2 460 774(13) C1

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 460 774
(13)
C1
(51) МПК
C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/00 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2011127448/10, 04.07.2011
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
04.07.2011
(45) Опубликовано: 10.09.2012 Бюл. № 25
C 1
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии, в
частности к получению питательных сред,
которые создают оптимальные условия для
жизнедеятельности легионелл. Питательная
среда содержит ферментативный гидролизат
кильки с содержанием аминного азота 0,100,14%, калий фосфорнокислый 1-замещенный,
R U
калий фосфорнокислый 2-замещенный 3водный, железо сернокислое закисное 7водное, активированный уголь, L-цистеина
гидрохлорид, агар микробиологический и
дистиллированную
воду
при
заданном
соотношении
компонентов.
Изобретение
позволяет повысить выход биомассы и
сократить сроки выращивания легионелл. 3 пр.
C 1
2 4 6 0 7 7 4
Адрес для переписки:
355035, г.Ставрополь, ул. Советская, 13-15,
СтавНИПЧИ
Ñòð.: 1
ru
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное учреждение
здравоохранения Ставропольский научноисследовательский противочумный институт
Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия
человека (RU)
2 4 6 0 7 7 4
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2412240 С1, 20.02.2011. RU 1614494
С1, 15.11.1994. SU 1359297 А1, 15.12.1987. RU
97115622 A1, 10.08.1999. Под ред.
ЛАБИНСКОЙ А.С. и др. Частная
медицинская микробиология с техникой
микробиологических исследований. - М.:
Медицина, 2005, с.563-565.
R U
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 04.07.2011
(72) Автор(ы):
Катунина Людмила Семёновна (RU),
Темежникова Надежда Дмитриевна (RU),
Куличенко Александр Николаевич (RU),
Таран Татьяна Викторовна (RU),
Ковтун Юрий Сергеевич (RU),
Старцева Ольга Леонидовна (RU),
Курилова Анна Алексеевна (RU),
Зуенко Анастасия Анатольевна (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 460 774
(13)
C1
(51) Int. Cl.
C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/00 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(24) Effective date for property rights:
04.07.2011
Priority:
(22) Date of filing: 04.07.2011
(45) Date of publication: 10.09.2012 Bull. 25
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe uchrezhdenie
zdravookhranenija Stavropol'skij nauchnoissledovatel'skij protivochumnyj institut
Federal'noj sluzhby po nadzoru v sfere zashchity
prav potrebitelej i blagopoluchija cheloveka (RU)
sulphate, activated carbon, L-cysteine hydrochloride,
microbiological agar and distilled water in the
preset proportions.
EFFECT: invention provides higher biomass yield
and reduced time of legionella cultivation.
3 ex
R U
2 4 6 0 7 7 4
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: nutrient medium contains enzyme
sprat hydrolyzate containing 0.10-0.14% of amine
nitrogen, potassium monophosphate, 3-aqueous
disubstituted potassium phosphate, 7-aqueous ferrous
Ñòð.: 2
en
C 1
C 1
(54) NUTRIENT MEDIUM FOR LEGIONELLA CULTIVATION
2 4 6 0 7 7 4
Mail address:
355035, g.Stavropol', ul. Sovetskaja, 13-15,
StavNIPChI
R U
(72) Inventor(s):
Katunina Ljudmila Semenovna (RU),
Temezhnikova Nadezhda Dmitrievna (RU),
Kulichenko Aleksandr Nikolaevich (RU),
Taran Tat'jana Viktorovna (RU),
Kovtun Jurij Sergeevich (RU),
Startseva Ol'ga Leonidovna (RU),
Kurilova Anna Alekseevna (RU),
Zuenko Anastasija Anatol'evna (RU)
(21)(22) Application: 2011127448/10, 04.07.2011
RU 2 460 774 C1
5
10
15
20
25
30
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред
для выращивания легионелл.
Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является
мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г;
кровь 10,0 г; агар-агар 15,0-20,0 г рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при
температуре 121°C (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды
для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 64-65;
С. - 269).
Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.
Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая
г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0; калий фосфорнокислый 1замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный
уголь 2,0; L-цистеина гидрохлорид 0,4; эмбриональный стимулятор роста
микроорганизмов 2,5; агар микробиологический 8,5; дистиллированная вода до 1 л
(Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011 г. Бюл. №5).
По питательной ценности предлагаемая среда равноценна аналогу, а по ростовым
качествам несколько превосходит аналог.
Целью настоящего изобретения является конструирование качественной
питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые
свойства легионелл.
Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной
основы содержит ферментативный гидролизат кильки; 0,01 М калий фосфатный
буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный;
калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный), а также активированный уголь; Lцистеин гидрохлорид; агар микробиологический; дистиллированную воду с
добавлением в среду в качестве стимулирующей добавки железа сернокислого
закисного 7-водного при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Ферментативный гидролизат кильки
(с содержанием аминного азота 0,10-0,14%) 280,0-320,0
35
Калий фосфорнокислый 1-замещенный
0,63-1,03
Калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный
0,96-1,36
Железо сернокислое закисное 7-водное
0,18-0,22
Активированный уголь
L-цистеин гидрохлорид
Агар микробиологический
40
45
50
Дистиллированная вода
0,2-0,6
8,0-12,0
до 1 л.
Килька ТУ-8-5344-113607. Биологическая ценность кильки состоит в следующем содержание влаги 67%, белка 13,4%; минеральные вещества кильки: зола 1,6%,
состоящая из солей мг на 100 г: калия 206; кальция 25; магния 23; фосфора 311; из
микроэлементов наибольшее количество в мкг: железа 1400; кобальта 30;
марганца 116; меди 240; никеля 8. В кильке содержатся также витамины: А - 0,06; С 1,1; В6 - 0,50; В2 - 0,12; ниоцина - 3,70; B1 - 0,02; фолацина - 13,0. Из белковых веществ в
кильке при ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты мг
на 100 г продукта: незаменимые: лизин 1090; метионин 410; триптофан 160; валин 660;
лейцин 1300; изолейцин 570; треонин 610; фенилаланин 560; заменимые аминокислоты:
пролин 480; аланин 790; аргинин 830; аспарагиновая кислота 1200; глицин 710;
тирозин 500; гистидин 330; глютаминовая кислота 1260; цистин 170; серин 570
Ñòð.: 3
DE
1,0-3,0
RU 2 460 774 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(М.Ф.Нестерин, И.М.Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва.
Пищевая промышленность». 1979. С. - 133-145).
Железо сернокислое закисное 7-водное ГОСТ 4148-78. Железо (II) сульфат.
Показатели качества: хч, чда, ч. Массовая доля основного вещества ≥99,0%
(Химические реактивы и высокочистые вещества. Каталог. / О.А.Гольдина,
Ю.С.Кузнецова, Т.Г.Иванова и др. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Химия, 1990. С. - 212).
В ходе многочисленных экспериментов первых исследователей по культивированию
легионелл было обнаружено, что важнейшими факторами роста легионелл являются
как аминокислоты, так и ионы железа (Легионеллезная инфекция / Н.Д.Темежникова,
И.С.Тартаковский. Москва. «Медицина», 2007. - С.42; 120).
Включение в состав среды 0,01 М калий фосфатного буфера (состав калий
фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при
приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения,
обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они
малотоксичны. Кроме того, HPO4 компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов,
нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию
питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования
клеток и вирусов, - М., 1989).
Ферментативный гидролизат кильки является качественной основой питательной
среды ввиду присутствия в нем 13,4% белка, а это значит, что основа содержит
большое количество аминокислот, железа, макро- и микроэлементов, которые играют
огромную роль в жизнедеятельности любых микроорганизмов.
При приготовлении питательной среды используют только дистиллированную
воду, без применения растворов, содержащих ионы натрия, в виду их губительного
действия на легионеллы.
Сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых
культур достаточного количества колоний через 24 ч при посеве 100 м.к.
В отличие от прототипа, предлагаемая среда экономична, выгодна и обеспечивает
оптимальные условия для размножения легионелл за 24 ч.
Приготовление ферментативного гидролизата кильки
Кильку размороженную в количестве 0,6 кг пропускают дважды через мясорубку,
затем помещают в 3-метровый л баллон, добавляют воду дистиллированную в
количестве 1,8 л, доводят рН до 8,2±0,1 с помощью калия гидроокиси по
фенолфталеину, затем добавляют коммерческий фермент панкреатин в
количестве 12,0 г. активностью 45 ед, добавляют в качестве консерванта хлороформ в
количестве 1% к объему. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно
перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 37±1°C. Содержимое
баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в
последующие сутки через 1,5-2,0 ч по 5 мин. В течение первого часа через каждые 15
мин измеряют рН, при изменении рН в кислую сторону обязательно корректируют
рН 40% раствором гидроокиси калия до значения 8,0-8,2. В последующие 2-е суток
ведут перемешивание через 1,5-2,0 ч по 5 мин. Динамику процесса гидролиза
контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по
достижению аминного азота 0,3-0,4%. После этого гидролиз останавливают и
гидролизат отстаивают в течение 2-х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата
декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр.
Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют
Ñòð.: 4
RU 2 460 774 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой
пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2
до +8°С.
Питательную среду на ферментативной основе кильки для выращивания легионелл
готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из кильки,
разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 300,0 мл,
другие ингредиенты в соотношении, г/л: калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,83;
калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,16; железо сернокислое закисное 7водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; агар микробиологический - 10,0;
дистиллированную воду до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного
расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:
1) в количестве 3 мл до рН 6,9±0,1. Приготовленную питательную среду разливают в
градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватномарлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В
расплавленный в кипящей водяной бане и остуженный до 56°C агар добавляют
простирилизованный в 10 мл дистиллированной воде L-цистеин гидрохлорид в
количестве 0,4 г, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в
течение 30 минут и используют для посева.
Соляную кислоту ГОСТ-3118-77 (чда, хч) используют для установления рН.
Массовая доля основного вещества, % 35-38.
Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с
методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по
биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии,
бруцеллеза, легионеллеза», (Москва, 2007), с использованием в качестве тест-культур
легионелл Legionella pneumophila АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophila ATCC
33152 Philadelphia.
Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара контрольной
среды СЭЛ рН 6,8 при температуре 37°C 24 ч. Из суточных культур готовили 1 млрд.
взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО
ГИСК им. Л.А.Тарасевича, затем серийными десятикратными разведениями в 0,01 М
буферном растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 (10 ‐6). Из
данных разведении взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого
подсушенного испытуемого агара, на среду СЭЛ и агар Хоттингера (отрицательный
контроль). Посевы инкубировали при 35±0,5°C в течение 5 суток. Через 24-120 ч
учитывали результаты путем подсчета выросших колоний.
Контрольная среда СЭЛ (Питательная среда для культивирования и выделения
возбудителя легионеллеза элективная) - состав г/л: питательная основа животного
происхождения - ферментолизат селезенки жидкий крупного рогатого скота в расчете
на сухое вещество - 7,0; активированный уголь ОУ-А 4,0; агар
микробиологический 17,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6; калий
фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,4; рН среды 7,1 (Производитель ФГУЗ
Рост НИПЧИ Роспотребнадзора. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117).
Контрольный агар Хоттингера. Промышленный регламент №1707-05 на
производство питательного агара для культивирования микроорганизмов, готового к
применению (агара Хоттингера). Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05571
от 20 августа 2009 г. Срок действия не ограничен.
Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л:
ферментативный гидролизат из кильки, разбавленного дистиллированной водой до
Ñòð.: 5
RU 2 460 774 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
показания аминного азота 0,10% - 280,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,63; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 0,96; железо сернокислое
закисное 7-водное - 0,18; активированный уголь - 1,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,2;
агар микробиологический - 8,0; дистиллированная вода - до 1 л.
При таком соотношении ингредиентов вырастало в среднем 100 плоско-выпуклых,
синевато-сероватых колоний диаметром 1,5 мм через 24 ч для обоих штаммов, взятых
в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в
количестве 45 колоний диаметром 1,0-1,3 мм соответственно, а на агаре Хоттингера
рост отсутствовал.
Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л:
ферментативный гидролизат из кильки, разбавленный дистиллированной водой до
показания аминного азота 0,12% - 300,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,83; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,16; железо сернокислое
закисное 7-водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,4; агар
микробиологический - 10,0; дистиллированная вода - до 1 л.
При таком соотношении ингредиентов вырастало 300 плоско-выпуклых, синеватосероватых колоний диаметром 1,0-1,5 мм через 24 ч для обоих тест-штаммов, взятых в
опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в
количестве 80 колоний диаметром 1,0-1,3 мм соответственно, а на агаре Хоттингера
рост отсутствовал.
Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л:
ферментативный гидролизат из кильки, разбавленный дистиллированной водой до
показания аминного азота 0,14% - 320,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 1,03; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,36; железо сернокислое
закисное 7-водное - 0,22; активированный уголь - 3,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,6;
агар микробиологический - 12,0; дистиллированная вода до 1 л.
При таком соотношении ингредиентов вырастало 89 плоско-выпуклых, синеватосероватых колоний диаметром 1,0-1,5 мм через 24 ч для обоих тест-штаммов, взятых в
опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в
количестве 42 колонии диаметром 1,2 мм, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.
Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной
среды на основе ферментативного гидролизата кильки (пример 2).
Формула изобретения
Питательная среда для выращивания легионелл, включающая питательную основу,
калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3водный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, агар микробиологический и
дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве основы содержит
ферментативный гидролизат кильки с добавлением в среду в качестве стимулирующей
добавки железа сернокислого закисного 7-водного при следующем соотношении
ингредиентов, г/л:
ферментативный гидролизат кильки
(0,10-0,14% аминного азота)
50
калий фосфорнокислый 1-замещенный
0,63-1,03
калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный
0,96-1,36
железо сернокислое закисное 7-водное
0,18-0,22
активированный уголь
1,0-3,0
L-цистеин гидрохлорид
0,2-0,6
Ñòð.: 6
CL
280,0-320,0
RU 2 460 774 C1
агар микробиологический
дистиллированная вода
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ñòð.: 7
8,0-12,0
до 1 л