влияние гипертермии на соотношение протеиназ различных

УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ГИПЕРТЕРМИИ
НА СООТНОШЕНИЕ ПРОТЕИНАЗ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ
В ПРОРАСТАЮЩИХ ЗЕРНОВКАХ ПШЕНИЦЫ
И.Ф. Александрова, Т.И. Николаева, А.А. Веселова
Нижегородский госуниверситет
Изучена активность кислых (pH 3.5) и щелочных (pH 7.8) протеиназ у
4-дневных прорастающих зерновок пшеницы при гипертермическом воздействии (42оС, 2 часа). Тепловой стресс приводил к снижению протеолитической активности как при кислом, так и при щелочном значениях pH на фоне
существенно более высокой активности при pH 3.5. Использование ингибиторов и активаторов протеиназ позволило предположить, что при тепловом
воздействии падение скорости протеолиза при кислом pH происходит в основном в результате снижения активности аспартатных протеиназ, а при
щелочном — металлопротеиназ, что приводит к изменению соотношения
различных типов протеиназ в прорастающих зерновках.
Тепловой стресс сопровождается изменением активности катаболических процессов в растениях. Как правило, указывается на повышение скорости гидролитического расщепления биополимеров, приводящее к возрастанию осмотического
давления и удержанию воды в клетках (Блехман, Шеламова, 1992). Однако такая
довольно чёткая зависимость не обнаруживается при исследовании протеолитических ферментов, типы которых и функции, выполняемые ими, весьма разнообразны (Sanjeev, Malik, 1988; Шишова и др., 1997; Александрова и др., 1999). Отмечено также, что при стрессе изменяется и содержание ингибиторов протеиназ
(Мосолов, 1998), что ещё более усложняет ответную реакцию растений на действие стрессорных факторов.
Цель данной работы изучить влияние гипертермии на активность кислых и
щелочных протеиназ в 4-дневных прорастающих зерновках пшеницы и проследить изменение соотношения различных типов протеиназ у контрольных и опытных проростков с использованием ингибиторного анализа.
В качестве объекта исследования использовали зерновки пшеницы сорта Московская 35, пророщенные в течение четырёх дней в термостате без освещения при
25оС на растворе 2 мМ CaSO4. Опытные проростки подвергали 2-часовой гипертермии при 42о С.
Активность протеиназ определяли по методу Ансона, субстратом служил
0.5%-ный гемоглобин на цитрат-фосфатном буфере (pH 3.5) или 0.25%-ный казеин на том же буфере (pH 7.8). Зерновки гомогенизировали в 0.9%-ной NaCl в соотношении 1:10. Инкубационная среда: 1 мл гомогената, 1 мл субстрата, 1 мл буфера или дополнительных реагентов, влияющих на протеолитическую активность. Конечные концентрации: ПХМБ, ЭДТА, цистеин — 1⋅10-3 М; иодацетамид — 1⋅10-4 М; пепстатин — 2⋅10-5 М. Время инкубации 1 ч при 37оС. Повторность опытов 3–5-кратная. Статистическую обработку проводили методом парных сравнений для связанных выборок с использованием критерия Стьюдента.
172
Из приведённых в таблице 1 результатов исследования видно, что в 4-дневных
прорастающих зерновках пшеницы основной вклад в расщепление белков вносили кислые протеиназы; их активность как в контроле, так и в опыте была в несколько раз выше (в 16.2 и 18.7 раз, соответственно). Высокотемпературное воздействие приводило к достоверному снижению интенсивности распада белков
при участии кислых и щелочных протеаз.
Таблица 1
Активность кислых и щелочных протеиназ в 4-дневных прорастающих
зерновках пшеницы, мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр. массы-1
рН
3.5
7.8
контроль
9.08
0.56
Х
тепловой стресс
7.50
0.40
Sd
p
0.53
0.06
0.02 < p < 0.05
0.05
%
к контр.
82
71
Обозначения: X — средняя арифметическая выборки, sd — стандартная ошибка разницы в парах
сравнений, р — уровень значимости.
Известно, что в распаде белков в семенах при прорастании участвуют различные типы протеиназ. Для выяснения уровня активности некоторых типов протеиназ при используемых значениях pH нами была проведена самостоятельная серия
опытов с применением ингибиторов и активаторов протеиназ. Результаты этих
опытов представлены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Активность щелочных протеиназ в присутствии модуляторов
Модулятор
активности
Без добавок
+ Цистеин
+ ЭДТА
+ ПХМБ
Контроль
мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр.
массы-1
0.60
1.72
0.20
не ингибировал
%
195
34
Тепловой стресс
мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр.
массы-1
0.48
0.85
0.46
не ингибировал
%
176
96
Анализ таблицы 2 показал, что под влиянием ингибитора цистеиновых протеиназ — ПХМБ ферментативная активность не снижалась ни в контроле, ни в
опыте, что должно говорить об отсутствии или очень незначительном вкладе этого типа протеиназ в расщепление белков при слабощелочном значении pH. В то
же время в присутствии цистеина отмечено возрастание активности. Можно
предположить, что создание более восстановленных условий и, в частности, возможное восстановление в белках-субстратах дисульфидных групп в сульфгидрильные делает их более доступными для протеолиза. В присутствии ЭДТА существенно (на 66%) снижалась активность в контрольном варианте и мало изменялась в опыте. Очевидно, падение активности, вызванное тепловым воздействием, происходит в значительной степени за счёт уменьшения активности металлопротеиназ. Не исключено также, что суммарное падание активности при щелочном значении pH наблюдалось и за счёт изменения активности пептидаз, среди
которых есть и металлсодержащие (Сарбаканова и др., 1987).
173
Таблица 3
Влияние модуляторов на активность кислых протеиназ
Модулятор
активности
Без добавок
+ Иодацетамид
+ ПХМБ
+ Цистеин
Без добавок
+ Пепстатин
+ ЭДТА
Контроль
мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр.
массы-1
9.08
7.61
8.22
7.86
7.72
0.56
не ингибировал
%
84
90
87
28
Тепловой стресс
мкмоль тир ⋅ мин-1 ⋅ г сыр.
массы-1
7.50
8.05
6.81
10.80
6.43
4.98
не ингибировал
%
107
90
144
77
ЭДТА при кислом значении pH в обоих вариантах опыта не снижал протеолиза. Основной вклад в уменьшение активности при тепловом стрессе, как видно из
таблицы 3, вносили аспартатные протеиназы: в присутствии пепстатина в контроле активность снижалась на 72%. В варианте с тепловым воздействием процент
ингибирования был значительно ниже. Можно предположить, что снижение суммарной активности протеиназ при гипертермии происходило за счет падения активности именно этого типа протеолитических ферментов. Аспартатные протеиназы, синтезирующиеся и локализованные в основном в зародыше, щитке, алейроновом слое, выполняют важную роль в процессинге и активации различных
белков — предшественников гидролаз перед их секрецией в эндосперме. В эндосперме аспартатные протеиназы локализованы в участке, прилегающем к щитку
(Kervinen et al., 1995). Менее четкие данные получены при использовании иодацетамида, ПХМБ и цистеина: они позволяют предположить наличие небольшой
доли цистеиновых протеиназ.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют об уменьшении
протеазной активности в 4-дневных прорастающих семенах пшеницы под влиянием высокотемпературного воздействия как при кислом (3.5), так и при щелочном (7.8) значениях pH. Наиболее существенные изменения при тепловом стрессе
происходят за счёт падения активности кислых аспартатных протеиназ. Вклад
металлопротеиназ в этот процесс сравнительно невелик, как и в целом их активность при слабощелочном значении pH. Вследствие этих изменений должно происходить смещение соотношения активностей протеиназ различных типов, направленное на повышение адаптивных возможностей организма в условиях стресса.
ЛИТЕРАТУРА
Александрова И.Ф., Веселов А.П., Зайцева И.В., Хесина О.В. Влияние гипертермии на
активность кислых протеиназ в семенах пшеницы при прорастании // Вестник Нижегор.
ун-та, сер. биол.. 1999. С. 105–108.
Блехман Г.И., Шеламова Н.А. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса //
Успехи современной биологии. 1992. Т. 112, вып. 2. С. 281–294.
Мосолов В.В. Новое о природных ингибиторах протеолитических ферментов // Биоорганическая химия. 1998. Т. 26. С. 273–278.
Сарбаканова Ш.Т., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Руденская Г.Н. Карбоксипептидаза семян пшеницы // Биохимия. 1987. Т. 52, вып. 8. С. 1167–1171.
174
Шишова Т.К., Руденская Ю.А., Лихолат Т.В., Мосолов В.В. Восстановление жизнеспособности зерна пшеницы, подвергнутого стрессовому воздействию под влиянием ризосферных микроорганизмов // ДАН. 1997. Т. 356. С. 285–286.
Kervinen J., Tormakangas K., Runeberg-Roos P. et al. Structure and possible function of
aspartic proteinases in barley and other plants // Adv. Exp. Med. Biol. 1995. V. 362. P. 241–254.
Sanjeev K., Malik C. Correlated changes of some amino acids and protease in wheat seedling
subjected of water and temperature stresses // Phyton. 1988. V. 28. P. 261–269.
175