Шаблон секции нашей конференции
advertisement
Использование ПАВ в бумажной хроматографии для разделения и определения биогенных аминов Е.Ю.Бырина Научный руководитель — к.х.н., доцент Ю.Ю. Петрова Сургутский государственный университет, г. Сургут, e-mail: famfour@mail.ru Бумажная хроматография (БХ) является простым и удобным методом разделения и идентификации многих биологически активных соединений. Впервые ПАВ в планарной хроматографии применили в 1963 г в БХ. Значительно позже ПАВ стали использовать для импрегнирования различных сорбентов в ТСХ в составе мицеллярных подвижных фаз. Ранее нами была разработана методика сорбционнокаталитического определения гистамина на фильтровальной бумаге по его активирующему действию в реакции окисления гидрохинона пероксидом водорода. В данной работе использовали метод БХ, в котором модифицировали подвижную фазу добавлением в нее малых количеств ПАВ, додецилсульфоната натрия (ДДСNa) и цетил триметиламмоний бромида (ЦТАБ), или неподвижную фазу путем добавления растворов ПАВ в пятно на линию старта либо импрегнирования ПАВ в хроматографическую бумагу (ХБ) с использованием растворов парафина и окисленного атактического полипропилена (ОАПП) в гексане трех марок низко (н)-, средне (ср)- и высоко (в)-ОАПП. В качестве модельной выбрали смесь, содержащую биогенный гетероциклический амин гистамин (Hisam) и его предшественник гистидин (His). В некоторых исследованиях в эту модельную смесь добавляли адреналин и норадреналин. Подвижной фазой в БХ служила смесь н-пропанол–NH3·H2O (7:3), обеспечивающая эффективное разделение гистамина и гистидина ( 8,93). Для проявления пятен на хроматограмме использовали 0,25 % раствор нингидрина в ацетоне. Исследование влияния выбранных ПАВ показало, что эффективность разделения гистамина и гистидина выше в случае импрегнирования ПАВ в бумагу. При этом наибольшие факторы разделения () достигнуты в случае импрегнирования ДДСNa с парафином и ЦТАБ со ср-ОАПП. Для оптимизации условий БХ в случае импрегнирования ПАВ в бумагу изучили зависимость эффективности разделения от концентрации парафина и ср-ОАПП в гексане. С увеличением концентрации парафина с 0,05 % до 5 % эффективность разделения увеличивается в 1,6 раз. Однако время хроматографирования в случае 5 % парафина значительно увеличивается. Поэтому, в качестве оптимального выбрали 1 % раствор парафина. При этом время хроматографирования составило 2–2,5 часа. В случае со ср-ОАПП с увеличением его концентрации с 0,5 до 5 % эффективность разделения растет, а затем при 10 % — уменьшается. В качестве оптимальной концентрации для импрегнирования выбрали 5 % ср-ОАПП в гексане. Для оптимизации концентрации ПАВ в растворе для импрегнирования ХБ изучили зависимость Rf гистамина и гистидина от концентрации ПАВ в интервале 0,02–1,00 мкмоль/см2. При этом показано, что подвижность гистамина на бумагах с ДДСNa и ЦТАБ повышается, а гистидина — повышается с ДДСNa и понижается с ЦТАБ. Поэтому, эффективность разделения компонентов модельной смеси выше на бумагах, импрегнированных ДДСNa (0,02– 0,75 мкмоль/см2). Активирующий эффект гистамина в присутствии ДДСNa увеличивается вплоть до концентрации 0,3 мкмоль\см2 ПАВ. Увеличение концентрации ЦТАБ в растворе для импрегнирования приводит к уменьшению активирующего эффекта гистамина. Поэтому, импрегнирование ЦТАБом оказалось нецелесообразным. Определение гистамина проводили непосредственно на ХБ, импрегнированной ДДСNa, сорбционно-каталитическим методом после БХ. Для оптимизации условий проведения индикаторной реакции на ХБ после разделения методом БХ, была изучена зависимость скорости реакции от рН в интервале от 5,0 до 7,5, концентрации добавляемой Cu (II) от 1·10–4 до 60 мкг/мл и выбраны pH 6,5 и 20 мкг/мл Cu (II). В оптимизированных условиях получена градуировочная зависимость, которая позволяет определять гистамин в интервале концентраций 1·10–12–5·10–11 М из 2 мкл анализируемого раствора с сmin 8·10–13 М (сн 1·10–12 М, sr 0,08). Определению 10–11 М гистамина не мешают 10–3 М 2, 2’–дипиридила, 10–2 М пиридина и гистидина, а так же 10–3 М норадреналина и адреналина. При этом показано, что импрегнирование ХБ ДДСNa не ухудшает селективность определения. Методика определения гистамина применена при анализе слюны. В анализируемом образце слюны, разбавленной в 10 4 раз, найдено (2,11 ± 0,53)·10–11 М гистамина по методу добавок и (2,34 ± 1,57)·10– 11 М гистамина по градуировочному графику при норме 2,20·10–13 М.
