КОМПОНЕНТНЫЙ АНАЛИЗ СПЕКТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПЕРЕХОДОВ В БЕЛКАХ

На правах рукописи
ЕМЕЛЬЯНЕНКО
Виктор Иванович
КОМПОНЕНТНЫЙ АНАЛИЗ СПЕКТРОВ
ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ КАК МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ
СТРУКТУРНЫХ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ
ПЕРЕХОДОВ В БЕЛКАХ
Специальность 03.00.02 - биофизика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата физико-математических наук
Пущино-2007
Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной
биофизики РАН, Пущино
Научный руководитель
доктор биологических наук, профессор
Бурштейн Эдуард Аронович
Официальные оппоненты:
доктор физико - математических наук
Гапеев Андрей Борисович
доктор биологических наук
Климов Вячеслав Васильевич
Ведущая организация:
Институт биологического приборостроения
РАН, Пущино
Защита диссертации состоится «19» сентября 2007 г. в 15 часов 30 минут
на заседании диссертационного совета Д 002.093,01 при Институте
теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу:
142290, г. Пущино, ул. Институтская, д.З, Московская область, ИТЭБ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН
Автореферат разослан «16» августа 2007 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
канд.физ-мат наук
Н Ф . Ланина
2
Общая характернстнка работы
Актуальность проблемы. Изучение структурных и физикохимических переходов в белках имеет важнейшее значение в исследовании
их биологических и физических свойств.
Среди различных физических и химических методов исследования
заметную роль играют методы, основанные на регистрации и
интерпретации
изменений
флуоресценции.
Люминесцентная
спектроскопия является мощным и универсальным методом изучения
структурных, физико-химических и функциональных свойств белков.
Флуоресцирующие аминокислотные остатки белка - триптофан, тирозин и
фенилаланин (Конев, 1965; Бурштейн, 1976, 1977а; Лакович, 1986;
Permyakov, 1993), или присоединенные красители (Weber & Farris, 1979;
Владимиров и Добрецов, 1980; Semisotaov et al, 1991) несут информацию
об изменении физических и химических свойств окружения в процессе
перехода.
При анализе переходов чаще всего рассматриваются изменения
интегральных значений параметров флуоресценции целого набора
флуорофоров, которые могут быть расположены в разных участках
белковой молекулы и находиться в процессе перестройки между разными
структурными и (или) физическими состояниями. При этом теряется
специфическая информация о различиях в изменении структурных и
физических свойств в разных участках белковых молекул и о
неодинаковом поведении отдельных популяций молекул в процессе
перехода.
В связи с этим возникает необходимость разработки новых приемов
анализа изменений спектров флуоресценции, которые должны обеспечить
более полную их интерпретацию при исследовании структурных
переходов в белках. Одним из таких подходов является разложение
спектров флуоресценции на компоненты, соответствующие излучению
отдельных флуорофоров или их групп, что позволяет следить за
изменением состояния их окружения в процессе перехода.
Целя и задачи исследования. Главной целью настоящей работы
является разработка и обосвовавие новых подходов в изучении состояний
и структурных перестроек в белках, основанных на компонентном анализе
составных спектров флуоресценции остатков триптофана или
присоединенных флуоресцентных меток.
Для достижения этого было необходимо решить следующие задачи:
- Исследовать взаимозависимости параметров лог-нормальной
функции, описывающей контуры спектров флуоресценции флуорофоров в
различных условиях. Определить функцию, описывающую форму
элементарного однородного спектра флуресценции флуорофора в белке.
з
- Разработать методы разложения составных спектров белков на
индивидуальные лог-нормальные компоненты и проверить применимость
предлагаемого подхода для анализа составных спектров флуоресценции
белков.
- Исследовать на основе выбранных подходов структурные и
физико-химические переходы в белках, вызываемые различными физикохимическими факторами.
- Охарактеризовать общие приемы и возможности использования
компонентного анализа спектров флуоресценции для определения
молекулярных особенностей структурных и физико-химических переходов
в белках. Проанализировать методические особенности, информативность
и пределы применимости разработанных подходов
Научная новизна и значимость работы. Показано, что широкие
асимметричные спектры флуоресценции различных органических
флуорофоров описываются четырехпараметрической функцией логнормального распределения.
Параметры различающихся по положению спектров излучения
одного и того же вида флуорофора в окружении с различной полярностью
и подвижностью строго взаимозависимы. Вследствие этого форма спектра
флуоресценции триптофана и ряда других сложных молекул определяется
только положением его максимума и может быть представлена
однопараметрическоЁ лог-нормальной функцией, что существенно
упрощает процедуру компонентного анализа.
Показано, что сложные спектры белковой флуоресценции можно
однознач^р разложить на компоненты, спектральные параметры которых
характеризуют окружение индивидуальных флуорофоров в составе белка
или
классов
флуорофоров
с
одинаковыми
спектральными
характеристиками.
Разработанные приемы и методы повышают информативность
спектрофлуоресцентного исследования природы структурных и физикохимических переходов в белках. Высокая точность описания формы
спектра дает возможность проведения в дальнейшем более глубоких
экспериментальных и теоретических исследований.
Практическая ценность. Разработанные методы и подходы
используются в конкретных научных исследованиях. Эмпирическая
однопараметрическая лог-нормальная функция используется в изучении
как фотофизических свойств флуорофоров, так в исследовании белков
методом флуоресценции.
Идентификация формы спектра флуоресценции элементарного
состояния остатков триптофана позволила уточнить широко используемую
4
интерпретационную модель статистически дискретных состояний остатков
триптофана в белках.
Разработаны алгоритмы описания и разложения на компоненты
спектров флуоресценции органических флуорофоров, в том числе остатков
триптофана в белках и органических флуоресцентных меток и зондов.
Предложенные подходы позволяют выделить в сложном спектре
излучения спектральные компоненты отдельных флуорофоров или их
классов в белке и исследовать локальные изменения их окружения в
процессе структурного или физико-химического перехода, что расширяет
арсенал методов изучения характеристик и природы функциональных
переходов в белках
Апробация работы. Основные результаты исследования были
представлены на Всесоюзных конференциях по спектроскопии
биополимеров (Харьков, 1980-1991); Ш Всесоюзном совещании
«Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное
обеспечение» (Рига, 1988); Международной конференции «Физика и
химия органических люминофоров 95» (Харьков, 1995); Всесоюзном
биофизическом съезде (Москва, 1982); Международной конференции по
люминесценции и фотофизике в честь 100-летия Яблонского (Торунь,
Польша, 1998); П и Ш Съездах биофизиков России (Москва, 1999 и
Воронеж, 2004); научных конференциях ИТЭБ РАН; 7-ой Конференции по
методам и приложению флуоресценции (Амстердам, Нидерланды, 2001).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа
изложена на 109 страницах, содержит 19 рисунков, 9 таблиц, 2J0 ссылок
на цитируемую литературу и состоит из разделов «Введение», «Обзор
литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение
результатов», «Выводы» и «Список литературы».
Материалы и методы
Препараты Аминокислоты и их производные получены от фирм
Ferak и Chemapol; продан и акрилодан - от фирмы Molecular Probes.
Спектроскопически чистые растворители получены от фирмы Aldrich
Chemical Со. Мочевину и KI (Реахим) дополнительно очищали путем
перекристаяизации из этанола. В опытах по тушению флуоресценции
иодидом в раствор KI для предотвращения образования 13~ добавляли до
O.lMMNaa^Oj.
Мелитгин был выделен и очищен методом, описанным ранее
(Демченко и др, 1987), Р-лактоглобулин получен по методике (Капланас и
др., 1975). Бычий сывороточный альбумин (БСА) производства фирмы
Sigma был предварительно обезжирен по (Chen, 1967) и очищен от
димеров и агрегатов (Нямаа и др., 1984). Препараты лизоцима куриного
5
яйца дрожжевой 3-фоефстлицераткиназы, алкогольдегидрогеназы из
печени лошади, фирмы Sigma были очищены от низкомолекулярных
примесей диализом или на колонке с сефадексом G-25. Субфрагмент 1 (S1)
миозина (изомер А1), актин, конъюгаты акрилодана с S1 миозина и с
актином были получены Андреевым О.А. как описано в работе
(Емельяненко и др., 2000).
Концентрации
белков
и
продана
определяли
спектрофотометрически, используя значения молярных коэффициентов
экстинкции, а конъюгатов белков с акрилоданом - по методу Бредфорд
(Bradford, 1976).
Спектральные измерения Спектры поглощения регистрировали на
спектрофотометрах Sbimadzu UV1600U или Specord UV-VIS (Carl Zeiss).
Спектры
флуоресценции
измеряли
на
автоматизированном
спектрофлуориметре лабораторного изготовления (Burstem et at., 1974)
Температуру образца в кювете изменяли с помощью элемента Пельтье и
измеряли с помощью калиброванной термопары. Величину рН растворов
измеряли с помощью рН-метра рН-410 (Аквилон). Все спектры
флуоресценции были исправлены на спектральную чувствительность
прибора (Емельяненко, 1991). Преобразование спектра в шкалу волновых
чисел осуществляли по формуле. I(v) = 1(A) X2
Спектры флуоресценции красителей и их конъюгатов с белками
были измерены Решетняк Я. К., спектры флуоресценции белка ОЕР-16 и
его мутантов измерены D.Linke. Спектры флуоресценции 1- и 2ацетилантраценов в различных растворителях были любезно
предоставлены нам проф. А. С. Черкасовым (ГОИ, Ленинград), а спектры
З-амино-М-метилфталимида - И. М. Гулисом (БГУ, Минск).
Обработка и анализ спектров флуоресценции. Параметры спектров
флуоресценции в шкале волновых чисел (положение максимума vm,
положения полумаксимальных амплитуд v+ и v_ и максимальную
интенсивность 1т) определяли, аппроксимируя его лог-нормальной
функцией вида:
/(K> = 7„^xp(-ln2-ln2(a-v)/(a-M»)/ln:2p))
при v<a
(1)
7(v) = 0
при v>a,
где р = (vm-vj/(v+-vj - параметр асимметрии спектра; а - vm+Hp/(p* -1),
Я = v+ - v_ - полуширина спектра. Площадь под спектром вычисляли по
формуле:
5=/ и Я(2я) 1Д сехр(с 2 /2)р/(р 2 -1) = / и 5 0 (У И( v* к),
(2)
где с = lnp / m2, S0 - площадь под кривой (1) при 1т = 1.
Составные спектры представляли суммой однопараметрических логнормальных функций (1), полученной с учетом зависимости между v+ и и.
от v„ (см. далее).
У( v) = T, Imj-'I( У, Vm,), где j - номер компоненты
б
Компонентный анализ спектров флуоресценции проводили,
обрабатывая одновременно весь массив спектров, полученных при разных
значениях концентрации белка, тушителя, ионной силы или температуры,
варьируя все максимальные амплитуды компонент и считая положения их
максимумов постоянными для всего массива. Аппроксимацию
экспериментальных спектров лог-нормальной функцией проводили,
используя программу оптимизации, основанную на методе Маркуардта
(Marquardt, 1963), минимизируя глобальный функционал:
Ф ~ Z k 5л(1жся — Уяот) >
где индекс к обозначает суммирование по числу экспериментальных
спектров, i — по числу измеренных точек в спектре. Качество разложения
оценивали по величине среднеквадратичной ошибки.
Результаты
Определение формы элементарного спектра
флуоресценции флуорофоров
Лог-нормальная функция (1) была использована нами для описания
формы спектров флуоресценции различных флуорофоров. Полученные
Ряс. 1. Аппроксимация спектров флуоресценции органических флуорофоров логнормальной функцией (1) (а) - экспериментальные значения интенсивностей
(точки) спектров и расчетные кривые (линии) для спектров бисульфата хинина в 1н
H2SO4 (1), 1-ацетилантрацена в метаноле (2), З-амино-Ы-метилфталимида в гексане
(3); продана в циклогексане (4), 2-аминогшридина в 1н H2S04 (5), DL -триптофана
в воде (6), химотрипсиногена рН 8 (7) и DL-тирозинав воде (8) Позиции
параметров Vm, V+,H V. , лог-нормальной функции указаны стрелками, (б) относительные (в % к максимальной интенсивности) отклонения расчетных
спектров
от
экспериментальных
(стрелки - положение
максимумов
соответствующих спектров)
расчетные лог-нормальные кривые (1) описывают экспериментальные
спектры разных флуорофоров, даже на их дальних крыльях (рис. 1а)
Хорошее совпадение экспериментальных и теоретических спектров видно
из графиков распределения остатков (рис 16). В результате подгонки
7
теоретической
функции (1) к экспериментальным значениям
интенсивности можно с высокой точностью определить значения
параметров спектра Im, vm v+ и v_, а также площадь под спектром
Зависимость между параметрами vm v+ и V-, характеризующими
форму спектров флуоресценции растворов СЗ-замещенных производных
Ю , см"
\.
_ п*-
3 1 52 33
v 10'3,см''
Р я с 2. Линейная зависимость между
параметрами Ущ, И V+, Vдля
однородных спектров флуоресценции
производных индола (о) и белков (х)
азурита, химотрипсиногенаА, р яактоглобулина
(рН 2,4),
Lмеромиозина,
сывороточного
альбумина (рН 6), нейротоксина
кобры, куриного кальдесмона и
мономерного мелиттина
индола и дипептидов триптофана в различных растворителях,
представлена на рис. 2. Полученные линейные зависимости описываются
уравнениями:
v+ = 0,831ц,+ 7070 (см'1)
(3)
v_ = 1,177 v„- 7780 (см 1 ).
Это означает, что положение максимума полностью определяет
форму спектра фяуоресцении..
Однородные спектры триптофановой флуоресценции белков
Анализ параметров спектров флуоресценции белков (см. рис.2),
содержащих различное число остатков триптофана, излучение которых
обусловлено лишь одним спектральным классом (Burstein et al., 1973;
Бурштейн, 1977а) показал, что v„, v+ и к. действительно соответствуют
линейной зависимости (3). Характерной особенностью таких спектров
является то, что, как и для однородных спектров производных индола в
растворах, в присутствии тушителя форма спектра флуоресценции не
изменяется и при данном положении максимума эти спектры имеют
минимальную полуширину. Нами не выявлены спектры белков с меньшей
полушириной, чем следует из соотношения (3).
Таким образом, форма элементарных спектров флуоресценции
остатков триптофана в белках может быть описана однопараметрической
лог-нормальной функцией в виде уравнений (1) и (3).
Влияние растворителя на форму и положение спектров
флуоресценции продана и акрилодана
Для спектров флуоресценции метки продана и зонда акрилодана в
коньюгате с трипептидом Lys-Cys-Phe, измеренных в разных
растворителях, также были получены линейные зависимости между
s
параметрами vm v_ и v+ (рис. 3). На этой зависимости можно выделить два
линейных участка, которые соответствуют спектрам, измеренным в
апротонных
{vm >~21000 см~!) и протонных (vm s-21000 см-1)
растворителях. Линейные зависимости описываются уравнениями:
v_ - 0,8858 vm+687,31 (см-1)
(4)
v+= 1,1151 v„-832,92 (см-1)
для протонных растворителей и
к. = 0,965 v» - 930,19 (см 1 )
(4а)
v+ - 0,936 vm + 2832,70 (см 4 )
для апротонных растворителей.
Рве 3 Зависимости положения
полумаксимальных амплитуд \'+ и
v. от положения максимума
спектров флуоресценции vm для
продана (о), конъюгата акрилодана
с трипептидом (Л) в разных
растворителях
и
конъюгата
акрилодана с F- и G-актином (х)
v
»>v- 26
Ю'\см '24
22 _
v ^ ^
20
IS
16 Z—i—I
18
20
i
I
. 1
24
22
v„10", см
.
i
26
Параметры спектров конъюгата акрилодана с F- и G-актином также
соответствуют этим зависимостям.
Таким образом, форма спектров флуоресценции производных
диметиламинонафталина однозначно определяется положением его
максимума. Уравнения (1) и (4,4а) являются аналитическим выражением
формы спектра однородной флуоресценции продана и акрилодана в
разных средах.
Выявленные закономерности позволяют предположить, что для
спектров флуоресценции многих органических флуорофоров и их
производных с различными заместителями в различных условиях
окружения форма полосы (ширина и асимметрия) однозначно связана с
положением ее максимума
Полученная нами однозначная линейная зависимость между
положением максимума и положением полумаксимальных амплитуд
позволяет уменьшить число параметров каждой лог-нормальной
компоненты до двух - положения максимума и максимальной амплитуды.
Это значительно упрощает задачу разложения составных спектров
флуоресценции белков, содержащих флуорофоры в различном окружении.
Тестирование разложения спектров флуоресценции на
элементарные лог-нормальные компоненты
Возможность применения аналитических выражений в виде функций
(1) и (3) для определения параметров спектров излучения индивидуальных
остатков или классов остатков проверена на экспериментальных спектрах
9
флуоресценции белка ОЕР-16 из наружной мембраны хлоропластов
гороха, содержащего два остатка триптофана (W77 и W100) и его
однотриптофановых мутантов W77F и W100F (рис. 4а). Несмотря на
наличие в излучении растворов этих белков спектральной компоненты
неизвестной природы с максимумом 320 нм, положение максимумов
элементарных компонент точно соответствовало излучению W77 и W100 в
каждом из мутантов (335 и 339,5-341 нм, соответственно (рис. 46).
Совпали и значения констант Штерна-Фольмера, характеризующие
доступность остатков триптофана в интактном ОЕР-16 и в мутантах
W100F и W77F 0,83-1,2 и 1,9-2,3 ^соответственно (рис. 4а, б).
320
340
3*0
380
400 420
НМ
320
340 360
3S0 400 420
НМ
Ряс 4 Определение положения максимумов и вкладов остатков триптофана в
спектрах флуоресценции однотриптофановых мутантов ОЕР-16 W100F в W77F (а) и
разложение на лог-нормальные компоненты спектров ОЕР-16 дикого типа (6) На
вкладках представлены графики Штерна-Фольмера для каждого мутанта (а) и
ОЕР-16 дикого типа (б); обозначения точек о - TrplOO, х - Тгр77, пунктир компонента неизвестной природы
Сравнение параметров лог-нормальных компонент, полученных
нами при разложении спектров флуоресценции белков (см. табл. 1), с
параметрами компонент, приведенных в литературе показывает хорошее
соответствие.
Таблица 1. Параметры компонент, полученных при разложении спектров
флуоресценции белков различными методами
Белок, условия
ДА НМ
3-фосфоглицераткиназа 325
^Н3,9
^ 324
Лнзопим, рН 5,2
328
330
Алкоголъдегидрогиназа, 324
PH7.5
326
326
т
0,13
0,30
0,51
039
0,43
0,52
Хъ нм
340
341
345
348
345
340
336
334
10
аг
0,87
0,70
0,49
0,61
0,57
0,48
Литература, метод
Privatetal,1980
Данная работа
Lehrer, 1971
Yamashitaetal,1995
Данная работа
EftraketaL, 1987
Wasylewski et al, 1988
Данная работа
Таким образом, разложением составных экспериментальных спектров
на компоненты, задаваемые в виде двухпараметрических лог-нормальных
функций, можно достоверно определять положение максимумов и вклады
элементарных компонент, соответствующих излучению отдельных
остатков триптофана, зондов и меток или их групп в белке, а также
оценивать их доступность растворителю. Это создает возможность
исследования характеристик структурных и физико-химических переходов
в белках.
Исследование структурных переходов в мелиттине в процессе
олигомеризацин
Для проверки возможности применения компонентного анализа в
исследовании перестроек белковых молекул был выбран хорошо
охарактеризованный процесс тетрамеризации мелштина из яда пчелы (26
остатков; 1 остаток триптофана), под действием изменений ионной силы и
концентрации белка при разных температурах и значениях рН раствора.
Спектр излучения мономерного мелштина имеет максимум при
349 нм (рис. 5, спектр 1) и с большой точностью описывается одной
элементарной лог-нормальной функцией (уравнения 1 и 3).
В присутствии 1 М (Ата = 335 нм) и 2М К О (Хт = 332,5 нм) ширина
спектров мелштина превышает теоретические значения для логнормальных функций с такими же положениями максимума. Спектры
флуоресценции мелиттина при различных концентрациях КС1
описываются суммой трех двухпараметрических
лог-нормальных
Рве. 5.
Спектры
флуоресценции
мелштина при рН 7,4 в присутствии
различных концентраций КО: 1 - О М ,
2 - 0 , 5 М, 3 - 1,0М,4-2,0МКС1
огаед.
Пунктиром представлены спектры логнормальных компонент 2 т 22, иД 1
спектра 2 с максимумами при 349 нм,
329 нм, и 344 нм, соответственно; 3 2 и
31 соответствующих
компонент
спектра 3,4 1 и 4 2 - компонент спектра 4
0,0•JJjJj 420 340 360 480 400 Спектр 1 описывается лог-нормальной
функцией с максимумом при 349 нм
Х,нм
компонент, в качестве одной из которых принят спектр излучения
мономера (пунктирные спектры на рис.5). Зависимости вкладов
компонент от ионной силы показаны на рис. 6 . 0 наличии двух переходов
с ростом ионной силы свидетельствуют изоэмиссионная точка при 346 нм
в серии спектров при концентрациях КС! до 1 М и отход от нее при
п
дальнейшем росте ионной силы (рис. 5), а также различное поведение
вкладов лог-нормальных компонент при концентрациях К О свыше 1 М
(рис. 6а). Следовательно, с ростом ионной силы до 1 М происходит
кооперативный переход из мономерного состояния мелитгина в некое
промежуточное, а при концентрациях КС1 >1 М имеет место второй
кооперативный переход. Этот вывод подтверждается представлением
изменений спектров флуоресценции в форме «фазовых графиков»
(рис. 66), на котором наблюдаются две линейные ветви и излом между
ними при ~1 М К О .
1,15 - 2MKCI
го
1,10
1,05
1,00
0,95
ЛОЛ
-1
б
МКС1
ON
1_
ч
о\
ч
схо*мкс1
"'"0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
~"~ 0,7
0,8
09
ксз,м
4ю
Ряс. б. я - Зависимость вкладов лог-нормальных
компонент
в
общую
площадь под
спектрами флуоресценции (0,8-Ю"4 М мелитгина при рН 7,4) от концентрации КС1
(о) - вклады компоненты с Хв при 349 нм, (п>- при 344 нм, (Д) - при 329 нм
б-Фазовое представление изменений спектров флуоресценции мелитгина при
изменении концентрации КС1 в координатах интенсивностей флуоресценции при 360
и320нм
При исследовании тушения флуоресценции тетрамера мелитгина
(2,0 М КС1) иодидом (табл. 2) показано, что компоненты спектров имеют
разные константы Штерна-Фольмера, т.е. определяющие их остатки
триптофана имеют существенно разную доступность растворителю, что не
согласуется с одинаковым состоянием субъединиц в кристаллической
структуре
тетрамерного мелитгина.
Параметры
Компонента I Компонента 2
Таблица 2. Параметры тушения компонент спектра флуоресценции
5 327,2±0,5
Ха
компоненты
(по
тушению
КГ),
нм
343,2±0,99
тетрамерного мелитгина (2,0 М КС1,7-10" М мелитгина)
Asv, M"' - константа Штерна-Фольмера для 2,33±0,бб
тушения KI
а, - вклад компоненты в общий спектр
0,52±0,08
9,20±1,73
0,48±0,08
Исследование влияния концентрации мелитгина на процесс
олигомеризации проведено в присутствии 0,8 М КС1 при рН 7,4. С ростом
концентрации мелитгина от 3ДО"5до 2 10"2 М положения максимумов
12
спектров смещаются от 349 до 333 нм, т.е. до положения,
соответствующего предельному сдвигу в 2 М КС1. Это означает, что и при
промежуточном значении ионной силы и достаточно высокой
концентрации белка завершаются оба перехода олигомеризации.
Положения максимумов компонент, как и в зависимости от ионной силы,
равны 329, 344 и 349 нм. В присутствии 0,8 М КС1 при концентрации
мелитгина более 0,2-0,3 мМ компонента с максимумом при 349 нм
практически исчезает и спектры описываются суммой лишь двух
компонент с А™ при 329 и 344 нм (рис 7а).
Для выяснения стехиометрии олигомеризации мелитгина до
образования интермедиата (концентрации КС1 до 0,8 М и концентрациях
белка до ~510 М) проведен анализ падения вклада мономерной
компоненты в спектр флуоресценции при увеличении концентрации белка
(рис. 7а). После поправки вкладов в излучение на соотношение квантовых
-4 ~
° -5
?5
§-6
-6,0
-5
^5
J.
-5,0
J.
-4,5
-4
-3
log(aC)
к^[мелиттин]
Рис 7. а - Зависимости от концентрации мелитгина вкладов лог-нормальных
компонент в общую площадь под спектрами флуоресценции в 0,8 М КО при рН 7,4
(вклады компоненты при 349 (о), 344 (а) и 329 нм (А)
б - Определение стехиометрии олигомеризации мелитгина на стадии образования
интермедиата по зависимости концентрации мономерной компоненты (аС) от общей
концентрации мелитгина С Измерения проведены с ростом концентрации меяитгана
до5КПМв0,8МКС1
выходов флуоресценции мономера и олигомера (суммы компонент 329 и
344 нм) определяли молярные вклады мономера а в общее содержание
мелитгина. Равновесная олигомеризация описывается уравнением*
К = (1-а)С/(аС)",
где К - константа равновесия олигомеризации; С - общая концентрация
мелитгина; п - степень олигомеризации. После логарифмирования
получаем:
log((l-a)C) = n-log(aC)+ logK
Из линейного графика зависимости log((l-a)C) от log(aC) (рис. 76)
следует, что п = 4,3±0,4, а logK = 16,9 ±2,0. Следовательно, уже на первой
стадии перехода идет кооперативная тетрамеризация мелитгина
13
Индуцируемые рН переходы в тетрамере мелиттина
Измеренные при разных значениях рН спектры флуоресценции
тетрамерного мелиттина описываются лог-нормальными компоненами с
максимумами при 328 и 344 им. Зависимости их квантовых выходов от рН
представлены кривыми 2 и 3 на рис. 8а.
В интервале рН от 7,0 до 9,0 выход флуоресценции компоненты при
328 нм падает на 25% без изменения выхода компоненты при 344 нм, что
приводит к длинноволновому сдвигу суммарного спектра (рис. 8а,
кривая 4). Это свидетельствует об изменении структурного или
динамического окружения остатка триптофана с коротковолновым
положением максимума, т.к депротонирование в этой зоне рН какой-либо
белковой группировки не вызывает усиления тушения флуоресценции
остатков триптофана (Бурштейн, 1976).
0,5
рН=8,9
: б
рН»61
0,4
°
0,2
* рН-11,7 „
Ч 9"
О
,йн-и
О
Я рН-0,7
0,1
_ L _ l J_^.l
,
1 .
1
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
"7
Рис. 8 Влияние рН на флуоресценцию тетрамерного мелиггана (в 2,0 М КО) а зависимость от рН квантового выхода (q, кривая 1) н положения максимума спектров
флуоресценции (кто, кривая 4) (С = 5 10"5 М, 2 М КС1 в 0,01 М ацетатном или 0,01
Трис-HCl буфере) Кривые 2 и 3 - зависимости квантовых выходов коротковолновой и
длинноволновой лог-нормальных компонент спектра, соответственно от рН б фазовое представление зависимости от рН в координатах вкладов ал и % компонент
Другие изменения вкладов компонент в зависимости от рН
наилучшим образом отражены на псевдо-фазовом графике в координатах
вкладов (ЙЬ Оп) (рис. 86). Такие графики выявили зоны структурных
перестроек и зоны тушения флуоресценции.
Тепловые переходы в тетрамере мелиттина
Исследования тепловых переходов в белках по спектрам
флуоресценции осложняются существованием фонового температурного
тушения флуоресценции вследствие тепловой активации структурной
подвижности в белке (Bushueva et al., 1975,1978,1980).
Разложение спектров тетрамерного мелиттина на лог-нормальные
компоненты показало их различное поведение в процессе тепловой
денатурации, что отражает изменения свойств разных остатков триптофана
(рис. 10). Анализ зависимостей обратной величины площади под
спектрами компонент 1(^=328 им) и П(Х=344нм) от отношения
температуры к вязкости T/rj, пропорциональное коэффициенту диффузии,
(рис. 106) показал, что при нагревании до ~60°С эти зависимости линейны,
что
характерно
для
чистого
температурного
тушения
(Bushueva et al., 1978; 1980), и лишь при температуре >60°С наблюдается
резкое отклонение от линейности и падение квантовых выходов обеих
компонент. Учитывая, что температурное тушение компоненты I много
более эффективно, чем компоненты П, можно считать, что
результирующий длинноволновый сдвиг суммарного спектра от 20 до 60°С
определяется не столько структурной перестройкой тетрамера, сколысо
более эффективным тушением коротковолновой компоненты соседними
группами в белке.
6
зд ий-"-"
а' • ' • I i \ \ .Л О.ОФ. k U Ь 'дЛ h i . ' I »•!•<•
200 400 «00 800 1000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
f,C
Щ
1т
Рис. 9 Влияние температуры яа флуоресценциютетрамерногомелиттина. а зависимость от температуры положения максимума спектров (кривая 1) и вкладов логнормальных компонент с положением максимумов при 328,344 и 351 им (кривые
2,3
и 4, соответственно) в нормированные по интенсивности спектры (С =5-10'5 М, 2 М
КО в 0,01 М трис-HCl, рН 7,4) б - зависимость от отношения Т/т| величин обратного
квантового выхода 1/q компонент тетрамера мелиттина с А*,» 328 (кривая 1) и 344 нм
(кривая 2) в - фазовое представление в кординатах (139о, Ъго) для температурной
зависимости спектров флуоресценции тетрамера мелиттина
В то же время, резкое падение квантовых выходов компонент I и П и
рост компоненты Ш(Ав,=351 нм) свидетельствуют о разрыхляющем
структурном переходе в тетрамере. Это подтверждается и переломом при
температуре ~бб°С линейной зависимости в псевдо-фазовом графике
(рис. 10в). Такая интерпретация полностью согласуется с результатами
исследования влияния температуры на структуру окружения остатков
Тгр19 в тетрамерном мелиттине методами ЯМР (Iwadate et al., 1998).
Истинного разворачивания субъединиц в структуре тетрамера при
нагревании до 95°С не наблюдалось.
Таким образом, анализ температурных изменений вкладов логнормальных компонент спектров флуоресценции тетрамера мелиттина
позволил выявить и правильно интерпретировать тонкие изменения в
состоянии остатков триптофана, индуцированные ростом температуры
15
Денатурация р-лактоглобулина мочевиной
Денатурацию Р-лактоглобулина (р-ЛГ) из коровьего молока
мочевиной исследовали при рН4,5 в присутствии 0,15 МКС1 при
температуре 4°С. Спектр флуоресценции нативного Р-ЛГ имеет форму
стандартной лог-нормальной функции с максимумом ~330нм.
Однокомпонентный характер спектра сохранялся при содержании
мочевины до ~3 М. При более высоких концентрациях мочевины спектры
флуоресценции р-ЛГ наилучшим образом описываются суммой трех логнормальных компонент с максимумами 330,349 и ~335-340 нм.
Рис. 10.
Зависимости
от
концентрации мочевины вкладов
лог-нормальных компонент в
общую площадь под спектрами
флуоресценции р-лактоглобулина
при рН 4,5 в присутствии 0,15 М
КС1 при температуре 4°С
4
6
[Мочевина] М
Компонента 335-340 нм имеет наибольшие вклады при концентрациях
мочевины 4 М и 5М. При содержании мочевины >6М в спектре
оставалась только компонента с максимумом при 349,0 нм.
Таким образом, использование компонентного анализа спектров
триптофановой флуоресценции позволило показать, что в процессе
денатурации
Р-ЛГ мочевиной образуются интермедиаты при
концентрациях денатурата 4 М и 5 М.
Взаимодействие продана с бычьим сывороточным альбумином
На рис. 11 представлены спектры флуоресценции свободного
продана в воде и в комплексе с бычьим сывороточным альбумином (БСА)
при разных их молярных соотношениях. При высоких молярных
отношениях БСАшродан большинство молекул зонда связывается в
наиболее сильном центре связывания ароматических лигандов
В семействе спектров, измеренных при молярных отношениях
БСА:продан 0,22, 0,68, 2,2 и 4,5, появляется полоса флуоресценции
связанного продана в области 450 нм, а в области -495 нм наблюдается
изоэмиссионная точка. Это означает, что продан в исследуемой системе
находится лишь в двух состояниях: свободном (или слабо связанном на
поверхности белка) и в низкополярном центре связывания, близком по
полярности к ацетонитрилу или ацетону. Спектры излучения разлагаются
на две лог-нормальные компоненты (уравнения 1 и 4,4а) с положением
максимумов при 524±3 и 454±2 нм (пунктирные линии на рис. 11).
J6
РисП. Влияние связывания продана с
БСА на спектры флуоресценции
(о) - 3 цМ продана в 0,01 М трис, 0,15 М
1.0 I -
/,
™ men
,£тГ%
"
NaCl, р Н 7,0 в отсутствие (спектр 1) и
присутствии
БСА
(спектры 2 - 5
соответствуют молярным отношениям
БСА:продан 0,22, 0,62, 2,25 и 4,5) и их
аппроксимация
суммой
двух логнормальных функций (сплошные линии)
Пунктирные кривые - лог-нормальные
компоненты спектров
Их вклады зависят от отношения БСАшродан. Анализ изменения вкладов
компонент показал, что константа равновесия образования комплекса
равна ~1 105 М"1. При этом квантовый выход флуоресценции продана в
комплексе с БСА в 3,5 раза выше, чем у свободного красителя в растворе.
Флуоресценция акрилодана в конъюгате с субфрагментом S1 миозина
При молярном соотношении акрилодана к субфрагметнту S1
миозина 1:1 краситель связывается с наиболее реактивной тиольной
группой Cys707. Спектры излучения такого конъюгата имеют максимум,
равный 505 нм (рис. 12а), но полуширина спектра больше полуширины
спектра акрилодана при этом положении максимума в соответствии с
зависимостями (4) и (4а), т.е. спектр конъюгата неоднороден.
550
600
450
500
550
600
450
500
550
600
Л,нм
Рис 12. Аппроксимация экспериментальных спектров флуоресценции (точки)
конъюгатов акрилодана с субфрагментом S1 миозина суммой двух лог-нормальных
компонент (сплошные линии) при молярных отношениях 1:1 (а) и 2:1 (6) в
присутствии разных концентраций тушителя KI (а - 0,0,05,0,15,0,20 и 0,30 М, б - 0,
0,05, 0,10, 0,15, 0,20 и 0,30 М) (в) - комплекса конъюгата 1:1с F-актином (сплошная
линия) Пунктирные линии-лог-нормальные компоненты спектра
В отсутствие тушителя положения максимумов лог-нормальных
компонент равны 451,5±3 и 506±1 нм с вкладами 11±3 и 89±3%,
соответственно (рис. 12а). Спектр коротковолновой компоненты
соответствует спектру модельного конъюгата акрилодана с трипептидом в
хлороформе, а спектр длинноволновой компоненты близок к спектру этого
коныогата в этаноле. С ростом концентрации иодида вклад
коротковолновой компоненты возрастает, а вклад длинноволновой падает
по закону Штерна-Фольмера с KSv = l,02±fi,Q7 M"1. Это вдвое ниже
доступности модельного коныогата в воде Ksv - 1,95±0,09 М"1, что
коррелирует с низкой доступностью Cys707 в структуре S1.
Спектр флуоресценции акрилодана в конъюгате с S1 при молярных
отношениях краситель:81 2:1, когда кроме Cys707 акрилодан связывается
и с Cys697 SI и с Cysl78 связанной с ним легкой цепи, значительно
отличается от спектра коныогата 1:1 (рис. 136), максимум спектра смещен
в длинноволновую сторону до 511 нм. Спектр описывается суммой
компонент, с положением максимумов при 454±3 и 512±1 нм и вкладами
6±1 и 94±1%, соответственно. В присутствии иодида, как и в случае
коныогата 1:1, наблюдается тушение длинноволновой части спектра и
относительное возгорание коротковолновой, с изоэмиссионной точкой при
476 нм (рис. 136). Интенсивность
длинноволновой
компоненты
уменьшается по закону Штерна-Фольмера с Ksv = 2,8±0,14 М"\ что на ~
40% превышает значение Ksv для модельного коныогата в воде. Это,
возможно, обусловлено существованием положительного заряда в
окружении излучающего флуорофора в конъюгате 2:1. Поскольку, судя по
кристаллической структуре, в отличие от Cys707 и Cys697 субфрагмента
SI (Rayment et al, 1993), Cysl78 легкой цепи хорошо доступен
растворителю, можно полагать, что именно связанный с ним флуорофор
вносит главный вклад в длинноволновую компоненту флуоресценции
коныогата 2:1.
При связывании коныогата акрилодан-Sl 1:1 с F-актином
положение максимума спектра комплекса, по сравнению со спектром
конъюгата 1:1 смещено в коротковолновую сторону до 496 нм (рис. 12в).
Положения максимумов компонент равны 453 нм и 501 нм с вкладами
16±3 и 84±3%, соответственно. В отличие от конъюгата 1:1, в спектре
комплекса этого конъюгата с F-актином относительный вклад
коротковолновой компоненты возрастает без изменения положения
полосы, а положение второй компоненты смещается на бнм в
коротковолновую сторону. При связывании S1 с F-актином, вероятно,
уменьшается полярность и (или) скорость релаксации окружения
акрилодана, связанного с Cys707.
Обсуждение результатов
Представленные результаты исследований позволяют подвести
некоторые итоги и сформулировать ряд общих преимуществ, которые дает
компонентный анализ спектров флуоресценции в исследовании
структурных состояний и переходов белков.
18
Эмпирическая
однозначная
зависимость
положения
полумаксимальных амплитуд от положения максимума спектров
флуоресценции флуорофоров показывает, что форма спектра излучения
определяется только положением его максимума. Форма элементарных
спектров флуоресценции остатков триптофана в белках или
присоединенных красителей описывается однопараметрической логнормальной функцией.
По соотношению положения максимума спектра и его ширины на
уровне полумаксимальной интенсивности можно оценить, однороден
(однокомпонентен)
ли
спектр.
Однокомпонентному
спектру
флуоресценции флуорофора соответствует полуширина, равная разности
значений положения полумаксимальных амплитуд при данном положении
максимума, для остатка триптофана- уравнение(3), для продана уравнения (4) и (4а). Если полуширина спектра превышает это
теоретическое значение, то спектр имеет составной характер, и
целесообразно производить его разложение на лог-нормальные
компоненты.
Определенность параметров лог-нормальных компонент значительно
повышается при одновременной обработке всего массива спектров,
полученных в эксперименте.
Получаемые при разложении компоненты следует рассматривать как
принадлежащие группам флуорофоров с разным типом окружения.
Опираясь на значения квантовых выходов флуоресценции белка и
вклады отдельных компонент, можно оценить значения их квантовых
выходов. Разложение спектров в присутствии разных концентраций
тушителей позволяет определить константы Штерна-Фольмера для каждой
компоненты, т.е. оценить доступность растворителю флуорофоров,
которым принадлежат эти компоненты.
Изучение переходов в белках с использованием компонентного
анализа спектров флуоресценции позволило получить более детальную
информацию как о ходе перехода, так и о ряде его особенностей. Для
процессов олигомеризации белков, связывания ионов или лигандов
оказалось, что отдельные компоненты спектра (их положение максимума,
выход излучения) более чувствительны к переходу. Это повысило качество
регистрации перехода и позволило точнее определить такие его
характеристики, как стехиометрия олигомеризации, связывание лиганда.
В случае тепловой денатурации особенно информативным оказался
анализ линейности зависимостей обратных выходов излучения в
отдельных компонентах от отношения абсолютной температуры к
вязкости растворителя Т/ц, В зонах чистого температурного тушения эти
зависимости должны быть линейными. Различная эффективность
температурного тушения, либо тушения под действием других эффекторов
(например, рН) приводит к сдвигам спектров флуоресценции белка,
19
которые обычно ошибочно приписывают структурному переходу. Анализ
соотношения эффективности тушения отдельных компонент помогает
избежать такой ошибки интерпретации.
Применение компонентного анализа спектров флуоресценции
позволило однозначно показать, что полностью тетрамеризованное
состояние мелиттина содержит остатки триптофана в разном структурном
окружении. Данных о протекании процесса олигомеризации мелиттина
через интермедиат в литературе нет. Эти данные получены нами впервые.
Использование компонентного анализа спектров триптофановой
флуоресценции позволило показать сложный характер процесса
денатурации р-лактоглобулина мочевиной, протекающий с образованием
интермедиатов, определить область существования и охарактеризовать их.
Параллельно с развитием методов, основанных на собственной
флуоресценции белка, развиваются методы исследования белков и других
биологических структур с использованием флуоресцентных красителей.
Так как для характеристики окружения красителей в структуре белков и
исследования ее перестроек используется анализ изменения спектров
излучения, представляло интерес проверить возможность использования в
этих случаях методов и подходов, развитых для анализа составных
спектров, основанных на аналитическом описании формы спектров логнормальной функцией.
Анализ спектров флуоресценции присоединенных к белкам меток и
зондов подтверждает возможность их разложения на лог-нормальные
компоненты и позволяет получать дополнительную информацию об
исследуемой системе.
Выводы
1. На основе описания гладких асимметричных спектров
флуоресценции различных флуорофоров лог-нормальной функцией
показано, что форма спектра полностью определяется положением его
максимума. Это позволяет представить элементарные спектры
флуоресценции остатков триптофана или присоединенных красителей в
белке двухпараметрической лог-нормальной функцией, зависящей от
положения максимума и максимальной амплитуды.
2. Разработаны приемы и методы для анализа составных спектров
флуоресценции белков на элементарные лог-нормальные компоненты, что
дает возможность изучать спектроскопические и структурно-физические
свойства отдельных классов или индивидуальных флуорофоров в белке.
3. Исследование поведения отдельных компонент позволяет
раздельно анализировать изменения состояния индивидуальных остатков
триптофана или их групп в процессе перехода. В целом, это позволяет
создать единый, основанный на измерениях спектров флуоресценции,
подход к анализу перестроек и физико-химических переходов белков.
20
4. С помощью компонентного анализа спектров флуоресценции
мелиттина обнаружено, что процесс его олигомеризации протекает через
тетрамерный интермедиат, отличающийся по свойствам от тетрамера при
максимальных концентрациях соли и белка.
5. Применение компонентного анализа спектров флуоресценции
позволило однозначно показать, что мелитган в полностью
тетрамеризованном состоянии содержит остатки триптофана в двух типах
структурного окружения с сильно различающейся полярностью и
доступностью ионным тушителям.
6. На примерах продана и акрилодана показано, что описание их
спектров
флуоресценции
лог-нормальной
функцией
позволяет
анализировать состояние окружения в белках флуоресцентных зондов
(продана) и ковалентно связанных меток (конъюгатов акрилодана).
Разложение составных спектров флуоресценции зондов и меток в белке
позволяет анализировать изменения их окружения в процессах
структурных и физико-химических переходов содержащих их белков.
Основные публикации по теме диссертации
1. Бурштейн Э.А.,
Емельяненко В.И.,
Веденкина Н.С.
1981.
Аналитическое описание спектров флуоресценции триптофана и
проверка
справедливости
модели
дискретных
состояний
триптофановых остатков в белках. Тез. докл. W Всес. Конф. по
спектроскопии биополимеров. Харьков. С. 25-26.
2. Емельяненко В Л , Веденкина Н С , Бурштейн Э.А. 1982. Анализ
формы спектров собственной флуоресценции белков. Тез. докл. Всес.
Биофизич. съезда, Москва. С. 33-34.
3. Емельяненко ВЛ., Бурштейн Э.А. 1984. К проблеме разложения
бесструктурного спектра флуоресценции белка на компоненты. Тез.
докл V Всес. Конф. по спектроскопии биополимеров. Харьков. С. 8384
4. Емельяненко В.И., 1991. Аналитическое представление формы
спектров
флуоресценции
стандартов.
Калибровка
спектрофлуориметра на спектральную чувствительность в УФ
области. Ж Ярдам Спектроск. 55:587-593.
5. Емельяненко В.И. 1995 Некоторые свойства триптофаниловой
флуоресценции белков Тез. докл. Международная научная
конференция "Физика и химия органических люминофоров 9 5 "
Харьков С. 50
6. Burstein E.A., Emelyanenko V.I. 1996. Log-normal Description of
fluorescence Spectra of Organic Fluorophores. Photochem. Photobiol 64:
316-320.
21
7. Емельяненко В Л , БурштейнЭА. 1998. Аналитическое описание
спектров флуоресценции ароматических аминокислот и белков
Ж. Прикя Спектроск 65:360-365.
8. Емельяненко ВЛ., Решетник .Я.К., Андреев ОЛ., Бурнггейн Э.А.
2000. Анализ лог-нормальных компонент спектров флуоресценции
связанных с белком продана и акрилодана Биофизика. 45:207-219.
9. Emelyanenko V.I., BursteinEA. 2001. Dielectric relaxation times
evaluation for environment of two individual tryptopha residues in the
fibrinogen E-fragment Abstr. 7* Conference on Methods and
Applications of Fluorescence. Amsterdam, The Netherlands. P.51.
WXinkeD., Frank J., Pope MS., Soil J., DkavetsL, FrommeP.,
BursteinEA., Reshetayak Ya.K. and Emelyanenko VJ. 2004. Folding
kinetics and structure of OEP16 Biophys J., 86:1-9.
П.ЕмельяненкоВЛ.,
Гршцешсо ВМ.,
БурштейнЭА.
2005.
Компонентный анализ спектров триптофановой флуоресценции
мелитпша в процессе олнгомеризации. Биофизика, 50:623-530.
12.Емельяненко В Д., Грищенко В.М., БурштейнЭА. 2007. Принципы
использования компонентного анализа спектров флуоресценции для
исследования переходов в белках. Тепловые я рН-индуцируемые
переходы в тетрамерном мелиттине. Биофизика (в печати).
22
Принято в печать 29.07.2007. Заказ № 17. Тираж 70 экз.
ООО «Фотон-век». ИНН 5039008988
г. Пущине Московская область.
(4967) 73-94-32
beornot@rambler га
http://photon-vek.narod.ru - кварцевые кюветы
23