. 4965–4969. 70. Mahoney W.C. et al. Amino acid sequence and secondary structural analysis of the corn inhibitor of trypsin and activated Hageman Factor // J Biol Chem. 1984/07/10 ed. 1984. Vol. 259, № 13. P. 8412–8416. 71. Behnke C.A. et al. Structural determinants of the bifunctional corn Hageman factor inhibitor: x-ray crystal structure at 1.95 A resolution // Biochemistry. 1998/11/04 ed. 1998. Vol. 37, № 44. P. 15277–15288. 72. Wang Y. et al. Cn3D: sequence and structure views for Entrez. // Trends Biochem. Sci. 2000. Vol. 25, № 6. P. 300–302. 81 73. Hojima Y., Pierce J. V, Pisano J.J. Hageman factor fragment inhibitor in corn seeds: purification and characterization. // Thromb. Res. 1980. Vol. 20, № 2. P. 149–162. 74. Swartz M.J. et al. Isolation and characterization of trypsin inhibitor from opaque-2 corn seeds // J Biol Chem. 1977/11/25 ed. 1977. Vol. 252, № 22. P. 8105–8107. 75. Burkhard R.K. et al. Thermodynamic measurements on the interaction of porcine trypsin with single- and two-chain trypsin inhibitors from corn seeds // J Agric Food Chem. 1979/03/01 ed. 1979. Vol. 27, № 2. P. 452–454. 76. Lei M.G., Reeck G.R. Resynthesis by factor XIIa of the trypsin-cleaved peptide bond in the corn protease inhibitor // Thromb Res. 1987/01/01 ed. 1987. Vol. 45, № 1. P. 87–94. 77. Li J. et al. A small trypsin inhibitor from the frog of Odorrana grahami // Biochimie. 2008/05/13 ed. 2008. Vol. 90, № 9. P. 1356–1361. 78. Li J. et al. Multiple bombesin-like peptides with opposite functions from skin of Odorrana grahami // Genomics. 2007/01/06 ed. 2007. Vol. 89, № 3. P. 413–418. 79. Ho S.N. et al. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. 1989/04/15 ed. 1989. Vol. 77, № 1. P. 51–59. 80. Froger A., Hall J.E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method // J Vis Exp. 2008/11/11 ed. 2007. № 6. P. 253. 81. Berman H.M. et al. The Protein Data Bank. // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, № 1. P. 235–242. 82. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: visual molecular dynamics. // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14, № 1. P. 33–38, 27–28. 83. Kabsch W., Sander C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. // Biopolymers. 1983. Vol. 22, № 12. P. 2577–2637. 84. Phillips J.C. et al. Scalable molecular dynamics with NAMD // J Comput Chem. 2005. Vol. 26, № 16. P. 1781–1802. 85. Best R.B. et al. Optimization of the additive CHARMM all-atom protein force field targeting improved sampling of the backbone phi, psi and side-chain chi(1) and chi(2) dihedral angles // J Chem Theory Comput. 2012. Vol. 8, № 9. P. 3257– 3273. 82 86. V. Sadovnichy Vl. Voevodin, and V. Opanasenko A.T. “Lomonosov”: Supercomputing at Moscow State University. In Contemporary High Performance Computing: From Petascale toward Exascale (Chapman & Hall/CRC Computational Science) // CRC Press. Boca Raton, USA. 2013. P. 283–307. 87. Boratyn G.M. et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. // Nucleic Acids Res. 2013. Vol. 41, № Web Server issue. P. W29–W33. 88. Consortium T.U. Update on activities at the Universal Protein Resource (UniProt) in 2013. // Nucl Acids Res. 2013. Vol. 41. P. 43–47. 89. Wu Y. et al. Structural insight into distinct mechanisms of protease inhibition by antibodies // Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. Vol. 104, № 50. P. 19784–19789. 90. Sali A., Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. // J. Mol. Biol. 1993. Vol. 234, № 3. P. 779–815. 91. Comeau S.R. et al. ClusPro: a fully automated algorithm for protein-protein docking // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № Web Server issue. P. W96–W99. 92. Comeau S.R. et al. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes // Bioinformatics. 2004. Vol. 20, № 1. P. 45– 50. 93. Raveh B., London N., Schueler-Furman O. Sub-angstrom modeling of complexes between flexible peptides and globular proteins // Proteins. 2010. Vol. 78, № 9. P. 2029–2040. 94. London N. et al. Rosetta FlexPepDock web server--high resolution modeling of peptide-protein interactions // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39, № Web Server issue. P. W249–W253. 95. Fradera X. et al. High-resolution crystal structures of factor XIa coagulation factor in complex with nonbasic high-affinity synthetic inhibitors // Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2012. Vol. 68, № Pt 4. P. 404–408. 96. Chelliah V., Blundell T.L., Fernández-Recio J. Efficient restraints for proteinprotein docking by comparison of observed amino acid substitution patterns with those predicted from local environment. // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 357, № 5. P. 1669–1682. 97. Kozakov D. et al. How good is automated protein docking? // Proteins. 2013. Vol. 81, № 12. P. 2159–2166. 83 98. Cheng T.M., Blundell T.L., Fernandez-Recio J. pyDock: electrostatics and desolvation for effective scoring of rigid-body protein-protein docking // Proteins. 2007. Vol. 68, № 2. P. 503–515. 99. Jimenez-Garcia B., Pons C., Fernandez-Recio J. pyDockWEB: a web server for rigid-body protein-protein docking using electrostatics and desolvation scoring // Bioinformatics. 2013. Vol. 29, № 13. P. 1698–1699. 100. Bao W.-J. et al. Highly efficient expression and purification system of small-size protein domains in Escherichia coli for biochemical characterization. // Protein Expr. Purif. 2006. Vol. 47, № 2. P. 599–606. 101. Dahl A.C., Chavent M., Sansom M.S. Bendix: intuitive helix geometry analysis and abstraction // Bioinformatics. 2012. Vol. 28, № 16. P. 2193–2194. 102. McBride J.D. et al. Peptide mimics of the Bowman-Birk inhibitor reactive site loop // Biopolymers. 2002/09/27 ed. 2002. Vol. 66, № 2. P. 79–92. 103. Brauer A.B. et al. The (1)H-NMR solution structure of the antitryptic core peptide of Bowman-Birk inhibitor proteins: a minimal canonical loop // J Biomol Struct Dyn. 2002/07/30 ed. 2002. Vol. 20, № 1. P. 59–70. 104. Mucsi Z. et al. Structure-oriented rational design of chymotrypsin inhibitor models // Protein Eng. 2003/10/16 ed. 2003. Vol. 16, № 9. P. 673–681. 105. Chen Z.Y. et al. Inhibition of plant-pathogenic fungi by a corn trypsin inhibitor overexpressed in Escherichia coli // Appl Env. Microbiol. 1999/03/02 ed. 1999. Vol. 65, № 3. P. 1320–1324. 106. Tu B.P., Weissman J.S. Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences // J Cell Biol. 2004/02/06 ed. 2004. Vol. 164, № 3. P. 341–346. 107. Toledano M.B. et al. The system biology of thiol redox system in Escherichia coli and yeast: differential functions in oxidative stress, iron metabolism and DNA synthesis // FEBS Lett. 2007/07/31 ed. 2007. Vol. 581, № 19. P. 3598–3607. 108. Salinas G. et al. Tuned Escherichia coli as a host for the expression of disulfiderich proteins // Biotechnol J. 2011/05/14 ed. 2011. Vol. 6, № 6. P. 686–699. 109. Faulkner M.J. et al. Functional plasticity of a peroxidase allows evolution of diverse disulfide-reducing pathways // Proc Natl Acad Sci U S A. 2008/05/06 ed. 2008. Vol. 105, № 18. P. 6735–6740. 84 Список сокращений и обозначений C1INH С1-ингибитор CHFI ингибитора трипсина из кукурузы (corn trypsin/factor XIIa inhibitor EGF эпидермальным фактором роста HEPES 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин]этансульфоновая кислота HMWK высокомолекулярным кининогеном HRG Гистидин-богатый гликопротеин OD оптическая плотность (optical density) АТ Антитромбин БСА бычий сывороточный альбумин ДМСО диметилсульфоксид ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота МД молекулярная динамика ПААГ полиакриламидный гель ПЦР полимеразная цепная реакция т.н. так называемый ТФ тканевый фактор фVII фактор VII фXI фактора XI фXIa активированный фактор XI фXII фактора XII фXIIa активированный фактор XII фXIII фактор XIII фXIIIа активированный фактор XIII
