Автореферат Рамазановой А.С. - Институт биоорганической
advertisement
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН __________________________________________________________________ На правах рукописи Рамазанова Анна Сергеевна Структурно-функциональные исследования новых токсичных белков яда гадюки Vipera nikolskii Специальность 02.00.10 – биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Отделе молекулярных основ нейросигнализации Учреждения Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН профессор, доктор химических наук, Уткин Юрий Николаевич Научный руководитель: Официальные оппоненты: профессор, доктор химических наук, Золотарев Юрий Александрович доцент, доктор биологических наук, Патрушев Лев Иванович Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки Защита состоится «12» октября 2011 г. В 11 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Автореферат разослан « » 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, Доктор физико-математических наук В.А.Олейников 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Поиск белков с новыми фармакологическими свойствами, которые могут использоваться в качестве инструментов для фундаментальных исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также служить основой для создания новых лекарственных препаратов, является актуальной проблемой современной биоорганической химии. Яды змей, представляющие собой сложные многокомпонентные белковые смеси с ярко выраженной биологической активностью, до сих пор остаются ценными источниками таких соединений. Яды змей исследуются уже давно и к настоящему моменту большинство из них достаточно хорошо изучено. Наиболее вероятно, что соединения с новыми свойствами могут быть обнаружены либо среди мало представленных в ядах соединений, либо в малоизученных или вовсе не изученных ядах. В свете этого представлялось весьма актуальным проведение исследования компонентов яда гадюки Никольского (Vipera nikolskii), обитающей в лесостепной зоне на юге России и Украины. Эта змея лишь недавно была выделена в новый вид, а ранее рассматривалась как черная (меланистическая) форма гадюки обыкновенной Vipera berus. Яд V. nikolskii совершенно не исследован и может содержать новые белки, не встречающиеся у V. berus. Следует также отметить, что в последнее время с применением методов генной инженерии идентифицировано большое количество белков, представляющих собой новые типы и подтипы рецепторов и ионных каналов. Однако их функциональная характеристика зачастую затруднена отсутствием специфических лигандов. Яды змей служили и продолжают служить источником селективных лигандов рецепторов и ионных каналов. В качестве примера можно привести –нейротоксины, сыгравшие важную роль в изучении никотиновых холинорецепторов. Тем не менее, возможности змеиных ядов как источников для выделения токсинов со специфической структурой и функцией использованы лишь в небольшой степени. Данная работа посвящена изучению яда гадюки Никольского с целью структурной характеристики новых белков, которые могут быть использованы для решения обозначенных проблем. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлись идентификация, выделение и структурно-функциональные исследования ранее неизвестных белковых токсинов, принадлежащих к разным 1 структурным семействам. В качестве объекта исследования была выбрана гадюка V. nikolskii. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи: 1. Выбрать семейства белков змеиных ядов, новые представители которых могут быть найдены у гадюк V. nikolskii и V. berus. 2. Осуществить оптимизацию условий клонирования для идентификации экспрессирующихся новых белков. 3. Провести клонирование и секвенирование кДНК, кодирующих новые белки ядов V. nikolskii и V. berus, и установить полные аминокислотные последовательности идентифицированных новых компонентов. 4. Выделить из ядов новые белки, для которых установлены аминокислотные последовательности, и исследовать их биологическую активность. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено исследование яда нового вида гадюки – гадюки Никольского. В результате идентифицирован ряд новых белков, для которых установлены аминокислотные последовательности. Эти белки принадлежат к различным структурно-функциональным семействам, включая фосфолипазы А2, протеолитические ферменты и их ингибиторы, трехпетельные токсины и др. Так, в яде V. nikolskii обнаружены две гетеродимерные фосфолипазы А2, установлены их полные аминокислотные последовательности и изучена биологическая активность. Отсутствие этих ферментов в яде гадюки обыкновенной V. berus подтверждает корректность выделения V. nikolskii в отдельный вид. Определены также аминокислотные последовательности никобина, новой тромбиноподобной сериновой протеиназы, и ингибитора протеиназ типа Кунитц. Некоторые тромбиноподобные протеиназы используются в диагностике состояния системы гомеостаза, в частности, в так называемом рептилазном тесте. Поскольку никобин отличается по последовательности от известных протеиназ, он может обладать уникальными свойствами. Впервые в яде змей подсемейства Viperinae идентифицированы белки семейства CRISP (цистеин-богатые секреторные белки), для которых установлены аминокислотные последовательности. Также впервые в подсемействе Viperinae показана экспрессия трехпетельных токсинов в ядовитой железе V. nikolskii. Эти токсины являются основными компонентами ядов змей семейства Elapidae. У всех изученных белков обнаружены уникальные замены в функционально-важных участках молекул, что может приводить к изменению специфичности воздействие на их биологические мишени. Таким образом, в практическом плане эти белки 2 могут оказаться перспективными для создания новых инструментов исследований физиологических процессов, протекающих в живых организмах, а также в качестве основы для создания новых фармацевтических препаратов. Апробация работы. Результаты работы представлялись на следующих симпозиумах и конференциях: VIII Международная конференция по физикохимической биологии, посвященная памяти академика Ю.А. Овчинникова, (Москва, 2006), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, (Новосибирск, 2008), IV Российский симпозиум “Белки и пептиды”, (Казань, 2009), 13-я Международная пущинская школаконференция молодых ученых (Пущино, 2009), второй международный симпозиум “Биофарма-2010 от науки к промышленности” (Ереван, 2010), V Российский симпозиум “Белки и пептиды”, (Петрозаводск, 2011). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего цитируемых работ. Работа изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Яды змей содержат множество полипептидных соединений, с высокой избирательностью воздействующих на различные жизненно важные процессы, происходящие в животных организмах. Идентификация и характеристика таких соединений позволяют получать новые ценные инструменты для изучения процессов жизнедеятельности. Одним из подходов к характеристике белков змеиных ядов является использование методов молекулярной биологии для установления аминокислотных последовательностей белков, экспрессирующихся в ядовитых железах змей, на основе структуры кДНК. В данной работе наряду с методами химии белка такой подход был использован для изучения яда нового вида гадюки Vipera nikolskii. В ходе работы были установлены аминокислотные последовательности и изучены свойства белков, относящихся к различным структурно-функциональным семействам, включая фосфолипазы А2 (ФЛА2), протеазы, ингибиторы ферментов и ионных каналов. 3 Выбор рациональной схемы клонирования. При выборе рациональной схемы клонирования кДНК, кодирующих разные классы белков, мы руководствовались следующими положениями: - простота используемого метода клонирования, т.е. клонирование в разрезанный Т-вектор без предварительной стадии обработки его рестриктазами и без встраивания в праймеры соответствующих сайтов рестрикции; - использование ПЦР со ступенчатым понижением температуры на стадии отжига для получения специфического продукта; - использования гнездового ПЦР (nested) для получения искомого продукта в составе продуктов ПЦР; - учет длины аминокислотной последовательности, кодируемой клонируемыми нуклеотидными последовательностями, при выборе времени элонгации. Так, например, для ФЛА2 (122 аминокислотных остатка) это время составляло 2 минуты, для трехпетельных токсинов (67 аминокислотных остатков) – 20 сек. Использованный подход позволил установить нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих белки, содержащиеся в яде в различных количествах или не обнаруженные вовсе. Так, гетеродимерные ФЛА2 составляют около 20% сухого яда по весу, а трехпетельные токсины как белки в яде гадюки пока обнаружить не удалось. Изучение гетеродимерных ФЛА2 V. nikolskii. Выделение гетеродимерных ФЛА2 из яда. Для выделения новых белков проводили разделение яда V. nikolskii методом катионнообменной ВЭЖХ (Рис.1А). Полученные в результате фракции 4 и 5 обладали фосфолипазной активностью и были названы HDP-1 (от английского названия HeteroDimeric Phospholipase – 1, гетеродимерная фосфолипаза - 1) и HDP-2, соответственно. На следующем этапе после фракционирования методом обращено-фазовой хроматографии (Рис.1Б) HDP-1 и HDP-2 были разделены каждая на две основные фракции. Определение липолитической активности показало, что более гидрофобные белки (HDP-1P и HDP-2P), элюирующиеся при более высокой концентрации ацетонитрила, обладали ферментативной активностью. Более гидрофильные белки (HDP-1I и HDP-2I) являлись ферментативно неактивными и всегда элюировались как пик с предплечьем, которое не отделялось от главного пика. Молекулярные массы белков HDP-1P и HDP-2P по данным MALDI масс-спектрометрии составили 13798±1 и 13827±1 Да, соответственно. В то время как молекулярные массы ферментативно неактивных компонентов 4 (HDP-1I и HDP-2I) совпали (очень сильный сигнал составил 13,624±1Да и небольшой сигнал 13,662±1Да.). Поэтому в дальнейшем будем называть эту Рисунок 1. Выделение гетеродимерных ФЛА2 из яда гадюки Никольского. Разделение сырого яда методом катионообменной ВЭЖХ (А) с последующим фракционированием HDP-1 и HDP-2 методом обращенно-фазной ВЭЖХ (Б). 5 субъединицу - HDP-In. Каждый из выделенных белков восстанавливали дитиоэритритом, алкилировали винилпиридином и подвергали автоматической деградации по Эдману для определения N-концевой аминокислотной последовательности. Полученные данные показали (Рис.2), что N-концевые последовательности компонентов HDP-1P и HDP-2Р ФЛА2 из гадюки Никольского гомологичны основным субъединицам гетеродимерных ФЛА2 васпина из V. aspis и вайпоксина из V.ammodites. В тоже время, N-концевая последовательность компонента HDP-In является гомологичной кислым субъединицам васпина и вайпоксина. На основании этих данных мы заключили, что белки HDP-1 и HDP-2 являются гетеродимерными фосфолипазами. Определение полных аминокислотных последовательностей гетеродимерных ФЛА2. Наиболее простым способом получения кДНК является обратная транскрипция мРНК и последующая амплификация со специфическими праймерами, структура которых выбирается на основании известных участков аминокислотной последовательности изучаемого белка, или по гомологии с ранее установленными последовательностями родственных белков. В данном случае праймеры выбирались на 5' и 3'-нетранслируемые области кДНК, кодирующие последовательности васпина и вайпоксина. Полученный в результате амплификации ПЦР-продукт включал в себя изоформы, соответствующие основным субъединицам HDP-1P и HDP-2P, а также аммодитину I1, одноцепочечной ФЛА2 из гадюки V. ammodytes. Выделить из полученных клонов тот, который бы содержал последовательность кислой субъединицы HDP-In, оказалось непросто. Из 23х изученных клонов лишь один соответствовал кислой субъединице, что для надежного установления последовательности было недостаточно. На основании различий в аминокислотных последовательностях кислой и основных субъединиц, а также аммодитина были выбраны высоко специфические праймеры, соответствующие кодирующим участкам мРНК HDP-In. С использованием этих праймеров, а также праймеров, соответствующих 5' и 3'-нетранслируемым участкам методом гнездового (nested) ПЦР был получен ампликон, в результате определения последовательности которого (без стадии клонирования) надежно установили последовательность субъединицы HDP-In (Рис. 2). Таким образом, нами были установлены аминокислотные последовательности двух гетеродимерных ФЛА2 экспрессирующихся в ядовитой железе гадюки Никольского. Присутствие двух гетеродимерных 6 ФЛА2 в яде змеи одного вида показано впервые. Идентифицированные нами ФЛА2 обладают высоким сходством с белками из яда европейских видов гадюк: васпином из V. aspis и вайпоксином из V.ammodites. ФЛА2 такого типа отсутствуют в яде гадюки обыкновенной V. berus, что подтверждает справедливость выделения гадюки Никольского в отдельный вид. 10 20 NLFQFAKMIN NLFQFAKMIN NLFQFAKMIN NLFQFAKMIN NLFQFAKMIN GKLGAFSVWN GKLGAFSVWN GKLGAFSVWN GKLGAFSVWN GKLGAFSVWN NLFQFGDMIL NLFQFGDMIL NLFQFGDMIL NLFQFGDMIL QKTGKEAVH QKTGKEAVH QKTGKEAVH QKTGKEAVH 90 30 40 50 60 70 80 YISYGCYCGW YISYGCYCGW YISYGCYCGW YISYGCYCGW YISYGCYCGW GGQGTPKDAT GGQGTPKDAT GGQGTPKDAT GGQGTPKDAT GGQGTPKDAT DRCCFVHDCC DRCCFVHDCC DRCCFVHDCC DRCCFVHDCC DRCCFVHDCC YGRVRGCNPK YGRVRGCNPK YGRVRGCNPK YGRVRGCNPK YGRVRGCNPK LAIYAYSFKK LAIYAYSFKK LAIYSYSFKK LAIYSYSFKK LAIYSYSFKN GNIVCGKNNG GNIVCGKNNG GNIVCGKNNG GNIVCGKNNG GNIVCGKNLG SYAIYGCYCGW SYAIYGCYCGW SYAIYGCYCGW SYAIYGCYCGW GGQGRAQDAT GGQGRAQDAT GGQGRAQDAT GGQGRAQDAT DRCCFAQDCC DRCCFAQDCC DRCCFAQDCC DRCCFAQDCC YGRVNDCNPK YGRVNDCNPK YGRVNDCNPK YGRVNDCNPK TATYTYSFEN TATYTYSFEN MATYTYSFEN MATYTYSFEN GDIVCGDNDL GDIVCGDNDL GDIVCGDNDL GDIVCGDNDL 100 110 120 CLRDICECDR CLRDICECDR CLRDICECDR CLRDICECDR CLRDICECDR VAANCFHQNQ VAANCFHQNK VAANCFHQNK VAANCFHQNK VAANCFHQNK NTYNKNYKFL NTYNKNYRFL NTYNKNYRFL NTYNKNYKFL NTYNKNYRFK SSSRCRQTSE SSSRCRQTSE SSSRCRQTSE SSSRCRQTSE SSSRCRQTSE QC QC QC QC QC HDP-1P HDP-2P Q8JFG0 P14420 Q10755 Васпин субъединица Вайпоксин субъединица ФЛА2-I комплекс субъединица B B В CLRAVCECDR CLRAVCECDR CLRAVCECDR CLRAVCECDR AAAICLGENV AAAICLGENV AAAICLGENV AAAICLGENV NTYDKNYEYY NTYDKNYEYY NTYDKNYEYY NTYDKNYEYY SISHCTEESE SISHCTEESE SISHCTEESE SISHCTEESE QC QC QC QC HDP-I P04084 Q8JFG1 Q10754 Вайпоксин субъединица Васпин субъединица ФЛА2-I комплекс субъединица A A А Рисунок 2. Сравнение аминокислотных последовательностей фосфолипаз А2 V. nikolskii с гомологичными белками других видов змей. Подчеркнуты последовательности, установленные методом Эдмана. Уникальные замены в HDP-1 и 2 выделены серым. Биологическая активность гетеродимерных ФЛА2. Исследование биологической активности выделенных белков показало, что основные субъединицы HDP-1P и HDP-2P обладают более высокой ферментативной активностью, чем гетеродимеры HDP-1 и HDP-2, а кислая субъединица HDP-In не активна. Было изучено влияние этих белков на процессы сворачивания крови, включая агрегацию тромбоцитов. Во всех экспериментах ферментативно активные, основные субъединицы HDP-1Р и HDP-2Р проявляли более высокую по сравнению с гетеродимерами биологическую активность. Они обладали более высокой ферментативной и антикоагулянтной активностью и более эффективно ингибировали агрегацию тромбоцитов. Кислая субъединица HDP-In обладала наименьшей 7 активностью или была не активна вовсе в этих тестах. В ряде работ было высказано предположение, что в случае вайпоксина эта субъединица при образовании гетеродимера стабилизирует основную активную субъединицу, защищая ее в частности от протеолиза. Исследование биологической активности гетеродимерных фосфолипаз показало наличие у них нейротоксической активности. Так, при изучении влияния этих белков на нервно-мышечную передачу в нервно-мышечном сочленении лягушки была выявлена картина действия типичная для так называемых пресинаптических нейротоксичных ФЛА2. При добавлении HDP-2 и HDP-2P наблюдалось постепенное уменьшение стимулированной секреции ацетилхолина, которое сопровождалось уменьшением частоты миниатюрных потенциалов концевой пластинки и появлением медленно растущих миниатюрных сигналов. Аналогичный эффект наблюдался для типичного нейротоксина кротоксина из яда Crotalus durissus, но при меньших концентрациях. Изучение тромбиноподобной сериновой протеиназы и ингибитора сериновых протеиназ типа Кунитца из гадюки Никольского. Яды змей содержат целый ряд протеолитических ферментов, воздействующих на разные стадии процесса коагуляции. Эти ферменты относятся к двум разным классам: металлопротеиназам и сериновым протеиназам (СП). Некоторые из СП, сходные по структуре с тромбином, обладают способностью сворачивать плазму крови in vitro. Такие белки, называемые тромбиноподобными ферментами (ТПФ), представлены в ядах многих змей семейств Crotalinae и Viperinae. Это хорошо согласуется с симптомами отравления ядами этих змей – образованием микроциркуляторных и макроциркуляторных тромбозов. Исследования, посвященные изучению влияния на коагуляцию компонентов ядов змей, позволили выделить и охарактеризовать большое число ТПФ, однако, полные первичные структуры определены далеко не для всех выделенных ферментов. В основном это было сделано с применением молекулярного клонирования. Однако, до сих не было установлено ни одной полной аминокислотной последовательности СП змей рода Vipera. Определение полной аминокислотной последовательности тромбиноподобного белка никобина. Для экстракции РНК были использованы ядовитые железы нескольких гадюк V. nikolskii. Для клонирования кДНК применяли метод ПЦР со ступенчатым 8 16 20+ 30 40+ 50 + 60 70 80 90+ LM_TL VIGGDECNINEHRFLVALYDGLSGTFLCGGTLINQEWVLTAQHCN----------RSLMNIYLGMHNKNVKFDDEQRRYPKKKYFFRC-N БИЛИНЕОБИН IIGGDECNINEHRFLVALYDVWSGSFLCGGTLINQEWVLTAAHCN----------MSNIYIYLGMHNQSVQFDDEERRYPKEKYLFRC-S АНКРОД VIGGDECNINEHRFLVALYDSTTRNFLCGGVLIHPEWVITAKHCN----------KKSMVLYLGKHKQSVKFDDEQERFPKEKHFIRC-N НИКОБИН VIGGDECNINEHPFLAFVTSDRRR---CAGTLINQEWVLTAAHCN----------GKYMKIELGVHDKMVRNEDKQTRVPKQK-FF-CLS ТРИПСИН IVGGYTCGANTVPYQVSLNS---GYHFCGGSLINSQWVVSAAHCYK----------SGIQVRLGEDNINVVE-GNEQFISASKSIVHPSY ТРОМБИН IVEGQDAEVGLSPWQVMLFRKSPQELLCGASLISDRWVLTAAHCLLYPPWDKNFTVDDLLVRIGKHSRTRYERKVEKISMLDKIYIHPRY 100 110 120 130 + 140 150 + 160 + 170 LM_TL -KNFTK-WDED---IRLNRPVRFSAHIEPLSLPSNPPS-----EDSVCRVMGWG-----QITSPPETLPDVPHCANINLFNYTVCRGAYP БИЛИНЕОБИН -KNFTK-WDKDIMLIRLNKPVRNSEHIAPLSLPSSPPI-----VGSVCRVMGWG-----TITSPNETLPDVPRCVNINLFNYTVCRGVFP АНКРОД -KPRTR-WGEDIMLIRLNKPVNNSEHIAPLSLPSNPPI-----VGSVCRVMGWG-----SINKYIDVLPDEPRCANINLYNYTVCRGVFP НИКОБИН SKEYTM-WDKDIMLIRLNTPVNNSTHIAPVSLASRPPV-----VGSVCRIMGWG-----TISSPKVILPDVPHCANIEIIKYSKCQGVHP ТРИПСИН NSN---TLNNDIMLIKLKSAASLNSRVASISLPTSCAS-----AGTQCLISGWG-----NTKSSGTSYPDVLKCLKAPILSDSSCKSAYP ТРОМБИН NWKE--NLDRDIALLKLKRPIELSDYIHPVCLPDKQTAAKLLHAGFKGRVTGWGNRRETWTTSVAEVQPSVLQVVNLPLVERPVCKASTR 180 190 200 210 +220 230 240 + LM_TL --RMP-T-KVLCAGVLEGGI---DTCNRDSGGPLICNGQFQ------GIVFWGPDPCAQPDKPGVYTKVFDYLDWIQSVIAGNT--TCSБИЛИНЕОБИН --RLPERSRILCAGVLEGGI---DTCKRDSGGPLICNGQFQ------GIVSWGPKRCAQPRKPALYSKVFDHLDWIQSIIAGNKTVNCPАНКРОД --RIPKKSKILCAGDLQGRL---DSCHCDSGGPLICSEEFH------GIVYRGPNPCAQPDKPALYTNIFDHLHWILSIMAGNA--TCYP НИКОБИН --ELPAKGRVVCAGIWQGGK---DSCHGDSGAPLICNGQLQ------GLLSWGGDPCAQPLQPGLYTDIFDYSDWIQSIIAGNTTATCPP ТРИПСИН ---GQITSNMFCAGYLEGGC---DSCQGDSGGPVVCSGKLQ------GIVSWGSG-CAQKNKPGVYTKVCNYVSWIKQTIASN------ТРОМБИН ---IRITDNMFCAGYKPGEGKRGDACEGDSGGPFVMKSPYNNRWYQMGIVSWGEG-CDRDGKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDRLGS----Рисунок 3. Аминокислотные последовательности ТПФ змей. Для сравнения приведены последовательности трипсина (P00760) и тромбина (P00735) крупного рогатого скота. Остатки цистеина обозначены знаком (+). Звездочками обозначены позиции S1 (D189), S2 (G216) и S3(G226) критически важные для субстратной специфичности. На примере фермента LM-TL аминокислоты каталитической триады (H57, D102, S195) выделены серым фоном, а пространственные аналоги анион-связывающего сайта и гидрофобного сайта выделены полужирным курсивом с подчеркиванием и без подчеркивания, соответственно. В последовательности никобина, выделенной полужирным шрифтом, уникальные замены подчеркнуты, а сайты N-гликозилирования выделены курсивом. Используется нумерация по химотрипсину. 9 понижением температуры на стадии отжига праймеров (“Step-down“), используя праймеры, соответствующие консервативным нетранслируемым 5’- и 3’-концевым участкам генов ТПФ других гадюк, в частности, Сerastes cerastes, V. russellii и Bitis gabonica. Полученные ПЦР продукты содержали фрагмент кДНК длиной 902 пары оснований. Всего были установлены нуклеотидные последовательности для 20 клонов. Последовательность каждого из клонов кодировала белок, состоящий из сигнального пептида длиной 18 аминокислотных остатков, пропептида – 6 аминокислотных остатков и собственно полипептидной цепи фермента равной 234 остаткам (Рис. 3). Полученная аминокислотная последовательность была использована для поиска родственных белков с применением программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Результаты поиска показали, что новый белок, идентифицированный нами и названный никобином, имеет высокую степень гомологии с другими ТПФ змей. Никобин содержит 12 остатков цистеина, которые консервативны для всех известных СП. Последовательность этого белка в 15 положениях имеет аминокислотные остатки, не встречающиеся в других СП (рис. 3, подчеркнуты). Тромбин взаимодействует с фибриногеном и другими важными субстратами посредством двух различных участков, называемых анион-связывающими экзосайтами – anion binding exosite (ABE-I и ABE-II), а также гиброфобным участком, так называемым арил-связывающим сайтом. Сайт АBE-I участвует в связывании и гидролизе природных субстратов - фибриногена, тромбиновых рецепторов (PAR-1, PAR-3 и GPIb), тромбомодулина. Сайт ABE-II связывает гликозаминогликаны, в частности, гепарин. Вместо этих сайтов в СП имеются кластеры положительно заряженных аминокислот. Для выяснения наличия и структуры таких кластеров в никобине нами построена модель его пространственной структуры (Рис. 4). Анализ полученной модели показал, что в случае никобина основными остатками, формирующими АBE-I-подобный сайт, являются Lys65, Lys73, Arg76 и Arg82. В то же время Lys96, Lys101, Lys167, Lys177 и Arg179 формируют ABE-II-подобный участок. У никобина в положениях 37-39 имеются три остатка аргинина; это – уникальный кластер, не встречающийся в других СП. Арил-связывающий сайт (Tyr98, Trp99, His172, Leu175, Val181, Leu213, Trp215) также сформирован у никобина (Рис. 4). Таким образом, на основании наличия в никобине двух сайтов связывания фибриногена можно сделать вывод, что этот фермент может взаимодействовать с фибриногеном. 10 Рисунок 4. Модель пространственной структуры никобина. Аминокислотные остатки, образующие каталитическую триаду (H57, D102, S195), подчеркнуты. Выделены аналоги экзосайтов. СП проявляют различную субстратную специфичность. Некоторые подобно тромбину гидролизуют фибриноген, являясь ТПФ. Для других субстратами служат кининоген или плазминоген. Некоторые ТПФ в отличие от тромбина отщепляют от молекулы фибриногена только один какойнибудь фибринопептид. Анализ специфичности различных СП змей позволил предположить, что определяющим фактором для отщепления обоих фибринопептидов является наличие ароматического остатка в положении 65 аминокислотной последовательности фермента. Так, если в этом положении находится остаток Tyr или Trp, отщепляются оба фибринопептида, в противном случае отщепляется фибринопептид А. В случае никобина в этом положении находится остаток лизина. Следовательно, исходя из особенностей строения и сравнения с другими СП, можно высказать предположение, что никобин способен отщеплять фибринопептид А. 11 В настоящее время СП классифицируются на три подтипа ферментов: коагуляционные, киногеназы и активаторы плазминогена. На основании данных сравнительного анализа никобин можно отнести к подтипу кининогеназ. Это заключение подтверждается данными проведенного нами филогенетического анализа, согласно которым никобин попадает в группу кининогеназ. Таким образом, впервые для рода Vipera определена полная аминокислотная последовательность ТПФ – никобина. На основании анализа установленной последовательности сделано предположение, что данный фермент будет отщеплять Аα-фибринопептид и в дальнейшем, после выделения белка, он может иметь хорошие перспективы для применения в биофармацевтике. Определение полной аминокислотной последовательности ингибитора протеиназ типа Кунитца (ИПТК) Для клонирования кДНК, кодирующих ИПТК, применяли ПЦР при постоянной температуре на стадии отжига праймеров, соответствующих консервативным нетранслируемым 5' и 3' концевым участкам генов ИПТК других змей. Для выбора праймеров были использованы последовательности ингибиторов типа Кунитца из гадюки V. ammodytes ammodytes. Полученные ПЦР продукты содержали фрагмент кДНК длиной ~ 600 п.о. Всего были установлены нуклеотидные последовательности для 10 клонов. Последовательность каждого из клонов кодировала белок, состоящий из сигнального пептида длиной 24 а.о. и, собственно, полипептидной цепи ингибитора, содержащей 71 а.о. (рис. 5). Полученная аминокислотная последовательность была использована для поиска родственных белков в базе данных UniProtKB с использованием программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Результаты поиска показали, что новый белок, идентифицированный нами, имеет высокую степень гомологии с другими ИПТК змей (рис. 4). ИПТК, экспрессирующийся в гадюке Никольского, имеет шесть консервативных остатков цистеина (рис. 4). Активный сайт ИПТК, взаимодействующий с сериновой протеиназой, сформирован довольно протяженной петлей; во взаимодействии с протеиназой непосредственно участвуют остатки Gly14–Ala18, также Gly39 и Cys40. Анализ аминокислотной последовательности ИПТК из гадюки Никольского и молекулярное моделирование его взаимодействия с трипсином и химотрипсином показали, что эффективность его взаимодействия с этими ферментами ниже, чем у других ИПТК из ядов змей. 12 1 10 20 30 40 50 60 70 (1) ------------------------- RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA-----------(2)-------------------------KNRPTFCNLLPETGRCNALIPAFYYNSHLHKCQKFNYGGCGGNANNFKTIDECQRTCAAKYG-----RSS-(3) MSSGGLLLLLGLLTLWEVLTPVSSKDRPDFCELPADTGPCRVRFPSFYYNPDEKKCLEFIYGGCEGNANNFITKEECESTCAA------------(4) MSSGGLLLLLGLLTLWAELTPVSGKKRPDFCYLPADTGPCMANFPRFYYDSASKKCKKFTYGGCHGNANNFETREECRKKCFASAARRPT-----(5) MSSGGLLLLLGLLTLWAELTPISGQDRPKFCHLPVDSGICRAHIPRFYYNPASNQCQGFIYGGCEGNANNFETRDQCRHTCGASGKEGPRPRIASN (6) LSSGGLLLLLGLLTLWAELTPVSSRDRPKFCYLPAEPGECNAYMPSFYYDSASNKCKKFIYGGCRGNANNFKTRDECHHTCVASGK-GIQPRIGSN (7) MSSGGLLLLLGLLTLWAELTPVSTRDRPKFCYLPADPGRCLAYMPSFYYDSASNKCKKFIYGGCRGNANNFKTWDECRHTCVASG---IQPRIASN (8) MSSGGLLLLLGLLTLWAELTPVSGQDHPKFCYLPADPGRCKAHIPRFYYDSASNKCNKFIYGGCPGNANNFKTWDECRQTCGASAMGRPT-----* * * * * * Рисунок 4. Сравнение последовательностей некоторых сериновых протеиназ типа Кунитца. (1) Апротинин - панкреатический ингибитор, (2) BF9 - химотрипсиновый ингибитор из Bungarus fasciatus, (3) ингибитор плазмина из Pseudonaja textilis, (4) сериновый ингибитор типа Кунитц из Bitis gabonica, (5) трипсиновый ингибитор из Daboia russellii siamensis, (6) ингибитор из гадюки Никольского, (7) химотрипсиновый и (8) трипсиновый ингибитор из Vipera ammodites. Звездочками обозначены остатки цистеина. Активный сайт Р1, P’ подчеркнут в последовательности V. nikolskii. 13 Таким образом, клонированные нами кДНК, кодируют аминокислотные последовательности новых белков СП никобина и ИПТК из гадюки V. nikolskii. На основании анализа установленных последовательностей можно сделать вывод, что свойства этих белков могут отличаться от свойств уже известных ферментов и ингибиторов. ТПФ применяются в клинической практике, в частности для диагностики нарушений коагуляции. Поскольку никобин по аминокислотной последовательности отличается от используемых ферментов, он может оказаться специфичнее, легче поддаваться контролю и оказывать меньше побочных эффектов. Изучение белков семейства CRISP (цистеин-богатых секреторных белков). Белки этого семейства были обнаружены в ядах змей сравнительно недавно (Осипов и др., 2001). Они не обладают ферментативной активностью, состоят из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 23-26 кДа и содержат 8 дисульфидных связей. Эти белки были обнаружены в ядах змей семейств Elapidae и Colubridae, а также подсемейства Crotalinae. Нами были впервые клонированы кДНК, и на их основе определены полные аминокислотные последовательности CRISP змей подсемейства Viperinae. Для выделения тотальной РНК использовались ядовитые железы гадюк V. nikolskii и V. berus. кДНК, как и ранее, амплифицировали с использованием ПЦР со ступенчатым понижением температуры на стадии отжига праймеров (Step-down PCR). Праймеры подбирали на консервативные нетранслируемые 5’и 3’- концевые участки генов CRISP других видов змей. Для получения нужного ПЦР-продукта использовали несколько комбинаций смысловых и антисмысловых праймеров (Рис. 5). Все комбинации праймеров приводили к амплификации продукта, содержащего фрагмент кДНК длинной около 1000 пар оснований. Секвенирование продуктов ПЦР позволило установить последовательности 880 и 971 нуклеотидных оснований для V. nikolskii и V. berus, соответственно. Установленные последовательности кДНК кодируют белки, состоящие из 220 аминокислотных остатков (Рис. 6). Установленные последовательности имеют наиболее высокую степень сходства с таковыми CRISP из Protobothrops jerdonii (85.5% идентичных аминокислотных остатков), абломина из A. blomhoffi (83.7%) и трифлина из Protobothrops flavoviridis (82.8%). Белки из V. nikolskii и V. berus очень похожи друг на друга. Единственное различие – наличие в белке V. nikolskii остатка Lys92 14 Рисунок 5. Анализ продуктов ПЦР, полученных при использовании различных праймеров, методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Дорожки 1, 3 и 5 - продукты ПЦР полученный из кДНК V.berus, дорожки 2 ,4 - V. nikolskii, 6 – ДНК маркеры. вместо Glu92 в V. berus. Установленные нами последовательности обнаруживают наибольшее сходство с последовательностями белков подсемейства Crotalinae. Однако, имеется несколько аминокислотных замен, которые уникальны для наших белков. Так, например остаток лизина в положении 92 имеется только в белке V. nikolskii. Другой такой заменой является остаток серина в положении 215, расположенный между двумя остатками цистеина в С-концевой части молекулы. Во всех других белках это положение занимает остаток фенилаланина. Замена фенилаланина на менее объемный остаток серина может привести к существенному увеличению подвижности в этой части молекулы и таким образом повлиять на биологическую активность белка. Проведенный филогенетический анализ показал, что CRISP гадюк наиболее близки к белкам из Евразийских змей. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что белки CRISP могут взаимодействовать с различными ионными каналами. Для нескольких таких белков пространственная структура установлена методом рентгеноструктурного анализа. На основе этих данных, а также данных молекулярного моделирования были сделаны выводы об остатках CRISP, вовлеченных во взаимодействия с ионными каналами. Таковыми оказались 15 Lys 184, Arg185, Gln198, Ser200, Gln 202, Asp204 и Arg 217. Из этих остатков в последовательностях CRISP гадюк присутствует только Gln198 (Рис. 6), что может свидетельствовать об отсутствии у найденных белков каналблокирующей активности. Однако имеющиеся у них уникальные замены (Glu/Lys92 и Ser 215) позволяют выдвинуть гипотезу о том, что эти белки обладают биологической активностью, отличной от других CRISP. Присутствие CRISP в яде гадюки V. berus было показано с использованием метода масс-спектрометрии. С этой целью яд фракционировали гельфильтрацией на колонке с Sephadex G-50 (Рис. 7). Полученные фракции затем анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле (Рис. 7). По данным электрофореза фракция IV содержит белок с массой около 25 кДа, которая близка массе 24555 Да, рассчитанной на основании установленной аминокислотной последовательности. Окрашенную полосу, соответствующую этому белку, вырезали из геля и подвергали гидролизу трипсином. Полученные в результате гидролиза пептиды анализировали методом MALDI масс-спектрометрии. Результаты анализа показали, что массы триптических пептидов соответствуют массам, рассчитанным на основании установленной аминокислотной последовательности. Около 70% всей последовательности CRISP подтверждено структурой пептидов, полученных из обнаруженного в яде белка. Таким образом, мы однозначно показали наличие в яде гадюки V. berus белка, принадлежащего семейству цистеин-богатых белков, причем это показано впервые для змей подсемейства Viperinae. Трехпетельные токсины змей подсемейства Viperinae. Трехпетельные токсины являются основными компонентами ядов змей семейства Elapidae. Экспрессия мРНК, кодирующих такие токсины, обнаружена в ядовитых железах некоторых ямкоголовых и ужеобразных змей, однако сами токсины в ядах этих змей до сих пор не идентифицированы. Также отсутствуют данные об экспрессии трехпетельных токсинов у гадюк. Нами клонированы кДНК, кодирующие трехпетельные белки в ядовитых железах гадюки Никольского и гадюки обыкновенной, и установлены их последовательности. Праймеры для проведения ПЦР были выбраны на основании литературных данных о последовательности геномной ДНК, кодирующей трехпетельные токсины у змеи Sistrurus catenatus edwardsii (Crotalinae) Для проведения ПЦР как и ранее был использован метод со ступенчатым понижение температуры на стадии отжига, поскольку ПЦР с постоянной температурой на стадии отжига 16 1.AAZ38982 P.textilis 2.Q8UW25 L.hardwickii 3.AM937249 V. nikolskii 4.AM937250 V.berus 5.Q8JI39 P.flavoviridis triflin 6.Q8JI40 A. blomhoffi ablomin 1 10 20 30 40 50 TVDFASESSNKNDYQKEIVDKHNDLRRSVKPTARNMLQMKWNSRAAQNAKRWA TVDFASESSNKKDYRREIVDKHNALRRSVKPTARNMLQMKWNSRAAQNAKRSA NVDFDSESPRKPEIQNEIIDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA NVDFDSESPRKPEIQNEIIDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA NVDFDSESPRKPEIQNEIIDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA NVDFDSESPRKPEIQNEIVDLHNSLRRSVNPTASNMLKMEWYPEAAANAERWA 60 70 80 90 100 110 120 130 1.NRCTFAHSPPYTRTVGKLRCGENIFMSSQPFAWSGVVQAWYDEVKKFVYGIGAKPPSSVTGHYTQVVWYKSHLLGCASAKCSST 2.DRCTFAHSPEHTRTVGKFRCGENIFMSSQPFAWSGVVQDWYDEIKNVVDGIGAKPPGSVIGHYTQIVWYKSHLLGCASAKCSST 3.FRCILSHSPRDSRVIGGIKCGENIYMSTSPMKWTAIIHKWHGEEKDFVYGQGASPANAVVGHYTQIVWYKSYRSGCAAAYCPSS 4.FRCILSHSPRDSRVIGGIKCGENIYMSTSPMKWTAIIHEWHGEEKDFVYGQGASPANAVVGHYTQIVWYKSYRSGCAAAYCPSS 5.YRCIESHSSRDSRVIGGIKCGENIYMATYPAKWTDIIHAWHGEYKDFKYGVGAVPSDAVIGHYTQIVWYKSYRAGCAAAYCPSS 6.YRCIEDHSSPDSRVLEGIKCGENIYMSPIPMKWTDIIHIWHDEYKNFKYGIGADPPNAVSGHFTQIVWYKSYRAGCAAAYCPSS 140 150 160 170 180 190 200 210 220 1.—-KYLYVCQYCPAGNIVGSIATPYKSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCKHNDDLSNCKTLVKKHKCQTEWIKSKCPATCFCRTEII 2.--KYLYVCQYCPAGNISSSIATPYKSGPSCGDCPSACVNGLCTNPCEYEDTFSNCKALAKKTKCKTEWIKSKCPATCFCHNKII 3.EYKYFYVCQYCPAGNMQGKTATPYTSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTHEDKFTNCKDLVKQG-CNNNYLKTNCPASCSCHNEII 4.EYKYFYVCQYCPAGNMQGKTATPYTSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTHEDKFTNCKDLVKQG-CNNNYLKTNCPASCSCHNEII 5.KYSYFYVCQYCPAGNIIGKTATPYKSGPPCGDCPSDCDNGLCTNPCTRENEFTNCDSLVQKSSCQDNYMKSKCPASCFCQNKII 6.EYSYFYVCQYCPAGNMRGKTATPYTSGPPCGDCPSACDNGLCTNPCTQEDVFTNCNSLVQQSNCQHNYIKTNCPASCFCHNEIK Рисунок 6. Аминокислотные последовательности CRISP. Последовательности белков V. berus и V. nikolskii выделены полужирным шрифтом. Уникальные аминокислотные замены подчеркнуты. Остатки цистениа выделены серым фоном. 17 Рисунок 7. Разделение яда V. berus гель-фильтрацией на Sephadex G-50 и анализ полученных фракций методом электрофореза в полиакриламидном геле (12%). Слева на электрофореграмме указаны молекулярные массы стандартных белков, сверху – номера фракций. Полоса, использованная для анализа методом MALDI массспектрометрии, отмечена стрелкой. Дорожка Nk содержит CRISP (P84805) из яда N. kaothia (мол. масса: 24953 Да). не давал результатов. С применением этого метода мы получили искомый продукт, длиной примерно 300 пар оснований. В целом для двух видов гадюк были установлены нуклеотидные последовательности 30 клонов. Все они кодировали белки, аминокислотная последовательность которых состояла из сигнального пептида - 21 аминокислотный остаток - и зрелого белка - 67 аминокислотных остатков (Рис. 8), включая 9 остатков цистеина. Для каждого вида змеи было идентифицировано 4 различных последовательности, которые представляют изофоромы трехпетельных токсинов. Три изоформы V. nikolskii совпали с таковыми из V. berus. Таким образом, всего идентифицировано 5 разных изоформ (Рис. 8). Сравнение установленных последовательностей с таковыми трехпетельных токсинов показало, что белки гадюк имеют наибольшее сходство с так называемыми необычными или слабыми токсинами, у которых дополнительная пятая дисульфидная связь расположена в первой полипептидной петле. Белки 18 гадюк также содержат остатки цистеина в гомологичных положениях первой петли. В целом, однако, число идентичных остатков в белках гадюк и трехпетельных токсинах не велико и не превышает 30%. В отличие от “классических“ трехпетельных токсинов в установленных нами последовательностях один остаток цистеина в положении 63 (Рис. 8) заменен на тирозин, вследствие чего сульфгидрильная группа другого остатка цистеина в положении 51, участвующего в образований дисульфидной связи в «классических» токсинах, остается свободной. Наличие свободной сульфгидрильной группы может приводить к образованию дисульфидных связей как между двумя трехпетельными белками, так и с другими белками. Следует отметить, что, хотя транскрипты аналогов трехпетельных токсинов на уровне мРНК находили у змей подсемейств Crotalinae и Colubrinae, сами токсины в ядах этих змей до сих пор не обнаружены. Мы впервые показали наличие мРНК трехпетельных токсинов и у змей подсемейства Viperinae, но идет ли их трансляция пока также остается невыясненным. 19 3FTx1 3FTx2 3FTx3 3FTx4 3FTx5 WTX CTX K-Bgt Erb 1 10 20 30 40 50 60 70 LTCATCSSVRCFVTPNVQCTEGSNQCF-KKWTG--SEGLLTKYERECAANCSNVTGEER-VMYCATDNCNK LTCATCSSVRCFVTPNVQCTEGSNQCF-KKWTG--SEGLLTKYERGCAANCSNVTGEER-VMYCATDNCNK LTCATCSSVRCVWTPNVQCTEGSNQCF-KKWNG--SEGLLTKYERGCAANCSNVTGQER-VMYCATDNCNK LTCASCSRRKCVWTPNVQCTEGSNQCF-KKWTG--SERLRTKYERGCAANCSNVTGEER-VMYCATDNCNK LICASCSRRKCVWTPNVQCTEGSNQCF-KKWTG--SEGLRTRYERGCAANCSTVTGEER-VMYCATDNCNK LTCLNCPEMFCG-KFQI-CRNGEKICF-KKLHQ--RRPLSWRYIRGCADTCPVGKPYE-MIECCSTDKCNR IRCFITPDITS---KD--C-PNGHVCYTKTWCDAFCSIRGKRVDLGCAATCPTVKTGV-DIQCCSTDNCNPFPTRKRP RTCLISPSSTPQT-----CPNGQDICFLKAQCDKFCSIRGPVIEQGCVATCPQFRSNYRSLLCCTTDNCNH RICFNHQSSQPQTTKT--CSPGESSCYHKQWSD----FRGTIIERGCG-—CPTVKPGIK-LSCCESEVCNN Рисунок 8. Аминокислотные последовательности предполагаемых трехпетельных токсинов из гадюк (3FTx1 - 3FTx5) и известных трехпетельных токсинов: слабого токсина WTX, альфа-кобратоксина (СТХ) каппа-бунгаротоксина (K-Bgt) и эрабутоксина (Erb). Остатки цистеина выделены серым фоном. 20 ВЫВОДЫ 1. Сочетанием методов химии белка и молекулярной биологии установлены аминокислотные последовательности ряда новых белков различных структурно-функциональных семейств из ядов гадюк V. nikolskii и V. berus. При этом белки двух классов – секретируемые белки, богатые остатками цистеина (CRISP) и трехпетельные токсины – обнаружены у змей подсемейства Viperinae впервые. Все изученные белки содержат уникальные замены в функционально-важных участках молекул. 2. Из яда гадюки Никольского выделены две гетеродимерные фосфолипазы А2, изучена их биологическая активность и установлены аминокислотные последовательности составляющих субъединиц. Впервые показано присутствие двух гетеродимерных фосфолипаз А2 в яде змеи одного вида. Отсутствие подобных белков в яде гадюки обыкновенной подтверждает на молекулярном уровне справедливость выделения гадюки Никольского в отдельный вид. 3. Установлены аминокислотные последовательности белков семейства CRISP гадюки Никольского и гадюки обыкновенной. Показано наличие такого белка в яде гадюки обыкновенной. 4. Впервые установлена полная аминокислотная последовательность сериновой протеиназы у змей рода Vipera. Данная протеиназа относится к классу тромбиноподобных ферментов и, судя по анализу аминокислотной последовательности, может представлять собой кининогеназу. 5. Впервые показано присутствие генов трехпетельных белков в подсемействе Viperinae. В отличие от большинства трехпетельных токсинов, содержащих четное число остатков цистеина, образующих внутримолекулярные дисульфидные связи, белки гадюк содержат 9 остатков цистеина, что делает возможным образование межмолекулярных дисульфидных связей. 21 Список публикаций 1. Ramazanova A.S., Zavada L.L., Starkov V.G., Kovyazina I.V., Subbotina T.F., Kostyukhina E.E., Dementieva I.N., Ovchinnikova T.V., Utkin Yu.N. (2008) Heterodimeric neurotoxic phospholipases A2 – the first proteins from venom of recently established species Vipera nikolskii: Implication of venom composition in viper systematics. Toxicon. V.51. P. 524-537. 2. Ramazanova A.S., Starkov V.G., Osipov A.V., Ziganshin R.H., Filkin S.Yu., Tsetlin V.I., Utkin Yu.N. (2009) Cysteine-rich venom proteins from the snakes of Viperinae subfamily – Molecular cloning and phylogenetic relationship. Toxicon. V. 53 P. 162-168. 3. Рамазанова А.С., Старков В.Г., Филькин С.Ю., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. (2011) Молекулярное клонирование и анализ последовательностей кДНК кодирующих сериновую протеиназу и ингибиторы типа Куниц в ядовитой железе гадюки Vipera nikolskii. Биоорганическая химия. Т. 37 С. 374-385. 4. Рамазанова А.С., Завада Л.Л., Баландин С.Б., Овчинникова Т.В., Уткин Ю.Н. (2006) Структурные исследования гетеродимерных фосфолипаз А2 из яда гадюки Vipera nikolskii. Международная конференция по физикохимимической биологии, посвященная памяти академика Ю.А. Овчинникова (VIII чтения). Москва. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 93. 5. Уткин Ю.Н., Осипов А.В., Рамазанова А.С., Старков В.Г., Филькин С.Ю. (2008) Протеомный анализ ядов змей и характеристика минорных белков. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. Тезисы. С. 283. 6. Рамазанова А.С., Осипов А.В., Старков В.Г., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. (2009) Структурные исследования новых токсичных белков из яда гадюк Vipera nikolskii и Vipera berus. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань. Тезисы. С. 132. 7. Рамазанова А.С., Осипов А.В., Старков В.Г., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. (2009) Характеристика новых белков, экспрессирующихся в ядовитых железах гадюки Никольского и гадюки обыкновенной. 13-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино. Тезисы. С 39. 22 8. Рамазанова А.С., Старков В.Г., Филькин С.Ю., Цетлин В.И.,Уткин Ю.Н. (2010) Тромбиноподобные сериновые протеиназы из ядов змей в терапии и диагностике нарушений кровообращения. 2-й Международный симпозиум “Биофарма-2010 от науки к промышленности” Ереван. Тезисы. С. 41. 9. Рамазанова А.С., Осипов А.В., Филькин С.Ю., Старков В.Г., Уткин Ю.Н. (2011) Новые гемотоксичные протеолитические ферменты из ядов змей. V Российский симпозиум «Белки и пептиды». Петрозаводск. Тезисы. С. 59. 23
