Ферментные электроды в аналитической химии

Ферментные электроды в
аналитической химии
Проф. Дж.Паллески
Dipartimento Scienze e Tecnologie Chimiche
Università di Roma Tor Vergata
Italia
UNIVERSITY OF ROME
TOR VERGATA
ГРУППА B.E.A.T.
Группа биоэлектроанализа университета Тор Вергата
www.uniroma2.it/dipartim/BEAT
Лаборатория аналитической химии
Биосенсоры
Иммуносенсоры
Электроанализ
В медицине
Пищевая
Пищевой
промышленность
промышленности Экология
Экологии l
Новые материалы /
Медиаторы
(углеродные нанотрубки
берлинская лазурь и др.)
СОДЕРЖАНИЕ
Î Ферменты для аналитической химии
Î Клинический анализ
Î Анализ продуктов питания
Î Экологический мониторинг
Î Заключение
Аналит
Биологический Преобразователь
сигнала
компонент
(фермент)
Считывающее
устройство
Амперометрические сенсоры
Кислородный электрод
Электрод Кларка:
¾ Катод (рабочий электрод): платина, золото
¾ Анод (элеткрод сравнения) Ag/AgCl,
Pt = катод
Анод = Ag/AgCl
O2 + 4H++ 4e- → 2 H2O
4Ag + 4Cl-→ 4AgCl + 4e-
Сенсоры H2O2
Реакция анодного окисления пероксида водорода:
H2O2 → O2 +2H+ +2eВместо газопроницаемой мембраны кислородного электрода
используется мембрана из ацетата целлюлозы, пропускающая
частицы с массой 100-150 Дальтон.
Это позволяет диффузию сквозь мембрану небольших молекул и
уменьшает возможное мешающее влияние полимерных частиц.
Сенсоры NAD(P)H
NAD(P)H участвует в реакциях, катализируемых
ферментами класса окисдоредокутаз. При этом
образуется
NAD(P)H,
который
может
прямо
окисляться на электроде или участвовать в реакции
с медиаторов на поверхности электрода:
Субстрат
Фермент + NAD(P)+
Med.(red)
Продукт
Фермент+NAD(P)H
Med.(ox)
e-
Амперометрические электрохимические биосенсоры
O-кольцо
Ферментная мембрана
Корпус
Pt
Рабочий электрод
Поликарбонатная
Мембрана из
мембрана
ацетата целлюлозы
Analyte
O2
H2O2
Электрод сравнения
(Ag/AgCl)
Ферменты, наиболее часто применяемые
для создания биосенсоров
Аналит
Фермент
Амигдалин
Аспарагин
Холестерин
Сложные эфиры
Глюкозы
Пероксид водорода
Липиды
Пенициллин G
Белки
Крахмал
Сахароза
Мочевина
Мочевая кислота
β-Гликохидаза
Аспарагиназа
Холестерол оксидаза
Химотрипсин
Глкозооксидаза
Каталаза
Липаза
Пенициллиназа
Трипсин
Амилаза
Инвертаза
Уреаза
Уриказа
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Обычно проводится двумя методами:
ƒ Физическая, когда фермент физически включается в носитель
ƒ Химическая,когда
образуется
ферментом и носителем
ковалентная
связь
между
Измерения
Стационарный режим
Считывающее
Биосенсор
устройство
Амперметр
Ячейка
Магнитная мешалка
Проточная система
Биосенсор
помещен
в
электрохимическую
проточную ячейку.
Электрохимическая
ячейка
связана
с
перистальтическим
насосом,
прокачивающим
буферный раствор с постоянной скоростью.
Режим проточно-инжекционного анализа (ПИА)
В режиме ПИА ячейка связана с потоком с
помощью крана
Инжектор
Насос
Петля
Записывающее
устройств
Буфер
Сток
Электрохимическая
ячейка
Амперметр
Режим проточно-инжекционного анализа (ПИА)
Медицина
Глюкоза
Молочная кислота
Пировиноградная кислота
Экология
Тяжелые металлы
Пестициды
Применение биосенсоров
Пищевая промышленность
Крахмал
Лактулоза
Яблочная кислота
Клинический анализ
Применение химических сенсоров
в клиническом анализе
5% взрослых больны диабетом
Они нуждаются в постоянном анализе крови.
Для оценки уровня глюкозы используют высоко селективный
биосенсоры на основе фермента глюкозооксидазы (GOD)
Метод основан на реакции катализируемой этим
ферментом (GOD)
Глюкоза + O2
GOD
→
Глюконовая кислота + H2O2
Количество H2O2 , образующееся в реакции, пропорционально
содержанию глюкозы
Определение глюкозы, пирувата и лактата
O-ring
Глюкозооксидаза
Корпус
Pt
рабочий электрод
Поликарбонатная
мембрана
Мембрана из ацетата
целлюлозы
Электрод сравнения
(Ag/AgCl)
Глкоза + O2
GOD
→
Глюконовая кислота + H2O2
Искусственная
поджелудочная железа
Перистальтический
насос
Анализ
глюкозы
Инсулиновый
инжектор
Инсулин
Глюкоза
Разведениеl
Glucose,
lactate e pyruvate
measurements
Ультрафильтрация
Анализатор
глюкозы
Ультрафильтрат
0.02 мл/мин
Лактатный
сенсор
0.25 мл/мин
Пируватный
сенсор
Нормозол +
кофакторы
Нормозол
+
кофакторы
Стандарт +
Лактат 0.1 мМ
Пируват 0.01 М
СТОП
INF INF
СТОП
200
мг/дл
GLU
EX
ГЛЮКОЗА
ЕДА
100
часы
СТОП
EX
EX
4•10-3
Моль/л
STOP
INF INF
GLU
ЛАКТАТ
ЕДАL
2
1
st
cal
cal
СТОП
INF INF
GLU
СТОП
EX
2•10-4
Моль/л
EX
часы
st
cal
cal
ПИРУВАТ
ЕДА
1
st cal
11a.m.
cal
12
13
cal
14
st
часы
15
cal
16
Измерения уровня лактата у бегунов
Лактат
ммоль
4
Изучение функционального
анаэробного режима
2
9 10
8
Скорость, км/ч
0
11
20
12
13
0
40 Время, мин. 60
Лактат,
ммоль
4
2
9 10
8
Скорость, км/ч
0
11
20
12
13
0
40 Время, мин. 60
60
Лактат,
мг/дл
20
200
Глюкоза,
мг/дл
100
Анаэробный режим
У гонщика Формулы 1
20
Скорость,
км/ч
10
Время, мин
15
30
45
60
Латкта
Мг/дл
20
200 Глюкоза,
Мг/дл
100
20 Скорость, км/ч
10
Время, мин
15
30
45
60
Лактат,
мг/дл
20
200
Глюкоза,
100 мг/дл
Анаэробный режим
у марафонца
20
Скорость,
Км/ч
10
Время, мин
15
30
45
60
Lactate
mg/dl
20
200
Glucose
100 mg/dl
20
10
Speed
Km/h
TIME
i
15
30
45
Анаэробный режим
Возраст, спорт
Скорость Лактат
(км/ч) (мг/дл)
24-26 Марафон
19.5
19.0
34-24 Триатлон
17.0
16.9
25-40 10000 м
15.2
16.0
24-26 Тренированный
11.0
15.0
Нетренированный 8.5
14.0
26-41
Анализ
продуктов питания
Определение биогенных аминов в продуктах
Биогенные амины – алифатические, алициклические и гетероциклические
органические основания небольшого молекулярного веса. Они синтезируются в
клетках животных и растений, но также образуются микроорганизмами путем
декарбоксилирования аминокислот.
Анализ присутствия биогенных аминов:
дает оценку безопасности и качества продукта питания;
позволяет избежать риск отравления аминами.
¾ В растениях биогенные амины (путресцин, спермин и спермидин)
включены в физиологические процессы. Пример – SAM, который
разлагается на этилен и полиамины
Созревание
Рост
+ Путроесцин
Как можно измерить биогенные амины в
продуктах питания ?
Определение биогенных аминов (путресцина, кадаверина, спермидина,
sспермина, гистамина, тирамина, триптамина) проводят с помощью
биосенсора, в котором используют фермент диаминокисдазу (DAO) и
поламиноксидазу (PAO).
DAO
R-CH2-NH2 +O2 ¼ R-CHO + H2O2 + NH3
PAO
NH2(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2+O2+H2O ¼ NH2(CH2)3-CHO+ H2O2 + Dap (пропилендиамин)
PAO
NH2(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 +O2+H2O ¼ NH2(CH2)3-NH-(CH2)3-CHO + H2O2 + Dap
Определение биогенных аминов в анчоусах
Биосенсоры на основе DAO использовали в определении уровня аминов в
анчоусах. Полученные результаты сравнивали с хроматографическим методом.
Хроматография позволяет разделять амины и определять индивидуальные
соединния, биосенсор на основе DAO дает отклик на суммарное содержание
биогенных аминов.
Биосенсор (¦) Хроматографический метод (|)
450
Corrente (nA)
360
270
180
90
0
0
50
100
Tempo (giorni)
150
200
Определение L-лактата в сыре
моцарелла
Молочная кислота (лактат) – основной продукт ферментации.
Определение лактата дает информацию о том, как протекает ферментация
7
0,8
0,55
pH
6
5,5
0,3
5
0,05
4,5
4
0
50
100
150
Время (мин)
200
-0,2
250
L-лактат (г/100 г)
6,5
L-Лактат: быстрое
накоплние в начале
процесса
pH: быстрый спад до рН
5.5, потом медленное
снижение
Определение L-лактата в моцарелле с
помощью проточно-инжекционного
анализа
В ПИА использовали лактатный биосенсор на основе лактатоксидазы (фермент
иммобилизован на нейлоновой сетке) и платинового электрода для измерения H2O2 .
Реакция, протекающая на электроде:
L-Лактат + O2 + H2O → Пируват + H2O2
ПИА система позволяет проводить определение L-лактата за 30 секунд при
воспроизводимости около 1%
Биосенсор на яблочную кислоту
L-малат + 2
NADP+
EM
⇒
Пируват + 2 NADPH + CO2
NADPH (образуется малатоксидазой (ЕМ)) восстанавливает
медиатор, который затем окисляется кислородом с образованием
пероксида водорода H2O2:
Пируватоксидаза
Пируват + HPO4- + O2
Мл/мин
a
0.3
b
0.3
Инжекторная
петля
Ферментный реактор
Ацетилфосфат + H2O2 + CO2
Самописец
Петля 62 см
Электрохимическая ячейка
Перистальтический насос
a= буферный раствор
MOPS 0.05 M pH 7.4
b= медиатор феназинметилсульфат (PMS) в 1 мМ MOPS
Определение яблочной и молочной
кислот в вине
Эти два метаболита играют важную роль в контроле качества вина, поскольку
отвечают за многие реакции, обусловливающие «букет» вина
Обычно анализ яблочной и молочной кислот проводят
спектрофотометрически
Альтернативным методом является измерение активности соответствующих
ферментов с помощью электрохимических сенсоров
Такие методы просты и позволяют проводить измерение уровня яблочной
и молочной кислот в вине в реальном масштабе времени
Ферментативные реакции могут включать:
L-лактат + O2 + H2O
Лактатоксидаза
Пируват + H2O2
маладегидрогеназа
Оксалоацетат + NADH + H+
L-малат + NAD+
L-малат + NADP+
Малатоксидаза
Пируватe + NADPH + CO2 + H+
Пируватоксидаза
Пируват + HPO4- + O2
Ацетилфосфат + H2O2 + CO2
Метод иммобилизации
M
M
P
M
P
P
1. Мембрана с предактивированными группами
2. Мембрана после присоединения пируватоксидазы
3. Мембрана после присоединения пируватоксидазы и
малатоксидазы
O-кольцо
Асимметричная
ферментная
мембрана
МЕ
Пируватоксидаза
Поликарбонатная
мембрана
Мембрана из ацетата
целлюлозы
Pt проволока
Внешний электрод
Стекло
Ag/AgCl
К амперметру
KCl 0.1 М
внутр.раствор
Изменение содержания яблочной кислоты
в процессе созревания вина
СРАВНЕНИЕ СО СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Сорт
Trebbiano
Trebbiano
Trebbiano
Trebbiano
Tintilia
Tintilia
Tintilia
Tintilia
Tintilia
Дата
07.сен
13.сен
22.сен
28.сен
08.сен
14.сен
22.сен
28.сен
05.окт
Спектрофотометрия
Амперометрия
(г/л)
(г/л)
8.75
6.05
4.55
2.57
4.54
4.12
3.52
3.05
2.38
8.65
5.85
4.53
2.83
4.29
4.28
3.57
2.65
2.15
E (%)
3
1
0
10
6
4
1
15
10
Определение малата и лактата в красных
винах
Накопление молочной кислоты
относительно присутствия Oenococcus
oeni starters
3
Накопление яблочной кислоты
относительно присутствия Oenococcus
oeni
L25
4
L25
L50
г/л
U50
г/л
L50
3
U25
2
1
U25
2
U50
1
0
0
0
2
4
Дни
6
8
0
2
4
Дни
6
8
МОНИТОРИНГ МЕТАБОЛИТОВ В ПРОЦЕССЕ
АЛКОГОЛЬНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ
Электрохимические биосенсоры (режим ПИА) в
измерении уровня глюкозы, фруктозы, глицерина и
этанола в процессе алкогольной ферментации
Ферментативные реакции
¾Глюкоза + O2 ⎯GOD→ Глконовая кислота + H2O2
¾Фруктоза + 2 PMS+⎯FDH→ кетофруктоза + 2 PMSH
PMSH----->2 PMS+ + 2e
¾Этанол + O2 ⎯AO→ Ацетальдегид + H2O2
¾Глицерин + АТФ (Mg2+) ⎯GK→ Глицерол-3-фосфат + ADP
Глицерол-3-фофат +O2 + H2O ⎯GPO→ Глицерон-3-ф+ H2O2
120
12
100
10
80
8
Svinatura
glucosio
fruttosio
etanolo
60
40
6
Delestage
X Ферментация за 75
часов
% vol
4
20
2
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
X Ферментация за 115
часов
g/L
“rimontaggi ripetuti” (150 Hl)
120
12
100
10
80
8
fruttosio
glucosio
etanolo
60
40
6
Svinatura
Rimontaggi
20
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Время (час)+
90
100
110
0
120
% vol
g/L
“unico delestage” (300 Hl)
Анализ объектов
окружающей среды
Биосенсор на основе холина
и ацетилхолинэстеразы:
применение в анализе вод
Цель
Быстрый и недорогой метод для определения суммы
антихолинэстеразных соединений в образце, важный
токсикологический показатель – процент ингибирования
активности фермента или эквивалентная
концентрация эталонного соединения (параоксон)
Ацетилхолин
Ацетилхолинэстераза
Ингибируется
пестицидами
Холин + O2 + H2O
H2O2
Электрод
Холин + уксусная кислота
Холиноксидаза
Не ингибируется
Бетаин + H2O2
O2 + 2H+ + 2e-
Передача нервного импульса
Ацетилхолинэстераза
Ингибирование ацетилхолинэстеразы
параоксоном
6
Холостая проба
2 мкг/кг
6 мкг/кг
4
10 мкг/кг
2
0
0
1
2
3
4 Время (минут)
Анализ искусственных образцов и
мешающее влияние тяжелых металлов
Соединение,
добавленное
в образец
Параоксион
Диметоат S P
Ометоат O P
Азинфос-Et S P
Пиримифос S P
Тяжелые металлы
Концентрация
в образце
(мкг/кг)
7.5
19.0
3.0
8.6
17.0
100
Эквивалентная
концентрация
параоксона
(мкг/кг)
7.0
4.0
1.5
5.0
4.5
0.5
Амперометрические биосенсоры для
определения тяжелых металлов
Поступление тяжелых металлов в окружающую среду является причиной
многих системных нарушений
Помимо других биологических последствий, ионы тяжелых металлов
оказывают ингибирующее действие на ферменты, связываясь с тиольными
группами белков
Традиционные методы определения металлов требуют сложной
пробоподготовки, дорогостоящего оборудования и обученного персонала
Биосенсоры позволяют решать задачи быстрого и чувствительного
определения ионов металлов в полевых условиях
Была проведена оценка влияния 15 ионов металлов на активность
12 оксидоредуктаз
Для построения калибровочных кривых использовали растворы ферментов
(ингибирование в гомогенных условиях) и препараты ковалентно
иммобилизованных ферментов
Были получены калибровочные кривые для Hg(II), Se(IV), Ni(II), V(V),
Cu(II) и Cd(II)
Активность ферментов контролировали амперометрически с помощью
сенсора на пероксид водорода
Общая реакция:
Субстрат + O2
Продукт + H2O2
Относительная активность оксидоредуктаз
после их инкубирования в течение 30 минут с 1- мг/л раствором металла
фермент, Е/мл
Отн.активность (%)
Определение тяжелых металлов
по ингибированию инвертазы
Реакции
Сахароза
E1
E1= Инвертаза
+ H2O
E2 = Глюкозооксидаза
D-Глюкоза + D-фруктоза
D-Глюкоза
E2
+ O2
Глюконовая кислота + H2O2
H2O2
Биосенсор
O2 + 2H++ 2e-
Измерение ингибирования
I1
Сахароза
INV
B
Сахароза
INV + ингибитор
A
I2
Время реакции
Время
Проточно-инжекционное определение
с 10 мМ сахарозой
80
60
40
20
0
0
20
40
60
[Hg2+] (мкг/кг)
80
100
Благодарность членам группы университета Тор Вергата