Институт биохимии и биотехнологии Серги Дурмиши Институт
advertisement
ANNALS OF AGRARIAN SCIENCE, vol. 10, no. 2, 2012 ИЗВЕСТИЯ АГРАРНОЙ НАУКИ, Том 10, Ном. 2, 2012 АГРОНОМИЯ И АГРОЭКОЛОГИЯ МОНООКСИГЕНАЗНЫЕ И ПЕРОКСИДАЗНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТЕКОВ М.Ш. Myasoedova Дурмишидзе Институт биохимии и биотехнологии Серги Дурмиши дзе Грузинского аграрного университета Аллея Давида Агмашенебели, 13 км. Тбилиси, 0131, Грузия; marlen_gordeziani@yahoo.com Поступила в редакцию: 02.03.12; одобрена к печати: 09.04.12 Рассмотрены сходства и различия механизмов окисления ксенобиотиков, катализируемых монооксигеназами и пероксидазами растительной клетки. Показано, что в отличие от животного, растительный цитохром P450 способен заменять монооксигеназный механизм окисления на пероксидазный, и это происходит путем его конверсии в цитохром P420. На основе экспериментальных данных установлен механизм трансформации цитохрома P450 и определена биологическая суть подобной химической модификации. В состав эндоплазматических клеточных мембран млекопитающих и растительных организмов входят ферментные системы, участвующие в метаболизме многочисленных и разнообразных по химической структуре эндогенных и экзогенных соединений, в том числе лекарственных препаратов, стероидов, простагландинов, канцерогенов и др. [1, 2]. Главной особенностью этих ферментов является способность внедрения одного атома молекулярного (атмосферного) кислорода в окисляемый субстрат и восстановления второго атома двумя электронами до образования воды. Таким образом, они выявляют одновременно монооксигеназные и оксидазные свойства и именно поэтому называются оксидазами со смешанной функцией. Особо важным представителем данного класса ферментов является цитохром P450, участвующий в превращении (детоксикации) многих токсических агентов (ксенобиотиков). Следует отметить, что этот процесс сопровождается метаболической активацией субстрата, вследствие чего образуются слишком реакционноспособные свободные радикалы, алкилированные или арильные интермедиаты, в дальнейшем “атакующие” на макромолекулы и инициирующие токсические процессы [3]. Цитохром P450 содержащие монооксигеназы катализируют многочисленные реакции: эпоксидирование, N-деалкилирование, O-деалкилирование, S-окисление, N-окисление и гидроксилирование алифатических и ароматических субстратов. Многообразие этих реакций обусловлено тем, что во всех случаях начальным этапом процесса является внедрение гидроксильной группы в молекулу субстрата, вследствие чего происходит повышение реакционной способности молекулы. Обобщенное уравнение этого превращения имеет следующий вид: RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1) Где RH – окисляемый субстрат и NADPH + H+ – восстановленный никотинамидный кофермент. Как очевидно, в реакции участвуют молекулярный кислород и NADPH. В случае их отсутствия цитохром P450 имеет способность пероксидзависимого гидроксилирования. Подобно этому ферменту, пероксидазы катализируют аналогичные реакции, в частности хлорпероксидаза (CPO) и пероксидаза хрена (HRP). Изучены кинетические и химические механизмы реакции деалкилирования, катализируемые цитохромом P450, в присутствии NADPH и O2, также сравнены они с реакциями, катализируемыми пероксидазами. Выявлены между ними и сходства и разности. Например, при использовании внутримолекулярного изотопа, показана разность механизмов N-деметилирования ксенобиотика цитохромом P450 и пероксидазой. Обычно большинство гемопротеинов, катализируя подобные реакции удаляют α-углеродный атом, в то время как цитохром P450 и CPO предпочитают одноэлектронное окисление, чему и следует депротонирование α-углеродного атома [4]. Из-за идентичности простетических групп цитохрома P450, CPO и HRP, считается, что разность в каталитических механизмах обусловлена своеобразностью той среды, которую создают протеины вокруг активного центра гема. Выдвинуто соображение, что в цитохроме P450 и CPO решающую роль может выполнить половина аксиального тиолата гемового железа. Тот факт, что цитохром P450 в вышеперечисленных реакциях может использовать пероксиды, гидропероксиды или перкислоты, наводит на мысль, что между цитохромом P450 и пероксидами существует тесная взаимосвязь [5-7]. Дело в том, что в монооксигеназном каталитическом цикле присоединение электрона, молекулы кислорода, второго электрона и двух протонов фактически является эквивалентным добавлению пероксида водорода (H2O2). Путь замещения NADPH и O2 пероксисоединением можно рассматривать как перокси-шунт. Таким образом, реакции оксигенирования с участием цитохрома P450 и управляемые пероксисоединениями и молекулярным кислородом, характеризуются общими особенностями. В реакциях, катализируемых пероксидами, роль электронного акцептора играют: пероксид водорода, алкилгидропероксиды или ацилгидропероксиды. ROOH + AH2 → ROH + A + H2O (2) Функция пероксидазы выражается в окислении определенного субстрата и в восстановлении гидропероксида. Последовательность этих реакций можно записать уравнениями: Пероксидаза + ROOH → Соединение – I + ROH (3) Соединение I + AH2 → ROH + A + H2O (4) Соединение II + AH2 → Пероксидаза + AH· (5) AH· → Нерадикальные продукты В реакциях ROOH – гидропероксид, AH-восстановленный субстрат и AH· – свободный радикал. Генерирование свободных радикалов многими органическими молекулами – явление вполне ожидаемое и возможное. Для каждого субстрата дальнейшая судьба радикалов строго определена. Некоторые субстраты способны восстановить соединение I до состояния нативного фермента без формирования соединения II [8, 9]. В случай HRP соединение I более стабильное, формирование его сопровождается высвобождением алкоголя (ROH) из гидропероксида. Изучен процесс высвобождения 18O кислорода из H2O2 и перкислот, катализируемый CPOом. Из полученных данных следует, что соединение I содержит один атом кислорода взятый из пероксисубстрата. Среди пероксидаз, CPO – катализируемые реакции своей разнообразностью уникальны. В присутствии галоген-анионов ( CI-, Br-, или I-, но не F-. Эти анионы отмечены в виде Х- в уравнении 7) обеспечивается формирование углеродгалогенной связи, подобно другим протогемным пероксидазам. Наподобие каталазы CPO катализирует пероксид-зависимое окисление множества разных субстратов (8) и реакцию разложения H2O2 с образованием O2 (9). Хотя, в отличие от каталазы, CPO способен разлагать алкилгидропероксиды и перкислоты с образованием O2. AH + X- + H2O2 + H+ → AX- + 2H2O (7) BH2 + H2O2 → B + 2H2O (8) 2H2O2 → 2H2O + O2 (9) Окружающие среды активного центра гема CPO и цитохрома P450, выделенного из клеток бактериальных и млекопитающих организмов, сходны. Оба фермента в комплексе с CO выявляют максимум спектрального поглощения на 443 нм. Применение спектроскопического метода Мессбауера, ЭПР-спектроскопии и метода X – лучевой абсорбции выявляет сходство окружности их активного центра [4], кроме того показано, что пятым аксиальным лигандом, связанным с гемовым железом, является тиолат, представленный в виде цистеинного остатка протеина. Сходство физико-химических свойств этих двух ферментов дает возможность допускать сходство механизмов протекания реакций характеризующих эти ферменты [10]. Для иллюстрации можно рассматривать реакции N-деметилирования и их механизмы (для сравнения вышеуказанных двух ферментов данную реакцию можно считать классической). CPO осуществляет пероксидзависимое деалкилирование диметиланилина (DMA) аналогичным механизмом, как и цитохром P450, выделенный из микросом печени кролика, ведет процесс пероксидзависимого деметилирования DMA и бензфентамина [11]. Для CPO и цитохрома P450 реакцию можно записывать следующим образом: ROOH + R′R′′–N–CH3 → R–OH + R′R′′–NH + HCHO (10) Где ROOH – пероксид, а R′R′′-N-CH3 – метилариламинный субстрат. Стехиометрическое соотношение образования формальдегида из DMA и N – монометиланилина составляет 1:1. Число оборотов этил-пероксид (EtOOH)зависимого процесса деалкилирования DMA, катализируемого ферментом CPO – 1470, и это гораздо больше, чем такой же процесс, катализируемый цитохромом P450, число оборотов которого составляет 20-30. Реакция подчиняется уравнению Михаелиса-Ментена. Разные пероксидазы, гидропероксидазы и перкислоты способны проводить процессы деметилирования, и начальная скорость зависит от оксиданта. CPO способен окислять ариламиновые субстраты, и число оборотов зависит от природы субстрата. Неспецифические ингибиторы цитохрома P450, такие как азид и nпропилгалат, подавляют деметилирование, в то время как специфические ингибиторы (SKF-525A и метирапон) не проявляют ингибирующего воздействия на реакцию. Агент – “Ловушка” супероксид-радикалов – тайрон и DL-эпинефрон явно тормозят деметилирование, а супероксиддисмутаза не дает значительного эффекта. Другие спин-ловушки – α-фенил-t-бутилнитрон и 5.5-диметилпиролин-N-оксид не вызывают значительного подавления деметилирования. Можно подумать, что в процессе N-деметилирования свободные радикалы не имеют первостепенного значения. Дифенилфуран и DL-гистидин, реагируя с синглетным кислородом, не ингибируют реакцию. Изучение реакций деметилирования, катализируемых ферментом CPO, дает основание развитию гипотезы, согласно которой структурные сходства активных центров CPO и цитохрома P450 определяют сходство их каталитической функции. Именно поэтому стало актуальным изучение реакций N-деметилирования, катализируемых ферментами, не имеющими сходное к цитохрому P450 окружение активного центра. Оказалось, что активность изозимов HRP – A и B-C значительно выше, чем активность цитохрома P450 печени в NADPH- и O2-зависимых реакциях. HRP катализирует пероксидзависимое окисление множества органических субстратов (2). Также как и в случае CPO, на первой стадии образования соединения I, катализируемого ферментом HRP, вместе с ферментом участвует Fe3+-форма фермента. При EtOOH – зависимом N-деметилировании DMA, катализируемого ферментом HRP, происходит: употребление гидропероксида, выделение формальдегида и формирование N-метиланилина в стехиометрическом соотношении 1:1:1 [12]. Реакции N-деметилирования, катализируемые ферментом HRP, протекают в присутствии множества оксидантов (пероксидов, гидропероксидов, надкислот). Число оборотов реакции абсолютно зависит от них. CPO пероксидаза употребляет хлорит натрия для осуществления хлорировании и пероксидации, HRP катализирует хлоритзависимое хлорирование DMA [12, 13]. В оптимальных условиях для пероксидзависимой реакции деметилирования DMA, осуществляемой B-C изозимами HRP, число оборотов реакции составляет 7060. Такая скорость по сравнению со скоростью, характерной для CPO, является довольно высокой. HRP участвует в каталитическом деметилировании множества вторичных и третичных N-метилариламинов. Эти реакции подчиняются уравнению МихаелисаМентена (для DMA Km = 0.34 mM, для H2O2 Km = 0.16 mM, для EtOOH Km = 0.020 mM). В том случае, если активные формы кислорода, генерирующие на ферменте HRP, являются интермедиатами реакции деметилирования, тогда реагенты, реагирующие с такими интермедиатами, должны вызывать явное ингибирование процесса деметилирования. Тайрон и супероксиддисмутаза, которые обычно взаимодействуют с супероксидами, не воздействуют на эту реакцию. Также не воздействуют на реакцию деметилирования, катализируемую ферментом HRP, и другие погашающие синглетного кислорода агенты – метионин, дифенилфуран, азид и гистидин. Так как вышеуказанные агенты не вызывают угнетения реакции деметилирования, можно прийти к заключению, что синглетный кислород не является интермедиатом этой реакции. “Уборщиками” гидроксильного радикала применяются тиомочевина, манитол, бензоат, этанол, диметилсульфоксид и аскорбат. Последний из них сильно ингибирует деметилирование, катализируемое ферментом HRP. Так как аскорбат является субстратом HRP, можно считать, что этот агент больше конкурирует с DMA для присоединения к активному центру фермента, чем стремится играть роль ловушки для гидроксильных радикалов. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что формирование свободных радикалов не должно играть важную роль в процессе деметилирования, так как они в процессе удаляются от фермента. Более того, генерированные от субстрата свободные радикалы в реакции не формируются в виде интермедиатов. Одним из предполагаемых механизмов деметилирования DMA считается начальное окисление аминного азота и образование N-оксида. В результате этой ферментной реакции образуется неустойчивый в водном растворе карбиноламин, который в дальнейшем разлагается на формальдегид и аминопродукт. В микросомальном препарате печени N-деметилирование DMA сопровождается процессом N-окисления. В результате этой реакции в виде интермедиата образуется третичный амин- N-оксид. Существуют различные экспериментальные данные и соответственно различные взгляды насчет того, является ли N-оксид обязательным интермедиатом N-деметилирования. С этой целью были изучены способности четырех очищенных изоферментов цитохрома P450 печени кролика и крысы, также CPO и HRP на метаболическое образование N-оксида [10,12]. Выяснилось, что из реконструированных систем четырех изоферментов цитохрома P450 ни один не детектирует образование регистрирующего количества N-оксида из DMA. При этом все четыре изофермента выявляют высокое число оборотов. Эти данные указывают на то, что N-оксид не является интермедиатом N-деметилирования, так как микросомальная N-оксидазная активность не ассоцирована с цитохромами. В стандартных условиях из DMA не образуется формальдегид в случай CPO и HRP, так как не образуется N-оксид. Гуенгерич [14] достоверно показал, что решающей ступенью этой реакции является начальное оксигенирование αуглеродатома, чему следует формирование в качестве интермедиата карбиноламина а не N-оксида. Исходя из того, что N-деметилирование должно начаться разрывом C-H связи, возникла необходимость изучить изменения кинетических данных этой реакции. С этой целью водород в группе N-метила был замещен на дейтерий. Таким подходом поставленные эксперименты накопили значительную информацию не только о механизме всей реакции, но и о кинетических деталях. В реакциях деметилирования N-метил-N-тридейтериометиланилина, проведенных микросомальным цитохромом P450 печени крысы, CPO , HRP и некоторые другими гемопротеинами, были определены внутримолекулярные изотопные эффекты (KH/KD) [15, 16]. Оказалось, что в случае HRP, гемоглобина, миоглобина и лактопероксидазы, изотопные эффекты высокие (KH/KD>8.5), а в случае цитохрома P450 и CPO низкие (KH/KD<31). Высокие изотопные эффекты, вероятно, объясняются радикальным механизмом расщепления C-H связи и рекомбинацией гидроксильного радикала. Такое заключение можно сделать в соответствии с высокими изотопными эффектами (7.7-9.2), регистрируемыми в процессе удаления атома водорода при ω- гидроксилировании октана катализируемой цитохромом P450 [17]. Таким образом, представленные гемопротейны N-деметилирование DMA осуществляют путем отщепления водородного атома от α-углеродатома. Возможно, что α-углеродатом депротонируется и образуется анилин-радикал. Такое заключение соответствует низким изотопным эффектам, которые ассоциируются с депротонированием амин-катион-радикалов α-углеродатомом. Гуенгерич [18] выявил низкий дейтерий и тритий изотопный эффект (~2) при метаболизме нифедипина, катализируемого цитохромом P450, и это он объяснил с точки зрения переноса электрон/протон/электрон, а не отщеплением водорода. Существует вероятность наличия нескольких возможных вариантов механизма N-деметилирования N1 N-диметиламина. Один из них подразумевает перенос одного электрона из амина на железо-оксоформы, в результате чего формируется амин-катион-радикал. В дальнейшем этот радикал депротонируется (H+) и образуется в виде нейтрального карбоцентрического радикала, который путем рекомбинации с гидроксил-радикалом (+OH-) превращается в карбиноламин. Этот последний уже нестабилен и разлагается на формальдегид и вторичный амин. Рассматривая данный материал, можно считать приемлемым ,что цитохром P450 и пероксидазы (CPO , HRP) кроме сходности их некоторых свойств имеют и разности. N-деметилирование DMA, катализируемое ферментами CPO и цитохром P450 происходит путем окисления аминного азота на начальной стадии с последующим депротонированием α-углеродатома и образованием свободного нейтрального радикала. N-деалкилирование, катализируемое ферментами HRP, гемоглобином и миоглобином, происходит путем удаления водорода от α-углеродатома. Разность между этими механизмами обусловлена окружающей средой каталитического центра гемопротеина. Лиганды гемового железа могут иметь значительное влияние на реакционную способность кислородосодержащих интермедиатов и на их химические свойства. Среди изученных пероксидаз N-деметилирование, катализируемое ферментом CPO, происходит также путем депротонирования, как и в случае цитохрома P450. Весьма интересны и заслуживают внимания нынешние взгляды на ферменты, противоречащие ранним традиционным взглядам на ферменты-биокатализаторы. Как выяснилось, в ходе реакции они модифицируются, и это особенно относится к таким ферментам, функционирование которых связано с генерацией и реализацией свободных радикалов, активных форм кислорода и реакционноспособных интермедиатов. Очевидно, что с этой точки зрения на первый план выступают гемопротеины [19-22]. Модификация в первую очередь проявляется в инактивации фермента, и это явление называется “самоинактивацией”. Особо опасным для клетки является накопление свободных радикалов, так как они инициируют многие патологические процессы. Когда их концентрация превышает допустимые границы и становится невозможным их удаление из клетки, тогда клетка прибегает к аппоптозу, т.е. заранее запрограммированному “самоубийству”. Термин аппоптоз (от греческого «листопад») в совершенстве выражает свою суть. Пораженная клетка не претерпевает некроз, а истощается. Органеллы разлагаются, макромолекулы гидролизируются и употребляются соседними клетками в виде строительных материалов. Явление самоинактивации ферментов можно рассматривать как “аппоптоз на ферментном уровне”, так как в это время фермент – генератор свободных радикалов сам выходит из строя, и в корне уничтожается процесс происхождения интермедиатов, уже не нужных для клетки. Здесь же следует отметить весьма вероятное мнение о том, что инактивация макромолекул путем модификации должна быть включена в механизм оборота внутриклеточных белков, с помощью которого регулируется удаление их молекул. Это обстоятельство является весьма значительным для всех тех ситуаций , которые связаны с вытеснением из организма избытка ксенобиотиков и особенно лекарственных препаратов [19]. Молекулярный механизм ферментной инактивации и ее истинная роль в клетке еще требует фундаментального изучения. На данном этапе имеются следующие факты: Многие ферменты модифицируются путем оксидации активными формами кислорода. Инактивация осуществляется ферментативными и химическими путями или радиолитически генерирующими реакционноспособными продуктами. Кислородсодержащие радикалы проявляют способность модификации аминокислотных остатков, непосредственно близлежащих к активному центру белка, и эта реакция весьма специфична. Структурные изменения, возникшие вблизи активного центра, могут вызвать конформационные сдвиги и повышение протеолитической активности. Что касается цитохрома P450, то в животной клетке процессы в принципе осуществляются двумя механизмами. Первый механизм связан с образованием активных временных субстратов, производящих в результате разложения пероксикомплекса этого гемопротеина. К таким реакционноспособным интермедиатам относятся свободные органические радикалы, эпоксиды, N-оксиды, S-оксиды, альдегиды, кетоны и др. Они со своей стороны ковалентно связывают апоцитохром P450 и вызывают его модификацию. Такого типа механизм инактивации проявляется при окислении так называемых “уничтожающих” (“истребляющих”) субстратов, которые необратимо или почти необратимо ингибируют фермент. Активация реакционноспособных групп субстратов сопровождается формированием реакционноспособных метаболитов, ковалентно связанных с апоферментом. Субстратов, которые вызывают такого рода инактивацию цитохрома P450, называют «уничтожающим» субстратом. (Например, хлорамфеникол соединяется с остатком лизина апофермента, паратион и хлороформ соединяются с цистеином и т.п.). Они проявляют высокую специфичность к ферменту. Второй механизм инактивации цитохрома P450 связан с генерацией активных форм кислорода (O2.- , HO-, H2O2 ) на активный центр фермента в каталитическом цикле. Это может быть результатом несопряженных монооксигеназных реакций (свободного окисления NADPH), когда восстанавливающие эквиваленты NADPH частично употребляются в гидроксилировании эндогенных и экзогенных соединений. Генерирование супероксиданиона в основном прерогатива цитохрома P450, так как вклад других микросомальных переносчиков в этом процессе весьма незначителен. Цитохром P450 предпочтительно инактивируется перекисью водорода – H2O2, формирующеейся на его активном центре. В то же время H2O2, полученная после дисмутации O2.- дает слабый эффект инактивации [23-31]. Исходя из самой химической природы субстрата, инактивация цитохрома P450 осуществляется: 1) необратимым связыванием метаболитов с апоферментом; 2) почти необратимым связыванием метаболитов с гемовым железом; 3). алкилированием или деструкцией гема. Первый и третий варианты могут быть комбинированы. При поражении гема модифицированный фермент необратимо инактивируется, в то время как модификация апофермента необратима [32, 33]. Часто инактивация фермента является результатом деструкции гема, нежели деструкцией апофермента. Надо отметить, что в рассмотренных исследованиях конверсия цитохрома P450 в цитохром P420 вообще не фигурирует. Поэтому нельзя обойти вниманием, в виде исключения, результат, полученный А. Скулачевым и его сотрудниками [34], что является весьма значительным в случае с растениями. Показано, что изолированная изоформа цитохрома P450 – 2B4 , редуцированная дитионитом, инактивируется активными формами кислорода вследствие аутооксидации, и эта инактивация происходит на фоне конверсии цитохрома в форму P420. Цитохром P450, встроенный в микросомальную и липосомную мембрану, является достаточно стабильным в ферри- и ферро состояниях [35]. Исходя из этого, высказано соображение, что для инактивации цитохрома P450 обязательно существование свободнорадикальной ступени, а конверсию в цитохром P420 можно считать следующей ступенью его деградации, так как она нестабильна и в присутствии O2 быстро теряет гем [36]. Исследования по изучению изменения цитохрома P450 в каталитическом цикле проводились в Лаборатории биологического окисления Института биохимии и биотехнологии Серги Дурмишидзе Грузинского аграрного университета [37-43]. В опытах применяли микросомальную фракцию проростков кукурузы в возрасте 7-14 дней. В молодых побегах (7 дней) доминирует цитохром P450. Фракция не имеет пероксидазную активность (способность окислять гваякол). Микросомальное окисление, в котором принимает участие этот фермент, практически вызывает необратимую конверсию фермента в его неактивную форму P420. Впоследствии во фракции возрастает пероксидазная активность. Аналогичный результат наблюдается при интенсивной аэрации молодых микросом на 120 минут: пятикратное повышение соотношении P420/P450 соответствует увеличению пероксидазной активности в 1.5 раза. Достоверно показано, что в микросомах функционирует гемопротеин, который соответствует гему пероксидазы. В животных организмах ни один агент, вызывающий инактивацию, не нарушает гем в активном центре, тогда как в цитохроме P450, кроме деструкции, окислению подвергаются аминокислотные остатки близлежащие гему. В отличие от животного, растительный цитохром P450 способен заменять монооксигеназный механизм окисления на пероксидазный и это является результатом его химической модификации, то есть конверсии в цитохром P420. В растениях цитохром P450 не теряет гем! В растениях пероксидазной активностью обладает цитохром P420! Очевидно, в растениях инактивация цитохрома P450 и приобретение пероксидазной активности осуществляется не путем «жесткого» воздействия активных форм кислорода, а путем постепенной «плавной» конверсии. Исходя из вышесказанного, в растениях инактивация цитохрома P450 не осуществляется по “классическому” пониманию этого процесса и инактивируется не само фермент, а инактивации подвергается механизм каталитической реакции. Термин – “Трансформация фермента” более соответствует такому типу модификации, при котором один механизм действия фермента заменяется другим, так как более совершенно выражает суть явления. Путем трансформации растительная клетка, с одной стороны, как и животная клетка, избавляется от генератора агрессивных интермедиатов – цитохрома P450, а с другой стороны в отличие от животной клетки, приобретает фермент, способный окислять ксенобиотики и ликвидировать агрессивные молекулы, – H2O2. Именно в этом состоит биологическая суть трансформации цитохрома P450 путем химической модификации. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Wislocki P.G., Muva G.T., Lu A.Y.H. Reactions Catalyzed by the Cytochrome P-450 System. Jn. Enzymatic Basis of Detoxication (Jakoby M.B. Ed) // Academic, New-York, 1980, pp. 135-182, 2. Guengrich F.P. Enzymatic Oxidation of Xenobiotic Chemicals // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 25, 1990, pp. 97-153. 3. Guengrich F.P. Oxidation of Toxic and Carcinogenic Chemicals by Human Cytochrome P-450 Enzymes // Chem. Res. Toxicol., 4, 1991, pp. 391-407. 4. Hollenberg P.F. Mechanisms of Cytochrome P-450 and Peroxidase Catalyzed Xenobiotic Metabolism // FASEB J., 6, 1992, pp. 686-694. 5. White R.E., Coon M.I. Oxygen Activation by Cytochrome P-450 // Annu. Rev. Biochem., 49, 1980, pp. 315-356. 6. Kadlubar F.F., Morton K.C., Ziegler D.M. Microsomal-catalyzed Hydroperoxidedependent c-oxidation of Amines // Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 1973, pp.12251260. 7. Rahimtula A.D., O, Bzien P.I. Hydroperoxide Catalyzed Liver Microsomal Aromatic Hydroxylation Reactions Involving Cytochrome P-450 // Biochem. Biophys. Res. Commun., 60, 1974, pp. 440-447. 8. Roman R., Dunford H.D. Ph-dependence on the Oxidation of Iodide by Compound I of Horseradish Peroxidase // Biochemistry, 11, 1972, pp. 2076-2082. 9. Potter D.W., Hinson J.A. The 1- and 2-electron Oxidation of Acetaminophen Catalyzed by Prostaglandin H Synthase // J. Biol. Chem., 262, 1987, pp. 974-981. 10. Kedderis G.L., Koop D.R., Hollenberg P.F. N-Demethylation Reactions Catalyzed by Chlorperoxidase // J.Biol. Chem., 225, 1980, pp. 10174-10182. 11. Nordblom G.D., White R.E., Coon M.I. Studies of Hydroperoxide-dependent Substrate Hydroxylation by Purified Liver Microsome Cytochrome P-450 // Arch. Biochem. Biophys., 175, 1976, pp. 524-533. 12. Kedderis G.L., Hollenberg P.F. Characterization of the N-demethylation Reactions Catalyzed by Horseradish Peroxidase // J. Biol. Chem., 258, 1983, pp. 8129-8138. 13. Hollenberg P.F., Rand-Meir T., Hager L.P. The Reaction of Chlorine with Horseradish Peroxidase and Chloroperoxidase: Enzymatic Chlorination and Spectral Intermediates // J.Biol. Chem., 249, 1974, pp. 5816-5825. 14. Guengevich F.P. Oxidation of Sparteines by Cytochrome P-450: Evidence Against the Formation of N-oxides // J. Med. Chem., 27, 1984, pp. 1101-1103. 15. Miwa G.t., Walsh I.S., Kedderis G.L., Hollenberg P.F. The Use of Intramolecular Isotope Effects to Distinguish Between Deprotonation and Hydrogen Atom Abstraction Mechanisms in Cytochrome P-450 and Peroxidase-catalysed N-demethylation Reactions // J.Biol. Chem., 258,1983, pp. 14445-14449. 16. Hollenberg P.F., Miwa G.t., Walsh I.S., Dwyer L.A., Rickert D.E., Kedderis G.L. Mechanisms of N-demethylation Reactions Catalyzed by Cytochrome P-450 and Peroxidases // Drug metab. Dispes. 13, 1985, pp. 272-275. 17. Jones I.P., Rettie A.E., Trager. Intrisic Isotope Effects Suggest that the Reaction Coordinate Symmetry for the Cytochrome P-450 Catalysed Hydroxylation of Octane is Isozyme Independent // J. Med. Chem., 33,1990, p. 1242-1246. 18. Guengevich F.P. Low Kinetic Hydrogen Isotope Effects in the Dehydrogenation of 1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-3,5-pyridinedieavboxylic Acid Dimethyl Ester (Nifedipine) by Cytochrome P-450 Enzymes are Consistent with an Electron/Proton/Electron Transfer Mechanism // Chem. Res. Toxicol.,3, 1990, pp. 21-26. 19. Karuzina I.I., Archakov A.I. The Oxidative Inactivation of Cytochrome P-450 in Monooxygenase Reactions // Free Radical Biol. Med.,16, 1993, pp. 73-97. 20. Ruchpaul K., Rein H., Blanck I. Regulation of the Activity of the Hepatic Endoplasmic Cytochrome P-450. In: Basis and Mechanisms of Regulation of Cytochrome P-450 (Ruchpaul K., Rein H. Eds) // Academic Werlag, Berlin, 1989, pp.321-345. 21. Archakov A.I., Zhukov A.A. Multiple Activities of Cytochrome P-450. Stoichismetrical approach. In: Drug Metabolism – From Molecules to Man // London, Taylor, Francis, 1989, pp. 473-476. 22. Zhukov A.A., Blanch I., Ristau O., Ruchpaul K., Archakov A.I. Stoichiometry of Cytochrome P-450-catalyzed Oxygenase and Oxidase Reactions. Corellations with the Spin State of the Ferric Heme. In: Cytochrome P-450 // Biochem. Biophysic.,23, 1989, pp.85-88. 23. Halpert I.R., Balfour C., Millev N.E., Kaminsky L.S. Dichloromethyl compounds as Mechanism-based Inactivations of Rat Liover Cytochrome P-450 in vitro // Mol. Pharmacol., 30, 1986, pp. 19-24. 24. Stevens I.C., Halpert I.R. Selective Inactivation of Four Rat Liver Microsomal Androstenedione Hydroxylases by Chloramphenicol Analoge // Mol. Pharmacol.,33, 1988, pp. 103-110. 25. Ortiz de Montellano P.R., Mico B.a., Mathews I.M., Kunze K.L., Miwa G.T., Lu A.V. Selective Inactivation of Cytochrome P-450 Isozymes by Suicide Substrates // Arch. Biochem. Biophys., 10, 1981, pp. 717-728. 26. Ortiz de Montellano P.R., Reich N.O. Catalist-dependent Inhibition of Cytochrome P-450 enzyme. In: Cytochrome P-450: Structure, Mechanism and Biochemistry (Ortiz de Montellano P.R. Ed) // Plenum Press, New York, 1986, pp. 273314. 27. Ortiz de Montellano P.R. Cytochrome P-450 Catalisis: Radical Intermediates and Dehydrogenation Reactions // Trends Pharmacol. Sci., 10, 1989, pp. 354-359. 28. Reed C.I., Lock E.A., De Matties F. Olfactory Cytochrome P-450. Studies with Suicids Substrates of the Hemoprotein // Biochem. J., 253, 1988, pp. 569-576. 29. Guengevich F.P., Willard R.I., Shea I.P., Richards L.E., Macdonald T.L. Mechanism-Based Inactivation of Cytochrome P-450 by Heteroatomsubstituted Cyclopropanes and Formation of Ving-opened Products // J. Amer. Chem. Soc., 106, 1984, pp. 6446-6447. 30. Guengevich F.P., Bucker R.H. Cytochrome P-450-catalysed Dehydrogenation of 1,4-Dihydropyridines // J. Biol. Chem., 263, 1988, pp. 8168-8175. 31. Guengevich F.P. Mechanism-based Inactivation of Human Liver Microsomal Cytochrome P-450 IIIA4 by Getodene // Chem. Res. Toxicol.,3, 1990, pp. 363-371. 32. Farrell G.C., Correia M.A. Structural and Functional Reconstitution of Hepatic Cytochrome P-450 in vivo. Reversal of Allye Alfylisopropylucetamide-mediated Destruction of the Hemoprotein by Exogenous heme // J. Biol. Chem., 255, 1980, pp. 10128-10133. 33. Bornheim L.M., Underwood M.C., Caldera P., Rettie A.E., Trager W.F., Wrighton S.A., Correia M.A. Inactivation of Multiple Hepatic Cytochrome P-450 Isozymes in Rats by Allyeisopropylacetamide: Mechanistic Implications // Mol. Pharmacol.,32, 1987, pp. 299-308. 34. Bachmanova G.I., Pogodina O.K., Kanaeva I.P., Archakov A.I. The Inactivation of the Reduced Cytochrome P-450. In: Biochem. Biophys. and Regulation of Cytochrome P450 (Gustafsson I.a., Carlstedt D., Mode A., Rafter I. Eds) // Elsevier Biomedical Press, Amsterdam,1980, pp. 599-601. 35. Bachmanova G.I., Uvarov V.V., Kanaeva I. P.,Archakov A.I. Suicide Inactivation of Reduced Cytochrome P-450 in Soluble and Membrane-bound states. In: Cytochrome P450, Biochem, Biophys and Environmental Implications (Hictanch E., Laitinen M., Hanninen O., eds) // Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1982, pp. 599-602. 36. Ingelman-Sandberg M., Paul K.G. Heme Release Rabbit Liver Microsomal Cytochrome P-450 LML // Acta Chem. Scand. B., 40, 1986, pp. 233-234. 37. Khatisashvili G., Kurashvili M., Gordeziani M., Kvesitadze G. Monooxygenase and Peroxydase Pathwayes of Xenobiotics Detoxication in Higher Plants // Fresenius Environmental Bulletin, 2, 1993, pp. 103-108. 38. Хатисашвили Г.А., Курашвили М.В., Чхиквишвили И.Д., Гордезиани М.Ш., Квеситадзе Г.И. Трансформация монооксигеназного механизма в пероксидазный и микросоальное окисление флавоноидов в растениях // Изв. АН Грузии, сер. биол., 19, 1993, с. 318-323. Khatisashvili G., Kurashvili M., Chikvishvili I., Gordeziani M., Kvesitadze G. Transformation of Monoxygenase Pathway to Peroxidase and Microsomal Oxidation of Flavonoides in Plants // Proc. Georg. Acad. Sci. Biol. Ser., 19, 1993, pp. 318323. 39. Khatisashvili G., Gordeziani M., Kvesitadze G., Korte F. Plant Monooxygenases: Participation in Xenobiotic Oxidation // Ecotoxicology and Environmental Safety, 36, 1997, pp. 118-122. 40. Гордезиани М., Хатисашвили Г. Мембранная ксенобиохимия // Аграриков, Тбилиси, 281 с. Gordeziani M., Khatisashvili G. Membranous Xenobiochemistry // Agrarikos, Tbilisi, 281 pp. (in Georgian). 41. Kiskeidze E., Zaalishvili G., Ebelashvili M., Khatisashvili G., Kurashvili M., Gordeziani M. Changes of Plant Monooxygenase System During Xenobiotics Oxidation. Proc. Georg. Acad. Sci. Biol. Ser. A. 2003, 29, p. 639-644. 42. Khatisashvili G., Kurashvili M., Gordeziani M., Kvesitadze G. Fuctional Evalution of Separate Components of Plant Monooxygenase System Involved in Xenobiotic Detoxication // Fresenius Environmental Bulletin, 3, 1994, pp. 621-626. 43. Пруидзе М.В., Хатисашвили Г.А Омиадзе Н.Т. Окисление оршанических ксенобиотиков фенолоксидазой из листьев чая // Изв. аграрной науки, т.4, № 2, 2006, с. 69-72. Pruidze M., Khatisashvili G., Omiadze N. Oxidation of Organic Xenobiotics by Phenoloxidase from Tea Leaves // Annuals of Agrarian Science 2006, 4, pp. 69-72. MONOXYGENASE AND PEROXIDASE MECHANISMS OF XENOBIOTIC METABOLISM M. Sh. Gordeziani It has been considered the resemblance and difference between the mechanisms of xenobiotics oxidation, catalyzed by monooxygenases and peroxidases of plant cell. It has been shown, that plant cytochrome P450 has the ability to change the monooxygenase mechanism of oxidation into the peroxydase mechanism, which is the result of conversion of P450 into P420. Based on experimental data, the mechanism of cytochrome P 450 transformation, has been stated and has been determined the biological phenomenon of cytochrome P 450 transformation via chemical modification.
