На правах рукописи Специальность 03.01.04 – «Биохимия» АВТОРЕФЕРАТ

На правах рукописи
СУХАНОВА Евгения Ивановна
ИНДУКЦИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ
ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ
ДРОЖЖЕЙ DIPODASCUS MAGNUSII
Специальность 03.01.04 – «Биохимия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
МОСКВА – 2011
Работа выполнена в лаборатории биологического окисления
Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор
Р.А. Звягильская
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор
Е.П. Феофилова
доктор биологических наук,
профессор
Г.Д. Миронова
Ведущая организация:
НИИ физико-химической
биологии им. А.Н. Белозерского при
Московском государственном
университете им. М.В. Ломоносова
Защита состоится «19» мая 2011 г. в «14.00» часов на заседании диссертационного совета
(Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии
им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН
по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.
Автореферат разослан «11» апреля 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Митохондрии в клетках высших эукариот, помимо их
известной роли в энергизации клетки и общем клеточном обмене, играют решающую роль в
выборе клетки между жизнью и смертью (апоптозом). Апоптоз – это генетически
запрограммированный, четко отрегулированный, высококоординированный механизм гибели
клеток, направленный на удаление невостребованных, поврежденных, инфицированных,
ослабленных, закончивших свой жизненный цикл, потенциально опасных клеток. Согласно
рекомендации Номенклатурной комиссии по клеточной гибели (2009), этот вид клеточной
смерти отличается от других (некроз, аутофагия, митотическая катастрофа) набором
характерных морфологических и биохимических признаков. Интерес к апоптозу огромен,
поскольку, по крайней мере, в клетках животных, он выполняет множество функций, от
созидательных (морфогенез, онтогенез, антираковая защита и т. д.) до разрушительных
(сепсис, инфаркт миокарда, инсульт, нейродегенеративные заболевания и т. д.).
До относительно недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь высшим
многоклеточным, поскольку считалось, что одноклеточные организмы не имеют в своем
геноме генов, аналогичных тем, которые кодируют апоптотические факторы многоклеточных
и поскольку существовал скептицизм относительно физиологической целесообразности и
эволюционных преимуществ апоптоза у одноклеточных, в том числе и дрожжей. Однако
сейчас установлено, что дрожжи в природе живут в виде сообществ (колонии, биопленки).
Известны вещества (ароматические спирты), ответственные за коммуникацию клеток.
Описаны многочисленные случаи гибели (в основном исследования проводились на дрожжах
S. cerevisiae) по механизму апоптоза под действием различных неблагоприятных внешних
факторов и внутриклеточных дефектов. Выявлен ряд апоптотических факторов, некоторые из
которых (эндонуклеаза G, цитохром с, белок, подобный протеазе HtrA) локализованы, как и в
митохондриях животных, в межмембранном пространстве и выход которых при повреждении
внешней мембраны означает начало необратимой стадии апоптоза, приводящей в конечном
итоге к гибели клетки. Однако вопрос – каким образом осуществляется выход
апоптотических факторов из дрожжевых митохондрий до недавнего времени не имел ответа.
Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов
из
межмембранного
пространства.
Один
из
них
включает
в
себя
активацию,
конформационную перестройку, встраивание во внешнюю мембрану митохондрий и
димеризацию проапоптотического белка Bax, члена семейства белков Bcl-2, в результате чего
образуется пора [Sheridan et al., 2008; Yamaguchi et al., 2008]. Другим механизмом выхода
1
апоптотических факторов из митохондрий является увеличение проницаемости митохондрий
в результате открытия ряда пор во внутренней митохондриальной мембране:
1) неспецифической, Ca2+/Pн-зависимой, циклоспорин А (ЦсА)-чувствительной поры,
мегаканала диаметром 2,6-2,9 нм, способного пропускать вещества с молекулярной массой до
1,5 кДа [см. Bernardi et al., 2006];
2) ЦсА-нечувствительной небелковой поры, образующейся при одновременном
добавлении к митохондриям Ca2+ и насыщенных жирных кислот и отличающейся от
классической Ca2+/Pн-зависимой поры отсутствием специфичности по отношению к
дивалентным катионам и способностью спонтанно закрываться [Mironova et al., 2001; Sultan
and Sokolove, 2001];
3)
ЦсА-чувствительной
поры,
индуцируемой
высокими
концентрациями
неорганического фосфата при кислых значениях рН [Kristian et al., 2001];
4) поры, открываемой в митохондриях животных (и растений) в условиях анаэробиоза
[Chavez et al., 1997; Kuzminova et al., 1998; Virolainen et al., 2002].
Открытие пор ведет к снижению мембранного потенциала, дисфункции митохондрий,
нарушению ионного гомеостаза, высокоамплитудному набуханию митохондрий и, как
следствие, выходу апоптотических факторов из митохондрий.
Дрожжевые клетки лишены белков семейства Bcl-2 (в геноме не найдены гены,
кодирующие эти белки). Практически ничего не известно об участии структурной
реорганизации крист в выходе апоптотических факторов из митохондрий. Информация же о
возможности индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий до сих
пор фрагментарна и противоречива. Известно лишь, что митохондрии S. cerevisiae содержат
неспецифическую пору (канал) [Prieto et al., 1992; 1995; 1996; Roucou et al., 1997; Manon et al.,
1998; Manon and Guerin, 1998; Gutiérrez-Aguilar et al., 2007], закрываемую при дефиците ATP.
Она имеет примерно те же размеры [Manon and Guerin, 1998], что и неспецифическая,
Ca2+/Pн-зависимая, ЦсА-чувствительная пора млекопитающих и ей приписываются те же
функции. В последнее время в нашей лаборатории было показано, что в митохондриях
дрожжей Dipodascus (ранее Endomyces) magnusii не индуцируется Ca2+/Pн-зависимая, ЦсАчувствительная пора [Дерябина и др., 2004], а митохондрии Yarrowia lipolytica лишены всех
Са2+-зависимых пор [Kovaleva et al., 2009; Ковалева и др., 2010].
Цель работы. Работа направлена на поиск условий индукции неспецифической
проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Dipodascus magnusii.
Выбор объекта исследования не случаен. Дрожжи D. magnusii, в отличие от дрожжей S.
cerevisiae,
характеризуются
ярко
выраженным
2
аэробным
типом
обмена,
содержат
многочисленные, хорошо структурированные митохондрии и полноценную дыхательную
цепь со всеми тремя пунктами энергетического обмена, напоминающую по своей структуре
дыхательную цепь млекопитающих.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать возможность индукции: а) классической Са2+-фосфат-зависимой, ЦсАчувствительной
поры;
б)
ЦсА-нечувствительной
поры,
индуцируемой
низкими
концентрациями Ca2+ и жирных кислот; в) поры, индуцируемой анаэробиозом; г) поры,
запускаемой окислительным стрессом;
2. Исследовать возможность функционирования ATP-зависимого К+-канала.
Научная новизна. На прочно-сопряженных митохондриях дрожжей D. magnusii впервые
проверены все условия индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны,
известные для митохондрий животных. Показано, что в митохондриях D. magnusii не
индуцируется
ни
Са2+-фосфат-зависимая,
циклоспорин
А-чувствительная
пора,
ни
циклоспорин А-нечувствительная пора, открываемая в митохондриях животных при
одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. В отличие от митохондрий животных и
растений,
анаэробиоз
не
индуцировал
повышенную
проницаемость
внутренней
митохондриальной мембраны дрожжей D. magnusii. Впервые показана ATP-зависимая
энергизация дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза. Прооксиданты совместно с
Са2+ (в присутствии Са2+ ионофора) – вызывали лишь снижение мембранного потенциала
митохондрий
дрожжей
«ресопрягающее»
D.
действие
magnusii,
АТР.
без
Доказано
образования
наличие
в
мегаканала.
митохондриях
Обнаружено
D.
magnusii
регулируемого К+-ATP-зависимого канала, закрываемого, как и в митохондриях животных (и
в митохондриях дрожжей Y. lipolytica) при добавлении ATP. В условиях окислительного
стресса селективный К+-ATP-зависимый канал может превращаться в неспецифическую
пору.
Практическое значение работы. Обнаруженное нами сходство ATP-зависимого К+канала (митоКАТР) митохондрий животных и дрожжей D. magnusii позволяет рассматривать
дрожжевые митохондрии в качестве перспективной модели для изучения структуры и
регуляции активности митоКАТР, которому в настоящее время отводится важная роль в
защите миокарда от последствий ишемии и для поиска новых «открывателей» канала.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской
конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и
антиоксиданты»
им.
Академика
Н.М.
Эммануэля
(2006,
Москва);
Европейских
Биоэнергетических Конференциях (EBEC) (2006, Москва; 2010, Варшава); Конгрессах FEBS
3
(2007, Вена; 2008, Афины; 2009, Прага); 24-й Международной конференции «Yeast Transport
and Energetics» (2006, Прага); 2-м Съезде микологов России с международным участием
«Современная микология в России» (2008, Москва); XXII Зимней молодежной научной
школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2010,
Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых
журналах, а также 12 тезисов докладов на конференциях.
Объем и структура работы. Работа изложена на 178 страницах печатного текста,
содержит 87 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы
(глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их
обсуждения (глав), выводов и списка цитируемой литературы (333 источника, в том числе
299 на иностранных языках).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Организм и условия выращивания. В работе использовали дрожжи Dipodascus
magnusii, штамм ВКМ-261. Клетки выращивали при 280C на роторной качалке (220 об/мин)
на полусинтетической среде [Звягильская и др., 1981], содержащей в качестве источника
углерода и энергии 1%-ый глицерин, и собирали в поздней экспоненциальной фазе роста (1012 г сырой биомассы/л).
Выделение
митохондрий
осуществляли
по
методу,
разработанному
в
нашей
лаборатории.
Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом в ячейке
(рабочий объём 1 мл) c закрытым кислородным электродом типа Кларка.
Потенциал,
генерируемый
на
внутренней
митохондриальной
мембране,
регистрировали на спектрофотометре Beckman coulter DU-650 с сафранином О в качестве
потенциал-зависимого зонда [Akerman and Wikstrom, 1976].
Набухание митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония), по
уменьшению оптической плотности митохондриальной суспензии при 540 нм.
Митохондриальный белок определяли по методу Брэдфорд [Bradford, 1976] с бычьим
сывороточным альбумином в качестве стандарта.
4
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В митохондриях дрожжей D. magnusii не индуцируется «классическая» Са2+/Рнзависимая, циклоспорин А-чувствительная пора
В работе использовали только прочно-сопряженные митохондриальные препараты. Они
сохраняли регуляцию метаболического состояния, окисляли добавленные субстраты с
высокими скоростями, высокими (порядка 4-5) величинами дыхательного контроля и
величинами ADP/O, близкими к теоретически ожидаемым. Об образовании пор(ы) судили,
как это принято в литературе, по совокупности двух параметров – снижению мембранного
потенциала (∆ψ) и высокоамплитудному набуханию митохондрий.
В нашей лаборатории ранее было показано [Дерябина и др., 2004], что митохондрии
дрожжей D. magnusii лишены классической Са2+/Pн-зависимой, ЦсА-чувствительной поры.
Однако в этой работе в качестве окисляемых субстратов использовали NAD-зависимые
субстраты (пируват + малат), что заметно снижало чувствительность системы к добавлению
прооксидантов; высокие (далекие от физиологических) концентрации Са2+ и, что важно,
высокие концентрации неорганического фосфата, который, как было показано в самое
последнее время [Yamada et al., 2009], является ингибитором поры. Поэтому нам пришлось
вновь исследовать вопрос о возможности индукции в митохондриях D. magnusii
«классической» поры. Это потребовало усовершенствования метода выделения митохондрий,
что позволило получить митохондриальные препараты, стабильные при инкубации в средах,
содержащих концентрацию фосфата на порядок более низкую, чем использовалось ранее.
При инкубации митохондрий дрожжей D. magnusii в присутствии умеренных
концентраций Ca2+ не было обнаружено снижения мембранного потенциала даже под
действием низких
концентраций
ЭГТА
(хелатора Ca2+),
препятствующего
выходу
накопленного иона и, тем самым, способствующего увеличению [Ca2+]м, что индуцирует
открытие Са2+/Pн-зависимой поры в митохондриях животных, и гидрофобного прооксиданта
фениларсиноксида, индуктора ЦсА-чувствительной поры в митохондриях животных
[Bernardi et al., 2006]. Поскольку, как было показано ранее в лаборатории, митохондрии
дрожжей D. magnusii обладают регулируемыми системами входа и выхода Ca2+ [см. Дерябина
и др., 2004], полученные данные позволили сделать вывод о том, что наличие
митохондриальной системы транспорта Ca2+ ещё недостаточно для индукции поры. В
дальнейших исследованиях мы использовали специфический Са2+ ионофор ETH129, который
при встраивании в мембраны образует селективный Са2+ канал. Сам ETH129 не влиял на
5
энергетические параметры митохондрий (скорость дыхания, величину мембранного
потенциала) и не вызывал набухания органелл. При одновременном добавлении к
митохондриям D. magnusii ионофора и умеренных концентраций Са2+, наблюдалось
ускорение дыхания в состоянии 4 и существенное снижение мембранного потенциала (Рис.
1А), свидетельствовавшие о разобщении окисления и фосфорилирования. Мембранный
потенциал частично восстанавливался добавлением неорганического фосфата, и полностью –
ЭГТА и бычьим сывороточным альбумином (БСА) (Рис. 1А), что указывало на активацию в
этих условиях Са2+/H+-обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот [Bradshaw et al.,
2001]. Са2+-ETH-зависимое снижение мембранного потенциала не было чувствительно к
действию ЦсА, ADP и Mg2+ – ингибиторов классической ЦсА-зависимой поры животных, но
частично ингибировалось АТP (Рис. 1Б). Защитное действие АТP было специфичным, т. к.
полностью снималось атрактилозидом, ингибитором транслоказы адениновых нуклеотидов
(ТАН) (не показано). Дрожжевые митохондрии не набухали в присутствии ETH129 и
2+
КЦХФ
25 нМ
Са
30 мкМ
0,16
0,12
ЭГТА 1 мМ
(БСА 1 мг/мл)
ETH
3 мкМ
0,08
0,04
0,00
-0,04
Рн
Мтх
0
А
2 мМ
200
Время, с
400
600
Мембранный потенциал (511-533 нм)
Мембранный потенциал (511-533 нм)
увеличивающихся концентраций Са2+.
2+
Са
30 мкM
0,16
ATP
200 мкM
0,12
ETH
3 мкM
0,08
0,04
КЦХФ
25 нM
ATP
500 мкM
ATP
100 мкM
0,00
-0,04
Б
Мтх
0
200
Время, с
400
Рис. 1. Влияние Ca2+, ETH129 (ETH), неорганического фосфата (Рн), ЭГТА, БСА и АТР на
мембранный потенциал митохондрий D. magnusii.
А) ЕТН129 в присутствии Са2+ снижал мембранный потенциал митохондрий, который частично
восстанавливался добавлением Рн и полностью – добавлением ЭГТА и БСА;
Б) (ЕТН129 + Са2+)-зависимое снижение мембранного потенциала частично обращалось
добавлением ATP;
Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4, 20 мкМ
сафранин О, 20 мМ Tris-сукцинат, митохондриальный белок – 0,5 мг/мл. Где указано, добавлен 25 нМ
КЦФХ (карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон, разобщитель).
Ранее было показано, что деэнергизация митохондрий животных или истощение пула
адениновых нуклеотидов [см. Bernardi et al., 2006] делает их более чувствительными к
повышенным
концентрациям
Ca2+,
вызывая
6
открытие
ЦсА-зависимой
поры.
Для
деэнергизации, дрожжевые митохондрии преинкубировали в течение 1 минуты с
антимицином А (ингибитором дыхательной цепи на уровне комплекса III) и олигомицином
(ингибитором переноса энергии, для предотвращения образования ATP). Aнтимицин А и
олигомицин полностью ингибировали дыхание в отсутствие добавленных дыхательных
субстратов, а также вызывали полный коллапс мембранного потенциала, но не набухание
митохондрий в присутствии Са2+ и ETH129 (не показано), что свидетельствовало об
отсутствии открытия поры и в этих условиях.
Для истощения внутримитохондриального пула адениновых нуклеотидов, дрожжевые
митохондрии преинкубировали с 10 мМ пирофосфатом (РР), который, как известно,
[Asimakis and Sordahl, 1981], транспортируется в митохондрии через ТАН, обмениваясь с
ATP и, тем самым, снижая его внутримитохондриальный уровень. Ответ обработанных
пирофосфатом дрожжевых митохондрий на добавление Ca2+ отличался от ответа
контрольных (необработанных) митохондрий и от митохондрий Y. lipolytica [Kovaleva et al.,
2009] тем, что мембранный потенциал снижался под действием умеренных концентраций
Са2+ без использования ЕТН129. Однако, обработанные пирофосфатом дрожжевые
митохондрии не набухали под действием умеренных концентраций Са2+, даже в присутствии
ETH129. Поэтому мы заключили, что в митохондриях D. magnusii, обработанных
пирофосфатом и, следовательно, имеющих сниженный пул внутримитохондриальных
нуклеотидов, в отличие от митохондрий животных, не индуцируется Ca2+-зависимая пора.
В отличие от митохондрий животных [Kristian et al., 2001], митохондрии D. magnusii
оказались устойчивы к действию высоких (до 10 мМ) концентраций фосфата при низких (рН
6,0) значениях рН даже в гипотонической среде. В этих условиях не было обнаружено ни
снижения величины мембранного потенциала, ни набухания митохондрий под действием
умеренных концентраций Са2+ и ионофора ЕТН129.
Таким образом, нам не удалось индуцировать Ca2+/Рн-зависимую пору в митохондриях D.
magnusii в условиях, способствующих ее открытию в митохондриях животных (в присутствии
низких концентраций ЭГТА, прооксидантов, при деэнергизации митохондрий или истощении
пула митохондриальных нуклеотидов, в присутствии высоких концентраций фосфата на фоне
сниженного значения рН).
Это сделало актуальным поиск других способов регуляции проницаемости внутренней
мембраны митохондрий дрожжей.
7
В митохондриях дрожжей D. magnusii не индуцируется
Са2+/пальмитат-зависимая пора
Из литературных данных известно [Sultan and Sokolove, 2001; Mironova et al., 2001], что
низкие концентрации Сa2+ и насыщенных жирных кислот (пальмитата или стеарата)
индуцировали в митохондриях животных открытие небелковой поры, характеризующейся
нечувствительностью к ЦсА и неорганическому фосфату. Поскольку взаимодействие жирных
кислот с митохондриями D. magnusii не исследовалось ранее, мы восполнили этот пробел.
Мы нашли, что, как и в митохондриях животных, пальмитат (аналогичные данные получены
и для других насыщенных жирных кислот – стеариновой и пентадекановой) является
эффективным разобщителем дрожжевых митохондрий, активируя дыхание в состоянии 4
(Рис. 2А) и снижая мембранный потенциал (Рис. 2Б), причем, в отличие от митохондрий
животных, дрожжевые митохондрии оказались гораздо более чувствительными к действию
жирных кислот. Разобщение, вызванное действием пальмитиновой кислоты, полностью
ингибировалось и предотвращалось БСА, связывающего жирные кислоты, и, что обнаружено
впервые, – АТР (Рис. 2В).
Это может быть связано, во-первых, с тем, что ATP является хелатором насыщенных
кислот, а во-вторых, с повторной энергизацией разобщенных митохондрий за счет энергии
гидролиза ATP. Реполяризующее действие ATP почти полностью снималось добавлением
атрактилозида и бонгкрековой кислоты.
Разобщающее
действие
жирных
кислот
промотировалось
митохондриально-
направленными мембранофильными катионами. В работе использовали SkQ1, SkQ3, C12TPP
и MitoQ, любезно предоставленные сотрудниками НИИ физико-химической биологии им.
А.Н. Белозерского. Все они являются положительно заряженными липофильными
соединениями с делокализованным зарядом, производными тетрафенилфосфония, два из них
(SkQ1 и SkQ3) содержат в качестве редокс-компонента пластохинон (компонент
фотосинтетической редокс-цепи), MitoQ – убихинон (компонент дыхательной цепи), а
C12TPP – не содержит хинона.
Мембранофильные катионы активировали, хотя и в разной степени, скорость окисления
пирувата + малата в состоянии 4 (Рис. 3А), что указывало на их разобщающий эффект.
Разобщающее действие липофильных катионов частично или полностью предотвращалось
добавлением АТР и БСА. Гораздо более высокие концентрации липофильных катионов
требовались для ингибирования дыхания дрожжевых митохондрий в состоянии 3 (не
показано).
8
Мембранный потенциал, % макс
V/V4
3,0
100
2,5
2,0
С50 = 15 мкМ
1,5
1,0
А
0
10
20
30
40
С50 = 9,3 мкM
60
40
20
0
[Пальм], мкМ
Б
6
8
10
12
[Пальм], мкM
Мембранный потенциал (511-533 нм)
0,5
80
Пальм
КЦХФ
Рис. 2. Влияние пальмитиновой кислоты
0,16
5 мкM
25 нM
(Пальм), АТР и БСА на митохондрии D. magnusii.
0,12
А) Концентрационная зависимость действия
Пальм
пальмитиновой
кислоты
на
дыхание
5 мкM
0,08
митохондрий D. magnusii в состоянии 4. Среда
инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris0,04
фосфатный буфер, 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4, 20
ATP 1 мM
0,00
мМ
Tris-пируват,
5
мМ
Tris-малат,
(БСА 1 мг/мл)
митохондриальный белок – 0,5 мг/мл.
В
Мтх
-0,04
Б) Концентрационная зависимость действия
0
200
400
Время, с
пальмитиновой
кислоты
на
мембранный
потенциал митохондрий D. magnusii;
В) Пальмитиновая кислота вызывала снижение мембранного потенциала, который полностью
восстанавливался добавлением ATP или БСА;
Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.
Все
исследуемые
дрожжевых
мембранофильные
митохондрий
(Рис.
3Б),
катионы
при
этом
снижали
мембранный
деполяризация
потенциал
мембраны
была
нечувствительной к действию антиоксидантов N-ацетилцистеина и тролокса, частично или
полностью ингибировалась и предотвращалась добавлением АТР и БСА. «Ресопрягающее»
действие ATP полностью или в значительной степени снималось добавлением ингибиторов
ТАН – атрактилозида и бонгкрековой кислоты.
При совместном действии пальмитата (аналогичное действие оказывали стеариновая и
пентадекановая кислоты) мембранофильные катионы в низких, еще неразобщающих
концентрациях, значительно усиливали вызываемое жирными кислотами разобщение
митохондрий: кривые зависимости деполяризации мембраны от концентрации кислоты в
присутствии липофильных катионов заметно сдвигались в сторону более низких
концентраций (Рис. 3В). Разобщение, вызываемое совместным действием жирной кислоты и
липофильных катионов, частично или полностью обращалось добавлением ATP и БСА.
9
С50= 8,5 мкМ
С50= 5 мкМ
2,0
С50= 4 мкМ
1,5
(4)
1,0
0,5
(2)
(1)
(3)
0
6
12
18
24
30
А
36
Мембранный потенциал, % макс
V/V4
С50= 5 мкМ
2,5
С50= 4 мкМ
100
С50= 6,2 мкМ
С50= 4,3 мкМ
80
С50= 3,8 мкМ
60
40
(2)
20
(1)
(4)
0
1
2
3
4
5
6
(3)
Б
7
[липофильные катионы], мкM
[липофильные катионы], мкM
Мембранный потенциал, % макс
С50= 9,3 мкМ
Рис. 3. Влияние липофильных катионов на
С50= 3 мкМ
100
митохондрии дрожжей D. magnusii.
С50= 3,6 мкМ
А) Концентрационные зависимости действия
80
С50= 4,7 мкМ
SkQ1 (кривая 1), С12ТРР (кривая 2), SkQ3
С50= 3,8 мкМ
60
(кривая 3) и MitoQ (кривая 4) на дыхание
митохондрий D. magnusii в состоянии 4. Состав
40
среды инкубации, как на Рис. 2А;
20
Б) Концентрационные зависимости действия
(4)
(1)
0
В
SkQ1 (кривая 1), С12ТРР (кривая 2), SkQ3
(2)(3) (5)
2
4
6
8
10
12
14
(кривая 3) и MitoQ (кривая 4) на мембранный
[Пальм], мкM
потенциал митохондрий D. magnusii;
В) Концентрационные зависимости действия пальмитиновой кислоты на мембранный потенциал
митохондрий D. magnusii в присутствии 1,5 мкМ SkQ1 (кривая 2), 2,5 мкМ С12ТРР (кривая 3), 1,5
мкМ SkQ3 (кривая 4), 1,5 мкМ MitoQ (кривая 5) и в отсутствие липофильных катионов (кривая 1);
Состав среды инкубации, как на Рис. 1.
Не исключено, что наблюдаемое нами и другими исследователями [Антоненко и др.,
2008; Skulachev et al., 2009] разобщение митохондрий под действием липофильных катионов
может быть объяснено их взаимодействием с эндогенными жирными кислотами, которые
содержатся в митохондриях.
В отличие от митохондрий животных, добавление Сa2+ к митохондриям дрожжей,
обработанных пальмитатом, не вызывало дополнительных изменений в энергетических
параметрах митохондрий (Рис. 4А). Лишь в присутствии Сa2+ ионофора ETH129 имело место
еще большее снижение мембранного потенциала, вероятнее всего за счет активации Са2+/Н+обмена, предотвращаемое добавлением БСА (Рис. 4Б). ЭГТА, хелатор Сa2+, ингибировал
деполяризацию, вызванную совместным действием Сa2+ и ETH129 (не показано). Инкубация
митохондрий с умеренными концентрациями Са2+ и пальмитиновой кислотой не вызывала
высокоамплитудного набухания митохондрий ни в отсутствие, ни в присутствии ЕТН129; в
присутствии высоких концентраций Са2+ и пальмитиновой кислоты имело место лишь
10
низкоамплитудное набухание (не показано). Следовательно, митохондрии D. magnusii
КЦХФ
25 нM
Пальм
10 мкM
Мембранный потенциал (511-533 нм)
Мембранный потенциал (511-533 нм)
лишены поры, зависимой от насыщенных жирных кислот и Сa2+.
0,12
2+
0,08
Са
100 мкM
0,04
БСА
1 мг/мл
0,00
Мтх
-0,04
0
200
Время, с
400
А
600
КЦХФ
25 нM
Пальм
10 мкM
0,16
0,12
2+
Са
100 мкM
0,08
ETH
7 мкM
0,04
БСА
1 мг/мл
0,00
Мтх
-0,04
0
Б
200
Время, с
400
600
Рис. 4. Влияние пальмитиновой кислоты (Пальм), Сa2+, БСА и ETH129 (ETH) на мембранный
потенциал митохондрий D. magnusii.
А) 100 мкМ Сa2+ не вызывал дополнительной деполяризации мембраны после действия
пальмитиновой кислоты; мембранный потенциал полностью восстанавливался БСА;
Б) Лишь при совместном действии Сa2+ и ETH129 наблюдалось дополнительное снижение
мембранного потенциала, полностью восстанавливаемое БСА;
Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.
Анаэробиоз не индуцировал повышенную проницаемость внутренней
митохондриальной мембраны D. magnusii
В митохондриях, выделенных из корней пшеницы, анаэробиоз и высокие концентрации
Са2+ индуцировали образование циклоспорин А-нечувствительной неспецифической поры с
выходом цитохрома с [Virolainen et al., 2002]. В митохондриях печени крысы в условиях
анаэробиоза, достигаемого насыщением среды инкубации азотом, и энергизации митохондрий
добавлением сукцината и ATP, 100 мкМ Са2+ вызывал образование циклосплорин Ачувствительной поры [Kuzminova et al., 1998]. На основании полученных данных авторы
сделали вывод о том, что кислород не является фактором, необходимым для открытия поры.
Мы
проверили
возможность
индукции
неспецифической
проницаемости
внутренней
митохондриальной мембраны в условиях анаэробиоза в митохондриях дрожжей D. magnusii.
Состояние анаэробиоза достигалось добавлением к митохондриям смеси субстратов –
пирувата, малата, сукцината и α-глицерофосфата. Скорость дыхания митохондрий в таких
условиях увеличивалась до максимальной (не показано), что должно было приводить к
11
быстрому исчерпыванию кислорода, т. е. возникновению гипоксии или анаэробиоза.
Действительно, при добавлении к дрожжевым митохондриям смеси субстратов, деполяризация
мембраны имела место уже на 200-400 с и мембранный потенциал восстанавливался до
исходного уровня введением микромолярных концентраций пероксида водорода (Рис. 5А).
Пероксид водорода, добавленный к митохондриям на начальной стадии инкубации,
Н2О2
0,20
10 мкМ
КЦХФ
25 нM
0,16
0,12
0,08
0,04
Н2О2
0,00
-0,04
Мтх
0
10 мкМ
200
Время, с
А
400
600
Мембранный потенциал (511-533 нм)
Мембранный потенциал (511-533 нм)
предотвращал наступление анаэробиоза (Рис. 5Б).
КЦХФ
25 нM
0,16
0,12
0,08
Н2О2
Н2О2
10 мкМ
10 мкМ
0,04
0,00
Б
Мтх
-0,04
0
200
Время, с
400
600
Рис. 5. Влияние смеси субстратов и пероксида водорода (Н2О2) на мембранный потенциал,
генерируемый митохондриями D. magnusii.
Анаэробиоз вызывал деполяризацию мембраны, которая полностью ингибировалась (А) и
предотвращалась (Б) добавлением пероксида водорода;
Состав среды инкубации, как на Рис. 1. + 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, 20 мМ Tris-αглицерофосфат. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.
Нами впервые обнаружено, что мембранный потенциал, сниженный в результате
наступления анаэробиоза (гипоксии), восстанавливался не только добавлением пероксида
водорода, но и ATP (Рис. 6А). Добавление ATP на начальной стадии инкубации митохондрий
почти полностью предотвращало индуцированную анаэробиозом деполяризацию мембраны
(Рис. 6Б). Действие АТР было специфичным, поскольку атрактилозид и бонгкрековая кислота
(ингибиторы ТАН) полностью снимали защитное действия АТР (Рис. 6В) и поскольку АDP (в
присутствии олигомицина – ингибитора синтеза АТР), в отличие от АТР, не предотвращал
деполяризацию, вызванную анаэробиозом, а лишь замедлял её.
Умеренные концентрации Ca2+ в состоянии анаэробиоза (гипоксии) на фоне АТР не
вызывали снижения мембранного потенциала, оно имело место только при одновременном
добавлении Ca2+ и ионофора ЕТН129, за счет активации Ca2+/H+-обмена, зависимого от
эндогенных жирных кислот. Но и в этом случае не наблюдалось высокоамплитудного
набухания митохондрий, т. е. образования мегаканала.
12
Н2О2
0,08
10 мкМ
0,04
ATP
1 мM
0,00
А
Мтх
-0,04
0
200
400
600
Время, с
800
1000
Рис. 6. Влияние смеси субстратов, АТР,
пероксида водорода (Н2О2), атрактилозида (Атр)
и бонгкрековой кислоты (Бонгк) на мембранный
потенциал, генерируемый митохондриями D.
magnusii.
А) Мембранный потенциал, сниженный в
результате наступления анаэробиоза, почти
полностью восстанавливался добавлением 1 мМ
АТР;
Б) 1 мМ АТР (в среде инкубации) в
значительной мере предотвращал снижение
мембранного
потенциала,
вызванного
наступлением анаэробиоза;
Мембранный потенциал (511-533 нм)
0,12
Мембранный потенциал (511-533 нм)
Мембранный потенциал (511-533 нм)
КЦХФ
25 нM
0,16
КЦХФ
25 нM
0,16
0,12
0,08
Н2О2
10 мкМ
0,04
0,00
-0,04
Б
Мтх
0
200
400
600
Время, с
800
1000
КЦХФ
25 нM
0,16
0,12
0,08
0,04
0,00
-0,04
Мтх
0
Н2О2
Атр 75 мкM ATP
10
мкМ
(Бонгк 6 мкM) 1 мM
200
400
Время, с
В
600
В) 75 мкМ атрактилозид и 6 мкМ бонгкрековая кислота полностью снимали реполяризующее
действие АТР после самопроизвольной деполяризации мембраны в результате наступления
анаэробиоза;
Состав среды инкубации, как на Рис. 5. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.
Влияние прооксидантов на митохондрии дрожжей D. magnusii
Из литературных данных известно [Bernardi et al., 2006], что окислительный стресс,
вызванный добавлением прооксидантов, способствует открытию Ca2+/Pн-зависимой поры в
митохондриях животных. Поэтому мы исследовали влияние прооксидантов на возможность
индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий D. magnusii.
Были
использованы:
фениларсиноксид
(гидрофобный
бифункциональный
SH-агент),
менадион (гидрофильный монофункциональный SH-агент), оксалоацетат (окислитель
эндогенного пула NADH), пероксид водорода, t-бутилпероксид и аскорбат в сочетании с Fe2+
– индукторы гидроксил-ион-радикала. В качестве субстрата окисления при измерении
мембранного потенциала мы использовали сукцинат, а не систему NAD-зависимых
13
субстратов, продуцирующую антиоксидант NADH, что позволило значительно «очувствить»
систему.
Менадион,
фениларсиноксид
и
оксалоацетат,
взятые
в
низких
(эмпирически
подобранных) концентрациях вызывали и существенное снижение мембранного потенциала
(Рис. 7А), частично ингибируемое восстановленным глутатионом и полностью ингибируемое
и предотвращаемое N-ацетилцистеином, БСА и АТР (Рис. 7А). Защитное действие АТР было
специфичным
и
частично
добавлением
снималось
Mg2+.
Добавление
умеренных
концентраций Са2+ на фоне неразобщающих концентраций прооксидантов не приводило к
дополнительному снижению мембранного потенциала. Мембранный потенциал снижался
только в присутствии ETH129 (Рис. 7Б), как мы теперь понимаем, за счет активации Са2+/H+-
Менадион ФАО
20 мкМ 20 мкМ
0,16
0,12
КЦХФ
25 нМ
OA
1,5 мМ
0,08
0,04
0,00
Мтх
-0,04
0
N-Ац 5 мМ
(БСА 1 мг/мл)
(АТР 100 мкМ)
200
Время, с
А
400
Мембранный потенциал (511-533 нм)
Мембранный потенциал (511-533 нм)
обмена, зависимого от эндогенных жирных кислот.
2+
Менадион ФАО
Ca
10 мкM 10 мкM 50 мкM
КЦХФ
25 нM
0,16
OA
0,5 мM
0,12
ETH
5 мкM
ЭГТА
1 мM
0,08
0,04
БСА
1 мг/мл
0,00
-0,04
Б
Мтх
0
200
Время, с
400
Рис. 7. Влияние менадиона, оксалоацетата (ОА), фениларсиноксида (ФАО), N-ацетилцистеина
(N-Aц), БСА, АТР, Са2+, ЕТН129 (ЕТН) и ЭГТА на мембранный потенциал митохондрий D. magnusii.
А) Менадион, ОА и ФАО в низких концентрациях вызывали снижение мембранного потенциала,
который полностью восстанавливался добавлением 5 мМ N-ацетилцистеина, 100 мкМ АТР и БСА в
концентрации 1 мг/мл;
Б) 5 мкМ ЕТН129 и 50 мкМ Са2+ в присутствии неразобщающих концентраций менадиона, ОА и
ФАО вызывали снижение мембранного потенциала, нечувствительное к действию ЭГТА и
восстанавливаемое добавлением БСА;
Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.
Митохондрии дрожжей D. magnusii не набухали при совместном действии ФАО,
менадиона и оксалоацетата в концентрациях, вызывающих снижение мембранного
потенциала, не набухали они и при добавлении умеренных концентраций Са2+ и ETH129, что
свидетельствовало об отсутствии открытия поры. Аналогичные данные были получены при
использовании других прооксидантов – пероксида водорода и t-бутилпероксида. Лишь
14
действие аскорбата в сочетании с FeSO4, в результате чего происходит образование
гидроксил анион-радикала, приводило к значительному снижению мембранного потенциала,
нечувствительному к действию антиоксидантов и АТР, но и в этом случае не наблюдалось
высокоамплитудного набухания митохондрий.
Таким образом, показано, что в митохондриях дрожжей D. magnusii прооксиданты
вызывали снижение мембранного потенциала, не увеличивающееся, в отличие от
митохондрий животных, от добавления умеренных
концентраций Ca2+. Снижение
мембранного потенциала, вызванное прооксидантами, предотвращалось добавлением
антиоксидантов, а также АТР (показано впервые!), в меньшей степени – других нуклеотидов.
Интересно, что ресопрягающее действие ATP проявлялось даже в тех случаях (например, при
добавлении
высоких
концентраций
фениларсиноксида),
когда
классический
водорастворимый антиоксидант N-ацетилцистеин был «бессилен». Полученные данные
логичнее всего объяснить тем, что основной мишенью прооксидантов является транслоказа
адениновых нуклеотидов – основной белок внутренней митохондриальной мембраны,
содержащий 4 цистеиновых остатка. Можно предположить, что в присутствии ATP белок
принимает конформацию, менее чувствительную к действию прооксидантов.
Митохондриальный АТР – зависимый калиевый канал в
митохондриях дрожжей D. magnusii
В митохондриях S. cerevisiae был обнаружен неспецифический канал (YMUC – yeast
mitochondrial unspecific channel), открываемый, в противоположность митоК+ATP каналу
митохондрий животных, в ответ на добавление ATP и закрываемый при дефиците ATP. Ранее
в нашей лаборатории (Ковалёвой М.В., кандидатская диссертация) в митохондриях дрожжей
Y. lipolytica был обнаружен ATP-зависимый К+-канал, закрываемый, как и в митохондриях
животных, при добавлении ATP. Поскольку дрожжи D. magnusii и Y. lipolytica, в отличие от
дрожжей S. cerevisiae, обладают аэробным типом обмена, зависимым от функционирования
митохондрий, было интересно узнать, является ли функционирование митоКАТР «животного
типа» общим свойством митохондрий дрожжей с аэробным типом обмена.
Найдено, что в изотонической среде, приготовленной на основе маннита, как основного
осмотического стабилизатора, набухания митохондрий не происходило. В среде, содержащей
KCl, имело место высокоамплитудное набухание митохондрий D. magnusii, ингибируемое
добавлением АТР (Рис. 8А, кривая 1). Ингибирующий эффект ATP частично снимался Mg2+
15
(Рис. 8А, кривая 2) и полностью – неорганическим фосфатом (Рис. 8А, кривая 3). Действие
ATP было специфичным.
Аналогичные данные были получены при измерении мембранного потенциала.
Добавление к слегка гипотонической среде 50 мМ KCl вызывало снижение мембранного
потенциала (Рис. 8Б), а последующее добавление ATP способствовало восстановлению
величины мембранного потенциала до исходного значения (Рис. 8Б). Однако, в отличие от
митохондрий Y. lipolytica [Kovaleva et al., 2009], для получения ответа на KCl к суперсопряженным митохондриям D. magnusii необходимо было добавить низкие (пикомолярные),
еще неразобщающие концентрации КЦХФ (Рис. 8Б). Концентрация ATP, вызывающая
полумаксимальный ресопрягающий эффект при добавлении 50 мМ KCl была равна 90 мкМ
(Рис. 8В). Ресопрягающее действие ATP было специфичным, поскольку в значительной мере
снималось атрактилозидом, а также пирофосфатом. ATP не мог быть заменен другими
ATP
2 мM
0,25
(1)
(2)
(3)
0,20
А
0
100
Время, с
200
300
Рис. 8. Влияние КCl, АТР, Mg2+,
неорганического фосфата (Рн) и КЦХФ на
митохондрии D. magnusii.
А) 2 мМ АТР полностью ингибировал
(кривая 1), АТР на фоне 2 мМ Mg2+ частично
ингибировал (кривая 2), АТР в присутствии 3 мМ
Рн совсем не ингибировал (кривая 3) набухание
митохондрий в KCl-среде; Среда инкубации
содержала 0,2 М КСl, 10 мМ Tris-НCl, pH 7,2-7,4,
митохондриальный белок – 0,5 мг/мл.
Б) 50 мМ KCl в присутствии 30 пМ КЦХФ
вызывал деполяризацию мембраны, полностью
ингибируемую добавлением 150 мкМ АТР;
Мембранный потенциал (511-533 нм)
0,30
Мембранный потенциал, % макс
Набухание (540 нм)
нуклеотидами.
KCl
50 мM
0,16
0,12
КЦХФ
25 нM
КЦХФ
30 пM
0,08
0,04
0,00
-0,04
ATP
150 мкM
Мтх
0
Б
200
400
Время, с
100
80
С50= 90 мкM
60
40
20
В
40
80
120
160
[АТР], мкM
В) Реполяризующий эффект АТР после деполяризации, вызываемой совместным действием КСl
и 30 пМ КЦХФ;
Состав среды инкубации, как на Рис. 1. Где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ.
16
Поскольку эквимолярные концентрации NaCl, LiCl, TEACl и TrisCl не снижали
мембранный потенциал даже в относительно высоких концентрациях (100 мМ и выше), был
сделан вывод о том, что обнаруженный нами ингибируемый ATP канал является
селективным для ионов К+.
Деполяризующий эффект КСl (на фоне 30 пМ КЦХФ) зависел от его концентрации (Рис.
9А). Концентрация КСl, оказывающая полумаксимальный деполяризующий эффект,
составляла 40 мМ. «Ресопрягающий» эффект АТР строго зависел от концентрации
добавленного KCl (Рис. 9Б). Чем выше была концентрация добавленного к митохондриям
KCl, тем более высокие концентрации ATP были необходимы для реполяризации мембраны.
В присутствии физиологической концентрации KCl, равной 100 мМ, концентрация ATP,
вызывающая полное ресопряжение, составляла величину 3 мМ, что находится в пределах
физиологических концентраций. Ресопрягающий эффект АТР зависел и от степени
энергизации митохондрий (Рис. 9В). Чем выше был уровень мембранного потенциала
(уровень энергизации митохондрий), тем более эффективней было реполяризующее действие
[АТР], мМ
Мембранный потенциал, % макс
АТР.
100
80
60
2,5
2,0
1,5
С50= 40 мM
40
1,0
0,5
20
0
3,0
А
0
20
40
60
80
100
120
Б
0,0
140
40
60
80
100
[KCl], мM
[KCl], мM
Эффект АТР, % макс
Рис. 9. Влияние КСl, КЦХФ и АТР на
мембранный
потенциал
митохондрий
D.
100
magnusii.
А)
Зависимость
величины
уровня
80
мембранного потенциала от концентрации
добавленного KCl;
Б)
Зависимость
концентрации
АТР,
60
необходимой для полного восстановления
мембранного потенциала (реполяризации), от
В
концентрации добавленного KCl;
40
80
70
60
50
В) Зависимость реполяризующего эффекта
Мембранный потенциал, % макс
АТР от величины мембранного потенциала (% от
максимума). Мембранный потенциал снижали, добавляя увеличивающиеся концентрации
разобщителя КЦХФ. Состав среды инкубации, как на Рис. 1.
17
Реполяризующий эффект ATP зависел от присутствия ионов Mg2+ (Рис. 10А) и
неорганического фосфата (Pн) (Рис. 10Б). Чем выше была концентрация этих агентов, тем
более высокие концентрации ATP были необходимы для реполяризации мембраны после ее
деполяризации, вызываемой КСl. В среде инкубации с ионной средой, имитирующей состав
цитоплазмы (5 мМ Mg2+, 5 мМ Рн и 1 мМ Na+), мембранный потенциал восстанавливался
лишь на 70% от максимальной величины, а концентрация АТР, необходимая для достижения
С50= 0,09 мМ
(1) С = 0,45 мM
50
100
С50= 0,45 мM
80
С50= 0,6 мM
(2)
(3)
(4)
60
40
А
20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
[АТР], мM
Мембранный потенциал, % макс
Мембранный потенциал, % макс
этого эффекта, увеличивалась (С50 составила 100 мкМ) (Рис. 10Б, кривая 5).
100
(1)
80
С50= 90 мкМ
60
(2)
(4)
(3)
(5)
С50= 75 мкM
40
С50= 70 мкM
С50= 70 мкM
20
Б
С50= 100 мкM
50
100
150
200
250
300
350
[АТР], мкM
Рис. 10. Влияние КСl, КЦХФ, Mg2+, неорганического фосфата (Pн), Na+ и АТР на мембранный
потенциал митохондрий D. magnusii.
А) Реполяризующий эффект АТР (кривая 1, С50 = 90 мкМ) и АТР в присутствии 1 мМ (кривая 2,
С50 = 0,45 мМ), 2 мМ (кривая 3, С50 = 0,45 мМ) и 5 мМ Mg2+ (кривая 4, С50 = 0,6 мМ) после
деполяризации, вызываемой совместным действием КСl и 30 пМ КЦХФ;
Б) Реполяризующий эффект АТР (кривая 1, С50 = 90 мкМ) и АТР в присутствии 1 мМ Рн (кривая
2, С50 = 75 мкМ) и 5 мМ Рн (кривая 3, С50 = 70 мкМ), 5 мМ Mg2+ и 5 мМ Рн (кривая 4, С50 = 70 мкМ), 5
мМ Mg2+, 5 мМ Рн и 1 мМ Na+ (кривая 5, С50 = 100 мкМ) после деполяризации, вызываемой
совместным действием КСl и 30 пМ КЦХФ.
Состав среды инкубации, как на Рис. 1.
Поскольку действие ATP на дрожжевые митохондрии было очень сходным с тем, что
было описано для митохондрий животных [Mironova et al., 2004] и дрожжей Y. lipolytica (см.
диссертацию Ковалёвой М.В.), нашим следующим шагом было исследование влияния на
митохондрии D. magnusii веществ, известных как регуляторы митоКАТР. Диазоксид, один из
самых
известных
открывателей
митоКАТР
митохондрий
животных,
индуцировал
высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий в среде, содержащей KCl и 1 мМ
ATP уже в низких (микромолярных) концентрациях (Рис. 11А).
18
Таким образом, в митохондриях дрожжей аэробного типа обмена – Y. lipolytica и D.
magnusii достоверно обнаружен ATP-зависимый К+-канал «животного типа», закрываемый
ATP.
Мы проверили действие некоторых прооксидантов: менадиона, ФАО и пероксида
водорода на повторную деполяризацию мембраны после ее реполяризации АТР. Эти
прооксиданты, особенно ФАО, вызывали повторную деполяризацию мембраны, которая
была нечувствительной к действию антиоксиданта N-ацетилцистеина и БСА, но
незначительно обращалась повторным добавлением АТР, и, что важно – повторное
набухание дрожжевых митохондрий, заингибированное добавлением ATP (Рис. 11Б). Это
означает, что в присутствии прооксидантов ATP-зависимый К+ канал может превращаться в
неспецифический канал (пору), через которую могли бы выходить апоптотические факторы,
локализованные в межмембранном пространстве.
ATP
Диазоксид
2 мM
50 мкM
0,30
0,25
0,20
Набухание (540 нм)
Набухание (540 нм)
0,35
Диазоксид
100 мкM
А
0
100
Время, с
200
300
ATP
2 мM
0,30
ФАО
100 мкM
ФАО
100 мкM
0,25
ФАО
100 мкM
0,20
0
100
Время, с
200
Б
300
Рис. 11. Влияние КСl, АТР, диазоксида и фениларсиноксида (ФАО) на набухание митохондрий
D. magnusii.
А) Диазоксид и Б) ФАО, добавленные после АТР, вызывали повторное набухание митохондрий в
KCl-среде. Состав среды инкубации, как на Рис. 8А.
Поскольку принимается, что концентрация цитоплазматического ATP составляет
примерно 1 мМ (большинство ATP-зависимых ферментов имеют величину Км для ATP,
лежащую именно в этом диапазоне), это означает что в «нормальных условиях» ATPзависимый К+-канал митохондрий дрожжей аэробного типа обмена, ингибируемый
микромолярными концентрациями ATP, должен находиться в закрытом состоянии. Однако,
как нами было найдено, ингибирующий эффект ATP частично снимался Mg2+ и
неорганическим фосфатом, что позволяет предположить то, что в физиологических условиях
19
(при внутриклеточных концентрациях Mg2+ и Pн, равных примерно 5 – 10 мМ), ATP может
реально выступать в качестве возможного модулятора ATP-зависимого K+-канала. Снижение
внутриклеточной концентрации ATP под действием разных неблагоприятных факторов
может служить сигналом для открытия канала (в зависимости от степени тяжести – мягкое
разобщение или превращение канала в неспецифическую пору, через которую могли бы
выходить апоптотические факторы). Последнее предположение требует дополнительных
исследований.
Прямо противоположный ответ на АТР у дрожжей S. cerevisiae, с одной стороны, и у Y.
lipolytica и D. magnusii, с другой стороны, может быть объяснен глобальной разницей в
способах энергообеспечения этих дрожжей. Первые являются факультативными анаэробами,
вторые – дрожжами аэробного типа обмена (D. magnusii – облигатный аэроб), обмен которых
полностью зависит от функционирования митохондрий. У факультативных анаэробов
снижение внутриклеточного уровня ATP, напротив, будет способствовать закрытию канала,
тем самым, обеспечивая возможность перехода на более эффективный – митохондриальный
способ запасания энергии.
20
ВЫВОДЫ
1. В митохондриях D. magnusii не индуцируется Са2+/Рн-зависимая, циклоспорин Ачувствительная пора в условиях, способствующих ее открытию в митохондриях животных. В
присутствии специфического Са2+ ионофора ETH129 имела место активация Са2+/Н+-обмена,
зависимого от эндогенных жирных кислот.
2. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий, без образования
мегаканала.
Разобщающее
действие
жирных
кислот
промотировалось
низкими
концентрациями мембранофильных катионов. Совместное действие насыщенных жирных
кислот и Сa2+ не индуцировало открытие поры.
3. Анаэробиоз (гипоксия) не индуцировал повышенную проницаемость внутренней
митохондриальной мембраны D. magnusii. Впервые показана ATP-зависимая энергизация
дрожжевых митохондрий в условиях анаэробиоза.
4. В митохондриях дрожжей D. magnusii прооксиданты вызывали лишь снижение
мембранного потенциала, не зависимое от Ca2+, без образования мегаканала. Отмечено
ресопрягающее действие АТР при деэнергизации мембраны всеми использованными
прооксидантами.
5. В митохондриях D. magnusii показано наличие регулируемого ATP-зависимого К+канала, закрываемого, как и в митохондриях животных, при добавлении ATP. Прооксиданты
(в том числе и мембранофильные катионы, действующие в микромолярных концентрациях
как прооксиданты) повторно открывали канал, вызывая высокоамплитудное набухание
митохондрий, т. е. превращали специфический К+-ATP-зависимый канал в неспецифическую
пору, через которую могли бы выходить апоптотические факторы. Последнее предположение
требует дополнительных исследований.
21
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах:
1. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Zyl'kova M.V., Ural'skaya L.A., Popova
K.M., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. «Induction of a non-specific permeability transition in
mitochondria from Yarrowia lipolytica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts» J. Bioenerg.
Biomembr., 2009, v. 41(3), p. 239-249.
2. Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Звягильская Р.А. «Взаимодействие дрожжевых
митохондрий с жирными кислотами и митохондриально-направленными липофильными
катионами» Биохимия, 2010, т. 75(2), С. 169-176.
3. Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Попова К.М., Зылькова М.В., Уральская
Л.А., Звягильская Р.А. «Индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий
дрожжей. Мини-обзор» Биохимия, 2010, т. 75 (3), С. 365-372.
4. Skulachev V.P., Antonenko Y.N., Cherepanov D.A., Chernyak B.V., Khailova L.S., Korshunova
G.A., Lyamzaev K.G., Roginsky V.A., Rokitskaya T.I., Severin F.F., Severina I.I., Simonyan R.A.,
Skulachev M.V., Sumbatian N.V., Sukhanova E.I., Tashlitsky V.N., Trendeleva T.A., Vyssokikh
M.Yu., Zvyagilskaya R.A. «Prevention of cardiolipin oxidation and fatty acid cycling as two
antioxidant mechanisms of cationic derivatives of plastoquinone (SkQs). Review» Biochim.
Biophys. Acta., 2010, v. 1797(6-7), p. 878-889.
Тезисы докладов:
1. Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Зылькова М.В., Романовская М.А. «Окислительный стресс
и индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica»
Труды Всероссийской конференции молодых ученых и II школы им. академика Н.М. Эмануэля
«Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты». Тезисы докладов. Москва, 2006, с.
173-174.
2. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Ural’skaya L.A., Guseva E.S. and Zvyagilskaya R.A.
«Prooxidant-induced low-conductance channel in mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast»
Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC. Short Reports. Moscow, 2006, v. 14, p. 332.
3. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I. «An mPTP-like pore in yeast mitochondria»
Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC. Short Reports. Moscow, 2006, v. 14, p. 336.
4. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Uralskaya L.A., Guseva E.S.
22
«Mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast does not undergo a typical permeability transition
(mPTP). Prooxidans induced only a low-conductance channel for H+» 24th Small Meeting on Yeast
Transport and Energetics. Program and Abstracts. 2006, p. 38А.
5. Zvyagilskaya R.A., Zyl’kova M.V., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A.
«Mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in different yeast species is dissimilarly
regulated» Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 15th EBEC. Short Reports. Moscow, 2008, p. 32.
6. Zylkova M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Kovaleva M.V., Zvyagilskaya R.A. «More on
permeability transition in Yarrowia lipolytica mitochondria» Abstr. Bari Intern. Symposium on
«Mitochondrial physiology and pathology» IUBMB Sympos. S1. Satellite events of the 33th FEBS
Congress and 11th IUBMB, Athens. 2008, SC2.38.
7. Зылькова М.В., Ковалева М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А., Звягильская
Р.А. «Индукция неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий» Труды 2-го
Съезда микологов России с международным участием «Современная микология в России».
2008, т. 2, с. 127-128.
8. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I. «Permeability transition in mitochondria from the
Endomyces magnusii yeast» The FEBS J. Abstracts of 33th FEBS Congress and 11th IUBMB
Conference. 2008, p. 266.
9. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. «Pathways for release of
apoptotic factors from yeast mitochondria» The FEBS J. Abstracts of 34th FEBS Congress «life’s
Molecular Interactions». Prague, Czech Republic, 2009, v. 4-143, p. 229.
10. Звягильская Р.А., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А. «Действие прооксидантов
на
митохондрии
дрожжей»
Труды
конференции
«Окислительный
стресс
и
свободнорадикальные патологии». Судак, Украина, 2009, с. 25.
11. Trendeleva T.A., Sukhanova E.I., Zvyagilsklaya R.A. «Effect of fatty acids and mitochondritargeting lipophilic cations on yeast mitochondria» Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, Short
Reports 16th EBEC. 2010, p. 63-64.
12. Суханова Е.И. Влияние митохондриально-направленных липофильных катионов на
дрожжевые митохондрии. XXII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные
направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 8-11 февраля 2010.
Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 88.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты 06-04-49687 и 09-0401238), Программы РАН по клеточной и молекулярной биологии и Института
митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова.
23