1 002588 2 Изобретение касается способа биосинтеза

1
Изобретение касается способа биосинтеза,
позволяющего получать кобаламины. Более
точно, оно касается способа увеличения продукции кобаламинов и, в частности, кофермента
B12, методами генной инженерии (методами
рекомбинантных ДНК) и/или путем добавления
нового предшественника кобаламинов. Наконец, настоящее изобретение касается способа
получения рекомбинантных штаммов, используемых в способе получения кобаламинов согласно настоящему изобретению.
Витамин B12 входит в класс молекул, называемых кобаламинами, строение которых
представлено, в частности, в заявке WO
91/11518.
Кобаламины синтезируют почти исключительно при помощи бактерий по сложному процессу, также описанному в заявке WO 91/11518.
На промышленном уровне в связи с высокой
сложностью механизмов биосинтеза производство кобаламинов и, в частности, витамина B12
осуществляют, главным образом путем культивирования в большом объеме бактерий Pseudomonas denitrificans, Propionobacterium shermanii и Propionobacterium freudenreichii.
Широко известно, что кобаламины синтезируются некоторыми микроорганизмами из
следующих субстратов: аминолевулиновой кислоты, S-аденозил-L-метионина, кобальта, глутамина, R1-амино-2-пропанола и 5,6-диметилбензимидазола.
Среди предшественников, названных выше, 5,6-диметилбензимидазол синтезируется
микроорганизмами, продуцирующими кобаламины. Представляется, что существуют два способа биосинтеза 5,6-диметилбензимидазола:
один способ является характерным для аэробных микроорганизмов и требует участия молекулярного кислорода, другой способ используется анаэробными микроорганизмами. Был выделен единственный ген, принимающий участие
в анаэробном процессе, речь идет о гене соbТ
Salmonella thyphimurium (Trzebiatowski et al.,
1994). К настоящему времени у аэробных микроорганизмов не был идентифицирован ни один
ген, синтезирующий 5,6-диметилбензимидазол.
Количество 5,6-диметилбензимидазола, синтезируемого микроорганизмами, часто является
лимитирующим.
Таким образом, 5,6-диметилбензимидазол
получают химически и добавляют в рабочие
среды. Упразднение этого добавления в среды
будет представлять, таким образом, определенное преимущество.
До сих пор ни в одном из способов промышленного получения кобаламинов не упоминается о добавлении предшественников, отличных от кобальта и 5,6-диметилбензимидазола.
Недавно были описаны (Crouzet et al., 1990,
Grabau et al., 1992) некоторые штаммы, продуцирующие кобаламины только на средах, содержащих R1-амино-2-пропанол. Таким обра-
002588
2
зом, R1-амино-2-пропанол может быть использован для улучшения производства кобаламинов. Однако его использование для возможной
промышленной ферментации является трудным
и дорогостоящим, так как, с одной стороны, R1амино-2-пропанол является раздражающим и
летучим продуктом, и, с другой стороны, он
может ингибировать рост микроорганизма. Следовательно, будет особенно выгодным найти
другой предшественник R1-амино-2-пропанольного остатка кобаламинов, не обладающий этими неудобствами. В этом отношении, описан
способ биосинтеза R1-амино-2-пропанола, начиная с L-треонина, через аминоацетон, некоторыми микроорганизмами. Но L-треонин не допускает, между тем, комплементацию штаммов,
упоминавшихся выше.
Вообще чтобы улучшить производство кобаламинов может быть полезным увеличение
количества их предшественников в среде, в особенности, если они являются лимитирующими.
Этот подход может быть осуществлен либо путем добавления в среду непосредственно лимитирующего предшественника или одного из его
производных или аналогов, либо путем усиления синтеза in situ этого предшественника в
продуцирующем штамме, с использованием
методов генной инженерии и, в частности, метода рекомбинантных ДНК.
Знание способов биосинтеза кобаламинов
и их предшественников является, на этот предмет, ключевым этапом для улучшения производства кобаламинов.
Так, большинство стадий способа биосинтеза витамина B12 были недавно охарактеризованы для Pseudomonas denitrificans (Blanche et
al., 1995). Было выделено не менее 22 генов cob,
вовлеченных в биосинтез кобаламинов и была
идентифицирована функция большинства полипептидов, кодируемых этими генами.
Другие гены, возможно, вовлеченные в
биосинтез кобаламинов или их предшественников, были выделены из других микроорганизмов. Иногда функция этих генов неизвестна.
Одно точное определение их роли или их влияния позволит найти им применение. Так, у факультативной фотосинтетической бактерии
Rhodobacter capsulatus недавно был секвенирован фрагмент ДНК, несущий, по меньшей мере,
один ген, необходимый для образования фотосинтетического аппарата (Pollich et al.,1993,
Pollich et al.,1995a). Было высказано предположение, что 5 из 8 выделенных генов, по причине
их сильного подобия 5 из 22 генов cob
Р.denitrificans, описанных выше, являются генами биосинтеза кобаламинов. Зато никакую определенную функцию не удалось непосредственно приписать 3 оставшимся генам bluB, bluE
и bluF. Гены bluВ, bluE и bluF, включая их промотирующие последовательности, были секвенированы и описаны в работе Pollich et
al.,1995a.
3
Согласно настоящему изобретению обнаружен новый предшественник кобаламина. Настоящее изобретение на самом деле позволяет
улучшить продуцирование кобаламина средами,
содержащими О-фосфо-L-треонин. Этот предшественник кобаламина, не описанный до сегодняшнего дня, играет роль, сравнимую с ролью
другого, уже известного, предшественника, R1амино-2-пропанола. Однако О-фосфо-L-треонин
обладает преимуществом по сравнению с R1амино-2-пропанолом, состоящим в том, что он
является нетоксичным и простым в обращении.
Кроме того, его эффективность с точки зрения
улучшения продуцирования кобаламинов может
быть более чем в 1000 раз выше эффективности
R1-амино-2-пропанола.
Предметом настоящего изобретения является также использование фрагмента ДНК Rhodobacter capsulatus для улучшения продуцирования кобаламинов или для осуществления или
увеличения синтеза in situ O-фосфо-L-треонина
или 5,6-диметилбензимидазола данной клеткой.
Настоящее изобретение позволяет получить улучшенное продуцирование кобаламинов
на средах, не содержащих R1-амино-2-пропанол
или О-фосфо-L-треонин, путем использования
фрагмента ДНК, несущего, в частности, гены
bluЕ и bluF Rhodobacter сарsulatus.
Настоящее изобретение позволяет, наконец, получить улучшенное продуцирование кобаламинов на средах, не содержащих 5,6диметилбензимидазол, путем введения фрагмента ДНК, несущего, в частности, ген bluВ
Rhodobacter capsulatus.
Предметом настоящего изобретения является способ биосинтеза кобаламинов путем
ферментации прокариотического микроорганизма, продуцирующего кобаламины, отличающийся тем, что в качестве указанного микроорганизма
используют
рекомбинантный
штамм микроорганизма, трансформированный
фрагментом ДНК, содержащим гены bluЕ и bluF
Rhodobacter capsulatus, кодирующие фермент,
вовлеченный в биосинтез О-фосфо-L-треонина,
или гомологичным фрагментом и/или фрагментом, который гибридизуется с указанными генами bluЕ и bluF и кодирует фермент, вовлеченный в биосинтез О-фосфо-L-треонина, и культивируют указанный штамм в условиях, обеспечивающих экспрессию данного фермента и продуцирование кобаламинов.
Другим предметом изобретения является
способ биосинтеза кобаламинов путем ферментации прокариотического микроорганизма, продуцирующего кобаламины, отличающийся тем,
что в среду ферментации добавляют предшественник кобаламинов О-фосфо-L-треонин.
Еще одним предметом изобретения является способ биосинтеза кобаламинов путем
ферментации прокариотического микроорганизма, продуцирующего кобаламины, отличающийся тем, что в качестве указанного мик-
002588
4
роорганизма
используют
рекомбинантный
штамм аэробного микроорганизма, трансформированный фрагментом ДНК, содержащим ген
bluВ Rhodobacter capsulatus, кодирующим фермент, вовлеченный в биосинтез 5,6-диметилбензимидазола, или гомологичным фрагментом
и/или фрагментом, который гибридизуется с
указанным геном bluВ и кодирует фермент, вовлеченный в биосинтез 5,6-диметилбензимидазола, и культивируют указанный штамм в
аэробных условиях, обеспечивающих экспрессию данного фермента и продуцирование кобаламинов.
Микроорганизм может эндогенно содержать ген, такой как охарактеризованный выше.
В этом случае способ согласно изобретению
допускает сверхпродуцирование фермента. Но
вышеупомянутый микроорганизм равным образом может быть эндогенно лишен гена этого
типа.
Под термином «фрагмент ДНК, кодирующий фермент, вовлеченный в способ биосинтеза
О-фосфо-L-треонина или 5,6-диметилбензимидазола» подразумевают, что экспрессия вышеупомянутого фрагмента ДНК выражается в синтезе O-фосфо-L-треонина или 5,6-диметилбензимидазола в клетке с последующим возможным выделением в культуральную среду.
Культивирование может осуществляться
партиями или непрерывно, а очистка кобаламинов может осуществляться способами, уже используемыми на промышленном уровне (Florent, 1986).
Изобретение содержит в себе использование фрагмента ДНК природного, синтетического или рекомбинантного происхождения и их
гомологов. Под фрагментом подразумевают
фрагмент, образующийся в результате вырождения генетического кода, или фрагмент, последовательность которого имеет, по меньшей мере, 25% гомологию и который кодирует полипептиды с одинаковой функцией.
Соответственно, используют микроорганизм, культивируемый в условиях аэробиоза, и
вышеупомянутый фрагмент ДНК, кодирующий
фермент, вовлеченный в способ биосинтеза 5,6диметилбензимидазола в условиях аэробиоза.
Предметом изобретения равным образом
является способ получения рекомбинантных
штаммов прокариотического микроорганизма,
продуцирующего кобаламин, отличающийся
тем, что вышеупомянутый микроорганизм
трансформируют при помощи методов генной
инженерии, по меньшей мере, одним фрагментом ДНК, кодирующим фермент, вовлеченный в
способ биосинтеза О-фосфо-L-треонина или 5,6диметилбензимидазола, таким как определенный выше.
Предметом изобретения, равным образом
являются рекомбинантные штаммы, полученные способом получения штаммов согласно
настоящему изобретению.
5
Настоящее изобретение содержит использование в способах согласно изобретению рекомбинантной ДНК, содержащей, по меньшей
мере, одну последовательность ДНК, кодирующую вышеупомянутый полипептид, в которой
вышеупомянутая последовательность или вышеупомянутые последовательности размещены
под контролем сигналов экспрессии.
В этом отношении можно, в частности,
поместить в положение 5' последовательности
ДНК промотирующие области. Такие области
могут быть гомологичны или гетерологичны
последовательности ДНК. В частности, могут
быть использованы сильные бактериальные
промоторы, такие как промотор оперона триптофана Ptrp или оперона лактозы Plac E.coli,
левый или правый промотор бактериофага лямбда, сильные промоторы фагов бактерий, таких
как corynebacteries, функциональные промоторы
грамотрицательных бактерий, такие как промотор Ptac E.coli, промотор PxylS генов катаболизма ксилола плазмиды TOL, промотор амилазы Bacillus subtilis Pamy. Равным образом, можно назвать промоторы, происходящие из гликолитических генов дрожжей, такие как промоторы генов, кодирующих фосфоглицераткиназу,
глицероальдегид-3-фосфат-дегидрогеназу, лактазу или енолазу, которые могут быть использованы в том случае, когда рекомбинантная ДНК
будет введена в эукариотный организм хозяина.
Сайт фиксации рибосом также будет находиться
в положении 5' последовательности ДНК, и он
может быть гомологичным или гетерологичным, подобно сайту фиксации рибосом гена сII
бактериофага лямбда.
Сигналы, необходимые для прекращения
транскрипции, могут быть размещены в положении 3' последовательности ДНК.
Рекомбинантная ДНК, используемая в способах согласно изобретению, может быть затем
введена непосредственно в клетку-хозяина, совместимую с выбранными сигналами экспрессии, или может быть клонирована на плазмидном векторе, чтобы дать возможность стабильно
вводить последовательность рассматриваемой
ДНК в клетку-хозяина.
Понятно, что изобретение содержит использование плазмид, содержащих последовательность ДНК, кодирующую вышеупомянутый
полипептид. Понятно, что эти плазмиды также
содержат систему функциональной репликации
и маркер селекции.
Могут быть использованы различные типы
векторов. В объеме изобретения предпочитают
использовать векторы типа RK2, то есть векторы, имеющие репликатор RK2. В качестве особого примера можно назвать вектор RK2 (Saurugger et al.,1986), вектор pXL435 (Cameron et
al.,1989), вектор pRK290 (патент США 4 590
163; Ditta et al.,1985) и вектор pXL1635 (заявка
WO 91/16439). Особенно интересным вектором
002588
6
является вектор pXL1635. Другие векторы описаны в заявке на патент WO 91/16439.
Согласно одному варианту осуществления,
используют микроорганизм, трансформированный фрагментом ДНК, содержащим фрагмент
BamHI длиной 6,8 т.п.н. плазмиды pER1 (фиг.
1), описанный в примерах, следующих ниже,
который кодирует синтез двух предшественников: О-фосфо-L-треонина или 5,6-диметилбензимидазола.
В методе осуществления, наилучшим образом приспособленном для экспрессии полипептида, вовлеченного в синтез О-фосфо-Lтреонина, используют фрагмент ДНК, содержащий фрагмент EcoRI/ClaI длиной 2,1 т.п.н.
плазмиды pER2 (фиг. 2), описанный в примерах,
следующих ниже.
В методе осуществления, наилучшим образом приспособленном для экспрессии полипептида, вовлеченного в синтез О-фосфо-Lтреонина, используют фрагмент ДНК, содержащий фрагмент EcoRI/EcoRV длиной 1,6 т.п.н.
плазмиды pER2 (фиг.2), описанный в примерах,
следующих ниже.
В другом методе осуществления, наилучшим образом приспособленном для экспрессии
полипептида, вовлеченного в синтез 5,6диметилбензимидазола, используют фрагмент
ДНК, содержащий фрагмент BamHI длиной 6,8
т.п.н. плазмиды pER1 (фиг.2), описанный в
примерах, следующих ниже.
Прокариотические микроорганизмы - хозяева, которые могут быть использованы согласно изобретению, представляют собой, в частности, бактерии типа Е.coli, Pseudomonas denitrificans, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, или Rhizobium melitoti или еще
Rhodobacter capsulatus. Другие бактерии описаны в заявке на патент WO 91/11518.
Тем не менее предпочтительно используют
бактерию Р.denitrificans или A.radiobacter.
Другие преимущества и характеристики
настоящего изобретения будут освещены в детальном описании, которое следует ниже.
Примеры 1 и 2 описывают, каким образом
можно добиться продуцирования кобаламинов,
добавляя О-фосфо-L-треонин в культуральную
среду штамма Pseudomonas denitrificans или
Rhodobacter capsulatus. Пример 2 показывает,
каким образом O-фосфо-L-треонин может выгодно заменить R1-амино-2-пропанол в средах
для продуцирования, так как, чтобы добиться
продуцирования кобаламинов, требуются, по
меньшей мере, в 1000 раз более высокие концентрации R1-амино-2-пропанола.
Пример 2 показывает также, что участок
хромосомы Rhodobacter capsulatus, несущий
гены bluE и bluF, вовлечен в синтез O-фосфо-Lтреонина. Пример 3 описывает строение плазмид, несущих гены bluE и bluF из фрагмента
ДНК Rhodobacter capsulatus. Этот пример 3 показывает, в частности, каким образом эти плаз-
7
миды, будучи однажды введенными в штаммы,
для которых продуцирование кобаламинов является зависимым от добавления R1-амино-2пропанола или О-фосфо-L-треонина, позволяют
добиться продуцирования кобаламинов на средах, не содержащих R1-амино-2-пропанол или
О-фосфо-L-треонин. Пример 4 показывает, что
участок хромосомы Rhodobacter capsulatus, несущий ген bluB, вовлечен в синтез 5,6диметилбензимидазола.
Перечень фигур
Фиг. 1 - рестрикционная карта плазмиды
pER1;
фиг. 2 - рестрикционная карта плазмиды
pER2;
фиг. 3 - рестрикционная карта плазмиды
pER3;
фиг. 1-3 представляют плазмиды pER1,
pER2 и pER3, соответственно.
1. Штаммы и плазмиды
Штаммы АН2 и BB1 Rhodobacter capsulatus (Pollich et al.,1995a) были созданы на основе
штамма 37b4 (DSM 938). Штамм G2650 Pseudomonas denitrificans был создан на основе
штамма SBL 27 Rifr путем введения транспозона
Tn5 (Crouzet et al.,1990). Сначала, используя
транспозон Tn5, несущий ген устойчивости к
тетрациклину, был создан штамм G2650[Tet].
Затем, исходя из штамма G2650[Tet], путем обмена гена устойчивости к тетрациклину транспозона Tn5 на ген устойчивости к спектиномицину, создали ген G2650[Sp]. Штамм SBL 27
Rifr происходит из штамма MB 580(патент США
3 018 225).
Плазмида pBBW1 была создана на основе
фрагмента ДНК Rhodobacter capsulatus (Pollich
et al.,1995a). Плазмида pAHW25 (Pollich et Klug,
1995a) была создана на основе плазмиды
pBBW1.
2. Молекулярные методы
Использованы обычные методы обработки
ДНК, описанные в лабораторном руководстве
(Sambrook et coll., 1989).
Ферменты использованы в соответствии с
рекомендациями изготовителя и получены в
лабораториях New England Biolabs и Boehringer
Mannheim.
Использованные методы содержали в основном следующие этапы:
- переваривание рестриктазами;
- лигирование молекул ДНК лигазами бактериофага Т4.
3. Методы трансформации
Трансформацию штаммов E.coli производили методом электропорации (Dower et coll.,
1988).
4. Методы конъюгации
Конъюгацию штамма S17-1 Е.coli с различными штаммами Р.denitrificans проводили
согласно модифицированной методике Симона
с сотрудниками (Simon et coll., 1989). Трансформация штаммов Pseudomonas может быть
002588
8
произведена всеми остальными методами генной инженерии.
5. Приготовление сред для продукции кобаламинов
Средой, используемой для продукции кобаламинов штаммами P.denitrificans, является
среда PS4, описанная Cameron et coll., 1989.
Средой, используемой для продукции кобаламинов штаммами Rhodobacter capsulatus,
является среда RA, описанная Polich, 1995b.
6. Количество продуцируемых кобаламинов
Произведенное количество кобаламинов
измеряют либо путем микробиологического
количественного определения, либо при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
-Микробиологическое количественное определение:
Произведенное количество кобаламинов
определяют полуколичественным методом, используя индикаторный штамм 113-3 E.coli, являющийся ауксотрофом для витамина В12
(Davis et Mingioli, 1950).
Этот индикаторный штамм представляет
собой мутант metE E.coli, который, следовательно, обладает только одной гомоцистеинметилтрансферазой (ЕС 2.1.1.13), которая является
В12-зависимой. На минимальной для роста среде он нуждается только в присутствии витамина
В12. Когда этот штамм введен в поверхностный
слой минимальной агаровой среды М9 (Miller,
1972) (которой не хватает только витамина В12,
чтобы допустить рост штамма), возможно количественное определение витамина В12. В самом
деле, если на поверхность слоя среды наносят
пробу раствора, содержащего витамин В12, то в
месте нанесения через 16 ч инкубации при 37°С
виден ореол роста. Витамин В12, содержащийся
в пробе, диффундирует и делает возможным
рост бактерий, введенных в агар. Диаметр ореола роста пропорционален концентрации В12 в
пробе.
Пробы получают лизисом клеток согласно
следующему протоколу: 0,1 мл раствора (ТрисНСl рН=8 100мМ, ЭДТА 20 мМ, сахароза
200г/л), содержащего 24 мг/мл лизоцима (Boehringer Mannheim) смешивают с 0,5 мл клеточной культуры, подлежащей количественному
определению. После 30 мин инкубации при
37°С добавляют 60 мкл раствора додецилсульфата натрия с концентрацией 30 г/л, и смесь
интенсивно перемешивают несколько секунд.
Десять микролитров полученного клеточного
лизата, или, в случае необходимости, продукта
его разбавления 1/50, наносят на поверхность
слоя агаровой среды.
-Количественное определение методом
ВЭЖХ:
Для количественного определения кобаламинов при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии используют методы, описанные в работе Blanch et coll., 1990.
9
002588
Пример 1. Влияние О-фосфо-L-треонина
на продуцирование кобаламинов штаммом
Pseudomonas denitrificans.
Штамм G2650 [Tet]Pseudomonas denitrificans культивируют в 25 мл среды PS4, содержащей 2 мкг/мл тетрациклина, в колбе Эрленмейера объемом 100 мл. После 24 ч ферментации при 30°С при перемешивании (250 об/мин),
в среду, в случае необходимости, добавляют
0,16 или 0,32 или 1,5 мл раствора О-фосфо-Lтреонина с концентрацией 10 г/л, что соответствует конечной концентрации 66, 132 и 600 мг/л,
соответственно. Количества кобаламинов, продуцированные в каждом из этих условий, количественно определяют методом ВЭЖХ по прошествии 148 ч ферментации. Результаты (табл.
1) показывают, что штамм G2650[Tet] не продуцирует витамин В12 в среде PS4. Зато присутствие О-фосфо-L-треонина в среде дает возможность продуцирования В12 этим же самым
штаммом.
О-фосфо-L-треонин,
добавленный в среду
(мг/л)
Продуцированный В12
(мг/л)
0
66
132 600
0
1,8
2,5
Таблица 1
600
(добавлен
при t=0)
4,2
3,8
Пример 2. Сравнительное влияние Офосфо-L-треонина и R1-амино-2-пропанола на
продуцирование кобаламинов штаммом Rhodobacter capsulatus.
Штамм АН2 Rhodobacter capsulatus культивируют в колбе Эрленмейера объемом 100 мл
в 70 мл среды RA в присутствии 10 мкг/мл канамицина и различных концентраций О-фосфоL-треонина и R1-амино-2-пропанола. После 2448 ч ферментации при 30°С при перемешивании
(100 об/мин), количество кобаламинов, продуцированное в различных условиях, измеряют
путем микробиологического количественного
определения.
Результаты показаны в табл. 2, в которой
"-" обозначает отсутствие ореола роста индикаторного штамма и "+" обозначает присутствие
гало роста, диаметр которого тем более значителен, чем больше имеется знаков "+". Эти результаты показывают, что штамм АН2
R.capsulatus, культивируемый в среде RA, не
продуцирует витамин В12. Зато в присутствии
О-фосфо-L-треонина или R1-амино-2-пропанола
этот штамм способен продуцировать витамин
В12. Результаты показывают также, что для того, чтобы получить тот же самый результат, что
и с О-фосфо-L-треонином, надо добавлять в
6.103 раз большее количество R1-амино-2пропанола.
Таблица 2
Концентрация Офосфо-L-треони- 10 нМ
на в среде (мг/л)
Продуцирование
В12 (мг/л)
25 нМ
+
50 нМ 100 нМ 250 нМ
++
+++
++++
10
Концентрация R1амино-2-пропанола в 6 мкМ
среде
Продуцирование В12
--
30 мкМ 150 мкМ
-
-
1,2 мМ
+
Пример 3. Влияние присутствия фрагмента
ДНК, происходящего из плазмиды pBBW1, в
штамме G2650, не продуцирующем кобаламины.
3.1. Строение плазмиды pER1 (фиг. 1).
Плазмида pER1 длиной 17,4 т.п.н. была
создана клонированием в сайт BamHI вектора
pXL435 (Cameron et coll., 1989) фрагмента ДНК
BamHI длиной 6,8 т.п.н., очищенного из плазмиды pBBW1 (Pollich et Klug, 1995).
3.2. Введение плазмиды pER1 в штамм
G2650 P.denitrificans.
Плазмида pER1, во-первых, была введена,
путем электропорации, в штамм S17-1 Е.coli и,
во-вторых, была введена в штамм G2650[Tet]
P.denitrificans, путем конъюгации со штаммом
S17-1 E.coli, содержащим плазмиду pER1. Отбирают трансконъюганты, устойчивые при 50
мкг/мл рифампицина и при 100 мкг/мл ливидомицина. Девять проанализированных клонов
содержали плазмиду pER1.
Тем же самым образом был создан контрольный штамм G2650[Tet], содержащий единственный вектор pXL435.
3.3. Продуцирование кобаламинов штаммом G2650, содержащим плазмиду pER1.
Клоны G2650[Tet], содержащие плазмиду
pER1, также как 2 клона, содержащих плазмиду
pXL435, культивируют в среде PS4 в присутствии рифампицина, тетрациклина и ливидомицина. После 140 ч ферментации при 30°С при перемешивании (250 об/мин), продуцированное
количество кобаламинов измеряют, путем микробиологического количественного определения и при помощи ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 3.
Штаммы G2650[Tet],
содержащие плазмиду
pER1
Штаммы G2650[Tet],
содержащие плазмиду
pXL435
Штамм G2650[Tet]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
В12
микробиологическое
количественное
определение
++
++
++
++
++
++
++
++
++
-
Таблица 3
В12
ВЭЖХ
(мг/л)
3
3,5
3,4
3,2
2,9
3,9
3,6
3,3
3,9
0
0
0
В то время как ни штамм G2650[Tet], ни
этот штамм, содержащий плазмиду pXL435, не
продуцируют витамин В12 в среде PS4, тот же
самый штамм, содержащий плазмиду pER1,
способен продуцировать В12 при концентрации
11
порядка 3,5 мг/л. Штамм G2650[Tet], содержащий плазмиду pXL435, то есть только вектор
клонирования, который способствовал созданию плазмиды pER1, не продуцирует В12: следовательно, это присутствие фрагмента ДНК
длиной 6,8 т.п.н., происходящего из плазмиды
pBBW1, является ответственным за продуцирование В12.
Этот фрагмент ДНК BamHI длиной 6,8
т.п.н., очищенный из плазмиды pBBW1, сообщает, таким образом, штамму G2650[Tet]
P.denitrificans способность продуцировать витамин В12 в среде PS4.
3.4. Субклонирование
Участки фрагмента ДНК BamHI длиной
6,8 т.п.н., содержащие гены bluЕ и bluF, были
субклонированы в клонирующий вектор
pXL435, производящий на свет плазмиды, называемые pER2 и pER3, благодаря промежуточным структурам.
Плазмида pER2 длиной 12,9 т.п.н. (фиг. 2)
содержит фрагмент EcoRI/ClaI длиной 2,1 т.п.н.,
очищенный из плазмиды pBBW1 и клонированный в вектор pXL435. Этот фрагмент ДНК был
предварительно клонирован в сайты EcoRI/ClaI
плазмиды pBluescript II SK+(Stratagene) и затем
был очищен из этой рекомбинантной плазмиды
в форме фрагмента ДНК BamHI/SalI для клонирования в вектор pXL435.
Плазмида pER3 длиной 11,9 т.п.н. (фиг. 3)
содержит фрагмент PstI длиной 2,1 т.п.н., очищенный из плазмиды pBBW1 и клонированный
в вектор pXL435. Он был предварительно клонирован в сайт PstI плазмиды pBluescript II SK+
и затем был очищен из этой рекомбинантной
плазмиды в форме рестрикционного фрагмента
BamHI/SalI для клонирования в вектор pXL435.
Плазмида pAHW25 (Pollich et Klug, 1995a)
содержит фрагмент EcoRI/EcoRV длиной 1,6
т.п.н., очищенный из плазмиды pBBW1 и клонированный в вектор pRK415 (Keen et al., 1988):
ген bluЕ транскрибируется в таком случае, начиная с промотора lac вектора.
Плазмиды pER2 или pER3 вводят в штамм
G2650[Tet] P.denitrificans, путем конъюгации со
штаммом S17-1 E.coli, содержащим эти же самые плазмиды. Клоны G2650[Tet], содержащие
плазмиды pER2, pER3 или pXL435 культивируют в 5 мл среды PS4 в присутствии рифампицина, тетрациклина и ливидомицина. Плазмиды
pAHW25 и pRK415 вводят в штаммы G2650[Sp]
P.denitrificans, путем конъюгации со штаммом
S17-1 Е.coli, содержащим эти же самые плазмиды. Клоны штаммов G2650[Sp], содержащих
плазмиды pAHW25 или pRK415, культивируют
в 25 мл среды PS4 в присутствии рифампицина,
ливидомицина и спектиномицина. После 140 ч
ферментации при 30°С при перемешивании (250
об/мин), продуцированное количество кобаламинов измеряют, путем микробиологического
количественного определения и при помощи
ВЭЖХ.
002588
12
Результаты, представленные в табл. 4, показывают, что только клоны штаммов G2650,
содержащих плазмиды pER2 или pAHW25, способны продуцировать витамин В12 в среде PS4.
Штамм G2650[Tet]
Штамм G2650[Sp]
Штаммы G2650[Tet],
содержащие плазмиду pXL435
Штаммы G2650[Tet],
содержащие плазмиду pER2
Штаммы G2650[Tet],
содержащие плазмиду pER3
Штаммы G2650[Sp],
содержащие плазмиду pRK415
Штаммы G2650[Sp],
содержащие плазмиду pAHW25
1
2
3
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
1
2
3
4
5
6
7
8
В12
микробиологическое
количественное
определение
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
Таблица 4
В12
ВЭЖХ
(мг/л)
0
0
0
0
0
7,4
5,3
7,9
3,5
5,2
6,8
7,2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3,0
2,2
3,0
2,9
2,9
3,3
3,1
2,4
Пример 4. Ген bluВ вовлечен в биосинтез
5,6-диметилбензимидазола (ДБИ), известного
предшественника В12.
Штамм ВВ1 Rhodobacter capsulatus является мутантным штаммом, который получают путем введения интерпозона в ген bluВ: это штамм
bluВ-(Pollich et coll., 1995). Штамм ВВ1 культивируют в 70 мл среды RA в колбе Эрленмейера
объемом 100 мл в присутствии 10 мкг/мл канамицина и различных концентраций ДБИ. Количества кобаламинов, продуцированные этим
штаммом в различных условиях, измеряют путем микробиологического количественного определения после 24 и 48 ч ферментации при
30°С при перемешивании (100 об/мин). Результаты, приведенные в табл. 5, показывают, что
мутантный штамм ВВ1, не продуцирующий В12
в одной среде RA, синтезирует эту молекулу,
когда в среде присутствует, по меньшей мере,
14 нМ ДБИ. Таким образом, ген bluВ вовлечен в
биосинтез 5,6-диметилбензимидазола.
Концентрация ДБИ в 0
среде, нМ
Продуцирование В12 -
7
14 35 70
-
+
140
Таблица 5
350
++ +++ ++++
+++++
13
Литература
1. Davis B.D. et E. Mingioli (1950), J. Bacteriol. 60 :17-28.
2. Dower W.J., J.F. Miller et C.W. Ragsdale
(1988) Nucl. Acids Res. 16: 6127-6145 Ref M9.
3. Sambrook J., E.F.Fritsch et T.Maniatis
(1989) Molecular cloning, a laboratory manual,
second edition.
4. Simon R., M.O'Connell, M.Labes et A.
Puhler (1986) Meth. In Enzymology 118:640-659.
5. Blanche F., D.Thibaut, M. Couder, et J.C.
Muller (1990), Anal. Biochem., 189:24-29.
6. Blanche F., В.Cameron, J.Crouzet, L. Debussche, D.Thibaut, M. Vuilhorgne, F.J.Leeper, et
A.R.Battersby (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
34:383-411.
7. Cameron В., К.Briggs, S.Pridmore,
G.Brefort, et J.Crouzet (1989). J.Bacteriol.,
171:547-557.
8. Crouzet J., L.Cauchois, F.Blanche,
L.Debussche, D.Thibaut, M.C.Rouyez, S.Rigault,
J.F.Mayaux, et B.Cameron (1990) J.Bacteriol., 172:
5968-5979.
9. Grabau С., et J.R.Roth (1992) J.Bacteriol.,
174:2138-2144.
10. Pollich M., S.Jock, et G.Klug (1993)
Mol.Microbiol., 10:749-757.
11. Pollich M., et G.Klug (1995a) J.Bacteriol.,
177:4481-4487.
12. Pollich M. (1995b) Dissertation, Ruprecht-Karls-Universitat Heidelberg
13. Florent J., (1986), Vitamins, Biotechnology, vol. 4, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, In H.J. Rehm and G.Reed (ed.), 115-158.
14. Ditta G., Schmidhauser Т., Yakobson E.,
Lu P., Liang X. W., Finlay D.R., Guiney D., et Helinski D., (1985), Plasmid, 13:149-154.
15. Miller J.H., (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.
16. Saurugger P.N., Hrabak O., Schwab H., et
Lafferty R.N., (1986). J. Biotechnol. 4:333-343.
17. Keen N.Т., S.Tamaki, D.Kobayashi et
D.Trollinger (1988) Gene 70:191-197.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ биосинтеза кобаламинов путем
ферментации прокариотического микроорганизма, продуцирующего кобаламины, отличающийся тем, что в качестве указанного микроорганизма
используют
рекомбинантный
штамм микроорганизма, трансформированный
фрагментом ДНК, содержащим гены bluЕ и bluF
Rhodobacter capsulatus, кодирующие фермент,
вовлеченный в биосинтез O-фосфо-L-треонина,
или гомологичным фрагментом и/или фрагментом, который гибридизуется с указанными генами bluЕ и bluF и кодирует фермент, вовлеченный в биосинтез О-фосфо-L-треонина, и культивируют указанный штамм в условиях, обеспечивающих экспрессию данного фермента и продуцирование кобаламинов.
002588
14
2. Способ биосинтеза кобаламинов путем
ферментации прокариотического микроорганизма, продуцирующего кобаламины, отличающийся тем, что в среду ферментации добавляют предшественник кобаламинов О-фосфо-Lтреонин.
3. Способ биосинтеза кобаламинов путем
ферментации прокариотического микроорганизма, продуцирующего кобаламины, отличающийся тем, что в качестве указанного микроорганизма
используют
рекомбинантный
штамм аэробного микроорганизма, трансформированный фрагментом ДНК, содержащим ген
bluВ Rhodobacter capsulatus, кодирующим фермент, вовлеченный в биосинтез 5,6-диметилбензимидазола, или гомологичным фрагментом
и/или фрагментом, который гибридизуется с
указанным геном bluВ и кодирует фермент, вовлеченный в биосинтез 5,6-диметилбензимидазола, и культивируют указанный штамм в
аэробных условиях, обеспечивающих экспрессию данного фермента и продуцирование кобаламинов.
4. Способ по любому из пп.1, 3, отличающийся тем, что указанный фрагмент ДНК представляет собой BamHI - фрагмент длиной 6,8
т.п.н. плазмиды pER1, рестрикционная карта
которой приведена на фиг. 1.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что
указанный фрагмент ДНК представляет собой
EcoRI/ClaI - фрагмент длиной 2,1 т.п.н. плазмиды pER2, рестрикционная карта которой приведена на фиг. 2.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что
указанный фрагмент ДНК представляет собой
EcoRI/EcoRV - фрагмент длиной 1,6 т.п.н. плазмиды pAHW25 или плазмиды pER2, рестрикционная карта которой приведена на фиг. 2.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что в результате биосинтеза получают витамин В12.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный штамм рекомбинантного микроорганизма представляет собой
штамм бактерий Pseudomonas denitrificans или
Agrobacterium radiobacter.
9. Способ получения рекомбинантного
штамма бактерий, продуцирующего кобаламины, отличающийся тем, что указанные бактерии
трансформируют фрагментом ДНК, содержащим гены bluЕ и bluF Rhodobacter capsulatus,
кодирующими фермент, вовлеченный в биосинтез О-фосфо-L-треонина, или гомологичным
фрагментом и/или фрагментом, который гибридизуется с указанными генами bluЕ и bluF и
кодирует фермент, вовлеченный в биосинтез Офосфо-L-треонина.
10. Способ получения рекомбинантного
штамма аэробных бактерий, продуцирующего
кобаламины, отличающийся тем, что указанные
бактерии трансформируют фрагментом ДНК,
содержащим ген bluВ Rhodobacter capsulatus,
15
002588
кодирующим фермент, вовлеченный в биосинтез 5,6-диметилбензимидазола, или гомологичным фрагментом и/или фрагментом, который
гибридизуется с указанным геном bluВ и кодирует фермент, вовлеченный в биосинтез 5,6диметилбензимидазола.
11. Способ по любому из пп.9, 10, отличающийся тем, что получают штамм бактерий
16
Pseudomonas denitrificans или Agrobac-terium
radiobacter.
12. Штамм бактерий, продуцирующий кобаламины, полученный в соответствии со способом по любому из пп.9, 11 формулы.
13. Штамм аэробных бактерий, продуцирующий кобаламины, полученный в соответствии со способом по любому из пп.10, 11 формулы.
Фиг. 1
Фиг. 3
Фиг. 2
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, ГСП-9 101999, Москва, Центр, М. Черкасский пер., 2/6