Физико-химические закономерности синтеза субмикронных
advertisement
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» На правах рукописи Метвалли Хассан Абдельфаттах ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СИНТЕЗА СУБМИКРОННЫХ ЧАСТИЦ ВАТЕРИТА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КОМПОЗИТАХ 02.00.04- Физическая химия Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук Научный руководитель: д.ф.-м.н, профессор Вениг Сергей Борисович Саратов 2015 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. СВОЙСТВА И ПОЛУЧЕНИЕ ЧАСТИЦ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ И ГИДРОКСИАПАТИТА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ КОМПОЗИТОВ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................. 11 1.1 Карбонат кальция. Физические и механические cвойства ................................... 11 1.1.1 Кристаллическая структура карбоната кальция ..................................................... 12 1.1.2 Применение карбоната кальция ............................................................................... 14 1.1.3 Получение карбоната кальция .................................................................................. 15 1.2 Гидроксиапатит. Физические и механические cвойства .......................................... 18 1.2.1 Кристаллическая структура гидроксиапатита ........................................................ 20 1.2.2 Получение гидроксиапатита ..................................................................................... 20 1.2.2.1 Метод осаждения кристаллов гидроксиапатита .................................................. 20 1.2.2.2 Ультразвуковая гомогенизация ............................................................................. 22 1.2.2.3 Синтез золь-гель методом ...................................................................................... 23 1.2.2.4 Гидротермальные методы ...................................................................................... 24 1.2.3 Твердофазные методы ............................................................................................... 25 1.2.4 Применение гидроксиапатита .................................................................................. 27 1.3 Композиты, содержащие наночастицы карбоната кальция или гидроксиапатита . 28 1.3.1. Факторы, влияющие на эффективность взаимодействия матрицы и наполнителя ............................................................................................................................................... 29 1.3.2 Композиты гидроксиапатит/полимерная матрица ................................................. 30 1.3.3 Композиты карбонат кальция/полимерная матрица .............................................. 31 1.4 Факторы, влияющие на механические свойства волокнистых материалов ............ 32 1.4.1 Влияние диаметра волокна ....................................................................................... 32 1.4.2 Влияние концентрации наполнителя ....................................................................... 34 1.4.3 Влияние скорости вращения коллектора................................................................. 36 1.5 Методы формирования нановолокон .......................................................................... 39 1.5.1 Электроформование полимерных волокон и параметры, влияющие на процесс электроформования ............................................................................................................ 39 1.5.2 Применение электроформованных волокон ........................................................... 40 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ................................................................................ 41 2.1 Материалы ..................................................................................................................... 41 2 2.1.1 Поли(ɛ -капролактон) (ПКЛ( .................................................................................... 41 2.2 Получение частиц ватерита и гиброксиапатита, а также содержащих их композитов........................................................................................................................... 42 2.2.1 Получение частиц карбоната кальция ..................................................................... 42 2.2.2 Исследование возможности применения неорганических частиц в качестве контейнеров для загрузки модельных веществ................................................................ 42 2.2.3 Получение субмикронных частиц ватерита ............................................................ 43 2.2.4 Получение микронных и субмикронных частиц гидроксиапатита ...................... 44 2.2.5 Модификация частиц карбоната кальция и гидроксиапатита наночастицами серебра ................................................................................................................................. 45 2.2.6 Получение нетканых композитов на основе поликапролактона, содержащих гидроксиапатит и карбонат кальция ................................................................................. 45 2.3 Методы характеризации образцов .............................................................................. 47 2.3.1 Рентгеновская дифракция ......................................................................................... 47 2.3.2 Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) ................................................... 48 2.3.3 Измерения зета-потенциала ...................................................................................... 48 2.3.4 Анализ изображений.................................................................................................. 48 2.3.5 Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDX). ............................... 48 2.3.6 Спектроскопия комбинационного рассеяния.......................................................... 49 2.3.7 Тестирование механических свойств ....................................................................... 49 2.3.8 Измерение удельной площади поверхности и среднего диаметра пор ................ 50 ГЛАВА 3. СИНТЕЗ ЧАСТИЦ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ МИКРОННОГО И СУБМИКРОННОГО РАЗМЕРА ПРИ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ГОМОГЕНИЗАЦИИ И ИХ ЗАГРУЗОЧНЫЕ СВОЙСТВА ............................................................................................... 51 3.1 Получение частиц карбоната кальция ........................................................................ 51 3.2 Применение неорганических частиц карбоната кальция и гидроксиапатита в качестве контейнеров для загрузки модельных веществ ................................................ 59 3.3 Основные параметры синтеза ватерита, оказывающие влияние на размер и форму частиц ................................................................................................................................... 60 3.3.1 Влияние скорости подачи и концентрация реагентов при различных соотношениях этиленгликоль- Н2О на размер частиц ватерита ................................... 60 3.3.2 Влияние концентрации этиленгликоля и различной скорости подачи и концентрации реагентов на соотношение ватерита и кальцита .................................... 65 3.3.3 СЭМ и XRD анализ кристаллов карбоната кальция............................................... 69 3.3.3.1 СЭМ и XRD анализ кристаллов карбоната кальция при оптимизированных условиях ............................................................................................................................... 77 3.4 Выводы к главе.............................................................................................................. 81 3 ГЛАВА 4. Получение микронных и субмикронных частиц ватерита и гидроксиапатита и их применение в качестве платформ для гигантского комбинационного рассеяния ...... 84 4.1 Формирование субмикронных частиц гидроксиапатита .......................................... 84 4.2 Получение частиц гидроксиаппатита микронного размера ..................................... 87 4.2.1 Идентификация фаз ................................................................................................... 90 4.3 Модификация неорганических ядер наночастицами серебра .................................. 92 4.4 Спектроскопия комбинационного рассеяния............................................................. 92 4.5 Выводы по главе ........................................................................................................... 95 ГЛАВА 5. Влияние добавок частиц гидроксиапатита и карбоната кальция на механические свойства нетканых композиционных материалов на основе поликапролактона ................................................................................................................... 96 5.1 Морфология нетканых композитных материалов ..................................................... 96 5.2 Механические свойства полученных нетканых композитных материалов .......... 100 5.3 Регрессионный анализ механических свойств ......................................................... 102 5.4 Численное решение .................................................................................................... 104 5.5 Выводы по главе ......................................................................................................... 106 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................................................................... 108 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...................................................................................................... 110 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ............................................................... 111 БЛАГОДАРНОСТИ .................................................................................................................. 129 ВВЕДЕНИЕ 4 Актуальность темы Карбонат кальция (СаСО3) является одним из наиболее распространенных минералов. В природе карбонат кальция встречается в виде трех полиморфных модификаций: кальцита – кубической формы с ромбоэдрической кристаллической решеткой, арагонита – иглообразных кристаллов с орторомбической решеткой и ватерита – кристаллов сферической формы с гексагональной решеткой. Ватерит, являясь наименее стабильной разновидностью карбоната кальция, привлекает значительный интерес исследователей [1], в том числе и как темплат для формирования кристаллов гидроксиапатита (HА) Ca10(PO4)6(OH)2, который является природной формой апатита кальция. Неорганические микрочастицы на основе гидроксиапатита и карбоната кальция привлекают широкий интерес в различных научно-исследовательских и прикладных областях благодаря их биосовместимости, биоразлагаемости, высокой удельной площади поверхности и простоте получения. Одним из основных преимуществ этих минеральных структур для биомедицинских применений является их химический состав, напоминающий неорганического фазу твердых тканей, таких как кости и зубы [2], что дает возможность использования кристаллов CaCO3 и HA, а также содержащих их композитов для восстановления и роста костной ткани [3-5]. Кроме того, способность этих пористых частиц инкапсулировать активные вещества является существенным преимуществом для их применения в качестве средств доставки и высвобождения биологически активных молекул, в том числе, реализующих пролонгированное действие [6]. Современные средства доставки лекарств подразумевают наличие сенсорной функции, которая комбинационного может быть рассеяния. реализована Шероховатая на основе поверхность эффекта частиц гигантского ватерита и гидроксиапатита, декорированная плазмонно-резонансными наночастицами, создает условия, необходимые для реализации эффекта гигантского комбинационного рассеяния, что, в свою очередь, обеспечивает высокую эффективность обнаружения детектируемых веществ. Метод получения частиц ватерита микронного размера был опубликован сравнительно недавно [7], но описанная методика синтеза частиц не позволяет получать частицы с управляемым размером в субмикронном диапазоне и заданной формы, а также не обеспечивает получения частиц с узким распределением по размерам. Позже была 5 продемонстрирована возможность перехода в субмикронный диапазон частиц ватерита за счет изменения вязкости среды в результате добавления этиленгликоля [8]. Однако, систематических физико-химических исследований влияния концентрации этиленгликоля (EG) в качестве компонента растворителя (смесь воды и этиленгликоля), а также концентрации реагентов и скорости их подачи на размер и процентное содержание сферических кристаллов ватерита в полученном осадке карбоната кальция не было найдено в литературе. С точки зрения дальнейшего применения важным моментом является вопрос масштабирования синтеза микрочастиц ватерита. Попытки увеличить количество однократно получаемого карбоната кальция по предложенной методике [7], как правило, приводят к потере «качества» образца (меняется распределение по размерам, пористость и т.д.). Так, при перемешивании с помощью магнитной мешалки на внешний вид и свойства получаемых частиц влияют такие факторы, как скорость перемешивания [9], особенности поверхности стеклянного стакана, в котором проводят синтез, форма и размер мешалки [10], а также ее положение при перемешивании [11]. Для устранения влияния указанных факторов, нами было предложено использовать низкочастотный ультразвук при плотности мощности, соответствующей кавитационному режиму, для интенсивного перемешивания во время синтеза частиц ватерита. Цель диссертационной работы Целью диссертационной работы является установление влияния физико- химических параметров синтеза на свойства получаемых частиц карбоната кальция, и их применение для создания композитов. Задачи исследования Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: • исследовать влияние концентрации реагентов, содержания этиленгликоля, скорости подачи реагентов в реакционную камеру на полиморфизм и размер получаемых частиц карбоната кальция; • исследовать влияние способа перемешивания реакционной смеси на размер, дисперсность, кристаллографическую фазу и массовый выход частиц CaCO3 с целью масштабирования синтеза; 6 • синтезировать частицы гидроксиапатита микронного и субмикронного размера с использованием частиц CaCO3 в качестве темплатов путем проведения реакции ионного обмена в присутствии фосфат-ионов; • получить композиты на основе поликапролактона (PCL) методом электроформования, содержащие различную массовую долю микрочастиц СаСО3 и HA в качестве наполнителя с целью улучшения механических характеристик волокон на основе PCL. • исследовать влияние массовой доли микрочастиц CaCO3 и НА на диаметр волокна и механические свойства получаемых композитов; • получить эмпирическое уравнение для прогнозирования зависимости модуля Юнга и предела прочности композитов от массовой доли наполнителя. Научная новизна работы 1. Использование ультразвука для гомогенизации реакционной смеси при проведении реакции осаждения карбоната кальция позволяет формировать пористые частицы ватерита субмикронного размера с низкой дисперсностью и высоким массовым выходом. 2. Установлены физико-химические параметры синтеза частиц карбоната кальция, варьирование которых позволяет получать частицы заданной формы (сферической и эллипсоидальной), размера и полиморфной модификации. 3. Показана возможность управления размером частиц гидроксиапатита с использованием предварительно полученных темплатов карбоната кальция. 4. Показано улучшение механических свойств волокнистых материалов на основе поликапролактона, полученных методом электроформования, за счет варьирования массовой доли микрочастиц гидроксиапатита (HА) и карбоната кальция (СаСО3) в интервале от 2,5 до 7,5%. На основе экспериментальных данных было получено эмпирическое уравнение, описывающее зависимость механических параметров (модуля Юнга и предела прочности) композитов от массовой доли неорганического наполнителя. Научно-практическая значимость 1. Субмикронные частицы карбоната кальция, полученные при ультразвуковом перемешивании, перспективны в качестве контейнеров для инкапсуляции и доставки биологически активных веществ. 2. Использование ультразвука для перемешивания реакционной смеси позволяет масштабировать методику синтеза частиц карбоната кальция без потери «качества» 7 образца с возможностью получения образцов субмикронного размера с узким распределением по размерам. 3. Микрочастицы HA и карбоната кальция, поверхность которых наночастицами серебра, могут быть использованы в модифицирована качестве платформ для чувствительного детектирования сигнала гигантского комбинационного рассеяния модельного красителя. 4. Композитный материал на основе поликапролактона с управляемыми механическими свойствами за счет варьирования массовой доли микрочастиц карбоната кальция и гидроксиапатита в волокне может найти применение в качестве матрикса для тканевой инженерии или раневого покрытия. 5. Эмпирическое уравнение, полученное на основе регрессионного анализа механических свойств бинарных композитов (полимерная матрица/наполнитель), может быть использовано для прогнозирования механических характеристик композитных нетканых материалов. Достоверность полученных результатов подтверждается применением научного оборудования, которое верифицируется в соответствии с международными стандартами обеспечения единства измерений и единообразием средств измерений. Основные положения и результаты, выносимые на защиту: 1. Перемешивание с использованием ультразвукового гомогенизатора обеспечивает более равномерное распределение центров роста и приводит к образованию поликристаллических частиц ватерита наименьшего размера 0,9 ± 0,1 мкм, с малым значением дисперсии по размеру (PDI 0,02) и с наибольшим выходом (88%) по сравнению с аналогичными характеристиками, полученными при перемешивании с использованием механического перемешивания или без такового. 2. С уменьшением скорости подачи ионов кальция и увеличении концентрации этиленгликоля в реакционной смеси полиморфная модификация синтезированных частиц карбоната кальция изменяется от кальцита до ватерита, при этом сферическая форма частиц ватерита переходит в эллипсоидальную при соотношении этиленгликоль:вода 4:1 и 6:1 при низких скоростях подачи ионов кальция. 8 3. Микронные и субмикронные частицы гидроксиапатита (HА) размера 0.6±0.1 мкм с игольчатой морфологией можно получить перекристаллизацией частиц ватерита размера 0.5±0.1 мкм путем реакции ионного обмена в присутствии фосфат-ионов. 4. Механические свойства композитных нетканых материалов на основе поликапролактона зависят от массовой доли микрочастиц карбоната кальция или гидроксиапатита, при этом значения модуля Юнга и предела прочности на растяжение композитов, содержащих 7,5 мас% HA составляют 56.3 и 28.7 MПa, соответственно (что в 25 и 28 раз превышает величины для чистого полимерного волокна), а для композитов, содержащих 7,5 мас% CaCO3 21.3 и 10.4 MПa (что в 9 и 10 раз больше аналогичных величин для чистого полимера). Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на российских и международных конференциях: Международная школа для студентов и молодых ученых по оптике, лазерной физике и биофизике «Saratov Fall Meeting 2012», Россия, Саратов, 25.09-28.09 2012 г.; конкурс научных работ в рамках Международной молодежной научной школы «Cовременные биоинженерные и ядернофизические технологии в медицине». Саратовский государственный технический университет (СГТУ). 18.09.2012 г.; IV Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике (ICCCPCM 2013). 02.06 – 04.06.2013 г., Москва, Россия; V International Workshop on «Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications», Бельгия, Гент, 9.05 – 12.05 2014 г., а также на объединенных семинарах Образовательно-научного института наноструктур и биосистем и факультета нано- и биомедицинских технологий СГУ. Гранты Грант «Дистанционно управляемые наноструктурированные материалы, включающие биосенсоры и инкапсулированные биоактивные вещества» (РФФИ, № 1203-33088 мол_а_вед); грант «Дистанционно управляемые наноструктурированные системы для адресной доставки и диагностики» Правительства Российской Федерации (Договор №14.Z50.31.0004) для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального 9 образования, научных учреждениях государственных академий наук и государственных научных центрах Российской Федерации. Личный вклад диссертанта состоит в самостоятельном выполнении представленных в диссертации экспериментальных исследований и расчетов, связанных с синтезом микронных и субмикронных частиц карбоната кальция, исследованием возможности масштабирования синтеза частиц ватерита с использованием ультразвука как способа гомогенизации реакционной смеси, а также измерением и анализом механических характеристик электроформованных композитов на основе поликапролактона, содержащих различную массовую долю микрочастиц CaCO3 и HA. Постановка задач исследования и обсуждение результатов проведены под руководством профессора С.Б. Венига, профессора Д.А. Горина. При использовании результатов, полученных в соавторстве, приведены ссылки на соответствующие источники. Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах перечня, рекомендованного ВАК. Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, списка литературы, включающего (217) источников, приложений. Общий объем диссертации составляет (129) страниц, включая (45) рисунков и (19) таблиц. 10 ГЛАВА 1. СВОЙСТВА И ПОЛУЧЕНИЕ ЧАСТИЦ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ И ГИДРОКСИАПАТИТА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ КОМПОЗИТОВ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Карбонат кальция. Физические и механические cвойства Карбонат кальция (СаСО3) является одним из наиболее распространенных видов минералов на поверхности нашей планеты, существующий в виде биогенных и неорганических отложений и осадочных пород. Карбонат кальция является основной минеральной составляющей мрамора [12]. В природе карбонат кальция встречается в виде трех полиморфных модификаций: кальцит – кубической формы с ромбоэдрической кристаллической решеткой, арагонит – иглообразные кристаллы с орторомбической решеткой и ватерит – кристаллы сферической формы с гексагональной решеткой. Кальцит является наиболее стабильной кристаллической фазой CaCO3 при комнатной температуре и давлении (RT), хотя при иных условиях возможн стабилизировать другие полиморфные модификации [13]. Ватерит и арагонит - метастабильные фазы, основные формы СаСО3 существующие в организме [14]. Однако, ватерит, как ожидается, имеет высокий потенциал возможных применений благодаря его свойствам, таким как высокая удельная площадь поверхности, высокая растворимость, высокая дисперсия и низкая плотность по сравнению с другими кристаллическими фазами [1,15-16]. Значения некоторых физических свойств и механо-физических свойств карбоната кальция приведены в таблицах 1.1 и 1.2 Таблица 1.1 - Физические свойства карбоната кальция [17] Молекулярный вес pH (насыщенный раствор) Плотность после уплотнения (г/см3) Твердость по Моосу (20°C) Удельный вес (твердые фазы) 100,09 9,3 to 9,8 0,43 to 0,98 3,0 2,70- 2,71 Таблица 1.2 - Механические свойства карбоната кальция [18] Твердость (по Кнупу) 3 Мооса Модуль Юнга 69,9 ГПa Модуль сдвига 35 ГПa Модуль сжатия 98 ГПa 11 1.1.1 Кристаллическая структура карбоната кальция Кристаллическая структура трех полиморфных модификаций карбоната кальция приведена в Таблице 1.3, и схематично показана на рисунке 1.1. Все они основаны на приблизительно гексагонально упакованных подрешетках ионов кальция Са+2 со слоями карбонат-ионов CO3-2, расположенных между основными слоями Са+2. Основное различие между этими тремя структурами заключается во взаимном расположении идеальнотреугольных CO3-2 групп, как показано на рисунке 1.1. В структуре кальцита, CO3-2 подрешетка также является гексагональной, и смещена относительно Са+2 подрешетки на вектор [1/3 2/3 1/12]. Плотность кальцита 2,72 кг/дм3. Треугольные группы CO3-2 являются копланарными; их плоскости перпендикулярны оси симметрии с и повернуты на 60° от одного слоя карбоната к следующему. В результате гексагональная элементарная ячейка содержит шесть слоев СаСО3. Структура арагонита является производной гексагональной решетки никколита (NiAs), при замене мышьяка на Ca+2 и Ni на CO3-2. Однако, ни Cа+2, ни CO3-2 слои не являются действительно плоскими в структуре арагонита, равно как и индивидуальные CO3-2группы не являются копланарными. Арагонит более плотный (плотность 2,94 кг/дм3) и тяжелее, чем кальцит. Эти факторы также как и две возможных ориентации групп CO3-2 в пределах одного слоя (Рис. 1.1b), совместно снижают симметрию до орторомбической структуры, пространственной группы Pmcn. В данном случае элементарная ячейка представляет собой два слоя CaCO3 и содержит четыре формульные единицы. Ватерит устойчив при низкой температуре (ниже 10°С при 1 атм), однако он имеет более высокую растворимость в воде по сравнению с кальцитом и арагонитом [19-20]. Авторы работы [21] сообщили, что после того, как частицы были сформированы и подвергнуты нагреванию, кристаллы карбоната кальция трансформируются в более стабильную форму кальцита. 12 Кальцит Арагонит Таблица 1.3 - Кристаллическая структура карбоната кальция Элементарная ячейка Точечная группа Точечная группа +2 -2 симметрии Ca симметрии CO3 Гексагональная (z = 6) 3 32 Орторомбическая (z =4) m M Ватерит Гексагональная (z = 6) Полиморф 32 2 z = число формульных единиц в элементарной ячейке Рисунок 1.1 - Схема проекции кристаллической структуры одного слоя CaCO3 – (a) кальцит, (b) – арагонит, (c) – ватерит. Элементарные ячейки обведены пунктирными линиями [22-23] Для определения кристаллической структуры кристаллов карбоната кальция можно использовать метод дифракции рентгеновских лучей. На рисунке 1.2 представлены теоретические данные рентгено-фазового анализа из базы данных для всех трех кристаллических структур, присутствующих в карбонате кальция. В таблице 1.4 представлены величины углов дифракции полиморфов CaCO3. 13 Рисунок 1.2 – Характеристичные дифракционные пики полиморфов карбоната кальция Таблица 1.4 - Величины дифракционных углов для различных полиморфов CaCO3 Кальцит 32.64º Ватерит 24.78 º Арагонит 26.95 º 1.1.2 Применение карбоната кальция Применение СаСО3 частиц определяется набором требуемых свойств, таких как морфология, структура, размер, удельная поверхность, пористость и др. Одним из наиболее важных параметров является морфология частиц [24]. Частицы карбоната кальция находят широкое применение в качестве наполнителей для изготовления бумаги, покрытий, пластмасс и др. Его основной функцией в бумажной промышленности является снижение затрат производства и увеличение яркости бумаги. Ниже приведены некоторые основные функции карбоната кальция как наполнителя [2526]: • улучшение качества печати (гладкость, адсорбционные свойства), • внешний вид (белизна, яркость), • стабильность размеров, 14 • текстура В производстве пластмасс карбонат кальция используется в качестве наполнителя в полимерных композитах на основе поливинилхлорида, ненасыщенных полиэфиров, полипропилена и полиэтилена [27]. В покрытиях, карбонат кальция используется в качестве основного наполнителя. Непрозрачность покрытий зависит от степени помола частиц и их распределения по размерам. Кроме того, карбонат кальция повышает свойства покрытия, такие как устойчивость к атмосферным явлениям, антикоррозийную стойкость, реологические свойства, абразивность. 1.1.3 Получение карбоната кальция Есть два основных химических метода синтеза CaCO3: твердофазный и химического соосаждения. Первый заключается в механической активации твердофазных химических реакций замещения за счет совмещения механического измельчения смеси реагентов с последующим нагревом. Однако в результате подобного синтеза образуются полидисперсные частицы неправильной формы, что ограничивает применение данного подхода. В то же время существует много вариантов проведения химическиго осаждения кристаллов CaCO3 из реакционного раствора, содержащего ионы кальция и карбонатионы, позволяющих контролировать размер и повышать качество получаемых частиц путем изменения физических и технологических параметров синтеза [28]. В последние годы были разработаны эффективные методы синтеза, позволяющие получать частицы ватерита размером от 430 нм [8] до 5 мкм [7]. Изменение соотношения солей в процессе синтеза карбоната кальция открыло возможность формирования частиц эллиптической и звездчатой формы в том же диапазоне размеров [29,30]. Гомогенное перемешивание реакционной смеси обеспечивает равномерное распределение центров роста и приводит к образованию однородных по параметрам частиц. Однако, существующие на данный момент методы синтеза ватерита, как правило, не могут обеспечить формирование частиц с узким распределением по размерам. Кроме того, при попытке масштабирования синтеза теряется «качество» карбоната кальция (дисперсность, пористость и т.д.) за счет гидродинамических процессов в реакционной смеси. При механическом перемешивания с помощью магнитной мешалки на параметры получаемых частиц оказывают влияние 15 многие факторы, такие как скорость перемешивания [19], особенности дна стеклянной посуды, в которой протекает синтез, форма и размер магнитного «якоря» [20, 22]. Для решения проблем, описанных выше, в текущей работе мы предложили использовать ультразвук для перемешивания реакционной смеси при синтезе частиц ватерита. Изменение параметров ультразвукового воздействия может помочь контролировать ход процессов осаждения и кристаллизации [31-33]. Распространение ультразвука в жидкой среде является движущей силой для переноса массы и может инициировать процесс кавитации. Мощность ультразвука оказывает влияние на первичную нуклеацию в ходе процесса кристаллизации, которое выражается в ускорении нуклеации и снижении агрегации центров роста, что уменьшает размер кристалла и общее распределение по размерам и ускоряет осаждение кристаллов [34]. Было исследовано влияние мощности и времени ультразвуковой обработки на размер кристаллов арагонита [35], кальцита [36], первичных зародышей карбоната кальция [37-39]. Для ватерита практические отсутствуют исследования в данном направлении. Те немногие, что имеются, показывают, что формируемые частицы имеют большие размеры (более 2 мкм) и неоднородны по форме и размеру [38,40-41]. В данной работе мы исследовали влияние ультразвука при синтезе карбоната кальция на размер, дисперсность, кристаллографическую фазу образованных частиц и массовый выход CaCO3, изучали возможность масштабирования синтеза, а также возможность инкапсуляции и эффективность загрузки частиц ватерита модельными веществами: в качестве высокомолекулярного вещества был выбран бычий сывороточный альбумин, маркированный ТРИТЦ (мол. вес≈66 кДа), а в качестве низкомолекулярного вещества был взят краситель родамин 6Ж (мол. вес = 0,479 кДа). Кроме того, недавно было обнаружено, что сферические пористые кристаллы карбоната кальция (ватерит) имеют высокий потенциал в качестве универсальной наноили микронной системы доставки лекарственного средства вследствие биосовместимости, высокой загрузочной емкости и способности сохранять свойства биологически активных соединений [42,43]. Это вызвало новый всплеск исследовательского интереса к карбонату кальция, который разделился на два направления. 16 Первое посвящено механизму формирования ватерита, кальцита и арагонита, которое стимулируется новыми возможностями нанотехнологических экспериментальных методов, а также возможностью компьютерного моделирования процесса образования кристаллов [44-48]. Второе связано с разработкой надежных методов синтеза субмикронных пористых кристаллов ватерита, которые могут найти применение в качестве средств доставки лекарств. Во втором случае главной проблемой является нахождение условий синтеза кристаллов ватерита, а затем, их стабилизация для предотвращения их быстрой (порядка 20 часов) перекристаллизации в термодинамически более стабильный кальцит. Для этого необходимо рассмотреть, принять во внимание и учесть влияние термодинамических и кинетических факторов, которые регулируют процесс кристаллизации (зарождения и последующего роста нанокристаллов) в водной среде. Кроме того, также необходимо учесть, что природа растворителя является важным параметром, влияющим на диэлектрическую проницаемость среды, сольватацию ионов, пересыщение, кинетику кристаллизации, рост кристаллов и растворимость продуктов реакции. В этой связи особое внимание было уделено нескольким работам, в которых описано осаждение ватерита в смесях растворителей, например, воды с этиленгликолем (EG). Этиленгликоль влияет на скорость осаждения ватерита и способствует его стабилизации, предотвращая его преобразование в кальцит [49]. Было предложено, что адсорбция EG снижает поверхностную энергию частиц ватерита, тем самым придавая ему термодинамическую стабильность. Авторы считают, что поверхностный слой влияет на структуру ночастицы также в связи с явлением поверхностного натяжения [49, 50]. При использовании системы растворителей этиленгликоль-вода исследователи учли такие факторы, как начальные концентрации солей, температура, соотношение вода/EG, скорость перемешивания и время реакции [42, 49, 51-55]. Условия формирования и параметры формируемых структур карбоната кальция (аморфного карбоната кальция, ватерита, кальцита и арагонита) [30,42, 49, 51-54], а также различные морфологии ватерита [55] были определены и описаны в указаных работах. Настоящее исследование посвящено комплексному исследованию влияния концентрации этиленгликоля (EG) в качестве органического растворителя, а также концентрации 17 реагентов, скорости подачи ионов кальция на размер и процентное содержание сферических кристаллов карбоната кальция в осадке. 1.2 Гидроксиапатит. Физические и механические cвойства Гидроксиапатит (HA) представляет собой неорганическое соединение, химический состав которого аналогичен формуле (Cа10(PO4)6(OH)2) [56-57]. Гидроксильные группы гидроксиапатита могут быть заменены на фторид или хлорид, что приводит к фторапатиту или хлорапатиту. Гидроксиапатит кристаллизуется в гексагональной сингонии и имеет удельный вес 3,08 [58]. Чистый гидроксиапатит представляет собой порошок белого цвета. Природные апатиты, однако, могут иметь коричневые, желтые или зеленые окраски [58]. В человеческом организме, гидроксипапатит является составляющим компонентом зубов и костей. Таким образом, он широко используется в качестве наполнителя в случае замены ампутированной кости или в качестве покрытия для ускорения срастания кости и протезных имплантатов. В дополнение к сказанному, гидроксиапатит нетоксичен и биосовместим, то есть не распознается организмом как инородный материал и, что самое главное, он проявляет биологически активные свойства и интегрируется в живую ткань аналогично процессам, происходящим при реконструкции здоровой кости в естественных условиях. Известно также о его остеокондуктивных свойствах, то есть способности выступать в качестве матрицы для образования новой костной ткани, а также обеспечения адгезии и пролиферации остеобластов [59]. Гидроксиапатит обладает следующими свойствами [60,61]: • Биоактивность - возможность естественной интеграции в костные структуры, а также в поддерживающие структуры для восстановления костной ткани. Биосовместимость – поверхность HА биосовместима с несколькими типами клеток, таких как макрофаги, фибробласты, остеобласты и др. Клетки растворяют кристаллы HА внутриклеточно путем фагоцитоза. Материал HА допускает пролиферацию фибробластов, остеобластов и других клеток костной ткани. Клетки не способны отличить HА от костной поверхности, что указывает на значительное сходство в химии и морфологии поверхности этих материалов. 18 • Остеокондуктивность - HА позволяет формировать костную ткань на своей поверхности, выступая в качестве поддерживающей матрицы или скаффолда. • Гидроксиапатит разлагается при температуре 800-1200°С в зависимости от его стехиометрии [62]. В таблицах 1.5 и 1.6 представлены опубликованные значения механических и физических свойств синтетического HА. В числе основных механических характеристик гидроксиапатита представлены прочность на изгиб, прочность на растяжение, вязкость на излом. Таблица 1.5 - Физические свойства синтетического гидроксиапатита [63 - 67] Физические свойства Значения Плотность 3,00 – 3,219 г/см3 Пористость 0,1 - 3 % Параметры кристаллической решетки ( ±0.003 нм) постоянная решетки a 9,432 – 0,9418 нм постоянная решетки b Индекс кристалличности 6,881 – 0,6884 нм 33 – 37 Таблица 1.6. Механические свойства синтетического гидроксиапатита [63, 64] Механические свойства Единицы измерения Предел прочности при 38 - 48 МПа растяжении Модуль Юнга 7 - 13 ГПа Прочность на изгиб 100 - 120 МПа Прочность на сжатие 350 - 450 МПа Модуль Юнга плотного HА варьируется от 35 до 120 ГПа [68], в зависимости от остаточной пористости и примесей. Модуль Юнга на изгиб составляет от 44 до 88 ГПа. Твердость по Виккерсу для HА составляет от 3 до 7 ГПа. Износостойкость и коэффициент трения для гидроксиапатита сопоставимы с зубной эмалью. 19 1.2.1 Кристаллическая структура гидроксиапатита Структура гидроксиапатита (Cа10(PO4)6(OH)2) состоит из кальция, окруженного фосфатными и гидроксильными группами. Он кристаллизуется в гексагональную систему со следующими кристаллографическими параметрами [69]: a = 9.418 Å, c = 6.881 Å, b = 2a Å. Кристаллографическая структура HА состоит из квази-компактной упаковки фосфатных групп, которые образуют два типа туннелей, параллельных оси С, на которой локализованы ионы Са2+. Одной из основных характеристик структур апатитов является то, что она позволяет обеспечить большое количество заместителей, которые не изменяют кристаллографическую структуру [70]. Рисунок 1.3 - Моноклинная структура гидроксиапатита (P21/b). Атомы P, O и Ca не являются необходимыми для данной схемы и были опущены для ясности. Атомы Ca расположены в вершинах треугольников вокруг каждой гидроксильной группы [18] 1.2.2 Получение гидроксиапатита Существует несколько методов, которые были разработаны для синтеза HA, которые могут быть классифицированы как твердофазные реакции и химические процессы, протекающие в растворе. К последним можно отнести осаждение [71, 72], зольгель синтез [73-75], гидротермальные реакции [76-78], синтез в эмульсиях [79] и механохимический синтез [80-82]. 1.2.2.1 Метод осаждения кристаллов гидроксиапатита Самый популярный и широко исследованный метод синтеза HА - метод осаждения в растворе. Этот метод находит широкое применение для синтеза гидроксиапатита в отличие от других методов, так как позволяет получать относительно большое количество HА в отсутствие органических растворителей при разумных затратах [83, 84]. В качестве 20 исходных материалов для этой реакции были выбраны гидроксид кальция Са(ОН)2 и ортофосфорная кислота Н3РО4 (уравнение 1) [84]. В результате реакции образуется искомый продукт HА и вода, собственно реакция проходит без образования побочных продуктов. 10 Ca(OH)2 + 6 H3PO4 → Ca10(PO4)6(OH)2 + 18H2O………………………………..…….(1) Размер, форма и площадь поверхности частиц HА, получаемых путем этой реакции очень чувствительны к скорости добавления ортофосфорной кислоты и температуре. Скорость добавления ортофосфорной кислоты оказывает влияние на рН реакционной смеси, а также на стабильность суспензии. Температура реакции определяет, будут ли полученные кристаллы HА моно- или поликристаллическими. Отмечалось, что HА частицы, синтезированные при низкой температуре (<60°С) являются монокристаллическими [85]. Также были предложены [83] еще две реакции синтеза HА по методике осаждения. В одной из них, исходными веществами служат фосфат аммония (NH4)2HPO4] и Са(ОН)2 (уравнение (2)). Во второй реакции - дигидрофосфат кальция [Са(H2PO4) 2H2O] и Са(ОН)2 (уравнение 3). pH контролировали в обоих случаях. В первой реакции, температура синтеза HА поддерживалась на уровне 40°С, а во второй - синтез осуществляли при комнатной температуре. Более высокая температура была использована для повышения кинетики реакции образования HА и растворимости Са (ОН)2. 10 Ca(OH)2 + 6 (NH4)2.HPO4 → Ca10(PO4)6(OH)2 + 6H2O + 12 NH4OH ………………...(2) 7 Ca(OH)2 + 3 Ca(H2PO4)2.H2O → Ca10(PO4)6(OH)2 +15 H2O ……………………..…….(3) Синтетические наночастицы HА могут быть получены методом осаждения при перемешивании при комнатной температуре и рН 10, как указано в работе [86]. Н3РО4 добавляли к Ca(OH)2 до соотношения Са/Р = 1,67. Кристаллизация начинается после добавления гидроксида аммония. Рост кристаллов проходил в течение 24 часов и далее проводили спекание при 1000 ° С в течение 1 часа. В работе [87] была предложена другая возможность синтеза гидроксиапатита, которая включает в себя химическую реакцию обмена в водной среде нитрата кальция [Са (NO3)2.4H2O] с (NH4)2HPO4. Размер кристаллов HА, синтезированных с помощью этой реакции можно контролировать путем изменения времени реакции и температуры [88]. В частности, чтобы получить HА с размером зерен <100 нм, раствор требует непрерывного 21 перемешивания при комнатной температуре в течение 24 часов [85]. Авторы [89] модифицировали методику гомогенного осаждения и использовали следующую реакцию (уравнение 4): Ca(EDTA)2- + 3/5HPO42- + 2/5H2O →1/10Ca10(PO4)6(OH)2 + HEDTA3- + 1/5 OH- (4) Модификация состояла в добавлении мочевины для осаждения вместо NaOH, что привело к получению более однородного осадка и дальнейшей его трансформации в HА благодаря изменению рН вследствие гидролиза мочевины. Температура реакции варьировалась от 125°С до 160°С. [53] Выбор эффективного метода перемешивания является главной проблемой химических методов осаждения [90, 91]. Были разработаны различные методы перемешивания для предотвращения агломерации/агрегации частиц для получения ультратонких осадков гидроксиапатита. Поскольку функция мешалки заключается в перемешивании смеси для ускорения реакции или улучшении их гомогенности, от способа перемешивания зависит размер частиц и их дисперсность. Как правило, для синтеза HA, используют три способа перемешивания: механический, магнитный и ультразвуковой. В предыдущих исследованиях для осаждения гидроксиапатита были использованы: механический [92-96] и магнитный [94, 97-98] способы перемешивания. 1.2.2.2 Ультразвуковая гомогенизация В последних исследованиях различные методы ультразвуковой гомогенизации были использованы для получения порошка HA [99, 100]. Этот подход включает растворение и осаждение твердых веществ через уменьшение размера частиц и активацию их поверхности интенсивным перемешиванием. Ультразвук может помочь контролировать ход этих процессов, подобный подход называется сонокристаллизацией [101]. Положительные эффекты, полученные при сонокристаллизации обычно приписывают эффектам, вызванным кавитацией, которая происходит при воздействии ультразвука высокой мощности на жидкость. Кавитация - взаимодействие акустического давления с полостями (микропузырьками), вызванными разрывом жидкости в разреженной части звуковой волны. Микроскопические пузырьки растут и коллапсируют под действием меняющегося поля давления внутри обрабатываемой жидкости. В ходе этого процесса может 22 происходить несколько явлений - образование свободных радикалов, образование ударных волн и микроструй, создание локальных горячих точек высокого давления и температуры, микро- и макроперемешивание и повышение объемной температуры [102]. Некоторые авторы уже изучали влияние ультразвука на процесс осаждения карбоната кальция из раствора [32, 35, 31, 37, 103-106], но описанные ими результаты неоднозначны. Утверждалось, что CaCO3 может кристаллизоваться на нанопузырьках, производимых при воздействии высокочастотного ультразвука (в диапазоне МГц), в результате чего получаются полые сферические частицы [39]. Эти условия более не были воспроизведены в настоящее время большая часть исследований проводится при низких ультразвуковых частотах (кГц). Авторы [103] сообщили о снижении скорости роста кристаллов в присутствии ультразвукового облучения. Однако, не отмечалось влияние этого воздействия на кристаллическую форму, морфологию или размер образованных кристаллов карбоната кальция. Основными преимуществами использования ультразвука при производстве высокодисперсных суспензий частиц являются: (1) увеличение скорости реакции, (2) уменьшение требуемого времени на обработку (3) общее улучшение эффективности использования энергии [107]. 1.2.2.3 Синтез золь-гель методом Золь-гель материалы могут быть изготовлены с помощью трех различных методов, а именно: гелеобразования коллоидных порошков, сверхкритической сушки и контроля гидролиза и конденсации прекурсоров, включая стадию сушки при температуре окружающей среды [108, 109]. Золь-гель синтез обеспечивает улучшение контроля за формированием конкретных фаз и их чистотой, при этом синтез HA происходит при более низких температурах по сравнению с гидротермальными реакциями. Недостатками золь-гель метода являются трудности гидролиза фосфата и высокая стоимость исходных химических материалов. [110]. По сравнению с другими низкотемпературными методами, техника золь-гель имеет ограниченную масштабируемость вследствие чувствительности процесса. Первый этап 23 этого метода заключается в формировании «золя» - дисперсии твердых частиц (коллоида) в жидкой среде. Исходные материалы механически смешивают в растворителе при значении рН, которое предотвращает осаждение. Как правило, используются алкоксиды металлов (например, тетраэтоксисилан для добавления кремния) и соли металлов (например, нитрат кальция, для получения кальция, фосфат аммония, для добавления фосфора). Для связывания мономерных звеньев и образования связей M-O-M внутри золя применяют реакции гидролиза и поликонденсации, что вызывает увеличение вязкости этот процесс называется гелеобразованием. В результате получается «гель», определением которого является двухфазная система, состоящая из твердой и жидкой (интерстициальной) фазы. Следующим шагом необходимо удалить жидкую фазу с помощью процесса сушки; Это, как правило, сопровождается значительной усадкой и уплотнением. Чтобы избежать образования трещин в получаемой 3-D монолитной структуре необходимо «состарить» гель перед сушкой. С другой стороны образование трещин может быть использовано для создания тонкой пудры золя-геля для дальнейшего гранулирования или формования. Наконец, используется специфический протокол спекания; на практике этот шаг может занять много времени. Авторы [110] исследовали возможность получения порошков HА «зольгель» методом, за счет упрощения некоторых стадий и использования более дешевых исходных химических веществ. 1.2.2.4 Гидротермальные методы Гидротермальные процессы, который работают при высокой температуре и высоком давлении, также являются одним из широко используемых методов синтеза гидроксиапатита. Эти процессы являются не только экологически безопасными, но также позволяют контролировать химический состав и стехиометрию получаемого продукта [111]. Гидротермальный синтез был использован для трансформации суспензий, растворов, гелей в кристаллическую фазу при мягких условиях реакции, как правило, при температуре ниже 350°С. Типичные порошки HА, синтезированные этим способом, состоят из игольчатых частиц 20 - 40 нм в диаметре и 100-160 нм в длину. 24 Мотивацией для синтеза HА с использованием гидротермального метода служит необходимость получения наноразмерных частиц для проникновения внутрь дентиновых канальцев для снижения гиперчувствительности зубов, что является проблемой для миллионов детей и взрослых во всем мире. Однофазные кристаллиты гидроксиапатита, имеющие форму стержней, были синтезированы гидротермальным методом при 200°С под давлением насыщенного пара воды в течение 24 ч путем смешивания Ca (NO3)2 4H2O и (NH4)2HPO4 в дистиллированной воде. Размер кристаллитов составил 100-600 нм в длину и 10-60 нм в диаметре. Однако предварительные результаты показывали, что для инфильтрации в дентиновые канальцы предпочтительннее сферические частицы [112]. Гидротермальные методы позволяют получать кристаллы гидроксиапатита с высокой степенью кристалличности, однако, с широким распределением по размерам [113]. Выход таких синтезов, близкий к 100%, относительно низкая стоимость реагентов и малые временные затраты на протекание реакции являются преимуществами гидротермального синтеза. Однако, в действительности масштабируемость этого метода ограничена размером реакционного сосуда. 1.2.3 Твердофазные методы В литературе мало исследований, посвященных твердофазному синтезу HА. Эта процедура основана на диффузии ионов через порошок сырья, для чего требуется относительно малоэффективная обработка при высокой температуре (<1250°C) чтобы инициировать реакцию. Для обеспечения однородности и достаточно малых размеров частиц, исходные материалы должны быть в первую очередь перемолоты в шаровой мельнице в течение приблизительно 16 часов. Обычно источники кальция и фосфата смешивают с добавками, например, диоксида кремния, оксида алюминия, связующим, например, ПВА, и органическим растворителем с образованием суспензии для помола, которую затем высушивают. Гранулы могут быть образованы из полученного порошка с использованием горячего или холодного прессования при давлении до 135 МПа. Наконец, для кристаллизации продукта проводят спекание при температуре до 1250°С. После заключительного спекания было предложено повторно провести дополнительное дробление [114] с последующим дополнительным прессованием и спеканием при 1250°С 25 для улучшения кристалличности и уменьшения размера зерна (7-8 мкм) и размера кристалла (50-70 нм). Часто твердотельный синтез HА включает смешение порошков β-ТСР (фосфат кальция) и Ca(OH)2 в определенных соотношениях (3: 0-3.4) в воде, мокрого помола, затем полученную смесь формуют, сушат и спекают [90] (см уравнение 5). 3Ca3(PO4)2(β-TCP)+Ca10(OH)2→Ca10(PO4)6(OH)2………………………………………………………..….(5) Высокая температура спекания не менее 1000°С в течение 8 часов была использована для достижения фазы чистого HA с высокой степенью кристалличности [92]. Было установлено, что важное значение для формирования чистого HА имеют соотношение β -TCP: Са(ОН)2, температура спекания, а агломерация частиц зависит от рН [90]. Трансформация агломератов HА в β-ТСР наблюдалось для порошка HA, приготовленного с помощью этого метода [115, 116]. Таблица 1.7 - Сравнение некоторых методов синтеза HА [117] Метод Преимущества Твердофазный Простота выполнения, низкая метод стоимость; формирование стехиометрического HА Осаждение Можно получать наночастицы HА; высокая экономическая и экологическая эффективность Этот процесс очень прост в использовании. Препаративная реакция и ее продукты могут быть легко регулированы. Недостатки Нужна высокая температура спекания; большая длительность процесса Трудность получения стехиометрического HА; нужно высокое значение pH для предотвращения образования HА с недостатком Ca; требуются высокие температуры спекания для образования кристаллического HА; результат очень чувствителен к условиям реакции (pH, скорость смешивания, температура сушки и др) Золь-гель Можно получать наноHА; Трудность гидролиза фосфата, просиходит равномерное дорогие прекурсоры молекулярное перемешивание; требуются низкие температуры реакции, больший контроль за чистотой фазы Гидротермальный Получается кристаллический Возможна агломерация порошка синтез однородный порошок HА; можно HА; для обработки нужны получать нано HA высокие давления 26 1.2.4 Применение гидроксиапатита Применение гидроксиапатита включает поверхностное покрытие для ортопедических и стоматологических металлических имплантов, где HА способствует процессу регенерации, остеоинтеграции и снижения высвобождения ионов металла, действуя как физический барьер; биокерамических заготовок для замены костных фрагментов, устранения дефектов периодонта; а также в качестве носителя биологически активных веществ для контролируемого высвобождения лекарственного средства с многообещающим потенциалом и подавления воспалительных процессов [118-119]. Как уже отмечалось, одним из основных преимуществ этих минеральных структур является химический состав, близкий к неорганической фазе твердой ткани [2, 120], включая кости [3] и зубы. Эта функция дает возможность имплантировать кристаллы CaCO3 и HA в поврежденные области человеческого организма [2] для восстановления костей [4]. Недавно было показано, что игольчатая морфология частиц HА обеспечивает улучшение механических и биологических свойств нанокомпозитных матриксов, применяемых для регенерации костной ткани [5]. С другой стороны, из-за их специфической морфологии поверхности, эти частицы являются привлекательным кандидатом для создания средств доставки с пролонгированным высвобождением модельных и терапевтических молекул [6, 121]. Медленное высвобождение антибиотиков и противоопухолевых препаратов из частиц HA было показано в культуре клеток [122] и в мышцах животных [120, 123]. Микроиглы неорганических пористых материалов, в том числе цеолитов [124], кремния [125, 126] и фосфатов кальция [124] были предложены в качестве трансдермальных систем доставки лекарственных средств. Небольшие размеры микроигл и их способность проникать в кожу неинвазивным способом сводит к минимуму риск заражения и обеспечивает безболезненную инъекцию [127]. Пористые частицы CaCO3 и HA могут также предотвратить деградацию загруженных в них молекул [128]. Для гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), пористые структуры на основе CaCO3 или HA, функционализованные наночастицами благородных металлов, могут явиться новой концепцией сенсоров, обеспечивающих прямое обнаружение молекул без использования меток [129]. Микроразмерные сферы на основе полистирола, диоксида кремния, и других материалов, функционализированные золотыми (или серебряными) наночастицами пригодны также для выполнения ГКР микроспектроскопии 27 без использования меток [130]. Тем не менее, некоторые стадии предварительной модификации (покрытие аминосиланом, полимерами и др.) необходимы для обработки гладкой поверхности указанных сферических частиц, что может вносить свой вклад в сигнал ГКР. Поэтому шероховатая поверхность потенциально может обеспечить прямую функционализацию микрочастицы наночастицами благородных металлов. В силу своей пористости CaCO3 (или способны HА) существенно повышать сигнал комбинационного рассеяния и, соответственно, эффективность обнаружения. Кроме того, способность пористых частиц включать в себя вещества может являться основной функцией средств доставки и высвобождения биологически активных молекул. Данная работа направлена на синтез неорганических частиц карбоната кальция или гидроксиапатита микронных и субмикронных размеров с развитой поверхностью. Синтез частиц СаСО3 в присутствии этиленгликоля позволяет управлять размером частиц. Частицы гидроксиапатита были синтезированы с использованием CaCO3 темплатов путем ионообменной реакции в присутствии фосфат-ионов. 1.3 Композиты, гидроксиапатита содержащие наночастицы карбоната кальция или Композитные материалы состоят, по крайней мере, из двух идентифицированных фаз, разделенных границей или границами раздела. Свойства композитов определяются несколькими параметрами, например формой наполнителя, размером и его распределением, свойствами и объемной фракцией наполнителя, свойствами матрицы (например, молекулярной массой), распределением частиц наполнителя в полимерной матрице и состоянием границы раздела фаз наполнитель/матрица. В случае биокомпозитов, необходимо учитывать такие факторы как биосовместимость наполнителя и матрицы, скорость деградации матрицы и ее нетоксичность [131]. Форма и распределение по размерам частиц наполнителя, а также его массовая доля оказывают существенное влияние на механические свойства композита. Основной задачей дизайна каркасов для инжиниринга биотканей является производство идеальной структуры, которая может заменить естественный клеточный каркас до тех пор, пока клетки не смогут вновь заселиться на нее и синтезировать новую природную матрицу. Электроформование - сравнительно недавно предложенный многообещающий метод для производства in vitro волокнистых каркасов для инжиниринга тканей, которые 28 позволяют варьировать диаметр волокна от нескольких микрон до десятков нм [132]. Большое число исследователей сообщают, что включение карбоната кальция или фосфатов кальция, таких как гидроксиапатит также помогало улучшить пролиферацию и дифференциацию остеобластов [123, 134-136]. 1.3.1. Факторы, влияющие на эффективность взаимодействия матрицы и наполнителя Сила взаимодействия на границе раздела фаз между наполнителем и полимером является важным фактором создания композитов гидроксиапатит/полимер. Недостаток адгезии между двумя фазами имеет результатом ухудшение механических свойств, в особенности прочности на растяжение. Смачиваемость не менее важна при соединении и сцеплении двух материалов (например, поверхности наполнителя и полимера), и зависит от гидрофобности или полярности наполнителя и поверхностных функциональных групп полимера. Гидрофильность относится к способности молекул вещества взаимодействовать с водой посредством водородных связей, в то время как гидрофобные вещества взаимодействуют между собой и другими веществами посредством сил Ван дер Ваальса и не склонны к формированию водородных связей. Рисунок 1.4. Схематическая иллюстрация контактного угла для (а) не смачиваемой системы, и (b) смачиваемой системы Смачиваемость зависит от энергии границы раздела фаз (поверхностного натяжения) которая также как и полная энергия стремится к минимуму. Степень смачиваемости описывается с помощью контактного угла θc, -угол, при котором граница раздела фаз жидкость - газ γLG встречается с границой раздела фаз твердое тело - жидкость γSL (Рис.1.4). Если контактный угол меньше 90 (Рис.1.4b), 29 жидкость будет растекаться, чтобы покрыть большую площадь поверхности и, таким образом, смачиваемая поверхность определяется как гидрофильная. Контактный угол 90 и выше, обычно характеризует поверхность, как несмачиваемую. Для количественного определения смачиваемости рассчитывают параметр S согласно уравнению (6) [133]: S = γSG _ (γSL + γLG ) ……………………………………………………..…………………. (6) Если S>0, жидкость смачивает поверхность полностью, когда S<0 это означает частичное смачивание. 1.3.2 Композиты гидроксиапатит/полимерная матрица Керамика на основе гидроксиапатита широко применяется, в качестве заменителей кости [137], так как его химический состав близок к минеральной фазе костей. Это порождает интерес к разработке материалов, используемых для лечения и восстановления костей [138]. Так авторами [139] методом элетроформования были получены гибридные мембраны полимолочная кислота/гидрооксиапатит и изучено влияние наполнителя на механические свойства композита. Авторы наблюдали наночастицы гидроксиапатита, которые были диспергированы в полимолочной кислоте (PLLA), и взаимодействовали с полимерной матрицей за счет образования водородных связей, что приводило к усилению поверхностного связывания и улучшению механических свойств (см. таблицу 1.8), а именно увеличению предела прочности на разрыв и повышению модуля упругости гибридной мембраны. Рост и адгезия клеток на PLLA/HA гибридной мембране были лучше в сравнении с чистой PLLA мембраной, что доказывает, что PLLA/HA гибридная мембрана может являться перспективным многообещающим биоматериалом для регенерации костной ткани. Таблица 1.8 - Механические свойства PLLA и PLLA/HA гибридной мембраны Волокно Предел прочности на Модуль упругости Толщина, мкм разрыв (МПа) (МПа) PLLA 12±2 1.4±0.11 0.040±0.005 PLLA/HA 118±10 2.86±0.24 0.040±0.005 Биодеградируемая каркасная система была сформирована [140], используя различные соотношения гидрооксиапатита (HА), смешанного с синтетическим полимером 30 поликапролактоном и природным полимером - желатином. Было исследовано влияние концентрации частиц гидрооксиапатита на механическое поведение нанокомпозитного материала, которое может объясняться межфазной адгезией между HА частицами и полимерной смесью. Результаты показали, что увеличение содержания гидрооксиапатита в полимерной смеси улучшает механические свойства волокна. Предел прочности на разрыв полученной мембраны увеличивался от 1,4 ± 0,2 до 1,8 ± 0,1, 3,2 ± 0,2, и 3,7 ± 0,2 MПа при увеличении концентрации загруженного HА от 0 до 10, 30, и 50%, соответственно. 1.3.3 Композиты карбонат кальция/полимерная матрица Карбонат кальция является одним из наиболее распространенных и недорогих неорганических наполнителей, который используется для создания нанокомпозитов. Наноразмерный порошок карбоната кальция высокой степени очистки имеет хороший потенциал применения в качестве функционального наполнителя в полимерных системах на основе полипропилена, поливинилхлорида, полиэтилентерефталата, которые производятся в настоящее время. Обычной практикой является покрытие поверхности наноразмерного порошка карбоната кальция жирными кислотами, например стеариновой кислотой, для снижения адсорбции влаги и агрегации частиц, и в то же время для диспергирования полярного наполнителя при допировании неполярного полимерного расплава [141]. Исследования армирующего влияния нано- и микроразмерного карбоната кальция проводились в различных полимерных матрицах, таких как полиэтилен высокой плотности (HDPE), нейлон, полипропилен (PP), полилактид, акрилонитрилбутадиенстирол (ABS), термопластичный полиуретан (TPU). Показано, что использование частиц карбоната кальция улучшает механические свойства и поверхностную гладкость нанокомпозитов [142-145]. Например, авторы [146] исследовали влияние добавок частиц карбоната кальция на механические, термические и морфологические свойства композита поликапролактон/хитозан. Как проиллюстрировано в таблице 1.9, при увеличении содержания карбоната кальция увеличивается модуль упругости, что является результатом взаимодействия между полимером и наполнителем вследствие большой площади раздела фаз между частицами. 31 Таблица 1.9 - Упругие свойства композита поликапролактон/хитозан с различным содержанием карбоната кальция Содержание CaCO3 в PCL/хитозан Предел прочности на Модуль упругости, композите, мас. % разрыв (МПа) (МПа) 0 15,05 ± 0,84 160,26 ± 4,15 0.5 17,31 ± 0.92 190,58 ± 3,20 1 20,18 ± 0,96 214,91 ± 3,53 3 14,65 ± 0,73 231,80 ± 3,89 5 12,16 ± 0,67 247,21 ± 5,36 7 9,18 ± 0,54 278,60 ± 4,53 Увеличение содержания карбоната кальция повышает предел прочности на разрыв и достигает максимума при 1 % массовой доле частиц карбоната кальция, вследствие хорошей диспергируемости порошка в матрице, что приводит к выраженному эффекту армирования. Действуя подобно стабилизирующим агентам, частицы усиливают межфазную адгезию. При последующем увеличении содержания частиц карбоната кальция предел прочности на разрыв постепенно уменьшается в результате агломерации частиц наполнителя. 1.4 Факторы, влияющие на механические свойства волокнистых материалов Механические свойства материалов, полученных методом электроформования, являются очень важными, так как именно от них будет зависеть область применения полученного материала, например для поддержания роста и миграции клеток в каркасах для биоинженерии. Были проведены исследования влияния состава полимеров и технологических параметров, характеризующих процесс получения волокон, для улучшения их механических свойств [147-150]. Согласно проведенным исследованиям, механические свойства нетканых материалов, полученных методом электроформования, сильно зависят от ориентации волокон и связей между ними [151]. 1.4.1 Влияние диаметра волокна Было изучено влияние диаметра волокна на модуль Юнга, значение предела прочности на разрыв, для чего были протестированы несколько волокон на основе 32 поликапролактона различного диаметра [152, 153]. Полученные результаты представлены в таблице 1.10, из которых видно, что предел прочности на разрыв для волокон на основе поликапролактона уменьшается с увеличением их диаметра [152]. Модуль Юнга также показывает подобную тенденцию с уменьшением диаметра волокна. Снижение диаметра волокон повышает степень кристалличности и молекулярной ориентации, которая объясняет рост прочности на растяжение для волокон меньшего диаметра. Таблица 1.10 - Механические характеристики волокон на основе капролактона, полученных методом электроформования Номер образца Напряжение текучести, МПа Предел прочности растяжение МПа 1 2 3 4 286 369 119 75 39 17 13 6 на Толщина, мкм 1.5 2.2 3.4 4.4 Подобные исследования влияния диаметра на механические свойства были проведены для волокон на основе нейлона 6 и ориентированного нейлона 6, полученных методом электроформования. Показано, что ориентированные волокнистые материалы демонстрируют более высокий модуль Юнга, и предел прочности на разрыв, по сравнению с неориентированными волокнистыми материалами. Это происходит в следствии того, что эти два вида нановолокон имеют характеристично разные реакции на растяжение, что является результатом разных механизмов разрушения, что было подтверждено данными сканирующей электронной микроскопии [154]. Таблица 1.11 - Модуль Юнга и предел прочности на разрыв для ориентированных и неориентированных материалов на основе нейлона 6, соответственно Обр азец Ориентиров анный Нейлон 6 Нетканный нейлон 6 (неориентир ованный ) Модуль Юнга ориентирован ного нейлона 6 Модуль Юнга неориентирова нного нейлона 6 1 2 3 4 180 ±12 nm 213 ± 15 nm 257 ± 15 nm 278 ± 16 nm 82 ±6 93 ±5 95 ±4 108 ±11 120 420 880 1100 40 45 48 39 33 Предел проч. на разрыв для ориент. волокон 12 17 44 52 Предел. проч на разрыв для неориент. волокон 5 10 6 4 Данные о механических свойствах, представленные в таблице 1.11 также позволили сделать вывод о том, что для упорядоченных волокон при увеличении диаметра волокна, модуль Юнга также увеличивается. Возможных причины этого две: 1) чтобы иметь такую же площадь сечения, требуется большее число более тонких волокон и это увеличивает шанс встретить дефектное волокно, которое может быть причиной более легкого разрыва; 2) неидеальная ориентация, то есть большее число волокон малого диаметра имеет больше шансов быть неориентированными по отношению к направлению растяжения, таким образом, в целом они имеют меньшее значение модуля Юнга сравнимого с волокнами большего диаметра [155]. 1.4.2 Влияние концентрации наполнителя Было изучено влияние объемной фракции гидроксиаппатита на механические свойства EV и ET полимеров (таблица 1.12), которые представляют собой сополимеры циклического диэфира D,L-молочной кислоты и ε-капролактона с различным молекулярным весом (М (EV)=1080000, М(ET)=40000). Как видно из представленных данных, модуль Юнга и точка текучести композитов увеличивются с увеличением содержания гидроксиапатита для обоих типов сополимеров. Эти материалы будут использоваться в качестве наполнителя костных материалов во внутренних, не несущих перегородках [156]. Таблица 1.12. Механические свойства сополимеров и композитов Сополимер/композит Модуль Юнга Точка текучести EV 1,679±0,503 0,008 ±0,003 HA\EV - 20\80 2,323±0,347 0,081± 0,010 HA\EV – 40\60 2,894±0,292 0,097±0,026 HA\EV – 80\20 3,857±0,790 0,304±0,100 ET 0,272±0,085 0,007±0,004 HA\ET - 20\80 1,063±0,213 0,008±0,004 HA\ET – 40\60 1,564±0,322 0,021±0,010 HA\ET – 80\20 3,128±0,378 0,043±0,019 Также было изучено влияние добавок мультистенных углеродных трубок (MWNTs) на механические свойства нановолокон на основе поливиниацетата (ПВА) [157]. Сравнивая с полимерным волокном, предел прочности на разрыв композита на основе ПВА/ MWNTs, содержащих только 1% нанотрубок, увеличивается на ~15% от 105 до 133 MПa, и модуль 34 упругости увеличивается на ~2% от 175 MПa до 178 MПa. Предел прочности композитных слоев ПВА/MWNTs с концентрацией углеродных нанотрубок 1 % имеет гораздо более высокое значение по сравнению с материалами на основе поливинилацетата. Более того, если весовой проект трубок увеличивается с 1 до 2.5 %, то предел прочности увеличивается на 5 % от 175 МПа до 184 МПа. Рисунок 1.5. (I) Зависимость предела прочности на разрыв как функция деформации (%) для (а) (ПВА) и (b)–(e) - нетканых материалов на основе нановолокон, содержащих 1%– 7.5% (ПВА/многостенные углеродные трубки), (II) - зависимость модуля растяжения от весовой концентрации наполнителя в композите, (III) - зависимость предела прочности на разрыв от весовой концентрации углеродных нанотрубок в композите, (IV) - зависимость удлинения на разрыв в процентах от весовой концентрации наполнителя Однако, при дальнейшем увеличении содержания наполнителя (углеродных нанотрубок), предел прочности и модуль упругости уменьшаются. Предел прочности композитов, содержащих 5 весовых процентов и более равен значению для чистых полимерных волокон ~5.7 МПа. Было показано, что распределение нагрузки зависит от напряжения при сдвиге на границе раздела фаз между наполнителем и полимерной матрицей [158,159]. 35 Существует три главных механизма переноса нагрузки от изолирующей полимерной матрицы к наполнителю из нанотрубок. Первый - это микромеханическое взаимодействие, которое затруднительно для данных композитов вследствие атомарно гладкой поверхности. Второе - это химическое взаимодействие между нанотрубками и матрицей. Так было установлено, что давление сдвига на границе раздела фаз вследствие таких связей, может вырасти на ~0.05 ГПа [160]. Третий механизм заключается в слабом ванн-дер-ваальсовом взаимодействии между наполнителем - трубками и полимерной матрицей. Также было теоретически изучено влияние ориентации нанотрубок на модуль Юнга композитов [161] с помощью численного моделирования [162,163]. Изначальное увеличение предела прочности на разрыв и модуль растяжения (например, для композитов содержащих 1 и 2,5 % весовых процентов наполнителя) приписывается высокой степени ориентации наполнителя из нанотрубок в волокнах. Когда увеличивается весовой процент наполнителя в нановолоконах (5% и 7,5%), имеет место агломерация нанотрубок, что, соответственно, уменьшает степень их анизотропии. Более того, агломерация нанотрубок увеличивает слабое ванн-дер-ваальсово взаимодействие между связками нанотрубок и нановолокнами. 1.4.3 Влияние скорости вращения коллектора Были исследованы механические свойства ориентированных сетей из волокон на основе капролактона, полученных методом электроформования при различных скоростях вращения коллектора [164]. Выявлено, что нановолокна получаются более направленными при увеличении скорости вращения коллектора. Показано, что увеличение скорости вращения оказывает значительное влияние на механические свойства как индивидуальных нановолокон, так и объемных каркасов. Было установлено, что жесткость и модуль Юнга индивидуальных волокон уменьшается с увеличением скорости вращения. уменьшением Авторы объясняют это ухудшение механических свойств упорядоченности (кристалличности) индивидуального волокна при высоких скоростях вращения. Однако, благодаря увеличению упорядоченности волокон, которое отмечается при высокой скорости вращения, предел прочности на разрыв и модуль растяжения каркаса вдоль оси ориентированных волокон растут с увеличением 36 скорости вращения. Максимальное значение предела прочности увеличивалось от 2.21 ± 0,23 МПа при скорости вращения коллектора 0 оборотов, до 9.58 ± 0.71 МПа при скорости вращения 6000 оборотов в минуту. Аналогично, значение предела прочности материала увеличивалось от 6,12 ± 0,80 МПа при скорости вращения 0 оборотов в минуту, до 33,20 ± 1,98 МПа при скорости вращения 6000 оборотов в минуту. Таким образом, авторы продемонстрировали, что увеличение упорядоченности волокон благодаря высокой скорости вращения коллектора действительно снижает механические свойства индивидуальных волокон, в то время как направленная ориентация волокон улучшает механические свойства нетканого материала, полученного на основе данных волокон [164]. Авторами [165] было изучено влияние скорости вращения на механические свойства волокон на основе поликапролактона [165] и показано, что увеличение скорости вращения оказывает значительное влияние на механические свойства. Так, предельное значение предела прочности и модуля растяжения увеличивается с увеличением скорости вращения коллектора как показано в табл. 1.13 и на рисунке 1.6. Таблица 1.13 - Механические свойства волокна из поликапролактона при различных скоростях вращения коллектора Волокна Напряжение текучести, МПа Поликапролактон Скорость вращения 1000 оборотов 240 в минуту Поликапролактон Скорость вращения 2000 оборотов 420 в минуту 37 Прочность, МПа Толщина, мкм 35 1,18 59 0,75 - волокно диаметр ~ 1.18мкм 100 rpm (0.7 м \ с) волокно диаметр ~ 2.7мкм 1000 rpm (8 м \ с) волокно диаметр ~ 0.75мкм 2000 rpm (16 м \ с) диаметр волокна (мкм) диаметр волокна (мкм) диаметр волокна (мкм) Рисунок 1.6. Морфология волокон поликапролактона при различных скоростях вращения коллектора 38 1.5 Методы формирования нановолокон Субмикронные волокна имеют потенциал в таких областях применений, заживление ран, биоинжиниринг [166] и фильтрация. Существует как ряд методов, используемых для синтеза нановолокон – темплатный синтез, метод фазового разделения, метод самосборки и электроформования. Преимуществом последнего метода формования нановолокна на основе полимерного биоматериала по сравнению с ранее указанными методами является то, что для образования волокон используется электростатическая сила вместо механической силы [167]. 1.5.1 Электроформование полимерных волокон и параметры, влияющие на процесс электроформования В процессе электроформования используется источник высокого напряжения для введения заряда определенной полярности в полимерный раствор или расплав, который затем устремляется в направлении коллектора противоположной полярности. Так как электростатическое притяжение между противоположно заряженной жидкостью и коллектором, и электростатическое отталкивание между одноименными зарядами в жидкости усиливаются, граница раствора изменяется от закругленного мениска до конуса (конуса Тейлора). Струя полимера выбрасывается из конуса Тейлора, когда применяемый электростатический заряд (напряженность электрического поля) преодолевает поверхностное натяжение жидкости. Полимерная струя проходит через атмосферу, при этом растворитель испаряется, что приводит к осаждению твердых полимерных волокон на коллекторе. Волокна, полученные с помощью этого процесса, как правило, имеют диаметр от десятков нанометров до нескольких микрометров. Возможность легко производить материалы в указанном размерном диапазоне привлекает интерес к электроформованию для применения в тканевой инженерии и для создания систем доставки лекарственных средств [168]. Таким образом, важными преимуществами метода электроформования являются возможность производства очень тонких волокон с большой площадью поверхности, простота функционализации для различных целей, превосходные механические свойства образца и простота процесса. Возможность реализации крупномасштабных производств в сочетании с простотой процесса делает этот метод очень привлекательным для различных применений. 39 На эффективность процесса электроформования влияют следующие свойства полимерного раствора поверхностное [166, 169, 170]: молекулярная масса и вязкость раствора, натяжение, проводимость растворителя. Кроме того, раствора, диэлектрические свойства [166, 169, 171, 172] на эффективность процесса электроформования также влияют следующие технологические параметры: напряжение, скорость подачи раствора, температура, скорость вращения коллектора, диаметр отверстия иглы. 1.5.2 Применение электроформованных волокон Полимерные волокна, полученные методом электроформования, находят широкое применение в качестве фильтрующих и защитных материалов, сенсоров, композитов, армированных нановолокнами для тканевой инженерии, средств доставки и высвобождения лекарственных веществ, перевязочных материалов, иммобилизации ферментов и т.д. [173, 174]. Доступные методы синтеза нановолокон и использование нановолокон в тканевой инженерии и для доставки лекарственных применений рассмотрены в обзоре [175]. Возможность применения в качестве армирующих материалов и биодеградируемость делают подобные волокна очень перспективным материалом для регенерации или замены костной ткани. Улучшение механических свойств полимера может быть достигнуто либо модификацией структуры полимера, либо добавкой наполнителя в полимерное волокно, например, частиц HА или CaCO3. В ходе написания обзора, было обнаружено отсутствие исследований, посвященных механическим свойствам полимерных волокон на основе поликапролактона, в состав которых входят наполнители в виде микрочастиц НА и СаСО3. Кроме того, возможно специфическая игольчатая морфология частиц гидроксиапатита будет способствовать существенному улучшению механических свойств волокон на основе капролактона. Это позволит улучшить биологическую активность материала за счет обеспечения улучшенного взаимодействия с костной тканью в месте скрепления и пролонгированного снабжения ионами кальция и фосфата. Кроме того, для получения материала с заданными механическими параметрами, важно получить эмпирическое уравнение для прогнозирования модуля Юнга композита в зависимости от массовой доли наполнителя. 40 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Материалы Фосфат натрия, карбонат натрия (Na2CO3), хлорид кальция (CaCl2), этиленгликоль (ЭГ), нитрат серебра, гидроксид аммония и флуоресцентный маркированный TRITC-BSA были приобретены в Sigma-Aldrich и использованы без дополнительной очистки. Фотосенсибилизатор "Фотосенс", коммерчески доступный фотосенсибилизирующий препарат, представляющий собой смесь сульфопроизводных фталоцианина алюминия (AlPcSn, с n = 2, 3 или 4), был предоставлен НИОПИК (Россия). Во всех экспериментах использовалась деионизованная вода, полученная на устрановке водоочистки Millipore Milli-Q (США и Канада). 2.1.1 Поли(ɛ -капролактон) (ПКЛ( Поли(ɛ-капролактон) (PCL) представляет собой биоразлагаемый сложный полиэфир с температурой стеклования около -60°С и низкой температурой плавления около 60°С (рис.2.1). Для варьирования указанных свойства PCL используют в смесях [176] или модифицируют (например, сополимеризацией [177]). Он синтезируется из εкапролактона при нагреве и использовании катализаторов путем полимеризации с раскрытием кольца [178]. PCL считается нетоксичным и биосовместимым материалом, находит применение в качестве матрицы для биоинженерии тканей и для формирования мембран [179, 180]. Рисунок. 2.1. Химическая структура поли(ɛ-капролактона) В настоящей работе был использован Кроме того органические PCL (мол. вес 70-90 кДа) фирмы Sigma-Aldrich. растворители диметилформамид (ДМФА, х.ч.) и тетрагидрофуран (ТГФ, х.ч.) были получены от местных поставщиков. В качестве наполнителей для полимерных волокон использовали синтезированные частицы карбоната кальция (средний размер частиц ~ 1,2 мкм) и гидроксиапатита (средний размер частиц ~ 1,4 мкм). Последний был синтезирован путем ионообменной реакции из 41 темплатов карбоната кальция. 2.2 Получение частиц ватерита и гиброксиапатита, а также содержащих их композитов 2.2.1 Получение частиц карбоната кальция Частицы карбоната кальция были изготовлены с использованием известного протокола [7]: равные объемы эквимолярных (0,33 М) водных растворов Na2CO3 и CaCl2 сливают при перемешивании при комнатной температуре. Для исследования влияния способа перемешивания на размер и форму получаемых частиц, были выбраны три подхода, в которых реакционный раствор перемешивали в течение 90 секунд с помощью: 1) ультразвукового гомогенизатора Sonopuls (Bandelin, Германия) при частоте 20 кГц и мощности 1 Вт/см2, 2) с помощью магнитной мешалки (IKA, Германия) в 500 оборотов в минуту и 3) в качестве контроля реакцию проводили без перемешивания в течение 90 секунд. Синтезированные частицы CaCO3 тщательно промывали последовательно водой и этанолом и сушили в течение 30 мин при 60°С. 2.2.2 Исследование возможности применения неорганических частиц в качестве контейнеров для загрузки модельных веществ Для оценки эффективности загрузки в полученные неорганические частицы инкапсулирвали флуоресцентные модельные вещества - TRITC-BSA и Родамин 6Ж – с использованием метода адсорбции. Для достижения этой цели, 20 мг каждого вида высушенных частиц СаСО3 инкубировали в 2 мл 1 мг/мл водного раствора TRITC-BSA или 0,1 мг/мл родамина 6Ж в течение 1,5 часов, встряхивая. Затем частицы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 секунд и супернатант отбирали. Эффективность загрузки оценивали с помощью спектрофотометра Lambda-950 (PerkinElmer, США). Оптическую плотность регистрировали при поглощении на максимуме длины волны каждого маркера, чтобы оценить его концентрацию - 557 нм и 520 нм для TRITC-BSA и для Родамина 6Ж, соответственно. Абсолютные значения были получены с помощью калибровочной кривой. Количество инкапсулированного вещества оценивали по разнице красителя, оставшегося после адсорбции в надосадочном растворе по отношению к исходной концентрации в растворе, который был добавлен к системе. 42 Окончательные данные представляют собой среднее от 10 образцов для каждого типа неорганических частиц. 2.2.3 Получение субмикронных частиц ватерита Целью данного эксперимента является исследование влияния концентрации этиленгликоля (EG) в реакционной смеси, а также концентрации и скорости подачи реагентов на форму и размер частиц карбоната кальция. В качестве основы для исследования мы использовали методику синтеза частиц карбоната кальция, описанную в работе [30], но модифицировали ее путем предварительного добавления гидроксида натрия и хлорида натрия для управления рН и ионной силой. Первоначально, карбонат натрия растворяли в смеси воды и этиленгликоля с гидроксидом и хлоридом натрия. Гидроксид натрия поддерживает щелочную среду рН, подходящую для осаждения карбоната кальция. На втором этапе, раствор хлорида кальция добавляют по каплям к раствору карбоната натрия при непрерывном перемешивании магнитной мешалкой при постоянной скорости перемешивания 1500 оборотов в минуту. Полученный раствор центрифугируют, полученный осадок промывают четыре раза деионизированной водой и два раза этанолом, затем сушат в течение 60 мин при 60°С. Для оптимизации параметров процесса и изучения влияния на полиморфизм, размер и морфологию получаемых образцов, варьировали скорость подачи хлорида кальция R1 = 10 мл / мин, R2 = 0,167 мл / мин, R3 = 0,084 мл / мин и R4 = 0,042 мл / мин. Кроме того, также изучалось влияние концентрации реагентов и соотношения эитиленгликоль: Н2О. Концентрация бралась равной 0,05, 0,1 и 0,33М, а соотношение этиленгликоль: Н2О изменяли следующим образом 0, 1:1, 4:1 и 6:1. 43 CaCl2 таб Na2CO3 Магнитная мешалка Рисунок 2.2. Схема процесса подготовки субмикронных частиц ватерита 2.2.4 Получение микронных и субмикронных частиц гидроксиапатита Для получения микронных и субмикронных частиц HA были синтезированы частицы карбоната кальция и использованы в качестве темплатов. Для перекристаллизации карбоната кальция в гидроксиапатит мы использовали известный протокол с незначительными изменениями [8]. Водный раствор CaCl2 (0,33 М) был добавлен к этиленгликолю в различных объемных соотношениях для исследования влияния на размер частиц: 12: 0; 10: 2; 8: 4; 6: 6; 4: 8 и 2:10, (что соответствует следующим объемным содержаниям этиленгликоля в реакционной смеси: 0%, 17%, 33%, 50%, 67%, 83%). Смесь Na2CO3 и EG была подготовлена таким же образом, как и для CaCl2. Равные объемы свежеприготовленных эквимолярных растворов CaCl2 и Na2CO3 смешивали в одном объеме и перемешивали при 500 оборотах в минуту с помощью магнитной мешалки в течение 15 мин при комнатной температуре. После перемешивания осадок частиц СаСО3 промывали три раза этанолом и сушили при 60°C в течение 1 часа. Для получения частиц гидроксиапатита из темплатных частиц карбоната кальция использовали реакцию ионного обмена в присутствии фосфат-ионов, при этом 2,5 мг приготовленных частиц CaCO3 диспергировали в 1 мл 1М Na3PO4 и выдерживали в 44 течение суток. После этого частицы промывали в воде в течение 5 раз и сушили в течение 1 ч при 80°С. Рисунок 2.3. Схема процесса получения частиц HA Этот метод имеет 2 стадии: 1) синтез сферических частиц карбоната кальция путем смешивания ионов Са2+ и ионов CO32-; 2) получение частиц гидроксиапатита из темплатов ватерита путем ионо-обменной реакции между частицами СаСО3 и ионами PO43- в растворе. 2.2.5 Модификация наночастицами серебра частиц карбоната кальция и гидроксиапатита Полученные CaCO3 и HA частицы субмикронных и микронных размеров были функционализированы наночастицами серебра с использованием реакции «серебряного зеркала» [181], при этом 50 мг частиц диспергировали в 9 мл свежеприготовленного реактива Толленса [Ag (NH3)2] OH, полученного путем смешивания равных объемов 0,5 М AgNO3 и NH4OH растворов при перемешивании. Для активизации в реакционную смесь добавляли 50 мкл ацетальдегида и суспензию перемешивали в течение 15 минут. Затем частицы трижды промывали водой. 2.2.6 Получение нетканых композитов содержащих гидроксиапатит и карбонат кальция Растворы для электроформования на основе поликапролактона, готовили растворением определенного количества гранул поликапролактона в системе растворителей ДМФА/ТГФ 23/77 (9 масс% поликапролактона). Растворы перемешивают магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение трех часов для полного растворения. Частицы HА и CaCO3 при 45 различных соотношениях: 2,5, 5 и 7,5% масс% добавляли к раствору полимера. Установка для электроформования показана на рисунке 2.5. Она состоит из трех компонентов: источника высокого напряжения, капиллярной трубки с иглой малого диаметра и коллектора. Высокое напряжение используется для создания электрически заряженной струи раствора полимера, направленной от иглы к коллектору. Прежде чем попасть в коллектор, растворитель испаряется, струя затвердевает и собирается в виде переплетений сети тонких волокон [182]. Один электрод помещают в прядильный раствор/расплав, а другой прикреплен к коллектору. На рис. 2.5 показана схема процесса изготовления и характеризации полученных нами образцов, которая включает 1) - приготовление смеси полимерного раствора и наполнителя (неорганических микрочастиц), (2) - электроформование материалов, (3) - исследование механических свойств полученных композитных нетканых материалов. Рисунок 2.4. Типичная схема процесса электроформования 46 Рисунок 2.5. Схематическое изображение получения и характеризации нетканых материалов получение (1) полимерного раствора, содержащего микрочастицы наполнителя; (2) электроформование композитных волокон; (3) изучение механических свойств полученных нетканых материалов 2.3 Методы характеризации образцов 2.3.1 Рентгеновская дифракция Спектры дифракции рентгеновских лучей порошков были получены на установках Xcalibur/Gemini и PDS120 использовал излучение (Nonius GmbH, Золинген, Германия). Дифрактометр Cu-Kα-диапазона. Изучался состав и фазы материала. Применялось ускоряющее напряжение 40 кВ и ток 40 мА, соответственно. Теоретический спектр HА моделировался программой кристаллографической базой данных (Open Powder Cell и открытой Cristallography Database [http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkr900]). Размер кристаллов порошков HА считался обратно пропорциональным ширине пика в соответствии с уравнением Дебая-Шерера (ур-е 4) [183]: (4), где β является полной шириной на половине максимальной высоты пика интенсивности отражения; λ — длина волны Cu-Kα (λ = 0,155 нм); К —безразмерный фактор формы, со значением, близким к единице. Коэффициент формы имеет типичное значение около 0,9, но зависит от фактической формы кристаллита; и D — размер кристаллов в нанометрах. 47 Количество ватерита в образцах рассчитывалось из данных рентгеновской дифракции с использованием уравнения Рао (5) [184]: ………………………………….. (5) где IC и IV — интенсивности для кальцита и ватерита, соответственно, и fV — содержание ватерита в образцах. 2.3.2 Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) Морфология порошков гидроксиапатита, карбоната кальция и композитов из поликапролактона с различной массовой долей HА и кальций-карбоната была охарактеризована с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Измерения СЭМ проводились с помощью прибора MIRA II LMU при рабочем напряжении 20 кВ и с помощью прибора XL30 ESEM FEG (Philips) при 15 кВ. Микроморфология исследовалась путём снятия изображений при увеличении варьирующемся от 100 до 40,000-кратного. 2.3.3 Измерения зета-потенциала Зета-потенциал суспензии наночастиц измерялся на установке Zetasizer Nano-Z (Malvern Instruments Ltd, UK). В целом, были проведены 10 измерений. Каждый результат представляет собой среднее значение трех последовательных прогонов с одним и тем же образцом. 2.3.4 Анализ изображений Распределение по размерам частиц карбоната кальция и гидроксиапатита исследовалось по набору изображений СЭМ так, чтобы получить как минимум 100 измерений на каждый образец. Анализ изображений и статистическую обработку проводили с использованием программы ImageJ (NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/). 2.3.5 Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDX). Химический состав порошка карбоната кальция энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии. 48 определялся с помощью 2.3.6 Спектроскопия комбинационного рассеяния Были использованы два микроскопа комбинационного рассеяния, работающих на двух разных лазерных частотах. Первая система конфокальной микроскопии комбинационного рассеяния CRM200 (WITec, Ульм, Германия), оснащенная пьезосканером P-500 (Physik Instrument, Карлсруэ, Германия) и диодным лазером накачки ближнего ИК диапазона с длиной волны 785 нм (Toptica Photonics AG, Graefelfing, Германия). Спектры регистрировались термоэлектрически охлаждаемой ПЗС-матрицей DU401ABV (Andor, Великобритания) с дифракционной решеткой спектрометра 300 линий/мм (Acton, Princeton Instruments Inc., Трентон, Нью-Джерси, США) со спектральным разрешением 6 см-1. Вторая используемая система это конфокальный микроскоп комбинационного рассеяния alpha300 (WITec, Ульм, Германия), оснащеный лазером с удвоением частоты на основе Nd:YAG (длина волны 532 нм), пьезоэлектрическим сканером Р-500 (Physik Instrumente, Карлсруэ, Германия). Спектры регистрировались термоэлектрически охлаждаемой ПЗС-матрицей DU401A-BV (Andor, Великобритания), расположенной после спектрометра (UHTS 300; WITec, Ульм, Германия) со спектральным разрешением 3 см-1. Лазерный пучок в обоих инструментах фокусировался с помощью 60-кратного водноиммерсионного объектива (Nikon, NA = 1,0) или 100× (Nikon, NA = 0,9) объектива микроскопа, предназначенного для работы в воздушной среде. 2.3.7 Тестирование механических свойств Механическую прочность с точки зрения предела текучести и предела прочности на разрыв исследовали с помощью универсальной установки тестирования механических свойств DMA Q800 (ТА Instruments, США) (рабочая длина — 50 мм), скорость вытяжения поддерживали равной 0,0450 МПа/мин. Все измерения проводились при комнатной температуре. Маты свежеизготовленных образцов из поликапролактона и композита обрезались до прямоугольной формы (10,23 мм × 6,45 мм × 0,12 мм). Модуль Юнга рассчитывался по следующим формулам (6, 7): E = сжатие (σ) / растяжение (ϵ) (6) E= (F/ A) / (Δl/lo) (7) 49 Относительное растяжение ϵ = ΔL/Lo, где ϵ — деформация растяжения, ΔL — изменение длины объекта и Lo — длина объекта до начала деформации. Напряжение при растяжении σ = F/Ao, где F — сила, прикладываемая к материалу и Ao — исходная площадь поперечного сечения до приложения силы. 2.3.8 Измерение удельной площади поверхности и среднего диаметра пор Удельную площадь поверхности и средний диаметр пор частиц карбоната кальция измеряли с помощью анализатора NOVA 1200E (Quantachrome, США) путем измерения количества физически адсорбированного газа в соответствии с методами БрунауэраЭммета-Теллера (BET) и Баррета-Джойнера-Халенды (BJH), соответственно. Исследуемые частицы были предварительно дегазированы в вакууме при температуре 60 °С в течение 4 ч, затем снималась изотерма адсорбции. В качестве адсорбата использовался азот. Расчеты проводились с помощью программного обеспечения анализатора. 50 ГЛАВА 3. СИНТЕЗ ЧАСТИЦ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ МИКРОННОГО И СУБМИКРОННОГО РАЗМЕРА ПРИ УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ГОМОГЕНИЗАЦИИ И ИХ ЗАГРУЗОЧНЫЕ СВОЙСТВА 3.1 Получение частиц карбоната кальция Частицы CaCO3 микронного размера были получены путем осаждения эквимолярных растворов CaCl2 и Na2CO3. Распределение ионов в реакционной смеси при образовании СаСО3 оказывает сильное влияние на качество получаемых частиц. Следствием равномерного распределения ионов является однородное распределение центров кристаллизации, что приводит к уменьшению размера частиц и его дисперсии. Поскольку ультразвук является одним из наиболее эффективных методов гомогенизации, можно считать, что использование ультразвука для перемешивания реакционной смеси при синтезе CaCO3 может обеспечить формирование более мелких частиц с низкой дисперсностью. Для того чтобы определить влияние способа смешивания на качество получения частиц (размер и его дисперсия, кристаллографические фазы CaCO3), эффективность ультразвуковой гомогенизации (рис 3.1 Панель a) сравнивали с известной техникой получения СаСО3 с использованием магнитной мешалки [7] (рис 3.1 Панель b) и контрольным синтезом без перемешивания реакционной смеси, в котором на распределение ионов влияет Для всех экспериментов время проведения синтеза (время перемешивания) составило 30 секунд, так как увеличение длительности перемешивания приводит к увеличению фазы кальцита в случае перемешивания с использованием магнитной мешалки [7]. Для демонстрации возможности масштабирования синтеза частиц ватерита реакцию поводили в двух разных объемах: «малый» составил 7.5 мл (3.75 мл 0.33 М Na2CO3 добавляли к 3.75 мл 0.33 М CaCl2) и «большой» объем составил 60 мл (30 мл 0.33 М Na2CO3 добавляли к 30 мл 0.33 М CaCl2).только диффузия (рис 3.1. Панель c). 51 Рисунок 3.1. Схема формирования частиц при различных способах перемешивания: панель с - контрольный эксперимент (без перемешивания), панель b - перемешивание с магнитным якорем, и ультразвуковая гомогенизация - панель а Были исследованя размер образующихся частиц и его распределение, кристаллографическая фаза и выход реакции. СЭМ изображения полученных частиц СаСО3 представлены на рисунке 3.2 52 Рисунок 3.2. СЭМ изображения частиц карбоната кальция, полученных в разных объемах реакционной смеси - 7,5 мл (верхний ряд, a-c) и 60 мл (нижний ряд, d-f) – с использованием различных способов перемешивания: a, d - контрольный образец без дополнительного перемешивания, b, e – образцы, которые перемешивали магнитной мешалкой, и c, f - образцы, полученные с участием ультразвука. Длина масштабного отрезка 10 мкм. На рисунке 3.2 приведены СЭМ изображения микрочастиц карбоната кальция, полученных при различных способах перемешивания, демонстрирующие влияние условий синтеза на размер и полиморфизм изготовленных частиц СаСО 3. Как можно видеть, контрольный образец (Рис. 3.2а) и образец, полученный при перемешивании магнитной мешалкой (Рис. 3.2b) содержат некоторое количество кубических кристаллов, которые представляют собой кальцит, в то время как образец, полученный при участии ультразвука, содержит практически только сферические частицы ватерита (Рис. 3.2с). 53 Таблица 3.1 - Средний размер, индекс полидисперсности (PDI), процентное содержание частиц кальцита, полученные экспериментально для различных объемов реакционной смеси («малого» - 7.5 мл и «большого» 60 мл) Объем Способ реакционн перемешивания ой смеси,мл Средний Содержание размер частиц, кальцита, % мкм PDI Масса CaCO3, мг Выход реакци и, % Контроль 7,5 4,2±0,5 26 0,22 91±5 78 Магнитная мешалка 7,5 2,6±0,2 11 0,07 88±3 74 Ультразвук 7,5 0,9±0,1 1 0,02 98±9 88 Контроль 60 3,3±0,5 14 0,20 734±23 72 Магнитная мешалка 60 2,5±0,1 9 0,10 816±104 75 Ультразвук 60 1,0±0,1 0.6 0,07 865±64 86 Средний размер частиц, индекс полидисперсности (PDI), процент непористых частиц кубической формы оценивали путем статистического анализа СЭМ изображений. Полученные данные приведены в таблице 3.1, из которых видно, что перемешивание с использованием ультразвукового гомогенизатора обеспечивает более равномерное распределение центров роста и приводит к образованию частиц с размером 0,9 ± 0,1 мкм и с наименьшим индексом полидисперсности (PDI 0.02). С другой стороны, синтезы, проведенные с помощью магнитной мешалки или без дополнительного перемешивания, демонстрируют менее равномерное распределение центров кристаллизации и, как результат, рост спонтанной агрегации частиц, в результате чего процесс роста кристаллов начинает доминировать над нуклеацией, что приводит к увеличению размера полученных частиц до 2.6 ± 0.2 мкм и 4.2 ± 0.5 мкм и PDI до 0.07 и 0.22, соответственно. Кроме того, локальное увеличение концентрации ионов в реакционной смеси, вызванное неоднородностью их распределения, ускоряет перекристаллизацию ватерита, что приводит к образованию до 26% кальцита в образце (для синтеза без дополнительного перемешивания). Гомогенизация реакционной смеси с помощью ультразвука позволяет сформировать почти 100% ватеритной фазы. На рисунке 3.3 представлены данные рентгено-фазового анализа осадков карбоната кальция при различных условиях синтеза. Установлено, что частицы, полученные с использованием ультразвука, представляют 54 собой только одну полиморфную модификацию - ватерит. В остальных образцах присутствуют такие кристаллографические плоскости, как (012), (104) и (202), которые являются типичными для кубической формы кальцита. Кроме того, контрольный образец имеет дополнительные кристаллографические плоскости кальцита (110), (113), (018), что свидетельствует о более выраженном присутствии фазы кальцита. Типичные пики ватерита, которые соответствуют кристаллографическим плоскостям (020), (110), (120), (220), (211), менее интенсивны для контрольного образца по сравнению с образцом, полученным путем перемешивания с помощью магнитной мешалки. Рисунок. 3.3. Теоретические и экспериментальные данные рентгено-структурного анализа частиц карбоната кальция, синтезированных при различных способах перемешивания. Красные квадраты и индексы Миллера соответствуют кальциту, черные квадраты и индексы Миллера - ватериту Кроме того, равномерное распределение ионов в реакционной смеси при ультразвуковой обработке реакционной смеси позволяет большему числу этих ионов вступить в реакцию с образованием 98 мг СaCO3, что составляет 87.5% от теоретического выхода (112 мг) (рисунок 3.4). 55 Для увеличения выхода полученных частиц карбоната кальция, необходимо увеличить количество Ca2+ и CO3- ионов, участвующих в реакции. Это условие может быть достигнуто либо за счет увеличения исходных концентраций реагирующих солей, либо за счет увеличения объема реакционной смеси (масштабирования синтеза). Так как увеличение концентрации приводит к значительному сокращению расстояния между ионами и, таким образом, приводит к неоднородному распределению центров кристаллизации, то увеличение объема в данном случае является более предпочтительным. Для изучения влияния увеличения объема реакционной смеси на "качество" получаемых частиц, общий объем был увеличен в 8 раз: с 7.5 мл до 60 мл. В результате было подтверждено, что «качество» частиц карбоната кальция определяется способом перемешивания реакционной смеси в большей степени, чем изменением ее объема (см. табл. 1). Наиболее низкое «качество» и высокую полидисперсность имели частицы, полученные путем синтеза без перемешивания реакционной смеси. В этом случае, центры роста распределяются по объему только под действием силы тяжести, что приводит к агрегации и формированию полидисперсных частиц. Перемешивание с помощью магнитной мешалки также не обеспечивает однородного перемешивания реакционной смеси. Как результат, высокое содержание кальцита (9% и 11%, в зависимости от объема реакционной смеси) в полученном осадке было приписано влиянию способа перемешивания на скорость нуклеации и распределение по размерам получаемых частиц. Таким образом, использование ультразвука в сочетании с увеличением объема реакционной смеси приводит к наибольшему массовому выходу частиц ватерита (1 г, 60 мл) с наименьшим индексом полидисперсности и размером 1.0 мкм. 56 Рисунок 3.4. Результаты исследования влияния способа перемешивания реакционной смеси на возможность масштабирования синтеза микрочастиц СаСО 3. Исследуемые объемы реакционной смеси были равны 7.5 мл (черный цвет) и 60 мл (серый цвет) Следует отметить, что равномерное распределение ионов улучшает выход реакции. Так, выход карбоната кальция при ультразвуковой гомогенизация составляет 85% по сравнению с 80% и 72% для синтезов с использованием магнитной мешалки и контроля без перемешивания, соответственно. Увеличение выхода карбоната кальция с использованием ультразвуковой гомогенизации может быть связано с тем, что процесс кристаллизации осуществляется за счет роста первичных зародышей и снижения уровня агломерации. Ультразвук обеспечивает большое количество энергии за счет коллапса кавитационных пузырьков, что усиливает массоперенос и ускоряет протекание химической реакции [40]. Помимо кавитации, ультразвук может производить механические флуктуации и термические эффекты, которые могут создавать микровозмущения в сверхкритической фазе [41]. Турбулентность уменьшает граничный слой и увеличивает скорость массопереноса [185]. Увеличение объема реакционной смеси в 8 раз с использованием ультразвука для перемешивания позволяет увеличить количество однократно получаемого карбоната 57 кальция без существенных потерь «качества» образца, что открывает возможности реализации предложенной методики синтеза на промышленном уровне. Время реакции оказывает сильное влияние на размер и форму CaCO3 частиц [9]. В нашей работе было исследовано влияние времени ультразвуковой обработки на качество частиц. Эксперимент проводили в тех же условиях в течение 1 часа. Расчеты, основанные на СЭМ изображениях (рис. 3,6), показали, что содержание кальцита увеличивается при увеличении времени синтеза (рис. 3.5). Размер ватерита не меняется в течение 10 минут синтеза. Дальнейшее увеличение времени синтеза приводит к рекристаллизации частиц ватерита, увеличивая, таким образом, количество кальцита. Формирование частиц ватерита происходит в первые 30 секунд синтеза. Дальнейшее хранение в воде в присутствии ионов Na2+ и Cl- вызывает растворение поверхностного слоя частиц, что приводит к высокой концентрации ионов вблизи поверхности частицы. Полученные дефекты выступают в качестве центров кристаллизации в более стабильную фазу кальцита. В конце 10-й минуты, небольшое количество частиц рекристаллизации - кальцита образуется, таким образом, запуская механизм частицы кальцита сталкиваются с частицами ватерита при ультразвуковой гомогенизации, что приводит к переходу в стабильную фазу кальцита, в результате чего получаются агрегаты, состоящие из нескольких частиц кальцита [186]. Рисунок 3.5. Влияние времени перемешивания на формирование фазы кальцита при ультразвуковой обработке в процессе получения карбоната кальция (содержание кальцита в синтезированном образце) 58 Рисунок 3.6. СЭМ изображения частиц карбоната кальция, полученных при различном времени УЗ обработки: (а) 1 мин, (b) 5 мин, (с) 10 мин, (d) 20 мин, (е) 30 мин, (f) 40 мин (g) 50 мин и (h) 60 мин. Шкала 10 мкм 3.2 Применение неорганических частиц карбоната кальция гидроксиапатита в качестве контейнеров для загрузки модельных веществ и Важным свойством носителей лекарственных средств является эффективность их загрузки. Бычий сывороточный альбумин маркированный TRITС и родамин 6Ж были выбраны для исследования загрузочных свойств полученных пористых частиц. Распределение обоих люминесцентных веществ TRITC-BSA (рис. 7а) и родамина 6Ж (рис. 7b) было исследовано с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии и показано (рис. 7b), что модельные вещества проникли через пористую структуру равномерно внутрь частиц. Очевидно, что нагрузка пористых частиц зависит от площади поверхности частиц. В случае карбоната кальция это означает, что есть сильная зависимость эффективности загрузки от «качества» образца, под которым понимается процентное соотношение пористых частиц ватерита и гладких частиц кальцита в образце. Таким образом, чем меньше процент кальцита и меньше размер частиц в целом, тем выше пористость и, как следствие, тем выше эффективность загрузки. Особенно эффективность это видно загрузки при частиц инкапсуляции ватерита, 59 высокомолекулярных синтезированных при веществ: ультразвуковой гомогенизации, которые имеют площадь поверхности 25 м2/г, равна 10% по массе, в то время как для менее пористых частиц ватерита, полученных с использованием магнитной мешалки (площадь поверхности составляет 10 м2/г) и контролького образца, этот параметр равен 8 мас% и 7 мас%, соответственно. Для низкомолекулярного вещества (Родамин 6Ж) эффективность загрузки одинакова для всех образцов, в силу того факта, что для таких малых молекул размер и внешняя поверхность области частицы имеют меньшее влияние на его адсорбцию. Эффективность загрузки для таких структур равна 1,5 ± 0,5%, что хорошо соответствует литературным данным для молекул с молекулярной массой <1 кДа. Рисунок 3.7. Изображения частиц ватерита, загруженных TRITC-BSA (а) и Родамином 6Ж (b). Шкала 5 мкм 3.3 Основные параметры синтеза ватерита, оказывающие влияние на размер и форму частиц 3.3.1 Влияние скорости подачи и концентрация реагентов при различных соотношениях этиленгликоль- Н2О на размер частиц ватерита Субмикронные частицы ватерита были синтезированы путем осаждения при смешивании растворов карбоната натрия и хлорида кальция. Влияние скорости подачи хлористого кальция, а также состава растворителя (соотношения этиленгликоль:вода) на размер частиц и их полиморфизм можно проанализировать, используя экспериментально полученные графические зависимости (рис. 3.8). Каждая зависимость на рис. 3.8 позволяет сравнить влияние двух факторов (скорость подачи и концентрации солей) на концентрации этиленгликоля в размер частиц ватерита при различной реакционной смеси. Точки на представленных зависимостях соответствуют четырем скоростям подачи хлорида кальция справа налево: 60 R1 = 10 мл / мин, R2 = 0.167 мл / мин, R3 = 0.084 мл / мин и R4 = 0.042 мл / мин. Температура синтеза была постоянной и поддерживалась на уровне 25 °C. Сопоставление рис. 3.8 a, b, c помогает учесть совместное влияние всех трех факторов - соотношения EG: H2O, скорости подачи и концентрации солей. Рисунок 3.8. Графические зависимости, показывающие влияние скорости подачи хлорида кальция и концентрации этиленгликоля на размер частиц ватерита при концентрациях реагентов 0,05, 0,1 и 0,33М и четыре скорости подачи R1 = 10 мл / мин, R2 = 0,167 мл / мин, R3 = 0,084 мл / мин и R4 = 0,042 мл/ мин, что соответствует точкам справа налево, соответственно (а) EG:H2O (1: 1), (б) EG:H2O (4: 1), (с) EG:H2O (6: 1) Из представленных данных можно сделать вывод, что размер частиц ватерита уменьшается с уменьшением скорости подачи и концентрации раствора хлорида кальция. Частицы ватерита с наименьшим размером 0.4 мкм были получены при скорости подачи R3 = 0.084 мл/мин и соотношении этиленгликоль:вода (4:1) (Рис. 3.8 (b)) и концентрации реагентов 0.05М. С увеличением концентрации этиленгликоля в реакционной смеси: 1) уменьшается диэлектрическая проницаемость растворителя, 2) снижается поверхностное натяжение, 3) увеличивается вязкость. Уменьшение диэлектрической проницаемости приводит к уменьшению растворимости солей. Согласно теории гомогенной нуклеации снижение поверхностного натяжения вследствие добавки этиленгликоля приводит к уменьшению критического радиуса нуклеации [52], что, в свою очередь, обеспечивает образование большего количества зародышевых частиц с радиусом больше критического значения по сравнению с ситуацией, наблюдаемой в чистой воде без этиленгликоля. Также уменьшение поверхностного натяжения приводит к уменьшению нуклеационного 61 барьера, что увеличивает скорость нуклеации. Увеличение вязкости реакционной смеси при добавлении этиленгликоля приводит к снижению скорости как роста, так и растворения уже сформированных частиц вследствие снижения скорости диффузии ионов. В результате суперпозиция факторов, перечисленных выше, приводит к получению частиц ватерита меньшего диаметра и более узкой дисперсией по размерам. Уменьшение исходной концентрации CaCl2 и скорости подачи приводит к аналогичным результатам. Это объясняет, почему низкая скорость подачи [Ca 2+] влияет на размер частиц CaCO3 и их полиморфизм. Низкая концентрация и низкая скорость подачи способствуют более равномерному распределению ионов в реакционной смеси, что благоприятно для процесса нуклеации. Очевидно, что наилучшие результаты могут быть получены при малой скорости подачи ионов [Са2+], и это соответствует концентрации реагентов 0.05 М и скорости подачи R3 = 0.084 мл/мин и R4 = 0.042 мл/мин, соответственно. Нужно отметить, что добавление EG уменьшает растворимость карбоната кальция и увеличивает пересыщение, которое компенсирует уменьшение концентрации взаимодействующих ионов в растворе. Интересно отметить незначительное увеличение размера частиц, наблюдаемое при самой высокой концентрации EG и низкой скорости подачи реагента (Рис. 3.8 c), которое может быть вызвано эффектом, аналогичным флокуляции. Частицы могут образовывать небольшие агрегаты кристаллов, соединенных молекулами EG. Другое объяснение принимает во внимание значительное увеличение вязкости и, следовательно, уменьшение коэффициента диффузии ионов в растворе, что совместно с уменьшением растворимости может привести к росту локальной концентрации ионов и увеличению пересыщения. Наши выводы иллюстрирует рис. 3.9 , где приведены кинетические зависимости изменения концентрации ионов кальция в реакционной смеси во времени при различных концентрациях реагентов 0,05, 0,1 и 0,33 М и скоростях добавления хлорида кальция R1 (10 мл/мин), R2 (0.167 мл/мин), R3 (0.084 мл/мин) и R4 (0.042 мл/мин). 62 Рисунок3.9. Изменение концентрации ионов [Ca2+] в реакционной смеси при различных концентрациях реагентов и четырёх скоростях подачи (R1-R4) Очевидно, что приток массы ионов [Са2+] в 0.05 М меньше за единицу времени, чем для концентраций 0.1 и 0.33М. Кроме того, приток массы ионов [Са2+] в 0,05М, будет отличаться от такового при R2 и R4. Это может служить объяснением того, что низкая скорость подачи [Ca2+] влияет на размер частиц СаСО3 и их полиморфизм (Рис. 5). Данный факт определяется распределением ионов и, следовательно, регулированием пересыщения при высокой постоянной концентрации этиленгликоля. Распределение ионов будет лучше при малых значениях притока массы ионов [Са2+], и это соответствует концентрации реагентов 0,05М и скоростям подачи R3 = 0.084 мл/мин и R4 = 0.042 мл/мин, соответственно. Низкая концентрация ионов кальция и низкая диэлектрическая проницаемость среды, а также высокая вязкость реакционной среды обеспечивает преобладание процесса нуклеации [52] над ростом частиц и их агрегацией. В случае высокой концентрации 63 реагентов и при высоких скоростях подачи хлорида кальция наблюдается увеличение локальной концентрации ионов и, как следствие, доминирование процесса роста. На рисунке 3.9 тангенс угла наклона прямых соответствует скорости изменения массы кальция в реакционной смеси. Из рисунка 3.9 можно видеть, что при увеличении тангенса угла наклона линий возрастает вероятность образования кальцита, в то время как доля ватерита уменьшается. Когда скорость изменения массы кальция в реакционной смеси находится в интервале (0-3x10-6 г/мин) полученный карбонат кальция представляет собой чистый ватерит (в), когда тангенс угла наклона лежит в интервале (3x10-6 – 30x10-6 г/мин ) карбонат кальция является смесью ватерита и кальцита (в+к) с различным процентным соотношением, зависящим от скорости добавления и концентрации реагента. Процент кальцита в смеси (в+к) увеличивается при высокой скорости подачи реагента (R1, R2) и низкой концентрации этиленгликоля, и снижается при низкой скорости подачи (R3, R4) и высокой концентрации этиленгликоля. Образование чистого кальцита наблюдается при высоких скоростях подачи R 1 и R2, в частности, при концентрации реагентов 0,33 М. Из рисунка 3.9 видно, что вдоль сплошной линии, соответствующей R2 и 0,33M, наблюдаются две фазы: в верхней части линии — чистый кальцит, а в середине ватерит+кальцит. В этом случае скорость подачи и концентрации являются постоянными и изменяется только соотношение EG:вода. Таким образом, было продемонстрировано влияние концентрации этиленгликоля на полиморфизм CaCO3. Дальнейший анализ рис. 3.9 показывает, что некоторые линии имеют одинаковый наклон, например, линия (0.05М — R2)) и (0.1М — R3), а также линии (0.05М — R3) и (0.1М — R4). Этот результат указывает на то, что при одинаковой скорости изменения массы кальция в реакционной смеси наблюдается одинаковый полиморфизм кристаллов с близкими значениями их свойств. Совпадение скоростей изменения массы кальция в реакционной смеси (рис. 3.9) может объясняться явлением пересыщения при выбранных параметрах (концентрации реагентов и скорости подачи хлорида кальция). Пересыщение в качестве движущей силы формирования карбоната кальция выражается в виде отношения S = [Ca2+] [CO32-]/ [sp] …………………………………………………………………..….. (8) 64 где [Са2+] и [CO32-] соответственно, и [SP] — — концентрации соответствующих ионов в растворе, произведение растворимости карбоната кальция, которое различно для ватерита и кальцита. В нашем случае, ионы карбоната доступны из раствора карбоната натрия, а ионы кальция подаются по каплям добавлением раствора CaCl2 (+ NaCl). При перемешивании ионы кальция диффундируют в объем раствора, формируя на короткое время так называемое «поле диффузии». Чем выше начальная концентрация хлорида кальция, тем выше в «поле диффузии» концентрация ионов кальция, которые взаимодействуют с карбонат-ионами с образованием кристаллов карбоната кальция. В таком случае, пересыщение, локально формируемое в «поле диффузии», будет выше при исходных концентрациях реагентов 0,1 или 0,33М и при высоких скоростях подачи R2 и R1. В этом случае реализуются условия для формирования кристаллов кальцита, потому что его произведение растворимостей 3,3110-9 меньше по сравнению с ватеритом (1,2310-8) [188]. В нашем случае невозможно рассчитать коэффициент пересыщения, потому что концентрация ионов кальция меняется в каждый момент. Но мы основываем наше объяснение на некоторых наблюдениях, сделанных авторами работы [189]. Мы принимаем, что в данном случае концентрация ионов кальция в растворе эффективно разбавлена большим объемом раствора, и, таким образом, пересыщение мало. В этом случае низкое локальное пересыщение способствует кристаллизации ватерита. Таким образом, локальные пересыщения в растворах 0,05М и 0,1М меньше таковых в 0,33М, и это объясняет присутствие различных полиморфов в растворах 0,05М и 0.1М и 0,33М с той же скоростью подачи и концентрацией этиленгликоля. Мы можем сделать заключение о том, что линии, которые имеют одинаковый угол наклона, соответствуют одной и той же полиморфной модификации и близким размерам частиц, поскольку вдоль них будут получаться одинаковые значения пересыщения. 3.3.2 Влияние концентрации этиленгликоля и различной скорости подачи и концентрации реагентов на соотношение ватерита и кальцита Вторая часть исследования посвящена изучению параметров, показанных совместно на рис. 3.10., которые влияют на соотношение фаз ватерит/кальцит (полиморфизм) в полученном осадке карбоната кальция. Известно, что кристаллы ватерита могут формироваться из аморфного CaCO3 или непосредственно из кластеров в 65 растворе [48]. В свою очередь кристаллы кальцита образуются из ватерита. Кристаллы ватерита в воде стабильны в течение порядка 20 часов, после чего они перекристаллизуются в кальцит [188]. Для предотвращения перекристаллизации было предложено много способов, например введение поверхностно-активного вещества, полимерных молекул, а также применение неводных сред для синтеза. В нашем случае стабилизация кристаллов ватерита обеспечивалась адсорбцией молекул этиленгликоля на их поверхности, что предотвращало контакт ватерита с водой [48, 55, 190-192]. Рисунок 3.10. иллюстрирует влияние некоторых параметров, таких как концентрация реагентов, концентрация этиленгликоля и скорость подачи ионов кальция на полиморфизм карбоната кальция. Вдоль оси абсцисс менялось соотношение этиленгликоль:вода, которое бралось равным 1:1, 4:1 и 6:1. Рисунок 3.10. Влияние концентрации реагентов, соотношения EG:вода и скорости подачи реагентов на полиморфизм CaCO3 66 Диаграмма отражает влияние скорости подачи ионов кальция и концентрации реагентов на процент кальцита с изменением концентрации этиленгликоля в смеси. Для наглядности критические точки диаграммы проиллюстрированы изображениями СЭМ кристаллической фазы карбоната кальция, формирующейся при данных условиях. Область значений, показанная на рис. 3.10 может быть разделена на четыре подобласти (G1 — G4). В области G1 (вдоль левой оси ординат) в качестве растворителя использовали чистую воду. Первоначально, при высокой скорости подачи R1 раствор CaCl2 прикапывали в течение 30 сек. В результате содержание кальцита составило 18, 24 и 29% при концентрации реагентов 0,05, 0,1 и 0,33М, соответственно. Однако при снижении скорости подачи ионов кальция (R2 – R4) кристаллы карбоната кальция представляют собой чистый кальцит (см. изображение СЭМ в верхнем левом углу рис. 3.10.). Это подтверждает и известную тенденцию быстрой перекристаллизации ватерита в более стабильный кальцит, так как ватерит является термодинамически метастабильной фазой карбоната кальция [188-193]. Область G2 на рисунке 3.10 охватывает содержание кальцита 20-50% и расположена в центре при соотношении вода:этиленгликоль 50% и средней скорости подачи ионов кальция R2. Если проанализировать влияние изменения соотношения EG: H2O от нуля до 1:1, 4:1 и 6:1 на содержание кальцита при движении вправо-вниз от левого верхнего угла, то становится ясно, что с ростом концентрации этиленгликоля EG содержание фазы ватерита увеличивается в зависимости от скорости подачи и концентрации реагентов до 100%. Это соответствует концепции, при которой термодинамический потенциал как движущая сила определяет вероятность формирования метастабильных полиморфных модификаций, так как растворимость карбоната кальция уменьшается при добавлении этиленгликоля, таким образом, увеличивая пересыщение реакционной смеси. С другой стороны, перекристаллизация ватерита в кальцит замедляется в присутствии этиленгликоля, что, скорее всего, является результатом снижения темпов роста более стабильного полиморфа (кальцит), а скорость перекристаллизации, как правило, определяется скоростью роста более стабильного полиморфа, а не скоростью растворения фазы метастабильного предшественника [194]. Также скорость превращения 67 ватерита в кальцит определяется вязкостью реакционной смеси, так как при большей взякости требуется больше времени для перераспределения ионов и процесса рекристаллизации. Аналогично о подобной задержке превращения ватерита в кальцит сообщалось в работе [192], где синтез проводился в присутствии этиленгликоля. Кроме того авторы работы [55] показали, что фаза ватерита стабильна в присутствии этанола, изопропанола и этиленгликоля. Из рисунка 3.10 можно также видеть, что скорость подачи ионов кальция оказывает значительное влияние на содержание ватерита при всех значениях концентраций реагентов 0,05, 0,1 и 0,33М. При понижении скорости подачи от R2 до R4, содержание ватерита увеличивается. Этот эффект менее выражен при скорости подачи R4 и низкой концентрации реагентов. Например, при соотношении этиленгликоль: Н 2О в 1:1 и концентрации реагентов 0.05М содержание ватерита может быть около 3% при высокой скорости подачи R1 (см. синий квадрат в верхней части рис. 3.10), также составила 71% при низкой скорости подачи R2 (см. коричневый треугольник) и с уменьшением скорости подачи до R3 и R4 содержание ватерита достигло 100%. Этот результат показал, что скорость подачи ионов кальция является еще одним важным фактором, влияющим на формирование ватерита. Влияние этого фактора лучше всего показано при скорости подачи R1 на кривых, для которых есть максимум, например, для соотношения этиленгликоль:H2O равного 1:1 при всех концентрациях реагентов. Третья область G3 (верхняя часть рис. 3.10 справа) показывает значительное снижение содержания кальцита при высокой скорости подачи ионов кальция (R1), например, когда концентрация этиленгликоля возрастает от 50 до 85%. В этом случае, содержание кальцита изменяется от 100% при концентрации EG = 50% до 75% при EG = 80%, а затем до снижается до 15% кальцита при EG = 85%. Область G4 на рис. 3.10 включает в себя содержание кальцита ≤10% и расположена в правом нижнем углу, где концентрация этиленгликоля составляет 80-85% при средних и низких скоростях подачи ионов кальция (R2, R3, R4), а также при концентрации этилегликоля 50%, но при низких скоростях подачи (R3, R4). Из сказанного выше становится очевидным тот факт, что содержание ватерита увеличивается в присутствии этиленгликоля при низкой концентрации реагентов и низкой скорости подачи хлористого кальция. Основной причиной влияния скорости подачи и 68 концентрации реагентов на размер частиц ватерита является то, что добавление CaCl2 по каплям приводит к появлению новых центров зародышеобразования вместо роста имеющихся кристаллов. Эти результаты сопоставлены с данными на рис. 3.9. при 0,05М, где значение притока массы ионов [Са2+] при низких скорости подачи R3 и R4 было меньшим, чем аналогичное значение притока массы ионов [Са2+] в 0,1 и 0,33 М, и именно такое распределение ионов (Рис. 3.9) объясняет увеличение содержания ватерита наряду с улучшением «качества» получаемых частиц, например, таких параметров, каких размер и вид распределения частиц по размерам. Содержание ватерита в образцах рассчитывают из данных XRD с использованием уравнения Рао [184]: ……………………….. (5) где IC и IV - интенсивности кальцита и ватерита, соотвественно, and fV - это содержание ватерита в образце. 3.3.3 СЭМ и XRD анализ кристаллов карбоната кальция СЭМ изображения образцов, полученных в чистой воде при трех различных концентрациях реагентов и 4 скоростях подачи ионов кальция, представлены на рисунке 3.11 (a-l). На рисунке 3,11 (a-d) представлены СЭМ изображения образцов, полученных при концентрации реагентов 0,05 М и скоростях подачи, R1, R2, R3 и R4 соответственно. Рис 3.11 (а) демонстрирует две морфологии – сферическую и кубическую, что указывает на присуствие ватерита и кальцита в этом образце при высокой скорости подачи R1 (10 мл/мин). Рисунки 3.11 (b-d) демонстрируют одну ромбовидную морфологию фазы кальцита, что наблюдается для всех концентраций и означает, что при низкой скорости подачи ватерит перекристаллизовывается в кальцит. Представленные данные находятся в хорошем согласии с рентгено-фазовым анализом (рис. 13 (а)). СЭМ изображения образцов, приготовленных при соотношении 1:1 (этиленгликоль: H2O) представлены на рисунке 12 (a-l). Рисунок 3,12 (а, е) представляет две морфологии; кальцита и ватерита при высокой скорости подачи R1 (10 мл/мин) и концентрациях реагентов 0,05 М и 0,1М соответственно. Однако, процент кальцита очень 69 мал. На рисунке 3.12 (i) наблюдается одна фаза кальцита в этом образце с высокой скоростью подачи R1 (10 мл / мин) и концентрацией 0,33 М. При снижении скорости подачи до R2, процент ватерита (сферическая форма) увеличился, а кальцита уменьшился, как показано на рисунке 3.12 (b, f, j). При очень низкой скорости подачи (R3 и R4) наблюдается только ватерит, а также агрегаты, состоящие из нескольких частиц ватерита, что наблюдается для концентраций 0,05 и 0,1М, как показано на рис. 3,12 (c, g, d, h), однако для 0,33 М наблюдается две фазы, небольшой процент кальцита и высокий процент ватерита (рис. 3.12 (k, l)). Также, эти наблюдения на СЭМ-изображениях находятся в хорошем согласии с рентгено-фазовым анализом (рис 3.13 (b)). Рисунок 3.11 (a-l). СЭМ изображения частиц карбоната кальция, синтезированных в чистой воде H2O, 0.05M (a-d), 0.1M (e-h) и 0.33M (i-l) при четырех скоростях подачи R1, R2, R3, и R4, соответственно 70 Рисунок 3.12 (a-l). СЭМ изображения частиц карбоната кальция при соотношении этиленгликоль:вода (1:1) , 0.05M (a-d), 0.1M (e-h) и 0.33M (i-l) при четырех скоростях подачи R1, R2, R3, и R4, соответственно. 71 Рисунок 3.13. XRD пики частиц карбоната кальция, полученных в чистой воде (a) и при соотношении этиленгликоль: H2O (1:1) (b) 72 На рисунках 3.14, 3.15 (a-l) приведены СЭМ изображения кристаллов, полученные при соотношении этиленгликоль: Н2О (4:1) и (6:1), соответственно. СЭМ показывает заметное изменение формы ватерита и полиморфизма кристаллов карбоната кальция с уменьшением скорости подачи. Рис 3.14, 3.15 (a, e, i) показали, что образуются две фазы ватерита и кальцита в этом образце при высокой скорости подачи R1 (10 мл/мин), и концентрациях реагентов 0,05 М, 0,1 М и 0,33М, соответственно. Однако процент кальцита очень мал по сравнению таковым при соотношении 1: 1 (этиленгликоль:H2O). При низкой скорости подачи реагента наблюдается только сферическая фаза ватерита с узкой дисперсией размеров на рис 3.14 (b, c, d) и рис 3.15 (f, g, h). СЭМ показывает преобразование кристаллической формы ватерита от сферической до эллиптической, особенно в образцах, которые были подготовлены при 0,05 и 0,1 М и для обоих соотношений этиленгликоль:H2O. Кроме того, эти наблюдения в СЭМизображениях находятся в хорошем согласии с рентгено-фазовым анализом (рис 3.16 (a, b)). Из СЭМ изображений следует, что размер частиц ватерита изменяется в зависимости от соотношения этиленгликоль:H2O, концентрации реагентов и скорости подачи ионов кальция. 73 Рисунок 3.14 (a-l). ). СЭМ изображения частиц карбоната кальция при соотношении этиленгликоль:вода (4:1) , 0.05M (a-d), 0.1M (e-h) и 0.33M (i-l) при четырех скоростях подачи R1, R2, R3, и R4, соответственно 74 Рисунок 3.15 (a-l). СЭМ изображения частиц карбоната кальция при соотношении этиленгликоль:вода (6:1) , 0.05M (a-d), 0.1M (e-h) и 0.33M (i-l) при четырех скоростях подачи R1, R2, R3, и R4, соответственно . 75 Рисунок 3.16. XRD пики частиц карбоната кальция, синтезированного при соотношении этиленгликоль: вода (4:1) и (a) (6:1) 76 3.3.3.1 СЭМ и XRD оптимизированных условиях анализ кристаллов карбоната кальция при Характеризацию полученных кристаллов карбоната кальция проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии и рентгеновской дифракции. На рисунке 3.17 (ad) приведены СЭМ изображения кристаллов, полученных при соотношении этиленгликоль:вода (4: 1) и концентрации реагентов 0,05 и различных скоростях подачи ионов кальция. Из данных изображений можно видеть изменения морфологии и полиморфизма кристаллов карбоната кальция, например, с уменьшением скорости подачи ионов кальция. Морфология частиц карбоната кальция, полученных при высокой скорости подачи ионов кальция R1, представлена на рисунке 3.17 (а). Видно, что в данном случае в образце присутствуют два полиморфа - ватерит и кальцит. Рисунок 3.17. (а-d). СЭМ изображения частиц CaCO3, полученных при соотношении, этиленгликоль:вода (4:1) и концентрации реагента 0.05 М с различной скоростью подачи: (а) R 1 = 0.167 мл/сек, (б) R2 = 0.167 мл/мин, (с) R 3 = 0.084 мл/мин и (г) R 4 = 0.042 мл/мин, соответственно 77 Основная кристаллографическая форма при скорости подачи R1 была представлена кальцитом, как показано на рисунках 3.17(а) и 3.10 (G1). С уменьшением скорости подачи до R2 отмечается присутствие как ватерита так и кальцита, хотя основной фракцией является кальцит (рис. 3.17(b). Далее с уменьшением скорости подачи ионов кальция до R3 в образце наблюдается только ватерит (рис. 3.17(с)) и эти параметры синтеза являются оптимальными. Размер кристаллов ватерита был снижен с 0,75 ± 0,21 мкм для R2 до 0,4 ± 0,1 мкм при R3, как показано на рисунке 3.8 (b) и 3.17 (b,c). Кроме того, следует отметить достаточно однородное распределение полученных частиц ватерита по размерам с низким индексом полидисперсности, величина которого составила 0.01. При наиболее низкой скорости подачи ионов кальция R4 наблюдалось образование ватерита, однако стоит отметить формирование агрегатов и, кроме того, размер частиц ватерита вырос до 0,71 ± 0,24 мкм (рис. 3.17 (d)). Сравнение рисунков 3.17 с и 5(d) показывает (см. вставку), что сферическая форм кристаллов ватерита переходит в эллиптическую. Эта тенденция особенно характерна для образцов, полученных при соотношении этиленгликоль:вода 4:1 и 6:1 при низкой скорости подачи ионов кальция R3 и R4. Аналогичная трансформация сферических частиц ватерита в эллиптическую форму описана и в других работах [30, 55, 195]. Было установлено, что время реакции играет важную роль в изменении морфологии, и содержание эллиптических кристаллов ватерита возрастает с увеличением времени реакции, особенно в присутствии EG [30]. Был сделано предположение, что эллиптические частицы образуются как результат агрегации первичных нанокристаллов, формирующихся в начале реакции. По мере увеличения числа наночастиц их суммарная энергия поверхности растет, следовательно, первичные наночастицы агрегируют с образованием кристаллов эллипсоида [30, 55, 195]. Но главная причина для этого перехода до сих пор неизвестна. Рентгеновские дифрактограммы кристаллов, полученных при разной скорости подачи ионов кальция и концентрации реагентов 0,05 М при соотношении этиленгликоль: H2O (4: 1) представлены на рисунке 3.18. 78 Рисунок 3.18. Рентгено-фазовый анализ частиц карбоната кальция, полученных при соотношении этиленгликоль:вода (4:1), концентрации реагентов 0.05M и различных скоростях подачи ионов кальция На основе анализа рентгенограммы на рисунке 3.18, характерные пики кальцита при 2Ɵ 29.40, 35.90 and 39.50 соответствуют (104), (110) и (113) кристаллографическим плоскостям кальцита, соответственно [196]. Фазе ватерита соответствуют кристаллографические плоскости (004), (111), (112), (113) и (041) при 24.800, 27.05 0, 32.70,49.870 и 52.440, соответственно [197]. Как можно видеть из рисунка 3.18, пики как кальцита, так и ватерита наблюдаются при высокой скорости подачи R1. С уменьшением скорости подачи до R2, рентгенограмма показывает уменьшение пиков интенсивности кальцита и увеличение интенсивности пиков ватерита. При более низкой скорости подачи R3 и R4 пики кальцита полностью исчезли, и наблюдается только пик ватерита. Наблюдаемые изменения содержания ватерита указывают, что скорость подачи влияет на зарождение и рост кристаллов ватерита. Снижение скорости подачи дает преимущество роста ватерита по сравнению с кальцитом. Оценка размера кристаллитов на основе уравнения Шерера показала, что размеры кристаллитов из кальцита и ватерита изменяются в диапазоне от 46 до 52 нм и 10,4 до 15,8 нм, соответственно. Фазы, размер и форма полиморфов при различных скоростях подачи и концентрациях реагентов и соотношении этиленгликоль:Н2О приведены в таблице 3.2. 79 Таблица 3.2 - Фазы, размер и форма полиморфов карбоната кальция при различных скоростях подачи и концентрациях реагентов, и при соотношении этиленгликоль: H2O Размер кристалл ита в кальците, нм Размер кристалл ита в ватерите, нм 48 Размер, мкм Ватерит, % Длинная ось Короткая ось 15,8 2,2 ± 0,6 - 3 50 15,8 1 ± 0,2 - 71 48 15,8 0,6 ± 0,3 - 95 48 15,8 0,5 ± 0,2 - 98 50 0 0 0 0 52 15,8 1,2 ± 0,4 - 80 0 15,8 0,75 ± 0,3 - 100 0 15,8 0,8 ± 0,3 - 100 48 50 0 0 0 0 0 0 0 0 50 15,8 1,4 ± 0,3 - 58 50 15,8 1,3 ± 0,2 - 65 50 10,4 1,3 ± 0,3 - 37 50 10,4 0,7 ± 0,3 - 90 0 10,4 0,4 ± 0,20 - 100 0 10,4 0,71 ± 0,3 0,41 ± 0,1 100 50 10,4 2,6 ± 0,4 - 35 49 10,4 1,2 ± 0,4 - 85 0 10,4 0,5 ± 0,2 - 100 0 10,4 0,8 ±0,3 0,5 ± 0,2 100 48 10,4 2,7 ± 0,6 - 25 50 10,4 1,5 ± 0,4 - 52 0 10,4 1,1± 0,2 0,7 ± 0,2 97 0 10,4 0,8 ± 0,3 0,45 ± 0,1 100 50 10,4 2 ± 0,4 - 80 80 Форма ватерита сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая сферичес кая эллиптич еская сферичес кая сферичес кая сферичес кая эллиптич еская сферичес кая сферичес кая эллиптич еская эллиптич еская сферичес Полимор фная модифик ация ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит кальцит ватерит+ кальцит Скорость подачи, мл/мин Соотнош ение EG:H2O 10 0,167 0,05 0,084 0,042 10 0,167 ватерит 0,084 ватерит 0,042 кальцит кальцит ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит 10 0,167 ватерит 0,084 ватерит 0,042 ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит Концентр ация реагенто в 0,084 1:1 0,1 0,33 0,042 10 0,167 0,05 10 0,167 0,1 ватерит 0,084 ватерит 0,042 ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит 0,167 ватерит 0,042 ватерит+ 10 4:1 10 0,33 0,084 0,05 6:1 50 10,4 0,9 ± 0,2 0,5 ± 0,1 98 0 10,4 0,85 ±0,2 0,5 ± 0,2 100 0 10,4 0,9 ± 0,1 0,55 ± 0,2 100 49 10,4 2,4 ± 0,5 - 83 48 10,4 1,2 ± 0,3 - 95 0 10,4 0,9 ± 0,2 0,6 ±0,1 100 0 10,4 0,95 ± 0,2 0,65 ± 0,2 100 50 10,4 2,7 ± 0,3 - 85 49 10,4 1,5 ±0,3 - 98 0 10,4 0,95 ±0,2 0,66 ± 0,2 100 0 10,4 1 ± 0,3 0,7± 0,3 100 49 15,8 3,1 ± 0,2 - 18 49 49 49 - - - - 49 15,8 3,5 ± 0,5 - 24 49 49 49 - - - - 49 15,8 3,9 ± 0,5 - 29 49 49 49 - - - - кая эллиптич еская эллиптич еская эллиптич еская сферичес кая сферичес кая эллиптич еская эллиптич еская сферичес кая сферичес кая эллиптич еская кальцит ватерит+ кальцит 0,167 ватерит 0,084 ватерит 0,042 ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит 10 0,167 0,1 ватерит 0,084 ватерит 0,042 ватерит+ кальцит ватерит+ кальцит 10 0,167 ватерит 0,084 эллиптич еская ватерит 0,042 сферичес кая Сфериче ская сферичес кая - ватерит+ кальцит кальцит кальцит кальцит ватерит+ кальцит кальцит кальцит кальцит ватерит+ кальцит кальцит кальцит кальцит 0,33 10 0,167 0,084 0,042 0,05 10 0,167 0,084 0,042 0,1 Чистая H 2O 10 0,167 0,084 0,042 0,33 3.4 Выводы к главе Было изучено влияние способа перемешивания реакционной смеси на размер, дисперсность, кристаллографическую фазу образующихся СаСО3 частиц и выход реакции, а также возможность масштабирования процесса синтеза без потери «качества» частиц. С этой целью, перемешивания были поставлены реакционной три смеси: эксперимента, ультразвуковая различающиеся гомогенизация способом реакционного раствора, перемешивание с магнитной мешалкой и синтез CaCO3 без дополнительного 81 перемешивания, в котором только диффузия влияет на распределение реагентов. Результаты показали, что размер частиц, индекс дисперсности (PDI), массовый выход и распределение по размерам сильно зависит от способа смешивания. УЗ перемешивание обеспечивает лучшее Ca2+ и CO32- распределение, ведущее к быстрому образованию маленьких поликристаллов ватерита (0,9 ± 0,1 мкм) с низкой дисперсией размеров (0,02) по сравнению с перемешиванием магнитной мешалкой и контролем без перемешивания. СЭМ и рентгено-фазовый анализ показали наличие только фазы ватерита в образцах, сформированных при обработке ультразвуком, однако отмечается образование смешанных фаз кальцита и ватерита в других образцах. Увеличение объема реакционной смеси в 8 раз при ультразвуковой гомогенизации позволяет масштабировать синтез без существенных потерь «качества» образца, который дает возможность вывести методику синтеза на промышленный уровень. Время реакции при УЗ перемешивании оказывает влияние на размер частиц, так как частицы ватерита образуются в течение 30 секунд и последующее увеличение времени реакции приводит лишь к его перекристаллизации в кальцит. Пористые частицы ватерита перпективы в качестве носителей как для высокомолекулярных веществ, таких как белки, так и для низкомолекулярных. Мы показали, что контейнеры, полученные при УЗ перемешивании имели более высокую эффективность загрузки (10 мас%) бычьим сывороточным альбумином по сравнению с другими образцами. Эффективность загрузки (1,5 мас%) для низкомолекулярных веществ (Родамин 6Ж) была одинакова для всех методов синтеза и не зависела от способа перемешивания реакционной смеси. Такие хорошие свойства загрузки, чувствительность к рН и биодеградируемые свойства открывает возможность применения ватерита в качестве платформы для доставки противоракового лекарственного средства. Показано, что концентрация и скорость подачи реагентов, соотношение этииленгликоль: вода являются ключевыми параметрами для контроля над морфологией и размером частиц, а также полиморфизмом кристаллитов. Результаты показали, что скоость подачи ионов кальция [Са2+] оказывает влияние на размер и морфологию частиц карбоната кальция. Содержание кальцита увеличивается с увеличением концентрации 82 реагентов, высокой скорости подачи и низкое соотношение EG. Чистый ватерит получается при низкой скорости подачи и низкой концентрации и высоком содержании EG. Различные формы ватерита, такие как сферические и эллиптические, были произведены в зависимости от параметров синтеза. В водном растворе [Ca2+] и [CO3-2] превоначально формируют кальцит и ватерит, который быстро превращается в чистый кальцит при средней и низкой скорости подачи (R2-R4) . В чистом виде ватерит был получен при малой скорости подачи 0,084 мл / мин, с низкой концентрации реагента 0,05 М и соотношении этиленгликоль-вода (4:1). Наименьший размер частиц ватерита составил 0,4 ± 0,12 мкм при скорости подачи R3 = 0,084 мл / мин, соотношении этиленгликоль: H2O (4: 1) и концентрации реагентов 0,05 М. Частицы ватерита имели сферическую форму с размером 0,4-2,7 мкм и эллиптическую с параметрами (0,4-0,7) и (0,7-1,1) мкм. 83 ГЛАВА 4. Получение микронных и субмикронных частиц ватерита и гидроксиапатита и их применение в качестве платформ для гигантского комбинационного рассеяния 4.1 Формирование субмикронных частиц гидроксиапатита Синтез поликристаллических сферических частиц ватерита проводили по классической методике путем осаждения из насыщенных растворов CaCl 2 и Na2CO3 при перемешивании [7, 188], в основе которой лежит рост первичных наночастиц, которые образуются мгновенно при сливании исходных растворов солей [188]. Добавка этиленгликоля в реакционной смеси снижает диффузию ионов, скорость роста кристаллов, увеличивает и количество зародышей с размером, превышаюшим критический радиус, таким образом, приводя к образованию стабильных частиц ватерита [8]. Таким образом, присутствие этиленгликоля, позволяет контролировать рост кристаллов, что опосредованно влияет на их размер [198]. Частицы гидроксиапатита HА были получены из синтезированных частиц ватерита с помощью ионообменной реакции в присутствии фосфат-ионов [199]. Реакционная схема предлагается в следующем виде: 6Na2HPO4 + 2H2O → Ca(PO4)6(OH)2 + 6Na2CO3 + 4H2CO3 СЭМ изображение темплатов ватерита, полученных при концентрации этиленгликоля 83% и их распределение по размерам представлены на рисунке 9 (а) и (с). СЭМ изображение HА частиц и их распределение по размерам показаны на рисунке 9 (b) и (d). Видно, что поверхность частиц гидроксиапатита покрыта наноиглами и напоминает «морскогой ежа». Для контроля размера получаемых неорганических частиц мы варьировали концентрацию этиленгликоля в реакционной смеси. Экспериментально полученная корреляция размера получаемых частиц с концентрацией этиленгликоля в реакционной смеси продемонстрирована на рисунке 10, из которого видно, что с увеличением содержания этиленгликоля снижается размер синтезированных частиц. Так, самые маленькие сферы карбоната кальция (0.5 ± 0.1 нм) были получены при наибольшей концентрации этиленгликоля (83%), в то время как максимальный размер (4.1±0.9 нм) частиц был показан для концентрации этиленгликоля 20%. 84 Рисунок 4.1. СЭМ изображения частиц: (а) субмикронных частиц карбоната кальция, синтезированных в присутствии EG (83%); (b) частицы HА, полученные из СаСО3 темплатов по реакции ионного обмена в присутствии фосфат-ионов. Распределение по размерам рассчитано на основе СЭМ анализа (n = 300, SD = 0,1): (c) частицы карбоната кальция; (d) частицы гидроксиапатита Кроме того, показано, что размер частиц гидроксиапатита коррелирует с размером матричных частиц CaCO3 (рис. 10) и варьируется от 0,6±0,1 до 4,3±1,1 нм. Электрокинетический потенциал HA частиц в водной суспензии при рН = 6.9 составил 24 мВ. 85 Рисунок 4.2. Зависимость размера частиц карбоната кальция (черная кривая с квадратами) от концентрации этиленгликоля в растворе. Время перемешивания было 15 мин в течение всех экспериментов. Зависимость размера HA частиц, полученных из соответствующих частиц карбоната кальция, с помощью реакции ионного обмена (красная линия с кругами) Энерго-дисперсионный спектр частиц HА представлен на рисунке 4.3 (а). Пик кремния связан с пластиной монокристаллического кремния, которая использовалась в качестве субстрата для СЭМ и EDX анализа. Полуколичественный анализ находится в согласии с элементным составом HA и примеси не присутствовали в осадке, как показано на рисунке 4.3 (а). Рис. 4.3 (б) сравнивает X-Ray дифракционную картину частиц HА (кривая 1) со спектром макрокристаллического HA кристаллографической базы данных (кривая 2), полученного из [http://dx.doi.org/10.1093/nar/ gkr900]. Все наблюдаемые XRD пики находятся в согласии. Для того, чтобы продемонстрировать потенциал применения неорганических частиц в качестве платформ для регистрации гигантского комбинационного рассеяния, поверхность неорганических частиц карбоната кальция и гидроксиапатита (3,1 ± 0.6 и 3,3 ± 0,8 мкм, соответственно) была модифицирована наночастицами серебра в качестве активных комбинационных центров. 86 Рисунок 4.3. Рентгеновские спектры, показывающие состав частиц. (а) энергодисперсионный рентгеновский анализ субмикронных частиц карбоната кальция (пунктирная линия) и гидроксиапатита (сплошная линия); (б) дифракция рентгеновских лучей анализ HA частиц. Экспериментальная кривая для частиц (1) с размером 500 нм по сравнению с теоретической рентгеновской дифракционной картиной (2) 4.2 Получение частиц гидроксиаппатита микронного размера Частицы CaCO3 микронного размера были получены реакцией соосаждения эквимолярных растворов карбоната натрия и хлорида кальция при различных условиях. Частицы карбоната кальция микронного размера были получены в воде при ультразвуковой обработке под воздействием более высокой плотности мощности. Их синтез основан на росте кристаллов ватерита поликристаллической модификации сферической формы, осаждаемых из концентрированных растворов CaCl2 и Na2CO3 [188]. Средний размер частиц карбоната кальция, получаемых в процессе ультразвуковой обработки, составлял 1,20 ± 0,01 мкм, как показано на рисунке 4.4 (а). Распределения по размерам были рассчитаны на основе изображений СЭМ частиц карбоната кальция (Рис. 87 4.4 (а)). На рисунке 4.4 (с) показано распределение по размерам для частиц карбоната кальция микронных размеров. Мы наблюдали частицы CaCO3 микрометрических размеров с большой дисперсией размеров и индексом полидисперсности (PDI) равным 0.07. Около 35% частиц были менее 1 мкм, а максимальный и минимальный размер частиц составлял 2,0 мкм и 0,5 мкм, соответственно. Полученные частицы CaCO3 были использованы для изготовления частиц гидроксиапатита микронного размера с помощью ионообменной реакции. Изображения СЭМ частиц HА микронных размеров показаны на рисунке 4.4 (b). Рисунок 4.4 (b) ясно показывает, что осажденные частицы имеют сферическую форму и большое количество тонких игл на поверхности, напоминая морского ежа. Было обнаружено, что каркас из такого игольчатого гидроксиаппатита с нанокомпозитным покрытием улучшает механические и биологические свойства, что является важным для применения его при регенерации костной ткани [200]. Сравнение соответствующих изображений этих образцов не выявило каких-либо существенных изменений между морфологией и наблюдаемым изменением размера частиц, который зависит от процесса, используемого для получения прекурсора CaCO3. Таким образом, для того, чтобы получить большое количество игольчатых частиц в осадке HА, было установлено, чтобы эффективным подходом будет оставить суспензию на ночь после завершения процесса осаждения. Рисунок 4.4 (d), показывает гистограмму распределения по размерам для микронных частиц гидроксиапатита, из которой был рассчитан средний размер частиц HА, равный 1,40 ± 0,05 мкм с показателем полидисперсности (PDI) 0,06 и размер игл, который составил менее 100 нм. Кроме того, мы наблюдали частицы HА микронного размера с большой дисперсией в размерах, присутствовало около 15% более мелких частиц (<1 мкм) и около 85% больше, чем 1 мкм. Максимальный и минимальный размер частиц был равен 2 и 0,5 мкм, соответственно. 88 Рис 4.4. СЭМ изображения синтезированных частиц карбоната кальция и гидроксиапатита микронного размера (A, B) и гистограммы распределения по размерам для частиц карбоната кальция и гидроксиапатита микронного размера (C, D), соответственно Размер кристаллов порошков HА обратно пропорционален ширине пика в соответствии с уравнением Дебая-Шерера (ур-е 2.) [183] ……………………………………………………………………..……….………(4) где β представляет собой полную ширину на полувысоте пика интенсивности отражения; λ — длина волны Cu-Kα (λ = 0,155 нм); К — безразмерный фактор формы, со значением, близким к единице. Коэффициент формы имеет типичное значение около 0,9, но зависит от фактической формы кристаллита; и D представляет собой размер кристаллов в 89 нанометрах. Инструментальное уширение учитывалось при обработке данных. Размеры кристаллитов порошка HА оцениваются в пределах порядка 77, 55,4 и 30,2 нм для плоскостей 002, 121 и 130, соответственно. Дзета-потенциал имеет важное влияние на стабильность раствора частиц. Дзетапотенциал микронных частиц CaCO3 и HА составлял 9,04 и -26,0 мВ, соответственно, в водной суспензии при рН равном 6,9. В общем, коллоидная система считается стабильной если она имеет абсолютное значение дзета-потенциала выше 30 мВ, поскольку поверхностный заряд предотвращает агрегацию частиц. На рис. 5. показано распределение дзета-потенциала (A) - частиц CaCO3 и (В) - частиц HА. Рисунок 4.5. Распределение дзета-потенциала частиц CaCO3 (а) и HА (b) 4.2.1 Идентификация фаз Энергодисперсионная распределение состава рентгеновская элементов в спектроскопия полученном (EDX) образце показала, что соответстствует гидроксиаппатиту. На рисунке 4.6 показаны элементы, содержащиеся в частицах HА микронных размеров. Также полуколичественный анализ показал, что соотношение элементов согласуется с химической формулой HА Ca10(PO4)6(OH)2. 90 Рисунок 4.6. Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия частиц карбоната кальция (чёрная линия) и гидроксиаппатита (HA) (красная линия) микронных размеров На рисунке 4.7 где представлены рентгеновские дифрактограммы больших частиц HА (1) по сравнению с ожидаемыми (2). Экспериментальная кривая для крупных частиц HА показывает хорошее согласие пиков HА с приведёнными в базе данных. Рисунок 4.7. Анализ дифракции рентгеновских лучей частицами HА a) крупные частицы, b) теоретический спектр 91 4.3 Модификация неорганических ядер наночастицами серебра Распределение серебра на поверхности микрочастиц показано на рис. 8. Пористая морфология поверхности CaCO3 и покрытая иглами поверхность HА служит центрами кристаллизации для агрегатов серебра. Коллоиды, функционализированные серебром, тестировали на способность детектировать молекулы с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Родамин В был выбран в качестве модельного вещества для экспериментов с ГКР. Перед получением спектров ГКР микрочастицы CaCO3 и HА инкубировали в растворе родамина B в метаноле в концентрации 10-5М в течение 20 мин. После этого капля наноплазмонных шариков переносилась на покровное стекло. Сигналы ГКР были измерены в сухом состоянии. 4.4 Спектроскопия комбинационного рассеяния Несколько характеристических пиков родамина B с волновыми числами 625, 1187, 1325, 1502, 1645 см-1 наблюдалось на поверхности наноплазмонных частиц CaCO3 и HА (рис. 4.8, кривые 1 и 2, соответственно). Эти пики сравнивались с эталонным спектром родамина В (рис. 4.9, кривая 4). Кластеры серебра на поверхности микрочастиц CaCO3 и HА способствовали усилению сигнала комбинационного рассеяния родамина В. Для оценки эффективности усиления на наноплазмоных микрочастицах оценивался коэффициент усиления ГКР (EF). Мы использовали определение среднего фактора усиления ГКР на основе формулы 10: (10) где ISERS и IRS — интенсивности сигнала ГКР и комбинационного рассеяния (высота пика 1502 см-1 ароматических бензольных колец), полученные в одинаковых условиях. Nvol и NSurf относятся к среднему числу молекул в объёме, участвующем в процессе комбинационного рассеяния для КР- и ГКР-экспериментов. Для оценки фактора усиления диаметр молекул родамина B считался равным 1,5 нм. 92 Рисунок 4.8. СЭМ изображения микрочастиц CaCO3 and HА до (a, b, соответственно) и после осаждения серебра (c, d, соответственно) с помощью реакции серебряного зеркала. Использовался режим вторичных электронов для изображений a, b; c, d изображения были получены в режиме рассеянных электронов. На врезках изображена поверхность микрочастиц при большем увеличении Использование длинноволнового лазера с длиной волны излучения 785 нм позволяло получать сигнал комбинационного сигнала с пренебрежимым влиянием его собственной люминесценции. С помощью уравнения 10 оценивался средний коэффициент усиления, он был равен 4,2 × 108 и 3,6 × 108 для наноплазмонных микрочастиц CaCO3 и HА, соответственно. Полученные значения соотносятся с данными из других источников, описывающих различные варианты сборок на основе наночастиц серебра [201-203]. Тем не менее, оценочные значения фактора усиления являются низкими, как было замечено Кнейпом для кластеров серебра [204]. Очевидно, что EF для обоих типов наноплазмонных микрочастиц одного порядка. Принимая во внимание шероховатости поверхностей частиц 93 CaCO3 и HА, можно ожидать равную вероятность формирования кластеров серебра в течение химической реакции, хотя, пористые поверхности микрочастиц CaCO3 обладают высоким адсорбционным сродством к наночастицам, как это было установлено ранее [205]. Оба типа наноплазмонных микрочастиц могут быть привлекательными в качестве платформы для ГКР экспериментов. Способность этих частиц к инкапсуляции раличных биологически активных веществ будет дополняться сенсорными свойствами. Нестабильность карбоната кальция в водных растворах вызывает высвобождение инкапсулированного вещества [206] и может быть полезно для комбинирования платформы ГКР с дополнительной функцией доставки лекарственных средств, в то время, как стабильность частиц HА открывает возможность долговременного нахождения такой ГКР-платформы в водном растворе. Рисунок 4.9. Спектры ГКР родамина B, полученные на поверхности покрытых плазмонным серебром микрочастиц CaCO3 (кривая 1) и HА (кривая 2). Эталонные спектры комбинационного рассеяния функционализированых серебром сфер CaCO3 (кривая 3) и раствора родамина В с концентрацией 10-5 в метаноле (кривая 4). Звездочками показаны соответствующие родамину линии КР. Положение пика КР на 1093 см -1 соответствует колебаниям молекулярных групп CO3-2 в ватерите. Все спектры получали на длине волны лазерного излучения 785 нм при мощности 20 мВт 94 4.5 Выводы по главе Был реализован синтез микронных и субмикронных частиц гидроксиапатита с использованием сферических частиц карбоната кальция в качестве темплатов. Анализ данных СЭМ показал развитую поверхность гидроксиапатита с большим количеством наноигл. Экспериментальные данные ясно показывают, что этиленгликоль является важным компонентом для контроля размера частиц СаСО3. Агрегаты серебра, выращенные на поверхности частиц CaCO3 и HА частиц, будут являться оптическиактивными центрами. Используя эти микрочастицы была получена детекция родамина B с помощью ГКР без дополнительного мечения. Неоднородность поверхности ГКР платформы является ключевым параметром повышения фактора усиления ГКР сигнала до 108. Пористость также представляет интерес для внедрения в поры различных биологически активных молекул, что подразумевает развитие многофункциональных носителей различных веществ. 95 ГЛАВА 5. Влияние добавок частиц гидроксиапатита и карбоната кальция на механические свойства нетканых композиционных материалов на основе поликапролактона 5.1 Морфология нетканых композитных материалов СЭМ изображения синтезированных частиц карбоната кальция и гидроксиапатита показаны на рис. 5.1 (а, b). Частицы карбоната кальция сферической формы (ватерит) были получены при ультразвуковой обработке (рис. 5.1 (а)), при этом их средний размер составил 1,20 ± 0,1 мкм. Из рисунка 5.1 (b) видно, что частицы HА имеют сферическую форму и игольчатую морфологию. Средний размер частиц HА составил 1,40 ± 0,5 мкм, а размер игл менее 100 нм. На рис. 5.1 (c-i) представлены СЭМ микрофотографии электроформованных волокон состава (с) из поликапролактона (d) PCL / 2,5% HA (е) PCL / 5% HA (f) PCL / 7,5% HA (g) PCL / 2,5% СаСО3 (h) PCL / 5% СаСО3 (i) PCL / 7,5% СаСО3, соответственно. Композитные волокна, содержащие частицы карбоната кальция и гидроксиапатита, были получены совместным электроформованием раствора полимера, в котором были диспергированы неорганические частицы. Морфология композитных волокон существенно не отличается от полимерных, однако отмечается значительное увеличение диаметра волокна [207]. Очевидно, при сравнении морфологии полимерных и композитных волокон (см. рис. 5.1с), включение обоих типов микрочастиц HA и СаСО3 в состав волокна, приводило к образованию дефектов структуры волокна в виде сферических частиц и их агрегатов. Например, для композитных электроформованных волокон (рис. 5.1 (f, i)), содержащих высокие концентрации (7,5 мас.%) неорганических частиц, отмечается значительное число дефектов. Формирование бусинной морфологии было связано с недостаточно эффективным распределением, а также аргегацией неорганических микрочастиц в полимерной матрице волокна. Для электроформованных волокон поликапролактона средний диаметр составил ~ 0.35 ± 0.10 мкм, в то время как для композитных волокон, он варьировался от 0.66 ± 0.20 мкм и 1.60 ± 0.39 мкм с дефектами и 0.36 ± 0.15 мкм и 0.59 ± 0.22 мкм без дефектов (см. таб. 5.1). Таким образом,, диаметр электроформованных композитных волокон растет с увеличением массовой доли неорганического наполнителя до 5%. 96 Наблюдаемое увеличение диаметра композитных волокон по сравнению с полимерными по нашему мнению является результатом повышения вязкости раствора для электроформования благодаря присутствию частиц наполнителя [208]. Кроме того, наблюдается уменьшение диаметра волокна при массовой доле частиц карбоната кальция и гидроксиапатита 7,5% (таб. 5.1), когда средний диаметр волокна вычисляется без учета дефектов (таб. 5.1), что можно объяснить увеличением вязкости дисперсии при увеличении массовой доли наполнителя. Таблица 5.1 - Средний диаметр композитных волокон с и без дефектов, полученных путем статистического анализа СЭМ-изображений волокон с различной массовой долей наполнителя Композит Средний диаметр волокна с Средний диаметр волокна без учета учетом дефектов, мкм дефектов, мкм PCL 0,35 ± 0,10 0,35 ± 0,10 PCL\ 2.5 % HA 0,78 ± 0,26 0,49 ± 0,20 PCL\ 5 % HA 1,10 ± 0,12 0,56 ± 0,20 PCL\ 7.5 % HA 1,60 ± 0,39 0,36 ± 0,15 PCL\ 2.5 % CaCO3 0,66 ± 0,20 0,57 ± 0,24 PCL\ 5 % CaCO3 0,97 ± 0,28 0,59 ± 0,22 PCL\ 7.5 % CaCO3 1,37 ± 0,35 0,50 ± 0,24 97 Рисунок 5.1 (a, b) СЭМ микрофотографии синтезированных частиц карбоната кальция и гидроксиапатита, соответственно; (c-i) СЭМ микрофотографии электроформованных волокон на основе поликапроклактона (с) PCL (d) PCL / 2,5% HA (е) PCL / 5% HA (f) PCL / 7,5% HA (g) PCL / 2,5% СаСО3 (h) PCL / 5% СаСО3 (l) PCL / 7,5% СаСО3, соответственно 98 Рисунок 5.2. СЭМ микрофотографии синтезированных частиц карбоната кальция и гидроксиапатита, соответственно; (c-i) СЭМ микрофотографии электроформованных волокон на основе поликапролактона (с) PCL (d) PCL / 2,5% HA (е) PCL / 5% HA (f) PCL / 7,5% HA (g) PCL / 2,5% СаСО3 (h) PCL / 5% СаСО3 (l) PCL / 7,5% СаСО3, соответственно 99 5.2 Механические свойства полученных нетканых композитных материалов На рисунке 12 (а, b) продемонстрирована зависимость модуля упругости при растяжении (МПа) и прочности на разрыв (МПа) от массовой доли (mf) частиц гидроксиапатита и СаСО3 в композите. По сравнению с чистым полимерным волокном (рис. 5.3 а,b) предел прочности на растяжение композита PCL/HА, содержащего только 2,5% HА увеличивается на ~ 523% от 1,01 до 6,34 МПа, а модуль Юнга увеличивается на ~ 936% с 2,24 МПа до 23,21 МПа. Более того, при увеличении массовой доли гидроксиапатита с 2,5% до 5%, предел прочности на растяжение увеличивается на ~ 140% от 6,34 МПа до 15,4 МПа и модуль Юнга увеличивается на ~ 58% по сравнению с 23,21 МПа до 36,7 МПа. При дальнейшем росте массовой доли наполнителя с 5% до 7,5%, предел прочности на растяжение увеличивается на ~ 86% от 15,4 МПа до 28,7 МПа и модуль Юнга увеличивается на ~ 53% по сравнению с 36,7 МПа до 56,3 МПа. Аналогично можно проследить изменение механических параметров композитов, содержащих частицы карбоната кальция (рис. 5.3) по сравнению с чистым полимерным волокном. Так, предел прочности на растяжение PCL/CaCO3, содержащих только 2,5% CaCO3 увеличивается на ~ 236% от 1,01 до 3,67 МПа, и модуль Юнга увеличивается на ~ 230% от 2,24 МПа до 7,4 МПа. При увеличении массовой доли CaCO3 в композите с 2,5% до 5% предел прочности на растяжение увеличивается на ~ 94% по сравнению с 3,67 МПа до 7,14 МПа и модуль Юнга увеличивается на ~ 54% по сравнению с 7,4 МПа до 11,4 МПа. При дальнейшем увеличении массовой доли CaCO3 с 5% до 7,5% предел прочности на растяжение увеличивается на ~ 45% по сравнению с 7,14 МПа до 10,4 МПа и модуль Юнга увеличивается на ~ 86% по сравнению с 11,4 МПа до 21,3 МПа. 100 Рисунок 5.3 (a, b). Зависимость (а) модуля Юнга (МПа) и (b) предела прочности на разрыв (МПа) от массовой доли HA и CaCO3 в композитах Как показано на рисунке 5.3 (а, b), при увеличении массовой доли гидроксиапатита и карбоната кальция модуль Юнга и прочность на разрыв также увеличиваются. Относительное удлинение значительно уменьшается для композитов с более высоким содержанием гидроксиапатита, как и ожидалось. Этот результат можно объяснить теорией перераспределения нагрузки. Классическая теория распределения нагрузки предполагает, что напряжение может переходить из полимерной матрицы на армирующий наполнитель через межфазную границу. Армирующий компонент имеет более высокий модуль Юнга, чем полимерная матрица, и, таким образом, обеспечивает перераспределение нагрузки между армирующим компонентом и матрицей, таким образом, повышая прочностные характеристики композита [209]. Как уже отмечалось, существует три механизма переноса нагрузки от полимерной матрицы к наполнителю, первый заключается в микромеханическом взаимодействии, второй представляет собой образование химических связей между матрицей и наполнителем, третий механизм – слабое ванн-дер-ваальсовое взаимодействие между матрицей и наполнителем [210]. Распределение наполнителя в матрице также является важным фактором, влияющим на механические свойства композитов. Известно, что агломерация наполнителя может снижать механические характеристики композитов [211]. 101 Частицы гидроксиапатита и карбоната кальция покрываются поликапролактоном при формировании композитного волокна, что свидетельствует о хорошем качестве взаимодействия взаимодействие на границе обеспечивает полимерная более матрица/наполнитель. равномерное распределение деформирующей нагрузки, результатом чего является усиление механических свойств. мнению, это обусловлено ван-дер-ваальсовым Межфазное По нашему взаимодействием между поликапролактоном и неорганическими частицами карбоната кальция и гидроксиапатита, а также образованием водородной связи между поверхностью HA и CaCO 3 частиц и функциональными группами поликапролактона [212, 213]. С другой стороны, из СЭМ изображений видно, что неорганические частицы недостаточно равномерно распределены внутри волокна, и поэтому конечные величины прочности на разрыв не так высоки, как ожидалось. Кроме того, увеличение содержания наполнителя увеличивает число слабых - ван-дерваальсовых и водородных взаимодействий между наполнителем и волокном. Это объясняет, усиление механических свойств композитов с увеличением массовой доли наполнителя. Несмотря на то, что частицы карбоната кальция также усиливают механические свойства волокна PCL, однако прочность PCL \(mf)CaCO3 волокон меньше, чем таковая для PCL\(mf)HA волокон, содержащих гидроксиапатит. Это может быть обусловлено различным характером распределения частиц карбоната кальция и гидроксиапатита благодаря их различной морфологии, и соответственно различной эффективности взаимодействия с полимерной матрицей. 5.3 Регрессионный анализ механических свойств Метод наименьших квадратов был применен для приближенного нахождения значения модуля Юнга композитных волокон поликапролактона, содержащих неорганические частицы гидроксиапатита и поликапролактона [214]. Этот метод применяется для оценки отношения между переменными. Переменные в этом методе могут быть независимыми (массовая доля наполнителя) и зависимыми (модуль Юнга композита). Модуль Юнга является функцией массовой доли наполнителя волокна. Экспериментальные данные для различного содержания (массовой доли) гидроксиапатита 102 и карбоната кальция CaCO3 (таблица 5.2, 5.3) были использованы для проведения расчетов. Таблица 5.2 - Значения модуля Юнга композита, содержащего гидроксиапатит, в зависимости от массовой доли последнего. mf 0,0 0,025 0,05 0,075 Eexp (МПа) 2,24 23,21 36,7 56,3 Таблица 5.3 - Значения модуля Юнга композита, содержащего карбонат кальция, в зависимости от массовой доли последнего. mf 0,0 0,025 0,05 0,075 Eexp (MПa) 2,24 7,4 11,4 21,3 Мы принимаем, что E = F(mf) - модуль Юнга композита - является функцией массовой доли неорганического наполнителя в композите, которая в свою очередь, является функцией объемной доли Vf. Таким образом, пусть E = F(Vf). Существует правило смесей для твердых композитов: F (Vf ) Vf E f (1 Vf ) Em (11) где Vf - объемная доля наполнителя (HA или CaCO3), Ef - модуль Юнга наполнителя (HA или CaCO3), Em - модуль Юнга основного полимерного материала (поликапролактон). Соотношение между объемной и массовой долей определяется уравнением (12), где учитывается плотность при расчете объемной доли. Vf mf (12) m f (1 m f ) f m где ρ- плотность композита. Также упоминаются правила смесей для пористых композитов [215, 216]: F (Vf ) K Vf E f (1 Vf ) Em (13) где К - коэффициент, который зависит от химического состава матрицы и наполнителя. Модифицируем уравнение 13: F (Vf ) K1 Vf E f K2 (1 Vf ) Em 103 (14) где K1, K2 - коэффициенты, которые зависят от конкретной смеси. Таким образом, функция F (Vf) является линейной комбинацией двух функций. Основная цель метода наименьших квадратов - найти такие значения K1, K2, которые минимизируют сумму [E exp, i F2 (m f ,i )] , где i 1..4 i 5.4 Численное решение Для нахождения коэффициентов К1, К2 был использован программный пакет Mathcad с применением метода наименьших квадратов. Полученные функции для HA и CaCO3 были построены с использованием графического пакета Gnuplot и приведены на рисунке 5.4 и 5.5: сплошная линия - стандартная функция (правило смесей), кресты экспериментальные данные. На рис. 5.4(a) и 5.5(a) приведен график зависимости модуля Юнга композита от массовой доли наполнителя при варьировании последней от 0% до 100%, а рис. 5.4(b), 5.5(b) демонстрируют изменение модуля Юнга при изменении массовой доли от 0% до 20%. Рисунок 5.4 (a, b) Зависимость модуля Юнга (MПа) от массовой доли гидроксиапатита в композите 104 Рисунок 5.5 (a, b) Зависимость модуля Юнга (MПа) от массовой доли CaCO3 в композите Комбинируя экспериментальные и литературные данные из [217] и, используя методику, описанную выше, были рассчитаны K1, K2 для объединенных данных (функции Ec ,1 (m f ) ) и участка соответствующего графика (рис. 5.6) для PCL + HA композита. Рисунок 5.6 Зависимость модуля Юнга (MПа) от массовой доли гидроксиапатита в (PCL+HA) композите, полученная из экспериментальных данных [217] Чтобы предсказать поведение PCL + HA композита в следующей серии экспериментов может быть использована следующая приближенная функция mf (рис. 5.7). Был 105 использован полином (уравнение 15) для аппроксимации наших экспериментальных данных. Ec,2 (m f ) 2.792 762.5 m f 878.7 m f 2 1344 m f 3 4631 m f 4 5028 m f 5 ……(15) Рисунок 5.7. Приблизительно определенная величина модуля Юнга, полученная с использованием уравнения (15) n Стандарные отклонения [E exp, i Ec ,k (m f ,i )] i 1 ,i 1..4, k 1, 2 , для рассчитанного n2 модуля Юнга представлены в таблице 5.4: Таблица 5.4 - Стандартные отклонения для рассчитанных механических характеристик PCL+HA PCL+CaCO3 Ec (m f )(MPa) Ec,1 (m f )(MPa) Ec,2 (m f )(MPa) 2,3 1,9 14,8 --- 1,358 --- 5.5 Выводы по главе • В этом исследовании композиты на основе поликапролактона с HА и CaCO3 были получены методом электроформования. В полимерные волокна включали различное количество микрочастиц гидроксиаппатита и карбоната кальция что позволяло получать биоподобные материалы для клинических применений. 106 • Как модуль Юнга, так и максимальное значение напряжения растяжения увеличиваются с увеличением массовой доли частиц HА и CaCO3. Мы считаем, что существует ван-дер-ваальсово связывание между макромолекулами поликапролактона и поверхностью как частиц HА, так и CaCO3. Равномерное распределение наполнителя в полимерной матрице является важным для улучшения механических свойств композита. • Механические свойства существенно меняются при увеличении массовой доли HА и CaCO3., например, модуль Юнга и предельное напряжение растяжения композита, содержащего 7,5 весовых процентов HА были выше примерно в 25 и 28 раз по сравнению с волокнами поликапролактона, соответственно. Также для композитов, содержащих 7,5 мас.% CaCO3 эти величины были выше в 9 и 10 раз по сравнению с волокнами поликапролактона. • Был проведён регрессионный анализ механических свойств бинарных композитов (полимерная матрица/наполнитель), в результате которого получено аппроксимирующее уравнение для предсказания механических параметров нетканых материалов. Представленные стандартные отклонения механических параметров указывают, что результаты анализа можно использовать для предсказания модуля Юнга композита при массовой доле наполнителя в интервале 0,00 и 0,1. 107 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе диссертационного исследования были получены следующие основные результаты: Размер частиц, индекс полидисперсности (PDI), массовый выход, а также распределение по размерам частиц карбоната кальция, получаемых в процессе синтеза, зависит от способа перемешивания реакционной смеси. Так, применение ультразвука для перемешивания реакционной смеси при синтезе карбоната кальция обеспечивает равномерное распределение ионов кальция и карбонат-ионов и приводит к формированию частиц ватерита с наименьшим размером 0,9 ± 0,1 мкм и низким значением индекса полидисперсности (PDI 0,02) по сравнению с таковыми параметрами для частиц, полученных с использованием магнитной мешалки или при проведении синтеза без дополнительного перемешивания. Продемонстрирована возможность масштабирования синтеза частиц СаСО3 при участии ультразвука. Увеличение объемов исходных солей, участвующих в реакции в 8 раз приводит к аналогичному увеличению массового выхода образующегося карбоната кальция без потери его «качества», что открывает перспективы адаптации разработанной методики синтеза до промышленного уровня. С уменьшением скорости подачи ионов кальция и увеличении содержания этиленгликоля в реакционной смеси полиморфная модификация синтезированных кристаллов карбоната кальция изменяется от кальцита к ватериту. Ватерит в чистом виде был получен при низкой скорости подачи ионов кальция 0,084 мл/мин, концентрации реагентов 0,05 М и соотношении этиленгликоль: вода (4:1). Частицы ватерита наименьшего размера (0,4 ± 0,1 мкм) получены при скорости подачи R3 = 0,084 мл/мин, соотношении этиленгликоль:вода (4:1) и концентрации реагентов 0,05М. Был осуществлен синтез частиц гидроксиапатита микронного и субмикронного размера путем ионообменной реакции в присутствии фосфат-ионов с использованием частиц ватерита в качестве темплатов. Для управления размером темплатных частиц ватерита варьировали содержание этиленгликоля в реакционной смеси. Полученные частицы гидроксиапатита имели высокоразвитую поверхность, покрытую наноиглами. Независимо от размера частиц в интервале 0,6 ± 0,1 мкм размер частицы 108 гидроксиапатита отличается от размера темплатных частиц ватерита на 100 нм, что соответствует длине игл. Методом электроформования были получены композитные волокна на основе капролактона, содержащие различную массовую долю частиц гидроксиапатита и карбоната кальция с целью формирования биоподобных материалов для биомедицинского применения. Показано, что механические свойства полученных композитных волокон существенно зависят от массовой доли частиц гидроксиапатита и карбоната кальция в волокне. Например, модуль Юнга и предел прочности при растяжении композитов, содержащих 7,5 мас.% гидроксиапатита выше примерно в 25, и в 28 раз по сравнению с полимерным волокном, соответственно. Для композитов, содержащих 7,5 мас.% карбоната кальция, соответствующие механические характеристики были выше в 9 и 10 раз по сравнению с чистым полимером. Был проведен регрессионный анализ механических свойств бинарных композитов (полимерная матрица/наполнитель), в качестве результата было получено приближенное уравнение для оценки механических параметров нетканых материалов в зависимости от массовой доли наполнителя. Представленные стандартные отклонения механических параметров показывают, что результаты анализа могут быть использованы для прогнозирования модуля Юнга композита, когда массовая доля наполнителей составляет от 0,00 до 0,1. 109 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ β-TCP Бета-фосфат кальция HA Гидроксиапатит PVC Поли(винил)хлорид EDTA Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль PVA Поливиниловый спирт PLLA Поли-L-молочная кислота PCL Поликапролактон EG Этиленгликоль HDPE Полиэтилен высокой плотности PP Полипропилен ABS Акрилонитрилбутадиенстирол TPU Термопластичный полиуретан MWNTs Мультистенные углеродные нанотрубки СЭМ Сканирующая электронная микроскопия XRD Рентгеновская дифракция UTS Предел прочности на растяжение E Модуль Юнга 110 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 G. Wolf and C. Gunther; Thermophysical Investigations of the Polymorphous Phases of Calcium Carbonate // Journal of thermal Analysis and Calorimetry.2001 V.65,P. 687698. 2 S.-H. Rhee, Synthesis of hydroxyapatite via mechanochemical treatment // Biomaterials. 2002. V.23 P.1147–1152. 3 L.L. Hench, Biomaterials: a forecast for the future // Biomaterials .1998.V.19.P.1419– 1423. 4 B. Palazzo, M. Iafisco, M. Laforgia, N. Margiotta, G. Natile, C.L. Bianchi, et al. Biomimetic hydroxyapatite–drug nanocrystals as potential bone substitutes with antitumor drug delivery properties // Adv. Funct. Mater.2007.V.17.P.2180–2188. 5 S.-I. Roohani-Esfahani, S. Nouri-Khorasani, Z. Lu, R. Appleyard, H. Zreiqat, The influence hydroxyapatite nanoparticle shape and size on the properties of biphasic calcium phosphate scaffolds coated with hydroxyapatite-PCL com-posites // Biomaterials 2010.V.31. P.5498–5509. 6 W. Paul, C. Sharma, Ceramic drug delivery: a perspective // J. Biomater. Appl. 2003.V.17. P.253–264. 7 D. V Volodkin, A. I. Petrov, M. Prevot and G. B. Sukhorukov,. Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation // Langmuir, 2004, V. 20, P.3398–3406. 8 B.V. Parakhonskiy, A. Haase, R. Antolini, Sub-micrometer vaterite containers: synthesis, substance loading, and release // Angew. Chem. Int. Ed. Engl.2012.V. 51 .P.1195–1197. 9 S. Schmidt and D. V. Volodkin,.Microparticulate biomolecules by mild CaCO3 templating // J. Mater. Chem. B, 2013, 1, 1210. 10 B. Coller, H. Gralnick and S. Burt,. The effect of stir bar size and shape on quantitative platelet aggregation // Thromb. Res., 1976.V.8, P.121–129. 11 K. W. Payne, E. J. Eisenbraun and J. M. Lucas,. Magnetic Stirring with the Stirring Bar Length Exceeding the Vessel Diameter // J. Chem. Educ., 2002, V.79, P.217. 111 12 Joseph R. Smyth. The crystal structure of calcite III // Geophysical research letters. 1997 V. 24, no. 13, P.1595-1598. 13 Lowenstam, H. A.; Weiner, S. On Biomineralization; Oxford University Press: New York, 1989. (b) Mann, S. Biomineralization. Principles and Concepts in Bioinorganic materials Chemistry; Oxford University Press: New York, 2001. 14 Hou, W. T.; Feng, Q. L. Cryst. Growth Des. Morphologies and Growth Model of Biomimetic Fabricated Calcite Crystals Using Amino Acids and Insoluble Matrix Membranes of Mytilus edulis.2006, V. 6, P.1086–1090. 15 Naka, K.; Tanaka, Y.; Chujo, Y. Effect of Anionic Starburst Dendrimers on the Crystallization of CaCO3 in Aqueous Solution: Size Control of Spherical Vaterite Particles // Langmuir 2002, V.18, P.3655–3658. 16 V. Radhaa Transformation and crystallization energetics of synthetic and biogenic amorphous calcium carbonate.2010. V. 107 no. 38 .P.16438–16443. 17 http://www.reade.com/Products/Minerals_and_Ores/calcium_carbonate.html 18 http://www.surfacenet.de/html/caco3.html 19 Nicole span et al. the unusual mineral vaterite in shells of the fresh water // Nature wissenschaften. 2010.V.97:P.734-751. 20 Gesa Behrens, Liisa T. Kuhn, Rick Ubic, and Arthur H. Heuer. Raman spectra of vateritic calcium carbonate // Spectroscopy letters.1995.V. 28(6), P.983-995. 21 Takeshi Ogino, Toshio Suzuki and Kiyoshi Sawada; The formation and transformation mechanism of calcium carbonate in water; Geochimica et Cosmochimica // Acta; 1987, V 51; P.2757 – 2767. 22 Kamhi S.R. On the structure of vaterite, CaCO3 // Acta Crystallographic a. 1963;V.16:P.770-772. 23 Jianwei wang and Udo Becker. Structure and carbonate orientation of vaterite (CaCO3). // American Mineralogist 2009.V.94, P.380–386. 24 J. Yu et al. Facile preparation of calcium carbonate particles with unusual morphologies by precipitation reaction // Journal of Crystal Growth.2004.V. 261 P.566–570. 25 Ritika Gupta. Synthesis of Precipitated Calcium Carbonate Nanoparticles Using Modified Emulsion Membranes // A Thesis Presented to The Academic Faculty. 2004. 26 Williams. E Scott; Principles of Wet End Chemistry; TAPPI Press; 1996 112 27 The European Calcium Carbonate Association, Calcium Carbonate; 2004; http://www.ima-eu.org/en/Calcium. 28 T. Tsuzuki, K. Pethick and P. McCormick,. Synthesis of CaCO3 nanoparticles by mechanochemical processing // J. Nanoparticle Res. 2000, P.375–380. 29 M. Yashchenok, B. V. Parakhonskiy, S. Donatan, D. Kohler, A. G. Skirtach and H. Möhwald, polyelectrolyte multilayer microcapsules template on spherical, elliptical and square calcium carbonate particles // J. Mater. Chem. B, 2013, V.1, P.1223-1228. 30 B. V. Parakhonskiy, A. M. Yashchenok, S. Donatan, D. V. Volodkin, F. Tessarolo, R. Antolini, H. Möhwald and A. G. Skirtach, Macromolecule loading into spherical, elliptical, star-like and cubic calcium carbonate carriers // Chemphyschem, 2014, V. 15, P.2817–22. 31 M. Jevtić and D. Uskoković. Influence of Urea as Homogeneous Precipitation Agent on Sonochemical Hydroxyapatite Synthesis // Mater. Sci. Forum, 2007, V. 555, P.285–290. 32 M. D. Luque de Castro and F. Priego-Capote. Ultrasound assisted crystallization (sonocrystallization) // Ultrason. Sonochem, 2007, V.14, P.717–24. 33 R. M. Wagterveld, H. Miedema and G.-J. Witkamp. Effect of ultrasonic treatment on early growth during CaCO3 precipitation // Cryst. Growth Des, 2012, V. 12, P. 4403– 4410. 34 S. S. V. Dalvi and R. N. R. Dave. Controlling Particle Size of a Poorly Water-Soluble Drug Using Ultrasound and Stabilizers in Ant solvent Precipitation // Ind. Eng. Chem. Res., 2009, V.48, P.7581–7593. 35 G. Zhou, J. C. Yu, X. Wang and L. Zhang. Sonochemical synthesis of aragonite-type calcium carbonate with different morphologies // New J. Chem., 2004, V.28, P.10271031. 36 G. J. Price, M. F. Mahon, J. Shannon and C. Cooper,. Composition of Calcium Carbonate Polymorphs Precipitated Using Ultrasound. Cryst // Growth Des. 2011, V. 11, P. 39–44. 37 M. He, E. Forssberg, Y. Wang, and Y. Han, “Ultrasonication-assisted synthesis of calcium carbonate nanoparticles // Chemical Engineering Communications. 2005. V. 192, (10–12), P. 1468–1481. 38 S. S. Berdonosov, I. V. Znamenskaya and I. V. Melikhov, Inorg. Mechanism of the 113 Vaterite-to-Calcite Phase Transition under Sonication // Mater. 2005, V. 41, P.1308– 1312. 39 S. S. Berdonosov, I. V. Melikhov and I. V. Znamenskaya,. Layered agglomeration of primary vaterite nanoparticles during ultrasonic stirring // Inorg. Mater. 2005, V.41, P.397–401. 40 I. Nishida. Precipitation of calcium carbonate by ultrasonic irradiation // Ultrason. Sonochem., 2004, V.11, P.423–8. 41 Y. Kojima, K. Yamaguchi and N. Nishimiya. Effect of amplitude and frequency of ultrasonic irradiation on morphological characteristics control of calcium carbonate. // Ultrason. Sonochem., 2010, 17, 617–20. 42 Volodkin D. CaCO3 templated micro-beads and -capsules for bioapplications // Adv Colloid Interface Sci. 2013. 43 Gebauer D., Völkel A.,Cölfen H. Stable prenucleation calcium carbonate clusters. // Science. 2008. V.322. P.1819. 44 Meldrum F.C., Sear R.P. Now you see them // Science. 2008. V.322. P.1802. 45 Myerson A.S., Trout B.L. Nucleation from solution // Science. 2013. V.341. P.855. 46 Wallace A.F. Hedges L.O., Fernandez-Martinez A. et al Microscopic evidence for liquid-liquid separation in supersaturated CaCO3 solutions // Science. 2013. V.341. P.885. 47 Nielsen M.H., Aloni S., De Yoreo J.J. In situ TEM imagine of CaCO3 nucleation reveals coexistence of direct and indirect pathways // Science. 2014. V.345. P.1158. 48 Flaten E.M., Seiersten M., Andreassen J-P. Polymorphism and morphology of calcium carbonate precipitated in mixed solvents of ethylene glycol and water // J Cryst. Growth. 2009. V.311. P.3533-3538. 49 Rusanov A.I. Striking World of Nanostructures // Rus. J. Gen. Chem. 2002. Vol. 72, No. 4, P. 495-511. 50 Li Q., Ding Y., Li F., Xie B., Qian Y. Solvothermal growth of vaterite in the presence of 114 ethylene glycol, 1,2-propanediol and glycerin // J. Cryst. Growth. 2002. V.236. P.357362. 51 Chen Y., Ji X., Wang X. Microwave-assisted synthesis of spheroidal vaterite CaCO3 in water mixed solvents without surfactants // J. Cryst. Growth. 2010. V.312. P.3191-3197. 52 Flaten E.M., Seiersten M., Andreassen J-P. Introduction time studies of calcium carbonate in ethylene glycol and water // Chem. Eng. Res. Design. 2010. V.88. P. 16591668. 53 Flaten E.M., Seiersten M., Andreassen J-P. Growth of the calcium carbonate polymorph vaterite in mixtures of water and ethylene glycol at conditions of gas processing // J. Cryst. Growth. 2010. V.312. P.953-960. 54 Qi R-J., Zhu Y-J., Microwave-assisted synthesis of calcium carbonate (vaterite) of various morphologies in water–ethylene glycol mixed solvents // J. Phys. Chem. B 2006. V.110. P. 8302–8306. 55 Manoli F., Dalas E. Spontaneous presipitation of calcium carbonate in the presence of ethanol, isopropanol and diethylene glycol // J. Cryst. Growth. 2000. V.218. P.359-364. 56 Samar J. Kalita, Abhilasha Bhardwaj, Himesh A. Bhatt. Nanocrystalline calcium phosphate ceramics in biomedical engineering // Materials Science and Engineering C. 2007 .V.27 .P.441–449. 57 Amit Kumar Nayak . Hydroxyapatite Synthesis Methodologies //An Overview /Int.J. ChemTech Res.2010, V.2(2). 58 Introduction to Hydroxylapatite as given in en.wikipedia.org/wiki/Hydroxyapatite 59 Dorozhkin, S. V. “Calcium Orthophosphates as Bioceramics: State of the Art // Journal of Functional Biomaterials. 2010.V.1 (1):P. 22–107. 60 Sakshu J. Processing of Hydroxyapatite by Biomimetic Process. Thesis presented in 2010 61 Hench LL, Wilson J. An introduction to bioceramics // London: World Scientific, 1993. p. 8, 165, 170, 331, 335. 115 62 Naruporn J,Chokchai Y. Effect of Sintering on Microstructure and Properties of Hydroxyapatite Produced by Different Synthesizing Methods // Journal of Metals, Materials and Minerals. 2010. V.20 (.2). P.53-61. 63 Orlovskii, V. P. et al. Hydroxyapatite and Hydroxyapatite-Based Ceramics‖ // In organics Materials.2002. V. 38, P.973 – 984. 64 Puajindanetr, S. Characterization and Sintering of Precipitated Hydroxyapatite‖, Ph.D. Thesis, Queen Mary and Westfield College London, Great Britain .1993. 65 Brown, P. A, Hydroxyapatite and Related Materials //CRC Press, Inc. 1994.ISBN: 0 8493 - 4750 – 5. 66 Slosarczyk, A. et al. FTIR and XRD Evaluation of Carbonated Hydroxyapatite Powders Synthesized by Wet Methods // Journal of Molecular Structure.2005. V. 744-747, P. 657 – 661. 67 S. Kehoe. Optimization of Hydroxyapatite (HAp) for Orthopaedic Application via the Chemical Precipitation Technique. PhD thesis presented in 2013. 68 Suchanek, W. and Yoshimura, M. Processing and Properties of Hydroxyapatite-Based Biomaterials for use as Hard Tissue Replacement Implants // Journal of Materials Research. 1998 V. 13, P. 94 – 114. 69 Corno. M .Periodic ab initio Study of Structural and Vibrational Features of Hexagonal Hydroxyapatite, Ca10(PO4)6(OH)2‖ // Phys. Chem. Chem. Phys. 2006. V. 8, P. 2464 – 2472. 70 Lijun Wang and George H. Nancollas* Chem. Calcium Orthophosphates: Crystallization and Dissolution // Rev.2008, V.108, P.4628–4669. 71 Afshar A, Ghorbani M, Ehsani N, Saeri MR, Sorrell CC. Some important factors in the wet precipitation process of hydroxyapatite // Mater Des 2003; V.24:P.197-202. 72 Saeri MR, Afshar A, Ghorbani M, Ehsani N, Sorrell CC. The wet precipitation process of hydroxyapatite // Mater Lett 2003; V.57:P.4064-4069. 73 Arcos D, Vallet-Regí M. Sol-gel silica based biomaterials and bone tissue regeneration.// Acta Biomater 2010; V. 6(8):P.2874-2888. 74 Chen J, Wang Y, Chen X, Ren L, Lai C, He W, Zhang Q. A simple sol-gel technique for synthesis of nanostructured hydroxyapatite, tricalcium phosphate and biphasic powders. // Mater Lett 2011; V.65:P.1923-1926. 116 75 Bajgai MP, Parajuli DC, Park SJ, Chu KH, Kang HS, Kim HY. In vitro bioactivity of sol-gel-derived hydroxyapatite particulate nanofiber modified titanium // J Mater Sci Mater Med 2010; V.21:P.685-694. 76 Goto T, Kim IY, Kikuta K, Ohtsuki C. Hydrothermal synthesis of composites of wellcrystallized hydroxyapatite and poly(vinyl alcohol) hydrogel // Materials Science and Engineering: C 2012.V.32:P.397-403. 77 Liu HS, Chin TS, Lai LS, Chiu SY, Chung KH, Chang CS, Lui MT. Hydroxyapatite synthesized by a simplified hydrothermal method. // Ceram Int 1997; V.23:P.19-25. 78 Hattori T, Lwadate Y. Hydrothermal Preparation of Calcium Hydroxyapatite Powders // J Am Ceram Soc 1990;V.73: P.1803-1805. 79 Koumoulidis GC, Katsoulidis AP, Ladavos AK, Pomonis PJ, Trapalis CC, Sdoukos AT, Vaimakis TC. Preparation of hydroxyapatite via microemulsion route // J Colloid Interface Sci 2003; V.259:P.254-260. 80 Nasser Y. M. Characterization, thermal stability and sintering of hydroxyapatite powders prepared by different routes // Mater Chem Phys 2005; V.94:P.333-341. 81 Adzila S, Sopyan I, Hamdi M, Ramesh S. Mechanochemical Synthesis of Nanosized Hydroxyapatite Powder and its Conversion to Dense Bodies // Mater. Sci Forum 2011V.;694:P.118-122. 82 Coreño A. J, Coreño A. O, Cruz R. JJ, Rodríguez C. C. Mechanochemical synthesis of nanocrystalline carbonate-substituted hydroxyapatite. // Optical Materials 2005;V.27: P.1281-1285. 83 Santos MH, de Oliveira M, de Freitas Souza P,Mansur HS, Vasconcelos WL. Synthesis control and characterization of hydroxyapatite prepared by wet precipitation process. // Mater Res. 2004; V.7(4):P.625-630. 84 Bouyer E, Gitzhofer F, Boulos MI. Morphological study of hydroxyapatite nanocrystal suspension // J Mater Sci: Mater Med. 2000; V.11: P.523-531. 85 Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: A review of preparation methodologies // J Appl Biomater Biomech. 2004; V. 2: P.74-80. 86 Manuel CM, Ferraz MP, Monteiro FJ. Synthesis of hydroxyapatite and tri calcium phosphate nanoparticles. Preliminary Studies // Key Eng Mater. 2003; V.240-242: P.555-58. 117 87 Jarcho M, Kay JF, Gumar KI, Doremus RH, Drobeck HP. Tissue, cellular and subcellular events at a bone ceramic hydroxyapatite interface // J Biosci Bioeng. 1977; V.1: P.79-92 88 Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, Siegel RW, Bizios R. Enhanced functions of osteoblasts on nanophase ceramics // Biomaterials. 2000; V.21: P.1803- 1810. 89 Janackovic D, Petrovic-Prelevic I, Kostic- Gvozdenovic L, Petrovic R, Jokanovic V, Uskokovic D. Influence of synthesis parameters on the particle sizes of nanostructured calcium hydroxyapatite // Key Eng Mater. 2001; V.192-195: P.203-206. 90 Niesz DE, Bennett RB, Snyder MJ. Strength characterization of powder aggregates // J. Am. Ceram. Soc. 1972; V.51; P.677-680. 91 Shi JL, Lin ZX, Qian WJ, Yen TS. Characterization of agglomerate strength of coprecipitated superfine zirconia powders // J. Eur. Ceram. Soc. 1994; V.13; P.265-273. 92 Mostafa NY. Characterization, thermal stability and sintering of hydroxyapatite powders prepared by different routes // Mater. Chem. Phys. 2005.V.94, P.333. 93 Smičiklas I, Onjia A, Raicevic S. Experimental design approach in the synthesis of hydroxyapatite by neutralization method. Sep. Purif // Technol.2005.V. 44, P.97. 94 Afshar A, Ghorbani M, Ehsani N, Saeri MR, Sorrell CC. Some important factors in the wet precipitation process of hydroxyapatite // Mater. And Des. 2003;V.24;P.197-202. 95 Saeri MR, Afshar A, Ghorbani M, Ehsani N, Sorrell CC. The wet precipitation process of hydroxyapatite // Mater. Lett. 2003;V.57;P.4064. 96 Binnaz H, Yeliz K. Digest, Double step stirring: A novel method for precipitation of nano-sized hydroxyapatite powder // Journal of Nanomaterials and Biostructures.2009. V. 4. (1), P. 73 – 81. 97 Liu Y, Hou D, Wang G. A simple wet chemical synthesis and characterization of hydroxyapatite nanorods // Mater. Chem. and Phys. 2004; V.86; P. 69-73. 98 R. E. Riman, W. L. Suchanek, K. Byrappa, C. W. Chen, P. Shuk, C. S. Oakes, Solution synthesis of hydroxyapatite designer particulates // Solid State Ion. 2002;V.151;P.393402. 99 Kim W, Saito F. Sonochemical synthesis of hydroxyapatite from H3PO4 solution with Ca(OH)2 // Ultrason. Sonochem. 2001; V.8;P.85-88. 118 100 Bayraktar D, Tas AC. Chemical preparation of carbonated calcium hydroxyapatite powders at 37°C in urea-containing synthetic body fluids // J. Eur. Ceram. Soc. 1999;V.19; P.2573-2579. 101 Hong Li, Jingkang Wang. Rapid sonocrystallization in the salting-out process // Journal of Crystal Growth. 2003.V.247.P.192–198. 102 Y. T. Shah,A. B. Pandit,V. S. Moholkar. Cavitation Reaction Engineering. The Plenum Chemical Engineering Series.1999. 103 Dalas E.,The effect of ultrasonic field on calcium carbonate scale formation // J.Crystal Growth. 2001. V.222, P.287-292. 104 M. Versluis, S. M. van der Meer, D. Lohse, P. Palanchon, D. Goertz, C. T. Chin, and N. de Jong. \Microbubble surface modes [ultrasound contrast agents // In: Ultrason. Symp., 2004. V. 1. 2004.P. 207-209. 105 R. A. Dawe and Y. Zhang. \Kinetics of calcium carbonate scaling using observations from glass micromodels // In: J. Petrol. Sci. Eng.1997.V.18 (3-4), P. 179-187 106 S. J. Doktycz and K. S. Suslick. Interparticle collisions driven by ultrasound // In: Science .1990V. 247.4946, P. 1067-1069 107 Hielscher Ultrasound Technology. Ultrasonic extraction and preservation. Copyright 1999–2007. Hielscher ultrasonics Gmbh. [Accessed on September 7, 2011]. Available at: http://www.hielscher.com/ultrasonics/extraction_01.htm. 108 Boccaccini AR, Erol M, Stark WJ, Mohn D, Hong Z, Mano JF. Polymer/bioactive glass nanocomposites for biomedical applications // A review. Composites Sci Technol 2010;V.70:P.1764-1776. 109 Vallet-Regí M. Evolution of bioceramics within the field of biomaterials // Comptes Rendus Chimie 2010; V.13:P.174-185. 110 Jillavenkatesa A. Sol–gel processing of hydroxyapatite // J Mater Sci 1998; V.33:P.4111-4119. 111 M. P. Mahabole, R. C. Aiyer, C .V. Rramakrishna, B. Sreedhar, R. S. Khairnar, Synthesis, characterization and gas sensing property of hydroxyapatite ceramic // Bull. Mater. Sci., 2005. V. 28, ( 6), P. 535–545. 112 P. J. Prendergast,R. Huiskes.The Biomechanics of Wolff’s law: Recent advances. // Journal of Medical Scienc.1995.V.164.P.152-154. 119 113 E. Sahin, Synthesis and characterization of hydroxyapatite-alumina-zirconia biocomposites. Thesis, Izmir Institute of Technology, Turkey. Presented in 2006. 114 Pramanik, S., et al., Development of high strength hydroxyapatite for hard tissue replacement // Trends Biomater. Artif. Organs, 2005. V.19(1): P. 46-51. 115 Rao RR, Roopa HN, Kannan TS. Solid state synthesis and thermal stability of HAP and HAP-β-TCP composite ceramic powders // Journal of Materials Science: Materials in Medicine 1997; V.8:P.511-518. 116 Nilen RW, Richter PW. The thermal stability of hydroxyapatite in biphasic calcium phosphate ceramics // J Mater Sci Mater Med 2008;V.19: P.1693-1702. 117 Avashnee Chetty, Ilse Wepener, Mona K. Marei et al.Hydroxyapatite, Synthisis , properties,and applications. This book chapter is dedicated to Dr Wim Richter on the occasion of his retirement. 118 Lazic, S., Zec, S., Miljevic, N., Milonjic, S. The Effect of Temperature on the Properties of Hydroxyapatite Precipitated From Calcium Hydroxide and Phosphoric Acid // Thermochim.Acta, 2001. V. 374, (1), P. 13-22. 119 Majid D, Hossein E-H, Mohammed R.H, Abbas Y. preparation and characterization of fluorohydroxyapatite nanopowders by nonalkoxide sol-gel method // Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures.2010.V. 5, (1), P. 29 – 33. 120 F. Schüth, K.S.W. Sing, J. Weitkamp, Handbook of Porous Solids, Wiley-VCHVerlag GmbH, Weinheim, Germany, 2002. 121 M. Itokazu, T. Sugiyama, T. Ohno, E. Wada, Y. Katagiri, Development of porous apatite ceramic for local delivery of chemotherapeutic agents // J. Biomed. Mater.Res. 1998.V.39 P.536–538. 122 S. Kano, A. Yamazaki, R. Otsuka, M. Ohgaki, M. Akao, H. Aoki, Application of hydroxyapatite–sol as drug carrier // Biomed. Mater. Eng. 1994.V.4.P. 283–290. 123 A. Uchida, Y. Shinto, N. Araki, K. Ono, Slow release of anticancer drugs from porous calcium hydroxyapatite ceramic // J. Orthop. Res.1992.V.10.P. 440–445. 124 M. Shirkhanzadeh, Microneedles coated with porous calcium phosphate ceramics: effective vehicles for transdermal delivery of solid trehalose // J. Mater.Sci. Mater. Med. 2005.V.16.P.37–45. 120 125 D.A. Edwards, Large porous particles for pulmonary drug delivery // Science .1997.V.276.P 1868–1872. 126 S. Rajaraman, H.T. Henderson, A unique fabrication approach for microneed-les using coherent porous silicon technology // Sens. Actuators B .2005.V.105.P.43–448. 127 M.R. Prausnitz, Microneedles for transdermal drug delivery // Adv. Drug Deliv.Rev. 2004.V.56: P. 581–587. 128 Q. Zhao, S. Zhang, W. Tong, C. Gao, J.C. Shen, Polyelectrolyte microcapsules templated on poly(styrene sulfonate)-doped CaCO3particles for loading and sustained release of daunorubicin and doxorubicin // Eur. Polym. J.2006.V.42.P.3341–3351. 129 I.Y. Stetciura, A.V. Markin, A.N. Ponomarev, A.V. Yakimansky, T.S. Demina, C.Grandfils, et al., New surface-enhanced Raman scattering platforms: composite calcium carbonate microspheres coated with astralen and silver nanoparticles // Langmuir.2013.V.29.P. 4140–4147. 130 R. Ahijado-Guzmán, P. Gómez-Puertas, R.A. Alvarez-Puebla, G. Rivas, L.M.LizMarzán, Surface-enhanced Raman scattering-based detection of the inter-actions between the essential cell division FtsZ protein and bacterial membrane elements // ACS Nano .2012.V.6.P. 7514–7520. 131 O. Bostman, H. Pihljama¨ki, Clinical biocompatibility of biodegradable orthopaedic implants for internal fixation // a review. Biomaterials. 2000. V.21.P.2615-2621. 132 T. Subbiah, G. S. Bhat, R. W. Tock, S. Parameswaran. S. S. Ramkumar. Electrospinning of nanofibers // J.Appl.Polym.Sci. 2005.V.96, P.557-569. 133 T.S. Chow, J. Phys. Condens. “Wetting of rough surfaces // Matter. 1998.V.10, P.445 134 K. Fujihara, M. Kotaki, S. Ramakrishna, Guided Bone Regeneration Membrane ... Composite Nano-Fibers // Biomaterials 2005, V. 26, P. 4139. 135 Turhani D, Cvikl B, Watzinger E, Weissenböck M, Yerit K, Thurnher D, Lauer G, Ewers R. In vitro growth and differentiation of osteoblast-like cells on hydroxyapatite ceramic granule calcified from red algae // J Oral Maxillofac Surg. 2005 .V.63(6):P.7939. 136 A. G. A. Coombes, S. C. Rizzi, M.Williamson, J. E. Barralet, S. Downes, W. A. Wallace.Precipitation Casting of polycaprolactone for Application in Tissue Engineering and Drug Delivery // Biomaterials 2004, V. 25, P.315-325. 121 137 S. Maeno, Y. Niki, H. Matsumoto, H. Morioka, T. Yatabe, A. Funayama, Y. Toyama, T. Taguchi, J. Tanaka. The effect of calcium ion concentration on osteoblast viability, proliferation and differentiation in monolayer and 3D culture. // Biomaterials 2005, V. 26, P.4847-4855. 138 W. Frieb, J. Warner, in: F. Schuth, K.S.W. Sing, J. Weitkamp (Eds.), Handbook of Porous Solids // Wiley-VCH, Weinheim, 2002, P. 2923. 139 S. Agarwal et al. Use of electrospinning technique for biomedical applications // Polymer .2008.V.49.P. 5603–5621 140 T.B. Nguyen. Hybrid hydroxyapatite nanoparticles-loaded PCL/GE blend fibers for bone tissue engineering // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 2012, P. 1– 19. 141 Gilbert M.: Pritchard G., Surface Treatments for Particulate Fillers in Plastics Additives: An A–Z Reference.// Chapman. Hall; London, UK: 1998. P. 590–603. 142 Bartczak, Z., Argon, A. S., Cohen, R. E., Weinberg, M. Toughness mechanism in semicrystalline polymer blends: II. High-density polyethylene toughened with calcium carbonate filler particles // Polymer 1999; V.40: P.2347-2365. 143 Zuiderduin W.C.J., Westzaan C., Huétink J., Gaymans R.J. Toughening of polypropylene with calcium carbonate particles. // Polymer. 2003; V.44: P.261–275. 144 Jiang, L.; Zhang, J.; Wolcott, M. P. Comparison of polylactide/ nano-sized calcium carbonate and polylactide/montmorillonite composites: Reinforcing effects and toughening mechanisms // Polymer 2007, V.48, P.7632. 145 Jiang, L.; Lam, Y.C.; Tam, K.C.; Chua, T.H.; Sim, G.W.; Ang, L.S. Strengthening acrylonitrile-butadiene-styrene (ABS) with nano-sized and micron-sized calcium carbonate // Polymer. 2005, V.46, P.243–252. 146 A.Sanaz. Enhancement of Mechanical and Thermal Properties of Polycaprolactone/Chitosan Blend by Calcium Carbonate Nanoparticles // Int J Mol Sci. 2012; V.13 (4): P.4508–4522. 147 Bajgai, M. P.; Aryal, S.; Bhattarai, S. R.; Bahadur, K. C. R.; Kim, K.-W.; Kim, H. Y. J. Poly(e-caprolactone) Grafted Dextran Biodegradable Electrospun Matrix: A Novel Scaffold for Tissue Engineering // Appl. Polym. Sci. 2008, V.108, P. 1447–1454. 122 148 Bosworth, L.; Clegg, P.; Downes, S. Electrospun nanofibres of polycaprolactone, and their use for tendon regeneration // Int. J. Nano Biomaterials. 2007, V.1, P.263–279. 149 Ghasemi-Mobarakeh, L.; Prabhakaran, M. P.; Morshed, M.; Nasr-Esfahani, M.-H.; Ramakrishna, S. Electrospun poly (ɛ-caprolactone)/gelatin nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering // Biomaterials 2008, V. 29, P. 4532– 4539. 150 Geun Hyung, K.; Taijin, M.; Su, A. P.; Wan, D. K.; Young, H. K. Fabrication of a biocomposite reinforced with hydrophilic eggshell proteins. // Biomed. Mater. 2007, V.2: P. 250–256. 151 Wang, M.; Jin, H. J.; Kaplan, D. J.; Rutledge, G. C. Mechanical properties of electrospun silk fibers. Macromolecules // 2004, V.37, P.6856–6864. 152 Wong, S.-C., A. Baji, and S. Leng. Effect of Fiber Diameter on Tensile Properties of Electrospun Poly(ε-caprolactone) // Polymer, 2008. V.49(21): P. 4713-4722. 153 Tan, E.P.S., S.Y. Ng, and C.T. Lim. Tensile testing of a single ultrafine polymeric fiber // Biomaterials, 2005. V. 26(13): P. 1453-1456. 154 Williamson, M.R. and A.G.A. Coombes. Gravity spinning of polycaprolactone fibres for applications in tissue engineering // Biomaterials, 2004. V. 25(3): P. 459-465. 155 Shu Zhnag .degree of Master of Science .Textile Chemistry .Raleigh, North Carolina presented in .August 7, 2009. 156 E, Ural . Poly (D, L-cactide/ε-caprolactone)/hydroxyapatite composites // Biomaterials .2000.V.21.P. 2147-2154. 157 J.S. Jeong et al. Mechanical properties of electrospun PVA/MWNTs composite nanofibers // Thin Solid Films. 2007. V.515.P. 5136–5141. 158 X. Zhang, T. Liu, T.V. Sreekumar, S. Kumar, V.C. Moore, R.H. Hauge, R.E. Smalley. Poly (vinyl alcohol)/SWNT composite film // Nano Lett. 2003. V.3.P.1285. 159 X. Zhang, T. Liu, T.V. Sreekumar, S. Kumar, X. Hu, K. Smith. Gel spinning of PVA/SWNT composite fiber // Polymer .2004.V.45. P. 8801. 160 H.D. Wagner, O. Lourie, Y. Feldman, R. Tenne. Stress-induced fragmentation of multiwall carbon nanotubes in a polymer matrix // Appl. Phys. Lett.1998.V.72. P. 188. 161 T. Liu, S. Kumar. Quantitative characterization of SWNT orientation by polarized Raman spectroscopy // Chem. Phys. Lett. 2003. V.378. P. 257. 123 162 R.J. Samuels, Structured Polymer Properties: The Identification, Interpretation, and Application of Crystalline Polymer Structure // John Wiley and Sons, New York, 1974. 163 T. Liu, S. Kumar. Effect of Orientation on the Modulus of SWNT Films and. Fibers // Nano Lett. (3) 2003.V.3.P. 647. 164 Thomas V, Jose MV, Chowdhury S, Sullivan JF, Dean DR, Vohra YK. Mechanomorphological studies of aligned nanofibrous scaffolds of polycaprolactone fabricated by electrospinning // Biomater Sci Polym .2006; V.17(9):P. 969-84. 165 Anton Kovalchuk and Joseph Deitzel University of Delaware // Center for Composite Materials 2011. 166 George G. Chase, Jackapon Sunthorn Varabhas, Darrell H Reneker. New Methods to Electrospin Nanofibers // Journal of Engineered Fibers and Fabrics. 2011. V. 6, (3) –P. 32-38. 167 H. Wang, X. Lu, Y. Zhao, C. Wang, Preparation of ZnS : Cu/PVA composite nanofiber via electrospinning // Materials Letters . 2006. V.60.P. 2480-2484. 168 Travis J. Sill, Horst A. von Recum*. Electrospinning: Applications in drug delivery and tissue engineering // Biomaterials. 2008. V.29. P.1989-2006. 169 Megelski S, Stephens JS, Chase DB, Rabolt JF. Micro- and nanostructured surface morphology on electrospun polymer fibers // Macromolecules 2002 .V.35 (22):P. 84568466. 170 Zhang CX, Yuan XY, Wu LL, Han Y, Sheng J. Study on morphology of electrospun poly(vinyl alcohol) mats // Eur Poly J 2005 V.41 (3): P. 423-32. 171 Deitzel JM, Kleinmeyer J, Harris D, Tan NCB. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles // Polymer. 2001 V.42 (1):P. 261272. 172 Doshi J, Reneker DH. Electrospinning process and applications of electrospun fibers // J Electrostatics. 1995 V.35 (2-3):P.151-60. 173 B.M. Min, G. Lee, S.H. Kim, Y.S. Nam, T.S. Lee, W.H. Park. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro // Biomaterials. 2004. V. 25(7-8), P. 1289–1297. 174 G.K. Sangamesh, P.N. Syam, J. Roshan, M.V. Hogan, C.T. Laurencin. Recent Patents on Electrospun Biomedical Nanostructures // An Overview. 2008. V.1. P. 68–78. 124 175 R. Vasita, D.S. Katti. Nanofibers and their applications in tissue engineering // Int J Nanomedicine. 2006.V.1(1), P. 15–30 176 Averous L., Moro L., Dole P. and Fringant C. Properties of thermoplastic blends: 4167.-starch–polycaprolactone // Polymer. 2000. V. 41, P. 4157. 177 Tan A., Rajadas J. and Seifalian A. M. Biochemical engineeringusing peptide amphiphiles. // J. Controlled Release 2012. V. 163. P. 342-352. 178 Albertsson A.-C. and Varma I. Aliphatic Polyesters: Synthsis properties and applicatioin .degradable Aliphatic polyster // In: Springer. 2002. P. 1-40 179 Gunatillake P. A. and Adhikari R. Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering // Eur. Cell. Mater. 2003, V. 5, P. 1-1. 180 Benito Eduardo Valarezo Valdez .Innovative processes for the production of new technique. Ph.D. Course in Chemical Engineering. materials by electrospinning Presented in 2013. 181 T. Bukreeva, I. V. Marchenko, B. V. Parakhonskiy, Y. V. Grigor’ev,. Formation of Silver Nanoparticles on Shells of Polyelectrolyte Capsules Using Silver-Mirror Reaction. // Colloid Journal 2009, V.71, P.596–602. 182 Fong H, Reneker DH. Electrospinning and formation of nanofibers. In: Salem DR, editor. Structure formation in polymeric fibers // Munich: Hanser; 2001. P. 225–46. 183 Y. Zhang et al. Electrospun biomimetic nanocomposite nanofibers of hydroxyapatite/chitosan for bone tissue engineering // Biomaterials. 2008. V.29. P. 4314–4322. 184 Wei, H., Shena, Q., Zhao, Y., Wang, D.J. veXu, D.F., 2003, Influence of polyvinylpyrrolidone on the precipitation of calcium carbonate and on the transformation of vaterite to calcite // Journal of Crystal Growth, 2003.V. 250, P. 516 – 524. 185 E. Riera, Y. Golás, a Blanco, J. a Gallego, M. Blasco and a Mulet,. Mass transfer enhancement in supercritical fluids extraction by means of power ultrasound // Ultrason. Sonochem. 2004 .V.11, P.241–4. 186 S. S. Berdonosov, I. V. Znamenskaya and I. V. Melikhov,. Mechanism of the Vateriteto-Calcite Phase Transition under Sonication // Inorg. Mater. 2005, V.41, P. 1308–1312. 125 187 Shestak I.V., Vorob,ev P.D., Cherednichnko D.V., Vorob,ev E.V., Bondareva G.V., Strnadova N. Effect of Polyacrylic Acid and Polyethylene Glycol on the Crystallization of Calcium Carbonate in the Presence of Magnesium Ions // Russ. J. Inorg. Chem. 2011. V. 56, ( 2),P. 176–180. 188 Andreassen J-P. Formation mechanism and morphology in precipitation of vateritenanoaggregation or crystal growth // J. Cryst. Growth. 2005. V.274. P.256-264. 189 Kitamura M. Konno H., Yasui A., Masuoka H. Controlling factor and mechanism of reactive crystallization of calcium carbonate polymorphsfrom calcium hydroxide suspensions // Journal of Crystal Growth. 2002. V. 236. P. 323–332. 190 Chen Y., Ji X., Wang X. Microwave-assisted synthesis of spheroidal vaterite CaCO3 in water mixed solvents without surfactants // J. Cryst. Growth. 2010. V.312. P.3191-3197. 191 Flaten E.M., Seiersten M., Andreassen J-P. Growth of the calcium carbonate polymorph vaterite in mixtures of water and ethylene glycol at conditions of gas processing // J. Cryst. Growth. 2010. V.312. P.953-960. 192 Qi R-J., Zhu Y-J., Microwave-assisted synthesis of calcium carbonate (vaterite) of various morphologies in water–ethylene glycol mixed solvents // J. Phys. Chem. B 2006. V.110. P. 8302–8306. 193 F.W. Yan, S.F. Zhang, C.Y. Guo, X.H. Zhang, G.C. Chen, F. Yan, G.-Q. Yuan. Influence of stirring speed on the crystallization of calcium carbonate. // Cryst. Res. Technol. 2009, V. 44, P.725 – 728. 194 K. Sawada, The mechanism of crystallization and transformation of calcium carbonates, // Pure Appl. Chem. 1997.V.69.P. 921–928. 195 Chen Y., Ji X., Wang X. Microwave-assisted synthesis of spheroidal vaterite CaCO3 in water mixed solvents without surfactants // J. Cryst. Growth. 2010. V.312. P.3191-3197. 196 Y. Shen, A. Xie, Z. Chen, W. Xu, H. Yao, S. Li, L. Huang, Z. Wu and X. Kong. Controlled synthesis of calcium carbonate nanocrystals with multi-morphologies in different bicontinuous microemulsions // Mater. Sci. Eng., A, 2007.V. 443, P. 95–100. 197 S Gopi, VK Subramanian. Anomalous transformation of calcite to vaterite: Significance of HEDTA on crystallization behavior and polymorphism at elevated temperatures // Indian J. Chem.2013. V. 52A, P. 342-349. 126 198 A.M. Yashchenok, B.V. Parakhonskiy, S. Donatan, D. Kohler, A.G. Skirtach, H.Möhwald, Polyelectrolyte multilayer microcapsules templated on spherical,elliptical and square calcium carbonate particles // J. Mater. Chem. B. 2013.V.1.P.1223-1228. 199 M. Yoshimura, P. Sujaridworakun, F. Koh, T. Fujiwara, D. Pongkao, A. Ahniyaz, Hydrothermal conversion of calcite crystals to hydroxyapatite // Mater. Sci. Eng.C: Mater. Biol. Appl. 2004.V.24.P. 521–525. 200 Venugopal J, Vadgama P, Kumar TSS, Ramakrishna S. Biocomposite nanofibresand osteoblasts for bone tissue engineering // Nanotechnology 2007;V.18(5):P.1–8. 201 G. Braun, I. Pavel, A.R. Morrill, D.S. Seferos, G.C. Bazan, N.O. Reich, et al., Chemically patterned microspheres for controlled nanoparticle assembly in the construction of SERS hot spots // J. Am. Chem. Soc. 2007.V.129.P. 7760–7761. 202 S.Y. Lee, L. Hung, G.S. Lang, J.E. Cornett, I.D. Mayergoyz, O. Rabin, Dispersionin the SERS enhancement with silver nanocube dimmers // ACS Nano . 2010. V.4. P. 5763– 5772. 203 H.-Y. Wu, C.J. Choi, B.T. Cunningham, Plasmonic nano gap-enhanced Raman scattering using a resonant nanodome array // Small. 2012. V.8.P. 2878–2885. 204 K. Kneipp, Y. Wang, H. Kneipp, L. Perelman, I. Itzkan, R. Dasari, et al., Single molecule detection using surface-enhanced Raman scattering (SERS) // Phys.Rev. Lett. 1997. V.78.P. 1667–1670. 205 A.M. Yashchenok, D. Borisova, B.V. Parakhonskiy, A. Masic, B.-E. Pinchasik, H.Möhwald, et al., Nanoplasmonic smooth silica versus porous calcium carbonate bead biosensors for detection of biomarkers // Ann. Phys. 2012.V.524. P. 723–732. 206 D.A. Edwards, Large porous particles for pulmonary drug delivery // Science. 1997.V.276. P. 1868–1872. 207 Zargarian SS, Vahid H . A nanofibrous composite scaffold of PCL/hydroxyapatitechitosan/PVA prepared by electrospinning // J Iranian Polymer. 2010. V.19 (6):P. 457468. 208 Patcharaporn W, Neeracha S, Prasit P, Pitt S. Preparation and Characterization of Novel Bone Scaffolds Based on Electrospun Polycaprolactone Fibers Filled with Nanoparticles. // Macromol Biosci. 2006. V.6:P. 70-77. 127 209 Thomason JL. The influence of fiber length, diameter and concentration on the strength and strain to failure of glass fiber-reinforced polyamide 6, 6.// Composites Part A: Applied Science and Manufacturing.2009.V.40: P.114-124. 210 Jeong JS, Moon JS, Jeon SY, Park JH, Alegaonkar PS, Yoo JB (2007). Mechanical properties of electrospun PVA/MWNTs composite nanofibers // Thin Solid Films.2007.V.515: P. 5136-5141. 211 Zhou J, Tang J, Meng H, Yu J. Study on PP/calcium sulfate whisker composite. // Engineering Plastics Application.2008.V. 36: P. 19-22. 212 Kamal KG, Akshay K, Pradeep KM, Pradeep S, Sujata M, Narendra KS, Abhinay M and Pralay M. Polycaprolactone composites with TiO2 for potential nanobiomaterials: tunable properties using different phases // J Phys Chem Chem Phys.2012.V.14:P. 12844–12853. 213 Wang J, Cheung MK. Miscibility and morphology in crystalline/amorphous blends by DSC, FTIR and C solid state NMR // Polymer.2002.V. 43: P. 1357–1364. 214 Wolberg J. Data Analysis Using the Method of Least Squares: Extracting the Most Information from Experiments // Springer. 2005 215 Piggott M. Load Bearing Fibre Composites // Kluwer Academic Publishers.2002. 216 Madsen B, Joffe R, Peltola H, Nattinen K. Short cellulosic fiber/starch acetate composites: micromechanical modeling of Young’s modulus // J Composite Materials.2011.V. 45: P. 2119-2131. 217 Sun JJ, Bae CJ, Koh YH, Kim HE, Kim HW. Fabrication of hydroxyapatitepoly(epsilon-caprolactone) scaffolds by a combination of the extrusion and bi-axial lamination processes. // J Mater Sci Mater Med. 2007.V.18 (6):P. 1017-23. 128 БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю, профессору кафедры материаловедения, технологии и управления качеством, д.ф.-м.н., Венигу Сергею Борисовичу за профессиональное руководство выполнением диссертационной работы, конструктивную критику и помощь в интепретации полученных результатов. Автор выражает глубокую благодарность профессору кафедры физики полупроводников СГУ, д.х.н., Горину Дмитрию Александровичу и доценту кафедры материаловедения, технологии и управления качеством СГУ, к.х.н., Иноземцевой Ольге Александровне за помощь в проведении исследований и конструктивную критику. Автор выражает глубокую признательность и благодарность профессору кафедры аналитической химии и химической экологии Института химии, д.х.н., Штыкову Сергею Николаевичу за конструктивную критику и профессиональные консультации при подготовке диссертационной работы. Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективу лаборатории электроформования Образовательно-научного института наноструктур и биосистем СГУ за проведение совместных исследований и помощь в интерпретации полученных результатов. Автор выражает глубокую признательность и благодарность коллективу лаборатории «Дистанционно управляемые системы для тераностики» Образовательно-научного института наноструктур и биосистем СГУ за всестороннюю помощь и поддержку. 129
