На правах рукописи АБАЛЕНИХИНА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И

На правах рукописи
АБАЛЕНИХИНА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА
ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И
ЛИЗОСОМАЛЬНЫЙ ЦИСТЕИНОВЫЙ ПРОТЕОЛИЗ
ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ
МОДУЛИРОВАНИЯ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА
03.01.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание степени
кандидата биологических наук
Рязань - 2015
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Рязанский государственный
медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
кандидат медицинских наук, доцент Фомина Мария Алексеевна
Официальные оппоненты:
Шумаев Константин Борисович - доктор биологических наук, старший научный
сотрудник лаборатории азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии
им. А.Н. Баха Федерального государственного учреждения Федерального
исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии»
Российской академии наук, г. Москва
Ерлыкина Елена Ивановна - доктор биологических наук, профессор,
заведующая кафедрой биологической химии им. Г.Я. Городисской
Государственного
бюджетного
образовательного
учреждения
высшего
профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская
академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки «Институт биологии Карельского научного центра» Российской академии
наук
Защита
состоится «19» октября 2015 г. в 14-00 ч. на заседании
Диссертационного совета Д 001.002.01 при ФГБНУ «НИИ питания» по адресу:
109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «НИИ питания» и на
сайте www.ion.ru
Автореферат разослан «___» _________2015
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
доктор биологических наук
Шилина Н.М.
3
1. Общая характеристика работы
1.1. Актуальность темы
Белки в силу особенностей своего строения являются одной из основных
ловушек активных форм кислорода и азота, образующихся под действием
ионизирующей радиации, фотохимических воздействий, а также в процессе
металл-зависимого окисления или ряда окислительно-восстановительных реакций
ферментативной и неферментативной природы (Дубинина Е.Е., 2006). Продуктом
токсического действия свободных радикалов и активных форм кислорода/азота
являются модифицированные белки, которые представляют собой один из
мощных элементов клеточной сигнализации и, одновременно, активно
используются для характеристики окислительного стресса (Čolak E., 2008). В силу
широкой природной распространенности белков и стабильности продуктов их
окисления, оценка окислительной модификации, в частности, карбонилирования,
протеинов считается надежным маркером оксидативного повреждения (Дубинина
Е.Е., 2006; Муравлева Л.Е. и др., 2010). Возможность регистрации содержания
окисленных белков, как в биологических жидкостях, так и в тканях, привела к
накоплению значительного фактического материала, который демонстрирует
изменение уровня карбонильных производных при ряде патологических
состояний (Исмаилова Ж.Г., 2004; Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В., 2008;
Grimsrud P.A. et al., 2008; Белоногов Р.Н. и др., 2009; Никитина Ю.В., Мухина
И.В., 2009; Толочко З.С., Спиридонов В.К., 2010; Ведунова М.В., Сазанов А.И.,
Конторщикова К.Н., 2010; Иванов В.В. и др., 2011). Однако, в настоящее время
отсутствует единый методологический подход к трактовке результатов, что
затрудняет анализ полученных данных.
В последние годы в качестве одного из агентов оксидативного стресса
рассматривается эндогенно продуцируемый оксид азота (Граник В.Г., Григорьев
Н.Б., 2004; Calabrese V. et al., 2009). Наблюдающееся в настоящее время
экспоненциальное нарастание исследований в области биологии оксида азота
привело к обнаружению множественности его эффектов (Thippeswamy T. et al.,
2006), демонстрирующих как токсическое (Szabõ C., Ischiropoulos H., Radi R.,
2006; Sener A. et al., 2013), так и защитное (Hummel S.G. et al., 2006; Ozçubukçu S.,
Ergün N., Ilhan E., 2014) действие этой «универсальной» молекулы. При этом
систематические исследования взаимоотношений стимуляции и ингибирования
синтеза NO с формированием карбонильных производных не проводились.
Известно, что модифицированные формы протеинов более подвержены
действию протеиназ, чем их нативные аналоги (Плешакова О.В., 1999; Лущак
В.И., 2007; Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В., 2008). С другой стороны, клеточные
протеиназы могут стать возможными мишенями для повреждающего действия
свободных радикалов, что свойственно другим ферментам (Grimsrud P.A. et al.,
2008).
Важным объектом исследований механизмов ответа тканей на
окислительное повреждение является иммунная система, для которой характерно
наличие способности к гибкому реагированию на внешние воздействия с
одновременным жестким поддержанием собственного гомеостаза (Захаров А.А.,
4
2008). На данный момент доказано участие в формировании иммунного ответа
лизосомальных цистеиновых протеиназ (Zhang T. et al., 2001; Kuester D. et al.,
2005; Zavasnik-Bergant T., Turk B., 2007; Conus S., Hans-Uwe Simon, 2010; Watts
C., 2012) и оксида азота (Bogdan Ch., 2001; Ibiza S., Serrador J.M., 2008; Pavanelli
W.R., Nogueira Silva J.J., 2010; David A. Wink et al., 2011; Singh A.K., 2011) в
качестве регуляторов. Однако, карбонильный статус иммуннокомпетентных
тканей в условиях изменения продукции оксида азота не описан.
Таким образом, представляется актуальным исследование влияния
изменения уровня синтеза оксида азота на процессы окислительного повреждения
и распада белков.
1.2. Цель и основные задачи исследования
Целью настоящей работы является изучение влияния конкурентного
ингибитора и субстрата синтеза оксида азота на состояние окислительной
модификации белков и лизосомального цистеинового протеолиза тимуса и
селезенки крыс in vivo и in vitro.
Задачи исследования:
1. Провести комплексную оценку содержания продуктов окислительной
модификации белков в тимусе и селезенке крыс в условиях изменения синтеза
оксида азота (II).
2. Описать изменения активности лизосомальных цистеиновых катепсинов
В, L и Н в изучаемых моделях с оценкой ингибиторного влияния и
аутокаталитического процессинга.
3. Проанализировать зависимость состояния лизосомального цистеинового
протеолиза от степени окислительной модификации белков.
1.3. Научная новизна
Впервые представлен способ комплексной оценки содержания продуктов
окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях,
позволивший обнаружить увеличение общего содержания карбонилированных
белков в условиях in vivo- и in vitro-ингибирования синтеза оксида азота.
Установлено нарастание доли вторичных маркеров окислительного стресса и
истощение резервно-адаптационного потенциала под действием конкурентного
ингибитора синтеза оксида азота. Впервые доказано, что воздействие N-нитро-Lаргининметилового эфира (L-NAME) приводит к повышению активности
лизосомальных цистеиновых протеиназ в тимусе и селезенке, преимущественно
за счет внелизосомальной фракции.
Показано, что субстрат NO-синтазы - L-аргинин при изолированном
применении не оказывает влияния на окислительную модификацию белков и
состояние лизосомального протеолиза иммунокомпетентных органов крыс.
Применение L-аргинина в условиях дефицита синтеза оксида азота оказывает
корригирующее действие на состояние карбонилового статуса и способствует
сохранению эффекта L-NAME для активности лизосомальных цистеиновых
протеиназ.
5
Впервые доказано влияние изменения уровня оксида азота на
аутопроцессинг катепсинов В, L и Н: при дефиците синтеза NO – преобладает
доля активных молекул, при моделировании избытка синтеза NO – преобладает
доля проэнзимов. Показано, что цистатин С не вносит существенного вклада в
регуляцию активности катепсинов В, L и Н в условиях изменения уровня синтеза
оксида азота.
Впервые была выявлена положительная корреляционная взаимосвязь между
увеличением количества карбонильных производных белков и активностью
катепсинов L и Н селезенки.
1.4. Теоретическая и практическая значимость работы
Работа
носит
преимущественно
фундаментальный
характер:
представленные в диссертации экспериментальные данные позволяют понять
роль субстрата (L-аргинин) и ингибитора (L-NAME) синтеза оксида азота в
процессах модификации белковых молекул в совокупности с изменением
активности лизосомальных протеиназ, что может быть использовано для
выяснения возможных путей утилизации карбонильных производных белков.
Патент «Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной
модификации белков в тканях и биологических жидкостях» (Фомина М.А.,
Абаленихина Ю.В., Фомина Н.В., Терентьев А.А., приоритет от 21.01.2013) может
быть использован в области клинической и фундаментальной биохимии с целью
определения степени выраженности и стадии окислительного стресса,
источников, образовавшихся карбонилов и направленности возможных
патологических последствий при накоплении окисленных белков.
1.5. Положения, выносимые на защиту
1. Внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг и 200 мг/кг способствует
окислительному карбонилированию белков иммунокомпетентных органов крыс in
vivo и in vitro. Пероральное введение L-аргинина в дозе 500 мг/кг способствует
снижению уровня карбонильных производных.
2. Моделирование дефицита синтеза оксида азота способствует повышению
активности лизосомальных цистеиновых протеиназ в тимусе и селезенке, в том
числе за счет увеличения доли зрелых форм.
3. Моделирование дополнительного синтеза оксида азота не влияет на активность
лизосомальных цистеиновых протеиназ, однако влияет на аутопроцессинг
катепсинов.
4. Применение L-аргинина в условиях дефицита синтеза оксида азота корригирует
состояние карбонилового статуса, при этом для изменений активности
лизосомальных цистеиновых протеиназ сохраняется эффект L-NAME.
5. Между процессом окислительной модификации белков и активностью
лизосомальных цистеиновых протеиназ L и Н выявлена положительная
корреляционная связь в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота.
6
1.6. Степень достоверности и апробация работы
Достоверность
результатов
работы
подтверждается
корректным
использованием теоретических и экспериментальных методов обоснования
полученных результатов и выводов. Достоверность экспериментальных данных
обеспечивается использованием современных средств и методик проведения
исследований. Положения теории основываются на известных достижениях
фундаментальных и прикладных научных дисциплин, сопряженных с предметом
исследования диссертации.
Результаты исследования доложены на: научно-практической конференции
молодых ученых «Аспирантские чтения 2013» (Рязань, 2013); ХII региональной
научно-практической конференции с международным участием «Обмен веществ
при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2013); ХIХ межгородской
конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (СанктПетербург, 2013); Международном симпозиуме, посвященном 150-летию
кафедры биохимии Казанского университета «Биохимия – основа наук о жизни»
(Казань, 2013); Международной научно-практической конференции «Актуальные
вопросы развития науки» (Уфа, 2014); Х юбилейной международной
конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии»
(Пицунда, Абхазия, 2014); Межрегиональной научной конференции университета
с международным участием (Рязань, 2014); Второй региональной конференции
молодых ученых «Пути инновационного развития экономики Рязанской области»
(Рязань, 2014).
1.7. Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 4 – в
журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 патент на изобретение, и 1 методические
рекомендации.
1.8. Личный вклад соискателя
Все изложенные в диссертации результаты получены автором
самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач,
интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным
руководителем и другими соавторами публикаций.
1.9. Объём и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы,
материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения и
выводов. Список литературы содержит 247 источников, из них 59 российских и
188 зарубежных. Объем работы составляет 142 страницы машинописного текста,
содержит 75 рисунков и 15 таблиц.
7
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Экспериментальные животные
Работа выполнена на 88 конвенциональных половозрелых крысах-самцах
линии Wistar массой 280-320 граммов. Животные содержались по 3-4 особи
одного пола в металлических клетках площадью 24 дм 2 при естественном
освещении, получали воду и полноценный сухой комбикорм для лабораторных
животных «Чара» (производство ЗАО «Ассортимент – Агро», Московская
область, Сергиев-Посадский район, д. Тураково). Приготовление кормов для
животных, расчет рациона осуществлялся сотрудниками вивария в соответствии с
установленными нормами. На основании этической экспертизы планируемых в
диссертационной работе исследований на лабораторных животных локальным
этическим комитетом ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России принято
положительное заключение (протокол № 5 от 07.12.2012 г.).
2.2. Экспериментальные модели
Для моделирования дефицита синтеза оксида азота осуществляли
внутрибрюшинное введение раствора неселективного ингибитора NO-синтазы Nнитро-L-аргининметилового эфира (L-NAME, «Sigma», США) на 0,9 % растворе
NaCl в дозе 25 мг/кг (Покровский М.В., 2008). Препарат вводился 1 раз в сутки в
утренние часы ежедневно в течение 7 дней. Выведение из эксперимента
осуществлялось на 8-е сутки.
Моделирование изменения уровня синтеза оксида азота (II) субстратом NOсинтазы, осуществляли путем внутрижелудочного введения раствора L-аргинина
(«Sigma», США) на 0,9 % растворе NaCl в дозе 500 мг/кг (Дорохина Л.В., Зинчук
В.В., 2000). Препарат вводили 1 раз в сутки до утреннего кормления ежедневно в
течение 10 дней. Выведение из эксперимента осуществляли на 11-е сутки.
Для изучения корригирующего действия L-аргинина осуществляли
внутрибрюшинное введение L-NAME в указанных дозах с 4-х по 10-е сутки на
фоне перорального введения L-аргинина. Животных выводили из эксперимента
на 11-е сутки.
Контрольные группы формировались для каждой серии эксперимента из
животных, сопоставимых по возрасту, полу, массе и условиям содержания с
экспериментальными особями. Животным контрольной группы осуществляли
введение физиологического раствора, при этом вариант введения, объемы
раствора и продолжительность воздействия совпадают с таковыми для
экспериментальной группы.
Для моделирования дефицита синтеза оксида азота (II) in vitro производили
инкубацию свежевыделенных тимоцитов и спленоцитов в полной питательной
среде, содержащей 5 мМ L-NAME (Стариков Ю.В., 2008) в течение 24 часов при
температуре 370С.
Для моделирования изменения уровня синтеза оксида азота (II) in vitro
производили инкубацию тимоцитов и спленоцитов в полной питательной среде,
содержащей 5 мМ L-аргинин (Стариков Ю.В., 2008) в течение 24 часов при
температуре 370С.
8
Контрольные группы формировались для каждой серии эксперимента из
тимоцитов и спленоцитов, инкубированных параллельно опытным пробам в
полной питательной среде в течение 24 часов при температуре 37 0С.
2.3. Определение концентрации метаболитов оксида азота
Содержание метаболитов оксида азота определяли в неседиментируемой
фракции гомогената спектрофотометрией в видимой области спектра по реакции
с реактивом Грисса (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2005). Уровень метаболитов
оксида азота (суммарную концентрацию нитратов и нитритов NOх) определяли
спектрофотометрическим методом по окраске в реакции диазотирования
нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Интенсивность
окраски определяли в видимой области спектра с регистрацией на
микропланшетном анализаторе StatFax 3200 (Awareness Technology, США) при
длине волны 540 нм и выражали в нмоль/мг белка.
2.4. Метод определения содержания белка
Содержание белка определяли в седиментируемой и неседиментируемой
фракциях гомогената по методу Лоури коммерческим набором НПЦ «Экосервис» (Санкт-Петербург).
2.5. Метод определения кислой фосфатазы
Активность кислой фосфатазы определяли в седиментируемой и
неседиментируемой фракциях гомогената унифицированным методом по
«конечной точке», используя коммерческий набор «Витал Диагностикс СПб»
(Санкт-Петербург). Количество образовавшегося в единицу времени nнитрофенола, пропорциональное активности фермента, определяется по
оптической плотности образца при 405 нм.
Метод определения активности лизосомальных цистеиновых протеиназ
Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектрофлуориметрическим
методом (System 3 Scanning Spectrofluorometr, Optical technology devices,
NewYork) по Barrett&Kirschke (Barrett A.J., Kirschke H., 1981). Удельную
активность катепсинов в тимусе и селезенке выражали в нмоль амидометилкумарина/сек г белка.
2.6.
Метод определение степени аутокаталитического действия катепсинов
Для выявления аутокаталитического действия катепсинов, реакционную
смесь, включающую 8 мМ ДТТ, 2 мМ ЭДТА и 0,1 мл исследуемого материала,
преинкубировали в течение 15 минут при 370 С. После этого к ней добавляли 20
мкМ Nα-CBZ-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin для катепсина В, N-CBZ-PheArg-7-амидо-4-метилкумарина для катепсина L и Arg-7-amido-4-methylcoumarin
для катепсина Н и инкубировали 60 минут при 37 0C (Борискина М.А., 1996).
Аутокаталитическое действие катепсинов оценивалось по коэффициенту
отношения значения активности фермента после прекаталитической инкубации к
2.7.
9
параллельно определяемому значению активности без преинкубации (Kaca–
коэффициент аутокаталитического действия).
2.8. Метод оценки окислительной модификации белков в тканях
Для оценки окислительной модификации белков использовали определение
уровня карбонильных производных по методу R.L. Levine в модификации Е.Е.
Дубининой (Дубинина Е.Е. и др., 1995). Метод оценки окислительной
модификации белков основан на реакции взаимодействия карбонильных
производных окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4динитрофенилгидразином
(2,4-ДНФГ)
с
образованием
2,4динитрофенилгидразонов, которые регистрировались спектрофотометрически. По
полученным результатам подсчитывали площадь под кривой спектра поглощения
продуктов окислительной модификации белков, которая складывалась из
площадей под кривой альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетондинитрофенилгидразонов (КДНФГ) (Пат. 2524667 РФ, МПК G01N33/52. Способ
комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков
в тканях и биологических жидкостях / Фомина М.А. и др.; Ряз. гос. мед. ун-т им.
И.П. Павлова. – 2013102618/15; заявл. 21.01.2013; опубл. 27.07.2014, Бюл. № 21. –
8 с.). Далее полученное значение выражали в условных единицах/грамм белка.
Способ оценки доли первичных и вторичных маркеров
окислительного стресса
Для оценки доли первичных маркеров подсчитывалась сумма АДНФГ, для
оценки вторичных - сумма КДНФГ, и соотносилась с общим содержанием
карбонильных производных белков (Sобщ).
2.9.
2.10. Способ оценки резервно-адаптационного потенциала
Оценка резервно-адаптационного потенциала производилась путем
подсчета отношения площади под кривой карбонильных производных белков при
спонтанном окислении протеинов к индуцированному по реакции Фентона,
принимая КДНФГинд. и АДНФГинд. за 100 % (Никитина Ю.В., Мухина И.В., 2009).
2.11. Статистическая обработка данных
Статистический
анализ
результатов
исследования
проведен
с
использованием программы «Microsoft Office Excel 2010» и «Statistica 10.0».
Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью
критерия Шапиро-Уилка (W-критерий). Результаты представляли в формате Ме
[min; max], где Ме- медиана, min - минимальное и max - максимальное значение.
Для оценки статистической значимости различий независимых выборок
использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест). Для проверки равенства
медиан нескольких выборок использовали критерий Краскела-Уоллиса. Для
оценки ранговой корреляции использовали коэффициент Спирмена. Критический
уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равным
0,05.
10
3. Результаты и обсуждение
3.1. Характеристика экспериментальных моделей
Для подтверждения эффекта конкурентного ингибитора и субстрата NOсинтазы осуществляли измерение уровня метаболитов оксида азота (табл. 1).
Таблица 1
Концентрация метаболитов оксида азота в тимусе и селезенке крыс в моделях
in vivo, Ме [min; max]
экспериментальная модель
тимус
селезенка
контроль 1
16,9 [10,9; 23,6]
10,6 [9,0; 18,9]
L-NAME (25 мг/кг)
15,2 [11,7; 19,9]
8,3 [6,6; 9,1]* (p=0,019)
контроль 2
17,9 [9,1; 31,5]
12,9 [10,5; 20,7]
L-аргинин (500 мг/кг)
23,8[10,7;49,2]* р=0,012 21,1[15,1;27,2]*р=0,012
контроль 3
15,8 [11,7; 24,9]
9,8 [8,5; 19,1]
L-NAME (25 мг/кг) +
13,2 [9,8; 34,6]^
12,1 [9,4; 14,2]^
L-аргинин (500 мг/кг)
р=0,008
p=0,008
Примечание: * - статистически значимые отличия относительно группы контроля;
^ - статистически значимые отличия относительно группы L-аргинин
В условиях in vitrо-моделирования дефицита синтеза оксида азота
концентрация NO2̄ и NO3̄ в тимоцитах и спленоцитах снижается, а при
дополнительном внесении субстрата в питательную среду – повышается (табл. 2).
Таблица 2
Концентрация метаболитов оксида азота (нмоль/мг белка) в тимоцитах и
спленоцитах крыс в условиях in vitro-модулирования синтеза оксида азота
экспериментальная модель
тимоциты
спленоциты
Контроль
24,9 [20,4; 32,7]
6,11 [5,7; 8,81]
L-аргинин (5 мМ)
40,0 [35,1; 42,1]* (p=0,01)
32,7[24,9;38,9]* (p=0,01)
*
L-NAME (5 мМ)
15,4 [12,7; 17,3] (p=0,03)
4,9 [4,3; 5,7]* (p=0,04)
Примечание: * - статистически значимые отличия относительно группы контроля
Жизнеспособность свежевыделеных тимоцитов составила 70,2 ± 2,8 %,
после инкубации жизнеспособность контрольной группы тимоцитов
незначительно снизилась и стала равна 66 ± 5,5 % (p=0,88). При in vitroмоделировании дополнительного синтеза оксида азота субстратом L-аргинин
данный показатель статистически значимо не изменился и составил 66,8 ± 2,1 %
(p=0,79), однако добавление 5 мМ L-NAME в инкубационную среду способствует
уменьшению жизнеспособности клеток по сравнению со свежевыделенными
клетками и инкубированным контролем - 52 ± 2,1 % (р=0,03).
Для свежевыделенных спленоцитов жизнеспособность клеток составила
69,7 ± 1,03%, после инкубации в полной питательной среде незначительно
снизился до 67,7 ± 2,4% (p=1,00). Добавление аргинина в питательную среду не
способствует изменению жизнеспособности клеток – 67,8 ± 2,3% (p=0,94), а
внесение L-NAME 5 мМ приводит к статистически значимому уменьшению
жизнеспособности – 48,5 ± 1,1% (p=0,02).
11
3.2. Оценка состояния окислительной модификации белков
3.2.1. Характеристика окислительного карбонилирования белков под
действием конкурентного ингибитора синтеза оксида азота – L-NAME
Внутрибрюшинное введение L-NAME приводит к статистически значимому
увеличению общей площади под кривой спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков селезенки крыс за счет статистически
значимого повышения количества альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов
основного характера при дозе 25 мг/кг (рис. 1).
e.o.п./г белка
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
λ(нм)
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
контроль 1
L-NAME (25 мг/кг)
5,1 [2,2; 9,6]
3,6 [2,7; 10,5]
p = 0,68
428 430 434
520 535
SКДНФГ н.
SАДНФГ о.
1,6 [0,24; 4,8]
2,7 [1,1; 5,5]
p = 0,11
0,4 [0,3; 0,9]
2,8 [2,2; 5,9]*
p = 0,002
SКДНФГ о.
0,06 [0,03; 0,12]
0,6 [0,4; 1,4]*
p = 0,001
S общ.
6,69 [3,8; 14,9]
10,9 [7,2; 23,5]*
p = 0,072
e.o.n./г белка
Примечание:
*- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 1. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков селезенки под действием L-NAME в дозе 25
мг/кг
Обнаруженные in vivo изменения подтверждаются в эксперименте in vitro
(рис. 2).
e.o.п./г белка
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
λ(нм)
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
контроль
L-Name (5
L-NAME
мМ)
(5мМ)
428 430 434
520 535
SКДНФГ н.
SАДНФГ о.
15,8 [15,6; 20,5]
7,4 [4,5; 9,8]
6,5 [4,7; 9,7]
1,1 [0,8; 1,7]
33,4 [25,7; 39,4]
25,7 [11,7; 44,9]
10,6 [7,1; 31,8]
23,5 [9,8; 44,9]*
4,7 [2,1; 8,0]*
72,1 [31,3; 129,8]*
p = 0,76
p = 0,23
p = 0,037
SКДНФГ о.
p = 0,037
S общ.
0,037
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 2. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков спленоцитов крыс под действием 5 мМ LNAME in vitro
В тимусе под действием L-NAME in vivo в дозе 25 мг/кг наблюдается
тенденция к увеличению содержания карбонильных производных белков, однако,
статистически значимых различий не отмечается (рис. 3).
12
e.o.п./г белка
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
λ нм.
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
контроль 1
L-NAME
(25 мг/кг)
428 430 434
SКДНФГ н.
520 535
SАДНФГ о.
SКДНФГ о.
12,65 [8,9; 26,3]
7,2 [4,8; 15,5]
7,8 [5,9; 15,9]
1,7 [1,3; 3,2]
29,2[20,6;53,7]
S общ.
14,08 [10,5; 40,8]
6,8 [4,4; 14,9]
10,7 [6,4; 20,5]
1,9 [1,1; 3,8]
33,6 [22,5;80,1]
P = 0,31
p = 0,31
p = 0,15
p = 0,15
p = 0,19
Рис. 3. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков тимуса экспериментальной группы под
действием L-NAME в дозе 25 мг/кг
Структурная организация кровяного русла тимуса органоспецифична и
находится в прямой зависимости от строения соединительнотканного каркаса. В
свою очередь N-нитро-L-аргининметиловый эфир способствует сужению сосудов,
что может затруднить биодоступность данного вещества для вилочковой железы.
Предположение об отсутствии изменений in vivo по причине слабой
биодоступности L-NAME в ткань тимуса, подтверждается в эксперименте in vitro.
Так, в тимоцитах, инкубированных в полной питательной среде с внесением 5 мМ
L-NAME, было отмечено статистически значимое повышение общей площади под
кривой относительно контрольного значения (рис. 4).
e.o.п./г белка
λ(нм)
L-NAME
(5мМ)
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 4. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков тимоцитов крыс под действием 5 мМ LNAME in vitro
В условиях in vivo- и in vitro-моделирования дефицита синтеза оксида азота
в селезенке доля вторичных маркеров статистически значимо возрастала, в тимусе
данный показатель не изменялся (табл. 3).
Таким образом, можно предположить, что для селезенки в условиях
моделирования дефицита синтеза оксида азота, мишенями для повреждающих
агентов являются остатки аминокислот основного характера. Для тимуса такой
специфичности отмечено не было.
13
Таблица 3
Доля первичных и вторичных маркеров окислительного стресса в селезенке и
тимусе крыс в условиях in vivo- и in vitro-моделирования
дефицита синтеза оксида азота, Ме [min; max]
Доля первичных
Доля вторичных
маркеров
маркеров
селезенка
Контроль 1
78,4 [56,2; 85,5]
20,6 [10,1; 35,6]
L-NAME (25 мг/кг) 69,1 [66,9; 75,1]*р=0,002 30,9 [24,9; 33,1]* р=0,002
Контроль in vitro
75,7 [67,2; 79,0]
24,3 [21,8; 30,6]
L-NAME 5 мМ
69,5 [60,1; 75,9]* р=0,01
30,5 [24,1; 36,8]* р=0,02
тимус
Контроль 1
73,6 [70,9; 75,8]
26,4 [24,6; 31,1]
L-NAME (25 мг/кг)
74,9 [70,1; 78,9]
25,1 [21,1; 29,9]
Контроль in vitro
76,2 [65,4; 78,6]
23,8 [20,1; 26,5]
L-NAME 5 мМ
77,3 [68,7; 80,4]
22,7 [19,8; 27,4]
Примечание: * - статистически значимые отличия относительно группы контроля
Характеристика окислительного карбонилирования белков под
влиянием субстрата синтеза оксида азота – L-аргинина
Влияние изолированного введения L-аргинина на формирование
карбонильных производных белков
Под действием L-аргинина in vivo (рис. 5) и in vitro (рис. 6) общая площадь
под кривой окислительной модификации белков селезенки не изменяется
относительно контроля, однако спектр поглощения продуктов претерпевает
изменения.
e.o.п./г белка
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
λ(нм)
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
контроль 2
L-аргинин
(500 мг/кг)
428 430 434
SКДНФГ н.
520
535
SАДНФГ о.
SКДНФГ о.
5,2 [2,5; 9,4]
1,2 [0,3; 5,4]
0,5 [0,3; 1,0]
0,06 [0,04; 0,1]
6,3 [3,2; 13,6]
S общ.
4,0 [0,07; 6,1]*
1,2 [0,2; 1,8]
0,7 [0,2;1,8]*
0,2 [0,1; 0,5]*
6,9 [1,0; 10,0]
p = 0,025
p = 0,64
p = 0,057
p = 0,0035
p = 0,7
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 5. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков селезенки под влиянием L-аргинина
e.o.п./г белка
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
λ(нм)
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
контроль
L-аргинин
(5 мМ)
428 430 434
535
SАДНФГ о.
SКДНФГ о.
15,8 [15,6; 20,5]
7,4 [4,5; 9,8]
6,5 [4,7; 9,7]
1,1 [0,8; 1,7]
33,4 [25,7; 39,4]
7,7 [6,6; 17,5]*
4,7 [1,8; 17,2]
5,8 [2,9;22,4]
2,6 [0,5; 5,4]*
18,4 [12,9; 81,1]
p = 0,36
p = 0,045
p = 0,76
P = 0,045
SКДНФГ н.
520
p = 1,0
S общ.
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 6. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов окислительной
модификации белков спленоцитов под влиянием 5 мМ L-аргинина in vitro
14
В тимусе крыс, в свою очередь, проявляется четкий антиоксидантный
эффект действия L-аргинина in vivo (рис. 7) и in vitro (рис. 8).
e.o.п./г белка
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
λ(нм)
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
контроль
L-аргинин
(5 мМ)
428 430 434
SКДНФГ н.
520
SАДНФГ о.
535
SКДНФГ о.
S общ.
13,05 [9,1; 24,3]
6,2 [4,4; 12,5]
7,3 [5,1; 14,08]
1,4 [0,9; 2,7]
28,4[20,6;53,7]
8,4 [3,7; 17,9]
5,2 [1,5; 6,5]*
6,1 [1,2; 8,4]*
1,2 [0,3; 1,9]
20,9[6,8;32,8]
p = 0,09
p = 0,02
p = 0,023
p = 0,12
p = 0,13
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 7. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков тимуса под влиянием L-аргинин in vivo
e.o.п./г белка
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
λ(нм)
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
контроль
L-аргинин
(5 мМ)
428 430 434
SКДНФГ н.
520
535
SАДНФГ о.
SКДНФГ о.
15,5 [12,1; 25,1]
5,5 [3,3; 8,1]
5,2 [3,1; 11,6]
1,03 [0,8; 1,9]
27,5 [20,9; 44,8]
S общ.
4,2 [2,08; 8,7]*
2,4 [0,7; 4,9]*
2,7 [0,5; 5,5]
0,6 [0,08; 1,3]
10,9 [3,4; 18,8]*
p=0,03
p=0,05
p=0,31
p=0,66
p=0,03
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 8. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков тимoцитов под влиянием L-аргинина
В условиях стимулирования синтеза оксида азота общее количество
карбонильных производных белков не изменяется относительно значений
контрольной группы. Однако, изменяется структура спектра поглощения
продуктов окислительной модификации белков селезенки: снижается количество
АДНФГ нейтрального характера, повышается содержание КДНФГ основного
характера. Для тимуса прослеживается тенденция снижения содержания
карбонильных
производных
белков.
Разнонаправленность
изменений
окислительного статуса иммунокомпетентных органов может объясняться разным
белковым составом тимуса и селезенки, то есть цитопротекторный и
цитотоксический эффект оксида азота, возможно, определяется его
взаимодействием с доступными мишенями.
Использование L-аргинина в условиях экспериментального дефицита
синтеза оксида азота
При сочетанном применении L-NAME (25 мг/кг) и L-аргинина общая
площадь под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации
белков селезенки статистически значимо не отличается от значений контрольной
группы (табл. 4). Для тимуса отмечалась несколько иная тенденция: значение
общей площади под кривой спектра поглощения продуктов окислительной
15
модификации белков статистически значимо снижается относительно значений
контрольной группы за счет АДНФГ и КДНФГ нейтрального характера (табл. 4).
Таблица 4
Значения площади под кривой спектра поглощения карбонильных производных
белков селезенки и тимуса в условиях корригирующего действия L-аргинина
селезенка
тимус
Контроль 3
L-аргинин (500 мг/кг) Контроль 3
L-аргинин (500 мг/кг)
+L-NAME (25 мг/кг)
+L-NAME (25 мг/кг)
S АДНФГ н.
4,0 [2,7; 10,01]
3,2 [1,9; 6,8]
13,9 [10,6; 26,1] 3,2 [2,2; 7,1]*p=0,001
SКДНФГ н.
1,1 [0,32; 5,9]
1,4 [0,8; 2,1]
6,9 [5,6; 14,5]
3,8 [0,8; 6,3]*p=0,005
SАДНФГ о.
0,32 [0,28; 1,51]
1,1 [0,7; 1,6]
7,8 [4,9; 13,1]
6,1 [1,1; 13,6]
SКДНФГ о.
0,05 [0,03; 0,32]
0,2 [0,1; 0,3]
1,7 [0,8; 3,1]
1,3 [0,3; 2,8]
S ОБЩ
6,57 [3,9; 14,4]
6,09 [4,8; 10,05]
29,8 [20,6; 53,7] 13,7[5,4;29,9]*p=0,009
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Для селезенки общая площадь под кривой окислительной модификации
белков в экспериментальной группе сочетанного применения L-NAME на фоне Lаргинина ниже относительно группы L-NAME и не отличается от значений
группы L-аргинин, что свидетельствует о корригирующем действии аргинина при
использовании L-NAME в дозе 25 мг/кг (рис. 9).
е.о.п./г белка
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
λ нм.
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
L-аргинин
(500 мг/кг)
L-Name (25 мг/кг)
L-NAME(25 мг/кг)
+L-аргинин (500 мг/кг)
428 430 434
SКДНФГ н.
4,0 [0,07; 6,1]
1,2 [0,2; 1,8]
3,6 [2,7; 10,5]
2,7 [1,1; 5,5]
3,2 [1,9; 6,8]
1,4 [0,8; 2,1]
#
p = 0,014
520 535
SАДНФГ о.
#
SКДНФГ о.
S общ.
0,7 [0,2;1,8]
0,2 [0,1; 0,5]
6,9 [1,0; 10,0]
2,8 [2,2; 5,9]
0,6 [0,4; 1,4]
10,9 [7,2; 23,5]
1,1 [0,7; 1,6]
#
#
p = 0,001
0,2 [0,1; 0,3]
#
p = 0,001
6,09[4,8;10,05]
#
#
p = 0,007
Примечание: # - статистически значимые отличия от группы L-NAME 25 мг/кг (p<0,05)
Рис. 9. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков селезенки экспериментальной группы LNAME (25 мг/кг) на фоне L-аргинина относительно группы L-NAME (25 мг/кг) и
L-аргинин
При использовании L-NAME (25 мг/кг) на фоне L-аргинина отмечается
статистически значимое снижение общей площади под кривой спектра
поглощения продуктов окислительной модификации белков относительно группы
L-NAME: за счет статистически значимого снижения содержания АДНФГ и
КДНФГ нейтрального характера и АДНФГ основного характера (рис. 10).
16
е.о.п./г.белка
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
λ нм.
0
230
254 270
280
356 363 370
SАДНФГ н.
L-аргинин
(500 мг/кг)
L-Name (25 мг/кг)
L-NAME(25 мг/кг)
+L-аргинин (500 мг/кг)
#
428 430 434
SКДНФГ н.
520 535
SАДНФГ о.
SКДНФГ о.
S общ.
8,4 [3,7; 17,9]
5,2 [1,5; 6,5]
6,1 [1,2; 8,4]
1,2 [0,3; 1,9]
20,9[6,8;32,8]
14,08 [10,5; 40,8]
6,8 [4,4; 14,9]
10,7 [6,4; 20,5]
1,9 [1,1; 3,8]
33,6 [22,5;80,1]
3,2 [2,2; 7,1]^#
3,8 [0,8; 6,3]#
6,1 [1,1; 13,6] #
1,3 [0,3; 2,8]
13,7[5,4;29,96] #
p=0,001; ^ p = 0,02
#
p = 0,003
#
p = 0,04
#
p = 0,002
Примечание: ^ - статистически значимые отличия от группы L-аргинина (p<0,05);
# - статистически значимые отличия от группы L-NAME 25 мг/кг (p<0,05)
Рис. 10. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов
окислительной модификации белков тимуса экспериментальной группы L-NAME
(25 мг/кг) на фоне L-аргинина относительно группы L-NAME (25 мг/кг) и Lаргинин
Для оценки устойчивости белков к повреждающему воздействию
используется реакция Фентона, широко применяемая, как источник
гидроксильных радикалов. В условиях моделирования дефицита синтеза оксида
азота наблюдалось истощение резервно-адаптационного потенциала селезенки
преимущественно за счет динитрофенилгидразонов основного характера (рис. 11).
Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05)
Рис.
11.
Состояние
резервно-адаптационного
потенциала
динитрофенилгидразонов селезенки в условиях in vivo-моделирования дефицита
синтеза оксида азота
17
Под действием ингибитора синтеза оксида азота in vivo отмечается
тенденция истощения резервно-адаптационного потенциала тимуса за счет
АДНФГ нейтрального характера (рис. 12). Уровень резервно-адаптационного
потенциала увеличивается под действием L-аргинина, а также относительно
значений контрольной группы при сочетанном применении L-NAME и Lаргинина, что указывает на положительное влияние L-аргинина.
Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05)
Рис.
12.
Состояние
резервно-адаптационного
потенциала
динитрофенилгидразонов тимуса в условиях in vivo-моделирования дефицита
синтеза оксида азота
Из полученных результатов следует, что в условиях дефицита синтеза
оксида азота значение резервно-адаптационного потенциала снижается
относительно показателей контрольной группы. Полученная тенденция
истощения резервно-адаптационного потенциала иммунокомпетентных органов
может свидетельствовать о недостаточной активности антиоксидантных систем и
накоплении поврежденных, имеющих слабую функциональную активность
белков.
3.2 . Оценка состояния лизосомального цистеинового протеолиза
Протеолитические системы способны удалять поврежденные белки, именно
поэтому их можно рассматривать как вторичные антиоксидантные системы.
Изучение активности протеиназ в условиях окислительного стресса важно для
понимания процесса обновления белков.
Внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе 25 мг/кг лабораторным
животным в течение 7 дней приводит к увеличению общей активности
катепсинов В, L и Н селезенки относительно контроля за счет увеличения
неседиментируемой активности (рис. 13).
18
Примечание: *- статистически значимые отличия относительно контроля (р < 0,05)
Рис. 13. Активность катепсинов В, L и Н селезенки в условиях in vivoингибирования синтеза оксида азота
Активность катепсинов В, L, Н тимуса не изменилась относительно
значений контрольной группы под действием L-NAME в дозе 25 мг/кг (рис. 14).
Рис. 14. Активность катепсинов В, L и Н тимуса в условиях in vivoингибирования синтеза оксида азота
Внутрижелудочное введение L-аргинина в дозе 500 мг/кг в течение 10 дней
не вызывало статистически значимых изменений активности катепсинов В, L, Н
селезенки и тимуса: значения неседиментируемой, седиментируемой и общей
активностей близки к значениям данных показателей контрольной группы.
Рис. 15. Активность катепсинов В, L и Н селезенки в условиях in vivoстимуляции синтеза оксида азота
19
Рис. 16. Активность катепсинов В, L и Н тимуса в условиях in vivo-стимуляции
синтеза оксида азота
В условиях in vitro-моделирования дефицита синтеза оксида азота
отмечается однонаправленная тенденция для спленоцитов и тимоцитов:
увеличение общей активности катепсинов L и Н относительно значений
контрольной группы (рис. 17 и рис. 18).
Примечание: * - статистически значимые Примечание: * - статистически значимые
отличия от контрольной группы (р < 0,05)
отличия от контрольной группы (р < 0,05)
Рис. 18. Активность катепсинов В, L
Рис. 17. Активность катепсинов
В, L и Н спленоцитов в условиях in и Н тимоцитов в условиях in vitrovitro-моделирования
дефицита моделирования дефицита синтеза оксида
азота
синтеза оксида азота
В условиях in vitro-моделирования дополнительного синтеза оксида азота
статистически значимых различий активности катепсинов В, L и Н спленоцитов и
тимоцитов относительно значений контрольной группы отмечено не было.
20
Рис. 19. Активность катепсинов В, L и Рис. 20. Активность катепсинов В, L и
Н спленоцитов в условиях in vitro- Н тимоцитов в условиях in vitroмоделирования синтеза оксида азота
моделирования синтеза оксида азота
В условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота, выход
катепсинов в цитозоль, возможно, происходит за счет повреждения мембраны, о
чем свидетельствует увеличение коэффициента лабильности кислой фосфатазы:
для селезенки контрольной группы 5,8 ± 1,2, в группе L-NAME – 14,2 ± 2,1, а для
тимуса – 2,8 ± 0,9 против 12,7 ± 3,1.
С целью оценки степени аутокаталитической активации проведен
сравнительный анализ коэффициента аутокаталитического действия (К асa)
катепсинов В, L, Н селезенки и тимуса крыс. В условиях in vitro-модулирования
синтеза оксида азота наблюдается одинаковая тенденция изменения
коэффициента аутокаталитического действия катепсинов В, L, Н спленоцитов
(табл. 5) и тимоцитов (табл. 5): в условиях инкубации в полной питательной среде
с L-аргинином – повышение коэффициента, а в условиях инкубирования в полной
питательной среде с L-NAME – снижение коэффициента аутокаталитического
действия относительно значений контроля и группы L-аргинина.
тимус
селезенка
Таблица 5
Значение коэффициета аутокаталитического действия катепсинов B, L, H
спленоцитов в условиях in vitro-модулировании синтеза NO (Ме [min; max])
Касa
катепсина В
Контроль
1,85 [1,82; 2,05]
L-аргинин
2,03 [1,73; 2,14]*
5 мМ
р=0,002
L-NAME
0,27 [0,19;
5 мМ
0,33]*р=0,02
Контроль
1,15 [1,11; 1,25]
L-аргинин
1,57 [1,14; 1,80]*
5 мМ
*р=0,03
L-NAME
0,52 [0,37; 0,70]*
5 мМ
р=0,035
Примечание: * – статистически значимые
Касa
Касa
катепсина L
катепсина H
1,56 [1,39; 1,65]
1,74 [1,64; 2,08]
1,70 [1,39; 1,97]*
4,01 [3,78;
р=0,045
4,11]*р=0,001
0,77 [0,51; 1,06]*
0,47 [0,22; 0,62]*
р=0,015
р=0,03
1,06 [1,06; 1,20]
1,09 [1,00; 1,20]
1,21 [1,13; 1,33]*
1,13 [1,06; 1,53]*
*р=0,05
*р=0,02
0,50 [0,08; 0,59]*
0,68 [0,38; 1,12]*
р=0,002
р=0,03
отличия от контрольной группы (р < 0,05)
21
Совместное введение L-аргинина и L-NAME (25 мг/кг) способствует
статистически значимому увеличению общей и неседиментируемой активности
катепсинов L и Н селезенки относительно контроля (рис. 21), то есть в условиях
данной экспериментальной модели эффект L-NAME сохраняется.
Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05)
Рис. 21. Активность катепсинов В, L и Н селезенки в условиях in vivo
корригирующего действия L-аргинина
Рис. 22. Активность катепсинов В, L и Н тимуса в условиях in vivo
корригирующего действия L-аргинина
При анализе полученных данных были выявлены прямые корреляционные
связи между общей площадью под кривой окислительной модификации белков и
общей активностью катепсина L и Н селезенки под влиянием L-NAME в условиях
in vivo (табл. 6) и in vitro (табл. 7). Данная тенденция свидетельствует о
существовании взаимосвязи процессов окислительного повреждения белков и
лизосомального цистеинового протеолиза в условиях дефицита синтеза оксида
азота.
22
Таблица 6
Коэффициенты корреляции (R) между общим содержанием карбонильных
производных белков и общей активностью катепсинов В, L и Н селезенки и
тимуса в условиях in vivo- изменения синтеза NO
Контроль
L-NAME
катепсин В
селезенка
тимус
0,36
0,24
0,38
-0,20
катепсин L
селезенка
тимус
0,55
-0,33
-0,20
0,62*
р=0,01
-0,14
0,27
-0,11
0,39
катепсин Н
селезенка
тимус
0,55
-0,024
-0,10
0,67*
р=0,037
0,071
0,21
0,36
0,23
L-аргинин
0,19
-0,57
L-NAME
-0,05
-0,61
+ L-аргинин
Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05)
Таблица 7
Коэффициенты корреляции (R) между общим содержанием карбонильных
производных белков и общей активностью катепсинов В, L и Н селезенки и
тимуса в условиях in vitro- изменения синтеза NO
Контроль
L-NAME
5 мМ
катепсин В
спленоциты тимоциты
0,56
0,40
-0,50
0,80
катепсин L
спленоциты тимоциты
0,50
-0,62
0,60
0,95*
р=0,02
катепсин Н
спленоциты тимоциты
0,50
0,20
0,87
0,90*
р=0,02
L-аргинин
-0,87
-0,60
0,20
-0,60
-0,50
-0,60
5 мМ
Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05)
Таким образом, активность лизосомальных цистеиновых протеиназ в
условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота нарастает и
сопровождается выходом катепсинов в цитоплазму за счет повреждения
лизосомальной мембраны. Важно отметить, что изменение уровня оксида азота
влияет на аутопрoцессинг катепсинов В, L, Н, что имеет важное функциональное
значение. Кроме этого, процесс карбонилирования белков и активация
лизосомальных цистеиновых протеиназ L и Н селезенки взаимосвязаны.
ВЫВОДЫ
1. Подавление синтеза оксида азота конкурентным ингибитором N-нитро-Lаргининметиловым эфиром приводит к нарастанию содержания
карбонильных
производных
белков
с
преобладанием
динитрофенилгидразонов основного характера селезенки и тимуса, при
этом наблюдается истощение резервно-адаптационного потенциала и
увеличение доли вторичных маркеров окислительного стресса.
23
2. В условиях дефицита синтеза оксида азота происходит активация
лизосомальных цистеиновых протеиназ В, L, Н селезенки и тимуса крыс,
сопровождаемая их выходом в цитоплазму за счет повреждения
лизосомальной мембраны.
3. Воздействие субстрата синтеза оксида азота L-аргинина приводит к
снижению уровня карбонильных производных белков без изменения
активности катепсинов В, L, Н тимуса и селезенки крыс. Применение Lаргинина в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота
оказывает корригирующее воздействие на показатели окислительной
модификации белков, однако, для активности катепсинов сохраняется
эффект N-нитро-L-аргининметилового эфира.
4. Между окислительным карбонилированием белков и активностью
лизосомальных цистеиновых протеиназ L и Н селезенки выявлена
положительная корреляционная связь в условиях моделирования дефицита
синтеза оксида азота.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Работы,
опубликованные
в
ведущих
рецензируемых
журналах,
рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России
1.
Абаленихина, Ю.В. Катепсин В иммунокомпетентных органов крыс в
условиях модуляции синтеза NO [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина //
Научное обозрение. – 2013. – № 2. - С.48-52. (0,31 печ.л.)
2.
Абаленихина, Ю.В. Окислительная модификация белков и изменение
активности катепсина L селезенки крыс в условиях моделирования дефицита
синтеза оксида азота [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина, С.А. Исаков //
Рос. медико-биол. вестн. им. акад. И.П. Павлова.– 2013. – №1. – С. 44-48. (0,34
печ.л.)
3.
Абаленихина, Ю.В. Окислительная модификация белков селезенки крыс
при экспериментальном дефиците синтеза оксида азота разной выраженности
[Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Фундаментальные исследования.–
2013. – № 11 (часть 9). - С. 1850-1855. (0,31 печ.л.)
4.
Абаленихина, Ю.В. Окислительная модификация белков и активность
катепсина Н тимоцитов крыс в условиях in vitro модулирования синтеза оксида
азота (II) [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Казан. мед. журн. – 2014. –
№4. – С. 553-557. (0,36 печ.л.)
Работы, опубликованные в других рецензируемых журналах
1. Fomina, M.A. Cathepsins B, L and H Splenocytes as the Secondary Antioxidant
Systems in the Conditions of Carbonyl Stress [Text] / M.A. Fomina, Yu.V.
Abalenikhina// Advances in Biochemistry, 2015. – Vol.3, № 1. –P. 5-8. (0,25 печ.л.)
24
Материалы научных конференций
1.
Абаленихина, Ю.В. Влияние L-аргинина на активность катепсинов В и Н
селезенки крыс [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Cб. науч. тр.,
посвящ. 90-летию со дня рождения выдающегося общего патолога и
патофизиолога академика Г.Н. Крыжановского и 180-летию со дня рождения
основоположника российской научной клинической медицины С.П. Боткина
«Актуальные проблемы клинической и экспериментальной патологии» / под ред.
Ю.Ю. Бяловского, В.В. Давыдова. – Рязань: РязГМУ, 2012. – С.14-17. (0,36 печ.л.)
2.
Абаленихина, Ю.В. Активность катепсина L спленоцитов крыс в условиях
in vitro-модулирования синтеза оксида азота [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А.
Фомина // Cб. науч. тр. по материалам IХ Междунар. науч. – практ. конф.
«Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в
решении актуальных проблем здравоохранения» / под ред. Х.М. Галимзянова [и
др.]. – Астрахань: ГБОУ ВПО Астраханская ГМА, 2013. – С. 77-78. (0,125 печ.л.)
3.
Абаленихина, Ю.В. Влияние N-нитро-L-аргининметилового эфира на
активность и аутопроцессинг катепсина L крыс in vivo и in vitro [Текст] / Ю.В.
Абаленихина, М.А. Фомина // Cб. науч. тр. по материалам ХII региональной науч.
– практ. конф. с Междунар. участием «Обмен веществ при адаптации и
повреждении (дни лабораторной диагностики южного федерального округа)» /
под ред. З.И. Микашинович. – Ростов н/Д.: ГБОУ ВПО Рост ГМУ, 2013. – С. 3-7.
(0,31 печ.л.)
4.
Абаленихина, Ю.В. Влияние N-нитро-L-аргининметилового эфира на
спектр окислительной модификации белков и жизнеспособность спленоцитов in
vitro [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Сб. науч. статей V Рос. науч. –
практ. конф. «Здоровье человека в ХХI веке» / под ред. проф. С.С. Ксембаева;
КГМУ. – Казань: Изд-во «Отечество», 2013. – С. 727-732. (0,375 печ.л.)
5.
Абаленихина, Ю.В. Влияние модуляторов синтеза оксида азота на
окислительную модификацию белков спленоцитов крыс [Текст] / Ю.В.
Абаленихина // Сб. тр. Междунар. симпоз. «Биохимия – основа наук о жизни» /
сост.: Н.И. Акберова; ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный
университет».- Казань, 2013. – С. 24-25. (0,125 печ.л.)
6.
Абаленихина,
Ю.В.
Корригирующее
действие
L-аргинина
на
окислительную модификацию белков селезенки крыс в условиях моделирования
дефицита синтеза NO [Текст] / Ю.В. Абаленихина // Бюллетень северного
государственного медицинского университета / под ред. С.И. Малявской [и др.]. –
Архангельск: СГМУ, 2013. – № 1. - С. 109-110. (0,125 печ.л.)
7.
Абаленихина, Ю.В. Спектр окислительной модификации белков как новый
подход к анализу влияния L-аргинина на образование карбонильных производных
протеинов тимуса крыс [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Сб. тез. по
материалам Всерос. науч. – практ. конф. с Междунар. участием, посвящ. 70-летию
Рязанского государственного университета «Здравоохранение: образование,
наука, инновации» / под ред. проф. Р.Е. Калинина [и др.]. – Рязань: РИО РязГМУ,
2013. – С.147-150. (0,25 печ.л.)
25
8.
Фомина, М.А. Влияние L-аргинина на активность катепсинов L и Н
селезенки крыс в условиях моделированного дефицита синтеза оксида азота
[Текст] / М.А. Фомина, Ю.В. Абаленихина // Cб. науч. статей по материалам Рос.
науч. – практ. конф. с Междунар. участием «Актуальные вопросы медицинской
биохимии и клинической лабораторной диагностики» / под ред. И.Г. Мустафина
[и др.]; КГМУ. – Казань: Изд-во «Отечество», 2013. – С. 183-188. (0,375 печ.л.)
9.
Абаленихина, Ю.В. Регуляция активности катепсина L селезенки крыс в
условиях in vivo моделирования дефецита синтеза оксида азота [Текст] / Ю.В.
Абаленихина, М.А. Фомина // Сб. статей Междунар. науч. – практ. конф.
«Актуальные вопросы развития науки» / под ред. А.А. Сукиасян. – Уфа: РИЦ
БашГМУ, 2014. – С. 64-66. (0,1875 печ.л.)
10. Абаленихина,
Ю.В.
Резервно-адаптационный
потенциал
иммунокомпетентных тканей при L-NAME-индуцируемом окислительном
стрессе [Текст] / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Cб. науч. тр. по материалам
Х юбил. Междунар. конф. «Окислительный стресс и свободнорадикальные
патологии» / ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный
комплекс» МЗ РФ. – Пицунда (Абхазия), 2014. – С. 7. (0,063 печ.л.)
Патент на изобретение
1.
Пат. 2524667 РФ, МПКG01N 33/52. Способ комплексной оценки
содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и
биологических жидкостях [Текст] / М.А. Фомина, Ю.В. Абаленихина, Н.В.
Фомина, А.А. Терентьев; ГБОУ ВПО Ряз. гос. мед. ун-т им. акад. И.П. Павлова. –
2013102618/15; заявл. 21.01.2013; опубл. 27.07.2014, Бюл. 21. – 8 с. (0,5 печ.л.)
Методические рекомендации
1.
Фомина, М.А. Способ комплексной оценки содержания продуктов
окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях:
методические рекомендации [Текст] / М.А. Фомина, Ю.В. Абаленихина; ГБОУ
ВПО РязГМУ Минздрава. – Рязань: РИО РязГМУ, 2014. – 60 с. (3,75 печ.л.)