основы дифференциации ингибиторов протонной помпы

ЛІКАРСЬКІ ЗАСОБИ
УДК 615.243.4
ОСНОВЫ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ
ИНГИБИТОРОВ ПРОТОННОЙ ПОМПЫ *
George Sachs, Jai Moo Shin
Лаборатория мембранной биологии Калифорнийского университета в Лос/Анджелесе,
Калифорния (США)
период внедрения в клиническую практику инги
биторов протонной помпы (ИПП) выявлено, что
для их активации необходима соляная кислота. Во
время ее секреции препараты накапливаются в за
кисленном пространстве париетальных клеток бла
годаря протонированию атома азота пиридина, а да
лее в результате протонирования атома азота бензи
мидазола происходят их активация и последующее
ковалентное связывание с протонной помпой за счет
образования дисульфидных связей с цистеинами
белков [1]. Сначала считали, что препараты должны
постоянно ингибировать секрецию кислоты, однако
фактически через определенный промежуток време
ни она восстанавливалась. Это объясняли синтезом
новых протонных помп. В то же время не были ис
следованы стабильность ковалентных дисульфидных
связей и вариабельность возможности разрыва раз
ных дисульфидных связей в протонном насосе.
Итак, ИПП накапливаются и активируются в парие
тальных клетках желудка. При этом образуется новое
соединение, которое, связываясь с Н+/К+АТФазой,
ингибирует секрецию соляной кислоты. Особый ин
терес вызывает наличие двух мест связывания —
цистеин в 813м положении (с которым связываются
все ИПП) и цистеин в 822м положении, который
доступен только пантопразолу. В отличие от связи с
цистеином в 822м положении, связь с цистеином в
813м положении биологически менее стабильна,
что обусловлено трехмерной структурой протонной
помпы. В период разработки разных препаратов
ИПП этот факт еще был не известен.
Исследования механизмов восстановления секре
ции кислоты продолжались в течение нескольких лет.
Сначала рассматривали только механизмы синтеза
белков новых протонных помп (насосов). В настоящее
время проводят прямые исследования возможности
диссоциации комплекса ИПП — протонная помпа.
В
Восстановление секреции соляной кислоты
Чем продолжительней действие ИПП, тем, вероятно,
выше его терапевтическая эффективность. Если обра
зовавшаяся дисульфидная связь стабильна, то секре
ция кислоты может восстанавливаться только в ре
зультате синтеза белков протонных помп de novo. Пос
кольку полужизнь протонного насоса длится примерно
54 часа, то полупериод восстановления секреции кис
лоты должен быть такой же продолжительности [2].
* Реферат статті: The basis of differentiation of PPIs // Drugs of
Today.— 2004.— 40, suppl. A.— P. 9—14.
66
В опытах на крысах показано, что длительность по
лужизни протонной помпы составляет 54 часа, пери
од полувосстановления активности К+стимулируе
мой АТФазы после 7 сут введения омепразола —
15 часов, а период полувосстановления секреции
соляной кислоты после 7 сут введения омепразола —
20 часов [2]. В исследованиях на добровольцах по
казано, что после приема омепразола, эзомепра
зола и других ИПП секреция соляной кислоты вос
станавливается за период менее 28 часов [3]. При
этом после приема пантопразола период восстанов
ления секреции соляной кислоты составляет 46 часов.
Эти данные дают основание полагать, что в восстанов
лении секреции кислоты определенную роль может
играть уменьшение количества дисульфидных связей
в результате их реакции с глутатионом [4—6].
Когда были получены данные о том, что омепразол
и эзомепразол связываются с цистеинами в 813м и
892м положениях, а пантопразол с цистеинами — в
813м и 822м, точная структура протонной помпы
еще была не известна, также как и роль цистеина в
822м положении в восстановлении секреции кисло
ты [7—9]. К настоящему времени удалось устано
вить, что цистеины в 813м и 822м положениях (но
не в 892м) располагаются на пути транспорта про
тонов, причем цистеин в 822м положении локализо
ван значительно глубже в мембране, чем цистеин в
813м (рис. 1). Глутатион может взаимодействовать
с цистеином в 813м положении, что приводит к раз
рыву дисульфидной связи с ИПП в этом месте, но он
не достигает цистеина в 822м положении, обуслов
ливая стабильность связи пантопразола с этим цис
теином.
Опыты ex vivo
Для подтверждения гипотезы о том, что различная
длительность восстановления секреции соляной
кислоты после приема ИПП обусловлена разной ско
ростью восстановления этих цистеинов, были прове
дены опыты на крысах, которым вводили разные
ИПП, после чего выделяли протонные помпы и инку
бировали их с глутатионом. После инкубации с глута
тионом в течение 60 мин активность ингибированной
омепразолом протонной помпы восстанавливалась
примерно в 90% случаев. В то же время активность
протонной помпы, ингибированной пантопразолом,
при инкубации с глутатионом не изменилась [6]
(рис. 2).
Ингибированные АТФазы были выделены у крыс,
которым вводили эти препараты. Восстановление
Сучасна гастроентерологія, № 5 (43), 2008 р.
ЛІКАРСЬКІ ЗАСОБИ
Химия ИПП
Рис. 1. Места связывания омепразола и
пантопразола на модели Н+/К+"АТФазы
париетальной клетки желудка:
1 — просвет желудка; 2 — протонная помпа; 3 —
стенка париетальной клетки; 4 — париетальная
клетка. Видно, что цистеин в 822м положении
локализован глубже в мембранном домене, чем
цистеин в 813м, который находится в просвете
входа в канал протонной помпы
АТФазной активности определяли в разные сроки
инкубации с глутатионом (10 ммоль/л).
Опыты с ингибиторами протонной помпы,
меченными радиоактивными нуклидами
Длительность связывания омепразола и пантопра
зола с протонной помпой определяли в опытах на
крысах. Животным со стимулированной секрецией
соляной кислоты внутривенно вводили 14Сомеп
разол или 14Спантопразол в дозах из расчета
20 мкмоль/кг. Для определения времени полувыве
дения препаратов из желудка животных забивали в
разные сроки после введения препаратов, выделяли
и очищали фракцию протонных насосов и определя
ли радиоактивность. Кроме того, определяли влия
ние глутатиона на задержку радиоактивности в белке
изолированного протонного насоса.
В этих опытах показано, что из всех белков желуд
ка ИПП связываются только с каталитической субъ
единицей Н+/К+АТФазы. Это обусловлено вторым
протонированием этих препаратов и кислотностью в
активных секреторных канальцах париетальных кле
ток, уровень которой должен быть достаточно высо
ким, чтобы произошло протонирование бензимида
зольного кольца ИПП. Поскольку пантопразол имеет
на бензимидазольном кольце акцептирующую элект
роны дифторметокси группу, а омепразол — метокси
группу, которая играет роль донатора электронов,
значение рКа азота бензимидазола у пантопразола
меньше, чем у омепразола. Протонирование бензи
мидазола повышает электрофильность 2С компо
нента бензимидазола, который далее взаимодей
ствует с непротонированным азотом пиридина. Пос
ледними исследованиями химии ИПП был подтвер
жден этот механизм [11].
Таким образом, протонированный пантопразол бо
лее стабилен, что дает ему возможность достичь
цистеина в 822м положении и связаться с ним, тогда
как протонированный омепразол быстро связывается
с цистеином в 813м положении, что предотвращает
его последующую реакцию с цистеином в 822м по
ложении [7].
Длительность существования комплекса
ИПП — протонная помпа
Было показано, что комплекс пантопразол — про
тонная помпа сохраняется примерно в 2 раза дольше,
чем комплекс омепразол — протонная помпа. Кроме
того, при инкубации с глутатионом сохраняется около
40% связанного пантопразола и только 15% связанно
го омепразола (рис. 3). Животным вводили меченые
ИПП, после чего выделяли фермент. Разрыв специфи
ческой связи омепразола или пантопразола определя
ли в разные сроки инкубации с глутатионом.
Это можно объяснить тем, что глутатион расщеп
ляет комплексы омепразола и пантопразола с цисте
ином в 813м положении и не расщепляет комплек
сы пантопразола с цистеином в 822м. В результате
этого при инкубации с глутатионом удаляется
бoльшая часть меченого омепразола, о чем свиде
тельствует полученное в опытах ex vivo восстановле
ние на 88% АТФазной активности. В то же время
благодаря связыванию пантопразола с цистеином в
822м положении удаляется только около половины
Восстановление активности
ингибированной омепразолом
протонной помпы на 88%.
Восстановление активности
ингибированной пантопразолом
протонной помпы не отмечено
Рис. 2. Восстановление глутатионом активности ингибированных омепразолом и пантопразолом
протонных помп
Сучасна гастроентерологія, № 5 (43), 2008 р.
67
ЛІКАРСЬКІ ЗАСОБИ
~40% связанного
пантопразола стабильно к
действию глютатиона.
~15% связанного
омепразола стабильно
к действию глутатиона
Рис. 3. Влияние глутатиона на связывание омепразола и пантопразола in vivo
меченого препарата, что обусловливает длительное
ингибирование протонной помпы [10].
Данные исследований на людях
Исследования различий действия ИПП проведены
также и на людях. На 36 здоровых добровольцах оп
ределяли скорость ингибирования и восстановления
секреции соляной кислоты после приема внутрь
20 мг омепразола и 40 мг пантопразола на фоне сти
муляции желудочной секреции однократной дозой
пентагастрина [12]. Секреция кислоты восстанови
лась на 50% через 5 часов после приема омепразола
и через 12 часов после приема пантопразола.
В другом исследовании было показано, что секре
ция кислоты восстанавливается на 50% через 24 часа
после приема омепразола или эзомепразола. Пос
кольку глутатион не может разорвать связь пантопра
зола с цистеином в 822м положении, восстановление
секреции кислоты может происходить только в резуль
тате синтеза белков протонной помпы de novo. Вот по
чему после приема пантопразола для восстановления
секреции кислоты на 50% требуется 46 часов [3].
Более длительное действие препарата способствует
стабильному подавлению секреции кислоты в течение
ночи. Это было показано при анализе данных 6 иссле
дований, проведенных на 2442 больных ГЭРБ, у кото
рых оценивали частоту возникновения ночных изжог.
Больные принимали омепразол, эзомепразол или
пантопразол в дозе 40 мг раз в 1 сут, а низатидин
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Sachs G., Shin J.M., Briving C. et al. The pharmacology of
the gastric acid pump: The H+,K+ATPase // Ann. Rev. Pharma
Toxic.— 1995.— 35.— P. 277—305.
2. GeddeK., Scott D., Besancon M. et al. Turnover of the
gastric H+,K+adenosine triphosphatase subunit and its effect on
inhibition of the rat gastric acid secretion // Gastroenterology.—
1995.— 109.— P. 1134—1141.
3. Katashima M., Yamamoto K., Tokuma Y. et al.
Comparative pharmacokinetic/pharmacodynamic analysis of
proton pupm inhibitors omeprazole, lansoprazole and pantopra
zole, in humans // Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet.—
1998.— 23.— P. 19—26.
4. Im W.B., Blakeman D.P., Sachs G. Reversal of antisecre
tory activity of omeprazol by sulfhydryl compounds in isolated
rabbit gastric glands // Biochim. Biophys. Acta.— 1985.—
845.— P. 54—59.
5. Fujisaki H., Shibata H., Oketani K. et al. Inhibitions of acid
secretion by E3810 and omeprazol, and their reversal by glu
tathione // Biochem Pharmacol.— 1991.— 42.— P. 321—328.
68
(блокатор Н2рецепторов) — по 150 мг 2 раза в 1 сут.
Оценивали полное прекращение ночных изжог в тече
ние периода лечения. В целом при лечении низатиди
ном и обоими омепразолами получены удовлетвори
тельные результаты. Однако эффективность пантоп
разола была выше этих препаратов, что связано с бо
лее длительным угнетением секреции кислоты ночью.
Заключение
Восстановление секреции кислоты после блокады
протонной помпы омепразолом частично происхо
дит в результате разрыва его связи с цистеином в
813м положении. Для восстановления секреции
кислоты после приема пантопразола требуется зна
чительно больше времени, что, вероятно, обуслов
лено синтезом белков протонной помпы de novo,
поскольку связь пантопразола с цистеином в 822м
положении не может быть разорвана под влиянием
глутатиона. В опытах на крысах показано, что связь
пантопразола с протонной помпой сохранялась в
2 раза дольше, чем с омепразолом. Данные послед
них исследований на людях дают основание пола
гать, что различия между длительностью действия
разных ИПП имеют клиническое значение, поскольку
более продолжительное существование комплекса
ИПП — протонная помпа приводит к более стабиль
ному подавлению секреции кислоты, что, в свою
очередь, более эффективно уменьшает количество
случаев возникновения изжоги в ночные часы.
6. Shin J.M., Sachs G. Restoration of acid secretion following
treatment with proton pump inhibitors // Gastroenterology.—
2002.— 123.— P. 1588—1597.
7. Besancon M., Simon A., Sachs G., Shin J.M. Sites of reac
tion of the gastric H+,K+ATPase with extracytoplasmic thiol
reagents // J. Biol. Chem.— 1997.— 272.— P. 22438—22446.
8. Besancon M.L., Mercier F., Shin J.M. et al. Membrane topo
logy and omeprazole labeling of the gastric H+,K+ATPase adeno
sinetriphosphatase // Biochemistry.— 1993.— 32.— P. 2345—2355.
9. Shin J.M., Besancon M.L., Simon A., Sachs G. The site of
action of pantoptazole in the gastric H+,K+ATPase // Biochim.
Biophys. Acta.— 1993.— 1148.— P. 223—33.
10. Shin J.M., Sachs G. Dwell time of proton pump inhibitors
on the gastric H,KATPase in vivo. Gastroenterology (submitted).
11. Shin J.M., Cho Y.M., Shachs G. Chemistry of covalent inhi
bition of the gastric H+,K+ATPase by proton pump inhibitors //
J. Am. Chem. Soc. (submitted).
12. Pratha V.S., Karlstadt R.G., Lynn R.B. et al. Pantoprazole
affords longterm inhibition of pentagastricstimulated gastric
acid secretion in healthy subjects // Am. J. Gastroenterol.—
2002.— 97 (suppl. O).— P. S49.
Сучасна гастроентерологія, № 5 (43), 2008 р.
ЛІКАРСЬКІ ЗАСОБИ
ОСНОВИ ДИФЕРЕНЦІАЦІЇ ІНГІБІТОРІВ ПРОТОННОЇ ПОМПИ
George Sachs, Jai Moo Shin
На початкових етапах використання інгібіторів протонної помпи вважалося, що ці з’єднання стабільно пригні
чують секрецію кислоти в шлунку. Однак для підтвердження інформації про відновлення секреції соляної кис
лоти після застосування цих препаратів потрібні були додаткові дослідження механізму цього явища. У дослі
дах із пантопразолом тривалість відновлення секреції кислоти була набагато більшою, ніж в омепразолу, і
відповідала обміну білків протонної помпи. Ці дані стали основою для припущення про різні місця зв’язування
різних інгібіторів протонної помпи, чим можна пояснити різну тривалість відновлення кислотної секреції і ме
ханізм їхньої дії. При зв’язуванні омепразолу з цистеїнами у 813му і 892му положеннях пригнічення протон
ної помпи відбувається за рахунок зв’язування з цистеїном у 813му положенні. Пантопразол, крім зв’язу
вання з цистеїном у 813му положенні, додатково зв’язується з цистеїном у 822му положенні. Обидва місця
знаходяться на шляху транспорту протонів, однак цистеїн у 822му положенні розташовується глибше в до
мені мембрани, ніж цистеїн у 813му положенні. Дослідами in vitro і in vivo показано, що відновлювач глутатіон
значно більшою мірою послаблює пригнічення секреції кислоти омепразолом, ніж пантопразолом, імовірно,
тому, що глутатіон не може досягти цистеїну в 822му положенні.
Таким чином, якщо зв’язок омепразолу з протонною помпою можна досить легко розірвати, то секреція кис
лоти після вживання пантопразолу відновлюється тільки внаслідок синтезу протонного насоса de novo. Клі
нічно це виражається тривалішою дією, що є терапевтичною перевагою препарату. Це було підтверджено під
час порівняння пантопразолу з обома омепразолами, що показало більш виражене зменшення кількості ви
падків нічної печії у хворих з гастроезофагеальною рефлюксною хворобою.
THE BASIS OF DIFFERENTIATION OF PPIS
George Sachs, Jai Moo Shin
Proton pump inhibitors (PPIs) were initially believed to block acid secretion permanently. Evidence that acid secre
tion returned after administration of the compounds led to investigations of the mechanism of this phenomenon.
Data showing that, after omeprazole administration, acid secretion returned in less time than the halflife of the
pump suggested that more than only new pump synthesis may play a role in acid recovery. In contrast, experiments
with pantoprazole revealed a much longer time to the return of acid secretion than that seen with omeprazole, simi
lar to that predicted from dependence on pump protein turnover. These data suggested that differences in the bind
ing sites of the agents could explain differences in the time to acid return and shed light on the mechanisms. While
omeprazole binds at cysteines 813 and 892, only cysteine 813 is involved in its inhibitory activity. Pantoprazole also
binds at cysteine 813, but additionally at cysteine 822. Both of these sites are located in the proton transport path
way, though cysteine 822 is found deeper in the membrane domain than cysteine 813. Experiments in vitro and in
vivo have shown that the reducing agent glutathione reverses the acidinhibitory activity of omeprazole to a much
greater degree than the activity of pantoprazole, most likely because glutathione cannot access cysteine 822. Thus,
while the omeprazolepump binding can be more easily reversed, pantoprazoleinduced acid inhibition is overcome
only by de novo pump synthesis. Clinically, this may lead to a longer duration of action and therapeutic advantages
for pantoprazole. This has also been demonstrated in an analysis comparing pantoprazole to both omeprazoles,
with pantoprazole showing superior relief of nighttime heartburn in patients with GERD.
Сучасна гастроентерологія, № 5 (43), 2008 р.
69