ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГИГИЕНЫ, ПРОФПАТОЛОГИИ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА»
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГИГИЕНЫ, ПРОФПАТОЛОГИИ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА» ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА На правах рукописи ОРЛОВА Татьяна Игоревна СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДВУХСТАДИЙНОЙ МЕТОДИКИ ХРОМАТОМАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ И ЭТЕРИФИЦИРОВАННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ Специальность 02.00.02 – аналитическая химия Диссертация диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Научный руководитель к.х.н., Уколов А.И. Санкт-Петербург, 2016 ОГЛАВЛЕНИЕ 1 Обзор литературы ....................................................................................................................... 7 1.1. Структура, состав и свойства жирных кислот ..................................................................... 7 1.2 Биологическая роль жирных кислот и их значение в медицине и токсикологии ........... 13 1.2.1 Химические классы липидов плазмы крови .................................................................... 13 1.2.2 Биологическая роль жирных кислот ................................................................................. 18 1.2.3 Исследование профилей жирных кислот в медицине и токсикологии ......................... 21 1.3. Инструментальные методы определения свободных и этерифицированных жирных кислот ......................................................................................... 26 1.3.1 Определение жирных кислот методами газовой хроматографии. ................................ 26 1.3.2 Определение жирных кислот методом жидкостной хроматографии ............................ 29 1.3.3. Определение жирных кислот методом капиллярного электрофореза ......................... 29 1.3.4. Методы экстракции жирных кислот из биологических образцов ................................ 30 1.3.5. Предварительное хранение и транспортировка биологических проб .......................... 31 1.4. Характеристика объектов исследования: химические соединения, потенциально влияющие на метаболизм липидов в организме. ............................................. 34 1.4.1 Фосфорорганические соединения ..................................................................................... 34 1.4.2 Мельдоний........................................................................................................................... 36 1.4.3 Фторацетат .......................................................................................................................... 37 2 Экспериментальная часть ........................................................................................................ 39 2.1 Методика определения свободных жирных кислот ........................................................... 39 2.2 Методика совместного определения свободных и этерифицированных жирных кислот ............................................................................................................................. 43 2.3 Определение оптимальных условий хранения и транспортировки биологических образцов ............................................................................................................. 46 2.4 Исследование влияния фосфорорганических соединений на профили жирных кислот плазмы крови крыс ........................................................................................... 47 2.5 Исследование влияния мельдония на профили жирных кислот плазмы крови практически здоровых добровольцев ........................................................................................ 48 2.5 Исследование влияния фторацетата на профили жирных кислот плазмы крови крыс .................................................................................................................................... 48 2.6 Исследование влияния алифатических углеводородов на профили жирных кислот плазмы крови и тканей печени и головного мозга крыс. ............................. 49 2 2.7 Статистическая обработка полученных результатов ......................................................... 50 3 Результаты и их обсуждение ................................................................................................... 51 3.1 Хроматографическое разделение ......................................................................................... 51 3.2 Подготовка проб к анализу ................................................................................................... 52 3.3 Построение градуировочных зависимостей ....................................................................... 58 3.4 Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматоматографии с масс-селективным детектированием .....................62 3.5 Оптимизация условий хранения образцов плазмы крови для определения жирных кислот методом газовой хроматомасс-спектрометрии ............................................. 68 3.6 Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введении сублетальных количеств зарина, зомана и вещества типа Vx, с применением антидотной терапии .......................................................................................... 73 3.7. Влияние мельдония на метаболизм жирных кислот ......................................................... 82 3.8 Исследование энергетического метаболизма крыс при действии фторацетата .............. 85 3.9. Изменения профилей жирных кислот тканей печени и головного мозга крыс при хроническом ингаляционном воздействии малых доз алифатических углеводородов ....... 88 Заключение................................................................................................................................... 98 Выводы ....................................................................................................................................... 101 Список литературы .................................................................................................................... 102 3 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ АЛК – альфа линоленовая кислота АЛТ – аланинтрансаминаза АСТ – аспартаттрансаминаза АХЭ – ацетилхолинэстераза ВЭЖХ-МС – жидкостная хроматография-масс-спектрометрия ГХ-МС – газовая хроматография-масс-спектрометрия ДН - диабетическая нефропатия ДГ – диглицериды ЖК – жирные кислоты ЖХ – жидкостная хроматография КАТ – каталаза КЭ – капиллярный электрофорез ЛК – линолевая кислота ЛПВП – липопротеины высокой плотности ЛПНП – липопротеины низкой плотности ЛПВП-Х – холестерол ЛПВП МДА – малоновый диальдегид МНЖК – мононенасыщенные жирные кислоты ОХ – общий холестерол ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты СЖК – свободные (неэтерифицированные) жирные кислоты СОД – супероксиддисмутаза ТБАГ – гидроксид тетрабутиламмония ТГ – триглицериды ТФМЭ – твердофазная микроэкстракция УВ – углеводороды ФА –фторацетат ФИ – фосфатидилинозитол ФК - фосфатидная кислота ФЛ – фосфолипиды ФОС - фосфорорганические соединения ФС – Фосфатидилсерин ФХ - фосфатидилхолин (лецитин) ФЦ – фторцитрат ФЭА - фосфатидилэтаноламин (кефалин) ЭЖК – этерифицированные жирные кислоты 4 ВВЕДЕНИЕ Хроматомасс-спектрометрические методы исследования профилей низкомолекулярных соединений - метаболитов крови и других биологических образцов приобретают все большее значение в современной токсикологии и фармакологии. Исследование метаболических профилей вносит значительный вклад в развитие лабораторно-клинической диагностики, например, исследования маркеров обмена жирных кислот (ЖК) являются одним из ключевых направлений в ранней диагностике сердечно-сосудистых рисков и метаболического синдрома. Для достоверной диагностики кризисных состояний организма необходимо определение ЖК в биологических образцах в свободной (СЖК) и этерифицированной (ЭЖК) формах. Изменения концентраций СЖК и ЭЖК являются следствием метаболической саморегуляции, а также маркерами поражения или дисфункции органов. Разработка надежной процедуры определения большого числа ЖК в свободной и этерифицированной формах позволит усовершенствовать методы диагностики метаболического синдрома, наследственных и онкологических заболеваний, а также осуществить раннее (доклиническое) выявление отклонений у лиц, находящихся в зоне риска. Основной метод определения ЖК в сыворотке или плазме крови - это жидкость-жидкостная экстракция и газовая хроматография (ГХ) с пламенно-ионизационным детектированием. Сочетание метода ГХ с масс-спектрометрией имеет ряд неоспоримых преимуществ как в части надежности идентификации аналитов, так и чувствительности, и селективности их определения. К недостаткам метода ГХ при любом варианте детектирования стоит отнести необходимость предварительной дериватизации аналитов, т.к. жесткие условия дериватизации могут спровоцировать неблагоприятные побочные реакции: изомеризацию непредельных ЖК и их окисление, причем скорость окисления возрастает с повышением степени непредельности. Таким образом, для повышения правильности и точности определения ЖК методом ГХ-МС, необходима разработка мягких методов дериватизации. В качестве способа извлечения и дериватизации СЖК нами выбрано экстрактивное алкилирование иодистым метилом. Прототипом послужила процедура, описанная в работе [1]. Возможности метода были нами впоследствии расширены за счет оптимизации анализа других видов биологических образцов, помимо плазмы крови: мочи и гомогенатов органов; список определяемых соединений расширен с 5 до 32 (включая важнейшие маркеры сердечно-сосудистых заболеваний - полиненасыщенные ЖК) [2], однако главным преимуществом стала возможность определения ЖК в этерифицированной форме [3]. Селективное одновременное определение СЖК и ЭЖК позволяет значительно сократить объем плазмы крови, требуемый для проведения анализа. 5 Практика применения разработанной методики при выполнении медико-биологических исследований в НИИ ГПЭЧ показала, что результаты анализа зависят от условий хранения образцов плазмы крови [4]. К условиям хранения можно отнести следующие параметры: продолжительность хранения, температура и количество циклов замораживания и размораживания (циклов з/р). Большой объем отобранных образцов приводит к большей продолжительности хранения, а создание лабораторного “банка” образцов и применение различных методов анализа неизбежно приводят к увеличению количества циклов з/р. Исследования влияния количества таких циклов на концентрации эндогенных соединений в образце стали особенно актуальными в связи с формированием крупных “банков” биологических образцов. Соблюдение надлежащих условий хранения и транспортировки биологических образцов позволяет значительно снизить вариации в результатах анализа. Количественная характеристика влияния условий хранения биологических образцов позволит значительно повысить надежность и достоверность определения ЖК. Настоящая работа посвящена совершенствованию методики количественного хроматомасс-спектрометрического определения ЖК в биологических образцах с целью установления механизмов воздействия токсичных химических соединений на организм, что позволит внести значительный вклад в практику лабораторно-клинической диагностики, а также гигиенического регламентирования вредных химических веществ. Для разработки метода совместного хроматомасс-спектрометрического определения ЖК в плазме крови необходимо было решить следующие задачи: разработать подходы к совместному определению свободных и этерифицированных ЖК плазмы крови людей и лабораторных животных и произвести оценку метрологических характеристик методики. Оптимизировать методику для количественного определения ЖК в образцах гомогенатов органов и тканей. Обосновать условия хранения биологических образцов с момента отбора до подготовки проб к анализу. Апробировать разработанный подход при оценке влияния сублетальных доз фторацетата, зарина, зомана и российского вещества Vx, а также средств антидотной терапии на качественный и количественный состав СЖК и ЭЖК плазмы крови экспериментальных животных. Провести апробацию методики при оценке влияния лекарственных препаратов на качественный и количественный состав СЖК и ЭЖК плазмы крови здоровых добровольцев-испытуемых (на примере мельдония). В результате выполнения работы создана аналитическая методика, позволяющая проводить профилирование жирнокислотного состава различных биологических объектов. Результаты работы позволили получить новые сведения о влиянии токсичных химических соединений на метаболизм липидов и повысить уровень оценки рисков, связанных с воздействием различных токсичных химических соединений. Разработанный метод позволил 6 усовершенствовать методологическую основу доклинических и клинических исследований в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, а также гигиенического регламентирования вредных химических веществ. Метод может быть использован в центрах профпатологии, медикобиологических НИИ, центрах Роспотребнадзора и токсикологических лабораториях. 1 Обзор литературы 1.1. Структура, состав и свойства жирных кислот Жирные кислоты представляют собой алифатические одноосновные карбоновые кислоты с открытой цепью, содержащиеся в основном в этерифицированной форме в жирах, маслах и восках растительного и животного происхождения [5]. Основные ЖК в организме человека имеют чётное число атомов углерода, что связано с особенностями их биосинтеза, при котором к углеводородному радикалу ЖК последовательно добавляются двухуглеродные фрагменты [6] (см. рисунок 2). Жирные кислоты являются структурными компонентами различных липидов. В составе триацилглицеридов они выполняют функцию депонирования энергии, так как их радикалы содержат богатые энергией СН2-группы [7]. Благодаря своей структуре, при окислении связей С-Н ЖК дают в два раза больше энергии, по сравнению с полисахаридами, что делает жир наиболее эффективной формой для хранения избыточной энергии у живых организмов. Поскольку увеличение клеточной концентрации СЖК является токсичным, они хранятся в основном в виде триглицеридов во внутриклеточных нейтральных липидных каплях, которые функционируют и как резервуары энергии, и как запас ЖК и стеринов, необходимый для синтеза мембран [8]. Жиры и фосфолипиды организма при нормальной температуре тела имеют жидкую консистенцию, так как количество ненасыщенных ЖК преобладает над насыщенными. В фосфолипидах мембран ненасыщенных кислот может быть до 80-85%, а в составе жиров подкожного жира - до 60% [5]. Свободные ЖК в организме природного происхождения, образованы посредством ферментативного гидролиза триацилглицеридов (ТГ). В свободном, неэтерифицированном состоянии ЖК в организме содержатся в небольшом количестве, например, в крови, где они транспортируются в комплексе с белком альбумином [9]. Жирные кислоты, как правило, содержат неразветвленную цепь из атомов углерода (С4-С24, включая углерод карбоксильной группы) и могут быть как насыщенными, так и ненасыщенными [10]. По степени ненасыщенности ЖК подразделяют на насыщенные, в которых двойные связи С=С отсутствуют, мононенасыщенные содержащие одну кратную связь, и полиненасыщенные, в структуре которых содержится более одной кратной связи [11]. По длине углеродной цепи ЖК подразделяют на короткоцепочечные (от С4 до С6), 7 среднецепочечные (от С7 до С12) и длинноцепочечные (более С13). Короткоцепочечные ЖК зачастую представляют собой промежуточные продукты синтеза или деградации более длинных ЖК, в отличие от которых не являются основными компонентами биологических мембран. В состав большинства мембран в организме входят липиды с ацильными группами, содержащими 14, 16, 18, 20, 22 или 24 атомов углерода [12]. Многие ЖК еще до полного установления их строения имели тривиальные названия, и эти названия настолько прочно утвердились в литературе, что их трудно исключить из употребления [13], поэтому правилами ИЮПАК для номенклатуры ЖК допускается использование их тривиальных названий [14]. В соответствии с систематической номенклатурой, количество и положение двойных связей в ненасыщенных ЖК часто обозначают с помощью цифровых символов: например, олеиновую кислоту как 18:1;9, линолевую кислоту как 18:2;9,12, где первая цифра – число углеродных атомов, вторая – число двойных связей, а следующие цифры – номера ближайших к карбоксилу углеродных атомов, вовлеченных в образование двойной связи [15]. Также позицию двойной связи обозначают знаком Δ, после которого указывают номер атома углерода, ближайшего к карбоксилу, у которого находится двойная связь. Например, С18:1Δ9 означает, что ЖК содержит 18 атомов углерода и одну двойную связь у 9-го атома углерода, считая от углеродного атома карбоксильной группы [6]. В настоящее время также применяется собственная номенклатура ненасыщенных ЖК (т.н. «омега-номенклатура»), предложенная Холманом в 1964 году [16]. Эта классификация позволяет учитывать путь образования ЖК в организме. В ней концевой атом углерода, независимо от длины цепи, обозначается символом ω. Отсчет положения двойных связей производится не как обычно от карбоксильной группы, а от терминальной метильной группы [14]. Структура любой ненасыщенной кислоты может быть выражена тремя цифрами: числом углеродных атомов в цепи, количеством двойных связей и количеством углеродных атомов между двойной связью и метильной группой (-углеродом) Так, линоленовая кислота обозначается как 18:3 ω-3 (омега-3) [17], а, например, линолевая кислота может быть обозначена как С18:2Δ9,12 или С18:2ω-6 [6]: 1 2 3 4 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 3СН2 СН2 СН2 СН2 СН=СН СН2 СН=СН СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СН2 СH2 C СН конец О ОН Линолевая кислота или 18:2 6 (октадекадиеновая кислота) 8 Таблица 1 – Наиболее распространённые насыщенные ЖК Пропановая кислота Бутановая кислота Пентановая кислота Гексановая кислота Гептановая кислота Октановая кислота Нонановая кислота Декановая кислота Ундекановая кислота Додекановая кислота Тридекановая кислота Тетрадекановая кислота Пентадекановая кислота Гексадекановая кислота Гептадекановая кислота Октадекановая кислота C2H5COOH C3H7COOH C4H9COOH C5H11COOH C6H13COOH C7H15COOH C8H17COOH C9H19COOH C10H21COOH С11Н23СООН С12Н25СООН Рациональная полуразвернутая формула CH3(CH2)COOH CH3(CH2)2COOH CH3(CH2)3COOH CH3(CH2)4COOH CH3(CH2)5COOH CH3(CH2)6COOH CH3(CH2)7COOH CH3(CH2)8COOH CH3(CH2)9COOH CH3(CH2)10COOH CH3(CH2)11COOH С13Н27СООН CH3(CH2)12COOH 53,9 °C С14Н29СООН CH3(CH2)13COOH 52 °C С15Н31СООН CH3(CH2)14COOH 62,8 °C С16Н33СООН CH3(CH2)15COOH 61,3 °C С17Н35СООН CH3(CH2)16COOH 69,4 °C Нонадекановая кислота С18Н37СООН CH3(CH2)17COOH 68,2 °C Эйкозановая кислота Генэйкозановая кислота Докозановая кислота С19Н39СООН CH3(CH2)18COOH 76,2 °C С20Н41СООН CH3(CH2)19COOH 75,2 °C С21Н43СООН CH3(CH2)20COOH Трикоциловая кислота Трикозановая кислота С22Н45СООН CH3(CH2)21COOH 80 °C 78,779,1 °C Лигноцериновая кислота Пентакоциловая кислота Тетракозановая кислота Пентакозановая кислота Гексакозановая кислота Гептакозановая кислота Октакозановая кислота С23Н47СООН CH3(CH2)22COOH С24Н49СООН CH3(CH2)23COOH 7783,5 °C С25Н51СООН CH3(CH2)24COOH 87,4 °C С26Н53СООН CH3(CH2)25COOH 87,5 °C С27Н55СООН CH3(CH2)26COOH 90,9 °C С28Н57СООН CH3(CH2)27COOH С29Н59СООН CH3(CH2)28COOH С30Н61СООН CH3(CH2)29COOH С31Н63СООН CH3(CH2)30COOH С32Н65СООН CH3(CH2)31COOH С33Н67СООН CH3(CH2)32COOH С34Н69СООН CH3(CH2)33COOH С35Н71СООН CH3(CH2)34COOH Тривиальное название Пропионовая кислота Масляная кислота Валериановая кислота Капроновая кислота Энантовая кислота Каприловая кислота Пеларгоновая кислота Каприновая кислота Ундециловая кислота Лауриновая кислота Тридециловая кислота Миристиновая кислота Пентадециловая кислота Пальмитиновая кислота Маргариновая кислота Стеариновая кислота Нонадециловая кислота Арахиновая кислота Генэйкоциловая кислота Бегеновая кислота Церотиновая кислота Гептакоциловая кислота Монтановая кислота Нонакоциловая кислота Мелиссовая кислота Гентриаконтиловая кислота Лацериновая кислота Псилластеариновая кислота Геддовая (геддинновая) кислота Церопластовая кислота Гексатриаконтиловая кислота Систематическое название (IUPAC) Нонакозановая кислота Триаконтановая кислота Гентриаконтановая кислота Дотриаконтановая кислота Тритриаконтановая кислота Тетратриаконтановая кислота Пентатриаконтановая кислота Гексатриаконтановая кислота Брутто формула Т.пл. −21 °C −8 °C −34,5 °C −4 °C −7,5 °C 17 °C 12,5 °C 31 °C 28.6 °C 43,2 °C 41 °C 92-94 °C Насыщенные ЖК, в отличие от ненасыщенных весьма устойчивы к окислению. Температуры плавления ЖК возрастают с увеличением длины цепи, а их растворимость в воде 9 уменьшается. В таблице 1 представлены некоторые насыщенные ЖК и их основные свойства [18]. Следует отметить, что при физиологической температуре (37°С) ЖК с количеством атомов углерода 10 и меньше являются жидкостями, а С12 и более – твердые вещества. Короткоцепочечные ЖК С2-С4 полностью смешиваются с водой, а длинноцепочечные, начиная с С20, - практически нерастворимы. По количеству двойных связей в молекуле жирные кислоты классифицируются следующим образом: ЖК с одной двойной связью относятся к моноеновым или мононенасыщенным. Если в составе молекулы имеется более одной двойной связи, такие ЖК относятся к классу полиеновых или полиненасыщенных. Двойные связи в ЖК в организме человека имеют цис-конфигурацию. Цис-конфигурация двойной связи делает алифатическую цепь молекулы изогнутой, что нарушает упорядоченное расположение насыщенных радикалов ЖК в фосфолипидах мембран, как наглядно показано на рисунке 1, и снижает тем самым температуру плавления. Чем больше двойных связей в ЖК липидов, тем ниже температура их плавления. ЖК с транс-конфигурацией двойной связи могут поступать в организм с пищей, например, в составе маргарина. В этих кислотах отсутствует излом, характерный для цис-связи, поэтому жиры, содержащие такие ненасыщенные кислоты, имеют более высокую температуру плавления, т.е. более твёрдые по консистенции [6]. А - цис-конфигурация радикала ЖК; Б - нарушение упорядоченного расположения радикалов насыщенных ЖК в гидрофобном слое мембран ненасыщенной кислотой с цис-конфигурацией двойной связи. Рисунок 1 - Конфигурации радикалов ЖК. В таблице 2 и 3 указаны основные мононенасыщенные и полиненасыщенные ЖК [18;19]. Полиненасыщенные ЖК, необходимые животным и человеку, но которые образуются в ходе биосинтеза в их организмах, называют незаменимыми. Поступление незаменимых ЖК в организм возможно только с пищей. К незаменимым ПНЖК относятся 18-атом- 10 ные кислоты семейств n-6 и n-3 (омега-6 и омега-3): линолевая кислота (ЛК) с двумя двойными связями (18:2n-6) и альфа-линоленовая кислота (АЛК) с тремя двойными связями (18:3n-3) [20]. Таблица 2 – Наиболее распространённые мононенасыщенные ЖК Тривиальное название Систематическое название ω1 Δ2 Акриловая 2-пропеновая кислота 3:1ω1 3:1Δ2 Метакриловая 2-метил-2-пропеноваякислота 4:1ω1 3:1Δ2 Кротоновая 2-бутеновая кислота 4:1ω2 4:1Δ2 Винилуксусная 3-бутеновая кислота 4:1ω1 4:1Δ3 Лауроолеиновая цис-9-додеценоваякислота 12:1ω3 12:1Δ9 Миристолеиновая цис-9-тетрадеценоваякислота 14:1ω5 14:1Δ9 Пальмитолеиновая цис-9-гексадеценоваякислота 16:1ω7 16:1Δ9 Петроселиновая цис-6-октадеценоваякислота 18:1ω12 18:1Δ6 Олеиновая цис-9-октадеценоваякислота 18:1ω9 18:1Δ9 Элаидиновая транс-9-октадеценоваякислота 18:1ω9 18:1Δ9 Цис-вакценовая цис-11-октадеценоваякислота 18:1ω7 18:1Δ11 Транс-вакценовая транс-11-октадеценоваякислота 18:1ω7 18:1Δ11 Гадолеиновая цис-9-эйкозеноваякислота 20:1ω11 19:1Δ9 Гондоиновая цис-11-эйкозеноваякислота 20:1ω9 20:1Δ11 Эруковая цис-9-доказеноваякислота 22:1ω13 22:1Δ9 Нервоновая цис-15-тетракозеноваякислота 24:1ω9 23:1Δ15 Примечание: 1 – ω – номенлатура, нумерация атомов углерода с СН3-конца; 2 - Δ – номенлатура, нумерация атомов углерода с COOH-конца. Таблица 3 – Наиболее распространенные полиненасыщенные ЖК (ПНЖК) Тривиальное название Систематическое название ω1 Δ2 транс,транс-2,4Сорбиновая 6:2ω3 6:2Δ2,4 гексадиеновая кислота Линолевая цис,цис-9,12-октадекадиеноваякислота 18:2ω6 18:2Δ9,12 цис,цис,цис-6,9,12Линоленовая 18:3ω6 18:3Δ6,9,12 октадекатриеноваякислота цис,цис,цис-9,12,15Линоленовая 18:3ω3 18:3Δ9,12,15 октадекатриеноваякислота цис-5,8,11,14Арахидоновая 20:4ω6 20:4Δ5,8,11,14 эйкозотетраеноваякислота Дигомо-γ-линоленовая 8,11,14-эйкозатриеновая кислота 20:3ω6 20:3Δ8,11,14 4,7,10,13,1620:5ω4 20:5Δ4,7,10,13,16 докозапентаеноваякислота 5,8,11,14,17Тимнодоновая 20:5ω3 20:5Δ5,8,11,14,17 эйкозапентаеноваякислота 4,7,10,13,16,19Цервоновая 22:6ω3 22:3Δ4,7,10,13,16,19 докозагексаеноваякислота 5,8,11-эйкозатриеновая кислота 20:3ω9 20:3Δ5,8,11 Примечание: 1 – ω – номенлатура, нумерация атомов углерода с СН3-конца; 2 - Δ – номенлатура, нумерация атомов углерода с COOH-конца. Основная роль ЛК и АЛК в организме животных и человека состоит в том, что они могут являться биохимическими предшественниками физиологически значимых длинноцепочечных ПНЖК с 20-22 атомами углерода. К длинноцепочечным ПНЖК, называемым частично незаменимыми, относятся арахидоновая (эйкозатетраеновая) кислота (20:4n-6, АРК), эйкозапентаеновая кислота (20:5n-3, ЭПК) и докозагексаеновая кислота (22:6n-3, ДГК). Как это видно из условных обозначений, АРК относится к семейству омега-6, а ЭПК 11 и ДГК – к семейству омега-3. Только растения имеют десатуразы Δ15 и Δ12 и могут синтезировать исходные ПНЖК семейства омега-6 и омега 3, т. е. линолевую и альфа-линоленовую кислоты. Животные, получив ЛК и АЛК с пищей, способны синтезировать из них длинноцепочечные ПНЖК омега-6 (АРК) и омега-3 (ЭПК, ДГК). В синтезе участвуют ферменты, удлиняющие углеродную цепь (элонгазы), а также десатуразы Δ5 и Δ6. Следует отметить, что эффективность синтеза длинноцепочечных ПНЖК у животных и человека невелика, хотя именно эти кислоты играют важнейшую роль в функционировании организма. Жирные кислот, двойные связи которых имеют транс-конфигурацию, в мембранах клеток встречаются очень редко. Продуктами ферментативного дегидрирования под воздействием десатураз являются цис-изомеры поэтому абсолютное большинство двойных связей в ацильных группах структурных липидов биологических мембран имеет цис-конфигурацию [21]. Транс-ЖК попадают в организм посредством питания, через молочные продукты, мясо, гидрированные растительные масла. Наиболее распространенной транскислотой является элаидиновая кислота. Большое количество транс-ЖК образуется как побочные продукты частичного гидрирования растительных жиров, используемых в производстве пищевой продукции. Возрастание случаев сердечных болезней, связанных с возросшим употреблением гидрированных растительных жиров, привело к запрету транс-жиров в некоторых странах [12]. Остается открытым вопрос, почему цис-ЖК имеют важное значение для здоровья человека, а транс-ЖК наносят вред организму. Ключ к ответу может находиться в разности температур плавления. Транс-ЖК имеют гораздо более высокую температуру плавления, чем соответствующий гомологический ряд цис-ЖК. Например, мононенасыщенная транс-кислота элаидиновая - обладает температурой плавления 43,7 С, а соответствующий ей цис-изомер олеиновая кислота - температуру плавления 16,2 С. Для сравнения, насыщенная стеариновая кислота с тем же количеством атомов углерода (С18) обладает температурой плавления 69,6С. Можно сделать вывод, что из двух ненасыщенных кислот, содержащих 18 углеродных атомов, и двойную связь у 9 углеродного атома, элаидиновая по свойствам более схожа с насыщенной жирной кислотой. Элаидиновая кислота является одной из распространённых транс-ЖК, применяемых в процессе приготовления продуктов. Было установлено, что она ингибирует активность десатураз, из-за чего ухудшается конвертация линолеиновой кислоты в арахидоновую. Также транс-ЖК являются причиной воспалений и кальцинации артериальных клеток, которые увеличивают риск инфаркта миокарда [22]. 12 1.2 Биологическая роль жирных кислот и их значение в медицине и токсикологии 1.2.1 Химические классы липидов плазмы крови В крови человека ЖК присутствуют либо в свободном виде, либо в виде ацильных функциональных групп в т.н. липидах, представленных тремя основными классами соединений: холестерин и его эфиры, триглицериды и фосфолипиды. O O R1 O R2 R1 O O O O R3 O Глицеролипиды HO O R2 OH O O P O HO O OX O X O Сфинголипиды Глицерофосфолипиды NH R O R OH Жирные кислоты RO O Стеролы O OH OH Эйкозаноиды SCoA Ацетил-КоА O O O O P O P OH OH OH Изопентенилпирофосфат O O n Пренолы Рисунок 2 - Разнообразие липидов плазмы крови. Взаимосвязи между основными категориями липидов показаны начиная с ацетил-КоА, который является строительным блоком в биосинтезе ЖК [23]. Из всех видов биологических соединений в организме, липиды выделяются значительным химическим разнообразием (см. рисунок 2). Липиды представляют собой большую группу природных гидрофобных соединений с разнообразной структурой и биологическими функциями, объединяемые в единую категорию по следующим трем признакам: 1) Плохую растворимость в воде и хорошую в неполярных растворителях; 2) Нахождение в природе в виде настоящих или потенциальных сложных эфиров высших ЖК; 3) Присутствие во всех живых организмах. Биологические функции липидов: структурная, энергетическая, защитная и регуляторная. Количество и состав резервных липидов непостоянны и зависят от режима питания 13 и физического состояния организма. Количество и состав структурных липидов в организме строго постоянны, генетически обусловлены и в норме, как правило, не зависят от режима питания и функционального состояния организма [24]. Наибольшим химических разнообразием обладает класс сфинголипидов, а стеролы, представляющие собой эфиры холестерола, являются основными липидными компонентами плазмы крови по молярному содержанию. Жирные кислоты Свободные ЖК представляют собой лишь небольшую фракцию от общего содержания ЖК плазмы крови, но, тем не менее, они являются высокоактивным классом липидов. Основным источником СЖК, качественный состав которых сильно зависит от диеты, является жировая ткань [25]. В нормальных условиях высвобождение ЖК из жировой ткани жестко регулируется в соответствии с энергетическими потребностями тканей. Однако, в результате некоторых метаболических расстройств, этот гомеостаз может быть нарушен, и тогда сдвиги в сторону повышения липолиза приводят к высвобождению избыточных колчиеств СЖК по отношению к потребностям тканей. Основной пул всех свободных ЖК в циркулирующей крови составляют три ЖК: олеиновая кислота (18:1) является основным компонентом, пальмитиновая кислота (16:0) и стеариновая (18:0). Вместе эти три ЖК составляют около 78% от общего количества СЖК в крови. Линолевая кислота (18:2) и арахидоновая кислоты (20:4) являются основными ПНЖК (около 8% от общего числа); α-линоленовая кислота (18:ω-3), эйкозапентаеновая кислота (20:5), и докозагексаеновая кислоты (22: 6), также присутствуют в значимых концентрациях. Вместе они составляют около 1% всех свободных ЖК. Важным классом метаболитов ЖК являются т.н. эйкозаноиды которые представляют собой класс биологически активных медиаторов, образующиеся при метаболизме арахидоновой кислоты или некоторых других ПНЖК [26]. Многие эйкозаноиды обладают воспалительным или противовоспалительным действием. Основные классы липидов плазмы крови представлены в таблице 4. Глицеролипиды Глицеролипиды представляют собой сложные эфиры трёхатомного спирта глицерола и ЖК. Глицерол может быть связан с одной, двумя или тремя жирными кислотами, соответственно образуя моно-, ди- или триацилглицериды [6]. 14 Таблица 4 – Содержание основных классов липидов в плазме крови Количество Суммарная концентра- Суммарная Химический класс представит ция в плазме крови, концентрация, елей класса нмоль/мл мг/дл Жирные кислоты ЖК 31 214 5,82 Эйкозаноиды 76 0,071 0,002 Глицеролипиды Триацилглицериды 18 1058 90,60 1,2-диацилглицериды 28 39 2,36 1,3-диацилглицериды 27 13 0,81 Глицерофосфолипиды Глицерофосфоэтаноламины 38 435 32,70 Лизофосфатидилэтаноламины 7 36,6 1,78 Глицерофосфохолины 31 1974 157,00 Лизофосфатидилхолины 12 103 5,25 Глицерофосфосерины 20 7 0,56 Глицерофосфоглицериды 16 6,12 0,48 Глицерофосфаты 15 2,5 0,17 Глицерофосфоинозитолы 19 31,5 2,74 N-ацилглицерофосфосерины 2 0,013 0,00 Сфинголипиды Сфингомиелины 101 303 22,80 Моногексозилсерамиды 56 2,3 0,18 Церамиды 41 11,6 0,73 Сфингоиды 6 0,6 0,02 Стеролы Свободные стеролы 14 826 31,80 Этерифицированные стеролы 22 2954 114,00 Пренолы Долихолы 6 0,025 0,00 Коэнзим-Q 2 4,59 0,39 Моно- и диацилглицериды образуются на промежуточных этапах распада и синтеза триацилглицеридов. Заместители атомах углерода в глицерине имеют различную пространственную конфигурацию, вследствие чего можно наблюдать стереоселективность ферментативного ацилирования. O R2 O R1 O O 2 O 1 3 R3 O Рисунок 3 - Пространственное расположение углеродных атомов глицерина Глицеролипиды составляют значительную долю от общих липидов, присутствующих в плазме. Из них наиболее распространенными являются триглицериды, уровень которых в плазме составляет 1,1 мкмоль/мл (90,6 мг/дл), однако абсолютная концентрация ТГ 15 зависит от приема пищи. Проблемой при определении ТГ является наличие множества изомерных соединений, включающих различные ацильные группы. Иногда такие группы изомерных глицеридов могут достигать до 10 соединений. Например, 52:3 ТГ является сложной смесью из нескольких изомеров (16:1/18:1/18:1, 16:1/18:0/18:2, 16:0/18:1/18:2), не считая региоизомеров. Всего в плазме крови удалось обнаружить приблизительно 200 ТГ. Повышенный уровень триацилглицеридов в крови является одним из дополнительных факторов риска развития ишемической болезни сердца. Глицерофосфолипиды Фосфатиды представляют собой соединение спирта, глицерина или сфингозина с высшими ЖК и фосфорной кислотой. В их состав также входят азотсодержащие соединения: холин, этаноламин, серин, циклический шестиатомный спирт инозитол (витамин В8) [27]. Фосфолипиды служат главными компонентами биологических мембран. Их общим отличительным признаком является наличие остатка фосфорной кислоты, который образует сложноэфирную связь с гидроксильной группой в положении С3 глицерина, поэтому фосфолипиды, по крайней мере, в нейтральной области рН, несут отрицательный заряд [24]. Фракция глицерофосфолипидов крови состоит более чем из 200 соединений. Подклассы включают в себя глицерофосфаты, глицерофосфохолины, глицерофосфоэтаноламины, глицерофосфоглицериды и глицерофосфосерины Подавляющее большинство глицерофосфолипидов в человеческой плазме это глицерофосфохолины и глицерофосфоэтаноламины. Положения ацильных заместителей в молекуле фосфолипидов, неравноценны. Ко второму атому углерода присоединена, как правило, полиненасыщенная ЖК. При углероде С1 находятся любые кислоты, чаще мононенасыщеннные или насыщенные. Наиболее простым глицерофосфолипидом является фосфатидная кислота (ФК) – промежуточное соединение для синтеза ТАГ и ФЛ. Фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилэтаноламин (ФЭА, кефалин), фосфатидилхолин (ФХ, лецитин) – структурные ФЛ, вместе с холестерином формируют липидный бислой клеточных мембран и обеспечивают активность мембранных ферментов, вязкость и проницаемость мембран [28,29]. Кроме этого, дипальмитоилфосфатидилхолин, являясь поверхностно-активным веществом, служит основным компонентом сурфактанта легочных альвеол. Его недостаток в легких недоношенных младенцев приводит к развитию синдрома дыхательной недостаточности. 16 Также фосфатидилхолин, являясь одним из важнейших компонентов желчи, поддерживает находящийся в ней холестерин в растворенном состоянии и, таким образом, препятствует образованию желчных камней. Структурные формулы некоторых важных фосфлипидов приведены на рисунке 4. O O R1 R2 O R2 O O R1 OH P OH O O фосфатидная кислота O OH P O O O O O NH2 COOH Фосфатидилсерин O O R2 R1 R2 O X = Серин Этаноламин O Холин P X O Инозитол O OH O O R1 O OH P O O O O O NH2 Фосфатидилэтаноламин Лизофосфолипиды O R2 R1 O OH P O O O O O N Фосфатидилхолин Рисунок 4 - Строение некоторых важных фосфолипидов Фосфатидилинозитол (ФИ) – играет ведущую роль в фосфолипид-кальциевом механизме передачи гормонального сигнала в клетку. Лизофосфолипиды – продукт гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А2, образуются при определенных стимулах, вызывающих в клетке синтез эйкозаноидов (простагландинов, лейкотриенов). Намного более редким является кардиолипин – структурный фосфолипид в мембране митохондрий. Плазмалогены при С1 содержат высший спирт вместо жирной кислоты. Они участвуют в построении структуры мембран и составляют до 10% фосфолипидов мозга и мышечной ткани [28]. Сфинголипиды Основным представителем у человека являются сфингомиелины, содержвщиеся, главным образом, в сером и белом веществе головного и спинного мозга, в оболочке аксонов периферической нервной системы, есть в печени, почках, эритроцитах и других тканях. В качестве ЖК выступают насыщенные и мононенасыщенные. В нервной ткани сфингомиелин участвует в передаче нервного сигнала по аксонам. В последние годы активно разрабатывается роль сфинголипидов в регуляции внутриклеточных процессов в качестве источника вторичного мессенджера церамида. Основу сфин- 17 голипидов составляет сфингозин, связанный амидной связью с ацильной группой (например, с ЖК). При этом несколько возможных радикалов связаны со сфингозином за счёт эфирной связи. Простейший представитель сфинголипидов — церамид. При гидролизе сфингомиелины образуют одну молекулу жирной кислоты, одну молекулу двухатомного ненасыщенного спирта сфингозина, одну молекулу азотистого основания (чаще это холин) и одну молекулу фосфорной кислоты [30; 31]. На рисунке 5 представлена общая формула сфингомиелинов. O O P O OH OH O Сфингомиелин N NH R OH OH NH2 Сфингозин OH OH NH2 Дигидросфингозин Рисунок 5 - Строение сфигномиелина Структуры молекул сфингомиелина и глицерофосфолипидов во многом схожи. Молекула сфингомиелина содержит полярную «головку», которая несет одновременно и положительный (остаток холина), и отрицательный (остаток фосфорной кислоты) заряды, и два неполярных «хвоста» (длинная алифатическая цепь сфингозина и ацильный радикал жирной кислоты). В некоторых сфингомиелинах, например, выделенных из мозга и селезенки, вместо сфингозина найден спирт дигидросфингозин (восстановленный сфингозин) [32]. 1.2.2 Биологическая роль жирных кислот Жиры (триацилглицериды) — наиболее важный резерв энергии в организме животных. Они хранятся главным образом в клетках жировой ткани, адипоцитах [33] и там же протекают основные процессы их синтеза и деградации. ЖК поступают с пищей или синтезируются в организме за исключение незаменимых. ЖК, необходимые для синтеза жиров (липогенеза), в составе триацилглицеридов переносятся из печени и кишечника в виде липопротеиновых комплексов. Липопротеин-липаза, 18 находящаяся на поверхности эндотелиальных клеток кровеносных капилляров, отщепляет от этих липопротеинов ЖК. Схема образования и деградации ЖК приведена на рисунке 6. В адипоцитах деградация жиров (липолиз) катализируется гормонзависимой липазой. Уровень свободных ЖК, поступающих из жировой ткани, зависит от активности этой липазы - фермент регулирует, таким образом, уровень ЖК в плазме. ЖК из жировой ткани транспортируются в плазму крови в неэтерифицированной форме. При этом растворимы только короткоцепочечные, но и ЖК с более длинными углеродными цепями, менее растворимые в воде, переносятся в комплексе с альбумином. Из плазмы крови ЖК поступают в ткани; здесь из них синтезируются жиры или за счет окисления вырабатывается энергия. Особенно интенсивен метаболизм ЖК в клетках печени (гепатоцитах). Рисунок 6 - Схема образования и деградации ЖК Жирнокислотные индексы активности ферментов Биотрансформация ЖК в организме происходит с участием двух типов ферментов элонгазы, осуществляющей удлинение углеродной цепочки, и десатуразы, ответственной за появление новой двойной связи в молекуле ЖК. Десатуразы - от англ. desaturation – класс ферментов, катализирующих реакции дегидрирования. Каждая десатураза, характеризуется высокой стерео- и региоселективностью и вводит двойную связь лишь в один строго определённый участок углеродной цепи ЖК. Например, десатураза Δ9, также известная как стеарил-CoA десатураза (SCD1), присоединяет двойную связь к девятому атому углерода, считаемому от карбонильного (COOH) 19 [34]. С помощью профилирования СЖК и ЭЖК в плазме крови и других биологических образцов, возможно определять активность ферментов десатураз и элонгаз [35]. Например, отношение концентраций стеариновой кислоты и олеиновой 18:0 к 18:1 или пальмитолеиновой к пальмитиновой кислоте 16:1 к 16:0, является показателем активности Δ9десатуразы, и, как следствие, клеточного роста и дифференциации за счет влияния на текучесть мембран и сигнальной трансдукции [36]. Активность фермента Δ6-десатуразы (D6D) можно вычислить как отношение концентраций линолевой и линоленовой кислот 18:3n-6 к 18:2n-6, Δ5-десатуразы (D5D) - как отношение арахидоновой к 8,11,14 –эйкозатриеновой кислоте 20:4n-6 к 20:3n-6. Активность элонгазы определяется отношением стеариновой к пальмитиновой 18:0 к 16:0. Значения индексов позволяют охарактеризовать различные метаболические функции и физические свойства клеток [35]. В настоящее время определение индексов играют важную роль в диагностике различных заболеваний, таких, как диабет и кардиологические заболевания, так как индексы являются показателем метаболизма клеток и могут стать ключом в понимании возникновения патологий и течения заболеваний. Измерение профиля, помимо изменения суммарной концентрации СЖК позволяет количественно охарактеризовать изменение липидного состава крови. Например, ЖК семейства ω-6 не могут конвертироваться в ω-3 ПНЖК, и наоборот. В связи с этим, незаменимые ЖК конкурируют за одни и те же энзимы, которые осуществляют элонгацию и десатурацию, и непропорционально высокое количество линолевой кислоты в питании приводит к образованию избытка соответствующих длинноцепочечных ЖК, таким образом ограничивая синтез производных α-линоленовой кислоты. Именно по этой причине адекватное соотношение линолевой и α-линоленовой ЖК имеет большее значение, чем их количественное содержание [37]. Стеарил-КоА десатураза (SCD), Δ6-десатураза (Δ6D) и Δ5десатураза (Δ5D) катализируют эндогенный синтез длинноцепочечных ненасыщенных ЖК, которые модулируют метаболические функции клетки. Индекс активности элонгазы является показателем активности синтеза ЖК. Жирнокислотные индексы активности ферментов используются для оценки активности этих ферментов и как самостоятельный диагностический маркер, например активность SCD и соотношение ω-6/ω-3 полиненасыщенных ЖК в крови связывают с риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, инсулинорезистентностью и пр. [38]. 20 Рисунок 7 – Схема образования арахидоновой и докозагексаеновой кислот из незаменимых ЖК Недавно было показано, что ω-6 ЖК обладают защитным действием против болезней сердца. В дополнение к снижению ЛПНП, ω-6 также снижают кровяное давление [39]. Авторы [40] предполагают, что высокие соотношения ω-6/ω-3 свидетельствуют о высоком риске возникновения онкологических заболеваний. Возможные механизмы кардиопротекторных эффектов ω-3 ЖК заключаются в понижении уровней триглицеридов, ослаблении аритмий, снижении кровяного давления, предотвращении агрегации кровяных телец [41] и пр. В моделях с использованием лабораторных животных диета, богатая омега-3 кислотами, уменьшала количество липопротеинов низкой плотности [42] в сравнении с диетами, богатыми насыщенными ЖК, которые увеличивали их содержание [43]. 1.2.3 Исследование профилей жирных кислот в медицине и токсикологии Нарушение метаболизма ЖК может являться как следствием, так и причиной различных заболеваний. Липопротеины (комплексы липидов и белков) плазмы крови играют ключевую роль в транспорте жиров и холестерина в организме, они регулируют синтез липидов и липолитические пути. Изменение метаболизма липопротеинов может приводить к серьёзным проблемам в организме. Повышенные уровни определённых липидов и липо- 21 протеинов плазмы связаны с увеличением риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний [44]. Использование ЖК в качестве биомаркеров различных заболеваний осложняется множественностью причин изменения жирно-кислотного состава крови. Однако характерные изменения концентраций ряда ЖК в совокупности с другими биологическими молекулами, например, эйкозаноидами, потенциально могут являться биомаркерами и служить инструментом для ранней диагностики различных заболеваний [45]. Онкологические заболевания Существуют исследования, связывающие некоторые онкологические заболевания и аномальные профили ЖК плазмы крови [46]. Быстропрогрессирующим раковым клеткам требуется питание липидами для построения мембран и протеиновых модификаций. Медленно прогрессирующим раковым клеткам тоже необходимо увеличенное количество липидов для активации сигнальных путей и развития устойчивости к апоптозу [47,48] Независимо от онкогенеза, многие разновидности рака обладают общим механизмом, характеризующимся иммуносупрессией и активацией провоспалительных сигнальных клеток. На основе этого факта строятся предположения о возможном использовании ω-3 ПНЖК (эйкозапентаеновой и/или докозагексаеновой кислоты), действие которых направлено на ингибирование воспалений, в онкологии; они могут быть полезны в качестве онкомаркеров [49,50,51]. Повышенная экспрессия генов, вовлеченных в липогенез, является общим фактором для многих видов рака, так некоторые раковые клетки синтезируют ЖК, вместо того чтобы использовать ЖК поступающие с питанием [52]. Поэтому в настоящее время активно проводятся исследования по выявлению закономерностей между нарушениями метаболизма ЖК и возникновение онкологических заболеваний. В работе [53] был изучен профиль ЖК крови больных множественной миеломой. В исследовании были отмечены значительные различия профилей ЖК по сравнению с контрольной группой. У больных наблюдались повышенные уровни насыщенных ЖК и ω-6 полиненасыщенных. Общее количество ω-3 полиненасыщенных ЖК было значительно понижено у больных множественной миеломой. В плазме крови больных были выявлены повышенные уровни транс-ЖК по сравнению с контрольной группой, а также наблюдалось значительное понижение отношения ω-3/ω-6 ЖК. Было высказано предположение, о том, что такое повышение могло быть следствием увеличения синтеза этих ЖК из-за повышенной экспрессии десатуразы и элонгазы. Кроме того, кластерный анализ показал различия в распределении ЖК в плазме у больных множественной миеломой. Так как единственный путь поступления незаменимых ПНЖК в организм является питание, следовательно, питание в сочетании с другими факторами, например, иммунологическими расстройствами, играет большую роль в развитии болезней. Совокупность этих факторов потенциально влияет 22 на метаболизм опухолевых клеток, функцию липидов как сигнальных молекул, или на процессы воспаления [53]. Высокое содержание липидов в пище и нарушение метаболизма эндогенных ЖК могут способствовать воспалениям с высоким канцерогенным риском, а нарушения метаболизма арахидоновой кислоты является причиной развития воспалительных реакций. Концентрации СЖК в крови больных и развитие рака груди связаны, что показано в работе [54]. Также известны работы по исследованию связи между жирнокислотным составом эритроцитов и опасностью возникновения рака простаты [55,56]: определение концентраций индивидуальных ЖК, а также традиционных групп ЖК показал обратно-пропорциональную зависимость между общим содержанием мононенасыщенных ЖК и риском развития рака. Выявлены корреляционные зависимости, между так называемым, западным образом жизни, характеризующимся высококалорийной едой, богатой насыщенными жирами, белками животного происхождения и рафинированными углеводами, и высокой заболеваемостью раком простаты. У таких больных, помимо всего, были выявлены нарушения метаболизма ЖК [57]. В онкологии известны некоторые общие тенденции изменений липидных профилей плазмы крови у больных, однако ряд противоречий пока не позволяет напрямую использовать данные о жирно-кислотном составе крови и тенденций их изменений для диагностики. По всей вероятности, эти противоречия связаны с тем, что различные типы раковых заболеваний обладают неодинаковыми механизмами получения и использования липидов крови [46]. Заболевания сердечно-сосудистой системы Повышенные уровни определённых липидов и липопротеинов плазмы являются маркерами риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний [44]. ЖК и эйкозаноиды являются важными компонентами липидов сигнальных молекул, вовлеченных в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний [58]. Многофакторный анализ профилей ЖК [58] показал, что уровни шести ЖК и пяти эйкозаноидов в плазме больных ишемической болезнью достоверно отличались от таковых у здоровых людей. Было отмечено значительное уменьшение концентрации эйкозапентаеновой кислоты (C20:5n3) и докозагексаеновой (С22:6n3) кислоты, а также пониженные уровни лауриновой (С12:0), миристиновой (С14:0) и миристолеиновой кислот (С14:1) в плазме больных. Кроме того, уровень транс-ЖК, в основном элаидиновой кислоты (С18:1n9t, одна из самых распространённых в организме транс-ЖК), оказался значительно выше у всех пациентов, такое повышение концентраций транс-ЖК в крови здоровых людей 23 в некоторых исследованиях связывают с риском возникновения различных хронических заболеваний [59]. Таким образом, для того чтобы раскрыть их биологическую значимость в заболеваниях сердечно-сосудистой системы, необходимо дополнительное изучение роли и механизмов метаболизма ЖК. Синдром внезапной сердечной смерти, по некоторым оценкам, составляет около 50% от смертностей всех сердечных заболеваний в США [60]. Одним из биомаркеров заболеваний такого рода является уровень СЖК в крови. Исследование показало значительное повышение СЖК в плазме крови людей в случаях острых сердечных приступов. Повышение уровней СЖК в крови при этом наблюдалось и у мужчин и у женщин [61]. Результаты определения ЖК в фосфолипидах показали, что пониженное содержание n-3-ПНЖК может быть связано не только с ишемическими, но также геморрагическими повреждениями головного мозга. Были исследованы образцы плазмы крови у больных, перенесших данные заболевания, и выявлено, что у них суммарная концентрация n-3-ПНЖК, а также содержание отдельных кислот (докозагексаеновой и эйкозапентаеновой) ниже, чем у здоровых людей. Механизмы, лежащие в основе ишемических болезней, не изучены до конца и определение жирно-кислотного состава крови может дать ответы на эти вопросы [62]. Сахарный диабет Одно из важных направлений изучения жирно-кислотного состава крови связано с исследованием диабета [63]. Сахарный диабет является наиболее распространённым заболеванием, вызванным нарушением обмена веществ. В настоящее время диабет является серьёзной проблемой здравоохранения из-за его высокой распространённости. Основные факторы при диабете это гипергликемия, дислипидемия и артериальная гипертензия, что, в свою очередь повышает риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний [64]. В исследовании [64] описаны факторы как генетической предрасположенности к заболеванию, так и влияние питания. Отмечено, что при потреблении большого количества насыщенных жиров возникает риск заболевания даже при отсутствии генетической склонности. Инсулинорезистентность и нарушение обмена липидов - характерные черты диабета 2 типа и диабетической нефропатии (ДН) [65]. Дисфункция органов вследствие избытка СЖК в крови получила название «липотоксичность» [66]. Дефицит инсулина и повышенный уровень СЖК тесно взаимосвязаны [67]. С одной стороны, дефицит инсулина ведет к повышению липолиза, снижению синтеза липидов и повышению уровня СЖК. С другой, высокий уровень СЖК усиливает тяжесть диабета в результате снижения секреции инсулина [68,3,7]. Кроме того, высокий уровень СЖК может стать причиной воспалительного 24 процесса и апоптоза β-клеток, этот феномен получил название "липоапоптоз" [69]. Динамика уровня ЖК отражает развитие заболевания; постепенный переход от диабета к разным стадиям ДН сопровождается повышением или понижением уровня СЖК и ЭЖК в крови, причем эти флуктуации являются иллюстрацией механизма самовосстановления клеток и органов [66,70], а изменения СЖК являются следствием метаболической саморегуляции ЭЖК [71]. Так, для начальной стадии диабета характерно повышение уровня СЖК и снижение уровня ЭЖК. По мере прогрессирования диабета вплоть до стадии ДН3, уровень СЖК остается неизменно повышенным, тогда как уровень ЭЖК растет, предотвращая рост СЖК; кроме того, избыток СЖК поступает в нежировые ткани. СЖК (наряду с глюкозой) подавляют экспрессию гена инсулина и уменьшают секрецию инсулина, но делают это не напрямую, а опосредованно [72]. В результате этерификации СЖК образуются, в частности, церамиды, воскообразные липиды, состоящие из сфингозина (2-амино-4-октадецен-1,3диол) и жирной кислоты. Церамиды в больших концентрациях присутствуют в клеточных мембранах, составляя основу сфинголипидов (например, сфингомиелина), класса фосфолипидов клеточных мембран. Церамиды являются не просто структурными элементами, но участвуют во внутриклеточной сигнализации, регулируя дифференцировку, пролиферацию, программируемую клеточную гибель клеток [73,41]. Метаболическое профилирование ЖК оказалось очень перспективным методом, который может повысить чувствительность и специфичность диагностики, дискриминировать диабет 2-го типа от различных стадий ДН. В одном из исследований в плазме крови больных было идентифицировано 15 СЖК и 15 ЭЖК, при этом наиболее информативным показателем оказалась арахидоновая кислота и ее производные, которые участвуют в синтезе простагландинов - известных участников воспалительных процессов [71]. Эндотелий сосудов – одна из главных мишеней СЖК, а поражение микрососудов почек – главная причина ДН [74,75]. Миопатия Нарушение нормальных процессов окисления ЖК является причиной важной группы заболеваний, которые могут сопровождаться тяжелыми осложнениями, в том числе, со смертельным исходом. Они охватывают широкий спектр клинических расстройств, включая миопатию, обусловленную накоплением липидов, прогрессивную кардиомиопатию, рецидивирующию гипогликемическую энцефалопатию или Рейе-подобный синдром, судороги, а также психические торможения. Среди прочих методов диагностики таких заболеваний применяется определение степени окисления дейтерированного пальмитата [1С], октаноата и бутирата, дейтерированной олеиновой кислоты в фибропластах, для уста- 14 новления специфики нарушений окисления ЖК [76]. 25 1.3. Инструментальные методы определения свободных и этерифицированных жирных кислот 1.3.1 Определение жирных кислот методами газовой хроматографии. Наличие у ЖК полярных функциональных групп, которые препятствуют их качественному и количественному определению методом ГХ-МС, обуславливает необходимость проведения предварительной дериватизации перед анализом. В литературе описаны основные подходы к дериватизации ЖК, однако существуют методы определения ЖК и без дериватизации, но обычно они используются для определения высоких концентраций ЖК, или для достаточно простых матриц, наподобие фармакологических добавок с малым содержанием примесей [77]. Один из самых популярных методов дериватизации карбоновых кислот, это перевод их в метиловые эфиры. При метилировании происходит конверсия органических кислот в их метиловые эфиры, более удобные для ГХ анализа соединения за счёт уменьшения полярности и увеличения летучести [78]. Основно-катализируемые реакции дериватизации ЖК Основно-катализируемые реакции чаще всего используют для определения ЭЖК. Применяемые для этой процедуры реагенты редко подходят для этерификации СЖК. Самый распространенный агент для конверсии ацилглицеридов в метиловые эфиры это метоксид натрия в метаноле [79]. Этот реагент, однако, не может быть успешно применен в случае высокой концентрации СЖК в анализируемой пробе [80]. Реакция переэтерификации протекает быстро даже при комнатной температуре. В таких мягких условиях не протекают реакции изомеризации двойных связей в ЖК, а также не происходит высвобождение альдегидов из плазмалогенов, которые могут помешать хроматографическому определению. В таких условиях не происходит переэтерификация сфигнолипидов и холестерола, для которых требуются более жесткие условия. Особенностью этого основно-катализируемого метода переэтерификации является отсутствие конверсии СЖК в метиловые эфиры. Условием протекания реакции является отсутствие воды в пробе, так как в противном случае происходит гидролиз сложных эфиров с образованием карбоновых кислот, что может вести к потерям при определении ЭЖК. Увеличение времени реакции дериватизации может стать причиной изменения исходного состава ЖК, например, высокие концентрации основания и высокая температура может привести к образованию сопряженных (конъюгированных) ЖК. Наряду с метоксидом натрия часто используют спиртовой раствор гидроксида калия. Чаще всего он используется для переэтерификации глицеридов при анализе масел. 26 Было отмечено, что процедура с метоксидом калия (реакция с которым протекает около двух минут) подходит для определения ЖК, входящих в состав большого количества разнообразных жиров. Намного реже для этерификации масел и жиров используются растворы гуанидина и его алкилпроизводны в метаноле. Этот щелочной реагент катализирует комплексный метанолиз масел, превращает ацилглицериды и свободные ЖК в их метиловые эфиры. Этот реагент также необходимо удалить из пробы перед газохроматографическим анализом. Реакция проходит в мягких условиях, поэтому не протекают реакции изомеризации двойных связей, время пробоподготовки занимает 2 минуты на водяной бане. Кислотно-катализируемые реакции. Среди всех разновидностей кислотно-катализируемых реагентов только трифторид бора в метаноле конвертирует и ацилглицериды, и свободные ЖК в метиловые эфиры. Применение трифторида бора для определения ЖК описано еще в 1964 г [81]. Он является реакционноспособным переэтерифицирующим реагентом, способен реагировать с плазмалогенами и высвобождать альдегиды, которые затем конвертируются в диметилацетали. Присутствие диметилацеталей в пробе может мешать газохроматографическому анализу ЖК. Система BF3-метанол, реагируя с холестеролом, образует холестириловый метиловый эфир и холистадиен, которые также являются мешающими компонентами при определении ЖК. Кроме того, раствор трехфтористого бора в метаноле имеет ограничения по возможным условиям хранения [79]. В работе [82] систему BF3-метанол применяли для определения жирно-кислотного состава триглицеридов. Для этого производили экстракцию липидов крови смесью хлороформ/метанол, а затем к высушенному осадку добавляли трифторид бора с метанолом. Возможность применения трифторида бора для анализа ЖК сыворотки крови и мембран эритроцитов описана в [83]; при это была использована экстракция липидов смесью хлороформ-метанол. Трифторид бора может быть использован как отдельно, для переэтерификации ЭЖК, таких как холестерин и триглицериды, так и в комбинации с метанолом и гидроксидом натрия для конверсии метиловых эфиров и СЖК, полярных эфиров, ТГ и т.д. [84]. Хлорид алюминия в метаноле также используют для переэтерификации некоторых липидов. В молочных и овощных маслах этот реагент может быть использован без предварительной экстракции липидов. Хлорид алюминия в метаноле сравним с системой BF3метанол по возможности переэтерификации холестероловых эфиров. Продукты метилирования, которые содержатся в пробе после реакции, не мешают последующему ГХ анализу. Однако такой способ не подходит для метилирования СЖК [85,79]. 27 Ацетилхлорид также, как и хлорид алюминия, добавляют в пробу без предварительной пробоподготовки, а затем производят экстракцию метиловых эфиров н-гексаном [85]. С помощью ацетилхлорида в исследовании [86] проводили метилирование холестероловых эфиров, фосфолипидов и сфингомиелина смесью метанол-бензол-ацетил хлорид. В результате авторы установили, что такая смесь применима для широкого спектра липидов, однако не подходит для дериватизации СЖК. Метанольный раствор соляной и серной кислот часто используют для метилирования как СЖК, так и для переэтерификации сфинголипидов [85]. Для определения СЖК используют 2, 5 или 10% растворы серной кислоты в метаноле и выдерживают при 60-70С в течении часа [54]. Было проведено исследование [87] кислотно-катализируемой дериватизации с использованием ацетил хлорида 5% и 10%, 2% H2SO4, 5% H2SO4, 14% BF3 и 5% HCl в метаноле. От процентного соотношения реагентов зависел выход метиловых эфиров различных типов липидов триглицеридов, фосфолипидов и холестерина. Наибольший общий выход реакции наблюдали при использовании 5% ацетилхлорида в метаноле, - Реакция проходила 30 минут при 90 °С. Так как ЖК в организме человека находятся в двух видах - в этерифицированном и неэтерифицированном, то их раздельное определение может дать полную картину о нарушении метаболизма. Например, был описан метод построения метаболического профиля пациентов с заболеванием диабета 2го типа. Для этого было предложено сначала метилировать этерифицированные ЖК с помощью 0,4М гидроксида натрия в метаноле и провести жидкость-жидкостную экстракцию для их извлечения из плазмы. Затем в остаточной плазме провести метилирование неэтерифицованных ЖК с помощью 5% серной кислоты в метаноле при 70°С 30 минут. Выход продуктов составил около 80%. Таким образом было определено 20 ЖК в этерифицированном и неэтерифицированном виде [88,89]. Одним из главных недостатков метилирования является относительно длительное время реакции и высокая температура, что способствует изменению структуры определяемых ЖК. Помимо метилирования, для дериватизации ЖК можно использовать различные реагенты, например, такие, как бис-триметилсилил-трифторацетамид (BSTFA [90], N-метилN-(трет-бутилдиметилсилил)трифторацетамид (MTBSTFA [91]. бис-(Пентафторфенил)диметилсилан, реакция с которым проходит всего 15 минут при комнатной температуре, является одним из наиболее мягких и надежных способов дериватизации [92]. Описан метод дериватизации пентафторбензилбромидом (PFBBr), в котором определяли 33 свободные 28 ЖК в плазме. Продолжительность реакции составляла 20 минут при комнатной температуре, а пределы обнаружения составили 0,05-1 пг/мкл. 1.3.2 Определение жирных кислот методом жидкостной хроматографии В связи с тем, что определение ЖК методом ГХ-МС сопряжено с необходимостью проведения трудоёмкой и времязатратной процедуры дериватизации, жидкостная хроматография является хорошей альтернативой. Благодаря мягким условиям подготовки проб, возможно определение низких эндогенных концентраций полиненасыщенных ЖК, эйкозаноидов (эйкозаноиды – это класс более 100 липидных медиаторов, производимых из С20 полиненасыщенных кислот, таких как арахидоновая, эйкозапентаеновая) [93], различных метаболитов [94] и продуктов окисления [95]. Мягкие условия подготовки проб позволяют снизить неконтролируемые изменения в структурах аналитов. В работе [93], для определения 6 полиненасыщеннвх кислот, 14 эйкозаноидов и 3 окисленных метаболитов применяли осаждение белков и онлайн-ТФЭ в сочетании с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, разделение компонентов пробы проводили на неполярной хроматографической колонке С18, для уверенной идентификации соединений были подобраны специфические МRМ-переходы. Предложенный метод отличается быстрой пробоподготовкой с возможностью автоматизации. Пределы обнаружения составили 200-1000 нг/мл для полиненасыщенных ЖК и 10-1000 пг/мл для метаболитов. Для ЖХ описаны, в том числе, методы подготовки проб, включающие стадию дериватизации. Например, было предложено проводить определение ЖК в тканях атеросклеротических бляшек после их удаления с внутренней стенки артерии. Для этого, сначала проводили экстракцию ЖК из матрицы с помощью раствора хлороформа в метаноле, затем полученную смесь гидролизовали с помощью 40% гидроксида калия, далее проводили дериватизацию свободных ЖК диметиламиноэтанолом с добавлением метилиодида. Полученные триметиламиноэтиловые эфиры ЖК определяли методом ВЭЖХ/МС-МС, пределы обнаружения составили 4-40 нг/мл [96]. 1.3.3. Определение жирных кислот методом капиллярного электрофореза Как было отмечено выше, определение транс-ЖК кислот методом ГХ сопряжено с рядом проблем, связанных с необходимостью введения стадии дериватизации среднелетучих и нелетучих аналитов [97]. Необычной альтернативой методам определения транс-ЖК является капиллярный электрофорез. КЭ - это инструментальная техника с высоким разрешением, которая позволяет разделять сложные комплексы биологических и химических смесей, что делает этот метод привлекательным для определения различных липидов [98]. 29 КЭ для определения транс-ЖК начали применять с 2003 г., основным объектом исследования стали пищевые продукты [99]. В работе [97] КЭ использовали для определения транс-ЖК в продуктах питания. Для этого липидную фракцию обрабатывали раствором NaOH/MeOH, а затем пробы были проанализированы на капиллярном электрофорезе Agilent Technologies с ультрафиолетовым детектором (длина волны 200 нм). Анализ ЖК проводили в буфере, рН которого выше рК кислот (выше 5), соответственно анализ проводился анионной формы ЖК. Таким образом были проведены анализы ненасыщенных ЖК C19:1, C18:1t, C18:1c, C18:2, C18:3. Сравнение результатов процедуры по определению транс-ЖК на КЭ и ГХ не показало значительной разницы, однако использование КЭ позволяет значительно сократить время анализа и пробоподготовки. Недостатком метода является низкая чувствительность по сравнению с ГХ, например, в шоколадной продукции методом КЭ обнаружить транс-жиры не удалось из-за низкого предела обнаружения. В работе [100] КЭ использовали для определения транс-ЖК в сырной продукции. Известны работы по применению КЭ для определения фосфолипидов в крови [101], показано, что метод КЭ составляет хорошую альтернативу тонкослойной хроматографии. В работе [102] показан пример сопряжения КЭ и масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением. Пределы обнаружения составляли 20 мкг/мл для лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот. 1.3.4. Методы экстракции жирных кислот из биологических образцов Чаще всего, содержание эндогенных кислот определяют в плазме крови, реже в моче [88]. Иногда проводится более избирательный анализ, например, на содержание ЖК в мембранах эритроцитов [103] или в тканях атеросклеротических бляшек [78]. Основным методом экстракции, применяемым как до, так и после дериватизации, является жидкость-жидкостная, с использованием, например, н-гексана [104,105], дихлорметана, этилацетата в качестве экстрагентов [106]. Наряду с жидкость-жидкостной применяют твёрдофазную экстракцию (ТФЭ) с использованием патронов С18 [93] и Strata-X (Phenomenex, Macclesfield, UK) [107]. Преимуществом ТФЭ является возможность автоматизации пробоподготовки, что приводит к ускорению процесса и минимизирует ошибки. Экстрактивное алкилирование Особое внимание к экстрактивному алкилированию с точки зрения применения в анализе связано с тем, что в этом процессе объединяются стадии экстракции и получения летучих производных анализируемых веществ. Реакции протекают в мягких условиях, причём использование межфазных агентов позволяет уменьшить продолжительность реакций и увеличить выходы продуктов. В качестве катализатора межфазного переноса использу30 ются четвертичные аммониевые и фосфониевые или другие ониевые соли, например, тетрабутиламмонийбромид, бензилтриэтиламмонийхлорид, трибутилгексадецилфосфо- нийбромид [108]. Особенно важно при определении ЖК предотвратить реакции гидролиза липидов. Для оценки возможного вклада реакций гидролиза и переэтерификации, в работе [1] авторы провели ряд экспериментов с внесением в сыворотку крови растворов L-α- дипальмитоиллецитина и триолеина в хлороформе. После процедуры экстрактивного алкилирования метилиодидом с катализатором межфазного переноса гидроксидом тетрабутиламмония установили, что процессы гидролиза и переэтерификации липидов в условиях экстрактивного алкилирования протекают в незначительной степени и не вносят заметного вклада в результаты определения СЖК. Твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ) В работе [109] показана возможность извлечения коротко- и среднецепочечных ЖК (С2-С10) из плазмы методом твёрдофазной микроэкстракции (ТФМЭ). Для этого авторы использовали волокно покрытое дивинилбензол/карбоксен/полидиметилсилоксаном. Достигнутый предел обнаружения на стандартных образцах ЖК составил 200 мкг/мл, применение высаливания с использованием комбинации солей (NH4)2SO4/NaH2PO4 позволила увеличить чувствительность метода. Такая комбинация оказалась намного эффективней, чем внесение смеси NaCl/Na2SO4. В качестве матрицы для исследования были взяты образцы сыра и вин, но метод пригоден и для сложных биологических матриц, таких как плазма крови. В работе [110] посвященной исследованию СЖК в сыре были достигнуты пределы обнаружения в 7 мкг/кг. В работе [111] описана разработка метода, который может быть применен для оценки пребиотиков, представляющих различные источники неперевариваемых углеводов в ферментных моделях. В этой работе авторы применяли ТФМЭ для определения СЖК в кишечных ферментах. Для этого была создана модельная смесь ферментов и бактерий, находящихся в толстой кишке. Применяли различные волокна для ТФМЭ среди которых дивинилбензол/карбоксен/полидиметилсилоксан показал хорошую экстракцию для летучих короткоцепочечных ЖК (масляной, изовалериановой, валериановой к-ты). Карбоксен/полидиметилсилоксан показал лучшую экстракцию для муравьиной и пропионовой кислоты. Преимущество метода состоит в отсутствии процедуры дериватизации и уменьшении влияния сложной матрицы на ГХ определение. 1.3.5. Предварительное хранение и транспортировка биологических проб К условиям хранения можно отнести следующие параметры: продолжительность хранения, температура и количество циклов замораживания и размораживания (далее 31 циклы з/р) [4]. В простейшем случае, до того как образец попадет в химико-аналитическую лабораторию, он будет заморожен до -20 °С (реже до -70 °С) в течение 24 часов, и, соответственно, пройдет один цикл з/р. Большой объем отобранных образцов приводит к большей продолжительности хранения, а создание лабораторного “банка” образцов и применение различных методов анализа увеличит количество циклов з/р. Исследования влияния таких циклов на концентрации эндогенных соединений в образце, стали особенно актуальными в связи с формированием крупных “банков” биологических образцов [112], которых в настоящее время существует значительное количество [113,114]. Подробно влияние условий хранения биообразцов на достоверность результатов метаболического профилирования методами ГХ-МС рассмотрено в различных работах [115,116]. Авторами [117] показано, что при соблюдении строгих требований к условиям хранения и транспортировки биологических образцов, вариации результатов анализа, обусловленные хранением, значительно ниже, чем индивидуальные вариации метаболических профилей. Оценка влияния условий хранения на результаты определения ЖК в биологических образцах произведена в нескольких работах на примере различных биологических образцов. Например, отмечено [118] увеличение концентраций СЖК при хранении на 32%, а также уменьшение концентраций триглицеридов, являющихся основным источником ЭЖК, на 19%. В работе [119] выявлено увеличение концентраций ЭЖК и некоторое уменьшение концентраций СЖК в процессе хранения (1 цикл з/р и хранение при комнатной температуре или при -40 °С в течение 6 месяцев). В других работах отмечается отсутствие наблюдаемых изменений [120]. Тем не менее, в этой работе отмечается, что выявленные изменения затрагивают только минорные ЖК, и не затрагивают основные компоненты жирнокислотного состава образцов. Однако концентрации многих минорных ЖК являются важными диагностическими маркерами, например, активности стеарил-КоА-, Δ6- и Δ5-десатураз, а также соотношение ω-6/ω-3 полиненасыщенных ЖК в крови связывают с риском возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, инсулинорезистентностью и пр. В работе [121] исследовали поведение ЖК в плазме и эритроцитах при длительном хранении при сильной заморозке. После отбора крови у доноров, из нее получали плазму и замораживали при -80 °С. Эритроциты трижды отмывали в буфере HEPES и также замораживали при -80 °С. Перед заморозкой проанализировали жирнокислотный состав проб. Результаты исследования показали, что произошли изменения в составе ЖК в триглицеридах плазмы, а именно: уменьшение С14:1 на 0,11 мольн. % и увеличение C22:5ω-3 32 на 0,04 мольн. %. При анализе эритроцитов после хранения наблюдалось несколько статистически значимых изменений по сравнению со свежими образцами, но изменения были очень малы. Значительное увеличение было отмечено у С14:0, С15:0 и С22:5ω-3 кислот по 0,07, 0,04 и 0,06 мольн. %, соответственно. В целом исследования показали стабильность ЖК в плазме и эритроцитах при хранении их при -80 °С. В работе [122] было проведено исследование условий хранения цельной крови. У добровольцев отбирали кровь в вакуумную пробирку с гепарином для предотвращения коагулирования. Затем аликвоту цельной крови объёмом 500 мкл отбирали в пробирку с добавленным бутилированным гидрокситолуолом (БГТ). Образцы хранились при -80 °С и -20 °С. Исследование показало отсутствие влияние условий хранения на общее содержание ЖК. Однако были выявлены статистически значимые закономерности между содержанием НЖК, ПНЖК и МНЖК в образцах, хранившихся в различных условиях. Количество НЖК значительно не отличались в образцах, хранившихся при разных температурах, в то время как концентрации МНЖК уменьшались в пробах, хранившихся при -20°С по сравнению с образцами, хранившимся при -80°С. С другой стороны, концентрация ПНЖК, общая концентрация ω-6 и ω-9 ЖК и их индивидуальные значения были значительно выше в образцах, хранившихся при -20 °С, как в относительных величинах, так и в абсолютных. В работе [123] указано, что добавка БГТ положительно влияет на стабильность ЖК в плазме при продолжительном хранении в условиях -20С, в особенности на суммарную концентрацию эйкозапентаеновой и догозагексаеновой кислот, являющуюсяся важным маркером ишемических болезней сердца [124,125]. Влияние условий хранения на состав ЖК икры тунца и кефали исследован в работе [126]. Жирно-кислотный состав образцов изучали после 0, 15, 30, 90 и 180 дней хранения при температуре +4 °C. В образцах икры кефали содержание общего количества ЖК (НЖК, МНЖК и ПНЖК) с течением времени уменьшается. В то время как в икре тунца наблюдали незначительное снижение в течении 30 дней ПНЖК, а затем резкое их уменьшается после 90 и 180 дней наблюдений. Но при этом содержание НЖК м МНЖК увеличивалось на протяжении всего периода исследования. Например, содержание докозагексаеновой кислоты (C22:6n-3), которая являлась доминантной ПНЖК в икре, в течение исследования уменьшилось вдвое, а эйкозапентаеновой - на треть. Обе ω-3 ЖК образуются путем элонгации и десатурирования альфа-линолевой кислоты [127] в организме. Также авторы обнаружили достоверную корреляцию между изменениями концентраций некоторых классов ЖК (в большей степени ПНЖК) и биогенными аминами (БА) в течение продолжительного хранения. Амино-липидная корреляция имеет место как между общим содержанием БА и ЖК, так и конкретными полиаминами, такими как спермидин, спермин и ПНЖК. 33 Таким образом напрашивается вывод об имеющемся ряде противоречий в результатах оценки влияния условий хранения биологических образцов, что вынуждает провести собственное исследование. Одной из задач работы являлось установление влияния условий хранения на результаты хроматомасс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных ЖК в плазме крови. 1.4. Характеристика объектов исследования: химические соединения, потенциально влияющие на метаболизм липидов в организме. Жирные кислоты являются общепринятым объектом медицинских исследований, являясь важным маркером патологий и тяжести метаболических нарушений. Однако в токсикологии им уделяется незаслуженно мало внимания, в то время как ЖК могут быть полезными как при контроле терапевтического процесса, так и при оценке тяжести отравления, понимании механизмов воздействия и возможных отставленных эффектах. Поэтому исследования влияния на жирнокислотный состав различных токсикантов и фармпрепаратов и сопоставление этого влияния с известными токсическими и фармацевтическими действиями представляются весьма актуальными. 1.4.1 Фосфорорганические соединения Механизм токсического действия фосфорорганических соединений (ФОС) обусловлен, главным образом, фосфорилированием сериновых фрагментов в активных центрах ацетилхолинэкстеразы (AChE, EC 3.1.1.7) и, соответственно, ингибировании этого фермента [128]. AChE катализирует гидролиз нейротрансмиттера ацетилхолина с образованием холина и ацетата в ходе передачи нервного сигнала. Однако помимо AChE, в человеческом организме присутствует более 1000 сериновых гидролаз, и большая их часть не охарактеризована физиологическими функциями. По разным оценкам, около 50 из них могут являться мишенями для ФОС. Профиль ингибирования различными ФОС для каждой гидролазы неодинаков [129]. Среди наиболее изученных можно выделить NTE (neuropathy target esterase, EC 3.1.1.5), деацилирущую фосфатидилхолины в мембранах [130,131], олеамидгидролазу (FAAH, EC 3.5.1.99), моноацилглицероллипазу (MAGL, EC 3.1.1.23) [132], лецитилхолестеролацилтрансферазу (LCAT, EC 2.3.1.43) [133], NTE-R (EC 3.1.1.5), KIAA1363 (EC 3.1.1.13), гормон-чувствительную липазу (HSL, EC 3.1.1.79). Некоторые липазы участвуют и в детоксификации ФОС в организме, так KIAA1363 гидролизует хлорпирифос-оксон и параоксон до диалкилфосфатов [134]. Помимо нейротоксичности, ФОС вызывают различные физиологические отклонения, включая центрально-периферическую дистальную сенсомоторную аксонопатию, из34 вестную как отставленный нейротоксический эффект (ОНЭ) [135] или ФОС-индуцированная отставленная полинейропатия (ОПН) [136], которая может не сопровождаться снижением активности эритроцитарной AChE [137]. ФОС могут вызывать иммунотоксичность [138] и окислительный стресс [139], кроме того, они могут влиять на клеточный метаболизм углеводов и липидов и приводить к инсулино-резистентности и нарушениям гомеостаза глюкозы [140,141]. Экспонирование ФОС приводит повышению уровня глюкозы в сыворотке крови [142], вызывая гипергликемию [143]. В качестве объяснения возможных механизмов нарушения гомеостаза глюкозы предполагают стимуляцию глюкогенеза и гликогенолиза в печени или активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси. Таблица 5 - Известные факты влияния ФОС на метаболизм липидов Доза, (LD50***), способ Орган или ФОС Эффект Ссылка введения, животные образец Диазинон 128 мг/кг, (300-400 Плазма 24 часа: ОХ≈*, ФЛ↓, [144] мг/кг), per os, крысы ЛПВП-Х↓, ЛПНП↑, ТГ↑ Малатион 400 мг/кг (5400-5700 Плазма ЛПВП≈, ОХ↓**, [145] мг/кг), per os, крысы ЛПНП↑, ТГ↑ Хлорпирифос 50 мг/кг (95-270 мг/кг), Плазма подкожно, крысы Фенитротион 50 мг/кг (250-800 мг/кг), Плазма подкожно, мыши 0,04-0,36 мг/кг/день Плазма (180-330 мг/кг), per os, крысы 12 мг/кг (25-80 мг/кг), в Сыворотка ДМСО в глаза, кролики Диметоат Дихлофос Хлорфенвинфос 0,3 мг/кг (9,6-39 мг/кг), внутрижелудочно, крысы, 14 дней подряд Зоман 100 мкг/кг, подкожно, крысы 0,4ЛД50 дважды с интервалом 1 час RVX 0,4ЛД50 дважды с интервалом 1 час Мозг Мозг 8-24 часа: ЛПВП↓, [146] ОХ≈ ЛПНП↑, ТГ↑ ТГ↑ в 1,7 раз [132] Арахидоновая к-та↓, [147] Сфингозины↓, ЛизоФХ↑ ЛПВП↑ Tmax 4 ч, [148] ЛПНП↓ Tmin 4 ч, ЛПОНП≈, ТГ↑, ЭЖК↑ Tmax 24 ч, СЖК↓ - тенденция ТГ↑ на 73%, ФЛ↓ на [149] 22%, СЖК≈, ОХ≈ СЖК↑ [204] Сыворотка ТГ≈ [137] Сыворотка ТГ≈ [137] Примечание: * - не изменялся, ** - быстро восстановился до нормы, *** - per os для крыс. Сокращения: ФЛ – фосфолипиды, ОХ – общий холестерол, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ЛПНП – липопротеины низкой плотности, ТГ – триглицериды, ДГ – диглицериды, ЛПВП-Х – холестерол ЛПВП, ФХ – фосфатидилхолины, СЖК – свободные ЖК. В дополнение к гипергликемиии, некоторые авторы [150,151] указывают на гиперлипидемию, а именно на увеличение концентрации триглицеридов в крови при отравлении 35 ФОС. Разрушение гомеостаза липидов приводит к нейродегенерации [152], раку, ожирению и атеросклерозу. В таблице 5 приведены некоторые примеры известных фактов указывающих на влияние ФОС на метаболизм липидов. Известные данные по влиянию ФОС на метаболизм липидов неоднозначны и трудно поддаются суммированию: во-первых, все ФОС, за исключением зомана и RVX, повышают уровни ТГ в плазме крови; во-вторых, ФОС могут как повышать, так и снижать уровни ЛПВП, причем изменения ЛПНП при этом обратно пропорциональны, в третьих, выявлено снижение уровней ФЛ, причем концентрации лизофосфатидилхолинов при этом повышаются. 1.4.2 Мельдоний В настоящее время мельдоний (3-(2,2,2-триметилгидразин) пропионат) используется при лечении ишемической болезни сердца, хронической сердечной недостаточности, абстинентном алкогольном синдроме, острых нарушениях мозгового кровообращения и др. [153,154,155,156]. Структурная формула мельдония представлена на рисунке 8. Рисунок 8- Структурная формула мельдония Мельдоний является структурным аналогом гамма-бутиробетаина, он ингибирует гамма-бутиробетаингидроксилазу (EC 1.14.11.1), которая участвует в биосинтезе Lкарнитина N-метиллизин из гамма-бутиробетаина => N,N-диметиллизин [157] => по схеме: лизин N,N,N-триметиллизин => => N,N,N- гидрокситриметиллизин => триметиламмониобутаналь => гамма-бутиробетаин => Lкарнитин. В результате блокируется транспорт длинноцепочечных ЖК в митохондрии; в то же время, короткоцепочечные кислоты могут свободно проникать в митохондрии и окисляться там, при этом не происходит накопления недоокисленных ЖК внутри митохондрий [158,159]. Снижение уровня карнитина обусловливает активацию окисления длинноцепочечных ЖК в пероксисомах, защищая митохондрии при ишемии-реперфузии. К фармакологическим и биологическим эффектам мельдония относят: кардиопротекторное действие, улучшение расслабления кардимиоцитов в диастоле за счет активации транспорта Ca2+ в эндоплазматический ретикулум, улучшение функционального состояния эндотелия, расслабление гладкомышечных клеток сосудов, улучшение микроциркуляции, 36 стимуляция карнитин-независимого окисления ЖК, увеличение уровня интерферона, активация гуморального иммунитета, антикетогенный эффект, сохранение баланса прооксидантной и антиоксидантной систем при воздействии повреждающих факторов, уменьшение внутрилегочного шунтирования, стабилизация мембран клеток, предотвращение метаболического ацидоза, активация гликолиза и ферментов цикла Кребса, мягкое разобщение дыхания митохондрий и усиление дыхательного контроля [160,161,162,163]. Мельдоний усиливает действие ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), нитроглицерина, антагонистов кальция, бета-адреноблокаторов и других антигипертензивных средств, потенцирует действие сердечных гликозидов [164]. 1.4.3 Фторацетат Фторацетаты (ФА) - это высокотоксичные вещества, действие которых проявляется не сразу, но спустя латентный период, составляющий для человека от получаса до нескольких часов, даже при отравлении летальными дозами [165,166]. Механизм токсического действия ФА широко известен под названием “летальный синтез”, суть которого заключается в превращении в клетках организма нетоксичного самого по себе ФА в токсичный фторцитрат (ФЦ) [167]. Метаболизм ряда соединений протекает с образованием в качестве промежуточного продукта ФА. Это противоопухолевые препараты (5-фторурацил и изомеры фторэтилнитрозомочевины), N-(2-фторэтил)-производные наркотических анальгетиков нормеперидина и норметазоцина, пестициды (1,3-дифтор–2-пропанол и фторацетамид), 1(ди)гало-2-фторэтаны и фторэтанол [168,169,170,171]. ФА оказался довольно сильным радиопротектором в силу своей способности снижать потребление кислорода и температуру тела [172]. Кроме того, ФА может предупреждать развитие толерантности организма к морфину [173], недавно получены данные о противоопухолевом эффекте ФА [174]. Особенности патогенеза при введении ФА окончательно не изучены. При отсутствии клинической и морфологической специфики для диагностических целей могут быть использованы биохимические показатели, характеризующие принцип действия ФА, прежде всего это уровень цитрата и фтора [175]. Кроме того, физиолого-биохимические эффекты, вызываемые ФА, включают в себя отклонения в регуляции углеводного обмена и снижение концентрации СЖК [176, 177], однако данные, полученные разными исследователями, неполны и противоречивы 1.4.5 Алифатические углеводороды с длиной цепи от 6 до 10 атомов углерода Среди алифатических углеводородов наиболее токсичным и потому хорошо изученным является н-гексан, который применяется в качестве растворителя в нефтехимической, химической, металлургической, резиновой, текстильной, кожевенной и мебельной промышленности. н-Гексан характеризуется высокой летучестью, высокой растворимостью в 37 жирах и способностью к аккумуляции в организме человека [178]. Длительный контакт рабочих с н-гексаном часто приводит к возникновению профессиональной патологии. Хроническое воздействие гексана может стать причиной нейропатий, заболеваний преимущественно периферических сенсорных и моторных нервов [179]. Основные проявления нейропатий – расстройство цветного зрения, нарушение регуляции деятельности сердца, слабость и онемение конечностей, нарушения тактильной чувствительности [180]. Таблица 6 - Известные результаты влияния н-гексана на организм Целевой Описание орган Увеличение массы органа, ослабление способности к метаболизму ксенобиотиков. АСТ↑, АЛТ↑, щелочная фосфатаза↑, альбумин (в крови)↑, соПечень держание белка в печени↓, общий и прямой билирубин↑, СОД↑, КAT↑, глутатионпероксидаза↑, глутатион-S-трансфераза↑, GSH↓, H2O2↑, МДА↑, RSH↓, глюкозо-6-фосфатаза↓ Гликоген печени ≈ Увеличение массы органа. Морфология: от прогрессирующей дегенерации проксимальных канальцев с умеренным кровоизлиянием в интерстиций Почки вплоть до некроза почечных канальцев. Мочевина↑, креатинин↑, общий уровень электролитов в плазме↑, глутатионпероксидаза↑, глутатион-S-трансфераза↑, GSH↓. H2O2↑, МДА↑ Снижение активности AХЭ и нейронспецифической енолазы (ЕС 4.2.1.11). Повышенное фосфорилирование глиального фибриллярного кислого белка в гиппокампе крыс. Нервная Энцефалопатия, возможно в результате нарушения интрацесистема ребральной проводимости. Набухание дистальных фрагментов аксонов при повышенном уровне нейрофиламентов диаметром 10 нм, валлеровская дегенерация удлиненных аксонов. Тестикулы Атрофия. Уменьшение массы в 3 раза. Поражение респираторного тракта. Изменения в составе легочного сурфактанта у крыс, значительное увеличение конЛегкие центрации фосфолипидов в бронхо-альвеолярном лаваже. Жировая дистрофия пневмоцитов, изменения пластинчатых тел пневмоцитов типа II. Липидный ЛПНП↑, ТГ↑, ОХ↑, ЛПВП↓ профиль Ссылка [181,182,183] [181] [184, 185, 186, 187, 188, 189, 190] [191] [192,193] [181] Примечание: ↑ - увеличение концентрации; ↓ - уменьшение концентрации; ≈ - концентрация не изменилась; АЛТ – аланинтрансаминаза; АСТ – аспартаттрансаминаза; АХЭ – ацетилхолинэстераза; СОД – супероксиддисмутаза; КАТ – каталаза; МДА – малоновый диальдегид; GSH – глутатион восстановленный; RSH – сульфгидрильные группы; ЛПНП – липопротеины низкой плотности; ТГ – триглицериды; ОХ - общий холестерол; ЛПВП - липопротеины высокой плотности. Известные факты влияния УВ (в основном гексана) на организм суммированы в таблице 6. Несмотря на имеющиеся сведения о влиянии УВ на морфофункциональные и клинико-биохимические показатели, механизмы возникновения патологий нуждаются в уточнении. 38 Хотя возникновение нейропатии обычно связывают с накоплением нейрофиламентов [194], точный механизм этого процесса неизвестен. Выдвигается несколько гипотез [195] для объяснения воздействия алифатических углеводородов. Отсутствие сведений о ведущем механизме патогенеза при воздействии УВ определяет актуальность исследования воздействия нейротоксичных углеводородов на липидные профили внутренних органов и тканей, что, возможно, позволит выявить новые аспекты патогенеза нейропатии. Определение воздействия токсичных соединений на липидные профили внутренних органов требует распространения метода определения СЖК и ЭЖК не только на плазму крови, но и на гомогенаты тканей. В результате выполнения этой задачи должна быть создана аналитическая методика, позволяющая проводить профилирование жирнокислотного состава различных биологических объектов (как образцов биологических жидкостей, так и внутренних органов). Результаты работы позволят получить новые сведения о влиянии токсичных химических соединений на метаболизм липидов и выйти на новый уровень оценки рисков, связанных с воздействием различных токсичных химических соединений. Разработанный метод позволит усовершенствовать методологическую основу доклинических и клинических исследований в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, а также гигиенического регламентирования вредных химических веществ. Метод может быть использован в центрах профпатологии, медико-биологических НИИ, центрах Роспотребнадзора и токсикологических лабораториях. 2 Экспериментальная часть 2.1 Методика определения свободных жирных кислот Для определения ЖК применяли газовый хроматограф Agilent 7890A, оснащенный автодозатором Agilent G4513A, с масс-селективным детектором Agilent 5975С GC/MS, капиллярная колонка HP-5MS 30 м 0,25 мм 0,25 мкм [2]. Определение компонентов осуществляли при следующем температурном градиенте: выдержка 3 мин при 50°С, затем подъем до 140°С со скоростью 20 °С/мин, затем до 280 °С со скоростью 5 °С/мин и выдержка при конечной температуре 8 минут. Ионизация электронным ударом 70Эв. Детектирование в режиме мониторинга избранных ионов (SIM – режим). Реактивы и стандарты Cмеси метиловых эфиров ЖК (Mix C4-C24), стандарты индивидульных ЖК, в том числе, внутренний стандарт – дейтерированная пальмитиновая кислота d31 фирмы SUPELCO. Дихлорметан, JT Baker. Метилиодид Sigma Aldrich. Натрия фосфат 2-замещён39 ный 2-водный, ACROS. Натрия фосфат 1-замещённый, , Sigma Aldrich. Гидроксид тетрабутиламмония Sigma Aldrich гидроксид тетрабутиламмония использовали в виде 0,2 М водного раствора. Подготовка проб плазмы к анализу Образец плазмы крови объемом 0,5 мл отбирали в стеклянную пробирку для центрифугирования емк. 15 мл и прибавляли 10 мкл внутреннего стандарта (раствор пальмитиновой кислоты d31 с концентрацией 5 мг/мл) [2]. К полученному раствору прибавляли 2 мл фосфатного буферного раствора с pH 8, 140 мкл 0,2 М раствора гидроксида тетрабутиламония, 200 мкл иодистого метила и 2 мл дихлорметана. Полученную смесь тщательно перемешивали 15 мин. Затем смесь центрифугировали 3 мин при 4000 g, отделяли и отбрасывали водный верхний слой, а в нижний органический слой добавляли осушитель − безводный сульфат натрия. Тщательно перемешивали, центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость в пробирки емк. 2 мл. Полученный раствор выпаривали под током азота до конечного объема около 50 мкл. Затем пробу разбавляли 50 мкл гексана и перемешивали в вортексе в течение 10 мин, после чего раствор переносили в виалу емк. 100 мкл и анализировали 1 мкл методом ГХ-МС. Подготовка проб мочи к анализу Образец мочи объемом 0,5 мл отбирали в стеклянную пробирку для центрифугирования емк. 15 мл и прибавляли 1 мл метанола и 2 мл фосфатного буферного раствора с pH 8, после тщательного перемещивания в полученный раствор вносили 10 мкл внутреннего стандарта (раствор пальмитиновой кислоты d31 с концентрацией 5 мг/мл), 140 мкл 0,2 М раствора гидроксида тетрабутиламония, 200 мкл иодистого метила и 2 мл дихлорметана [2]. Полученную смесь тщательно перемешивали 15 мин. Затем смесь центрифугировали 3 мин при 4000 g, отделяли и отбрасывали водный верхний слой, а в нижний органический слой добавляли осушитель − безводный сульфат натрия. Тщательно перемешивали, центрифугировали и отбирали надосадочную жидкость в пробирки емк. 2 мл. Полученный раствор выпаривали под током азота до конечного объема около 50 мкл. Затем пробу разбавляли 50 мкл гексана и перемешивали в вортексе в течение 10 мин, после чего раствор переносили в виалу емк. 100 мкл и анализировали 1 мкл методом ГХ-МС. Масс-спектрометрическое детектирование В качестве режима ионизации использовали ионизацию электронами при 70 эВ. Детектирование осуществляли в режиме мониторинга избранных ионов. Такой режим значительно повышает как чувствительность за счет увеличения специфичности, так и селективность путем уменьшения фоновых сигналов от матрицы. Идентификация целевых компо40 нентов осуществлялась из предустановленной библиотеки NIST. Для подтверждения каждого компонента требуется два или три характеристичных иона. Для насыщенных ЖК характерной и самой интенсивной была масса 74, для ненасыщенных - 55,79,67. Эти значения были использованы в дальнейшем для количественной обработки. В качестве второго характеристичного иона выбирали молекулярный ион метилового эфира ЖК, если он был обнаружен. Для компонентов, для которых не удалось добиться полного хроматографического разделения, при одинаковых характеристичных ионах с целью идентификации и количественной обработки выбирали молекулярные ионы метиловых эфиров ЖК. Условия регистрации избранных ионов представлены в таблице 7. Таблица 7 - Условия регистрации избранных ионов № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Определяемый компонент Время уд-ия, мин Метиловый эфир гексановой кислоты 5,878 Метиловый эфир гептановой кислоты 6,930 Метиловый эфир октановой кислоты 7,863 Метиловый эфир нонановой кислоты 8,820 Метиловый эфир декановой кислоты 9,915 Метиловый эфир ундекановой кислоты 11,207 Метиловый эфир додекановой кислоты 12,724 Метиловый эфир тридекановой 14,399 кислоты Метиловый эфир миристиновой 16,205 кислоты Метиловый эфир пентадекановой 18,046 кислоты Метиловый эфир пальмитолеиновой 19,565 кислоты Метиловый эфир пальмитиновой 19,927 кислоты Метиловый эфир гептадекановой 21,734 кислоты Метиловый эфир линолевой кислоты 22,972 Метиловый эфир олеиновой кислоты 23,093 Метиловый эфир линоленовой кислоты 23,105 Метиловый эфир элаидиновой кислоты 23,196 Метиловый эфир цис-6-октадеценовой 23,196 кислоты Метиловый эфир стеариновой кислоты 23,534 Метиловый эфир нонадекановой 25,280 кислоты Метиловый эфир арахидоновой 25,815 кислоты Метиловый эфир арахиновой кислоты 26,937 Метиловый эфир генэйкозановой 28,544 кислоты 41 m/z1 m/z2 dwell time 74 74 74 74 74 74 74 74 99 87 127 87 143 143 214 228 10 10 10 10 10 10 10 10 74 242 10 74 256 10 55 236 10 74 270 10 74 284 10 294 296 292 296 296 10 10 10 10 10 74 74 298 87 10 10 79 150 10 74 74 326 340 10 10 № п/п 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Определяемый компонент Время уд-ия, мин Метиловый эфир эруковой кислоты 29,722 Метиловый эфир бегеновой кислоты 30,110 Метиловый эфир трикозановой 31,606 кислоты Метиловый эфир нервоновой кислоты 32,724 Метиловый эфир тетракозановой 33,063 кислоты Метиловый эфир цис-5,8,11,14,17-эйко- 25,940 запентаеновой кислоты Метиловый эфир цис-8,11,14-эйкоза- 26,125 триеновой кислоты Метиловый эфир цис-11,14-эйкозадие- 26,436 новой кислоты Метиловый эфир гондоиновой (цис-11- 26,525 эйкозеновой) кислоты) Метиловый эфир миристолеиновой 15,990 кислоты Метиловый эфир цис-10-пентадекано- 17,831 вой кислоты Метиловый эфир цис-10-гептадекано- 21,372 вой кислоты Метиловый эфир гамма-линоленовой 22,696 кислоты Метиловый эфир линолаэдиновой 23,103 кислоты Метиловый эфир 26,570 цис-11,14,17-эйкозатриеновой кислоты Метиловый эфир 29,670 цис-13,16-докозадиеновой кислоты m/z1 m/z2 dwell time 320 74 74 354 368 10 10 10 55 74 348 382 10 10 79 201 10 79 320 10 67 322 10 79 320 10 55 208 10 55 222 10 55 282 10 79 292 10 294 10 320 79 10 67 350 10 При большом количестве перекрывающихся пиков в одной масс-хроматограмме, время сканирования по каждому значению m/z было подобрано так, чтобы чувствительность и точность не были потеряны из-за слишком короткого времени сканирования, искажения формы пика или недостаточного числа точек сбора данных на хроматографический пик, для устранения этих проблем время регистрации разделяли на несколько окон (сегментов), в каждом из которых масс-спектрометр регистрировал только определенные значения m/z [2]. Если анализируемые вещества элюировались на стыке двух сегментов, осуществляли настройку сегмента так, чтобы можно было зарегистрировать компонент, даже если он сдвинется из одного сегмента в другой. Построение градуировочных зависимостей Градуировочные зависимости строили по стандартным растворам ЖК после экстрактивного алкилирования из метанола. Были проанализированы градуировочные растворы с концентрацией каждой кислоты 0,02; 0,2; 2; 4; 8; 20; 50 мкг/мл [2]. 42 Определение воспроизводимости методики Воспроизводимость количественного определения СЖК оценивали следующим образом: в объединенный образец плазмы крови от нескольких добровольцев вносили добавку стандартной смеси ЖК. Затем образец разделяли на 15 аликвот, в которых определяли СЖК [2]. Апробацию методики проводили с использованием образцов плазмы крови и мочи добровольцев, а также лабораторных животных (самцы крыс). Группа добровольцев насчитывала 20 практически здоровых мужчин 20‒25 лет. Отбор крови проводили с утра натощак из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Отбор мочи проводили в тот же день утром натощак. В моче предварительно измеряли содержание креатинина. В табл. 4 приведены результаты определения концентраций СЖК в плазме крови и моче добровольцев, а также плазме крови крыс [2]. Самцы крысы (20 особей) получены из питомника Рапполово. Условия содержания экспериментальных животных соответствовали «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденных МЗ СССР 06.07.1973 г. и Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.1977г. Кровь после декапитации отбирали в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта 2.2 Методика совместного определения свободных и этерифицированных жирных кислот Для определения метиловых эфиров ЖК использовали газовый хроматограф Agilent 7890A, с масс-селективным детектором Agilent 5975С [3]. Газовый хроматограф оборудован капиллярной колонкой HP-5MS 30м х 0,25мм, 0,25 мкм. Условия газохроматографического разделения и масс-селективного детектирования приведены в таблице 8. 43 Таблица 8 - Условия газохроматографического разделения и масс-селективного детектирования метиловых эфиров ЖК [3] Условия анализа Характеристики Газ-носитель Гелий газообразный высокой чистоты марки 6.0, объемная доля гелия не менее 99.9999% об. Режим ввода пробы Объем пробы 1 мкл, без деления потока (1 мин), под давлением 69 кПа Температурный режим 3 минуты при температуре 50 °С, затем подъем до 140 °С со термостата колонки скоростью 20 °С/мин, затем подъем до 280 °С со скоростью 5°С/мин, затем 8 минут при конечной температуре. Температура инжектора 250 °С Объемная скорость газа-но1 мл/мин сителя через колонку Режим работы масс- Ионизация электронами с энергией 70 эВ. Температура источспектрометра ника ионов: 280 °С. Температура квадруполя: 150 °С. Температура интерфейса: 280 °С. Масс-селективное детектирование в режиме мониторинга избранных ионов. Реактивы и стандарты Смесь метиловых эфиров ЖК (F.A.M.E. Mix C4-C24, Supelco, кат № 18919), набор стандартов насыщенных ЖК с нечетным числом атомов углерода (Supelco, кат № OC91KT), с четным числом атомов углерода (Supelco, кат № EC10A-1KT) и ненасыщенных ЖК (Supelco, кат № UN10-1KT) [3]. Внутренний стандарт – дейтерированная пальмитиновая кислота d31 (Supelco, кат № 366897).и дейтерированный эфир пальмитиновой кислоты (Supelco, кат № 366897). CH2Cl2, JTBaker, CH3I, Sigma-Aldrich, водный раствор гидроксида тетрабутиламмония (ТБАГ), Sigma-Aldrich. Гидроксид натрия, Sigma-Aldrich. Гексан, Fluka Analytical. Подготовка образцов для анализа Последовательность определения СЖК и ЭЖК в образце приведена на рисунке 10. Образец плазмы крови объемом 0,1 мл отбирали в стеклянную пробирку для центрифугирования вместимостью 15 мл, прибавляли по 10 мкл внутренних стандартов (раствор пальмитиновой кислоты-d31 с концентрацией 10 мкг/мл и раствор метилового эфира пальмитиновой кислоты-d31 с концентрацией 10 мкг/мл) [3]. К полученному раствору прибавляли 1 мл 0,4 М раствора NaOH в метаноле, тщательно перемешивали в вортексе в течение 10 мин, затем добавляли 2 мл гексана, полученную смесь опять перемешивали 10 мин. После центрифугирования пробы верхний слой, содержащий ЭЖК, переносили в пробирки Эппендорф, выпаривали под током азота, перерастворяли в 100 мкл CH2Cl2 и анализировали методом ГХ-МС. В оставшийся нижний слой, содержащий СЖК, добавляли 3 мл фосфатного буфера с рН 8, выдерживали в ультразвуковой ванне в течение 5 минут, затем добавляли 200 мкл ТБАГ, 100 мкл CH3I и 3 мл CH2Cl2. Полученную смесь тщательно перемешивали в течение 10 минут, затем центрифугировали и отделяли верхний водный слой. Оставшийся 44 органический слой выпаривали под током азота, перерастворяли в 100 мкл CH2Cl2 и определяли СЖК методом ГХ-МС. Идентификационные и метрологические характеристики методики для метиловых эфиров ЖК приведены в таблице 9. Таблица 9 - Масс-спектрометрические характеристики и времена удерживания метиловых эфиров ЖК [3] Относительная Метиловый эфир Время удошибка, % m/z жирной кислоты ия, мин ЭЖК СЖК Ундециловая, C11:0 11,17 74, 143 14 17 Лауриновая, C12:0 12,68 74, 214 16 13 Тридекановая, C13:0 14,35 74, 228 15 8 Миристиновая, C14:0 16,14 74, 242 4 3 Миристолеиновая, C14:1 16,96 55, 208 4 7 цис-10-Пентадеценовая, C15:1 17,77 55, 222 16 Пентадекановая, C15:0 17,99 74, 256 2 7 Пальмитолеиновая, C16:1n-7 19,47 55, 236 3 11 Пальмитиновая, C16:0 19,88 74, 270 3 11 цис-10-Гептадеценовая, C17:1 21,32 55, 250 12 Маргариновая, C17:0 21,68 74,284 2 16 γ-Линоленовая, C18:3n6 22,63 79, 292 5 8 Линолевая, C18:2n6c 22,92 294 5 16 Олеиновая, C18:1n9c 23,03 296 6 12 Линоленовая, C18:3n3 23,03 292 10 5 Линоэлаидиновая, C18:2t 23,05 294 Элаидиновая, C18:1n9t 23,13 296 8 12 Стеариновая, C18:0 23,47 74, 298 3 11 Арахидоновая, C20:4n6 25,75 79, 150 6 11 цис-5,8,11,14,17-Эйкозапентаеновая, C20:5 25,87 79, 201 8 14 цис-8,11,14-Эйкозатриеновая, C20:3n8 26,05 79,320 5 13 цис-11,14-Эйкозадиеновая, C20:2 26,36 322 11 10 цис-11-Эйкозеновая, C20:1 26,46 292 9 8 цис-11,14,17-Эйкозатриеновая, C20:3n11 26,50 320 17* 12 Арахиновая, C20:0 26,88 74, 326 9 12 Генэйкозановая, C21:0 28,49 74, 340 15 4 цис-13,16-Докозеновая, C22:2 29,61 350 Эруковая, C22:1n9 29,67 320 25* 15 цис-4,7,10,13,16,19-Докозагексаеновая, C22:6n3 29,90 79, 91 13 5 Бегеновая, C22:0 30,06 74, 354 12 12 Трикозановая, C23:0 31,55 74, 368 24* 7 Нервоновая, C24:1n9 32,66 55, 348 4 Лигноцериновая, C24:0 33,01 74, 382 18* 6 Внутренний стандарт: пальмитиновая кислота-d31 19,47 301 Примечание: * - высокая погрешность обусловлена низкими концентрациями в исследуемых пробах, на уровне или ниже предела определения. 45 Определение состава СЖК и ЭЖК в плазме крови человека проводили по разработаной методике. В исследование участвовало 12 здоровых мужчин в возрасте 20-25 лет. Отбор крови у добровольцев проводили натощак, из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. 2.3 Определение оптимальных условий хранения и транспортировки биологических образцов Определение СЖК и ЭЖК проводили c использованием разработанного двухстадийной методики. Отбор крови у добровольцев проводили из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Для получения плазмы кровь центрифугировали 15 мин при 4000 g. Образцы плазмы были пулированы и затем аликвотированы. Перечень условий хранений различных аликвот приведен в таблице 10 [4]. Хранение аликвот объемом 500 мкл производили в пробирках типа Eppendorf на 2 мл. Для предотвращения возможных реакций окисления в образцах, в серию аликвот перед хранением был добавлен ди-трет-бутилгидрокситолуол в концентрации 100 мкг на образец. Для определения влияния основного белка плазмы крови на определение ЖК был проведен модельный эксперимент: приготовлен раствор HSA – человеческого сывороточного альбумина, свободного от ЖК (Sigma-Aldrich) концентрацией 40 мг/л, соответствующий естественной биогенной концентрации HSA в плазме крови человека. Затем внесены олеиновая и пальмитиновая кислоты в концентрации 20 мкг/мл. Образец разделили на три аликвоты, первую проанализировали незамедлительно, вторую хранили при -20 °С в течение 14 дней, третью – 28 дней. Условия хранения систематизированы в таблице 10. 46 Таблица 10 - Различные условия хранения аликвот плазмы крови [4] Описание условий хранения Замораживание пробы до -20 °С, хранение 24 часа и размораживание до +20 1 цикл °С в течение двух часов при комнатной температуре. Затем следующий 2 цикл цикл. 3 цикл 1 день Хранение пробы при +4 °С 2 дня 3 дня Замораживание пробы до -20 °С, хранение 14 или 28 дней и разморажива- 14 дней ние до +20 °С в течение двух часов при комнатной температуре 28 дней Замораживание пробы до -70 °С, хранение 14 или 28 дней и разморажива- 14 дней ние до +20 °С в течение четырех часов при комнатной температуре 28 дней 1 цикл Добавление в пробу ди-трет-бутилфенола и замораживание пробы до -20 °С, хранение 24 часа и размораживание до +20 °С в течение двух часов при 2 цикл комнатной температуре. Затем следующий цикл 3 цикл Разбавление пробы метанолом (1 к 2), охлаждение -20 °С, хранение 14 или 14 дней 28 дней и нагрев до +20 °С в течение двух часов при комнатной температуре 28 дней Все образцы были заморожены и разморожены однократно, за исключением исходного. 2.4 Исследование влияния фосфорорганических соединений на профили жирных кислот плазмы крови крыс Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180-230 г. Условия содержания экспериментальных животных соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 N 267). Для получения плазмы кровь, отобранную после декапитации крыс в пробирки с ЭДТА-К3, центрифугировали 15 мин при 4000 g. В первом эксперименте использовали 5 групп животных [128]. Трем группам вводили ФОВ, одна группа получала только антидот, контрольная группа получала равный объем физиологического раствора. GD, GB и RVX вводили подкожно (п/к) в дозах 90, 45 и 6 мкг/кг, соответственно (½DL50). Карбоксим (10 мг/кг) в смеси с атропином (30 мг/кг) [18] вводили внутримышечно сразу после отравления. Измерение показателей проводили через 3 и 24 часа. На каждую временную точку было взято 3 животных. Исследовали качественный и количественный состав СЖК плазмы крови крыс. Во втором эксперименте использовали 3 группы животных. Первой группе двукратно вводили п/к RVX в дозах 4,8 мкг/кг (2×0,4LD50) с интервалом 1 час, т.о. введенная 47 доза составила 9,6 мкг/кг. Второй группе после введения RVX, вводили карбоксим следующим образом: непосредственно перед употреблением содержимое одной ампулы разводили в физиологическом растворе (смешивали с 14 мл физ. раствора и стерилизовали фильтрацией) и вводили внутримышечно (в/м) из расчета 100 мкл/100 г веса тела сразу после введения RVX. Контрольная группа получала равный объем физиологического раствора. Измерение показателей проводили через 3, 24, 72 часа и 1 неделю. На каждую временную точку было взято 6 животных. Измеряли качественный и количественный состав СЖК и ЭЖК плазмы крови крыс. Определение СЖК и ЭЖК проводили с использованием двухстадийной методики. 2.5 Исследование влияния мельдония на профили жирных кислот плазмы крови практически здоровых добровольцев Исследование проводили с участием 12 практически здоровых мужчин 20-25 лет. Эксперимент разделили на два этапа: в ходе первого этапа у добровольцев в течение одного дня отбирали образцы плазмы крови, в ходе второго этапа добровольцы получали 2500 мг мельдония утром и у них также отбирали образцы плазмы крови по аналогичной схеме. Режимы питания добровольцев на двух этапах исследования одинаковые. Отбор крови у добровольцев проводили из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. В первый день фонового тестирования у добровольцев отбирали образцы крови и мочи в течение всего дня: фон, 15 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов. Для уменьшения влияния питания на фоновые значения клинико-биохимических показателей добровольцы получали обед не ранее чем через два часа после отбора крови (после точки отбора “2 часа”). Расписание отбора проб плазмы крови после приема мельдония в точности повторяет фоновое тестирование. 2.5 Исследование влияния фторацетата на профили жирных кислот плазмы крови крыс В настоящей мы исследовали изменение содержания триглицеридов и СЖК после острой интоксикации натриевой солью фторацетата у крыс; пероральная доза составила 2 мг/кг (1/2LD50) [167]. Для экспериментальных исследований использовали белых крыс породы Wistar. Действие ФА оценивали при пероральном введении. Стандартные методы лабораторной диагностики включали в себя определение лактата, пирувата, цитрата, гликогена, глюкозы, триглицеридов, СЖК. 48 2.6 Исследование влияния алифатических углеводородов на профили жирных кислот плазмы крови и тканей печени и головного мозга крыс. Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180-230 г. Условия содержания экспериментальных животных соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 N 267). Для получения плазмы кровь отбирали в пробирки с ЭДТА-К3 после декапитации крыс и центрифугировали 15 мин при 4000 g. Для оценки токсических свойств смеси нормальных алифатических углеводородов С6-С10, а именно гексана, гептана, октана, нонана и декана (далее – УВ) был проведен хронический 90-суточный эксперимент. Смеси предельных углеводородов подавали в камеры непрерывно в течении 90 суток с помощью специально сконструированного дозатора, позволяющего точно регулировать и постоянно поддерживать заданную концентрацию смеси в камере в течение эксперимента. Таблица 11 - Концентрации компонентов смеси предельных углеводородов С6-С10 Суммарное содержание смеси Углеводород УВ, мг/м3 гексан C6H14 гептан C7H16 Группа 1 (высокая 160 ± 20,5 октан C8H18 доза) нонан C9H20 декан C10H22 гексан C6H14 гептан C7H16 Группа 2 (средняя 31,4 ± 5,6 октан C8H18 доза) нонан C9H20 декан C10H22 гексан C6H14 гептан C7H16 Группа 3 5,2 ± 1,1 октан C8H18 (низкая доза) нонан C9H20 декан C10H22 Группа Содержание мг/м3 25,9 104,7 25,9 1,8 1,8 5,0 20,3 5,0 0,34 0,34 0,84 3,4 0,84 0,06 0,06 УВ, Концентрации УВ в воздухе при экспонировании животных были довольно низкими: содержание гептана в смеси составляло всего 104,7 мг/м3 в первой группе, 20,3 мг/м3 во второй и 3,4 мг/м3 в третьей. Актуальность исследования влияния низких концентраций УВ согласуется с современными тенденциями в токсикологии, которые предполагают исследование концентраций токсикантов, релевантных их содержанию в окружающей среде. Соотношения предельных 49 углеводородов в смеси заданы соотношениями их концентраций в атмосферном воздухе вблизи нефтеперерабатывающих заводов, что наглядно представлено в таблице 11. После экспонирования у животных были отобраны образцы органов, которые незамедлительно заморозили в жидком азоте (-196°С) и гомогенизировали. К полученным гомогенатам массой от 80 до 120 мг добавляли раствор 4 мл КОН в метаноле, пробы тщательно перемешивали в УЗ-ванне в течении 10 минут, а затем в вортексе в течение 15 минут, затем проводили экстракцию метиловых эфиров 4 мл гексана дважды, экстракт выпаривали и определяли ЭЖК методом ГХ-МС. В оставшийся раствор гидроксида калия для установления рН 7 добавляли фосфатный буфер, а затем проводили процедуру экстрактивного алкилирования иодистым метилом (200 мкл) в присутствии катализатора межфазного переноса ТБАГ (300 мкл). При увеличении веса образцов соответственно увеличивали количество реагентов. 2.7 Статистическая обработка полученных результатов Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью прикладного пакета программ «STATISTICA» (версия 6.0, StatSoft Inc, 2001) и Microsoft Excel 2007 с дополнением Multibase 2015. В случае трех и более выборок различия по анализируемым показателям оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным межгрупповым сравнением величин по критерию Фишера. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми показателями вычисляли коэффициент корреляции Пирсона. Для всех видов анализа статистически значимыми по сравнению с контролем считали значения с р < 0,05. Результаты представлены как медиана (5%; 95% перцентиль) [2,3,4,128]. Факторный анализ данных проводили методом PLS-DA, который является частным случаем метода главных компонент (англ. PCA – principal component analysis) [196]. При анализе данных методом PCA особое внимание уделяется графикам счетов и нагрузок, которые несут в себе информацию о распределении данных. На графике счетов каждый образец изображается в координатах t1 и t2 (старшие главные компоненты ГК1 и ГК2) или в координатах младших компонент t3, t4 и пр. Близость двух точек означает их схожесть, т.е. положительную корреляцию. Точки, расположенные под прямым углом, являются некоррелированными, а расположенные диаметрально противоположно – имеют отрицательную корреляцию. График нагрузок при этом используется для исследования роли переменных. На графике нагрузок каждый образец изображается в координатах p1 и p2. Анализ графика нагрузок позволяет установить, какие переменные коррелируют друг с другом. 50 3 Результаты и их обсуждение 3.1 Хроматографическое разделение При разработке методики нами было проведено сравнение эффективности разделения метиловых эфиров ЖК на капиллярных колонках: HP-FFAP Polyethylene Glycol, SUPELCO SPB-1701 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм и HP-5MS 30 м, 0,25 мм, 0,25 мкм [2]. Режимы программирования температуры при использовании колонки HP-FFAP Polyethylene Glycol: начальная температура термостата 50°С, конечная 200 °С, скорость подъема температуры варьировали от 5 °С/мин до 20 °С/мин, в том числе с использованием “ступенчатого” температурного градиента. Форма хроматографических пиков наиболее легких компонентов смеси симметрична, однако при достижении температуры выхода 200 °С форма пиков тяжелых компонентов не позволяла провести количественную оценку их площадей. Можно предположить, что увеличение конечной температуры до 300 °С позволило бы добиться правильной формы пиков тяжелых компонентов, однако диапазон допустимых рабочих температур неподвижной фазы FFAP меньше этой температуры. Режимы программирования температуры при использовании колонки SUPELCO SPB 1701 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм: начальная температура термостата 50 °С, конечная 240 °С, скорость подъема температуры варьировали от 5 °С/мин до 20 °С/мин, в том числе с использованием “ступенчатого” температурного градиента. Оказалось, что с использованием SPB-1701 разделение компонентов происходит еще худшим образом по сравнению с колонкой FFAP. На рисунке 9 представлены хроматограммы, полученые при использоваA b und a nce нии колокни FFAP и HP-5MS. T IC : g r a d _ 3 .D \ d a ta .m s T IC : G R A D _ 5 _ M IX _ 2 M G _ 5 .D \ d a ta .m s ( * ) 3200000 3000000 2800000 2600000 2400000 2200000 2000000 1800000 HP-5MS 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 FFAP 400000 200000 4 5 .0 0 4 5 .5 0 4 6 .0 0 4 6 .5 0 4 7 .0 0 4 7 .5 0 4 8 .0 0 4 8 .5 0 4 9 .0 0 4 9 .5 0 5 0 .0 0 5 0 .5 0 5 1 .0 0 5 1 .5 0 T im e --> Рисунок 9 - Масс-хроматограмма смеси метиловых эфиров ЖК по характеристичным ионам, при использовании капиллярных колонок HP-5MS и FFAP 51 Наименее полярная из рассмотренных, колонка HP-5MS, тем не менее, позволила добиться разделения большинства целевых соединений, как показано на рисунке 10, за исключением пар кислот линолэлаидиновая и линоленовая, цис-11-эйкозеновая и цис11,14,17-эйкозатриеновая (температурный режим приведен в экспериментальной части). Масс-спектральные характеристики компонентов неразделенных пар позволяют проводить их селективное определение. Рисунок 10- Масс-хроматограмма смеси метиловых эфиров ЖК по характеристичным ионам. Капиллярная колонка HP-5MS 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм. 3.2 Подготовка проб к анализу Экстрактивное алкилирование СЖК проводили йодистым метилом с использованием хлористого метилена в качестве растворителя в присутствии катализатора межфазного переноса гидроксида тетрабутиламмония (ТБАГ) [2]. Была проведена оценка зависимости выхода метилпальмитата при алкилировании пальмитиновой кислоты от состава реакционной смеси; результаты приведены в таблице 12. Общий объем пробы составил 500 мкл в растворе метанола. 52 Таблица 12 - Зависимость выхода метилпальмитата при алкилировании пальмитиновой кислоты в различных условиях [2]. Выход продукта ,% Состав реакционной смеси 2 мл буферного раствора + 70 мкл ТБАГ + 100 мкл CH3I + 1 мл CH2Cl2 2 мл буферного раствора + 70 мкл ТБАГ + 100 мкл CH3I + 2 мл CH2Cl2 2 мл буферного раствора + 140 мкл ТБАГ + 100 мкл CH3I + 2 мл CH2Cl2 2 мл буферного раствора + 140 мкл ТБАГ + 200 мкл CH3I + 1 мл CH2Cl2 55 53 82 91 Дальнейшее увеличение количества реагентов не привело к повышению выхода реакции. Степени извлечения/превращения ЖК при экстрактивном алкилированим из биологических образцов (плазмы крови и мочи) не отличаются от степеней извлечения из водных растворов. Необходимым условием количественного протекания реакции экстрактивного алкилирования является обеспечение взаимодействия между отдающей и принимающей фазами, поэтому значительное влияние на скорость реакции оказывает способ перемешивания реакционной смеси. При использовании ультразвуковой ванны для перемешивания в течение 10 минут выход реакции метилирования пальмитата составил всего лишь 30%, а при использовании механического перемешивающего устройства (т.н. вортекс) в течение 10 минут выход реакции составил 90%. Увеличение времени перемешивании в вортексе не привело к повышению выхода реакции. Важно отметить, что для успешного определения ЖК в биологических образцах необходимым условием является правильный выбор лабораторной посуды для анализа. Так, при использовании любой пластиковой посуды для экстрактивного алкилирования, в образец привносились значительные количества пальмитиновой и стеариновой кислот. По этой причине для вышеуказанной процедуры необходимо использовать только стеклянную посуду, а полученный раствор в дальнейшем можно хранить в любой посуде. На рисунке 11 представлены сравнение хроматограм, после проведения экстрактивного алкилирования образца заведомо чистой воды, проведенного в пластиковой посуде и стеклянной 53 A b u n d a n c e T 6 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 IC : M .D \ d a ta .m s Пластиковая посуда 5 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 .0 0 T A 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 im e - - > b u n d a n c e Стеклянная посуда T IC : S te k lo .D \ d a ta .m s ( * ) 6 0 0 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 4 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 3 5 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 5 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 1 0 .0 0 T im e 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 - - > Рисунок 11- Масс-хроматограммы смеси метиловых эфиров ЖК по характеристичным ионам после экстрактивного алкилирования образца заведомо чистой воды, проведенного в пластиковой посуде и стеклянной При анализе образцов плазмы необходима стадия депротеинизации. Наиболее мягким вариантом этой процедуры является добавление смешивающегося с водой органического растворителя (метанола) с последующим осаждением белка центрифугированием. Однако длинноцепочечные ЖК (С ≥ 20), по-видимому, осаждаются вместе с белками, и в результате выход их метиловых эфиров составляет не более 10%. В дальнейшем для повышения выхода “тяжелых” ЖК было решено исключить стадию депротеинизации плазмы, а реагенты добавлять непосредственно в образец, разбавляя пробу только буферным раствором. При этом на границе раздела фаз образуется белковая пленка, в которой, вероятно, и концентрируются некоторые длинноцепочечные кислоты, поэтому для повышения степени их извлечения увеличили время перемешивания в вортексе до 15 минут. Масс-хроматограммы экстракта из плазмы крови и стандартной смеси метиловых эфиров ЖК зарегистрированные по характеристичным ионам представлены на рис. 12. Различия обусловлены низким содержанием нечетных ЖК в плазме, в отличие от стандартной смеси. 54 - Стандартная смесь метиловых эфиров ЖК Abundance T IC : F r_ 3 6 .D \ d a ta .m s T I C : C a l_ 4 0 0 . D \ d a t a . m s ( * ) - Образец плазмы 80000 75000 70000 65000 60000 55000 50000 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 2 1 .0 0 2 2 .0 0 2 3 .0 0 2 4 .0 0 2 5 .0 0 2 6 .0 0 2 7 .0 0 2 8 .0 0 2 9 .0 0 3 0 .0 0 T im e - - > Рисунок 12 - Масс-хроматограмма реконструированная по характеристичным ионам стандартной смеси метиловых эфиров ЖК и образца плазмы после экстрактивного алкилирования Степени извлечения СЖК из плазмы представлены в таблице 13. При определении ЖК в моче столкнулись с проблемой, связанной с определением внутреннего стандарта. При внесении его в любом растворителе (в воде, в метаноле, дихлорметане, гексане) в мочу или в мочу с добавкой буфера, степень извлечения/превращения внутреннего стандарта составила не больше 2%. Но при добавлении в мочу двойного объёма метанола, а только потом фосфатного буфера и остальных реагентов, выход реакции составил порядка 84%. Таким образом порядок введения имеет большое значение. Степени извлечения СЖК из мочи представлены в таблице 14. 55 Таблица 13 – Степени извлечения/превращения продуктов реакции экстрактивного алкилирования из плазмы крови Наименование Степень соединения извлечения/превращения, % Капроновая кислота 58,5 Капри́ловая кислота́ 72,2 Каприновая кислота 71,5 Ундециловая кислота 63,9 Лауриновая кислота 68,5 Тридекановая кислота 69,2 Миристолениновая кислота 68,0 Миристиновая кислота 76,4 цис-10-пентадекановая кислота 72,2 Пентадекановая кислота 79,6 Пальмитолеиновая кислота 88,8 Пальмитиновая кислота 69,5 цис-10-гептадекановая кислота 80,6 Маргариновая кислота 84,6 Гамма-линоленовая кислота 70,4 Линолевая кислота 55,8 Олеиновая кислота 67,7 Линолаэдиновая кислота 78,8 Линоленовая кислота 76,2 Элаидиновая кислота 83,1 Стеариновая кислота 81,9 Арахидоновая кислота 64,9 цис-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота 62,1 цис-8,11,14-Эйкозатриеновая 71,4 цис-11,14-эйкозадиеновая кислота 73,4 Гондоиновая (цис-11-эйкозеновая кислота) 74,8 цис-11,14,17-Эйкозатриеновая кислота 70,3 Арахиновая кислота 81,4 Генэйкозановая кислота 74,3 цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота 53,5 цис-13,16-докозеновая кислота 66,0 Эруковая кислота 68,5 Бегеновая кислота 72,8 Трикозановая кислота 64,9 Нервоновая кислота 55,4 Лигноцериновая кислота 65,7 Пеларгоновая кислота (Нонановая кислота) 72,3 Энантовая кислота (гептановая кислота) 84,5 Нанодекановая кислота (Нанодециловая кислота) 78,9 56 Таблица 14 – Степени извлечения/превращения продуктов реакции экстрактивного алкилирования из мочи Наименование Выход реакции,% соединения Капроновая кислота 91,0 Капри́ловая кислота́ 76,0 Каприновая кислота 82,5 Ундециловая кислота 81,4 Лауриновая кислота 81,4 Тридекановая кислота 80,8 Миристолеиновая кислота 86,8 Миристиновая кислота 80,6 Цис-10-пентадекановая кислота 78,2 Пентадекановая кислота 81,1 Пальмитолеиновая кислота 98,8 Пальмитиновая кислота 84,1 цис-10-гептадекановая кислота 87,2 Маргариновая кислота 83,1 γ-линоленовая кислота 79,7 Линолевая кислота 81,9 Олеиновая кислота 54,7 Линоэлаидиновая 82,0 Линоленовая кислота 80,0 Элаидиновая кислота 85,2 Стеариновая кислота 87,0 Арахидоновая кислота 83,2 цис-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота 79,6 цис-8,11,14-Эйкозатриеновая 81,4 цис-11,14-эйкозадиеновая кислота 85,3 Гондоиновая (цис-11-эйкозеновая кислота) 82,5 цис-11,14,17-Эйкозатриеновая кислота 81,3 Арахиновая кислота 86,1 Генэйкозановая кислота 87,1 цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота 79,0 цис-13,16-докозеновая кислота 85,0 Эруковая кислота 84,4 Бегеновая кислота 86,7 Трикозановая кислота 87,4 Нервоновая кислота 81,4 Лигноцериновая кислота 86,7 Пеларгоновая кислота (Нонановая кислота) 83,0 Энантовая кислота (гептановая кислота) 80,1 Нанодекановая кислота (Нанодециловая кислота) 76,5 После экстракции дихлорметаном необходимо сконцентрировать и выпарить 2 мл растворителя. Важно отметить, что при выпаривании досуха, короткоцепочечные кислоты С6-С10 испаряются, и их невозможно определить далее. Поэтому, для определения полного профиля ЖК, необходимо выпаривать до конечного объёма примерно 50 мкл. Конечный объём доводили до 100 мкл гексаном. В итоге проба была сконцентрирована в 5 раз. Масс57 хроматограммы стандатной смеси метиловых эфиров ЖК реконструированные по характеристичным ионам и образца мочи посли экстрактивного алкилирования представлены на рисунке 13. A b und a nc e T IC : K a rm a n o vмочи _ 1 5 .D \ d a ta .m s Образец 200000 150000 100000 50000 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 8 .0 0 3 0 .0 0 3 2 .0 0 3 4 .0 0 T im e --> A b und a nc e СтандартнаяTсмесь метиловых эфиров ЖК IC : C a l_ 4 0 0 .D \ d a ta .m s (*) 200000 150000 100000 50000 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 8 .0 0 3 0 .0 0 3 2 .0 0 3 4 .0 0 T im e --> Рисунок 13 - Масс-хроматограммы реконструированные по характеристичным ионам смеси метиловых эфиров ЖК и образца мочи посли экстрактивного алкилирования. 3.3 Построение градуировочных зависимостей Градуировочные зависимости строили по стандартным растворам ЖК после экстрактивного алкилирования из метанола. Были проанализированы градуировочные растворы с концентрацией каждой кислоты 0,02, 0,2, 2, 4, 8, 20, 50 мкг/мл. После оценки эндогенных уровней ЖК в матрице, для кислот с низкими значениями концентраций, на градуировочных графиках были изменены верхние пределы количественного определения (до 20 мкг/мл). Для корректного построения градуировочных кривых ввели весовой коэффициент. Исходя из индивидуальных свойств кислот и ранга определяемых концентраций, весовой коэффициент высчитывали для каждой кислоты отдельно, по минимальной сумме относительных ошибок. Вид градуировочных графиков и хроматографических пиков, определяемых ЖК приведен в приложении А. 58 Таблица 15 – Воспроизводимость методики определения СЖК в плазме крови и моче Относительная Относительная Метиловый эфир ошибка определения ошибка определения жирной кислоты СЖК в плазме, % СЖК в моче, % * Капроновая, С6:0 14 9 Гептановая (энантовая), C7:0 15 7 Каприловая, C8:0 10 8 Нонановая (пеларгоновая), C9:0 15 11 Каприновая, C10:0 14 6 Ундециловая, C11:0 18 13 Лауриновая, C12:0 16 10 Тридекановая, C13:0 17 16 Миристиновая, C14:0 11 14 Миристолеиновая, C14:1 15 12 цис-10-Пентадеценовая, C15:1 15 7 Пентадекановая, C15:0 12 9 Пальмитолеиновая, C16:1n-7 13 16 Пальмитиновая, C16:0 8 11 цис-10-Гептадеценовая, C17:1 10 14 Маргариновая, C17:0 12 8 γ-Линоленовая, C18:3n6 12 10 Линолевая, C18:2n6c 11 12 Олеиновая, C18:1n9c 12 13 Линоленовая, C18:3n3 11 10 Линоэлаидиновая, C18:2t 14 16 Элаидиновая, C18:1n9t 11 13 Стеариновая, C18:0 9 14 Арахидоновая, C20:4n6 11 7 цис-5,8,11,14,17-Эйкозапентаеновая, C20:5 13 9 Нонадекановая, C19:0 13 13 цис-8,11,14-Эйкозатриеновая, C20:3n8 14 10 цис-11,14-Эйкозадиеновая, C20:2 15 11 цис-11-эйкозеновая, C20:1 16 8 цис-11,14,17-Эйкозатриеновая, C20:3n11 16 10 Арахиновая, C20:0 17 14 Генэйкозановая, C21:0 17 15 цис-13,16-Докозеновая, C22:2 18 16 Эруковая, C22:1n9 17 11 цис-4,7,10,13,16,19-Докозагексаеновая, 14 9 C22:6n3 Бегеновая, C22:0 18 14 Трикозановая, C23:0 17 13 Нервоновая, C24:1n9 19 8 Лигноцериновая, C24:0 17 9 59 Так как невозможно построить градуировочные графики с использованием образцов с внесением аналитов, наиболее рациональным представляется использование метода относительной градуировки для количественного определения СЖК в биожидкостях [2]. Коэффициент извлечения/превращения К вычисляли по формуле: K Si m Si 100,% , S st где K – коэффициент извлечения, %; Si – площадь хроматографических пиков в образце плазмы без добавки; Si+m − площадь хроматографических пиков аналитов в образце плазмы с добавкой стандартной смеси ЖК; Sst − площадь хроматографических пиков аналитов в стандартной смеси ЖК. Коэффициенты корреляции градуировочных графиков составляют не менее 0,990, минимальные значения характерны для цис-10-пентадеценовой и элаидиновой кислот: 0,9906 и 0,9902 соответственно. Воспроизводимость количественного определения СЖК оценивали следующим образом: в объединенный образец плазмы крови от нескольких добровольцев вносили добавку стандартной смеси ЖК. Стандартную добавку вводили для оценки воспроизводимости кислот, находящихся в плазме крови человека в минорных количествах. Затем образец разделяли на 15 аликвот, в которых определяли СЖК. Результаты представлены в таблице 15. В табл. 16 приведены результаты определения концентраций СЖК в плазме крови и моче добровольцев, а также плазме крови крыс. 60 Таблица 16 - Экспериментально определенные концентрации СЖК в плазме крови людей и крыс и в моче человека [2] Содержание СЖК в Содержание СЖК в Содержание СЖК в моче чеплазме крови чело- плазме крови крыс, ловека, мкг/ммоль креатинина СЖК века, мкг/мл мкг/мл min max min max min max C6:0 0,02* 0,60 0,41 0,55 -*** C8:0 0,07 0,29 0,09 1,04 2,40 24,80 C10:0 0,16 0,72 0,16 0,71 0,00 12,80 C11:0 0,05 0,15 0,04 0,14 C12:0 0,21 2,95 0,17 1,43 C13:0 0,02 0,12 0,16 0,24 ** C14:1 0,30 4,27 0,00 286,00 C14:0 0,96 10,77 2,48 4,65 0,40 12,20 C15:1 0,26 0,89 0,50 8,90 C15:0 0,15 10,40 0,60 0,78 0,00 7,40 C16:1n-7 0,23 23,67 3,33 6,25 C16:0 30,53 163,57 29,35 42,55 0,00 556,70 C17:1 0,04 7,61 0,00 41,70 C17:0 0,32 1,25 0,16 0,67 0,00 5,60 C18:3n6 0,33 0,72 0,26 0,39 C18:2n6c 21,96 162,93 40,54 74,42 0,00 36,60 C18:1n9c 9,27 179,44 10,62 23,33 0,00 1161,30 C18:2t 0,08 1,26 C18:3n3 0,37 2,84 3,35 7,38 C18:1n9t 0,92 11,27 1,39 2,92 0,00 28,40 C18:0 8,40 38,29 6,69 18,49 11,70 583,20 C20:4n6 1,69 3,80 8,76 18,97 0,00 8,50 C20:5 0,22 2,13 0,69 1,72 0,00 11,50 C20:3n8 0,29 1,00 0,29 0,94 0,70 5,20 C20:2 0,31 1,08 0,02 0,80 0,00 26,40 C20:1 0,32 1,30 0,02 0,36 0,00 4,90 C20:3n11 0,17 0,31 0,00 3,10 C20:0 0,08 0,37 0,02 0,63 0,00 6,40 C21:0 0,01 0,14 0,60 5,20 C22:6n3 0,97 5,22 1,01 3,50 0,70 16,50 C22:2 0,06 0,33 C22:1n9 0,06 0,18 0,00 5,30 C22:0 0,01 0,28 0,02 0,35 1,40 11,20 C23:0 0,11 6,28 1,00 6,50 C24:1n9 0,15 3,04 0,02 0,53 0,00 44,20 C24:0 0,08 0,70 0,02 0,17 1,70 15,40 Примечание: * – минимальное зарегистрированное значение концентрации ниже предела определения; ** – целевое соединение определяется в плазме крови только людей; *** – целевое соединение не определяется в моче. 61 3.4 Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматоматографии с масс-селективным детектированием Метод экстрактивного алкилирования был успешно применён для определения свободных ЖК в плазме крови. Однако для проведения более детального исследования оказалось необходимым совместное определение СЖК и ЭЖК в одной пробе. Одной из задач работы являлась разработка способа подготовки образцов к ГХ-МС анализу, позволяющего проводить селективное определение СЖК и ЭЖК в одной аликвоте образца в “мягких” условиях. Разработанная процедура основана на сочетании “классической” переэтерификации раствором KOH в MeOH и предложенного нами ранее метода определения СЖК с использованием экстрактивного алкилирования [3]. Разработанный метод характеризуется небольшой продолжительностью реакции, “мягкими” условиями и высокими выходами продуктов реакции. Объединение стадий экстракции и получения летучих производных позволяет работать с различными биологическими жидкостями без дополнительных стадий депротеинизации и фильтрации. Наглядно схема последовательного определения СЖК и ЭЖК в плазме крови представлена на рисунке 14. Рисунок 14 - Схема последовательного определения СЖК и ЭЖК в образце плазмы крови Из рисунка 10 видно, что на первой стадии пробоподготовки необходимо извлечь ЭЖК из матрицы пробы. Для этого применяли процедуру переэтерификации связанных ЖК в их метиловые эфиры с помощью 0,4 М раствора гидроксида натрия в метаноле с последующей экстракцией гексаном. Условия протекания реакции можно охарактеризовать как мягкие, однако требовало подтверждения отсутствие гидролиза ЭЖК, что могло бы приво- 62 дить к завышенным результатам определения СЖК. Для этого образец плазмы крови разделили на две аликвоты: в одной аликвоте только определяли содержание СЖК, а во второй - содержание СЖК после переэтерификации ЭЖК. Относительное расхождение между результатами определения СЖК в двух аликвотах составило не более 15 %, что не превышает относительной ошибки метода, следовательно, на первой стадии пробоподготовки образование СЖК не происходит или происходит в незначительной степени. Процесс двухстадийного определения ЖК заключается в последовательном выполнении стадий переэтерификации ЭЖК в метиловые эфиры и экстрактивного метилирования СЖК. Переэтерификация ЭЖК протекает при pH > 11, в то время как экстрактивное алкилирование протекает при pH 8. Таким образом, переход от первой стадии процедуры ко второй требует коррекции рН пробы. Для решения этой проблемы разработали три варианта создания необходимого pH в пробе: добавка серной или соляной кислот и разбавление пробы фосфатным буфером с pH 8. Коэффициенты извлечения пальмитиновой кислоты составили 5%, 10% и 73%, соответственно. Количества реагентов, необходимые для достижения требуемого pH среды, определяли титриметрически. Установили, что наибольший выход продуктов реакции экстрактивного метилирования достигается при коррекции рН с помощью фосфатного буферного раствора. Для определения содержания ЖК в плазме крови использовали метод относительной градуировки с внутренним стандартом. Градуировочные графики строили по стандартным растворам метиловых эфиров ЖК в дихлорметане. В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерированную пальмитиновую кислоту d31, которую добавляли в анализируемый образец в виде свободной кислоты (для определения СЖК) и в виде метилового эфира (для определения ЭЖК). Процесс построения градуировочных графиков осложнен различными биогенными уровнями содержания в крови свободных и связанных ЖК. Требования к диапазону определяемых концентраций метиловых эфиров ЖК после первой и второй стадий подготовки проб не совпадали. Так, например, содержание свободной линолевой кислоты в плазме крови человека составляет 15-70 мкг/мл, а в этерифицированном виде может достигать 600 мкг/мл. Для повышения воспроизводимости анализа градуировочные графики были разбиты на линейные диапазоны для высоких и низких концентраций. На рисунке 15 представлены масс-хроматограммы ЖК зарегистрированные по характеристичным ионам в плазме крови. 63 A b u n d a n c e T IC : E T _ 8 .D \ d a ta .m s 2 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0 T im e - - > A b u n d a n c e T IC : F _ 8 5 .D \ d a ta .m s (* ) 2 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0 T im e - - > Рисунок 15 - Масс-хроматограммы ЖК по характеристичным ионам полученные после экстрактивного алкилирования СЖК (вверху) и переэтерификации ЭЖК (внизу) из плазмы крови В таблице 17 приведены метрологические параметры методики измерений СЖК и ЭЖК, такие, как показатель повторяемости (среднего квадратического отклонения повторяемости) - σr(Δ), % отн.; показатель воспроизводимости (среднеквадратического отклонения воспроизводимости) - σR(Δ), % отн.; показатель точности (Р = 0,95) - ± Δ, % отн.; показатель правильности (границы, в которых находится неисключенная систематическая погрешность методики). Оценку воспроизводимости метода осуществляли следующим образом: плазму крови, полученную от нескольких добровольцев, объединяли, тщательно перемешивали и делили на 15 частей. В каждой аликвоте определяли СЖК и ЭЖК. Результаты приведены в таблице 17. Относительная ошибка определения большинства ЖК менее 15 %. Исключение составляют ЖК, фоновое содержание которых ниже или на уровне предела определения. 64 Таблица 17 – Метрологические параметры методики измерений СЖК и ЭЖК в плазме крови СЖК ЭЖК ЖК σr(Δ), σR(Δ), ±Δ, % σr(Δ), σR(Δ), ±Δ, % % отн. % отн. отн. С*, мкг/мл % отн. % отн. отн. С, мкг/мл С11:0 5 7 14 0,02-0,16 -** С12:0 6 4 8 0,13-8,20 14 15 29 0,9-3,7 С13:0 28 20 39 0,04-0,10 0,08-0,12 С14:1 18 21 42 0,26-1,52 26 14 27 0,3-0,9 С14:0 15 13 25 1,6-16,1 7 5 10 1,4-6,1 С15:1 26 17 33 0,03-0,19 С15:0 16 12 23 0,52-2,63 15 10 20 0,3-0,9 С16:1 5 5 9 4-36 1 1 2 0,9-10,4 С16:0 2 2 4 58-196 1 2 4 20-76 С17:1 22 12 24 0,5-2,0 16 12 23 0,3-0,7 С17:0 17 16 31 1,0-2,5 10 6 13 0,2-0,6 C18:3n6 37 25 48 0,5-8,0 12 9 18 0,3-1,8 C18:2n6c 2 3 7 127-426 1 2 4 34-103 C18:1n9c 3 4 7 62 - 230 1 2 4 17-70 C18:3n3 19 11 22 0,8-6,5 13 10 20 0,5-1,7 C18:1n9t 10 7 13 5,5-25,0 6 8 15 0,9-7,1 C18:0 5 4 7 28-79 2 1 2 10-26 C20:4n6 3 6 12 84-205 1 1 2 11-54 C20:5 17 14 27 1,9-27,0 14 14 27 0,4-5,9 C20:3n8 13 10 20 8-25 3 2 3 1,0-4,9 C20:2 8 9 17 1,5-4,8 12 6 11 0,4-1,2 C20:1 32 21 40 0,7-2,1 12 9 17 0,3-0,7 C20:3n1 0,7-2,1 1 34 19 38 C20:0 27 23 43 0,1-0,5 29 24 46 0,1-0,2 C21:0 19 14 27 0,03-0,05 C22:6 7 5 9 11-56 3 2 4 2,3-31,9 C22:2 33 24 47 0,00-0,34 C22:1n9 31 20 40 0,18-0,33 C23:0 64 54 106 0,00-0,24 42 30 59 0,00-0,27 C24:0 18 17 32 0,20-0,59 Примечание: * - диапазон концентраций ЖК в плазме крови; ** - ЖК отсутствует в плазме крови в этерифицированной форме. 65 Таблица 18 – Сравнение содержания концентраций СЖК после экстрактивного алкилирования Средние значеСредние исходные Изменение ния конц-ий СЖК значения конц-ий конц-ий СЖК после изСЖК СЖК, % влечения ЭЖК Ундециловая кислота 0,17 0,14 - 14 Лауриновая кислота 2,5 2,92 +11 Тридекановая кислота 0,18 0,15 -13 Миристолеиновая 0,38 0,43 +9 Миристиновая кислота 2,06 2,34 +10 Пентадекановая кислота 0,58 0,53 -6 Пальмитолеиновая кислота 2,81 3,19 +8 Пальмитиновая кислота 43,39 48,15 +7 цис-10-Гептадеценоат 0,27 0,31 +9 Маргариновая кислота 0,41 0,37 -7 Гамма-линоленат 0,44 0,51 +10 Линолевая кислота 63 68,16 +5 Олеиновая кислота 21,07 25,4 +13 Линоленовая кислота 0,73 0,84 +10 Элаидиновая кислота 1,24 1,17 -4 Стеариновая кислота 18,64 17,96 -3 Арахидоновая кислота 35,46 31,99 -7 цис-5,8,11,14,171,46 1,73 +12 эйкозапентаеновая кислота цис-8,11,14-Эйкозатриеновая 2,46 2,42 -1 цис-11,14-эйкозадиеновая 0,59 0,68 +10 кислота Гондоиновая (цис-110,36 0,42 +11 эйкозеновая кислота) Арахиновая кислота 0,18 0,15 -13 Генэйкозановая кислота 0,04 0,05 +15 цис-4,7,10,13,16,1911,36 12,85 +9 докозагексаеновая кислота цис-13,16-докозеновая кислота 0,33 0,33 0 Эруковая кислота 0,28 0,31 +7 Бегеновая кислота 0,07 0,08 +9 Трикозановая кислота 0,26 0,26 0 Лигноцериновая кислота 0,56 0,56 0 Апробация метода. Разработанную методику использовали для определения эндогенного содержания ЭЖК и СЖК в плазме крови доноров. Группа добровольцев насчитывала 30 практически здоровых мужчин 20-25 лет. Отбор крови проводили утром натощак из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Результаты определения ЭЖК и СЖК в плазме крови добровольцев представлены в таблице 19. 66 Таблица 19 - Экспериментально измеренные концентрации ЭЖК и СЖК в плазме крови доноров С11:0 Концентрации ЭЖК, мкг/мл* Орлова Т.И. Лит. 0,03 (0,00;0,09) - С12:0 1,26 (0,13; 8,20) 31,1 ± 12 [199] 1,15 ± 0,18 [198] 3,94 ± 0,17 [200] С13:0 С14:1 0,06 (0,04; 0,10) 0,67 (0,26; 1,52) - С14:0 6,27 (1,60; 16,08) 135,2 ± 35 [211] 17,2 ± 4,2 [198] 21,90 ± 1,42 [209] С15:1 С15:0 0,14 (0,03; 0,19) 1,25 (0,52; 2,63) 4,64 ± 0,28 [208] С16:1 7,53 (3,58; 35,68) 96,8 ± 27 [209] 23,90 ± 4,09 [198] 19,74 ± 2,81 [208] ЖК С16:0 135,48 (58,37; 195,62) С17:1 С17:0 C18:3n6 0,97 (0,49; 1,99) 1,48 (0,98; 2,55) 2,01 (0,46; 8,15) 269,95 (126,95; 425,80) C18:2n6c C18:1n9c 128,80 (61,85; 226,23) C18:3n3 C18:1n9t 2,99 (0,79; 6,53) 11,15 (5,46; 24,99) 367 ± 125 [198] 404,00 ± 51,60 [199] 769,20 ± 68,43 [200] 23,4 ± 11 [209] 69,1 ± 26 [209] 535,6 ± 218 [209] 737,00 ± 117,00 [199] 634,38 ± 26,30 [200] 58,9 ± 24 [209] Концентрации СЖК, мкг/мл* Орлова Т.И. Лит. 0,14 (0,09; 0,18) 0,2 – 2,4 [197] 13,65 ± 7 [198] 1,90 (0,91; 3,66) 1,45 ± 0,25 [199] 0,95 ± 0,11 [200] 0,10 (0,08; 0,12) 0,53 (0,28; 0,94) < 0,08 [197] 1,8-15,9 [201] 0,7-5,0 [197] 2,87 (1,44; 6,09) 52,7 ± 14 [198] 9,37 ± 2,50 [199] 3,73 ± 0,32 [200] 0,52 (0,30; 0,89) 2,31 ± 0,29 [200] 1,1-21,6 [201] 2,12 (0,91; 10,43) 0,5-4,8 [197] 42,25 ± 17 [198] 13,74 ± 3,21 [199] 19,2-199,6 [201] 14,8-56,6 [197] 40,93 (20,09; 75,85) 163,5 ± 78 [198] 256,00 ± 46,20 [199] 130,37 ± 3,77 [200] 0,37 (0,28; 0,72) 9 ± 4 [198] 0,36 (0,15; 0,62) 32,5 ± 14 [198] 0,44 (0,25; 1,81) 14,91 ± 6,0 [202] 11,6-102,8 [201] 57,33 (34,32; 103,09) 3,6-46,4 [197] 30,71 (16,95; 70,20) 1,04 (0,51; 1,72) 2,25 (0,88; 7,14) 51,08 (28,38; 78,50) 310,2 ± 168 [209] 123,00 ± 14,10 [199] 254,70 ± 9,60 [200] 132,49 (84,42; 205,00) 287,5 ± 94 [209] 120,00 ± 17,40 [199] 174,78 ± 12,19 [200] C20:5 8,74 (1,84; 26,81) 66,4 ± 39 [209] 11,10 ± 1,96 [199] 1,49 (0,44; 5,85) C20:3n8 14,42 (7,60; 24,54) 61 ± 28 [209] 28,80 ± 3,36 [199] 28,18 ± 1,71 [199] 1,92 (1,00; 4,86) C20:2 2,41 (1,54; 4,77) 89,4 ± 22 [210] 0,64 (0,42; 1,19) C20:1 1,38 (0,72; 2,07) 10,3 ± 7 [209] 0,43 (0,30; 0,71) C18:0 C20:4n6 67 16,74 (9,89; 26,23) 25,23 (11,28; 53,89) 10,4-74,4 [197] 226 ± 98 [198] 479,00 ± 90,00 [199] 81,41 ± 4,54 [200] 13,83 ± 1,9 [202] 16,05 ± 9 [198] 8,8-133,5 [201] 4,8-21,3 [197] 144 ± 55 [198] 77,80 ± 12,40 [199] 47,74 ± 4,01 [200] 172,53 ± 2,3 [202] 165,1 ± 73 [198] 92,70 ± 16,80 [199] 16,24 ± 2,26 [200] 18,41 ± 9,5 [202] 21,35 ± 15 [198] 10,50 ± 2,40 [203] 1,27 ± 0,17 [200] 47,86 ± 2,4 [202] 27,05 ± 15 [198] 23,70 ± 3,55 [203] 6,01 ± 4,4 [202] 34,5 ± 16 [198] 7,31 ± 3,5 [202] 0,4 ± 0,2 [198] Концентрации СЖК, мкг/мл* Орлова Т.И. Лит. C20:3n1 27,05 ± 15 [198] 0,35 (0,34; 0,36) 1 4,27 ± 0,24 [199] 10,39 ± 3,4 [202] 31,1 ± 18 [209] 8,95 ± 4 [198] C20:0 0,24 (0,14; 0,46) 3,23 ± 0,27 [199] 0,12 (0,09; 0,20) 3,81 ± 0,15 [199] 4,29 ± 0,52 [200] 1,36 ± 0,15 [200] C21:0 0,04 (0,03; 0,05) 0,05 (0,04; 0,08) 43,78 ± 2,8 [202] 57,4 ± 120,3 ± 57 [209] 21 [198] C22:6 29,93 (10,99; 56,23) 15,80 ± 5,74 [199] 6,47 (2,34; 31,86) 30,26 ± 7,19 [203] 19,28 ± 2,41 [200] 3,77 ± 0,12 [200] C22:2 - (-; 0,34)** 40,1 ± 27 [209] 14,65 ± 5 [198] C22:1n9 0,30 (0,18; 0,33) 0,32 (0,28; 0,34) 21,54 ± 2,9 [202] С22:0 0,07 (0,05; 0,10) 156,4 ± 66 [209] 0,07 (0,05; 0,10) 67,4 ± 25 [198] C23:0 0,14 (0,00; 0,24) C24:1 0,29 (0,01; 0,30) 31,16 ± 3,5 [202] 17,53 ± 4,4 [202] C24:0 0,55 (0,20; 0,59) 0,56 (0,54; 0,62) 6,05 ± 0,51 [200] 1,26 ± 0,15 [200] Примечание: *- концентрации представлены в виде: медиана (персентиль 5 %; персентиль 95 %); ** - ЖК обнаружена в плазме крови только у двух доноров, что связано с нутритивными особенностями. ЖК Концентрации ЭЖК, мкг/мл* Орлова Т.И. Лит. 61 ± 28 [209] 0,43 (0,04; 0,51) 4,93 ± 0,43 [199] Имеющиеся в литературе многочисленные данные о содержании СЖК и ЭЖК в плазме крови человека крайне противоречивы и часто сообщаются без указания пола, возраста, спектра заболеваний. Результаты исследований, представленные в таблице 17, в дальнейшем планируется использовать в рамках фармакометаболомных исследований с привлечением того же контингента добровольцев. Таким образом, в рамках настоящей работы разработана двухстадийная процедура количественного определения ЭЖК и СЖК в плазме крови с использованием газовой хроматомасс-спектрометрии. Диапазон измеряемых концентраций 0,2-800 мкг/мл. Относительная ошибка определения большинства аналитов не превышает 15 %. При переходе от первой стадии переэтерификации ЭЖК в метиловые эфиры и экстракции их из матрицы, ко второй - экстрактивному метилированию СЖК, - предложено проводить коррекцию рН пробы путем разбавления фосфатным буфером (рН 8). Разработанная процедура позволяет проводить количественное определение ЖК в плазме крови на уровне биологически обусловленных концентраций. Показано отсутствие конверсии ЭЖК в СЖК в ходе процедуры 3.5 Оптимизация условий хранения образцов плазмы крови для определения жирных кислот методом газовой хроматомасс-спектрометрии Следует отметить, что многие приведенные в литературе данные по влиянию хранения биологических образцов на определение ЖК противоречивы и получены разными ме68 тодами, что вынуждает провести собственное исследование. Одной из задач работы являлось установление влияния условий хранения биологических образцов на результаты хроматомасс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных ЖК в плазме крови [4]. Для каждого аналита вычисляли матричный фактор, равный отношению площади пика аналита в присутствии матрицы к площади пика в отсутствии матрицы (водного раствора аналита). Установили, что коэффициенты вариации IS-нормализованного матричного фактора не превышают 15%. Матричный фактор составляет от 0,6 до 0,9 для различных кислот (в среднем 0,72 ± 0,08), при этом его зависимости от числа атомов углерода в молекуле жирной кислоты не выявлено. В таблицах 20 и 21 приведены результаты оценки стабильности этерифицированных и свободных ЖК в плазме крови при различных условиях хранения образцов. Изменений не выявлено Изменений не выявлено Таблица 20 - Результаты оценки стабильности этерифицированных ЖК в плазме крови при различных условиях хранения образцов. Изменения определяемых концентраций ЭЖК в образце приведены в % от исходных значений [4] Хранение при Хранение при -20 °С в течеОпределяемые ЖК +4 °С без замо- -20 °С, с повт. -70 °С в течение одной или в пулированном раживания, кол- Зам-ем, кол-во ние одной или двух недель образце плазмы во дней циклов двух недель крови 1 2 3 1 2 3 14 д 28 д 14 д 28 д Додекановая -21 * -38 -53 -76 -30 -62 -64 Миристиновая -21 * -29 * -33 * * -16 Пальмитолеин-я -30 -26 -27 -19 -27 +20 * +38 Пальмитиновая -28 -28 -32 * -22 * * +21 Линолевая -31 -32 -23 +22 +56 +55 * +91 Олеиновая -23 -22 -15 * +34 +36 * +47 Линоленовая -17 -37 -31 -42 -27 +31 +27 +60 Элаидиновая * -29 -25 * -16 * * +43 Стеариновая -22 -26 -21 -20 -26 * * +20 Арахидоновая -18 -16 -21 * -18 * * +16 Эйкозапентаеновая * * * * * +20 * +54 Эйкозатриеновая -17 -19 * * +22 * * * Эйкозадиеновая * * * -20 -24 -18 -17 -18 Докозагексаеновая * +18 +27 * -46 -68 -32 -66 Примечание: * - Величина изменений не превышает методическую погрешность измерений (≤15%) В результате можно рекомендовать следующие надлежащие условия хранения: температура -20 °С, продолжительность не более двух недель и не более одного замораживания образцов. При соблюдении этих условий в образце происходят минимальные изменения. Единственным выявленным отклонением является уменьшение концентрации свободной 69 докозагексаеновой кислоты на 19% через 2 недели при -20°С. Увеличение количества циклов з/р приводит к увеличению концентраций СЖК и уменьшению концентраций ЭЖК, причем третий цикл значительно усугубляет изменения. Изменений не выявлено Изменений не выявлено Таблица 21 - Результаты оценки стабильности этерифицированных ЖК в плазме крови при различных условиях хранения образцов. Изменения определяемых концентраций СЖК в образце приведены в % от исходных значений [4] Хранение при Хранение при -20 °С в тече- Хранение при Хранение при -20 °С, с повтор- ние одной или -70 °С в течеОпределяемые +4 °С без замоным заморажи- двух недель, ние одной или ЖК в пулированраживания, ванием, кол-во без повтор- двух недель, ном образце кол-во дней циклов ного замора- без повторного плазмы крови живания замораживания 1 2 3 1 2 3 14 д 28 д 14 д 28 д Додекановая * * * -36 * * * * Миристиновая -20 * * -41 * * * * Пальмитолеин-я * * +18 +50 * * * +24 Пальмитиновая +16 * +16 +28 * * * * Линолевая +24 * * +76 * * +19 +57 Олеиновая +23 * * +46 * * * +24 Линоленовая * * * +22 * * * * Элаидиновая +19 * * +39 * +27 +19 +41 Стеариновая * * * +17 * * * * Арахидоновая * * +24 +76 * -17 -17 -60 Эйкозапентаенова * +17 +31 +76 * -18 * -34 я Эйкозатриеновая * * +22 +54 * * * * Эйкозадиеновая -16 * * +35 * * * +30 Докозагексаенова * * +26 +52 -19 -42 -17 -37 я Примечание: * - Величина изменений не превышает методическую погрешность измерений (≤15%) Хотя хранение образцов при 4 °С в течение двух дней не влияет на концентрации СЖК, тем не менее ЭЖК нестабильны даже в течение 24 часов в образце при такой температуре. Интересно отметить, что понижение температуры хранения до -70 °С значительным образом сказалось на концентрациях определяемых соединений. Модельный эксперимент с использованием раствора альбумина с внесением пальмитиновой и олеиновой кислот показал, что альбумин не влияет на концентрацию пальмитиновой кислоты, концентрация же олеиновой при этом уменьшается. Наглядно этот процесс отражен на рисунке 16. Разницей в связывании кислот с альбумином можно пренебречь, так как константы связывания олеиновой и пальмитиновой приблизительно равны. 70 Рисунок 16 – Влияние хранения на концентрации пальмитиновой и олеиновой кислот в растворе альбумина Внесение антиоксиданта в образцы плазмы крови перед хранением не позволило увеличить продолжительность хранения или количество циклов з/р. Стабильность ЖК в плазме крови при хранении можно оценить методами факторного анализа. Рассмотрим три группы образцов (контроль, "0 циклов", "1 цикл", "2 цикла" и "3 цикла"), как показано на рисунках 17, 18 и 19. PLS-DA анализ полученного массива данных позволяет заключить, что первые два цикла з/р значимо не отличаются от исходного образца. Рисунок 17 – График счетов главных компонент 1 и 2 построенный методом PLS-DA иллюстрирующий сравнение групп образцов "0 циклов", "1 цикл", "2 цикла" и "3 цикла". Результаты получены при определении СЖК Значимость полученных результатов оценивалась с помощью т.н. перестановочного теста, реализованного в ПО Multibase 2015 (50 перестановок). Основным влиянием на профиль СЖК обладают насыщенные ЖК с низкой концентрацией миристиновая, додекановая, бегеновая и арахидиновая. Различия между исходным образцом и образцом, хранившимся 2 недели при -20 °С значительно меньше чем между исходным и образцом, хранившимся 4 недели при -20 °С. На рисунке 14 представлена аналогичная иллюстрация влияния циклов 71 з/р на профили ЭЖК. Установлено, что уже второй цикл з/р образцов вносит достоверные различия в состав ЭЖК. В таблице 22 суммированы основные результаты, полученные в настоящей работе. Рисунок 18 – График счетов главных компонент 1 и 2 построенный методом PLS-DA иллюстрирующий сравнение групп образцов "0 дней", "2 недели" и "4 недели". Результаты получены при определении СЖК Рисунок 19 – График счетов главных компонент 1 и 2 построенный методом PLS-DA иллюстрирующий сравнение групп образцов "0 циклов", "1 цикл", "2 цикла" и "3 цикла". Результаты получены при определении ЭЖК Отмечено, что понижение температуры хранения образцов до -70 °С оказывает негативное влияние на вариацию концентраций СЖК и ЭЖК в образцах плазмы крови. Так концентрации СЖК изменяются в диапазоне от -17 до +19 %, а ЭЖК от -62 до +27 % [4] 72 Таблица 22 – Различные условия хранения аликвот плазмы крови [4] Описание условий хранения Замораживание пробы до -20 °С, хранение 24 часа и раз- 1 цикл мораживание до +20 °С в течение двух часов при комнат2 цикл ной температуре. Затем следующий цикл. 3 цикл 1 день Хранение пробы при +4 °С 2 дня 3 дня Замораживание пробы до -20 °С, хранение 14 или 28 дней 14 дней и размораживание до +20 °С в течение двух часов при 28 дней комнатной температуре Замораживание пробы до -70 °С, хранение 14 или 28 дней 14 дней и размораживание до +20 °С в течение четырех часов при 28 дней комнатной температуре Добавление в пробу ди-трет-бутилфенола и заморажива- 1 цикл ние пробы до -20 °С, хранение 24 часа и размораживание 2 цикл до +20 °С в течение двух часов при комнатной темпера3 цикл туре. Затем следующий цикл Разбавление пробы метанолом (1 к 2), охлаждение -20 °С, 14 дней хранение 14 или 28 дней и нагрев до +20 °С в течение двух 28 дней часов при комнатной температуре Результат Отсутствуют изменения в составе СЖК↑, ЭЖК↓ СЖК↑↑, ЭЖК↓↓ ЭЖК↓, СЖК стабильны в течение двух дней Свободная ДГЕ↓ Значимые изменения в составе ЭЖК и СЖК Добавление антиоксиданта не повлияло на результаты Значительные изменения в составе ЭЖК и СЖК В результате предложены рекомендации по надлежащему хранению образцов плазмы крови для определения ЖК [4]. Образцы сохраняют пригодность для анализа в течение одного цикла замораживания/размораживания, до 14 дней хранения при -20 °С. Показано, что СЖК проявляют большую стабильность, их определение возможно и после двух циклов замораживания/размораживания, даже после хранения образцов при +4 °С в течение двух дней. Показано, что использование добавок антиоксиданта в плазму крови перед хранением не позволяет увеличить продолжительность хранения или количество циклов замораживания/размораживания. Понижение температуры образцов до -70 °С изменяет первоначальный состав СЖК и ЭЖК. 3.6 Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введении сублетальных количеств зарина, зомана и вещества типа Vx, с применением антидотной терапии Разработанный метод был применен для оценки влияния ФОС на состав СЖК и ЭЖК плазмы крови [128]. Методом PLS-DA на рисунке 20 проиллюстрированы различия в профилях свободных ЖК плазмы крови при введении ½ LD50 зарина, зомана, RVX и терапев73 тической дозы Пеликсима. Можно заметить, что воздействие RVX через 3 часа заметно отличается и от контрольной группы и от групп, которым вводили другие ФОС или Пеликсим. RVX Sarin 1.160 PELIKSIM Soman -2.77 PC2 (20.1% ) Control 2.557 -2.05 PC1 (49.4% ) Рисунок 20 – График счетов старших главных компонент, иллюстрирующий различия в контрольной группе животных и группах ½ LD50 зарина, зомана, RVX и Пеликсим. Результаты обработаны методом PLS-DA Введение крысам ½ LD50 зарина или зомана вызывает уменьшение уровня СЖК через 3 часа на 42% и на 34% соответственно (p < 0,05, как показано на рисунках 21а и 21б). Через 24 часа уровень СЖК возвращается к норме. Все результаты измерений суммированы в таблице 21. Рисунок 21а и 21б – Изменение суммарного содержания СЖК при введении ½ LD50 зарина и зомана крысам (1 серия) 74 Известно [204], что зоман вызывает судороги, которые сопровождаются повышенным катаболизмом фосфолипидов в мозгу крыс с образованием холина и свободных ЖК. Судороги, вызванные иными причинами, например, обратимым ингибитором холинэстеразы неостигмином [148], который не способен фосфорилировать ферменты, также приводят к увеличению уровней СЖК (особенно арахидоновой кислоты) и диацилглицеридов в мозгу, так как происходит активация фосфолипазы А2 [205], причем введение антиконвульсантов после отравления зоманом предотвращает увеличение СЖК в мозгу, но не предотвращает ингибирование AChE. Однако увеличение концентрации СЖК в мозгу не связано с концентрациями СЖК в плазме крови, поэтому остается неясной причина уменьшения концентраций СЖК в первые часы после отравления. С другой стороны, ФОС подавляют действие внеклеточных липаз и внутриклеточной холестерин-эстеразы, что должно приводить именно к уменьшению концентраций СЖК, однако не зафиксировано увеличения уровня ТГ - одних из возможных субстратов липаз [137]. Антидотная тепапия и купирование судорог [206] с помощью препарата «Пеликсим» (реактиватор холинэстеразы и атропин) не оказывает влияния на профиль изменения концентраций СЖК после отравления ФОС, что наглядно продемонстрировано на рисунках 22а и 22б: можно наблюдать снижение уровня СЖК через 3 часа и восстановление через 24 часа. Рисунок 22а и 22б - Изменение суммарного содержания СЖК при введении ½ LD50 зарина (слева) и зомана (справа) и антидотной терапией Пеликсимом 75 400,0 306,5 Конц-ия СЖК, мкг/мл 350,0 300,0 263.9 211.3* 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 Контроль 3 часа 24 часа Рисунок 22 – Изменение суммарного содержания СЖК при введении терапевтической дозы Пеликсима Можно заключить, что механизм, ответственный за уменьшение уровня СЖК после отравления, не связан с судорогами и не связан с ингибированием липаз, так как оксимы, входящие в состав антидотов, представляют собой достаточно реакционноспособные нуклеофильные агенты, способные разрывать различные связи ФОС-фермент для реактивации ферментов [207]. В пользу этого довода говорит и тот факт, что введение Пеликсима крысам без ФОС оказывает аналогичное влияние на уровни СЖК, как пказано на рисунке 24. Рисунок 24а и 24б – Изменение суммарного содержания СЖК при введении ½ LD50 RVX (n=3) и 2×0,4 LD50 RVX (n=6) RVX оказывает иное действие на уровень СЖК в плазме крови в первые часы после отравления. Введение RVX в дозе ½ LD50, как показано на рисунке 24а, вообще не вызывает изменений в концентрации СЖК в течение суток после отравления, в то время, как введение 2×0,4 LD50 RVX вызывает их значимое увеличение на 35% через 3 часа, что наглядно представлено на рисунке 24б. Введение Пеликсима после RVX также приводит к снижению и последующему восстановлению СЖК, что продемонстрировано на рисунке 76 24а. Введение Карбоксима (не содержит атропин) после получения 2×0,4 LD50 RVX не оказывает влияния на профиль СЖК в течение 24 часов (происходит увеличение и последующий спад, как показано на рисунке 25б). Можно заключить, что реактивация ферментов не изменяет профиль СЖК в первые сутки после отравления ФОС, следовательно, такие изменения не связаны напрямую с фосфорилированием ферментов. Введение 2×0,4 LD50 RVX можно охарактеризовать и более отставленными последствиями, как показано на рисунке 27а. Через 24 часа после отравления происходит временный спад концентрации СЖК практически до исходного уровня, а затем постепенный рост, который через 7 дней превышает норму на 81%. При таком увеличении концентрации, СЖК могут проявлять т.н. липотоксичность, так как увеличение доступности СЖК приводит к ингибированию окисления глюкозы и ее захвата мышечными клетками крыс [208]. Повышенная концентрация СЖК в плазме приводит к нарушениям сигнального каскада инсулина [209]. В течение короткого времени экспонирования СЖК (несколько часов) глюкозазависимая секреция инсулина увеличивается, тогда как при хроническом воздействии СЖК секреция инсулина затрудняется [210]. На молекулярном уровне избыточная аккумуляция внутримышечных метаболитов СЖК, таких как Ацил-КоА, церамид и диацилглицериды, может приводить к избыточной активации различных ферментных систем [211]. Терапия Карбоксимом предотвращает увеличение СЖК в течение 7 дней после отравления, что наглядно продемонстрировано на рисунке 26б. Так, в период 0-72 часа СЖК остаются повышенными, однако через 7 дней понижаются до нормы. Введение дозы 2×0,4 LD50 RVX увеличивает концентрации ЭЖК на 30 % через 7 дней относительно контрольной группы, как показано на рисунке 27а. Стоит отметить, что показатель ЭЖК - это валовое количество этерифицированных ЖК, входящих в различные соединения в виде ацильных групп, поэтому невозможно точно установить их фракционный состав. Однако, как было отмечено ранее, изменений уровня ТГ при введении 2×0,4 LD50 RVX не выявлено, следовательно, прирост концентраций ЭЖК происходит за счет других классов липидов крови. Введение Карбоксима предотвращает накопление ЭЖК, что графически представлено на рисунке 26б. Изменения уровней СЖК могут происходить по различным механизмам; в острой фазе концентрации СЖК быстро увеличиваются, затем подключается второй механизм, приводящий к постепенному увеличению концентрации СЖК к концу эксперимента. Установлено, что антидотная терапия купирует отставленные последствия отравления, но не предотвращает токсические эффекты в первые часы. 77 Рисунок 25а и 25б – RVX с лечением пеликсимом и карбоксимом Рисунок 26а и 26б – Изменение суммарного содержания СЖК при введении 2×0,4 LD50 RVX (слева) и лечением карбоксимом (справа), отбор крови до 7 дней Рисунок 27а и 27б – Изменение суммарного содержания ЭЖК при введении 2×0,4 LD50 RVX (слева) и лечением карбоксимом (справа), отбор крови до 7 дней после отравления (n=6) 78 Таблица 23 - Результаты измерений концентраций СЖК и ЭЖК в плазме крови крыс при воздействии различных ФОС и антидотной терапии [128] Группа Контроль (1 серия) Зарин ½LD50 Время отбора проб, ч фон 3 24 Зоман ½LD50 3 24 RVX ½LD50 3 24 Зарин ½LD50 + Пеликсим 3 24 Зоман ½LD50 + Пеликсим 3 24 RVX ½LD50 + Пеликсим 3 24 Пеликсим 3 24 Контроль (2 серия) RVX 2×0,4 LD50 фон 3 24 72 168 RVX 2×0,4 LD50 + Карбоксим 3 24 72 168 Примечание: * - индекс Сумма мкг/мл СЖК, Сумма ЭЖК, мкг/мл 306,5 (277,5;341,9) 195,0* (63,8; 278,3) 253,8 (228,1; 286,6) 206,0* (180,8; 220,7) 259,5 (217,0; 302,7) 308,6 (279,6;358,8) 282,6 (218,0; 383,2) 187,6* (176,5; 199,4) 284,0 (260,8; 306,3) 244,4* (231,0; 257,7) 374,9 (354,7; 395,2) 237,8* (189,5; 284,3) 269,9 (239,6; 412,9) 211,3* (198,4; 224,3) 263,9 (252,6; 275,2) 263,3 1156,0 (213,3; 322,8) (987,0; 1567,5) 358,3* 1235,0 (307,5; 411,8) (1101,4; 1532,3) 231,4 1325,8* (193,0; 330,3) (1152,8;1470,4) 374,5* 1262,4 (335,8; 411,5) (1038,3;1769,1) 459,6* 1585,2* (351,7; 628,9) (1102,7;2159,0) 407,9* 1250,0 (278,8; 505,9) (1125,7;1546,7) 334,2* 1589,4* (295,7; 440,0) (1362,6;1937,6) 363,3* 1278,7 (295,7; 427,1) (909,5;1821,5) 270,4 1257,9 (208,1; 339,5) (966,3;1623,3) P/S равен доли полиненасыщенных ЖК в общем P/SF* , ед.инд. P/SE* , ед.инд. 1,89 (1,71; 2,11) 2,46* (0,80; 3,51) 2,18 (1,96; 2,46) 2,62* (2,30; 2,81) 2,42* (2,02; 2,82) 2,02 (1,83; 2,34) 1,65 (1,27; 2,23) 3,06* (2,88; 3,25) 1,96 (1,80; 2,11) 2,57* (2,43; 2,71) 2,92* (2,76; 3,08) 2,21* (1,76; 2,64) 1,57 (1,39; 2,40) 2,85* (2,68; 3,02) 2,07 (1,98; 2,16) 1,93 3,13 (1,65; 2,19) (3,06; 3,30) 2,52* 3,31 (2,28; 2,63) (3,14; 3,50) 2,18* 3,26 (2,00; 2,37) (3,08; 3,52) 2,61* 3,24 (2,45; 2,70) (3,15; 3,60) 2,63* 3,32 (2,21; 2,75) (3,14; 3,78) 2,68* 3,20 (2,05; 2,88) (3,09; 3,41) 2,61* 3,75* (2,29; 2,85) (3,55; 4,01) 2,49* 2,95 (2,34; 2,55) (2,88; 3,27) 2,41* 3,24 (2,27; 2,72) (3,16; 3,36) содержании свободных или эте-ри- фицированных ЖК. Нижний индекс F – указывает на фракцию свободных ЖК, а E – на фракцию этерифицированных ЖК. 79 Благодаря разработанному методу, стало возможным вычислять не только суммарное содержания СЖК и ЭЖК, но также оценивать качественные изменения состава липидной фракции. Для характеристики качественного изменения профилей ЖК можно использовать соответствующие индексы [212]: SFAF – суммарное количество насыщенных ЖК, PUFAF – суммарное количество полиненасыщенных ЖК, USIF – индекс непредельности (вычисляется по формуле 1), OFAF – суммарное количество нечетных ЖК, а также P/SF (формула 2). Индекс P/S равен доли полиненасыщенных ЖК в общем содержании свободных или этерифицированных ЖК. Нижний индекс F – указывает на фракцию свободных ЖК, а E – на фракцию этерифицированных ЖК. 𝑈𝑆𝐼 = ∑ 𝐹𝐴𝑖 × 𝐷𝐵𝑖 (1) , где FA – концентрация i-той ЖК в мкг/мл; DB – число двойных связей С=С в молекуле i-той ЖК. 𝑃/𝑆𝐹(𝐸) = 𝑃𝑈𝐹𝐴𝐹(𝐸) 𝐹(𝐸)𝐹𝐴 , (2) , где F(E)FA – суммарная концентрация свободных или этерифицированных ЖК в мкг/мл; PUFAF(E) – суммарная концентрация свободных или этерифицированных полиненасыщенных ЖК. Большая часть таких показателей коррелирует с общим изменением СЖК и ЭЖК, однако, доля свободных нечётных ЖК (OFAF) возрастает при отравлении зоманом и зарином, наряду с этим возрастает соотношение P/SF, то есть увеличивается доля ПНЖК в составе СЖК крови. Стоит отметить, что суммарное количество ПНЖК падает согласно общему изменению СЖК, однако доля их возрастает. То есть в первую очередь происходит утилизация насыщенных чётных СЖК. Данная зависимость сохраняется и при введении только Пеликсима. В пользу необходимости вычисления индекса P/SF говорит и тот факт, что все возможные индексы: SFAF, PUFAF, USIF, OFAF в нашем эксперименте показали достоверную корреляцию (критерий корреляции Пирсона, p < 0,05) с общим содержанием СЖК, в отличие от индекса P/SF. Введение ½LD50 RVX не вызывает изменения индекса P/SF, в то же время доза 2×0,4 LD50 RVX приводит к увеличению P/SF на 30% через 3 часа. Тенденции к снижению в течение 7 дней не выявлено. На рисунке 28 приведен график иллюстрирующий изменения профилей СЖК после введения 2×0,4 LD50 RVX в координатах (индекс P/SF; суммарная концентрация СЖК), через дней индекс P/SF выше на 37% от контрольной 80 группы, СЖК выше на 80%. При этом терапия Карбоксимом не влияет на увеличение индекса P/SF – доля ПНЖК среди СЖК остается выше в течение 7 дней. Рисунок 28 – Изменение профилей СЖК после введения 2×0,4 LD50 RVX в координатах (индекс P/SF; суммарная концентрация СЖК). Пунктирной линией соединены точки соответствующие медианам групп [128] Введение 2×0,4 LD50 RVX, равно как и последующая терапия Карбоксимом, не оказывает влияния на индекс P/SE, этерифицированных форм ЖК. Таким образом, индекс P/SF является более чувствительным маркером интоксикации ФОС по сравнению с P/SE. Таким образом, с помощью разработанного метода впервые описано воздействие высокотоксичных ФОС на профили СЖК плазмы крови. Детальное определение ЖК показало, что RVX проявляет необычное влияние на профиль ЖК, в отличие от зарина и зомана. Вместе с тем, действие RVX на липидный обмен отличается от действия значительно менее токсичных фосфорорганических пестицидов: выявлены признаки гиперлипидемии, а именно увеличение числа этерифицированных на 30% и свободных форм ЖК в плазме крови на 81% через неделю после отравления. Такое значительное повышение уровней СЖК в крови в поздние сроки после отравления может служить одной из причин развития гипергликемии. Механизм возникновения гиперлипидемии явно отличается от механизмов токсического действия фосфорорганических пестицидов, так как зоман и RVX не вызывают увеличения концентраций триглицеридов в плазме крови. RVX обладает значительно более избирательным токсическим действием, так как доза ½LD50 RVX ингибирует AChE, но не влияет на липидный обмен в первые 24 часа. Увеличение дозы до 2×0,4 LD50 RVX приводит к нарушениям липидного обмена. Причем стоит отметить, что уровень концентраций СЖК в плазме крови при воздействии ФОС не коррелирует с уровнями СЖК в мозгу. Сравнение изменений профилей СЖК при отравлении ФОС с последующей антидотной терапией и без нее позволяет предположить, что к изменениям концентраций СЖК 81 в первые часы и после первых суток отравления RVX приводят различные механизмы. Антидотная терапия купирует отставленные последствия отравления, но не купирует токсические эффекты ФОС в первые часы [128]. Помимо общего изменения концентраций СЖК, измерение профилей позволяет характеризовать качественное изменение липидного состава крови: при отравлении зоманом и зарином в первую очередь из крови утилизируются насыщенные ЖК, а при отравлении RVX происходит обогащение фракции СЖК полиненасыщенными ЖК. Терапия отравлений RVX препаратом Карбоксим позволяет нормализовать концентрации СЖК и ЭЖК в плазме крови, однако такая антидотная терапия не оказывает влияния на повышенное содержание свободных полиненасыщенных ЖК. Измерение профилей свободных и этерифицированных форм ЖК является важным инструментом для определения нарушений липидного обмена, а полученные данные позволяют более полно охарактеризовать состояние тканей и органов в период острой интоксикации ФОС и в более отдаленные сроки. 3.7. Влияние мельдония на метаболизм жирных кислот В настоящей работе было оценено влияние на организм не только отравляющих веществ, но также фармпрепаратов на примере мельдония. Следует отметить, что, помимо индексов полиненасыщенности и непредельности, в исследованиях является полезным и определение индексов активности десатураз и элонгазы, что становится возможным после количественного определения индивидуальных СЖК и ЭЖК. Изменение индексов активности свидетельствуют об изменении метаболизма не только ЖК, но и метаболизма организма в целом. Активация гликолиза под воздействием мельдония может приводить к изменениям в метаболизме ЖК, поэтому нами было предложено определить влияние мельдония на метаболизм ЖК. Оценка влияния мельдония на концентрации ЖК и их метаболитов в плазме крови произведена впервые и позволила получить новую информацию о механизме действия лекарственного средства. На первом, фоновом, этапе исследования было проанализировано изменение ЖК в плазме крови в течение дня, начиная с утра, когда отбор крови проводился натощак, а затем в динамике после приема пищи. Было установлено, что после приема пищи концентрации СЖК и ЭЖК начинают возрастать, достигая максимума в 8 ч. Эта тенденция проиллюстрирована на рисунках 29 и 30. Также были определены максимумы индивидуальных кислот и 82 отслежена среднесуточная динамика изменения в плазме крови. На втором этапе было показано, что однократное употребление мельдония предотвращает повышение содержания СЖК и ЭЖК после употребления пищи практически до утреннего уровня. Рисунок 29 – Изменения концентраций СЖК в плазме крови. Знаком «*» отмечены статистически значимые изменения между двумя группами (p = 0,019) Рисунок 30 – Изменения концентраций ЭЖК в плазме крови. Знаком «*» отмечены статистически значимые изменения между двумя группами (p = 0,031) Суммарные концентрации ЭЖК имеют тенденцию к увеличению после приема пищи при воздействии мельдония, при этом разница между фоновой и контрольной группами статистически значима. 83 В настоящей работе выявлено, что добровольцев, участвовавших в исследовании, можно разделить на две группы, исходя из данных по соотношению концентраций ω-6 и ω3 полиненасыщенных ЖК в крови. В первой группе этот показатель составил 5,1 (3,6; 7,2), а во второй – 14,3 (8,4; 22,0), различия между группами статистически значимы (p < 0,0001). Такое разделение оказалось необходимым, так как при приеме мельдония в первой группе изменение индекса отсутствовало, а во второй происходило его снижение после приема пищи. Этот факт отражен наглядно на рисунке 31. Стоит отметить, что корреляция между суммарной концентрацией СЖК и соотношением концентраций ω-6 и ω-3 – отсутствует (коэффициент корреляции Пирсона меньше критического значения). Рисунок 31 – Изменение соотношения концентраций ω-6 и ω-3 полиненасыщенных свободных ЖК в крови. Знаком «*» отмечены статистически значимые изменения между двумя группами (p = 0,045) Выявлено, что однократное употребление мельдония препятствует повышению индекса ω-6/ω-3 после приема пищи, разница составляет 38 %. Установлено, что снижение индекса происходит за счет уменьшения концентрации ω-6 полиненасыщенных ЖК, в то время как концентрации ω-3 остаются неизменными. Выявленные воздействия мельдония на метаболизм ЖК суммированы в таблице 24. Отсутствие естественного увеличения концентраций СЖК и ЭЖК в плазме крови после приема пищи может свидетельствовать об активации гликолиза, и преимущественном использовании глюкозы в качестве энергетического субстрата, что приводит к замедлению процессов липолиза и транспорта липидов. Положительным влиянием мельдония на 84 метаболизм можно назвать снижение соотношения ω-6/ω-3 полиненасыщенных ЖК, что может свидетельствовать о снижении рисков середчно-сосудистых заболеваний. Таблица 24 – Краткое описание выявленных воздействий мельдония на метаболизм ЖК Субстраты/ Возможный механизм Эффект метаболиты Отсутствует естественное увеличение концентраций Свободные ЖК после приема пищи. Преимущественное использование Суммарная концентрация глюкозы в качестве энергетичеснижена на 37 %. ского субстрата приводит к замедОтсутствует естественное лению процессов липолиза и трансувеличение концентраций порта липидов Этерифицированные после приема пищи. ЖК Суммарная концентрация снижена на 34 %. Отношение концен- Снижает концентрации ω-6 траций ω-6 к ω-3 по- ПНЖК. Индекс ω-6/ω-3 снилиненасыщенным жен после приема пищи на Не ясен. свободным жирным 38%. кислотам Определение индексов активности десатураз, а также отношение ω-6/ω-3 позволило в полной мере оценить влияние фармпрепарата на организм человека. Разработанная методика определения ЖК может быть использована для оценки воздействия препаратов на метаболизм ЖК. 3.8 Исследование энергетического метаболизма крыс при действии фторацетата Действие ФА на организм является довольно изученным материалом, однако всестороннее исследование изменений, происходящих при отравлениях, позволят в полной мере понять механизмы воздействия отравляющего вещества. Помимо ЖК, в плазме крыс после интоксикации были определены уровни цитрата, глюкозы, лактата, а также аминокислот. Общее исследование плазмы крови показало, что уровень цитрата в плазме повышается в два раза уже через час после отравления, и это единственный показатель плазмы крови крыс, который оставался повышенным в течение всего периода проведения исследований. В ходе исследований не было обнаружено отклонений в уровне глюкозы в плазме крови во все сроки после отравления крыс ФА в дозе ½ЛД50, но в печени наблюдается повышение уровня глюкозы почти в 3 раза, в сердце – в 2 раза, в мозге – в 2-3 раза [167]. Таким образом, локальное нарушение утилизации глюкозы в органах не отражается на системном уровне глюкозы, который, следовательно, не может служить надежным критерием интоксикации ФА и степени тяжести тканевой гипоксии. Другой источник углеводов, гли- 85 коген, резко сокращается в печени и мозге крыс в первые часы после отравления, но восстанавливается через сутки. Уровень лактата достоверно снижается при интоксикации ФА в сердце и мозге крыс через 3 и 6 часов, в печени через 3 часа, и лишь в почках уровень лактата не меняется. В плазме крови крыс уровень лактата снижался в первые часы после отравления. Повышение концентрации некоторых аминокислот в плазме крови крыс через 3 часа после отравления ФА свидетельствует об усилении распада белка в скелетных мышцах. По данным других исследователей, концентрация глутамина в плазме артериальной крови увеличивается в два раза в течение 1-3 часов при остром ацидозе [213], главным образом вследствие усиленного выхода глутамина из мышечной ткани [214]. Однако при хроническом метаболическом ацидозе уровень глутамина в плазме артериальной крови понижается до 70% от нормы [215]. В экспериментах наблюдали некоторое снижение уровня глутамата и значительное снижение глутамина в плазме крови крыс, что может свидетельствовать о невысокой степени ацидоза, постепенном его развитии, невысокой активности АТФ-зависимой глутаминсинтазы скелетных мышц и быстрой утилизации имеющегося и появляющегося глутамина эндотелием сосудов и почками. Исследования жирно-кислотного состава плазмы крови крыс показали, что через 3 часа после отравления ФА концентрации ТГ и СЖК в плазме крови крыс изменились в противоположных направлениях: уменьшение ТГ и увеличение СЖК, вплоть до 75% от уровня контроля. Через 24 ч уровень ТГ оставался пониженным, а уровень СЖК снизился несколько ниже уровня контроля. С помощью ГХ-МС мы проанализировали изменения кноцентраций 36 ЖК и выявили существенные изменения 7 из них: додекановой (C12:0), пальмитолеиновой (C16:1n7), пальмитиновой (C16:0), линолевой (C18:2n6c), олеиновой(C18:1n9c), элаидиновой (C18:1n9t) и цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновой кислоты (C22:6n3). В таблице 25 представлены изменения содержания триглицеридов и СЖК после острой интоксикации натриевой солью фтор ацетата у крыс, пероральная доза составила 2 мг кг-1 (1/2LD50). Снижение уровня ТГ объясняется резким снижением потребления пищи вследствие угнетения ЦНС, а также обусловлено усилением активности липопротеинлипазы эндотелия за счет инсулина, выброс которого может усиливаться в результате повышения уровня глюкозы в тканях и нарастающего доминирования парасимпатической регуляции при интоксикации ФА [216]. 86 Таблица 25 - Изменение содержания триглицеридов и СЖК после острой интоксикации фторацетатом у крыс, пероральная доза составила 2 мг/кг (1/2LD50) [167] Триглицериды Суммарная концентрация СЖК Группа mM uM Контроль 1,62 ± 0,24 100,6 ± 13,6 3ч 0,96 ± 0,11 174,6 ± 9,46 24 ч 0,98 ± 0,13 82,4 ± 16,8 В более поздние сроки достоверное снижение СЖК свидетельствует об усиленном их использовании в качестве энергетического субстрата – утилизация, очевидно, неполная, но важно получение восстановительных эквивалентов в реакциях КоА-зависимого окисления ЖК. При интоксикации ФА в тканях экспериментальных животных главными энергетическими источниками являются лактат, глутамат и глутамин. Глюкоза и СЖК не являются энергетическими субстратами в первые часы после отравления, но могут быть утилизированы в более позднем периоде. На рисунке 32 приведена иллюстрация изменения индекса активности элонгазы и Δ5-десатуразы после введения крысам дозы эквивалетной ½LD50 ФА. Выявлено нарушение, а именно снижение биосинтеза и метаболизма ЖК. * * * Рисунок 32 – Индекс активности элонгазы (слева) и Δ5-десатуразы (справа) после введения ½DL50 ФА. В результате можно заключить, что исследование влияния ФА на профили ЖК позволило получить новые сведения о механизме действия токсиканта, входящего в группу т.н. метаболических ядов, к которым относится значительная часть препаратов, используемых, в том числе, в качестве химиотерапии при онкологических заболеваниях. Полезным оказалось определение и общего количество СЖК, а также изменение концентрации индивидуальных кислот, что позволило определить активность элонгазы и Δ5-десатуразы. 87 3.9. Изменения профилей жирных кислот тканей печени и головного мозга крыс при хроническом ингаляционном воздействии малых доз алифатических углеводородов Хроническое воздействие углеводородов приводит к целому ряду нарушений деятельности различных систем организма, в частности оно приводит к атрофии тестикул, энцефалопатии, влияет на печень и почки животных и человека. Несмотря на имеющиеся многочисленные сведения о влиянии УВ на морфофункциональные и клинико-биохимические показатели, механизмы возникновения патологий нуждаются в уточнении. Хотя возникновение нейропатии обычно связывают с накоплением нейрофиламентов, точный механизм возникновения этого процесса неизвестен. В работе [217] впервые предпринята попытка протеомного исследования токсического действия 2,5-гександиона: выявлено уменьшение экспрессии белков, обеспечивающих физическую целостность аксонов, редокс-баланс, фолдинг. В то же время, повышается экспрессия белков, отвечающих за энергетический обмен. Ранее в НИИ ГПЭЧ было впервые исследовано хроническое ингаляционное воздействие низких доз алифатических углеводородов на метаболический профиль плазмы крови лабораторных животных с использованием сочетания ГХ-МС и ВЭЖХ-МС высокого разрешения [218]. Выявлены маркеры нарушения биосинтеза полиаминов, метаболизма желчных кислот, функции почек, нарушения цикла мочевины, и снижения синтеза триглицеридов и глицерофосфолипидов, что свидетельствует о снижении функциональной активности печени. Между тем в плазме крови не были выявлены метаболические маркеры воздействия на нервную систему, поэтому было решено провести дополнительное исследование с целью получения новых сведений о возможном механизме токсического действия низких доз УВ на головной мозг и печень крыс, в частности о воздействии УВ на состав липидов в этих органах. Для решения этой задачи необходимо было оптимизировать разработанную двухстадийную методику для количественного определения ЖК в образцах гомогенатов органов и тканей. Существующие методы определения липидного профиля гомогенатов органов и тканей можно разделить на две категории: с использованием ГХ-МС и ВЭЖХ-МС высокого разрешения. Схема анализа представлена на рисунке 34. 88 Рисунок 34 – Общая схема хроматографических методов определения липидного профиля органов и тканей Первой стадией чаще всего является жидкостная экстракция, причем подавляющее большинство исследователей использует один метод [219]. Вторая стадия включает ВЭЖХразделение и масс-спектрометрическое детектирование. Третья - применение методов нецелевой липидомики. Липидомика является разделом метаболомики, занимающимся количественным анализом всего разнообразия липидов (липидома) биологических объектов. В научных исследованиях масс-спектрометрический анализ наиболее часто применяется в комплексе с высокоэффективной жидкостной хроматографией, позволяющей выполнить предварительное разделение веществ анализируемой пробы [220]. Для этого созданы и активно разрабатываются различные базы данных аналитических характеристик, крупнейшими из которых являются LIPID MAPS [221,222], которая содержит масс-спектры, классификации и протоколы анализа 10000 различных липидов и LipidBank [223,224] - японская библиотека, в состав которой входит более 7000 липидов, включая экспериментальные данные и масс-спектры. Примером использования ГХ-МС и предварительного разделения и очистки образцов является работы [225,226]. Предложенная процедура совместного определения СЖК и ЭЖК в плазме крови была распространена на образцы гомогенатов. Для этого потребовалось ввести стадию разбавления пробы, поскольку концентрации ЭЖК в гомогенатах существенно выше, чем в крови. В остальном никаких видоизменений методики не потребовалось. На рисунке 33 представлены масс-хроматограммы реконструированные по характеристичным ионам ЭЖК в образце печени и головного мозга. Можно заметить, что никаких принципиальных отличий от результатов подготовки образцов плазмы крови (см. рисунок 15) не наблюдается. 89 A b u n d a n c e T IC : 2 0 .0 2 7 1 8 0 0 0 0 0 E t_ 3 6 _ M .D \ d a ta .m s 2 3 .6 4 6 ЭЖК образца мозга 1 6 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 2 5 .8 2 8 1 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 2 6 .8 1 1 2 6 .0 2 2 2 5 . 12 56 3. 5 1 9 2 1 .6 3 5 2 0 0 0 0 0 1 6 .0 9 6 1 7 .9 4 1 2 9 .9 7 8 3 2 .9 2 3 3 1 .4 7 5 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0 2 4 .0 0 2 6 .0 0 2 8 .0 0 3 0 .0 0 3 2 .0 0 3 4 .0 0 A b u n d a n c e T im e - - > 2 1 6 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 . 0 1 6 . 0 1 7 9 6 . 9 4 2 E 3 t _ . 6 5 8 . D 4 2 5 \ d . 9 1 . 6 4 a 0 t a . m s 2 2 4 8 3 2 3 5 4 . 1 2 4 . 3 2 . 1 . 6 7 8 2 1 5 1 26 7 6. . 9 0 . 41 1 e : 0 1 i m I C 3 ЭЖК образца печени 2 T T 5 6 . 0 0 1 9 1 8 9 3 2 9 8 . 0 7 0 . 32404. 9 2 3 . 1 0 2 02 31 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 9 7 6 . 8 1 8 7 2 2 6 6 . .3 5 4 1 9 9 2 9 . 9 7 4 . 97 27 0 3 3 2 2 . 5 2 5 . 2 3 4 . 3 1 . 0 5 6 2 9 7 0 8 2 9 9 . .5 9 3 1 2 2 2 2 666 . 4 2. 7 0 0 9 4 2 2 9 ..3 8 6 0 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0 3 4 . 0 1 7 0 - - > Рисунок 33 - Масс-хроматограммы реконструированные по характеристичным ионам ЭЖК в образце печени и мозга В таблицах 26 и 27 представлены результаты определения СЖК и ЭЖК в гомогенатах головного мозга и печени интактных крыс. Результаты приведены в виде медиана (персентиль 5% и 95%). 90 Таблица 26 – Содержание ЭЖК в тканях печени и головного мозга интактных крыс Содержание ЭЖК, мкг/г органа ЖК Печень Мозг Медиана 5%1 95%2 Медиана 5%1 95%2 Ундециловая кислота 0,3 0,2 0,4 0,4 0,3 0,5 Лауриновая кислота 1,7 1,4 2,0 1,3 1,1 1,6 Тридекановая кислота 1,2 0,9 1,3 0,7 0,6 0,9 Миристолеиновая 2,9 2,1 5,3 0,0 0,0 0,0 кислота Миристиновая кислота 124,6 70,2 136,1 154,8 140,0 170,8 цис-10-пентадекановая Пентадекановая кислота 197,3 115,7 208,1 92,6 86,4 118,4 Пальмитолеиновая 658,6 408,4 898,8 687,0 477,9 929,0 кислота Пальмитиновая кислота 20325,3 16949,3 23279,1 30917,4 20784,4 40258,2 цис-10-гептадекановая Маргариновая кислота 601,2 440,4 701,8 388,8 243,1 426,6 Гамма-линоленат 293,0 254,0 344,4 8,2 8,0 13,4 Линолевая кислота 98,7 75,4 148,0 185,6 140,2 243,0 Олеиновая кислота 5837,3 4093,2 7734,7 33019,8 20906,4 38563,5 Линолелаидат Линоленовая кислота 165,4 136,7 229,0 15,7 14,1 21,8 Элаидиновая кислота 2714,1 1716,6 3107,2 8247,7 4898,1 8911,9 Стеариновая кислота 14122,0 11501,2 16360,4 25459,7 17919,4 32885,5 Арахидоновая кислота 23596,0 22286,0 25365,5 20810,9 15651,6 29451,9 цис-5,8,11,14,17эйкозапентаеновая 358,0 338,4 474,2 221,4 206,0 247,7 кислота цис-8,11,14735,0 587,3 834,7 573,8 419,0 687,6 Эйкозатриеновая цис-11,14327,2 258,1 438,1 383,1 259,2 414,1 эйкозадиеновая кислота Гондоиновая (цис-11158,3 127,3 185,8 4131,0 2841,6 5764,4 эйкозеновая кислота) цис-11,14,17Эйкозатриеновая 13,4 4,4 14,9 кислота Арахиновая кислота 58,9 49,8 63,2 479,1 335,4 583,5 Генэйкозановая кислота 2,1 1,8 2,2 73,6 65,8 48879,1 цис-4,7,10,13,16,19докозагексаеновая 3541,9 3349,1 4043,3 20806,3 15910,9 28241,4 кислота цис-13,16-докозеновая 6,0 5,7 6,3 62,4 60,3 70,6 кислота Эру́ковая кислота 11,2 9,6 12,9 380,5 305,0 512,7 Бегеновая кислота 13,5 12,4 15,6 389,5 313,2 465,7 Трикозановая кислота 4,7 3,3 4,8 293,5 209,1 351,8 Нервоновая кислота 7,5 5,5 8,5 331,6 258,0 396,1 Лигноцериновая 25,6 18,0 31,6 425,8 332,2 528,3 кислота Примечание: 1 – персентиль 5%, 2 – персентиль 95% 91 Таблица 27 – Содержание СЖК в тканях печени и головного мозга крыс Содержание СЖК, мкг/г органа ЖК Печень Печень Медиана 5%1 95%2 Медиана 5%1 Ундециловая кислота 0,0 0,0 0,0 0,4 0,3 Лауриновая кислота 1,0 0,7 2,0 2,0 1,6 Тридекановая кислота 0,4 0,3 0,8 0,7 0,6 Миристолеат 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Миристиновая кислота 3,3 1,1 5,6 11,4 5,2 цис-10-пентадеценоат 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Пентадекановая 3,1 1,1 6,7 4,1 2,3 кислота Пальмитолеиновая 12,6 4,2 21,1 27,9 22,2 кислота Пальмитиновая кислота 290,8 130,6 492,3 828,2 641,5 цис-10-гептадеценоат 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Маргариновая кислота 8,2 3,3 17,1 11,1 7,8 Гамма-линоленат 5,9 2,2 10,4 0,9 0,7 Линолевая кислота 1,7 0,9 2,8 3,8 3,5 Олеиновая кислота 104,6 37,0 184,4 875,4 790,3 линоленлаидат 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Линоленовая кислота 3,4 1,6 4,7 0,0 0,0 Элаидиновая кислота 43,5 14,3 75,6 211,5 181,0 Стеариновая кислота 197,9 87,7 320,5 554,2 485,2 Арахидоновая кислота 492,3 193,6 885,3 767,3 718,5 цис-5,8,11,14,17эйкозапентаеновая 4,5 2,4 17,9 4,4 3,9 кислота цис-8,11,1413,6 4,5 25,4 15,2 14,8 Эйкозатриеновая цис-11,146,6 2,5 10,9 8,7 8,2 эйкозадиеновая кислота Гондоиновая (цис-112,6 1,1 4,2 101,3 77,5 эйкозеновая кислота) цис-11,14,17Эйкозатриеновая 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 кислота Арахиновая кислота 1,1 0,5 1,7 10,7 6,6 Генэйкозановая кислота 0,5 0,3 0,9 1,7 1,3 цис-4,7,10,13,16,19докозагексаеновая 116,1 46,2 207,2 1104,3 1047,8 кислота цис-13,16-докозеновая 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 кислота Эру́ковая кислота 0,6 0,5 1,2 9,4 7,8 Бегеновая кислота 1,0 0,8 1,9 10,0 8,6 Трикозановая кислота 0,0 0,0 0,0 5,9 5,1 Нервоновая кислота 0,6 0,5 1,4 9,8 7,8 Лигноцериновая 0,9 0,7 2,1 9,8 8,1 кислота Примечание: 1 – персентиль 5%, 2 – персентиль 95% 92 95%2 0,5 2,7 0,9 0,0 11,9 0,0 4,2 30,8 923,9 0,0 11,6 1,2 4,1 970,6 0,0 0,0 256,9 628,6 825,2 5,1 15,4 10,2 140,9 0,0 11,7 1,9 1197,4 0,0 12,9 12,7 6,9 11,1 12,0 Нарушения редокс-гомеостаза сопровождают многие патологические состояния и имеют особое значение при острых химических отравлениях [227,228]. Многие ксенобиотики индуцируют образование активных форм кислорода (АФК), которые могут участвовать в их биотрансформации. В то же время, некоторые метаболиты обладают свойствами свободных радикалов и оказывают повреждающее действие на клетки организма [229]. Углеводороды не способны сами по себе образовывать свободные радикалы, однако могут быть вовлечены в механизм возникновения оксидативного стресса опосредованно. Так, показано, что экспонирование гексаном [181,182,230] приводит к избыточному образованию пероксида водорода и МДА – одного из основных продуктов перекисного окисления липидов. Воздействие свободных радикалов на ПНЖК и состав ЖК вызывает изменения в мембранах клеток [231]. В частности, ПНЖК играют важную роль в качестве компонента фосфолипидов в биологической мембране, они существенно менее устойчивы к окислительному стрессу, по сравнению с насыщенными ЖК или мононенасыщенными ЖК [232]. Изменения профилей ЖК, в особенности увеличение транс-ЖК и уменьшение цис-ЖК, наблюдалось в печени крыс, пораженной арсенатом натрия [233]. Головной мозг Среди химических компонентов головного мозга особое место занимают липиды, высокое содержание и специфическая природа которых придают мозговой ткани характерные особенности. Значительную часть липидной фракции составляют эфиры холестерола. Любые нарушения метаболизма холестерола могут вызывать нейротоксичность [234]. Точное соответствие между ингибированием стерологенеза и развитием периферической нейропатии неизвестно. Однако описано ингибирование биосинтеза стерола 2,5-гексанодионом [235]. Холестерол это липидный компонент нейрофиламентов который считается основным липидом свободных от миелина аксонов [236]. Уменьшение содержания холестерола в нервной ткани может изменять текучесть мембран нервов и изменять влияние АТФаз. Помимо эфиров холестерола в группу липидов головного мозга входят фосфоглицериды, холестерин, сфингомиелины, цереброзиды, ганглиозиды и очень небольшое количество нейтрального жира, как показано в таблице 28. Многие липиды нервной ткани находятся в тесной взаимосвязи с белками, образуя сложные системы протеолипидов. В сером веществе головного мозга фосфоглицериды составляют более 60% от всех липидов, а в белом веществе – около 40%. В белом веществе содержание холестерина, сфингомиелинов и особенно цереброзидов больше, чем в сером веществе. 93 Таблица 28 – Липидный состав нервной ткани [237] Общее содержание липидов % от сухой массы В % от общих липидов Холестерин Цереброзиды Ганглиозиды Фосфатидилэтаноламины Фосфатидилхолины Фосфатидилсерины Фосфатидилинозитолы Плазмалогены Сфингомиелины Серое вещество 32,7 Белое вещество 54,9 Миелин 70,0 22,0 5,4 1,7 22,7 26,7 8,7 2,7 8,8 6,9 27,5 19,8 5,4 14,9 12,8 7,9 0,9 11,2 7,7 27,7 22,7 3,8 15,6 11,2 4,8 0,6 12,3 7,9 Далее представлены результаты определения СЖК и ЭЖК в гомогенатах головного мозга и печени крыс экспонированных малыми дозами УВ. В мозге крыс обнаружено снижение суммарного содержания ЭЖК, в среднем в 2 раза. Достоверные изменения наблюдаются только в группе подвергавшейся воздействию максимальной дозы, однако тенденция к снижению сохраняется и в других группах, как показано на рисунке 36. Суммарное содержание ЭЖК в мозге, мкг/мг 250,0 200,0 * 150,0 100,0 50,0 0,0 Контроль Группа 1 Группа 2 Группа 3 Рисунок 36 – Изменение суммарной концентрации ЭЖК в головном мозге крыс при различных дозах экспонирования УВ В работе [238] показано, что нейропатия, вызванная воздействием 2,5-гександиона и 2,5-гександиола, приводит к изменению состава липидов мозга и седалищного нерва крыс. Выявлено уменьшение веса мозга по сравнению с контрольной группой (на 20%), селезенки и тимуса, а также уменьшение содержания стеролов в полном гомогенате мозга и миелине. Авторы отмечают, что изменение в составе липидов мозга может быть одним из ключевых факторов возникновения нейропатии. 94 Методами факторного анализа в образцах головного мозга было выявлено увеличение концентраций длинноцепочечных СЖК, и снижение концентраций свободных ПНЖК, что представлено на рисунках 37-40. Рисунок 37 – Изменение содержания ненасыщенных ЖК в составе фракции СЖК в головном мозге крыс при различных дозах экспонирования УВ Рисунок 38– График счетов старших главных компонент, иллюстрирующий различия в составе ЭЖК головного мозга между контрольной группой животных и группами, которые были экспонированы низкой, средней и высокой дозой УВ. Результаты обработаны методом OPLS-DA. Рисунок 39 – График счетов старших главных компонент, иллюстрирующий различия в составе ЭЖК головного мозга между контрольной группой животных и группами, которые были экспонированы низкой, средней и высокой дозой УВ. Результаты обработаны методом OPLS-DA. 95 Рисунок 40 – График счетов старших главных компонент, иллюстрирующий различия в составе СЖК головного мозга между контрольной группой животных и группами, которые были экспонированы низкой, средней и высокой дозой УВ. Результаты обработаны методом PLS-DA. Печень При анализе гомогенатов печени было обнаружено недостоверное уменьшение индекса Δ5-десатуразы (отношения арахидоновой к эйкозатриеновой кислоте), причем эффект дозозависимый. Также выявлено уменьшение степени ненасыщенности кислот как индикатор вязкости клеточных мембран [239]. В связи с перекисным окислением липидов, выявленное увеличение индекса вязкости мембран (SFA/UFA) в печени (p < 0,05) может вносить вклад в потерю целостности мембран. Более того, уменьшение концентрации арахидоновой кислоты влияет на текучесть клеточных мембран [240]. В печени также выявлено снижение индекса Δ5, но уже статистически значимое (p < 0,001); значительно (p < 0,01) повышено отношение концентраций, насыщенных к кислотам к ПНЖК, что представлено на рисунке 41. Суммарное содержание СЖК в печени при этом дозозависимо уменьшается (рис. 42). * Рисунок 41 – Изменение суммарной отношений концентраций насыщенных кислот к ПНЖК в печени крыс при различных дозах экспонирования УВ 96 Суммарное содержаниеСЖКв печени, мкг/мг 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 * 0,0 Контроль Группа 1 Группа 2 Группа 3 Рисунок 42 – Изменение суммарной концентрации СЖК в печени крыс при различных дозах экспонирования УВ Методами факторного анализа в образцах печени было выявлено увеличение концентраций свободных линолевой и линоленовой кислот. Рисунок 43 – График счетов старших главных компонент, иллюстрирующий различия в составе ЭЖК печени между контрольной группой животных и группами, которые были экспонированы низкой, средней и высокой дозой УВ. Результаты обработаны методом PLS-DA. Рисунок 44– График счетов старших главных компонент, иллюстрирующий различия в составе СЖК печени между контрольной группой животных и группами, которые были экспонированы низкой, средней и высокой дозой УВ. Результаты обработаны методом PLSDA. 97 Впервые описано хроническое ингаляционное воздействие низких доз алифатических углеводородов на профили СЖК и ЭЖК головного мозга и печени крыс. В мозге крыс обнаружено снижение суммарного содержания ЭЖК, в среднем в 2 раза. Выявлено значительное снижение содержания суммарных концентраций СЖК в печени. Возможно этот эффект можно объяснить следствием снижения синтетической функции печени вод воздействием токсичных соединений. Основным преимуществом разработанного метода определения СЖК и ЭЖК в гомогенатах органов и тканей является точный количественный анализ, по сравнению с методами нецелевой липидомики, и высокая чувствительность, позволяющая определять даже минорные ЖК. Простота метода и отсутствие стадии выделения липидных фракций позволяют проводить профилирование, определять СЖК и ЭЖК, вычислять различные количественные индексы и параметры (ω-6/ω-3 и пр.), и, таким образом, выявлять токсическое действие химических соединений на органы лабораторных животных. Использование разработанного метода определения жирнокислотного состава органов и тканей лабораторных животных позволит внести существенный вклад в практику медико-биологических исследований и гигиенического регламентирования вредных химических соединений. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В данной работе выполнено совершенствование методов количественного хроматомасс-спектрометрического определения ЖК в биологических образцах. Были разработаны рекомендации по хроматомасс-спектрометрическому определению СЖК и ЭЖК в биологических образцах. Перечень целевых соединений включает 12 насыщенных кислот (С11С24) и 20 ненасыщенных кислот (С16-С24), в том числе ω-3, ω-6, ω-9 и полиненасыщенные ЖК. Пределы обнаружения не более 0,02 мкг/мл, относительная ошибка определения не выше 15 %, при этом мягкие условия подготовки проб исключают побочные реакции переэтерификации, окисления и гидролиза аналитов. Составлены рекомендации, включающие в себя описание надлежащих условий хранения биологических образцов для повышения надежности определения исходного состава СЖК и ЭЖК. Показано, что образцы плазмы крови сохраняют пригодность для анализа в течение одного цикла замораживания/размораживания и до 14 дней хранения при -20 °С. СЖК проявляют большую стабильность, так, их определение возможно и после двух циклов замораживания/размораживания, и даже после хранения образцов при +4 °С в течение двух дней. Использование добавок антиоксиданта в плазму крови перед хранением не поз98 воляет увеличить продолжительность хранения или количество циклов замораживания/размораживания. Понижение температуры образцов до -70 °С изменяет первоначальный состав СЖК и ЭЖК. Разработанные надежные и валидированные методики определения ЖК позволили внести значительный вклад в практику лабораторно-клинической диагностики, а также гигиенического регламентирования вредных химических веществ, в том числе фосфорорганических соединений и предельных углеводородов. Применение разработанного метода в практике токсикологических исследований НИИ ГПЭЧ позволило впервые охарактеризовать изменения качественного и количественного состава свободных и этерифицированных ЖК плазмы крови при воздействии различных вредных и сильнодействующих химических соединений, таких как фторацетат, зарин, зоман и российское вещество Vx без применения и с применением антидотных препаратов, а также алифатических углеводородов. Впервые выявлено влияние мельдония на метаболизм ЖК у здоровых добровольцев-испытуемых. Внедрение разработанной методики позволило впервые описать воздействие высокотоксичных ФОС на профили СЖК плазмы крови. Детальная идентификация ЖК показала, что RVX проявляет необычное влияние на профиль ЖК, в отличие от зарина и зомана. Вместе с тем, действие RVX на липидный обмен отличается от действия значительно менее токсичных фосфорорганических пестицидов: выявлены признаки гиперлипидемии, а именно увеличение числа этерифицированных на 30% и свободных форм ЖК в плазме крови на 81% через неделю после отравления. Помимо общего изменения концентраций СЖК, измерение профилей позволяет характеризовать качественное изменение липидного состава крови: при отравлении зоманом и зарином в первую очередь из крови утилизируются насыщенные ЖК, а при отравлении RVX происходит обогащение фракции СЖК полиненасыщенными ЖК. Терапия отравлений RVX карбоксимом позволяет нормализовать концентрации СЖК и ЭЖК в плазме крови, однако такая антидотная терапия не оказывает влияния на повышенное содержание свободных полиненасыщенных ЖК. Можно предположить, что возникновение хронической профессиональной патологии у лиц, работавших ранее на производстве химического оружия, связано именно с нарушениями липидного обмена, характерными для RVX. Примером использования профилей ЖК для вычисления отношений ω-6/ω-3 ЖК может служить выявленное воздействие мельдония на метаболизм ЖК. Показано отсутствие естественного увеличения концентраций СЖК и ЭЖК в плазме крови после приема пищи, что может свидетельствовать об активации гликолиза, и преимущественном 99 использовании глюкозы в качестве энергетического субстрата, что приводит к замедлению процессов липолиза и транспорта липидов. Положительным влиянием мельдония на метаболизм можно назвать снижение соотношения ω-6/ω-3 полиненасыщенных ЖК, что может свидетельствовать о снижении рисков сердечно-сосудистых заболеваний. Другим примером использования профилей ЖК для вычисления индексов активности ферментов, участвующих в метаболизме липидов, является установленное воздействие метаболического яда – фторацетата - на индексы активности элонгазы и Δ5-десатуразы. Выявлено снижение биосинтеза и метаболизма ЖК. Можно заключить, что исследование влияния ФА на профили ЖК позволило получить новые сведения о механизме действия токсиканта, входящего в группу т.н. метаболических ядов, к которым относится значительная часть препаратов используемых, в том числе, в качестве химиотерапии при онкологических заболеваниях. Полезным оказалось определение и общего количества СЖК, а также изменение концентрации индивидуальных кислот, что позволило определить активность элонгазы и Δ5-десатуразы. Показано, что разработанный двухстадийный метод позволяет проводить определение СЖК и ЭЖК в образцах гомогенатов органов (печень и головной мозг) без видоизменения методики и дополнительных стадий подготовки и очистки проб. В результате впервые описано хроническое ингаляционное воздействие низких доз алифатических углеводородов на профили СЖК и ЭЖК головного мозга и печени крыс. В мозге крыс обнаружено снижение суммарного содержания ЭЖК в среднем в 2 раза. Выявлено уменьшение степени ненасыщенности кислот, как индикатор вязкости клеточных мембран. В связи с перекисным окислением липидов, выявленное увеличение индекса вязкости мембран (SFA/UFA) в печени (p < 0,05) может вносить вклад в потерю целостности мембран. Более того, уменьшение концентрации арахидоновой кислоты также влияет на текучесть клеточных мембран. Установлено значительное снижение содержания суммарных концентраций СЖК в печени. Возможно, этот эффект объясняется следствием снижения синтетической функции печени под воздействием токсичных соединений. Основным преимуществом разработанного способа определения СЖК и ЭЖК в гомогенатах органов и тканей является точный количественный анализ, по сравнению с нецелевыми методами, и высокая чувствительность, позволяющая определять даже минорные ЖК. Несмотря на простоту и отсутствие стадии выделения липидных фракций, данная методика позволяет проводить профилирование, определять СЖК и ЭЖК, вычислять различные количественные индексы и параметры (ω-6/ω-3 и пр.), и, таким образом, выявлять токсическое действие химических соединений на органы лабораторных животных. Использо100 вание разработанной методики определения жирнокислотного состава органов и тканей лабораторных животных позволит внести существенный вклад в практику регламентирования вредных химических соединений. В результате выполнения работы создана аналитическая методика, позволяющая проводить профилирование жирнокислотного состава различных биологических объектов, которая позволяет решать практические задачи в рамках токсикологических экспериментов, в частности, производить оценку нарушений механизмов синтеза ЖК, оценивать вероятность развития сердечно-сосудистых заболеваний, а также степень поражения мембран клеток печени и других органов. Результаты работы позволили получить новые сведения о влиянии токсичных химических соединений на метаболизм липидов и выйти на новый уровень оценки рисков, связанных с воздействием различных токсичных химических соединений. Работа позволила усовершенствовать методологическую основу доклинических и клинических исследований в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, а также гигиенического регламентирования вредных химических веществ. Методика может быть использована в центрах профпатологии, медико-биологических НИИ, центрах Роспотребнадзора и токсикологических лабораториях. ВЫВОДЫ 1. Двухстадийная хроматомасс-спектрометрическая методика совместного количественного определения свободных и этерифицированных ЖК в плазме крови людей и лабораторных животных на принципах экстрактивного алкилирования позволяет проводить определение 32 ЖК, включая полиненасыщенные, и обеспечивает пределы обнаружения не менее 0,02 мкг/мл, относительную ошибку определения не выше 15 %, при этом мягкие условия подготовки проб исключают побочные реакции переэтерификации, окисления и гидролиза аналитов. 2. Установлено, что условия хранения образцов плазмы крови влияют на содержание в ней СЖК и ЭЖК. Охарактеризованы оптимальные условия хранения биологических образцов перед анализом, не влияющие на исходный состав ЖК, а именно: не более 14 дней в замороженном виде при температуре -20 °С без повторного замораживания. 3. Показано, что гомогенаты органов и тканей можно использовать в качестве образцов для определения СЖК и ЭЖК без введения дополнительных стадий разделения и очистки в предложенную двухстадийную схему. 4. Внедрение разработанной схемы в лабораторно-клиническую диагностику при гигиеническом регламентировании вредных химических веществ позволило установить ранее неизвестные аспекты токсического действия фосфорорганических соединений, алифатических углеводородов и фторуксусной кислоты на организм животных. 101 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Крылов А.И., Хлебникова Н.С., Полуяктова С.К. // Журн анал хим. - 1991. - Т. 46. - №12. - С. 2428-2435 2. Уколов А.И., Орлова Т.И., Савельева Е.И., Радилов А.С. Хроматомасс- спектрометрическое определение свободных жирных кислот в плазме крови и моче с использованием экстрактивного алкилирования // Журнал аналитической химии, 2015, Т. 70, № 9, С. 968-975. 3. Орлова Т.И., Уколов А.И., Савельева Е.И., Радилов А.С. Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматоматографии с масс-селективным детектированием // Аналитика и контроль, 2015, Т. 19, № 2, С. 183-188. 4. Уколов А.И., Орлова Т.И., Радилов А.С. Влияние биологической матрицы и условий хранения на определение жирных кислот плазмы крови методом ГХ-МС // Вестн. СанктПетерб. гос. ун-та. 2015. Сер. 4. В печати. 5. Электронный ресурс http://lipidlibrary.aocs.org/lipids/fa_branc/file.pdf от 04.07.2015 6. Электронный ресурс http://biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Part58-371. 7. Электронный ресурс http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/chemistry/clas- ses_stud/ru/stomat/ptn/1/биоорганическая%20химия/03.%20классификация%20липидов.%20фосфолипид ы.htm 8. Bicalha B., David F., Rumplel K., Kindtd E., Pat Sandra. Creating a fatty acid methyl ester database for lipid profiling in a single drop of human blood using high resolution capillary gas chromatography and mass spectrometry //J of Chromatogr A. - 2008. - V. 1211 - P. 120–128. 9. Ashraf-Khorassani M., Isaac G., Rainville P., Fountain K., et al. Study of UltraHigh Performance Supercritical Fluid Chromatography to Measure Free Fatty Acids With Out Fatty Acid Ester Preparation // J of Chromatogr. - 2015. - V.997. - P. 45–55. 10. Электронный ресурс http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/80433 от 04.07.2015 11. Van Meer G, Voelker DR, Feigenson GW. Membrance lipids: where they are and how they behave// Nat Rev Mol Cell Biol. – 2008. - V.9(2). - P. 112–24. 12. Stillwell W. An Introduction to Biological Membranes. 2013. Chapter 4 – Membrane Lipids: Fatty Acids. P. 43–56 13.Электронный ресурс http://chem21.info/info/1350323/ от 04.07.2015 14. Тюкавкина Н. А., Бауков Ю. И., Зурабян С.Э. Биоорганическая химия. - 2010. - 416 с. 15. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.1998 г. 102 16. Holman RT. Nutritional and metabolic interrelationships between fatty acids// Fed Proc. – 1964. - V. 23. –P. 1062-1067 17. Электронный ресурс http://nenuda.ru/ионизирующего-излучения-на-процессы- перекисного-окисления.html 18. электронный ресурс от 04.07.2015 https://ru.wikipe- dia.org/wiki/%C6%E8%F0%ED%FB%E5_%EA%E8%F1%EB%EE%F2%FB 19. IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN) The Nomenclature of Lipids Recommendations, 1976 Eur. J. Biochem. 79, 11-21(1977) 20. Гладышев М.И. Незаменимые полиненасыщенные ЖК и их пищевые источники для человека. //Journal of Siberian Federal University. Biology. - 2012. - В. 4. - P. 352-386. 21. Боровик Т.Э., Грибакин С.Г., Звонкова Н.Г., Скворцова В.А., Степанова Т.Н., Шмакова С.Г.. Питание и развитие мозга: роль длинноцепочечных полиненасыщенных ЖК ФГБУ. // Научный центр здоровья детей РАМН, 2ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава. Москва. Питание здорового и больного ребенка. 22. Kummerow F. A. The negative effects of hydrogenated trans fats and what to do about them.// Atherosclerosis. – 2012. - V. 205(2). – P. 458-465 23. Quehenberger O. et al. Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in human plasma. // Journal of Lipid Research. - 2010. - V. 51. - P. 3299-3305. 24. Кольман Я., К.- Г. Рем Наглядная БИОХИМИЯ Перевод с немецкого профессора, д-ра биол. наук Л. В. Козлова, канд. биол. наук Е. С. Левиной и канд. хим. наук П. Д. Решетова под редакцией канд. хим. наук П. Д. Решетова и канд. хим. наук Т. И. Соркиной Москва “Мир” 2000 25. Hertzel A. V., Thompson B.R., Wiczer B.M., Bernlohr D.A. Lipid metabolism in adipose tissue./ In Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. D. E. Vance and J. E. Vance. Amsterdam. - 2008. – P. 277–304. 26. Funk C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. //Science. - 2001. - V. 294. - P. 1871 – 1875. 27. Электронный ресурс от 10.07.2015http://biokhimija.ru/lekcii-po-biohimii/24-stroenieobmen-lipidov/133-fosfolipidy.html 28. Электронный ресурс от 10.07.201 5http://www.xumuk.ru/biologhim/076.html 29. Электронный ресурс http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/whatlip/file.pdf 30. Электронный ресурс http://themedicalbiochemistrypage.org/lipids.php 31. Dowhan W., Bogdanov M., Mileykovskaya E. Lipoproteins and Membranes (Fifth Edition) //Biochemistry of Lipids. – 2008. - P. 1–37. 103 32. Электронный ресурс https://en.wikipedia.org/wiki/Sphingolipid от 10.07.2015 33. Северин Е.С. Биохимия. /Изд. ГЭОТАР-МЕД. 2003. 34. Гладышев М.И. Незаменимые полиненасыщенные ЖК и их пищевые источники для человека. //Journal of Siberian Federal University. Biology 4. - 2012. - V. 5 - P. 352-386. 35. Warensjö E., Sundström J., Vessby B., Cederholm T., Risérus U. Markers of dietary fat quality and fatty acid desaturation as predictors of total and cardiovascular mortality: a population-based prospective study1–3. 2008. - V. 88. - P. 203-209. 36. Jeyakumar S.M, Lopamudra P., Padmini S., Balakrishna N. et al. Fatty acid desaturation index correlates with body mass and adiposity indices of obesity in Wistar NIN obese mutant rat strains WNIN/Ob and WNIN/GR-Ob Nutrition. // Metabolism Nutrition & Metabolism. – 2009. - V. 6:27 37. Боровик Т.Э., Грибакин С.Г., Звонкова Н.Г., Скворцова В.А. и др. Питание и развитие мозга: роль длинноцепочечных полиненасыщенных ЖК ФГБУ Научный центр здоровья детей РАМН, 2ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава, Москва. 2012. 38. Simopoulos AP. The importance of the omega-6/omega-3 fatty acid ratio in cardiovascular disease and other chronic diseases.//Exp Biol Med (Maywood). - 2008. - V. 233. - P. 674–688. 39. Harris W.S., Mozaffarian D., Rimm E. et al. Circulation. Omega-6 fatty acids and risk for cardiovascular disease: a science advisory from the American Heart Association Nutrition Subcommittee of the Council on Nutrition, Physical Activity, and Metabolism; Council on Cardiovascular Nursing; and Council on Epidemiology and Prevention.//Circulation. - 2009. - V. 119. - P. 902–907. 40. Williams C.D., Whitley B.M., Hoyo C. et al. A high ratio of dietary n-6/n-3 polyunsaturated fatty acids is associated with increased risk of prostate cancer.// Nutr Res. – 2011. - V. 31(1) - P.18. 41. Richard J. Deckelbaum. n-6 and n-3 Fatty acids and atherosclerosis: ratios or amounts?// Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. - 2010. - V.30 - P. 2325-2326. 42. Chang C.L., Seo T., Matsuzaki M. et al. n-3 fatty acids reduce arterial LDL-cholesterol delivery and arterial lipoprotein lipase levels and lipase distribution.//Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009. - V. 29. - P. 555–561. 43. Seo T., Qi K., Chang C. et al. Saturated fat-rich diet enhances selective uptake of LDL cholesteryl esters in the arterial wall.// J Clin Invest. – 2005. - V. 115. - P. 2214–2222. 44. Hegele R.A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications.// Nat. Rev. Genet. - 2009. - V. 10. - P.109-121. 45 Xua Y., Hoa W., Xud F., Wene T. Exploratory investigation reveals parallel alteration of plasma fatty acids and eicosanoids in coronary artery disease patients.// Prostaglandins & Other 104 Lipid Mediators. – 2013. – V.106. –P. 29–36 46. Munir R., Usman H., Hasnain S., Smans K. , Kalbacher H. et al. Atypical plasma lipid profile in cancer patients: Cause or consequence?// Biochimie. - 2014. –V.X. - P. 1-10 47. Rysman E., Brusselmans K., Scheys K., Timmermans L. et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics by promoting membrane lipid saturation. // Cancer Res. – 2010. - V. 70. - P. 8117-8126 48. Ventura R., Mordec K., Waszczuk J., Wang Z. et al. Inhibition of de novo Palmitate Synthesis by Fatty Acid Synthase Induces Apoptosis in Tumor Cells by Remodeling Cell Membranes, Inhibiting Signaling Pathways, and Reprogramming Gene Expression. // EBioMedicine. 2015. – V.2. - №8. – P.808-824. 49. Mocelina M., Camargoa C.Q. et al. A systematic review and meta-analysis of the n-3 polyunsaturated fatty acids effects on inflammatory markers in colorectal cancer.// Clinical Nutrition. Available online 29 April 2015 50. Caia F., Sorg O., Grancia V., Lecumberria E. et al. Interaction of ω-3 polyunsaturated fatty acids with radiation therapy in two different colorectal cancer cell lines.// Clinical Nutrition. 2014. - V. 33. – P. 164–170. 51. Sawada N., Inoue M., Iwasaki M., Sasazuki S. et al. Consumption of n-3 Fatty Acids and Fish Reduces Risk of Hepatocellular Carcinoma. //Japan Public Health Center–Based Prospective Study Group Gastroenterology. - 2012. - V. 142. - №, 7. - P. 1468–1475. 52. Campa D., Husing A., Chang-Claude J., Dostal L., et al. Genetic variability of the fatty acid synthase pathway is not associated with prostate cancer risk in the European Prospective Investigation on Cancer. //European Journal Of Cancer. – 2011. – V. 47. – P. 420 – 427 53. Jurczyszyna A., Czepielb J., Gdula-Argasińskac J., Paśkod P. et al. Plasma fatty acid profile in multiple myeloma patients. // Leukemia Research. -2015. – V.39. – P. 400–405 54 Wuwen L., Tongshu Yang, Identification of possible biomarkers for breast cancer from free fatty acid profiles determined by GC–MS and multivariate statistical analysis. //Clinical Biochemistry. - 2012. - V. 45. - P. 127–133 55. Shannona J., O’Malleya J., Moria M., Garzotto M. et al. Erythrocyte fatty acids and prostate cancer risk: A comparison of methods.// Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. - 2010. – V.183. – P. 161–169 56. Sosnowski R., Zawistowski J. Plasma Phospholipid Fatty Acids and Prostate Cancer Risk in the SELECT Trial. // European Urology. – 2014. – V.65. – P. 1012-1020. 57. Chan J.M., Gann P.H., Giovannucci E.L. Role of diet in prostate cancer development and progression. //J. Clin Oncol. – 2005. – V. 23. – P. 8152-8160. 105 58. Xua Y., Hoa W.E., Xud F., Wene T. et al. Exploratory investigation reveals parallel alteration of plasma fatty acids and eicosanoids in coronary artery disease patients.// Prostaglandins & Other Lipid Mediators. – 2013. – V.106. – P. 29–36 59. Lichtenstein A.H. Trans fatty acids and blood lipid levels, parameters of cholesterol metabolism, and hemostatic factors.// Nutritional Biochemistry. – 1998. – V.9. - №5. – P. 244-248 60. Havmoeller R., Reinier K., Teodorescu C., Ahmadi N. et al. Elevated plasma free fatty acids are associated with sudden death: A prospective community-based evaluation at the time of cardiac arrest. // Heart Rhythm. – 2014. – V.11. - P. 691–696 61. Oliver M.F., Opie L.H. Effects of glucose and fatty acids on myocardial ischaemia and arrhythmias.// Lancet. - 1994. – V. 343. – P.155–158 62. Song T. , Changa Y., Shin M., Heo J. et al. Low levels of plasma omega 3-polyunsaturated fatty acids are associated with cerebral small vessel diseases in acute ischemic stroke patients. // Nutrition Research. – 2015. – V.35. - №5. – P. 368–374 63. Forouhi N., Koulman A., Sharp S.J. et al. Differences in the prospective association between individual plasma phospholipid saturated fatty acids and incident type 2 diabetes: the EPIC-InterAct case-cohort study . //The Lancet Diabetes & Endocrinology. – 2014. – V.2. – P. 810-818 64. Noorshahi N., Sotoudeh G., Djalalia M., Reza M. APOA II genotypes frequency and their interaction with saturated fatty acids consumption on lipid profile of patients with type 2 diabetes.// Clinical Nutrition. – 2015. - in press 65. Уколов А.И., Орлова Т.И., Мигаловская Е.Д., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Метаболомика: на пути интеграции биохимии, аналитической химии, информатики // Успехи современной биологии, 2015, Т. 135, № 1, С. 3-17. 66. Weinberg J.M. Lipotoxicity.// Kidney Int. - 2006. – V. 70. – P. 1560-1566 67 Charles M.A., Eschwège E., Thibult N., Claude J.R. et al. The role of non-esterified fatty acids in the deterioration of glucose tolerance in Caucasian subjects: results of the Paris Prospective Study. //Diabetologia. – 1997. – V. 40. - № 9. – P. 1101-1106. 68. Itoh Y., Kawamata Y., Harada M., Kobayashi M. et al. Free fatty acids regulate insulin secretion from pancreatic beta cells through GPR40.// Nature. – 2003. – V. 422. - № 6928. – P. 173176. 69. Listenberger L.L., Schaffer J.E. Mechanisms of lipoapoptosis: implications for human heart disease. //Trends Cardiovasc. Med. – 2002. – V. 12. – P. 134-138. 70. Carpentier A.C. Postprandial fatty acid metabolism in the development of lipotoxicity and type 2 diabetes. //Diabetes Metab. – 2008. – V. 34. – P. 97-107. 106 71. Han L.D., Xia J.F., Liang Q.L., Wang Y. et al. Plasma esterified and non-esterified fatty acids metabolic profiling using gas chromatography-mass spectrometry and its application in the study of diabetic mellitus and diabetic nephropathy.// Anal. Chim. Acta. – 2011. – V. 689. – P. 85-91. 72. Poitout V., Hagman D., Stein R., Artner I. et al. Regulation of the insulin gene by glucose and fatty acids.// J. Nutr. – 2006. – V. 136. – P. 873-876. 73. Radin N. Killing tumours by ceramide-induced apoptosis: a critique of available drugs.// Biochem. J. – 2003. – V. 371. – P. 243–256. 74. Suzuki K., Babazono T., Murata H., Iwamoto Y. Clinical significance of urinary liver-type fatty acid-binding protein in patients with diabetic nephropathy. //Diabetes Care. – 2005. – V. 28. – P. 2038-2039. 75. Dabla P.K. Renal function in diabetic nephropathy.// World J. Diabetes. – 2010. – V.1. – P. 48-56 76. Neuromuscular Disorders of Infancy, Childhood, and Adolescence (Second Edition) A Clinician's Approach, Chapter 40 – Lipid Storage Myopathies Due to Fatty Acid Oxidation Defects Ingrid Tein. Edited by Darras B.T., Jones H. R., Ryan M.M. and De Viv D.C. - 2015. – P. 761795. 77. Zhang H., Wang Z, Oscar Liu. Note to users Development and validation of a GC-FID method for quantitative analysis of oleic acid and related fatty acids// Journal of Pharmaceutical Analysis. – 2015. - In Press 78. Wei G., Zeng E.Y. Gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry in quantifying fatty acids.// Trends in Analytical Chemistry. - 2011. – V. 30. - No. 9. – P. 60-68. 79. Shantha N.C., Napolitano. Gas chromatography of fatty acids// Journal of Chromatography. 1992. – V.624. - P. 37-51 80. Shi W., Li J., He B., Yan F. et al. Biodiesel production from waste chicken fat with low free fatty acids by an integrated catalytic process of composite membrane and sodium Methoxide // Bioresource Technology. – 2013. – V. 139. – P. 316–322. 81. Morrison W.R., Smith L.M. Preparation of fatty acid methyl esters þ dimethylacetals from lipids with boron fluoride-methanol.//J.LipidRes. - 1964. - V5. - P600–608. 82. Lands W., Libelt B., Morris A., Kramer N.C. Maintenance of lower proportions of ( n - 6) eicosanoid precursors in phospholipids of human plasma in response to added dietary (n - 3) fatty acids. //.Biochimica et Biophysica Acta. - 1992. - V.1180. - P.147-162. 83. Vognild E., Elvevoll E.O., Brox J., Olsen R.L. et al. Effects of dietary marine oils and olive oil on fatty acid composition, platelet membrane fluidity, platelet responses, and serum lipids in 107 healthy humans.// Lipids. - 1998. – V. 33. - P. 427-436. 84. Ostermann A. I., Müller M.,Willenberg I. , HelgeScheb N. Determining the fatty acid composition in plasma and tissues as fatty acid methyl esters using gas chromatography – a comparison of different derivatization and extraction procedures. //Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids . – 2014. - V. 91. - P. 235–241. 85. Eder K. Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters //Journal of Chromatography B. - 1995. - V.671.- P. 113-131. 86. Lepage G., Roy C.C. Direct transesterification of all classes of lipids in a one-step reaction.// G. Lipid Res. – 1986. – V.27. – P. 114-120. 87. Bicalha B., David F., Rumplel K., Kindtd E. et al. Creating a fatty acid methyl ester database for lipid profiling in a single drop of human blood using high resolution capillary gas chromatography and mass spectrometry // //J of Chromatogr A. - 2008. - V. 1211. - P. 120–128. 88. Yi L., He J., Liang Y., Yuan D. et al. Simultaneously quantitative measurement of comprehensive profiles of esterified and non-esterified fatty acid in plasma of type 2 diabetic patients // Chemistry and Physics of Lipids. - 2007. - V. 150. - P. 204–216. 89. Dai L., Gonçalves C.M, Lin Z., Huang J. et al. Exploring metabolic syndrome serum free fatty acid profiles based on GC–SIM–MS combined with random forests and canonical correlation analysis // Talanta. - 2015. - V. 135. - P. 108–114. 90. Wu H., Xue R., Dong L., Liu T. et al. Metabolomic profiling of human urine in hepatocellular carcinoma patients using gas chromatography/mass spectrometry // Analytica Chimica Acta. 2009. - V. 648. - P. 98–104. 91. Kelley R.I. Quantification of 3-methylglutaconic acid in urine, plasma, and amniotic fluid by is tu dilution gas hromatography~mass spectrometry//Ciinica Chirnica Acta. - 1993. - V. 220. - P. 3S7-164. 92. Yang Y.J., Choi M.H., Paik M., Yoon H. et al. Gas chromatographic–mass spectrometric determination of plasma saturated fatty acids using pentafluorophenyldimethylsilyl derivatization. // J Chromatogr B. - 2000. - V. 742. - P. 37–46 93. Kortza L., Dorowa J., Beckera S., Thierya J. et al. Fast liquid chromatography–quadrupole linear ion trap-mass spectrometry analysis of polyunsaturated fatty acids and eicosanoids in human plasma// //J of Chromatogr B. - 2013. - V. 927. - P. 209–213. 94. Amet Y., Adas F., Berthou F. High performance liquid chromatography of fatty acid metabolites Improvement of sensitivity by radiometric, fluorimetric and mass spectrometric methods.// Analytica Chimica Acta. - 2002. - V. 465. - P.193–198. 95. Levison B.S., Zhang R., Wang Z., Fu X. et al. Quantification of fatty acid oxidation products using online high performance liquid chromatography tandem massspectrometry.// Free Radical 108 Biology and Medicine. - 2013. - V. 59. - P. 2–13. 96. Pettinella C., Lee S., Cipollone F., Blair I.A. Targeted quantitative analysis of fatty acids in atherosclerotic plaques by high sensitivity liquid chromatography/tandem mass spectrometry.// J of Chromatogr B. - 2007. - V. 850. - P. 168–176. 97. Porto B.L., Faria I.D., de Oliveira Mendes T., de Oliveira M. A.L. Fast screening method for the analysis of trans fatty acids in processed food by CZE-UV with direct detection //Food Control. - 2015. - V. 55. - P. 230-235. 98. Otieno A.C., Mwongela S.M. Capillary electrophoresis-based methods for the determination of lipids. //A review analytica chimica acta. -2008. – V. 624. – P. 163–174. 99. Oliveira M.A.L., Solis V.E.S., Gioielli L.A., Polakiewicz B. et al. Method development for the analysis of trans-fatty acids in hydrogenated oils by capillary electrophoresis. //Electrophoresis. 2003. - V. 24. – P. 1641-1647. 100. Castro Barra P., Barra M.M., Azevedo M.S., Fett R. et al. A rapid method for monitoring total trans fatty acids (TTFA) during industrial manufacturing of Brazilian spreadable processed cheese by capillary zone electrophoresis.// Food Control. -2012. – V. 23. – P. 456-461. 101. Gaoa F., Donga J., Li W., Wang T., et al. Separation of phospholipids by capillary zone electrophoresis with indirect ultraviolet detection. // J of Chromatogr A. -2006. – V. 1130. – P. 259–264. 102. Petersson M.A., Hulthe G., Fogelqvist E. New sheathless interface for coupling capillary electrophoresis to electrospray mass spectrometry evaluated by the analysis of fatty acids and prostaglandins. // J of Chromatogr A. – 1999. – V. 854. – P. 141–154. 103. Alexander L.R., Justice J.B. Fatty acid composition of human erythrocyte membranes by capillary gas chromatogrsphy mass-specrometry. // J of Chromatogr. - 1985. – V. 342. – P. 1-12. 104. Yi L., He J., Liang Y., Yuan D. Et al. Simultaneously quantitative measurement of comprehensive profiles of esterified and non-esterified fatty acid in plasma of type 2 diabetic patients. // Chemistry and Physics of Lipids. – 2007. – V. 150. – P. 204–216. 105. Zheng X., Shen J., Liu Q., Wang S. et al. Plasma fatty acids metabolic profiling analysis of coronary heart disease based on GC–MS and pattern recognition. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. – 2009. – V.49. – P. 481–486. 106. Jones P.M., Michael J. Clinical applications of 3-hydroxy fatty acid analysis by gas chromatography–mass spectrometry. //Biochimica et Biophysica Acta. – 2011. – V. 1811. – P. 657–662 107. Zhang J., Pearson T., Matharoo-Ball B., Ortori C.A. et al. Quantitative profiling of epoxyeicosatrienoic, hydroxyeicosatetraenoic, and dihydroxyeicosatetraenoic acids in human intrauterine tissues using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry//Analytical Biochemistry. – 2007. – V. 365. – P. 40–51 109 108.Электронные ресурсы http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_chemis- try/2535/%D0%9C%D0%95%D0%96%D0%A4%D0%90%D0%97%D0%9D%D0%AB%D0% 99 109 Fiorini D., Pacetti D., Gabbianelli R., Gabrielli S. et al. A salting out system for improving the efficiency of the headspace solid-phase microextraction of short and medium chain free fatty acids. // J of Chromatogr A. – 2015. – in press. 110 Rincón A.A., Pino V., Ayala J.H., Afonso A.M. Multiple headspace solid-phase microextraction for quantifying volatile free fatty acids in cheeses.// Talanta. – 2014. – V.129. – P. 183– 190. 111 Bianchi F., Dall’Asta M., Del Rio D., Mangia A. et al. Development of a headspace solidphase microextraction gas chromatography–mass spectrometric method for the determination of short-chain fatty acids from intestinal fermentation.// Food Chemistry. – 2011. – V. 129. – P. 200– 205 112 Sankaranarayanan R., Wahrendorf J., Demaret E. International Agency for Research on Cancer. Directory of on-going research in cancer epidemiology. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer. 1996. – P.789–803. 113 Multiple Risk Factor Intervention Trial Group. Multiple risk factor intervention trial: risk factor changes and mortality results. JAMA 1982;248:1465-1477 114 The ARIC Investigators. The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study: design and objectives. //Am J Epidemiol. - 1989. – V.129. – P. 687-702. 115. Pasikanti K.K., Ho P.C., Chan E.C. // Rapid Commun Mass Spectrom.- 2008. - V. 22. - P. 2984-2990. 116. Want E.J., Cravatt B.F., Siuzdak G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. // Chembiochem. - 2005. - V. 6. - P. 1941-1951. 117. Dunn W.B., Broadhurst D., Ellis D.I., Brown M., Halsall A., O’Hagan S. A GC-TOF-MS study of the stability of serum and urine metabolomes during the UK Biobank sample collection and preparation protocols.// Int J Epidemiol. - 2008. - V. 37. - № 1. - P.23-30. 118. Paltiel L., Rønningen K.S., Meltzer H.M., Baker S.V. et al. Evaluation of Freeze Thaw Cycles on stored plasma in the Biobank of the Norwegian Mother and Child Cohort Study.// Cell Preserv Technol. – 2008. – V.6. – P. 223-230. 119. Yi L., Heb J., Liang Y., Yuan D. et al. Simultaneously quantitative measurement of comprehensive profiles of esterified and non-esterified fatty acid in plasma of type 2 diabetic patients. // Chemistry and Physics of Lipids. – 2007. – V. 150. – P. 204–216. 110 120. Matthan N.R., Blanche I., Resteghini N., Ausman L. M. Long-term fatty acids stability in human serum cholesteryl ester, triglyceride and phospholipid fractions. // The Journal of Lipid Research. – 2010. – V. 51. – P. 2826-2832. 121. Hodson L., Skeaff C.M., Wallace A. J. Arribas G.L. Stability of plasma and erythrocyte fatty acid composition during cold storage. // Clinica Chimica Acta. -2002. – V.321. – P. 63–67. 122. Nurhasan M., Roos N., Aristizabal Henao J.J., Chamnan C.,.Stark K.D , Lauritzen L. Effect of storage temperature in a Cambodian field setting on the fatty acid composition in whole blood.// Prostaglandins, Leukotrienes and Essential FattyAcids. - 2015. – V. 96. - P. 57–61. 123. Metherel A.H., AristizabalHenao J.J., Stark K.D. EPA and DHA levels in whole blood decrease more rapidly when stored at -20C as compared with room temperature, 4 and -75C //Lipids. -2013. – V. 48. – P. 1079–1091. 124. Miller P.E., Van Elswyk M., Alexander D.D. Long-chain omega-3 fatty acids eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid and blood pressure: a meta-analysis of randomized controlled trials.// Am J Hypertens. – 2014. – V. 27. – P. 885-896. 125.Cohen B.E., Garg S.K., Ali S., Harris W.S. et al. Red blood cell docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid concentrations are positively associated with socioeconomic status in patients with established coronary artery disease: data from the Heart and Soul Study.//J Nutr. - 2008. – V. 138. - № 6 – P. 1135-1140. 126. Restuccia D., Spizzirri G., Bonesi M., Rosa T. et al. Evaluation of fatty acids and biogenic amines profiles in mullet and tuna roe during six months of storage at 4 C. //Journal of Food Composition and Analysis. - 2015. – V. 40. - P 52–60. 127. Huynh M.D., Kitts D.D., Hu C., Trites A.W . Comparison of fatty acid profiles of spawning and non-spawning Pacific herring, Clupea harengus pallasi. //Comparative Biochemistry and Physiology. Part B: Biochemistry and Molecular Biology. – 2007. – V. 146. – P.504–511. 128. Уколов А.И., Орлова Т.И., Савельева Е.И., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введении сублетальных количеств фосфорорганических отравляющих веществ // Токсикологический вестник, 2015, Т. 132, № 3, С. 2-11. 129. Casida J.E., Nomura D.K., Vose S.C., Fujioka K. Organophosphate-sensitive lipases modulate brain lysophospholipids, ether lipids and endocannabinoids // Chemico-Biological Interactions. – 2008. - V. 175. - P. 355–364. 130. Lotti M., Moretto A. Organophosphate-induced delayed polyneuropathy // Toxicol. Rev. – 2005. - V. 24. - P. 37–49. 111 131. Androutsopoulos V. P., Hernandez A. F., Liesivuori J., Tsatsakis A. M. A mechanistic overview of health associated effects of low levels of organochlorine and organophosphorous pesticides // Toxicology. – 2013. - V. 307. - P. 89–94. 132. Suzuki H., Ito Y., Noro Y., Koketsu M., Kamijima M., Tomizawa M. Organophosphate agents induce plasma hypertriglyceridemia in mouse via single or dual inhibition of the endocannabinoidhydrolyzing enzyme(s) // Toxicology Letters. – 2014. - V. 225. – P. 153– 157. 133. Nakagawa M., Uchiyama M. Effect of organophosphate pesticides on lecithin-cholesterol acyltransferase in human plasma // Biochemical Pharmacology. - 1974. - V. 23. - P. 1641-1645. 134. Nomura D.K., Fuijioka K., Issa R.S., Ward A.M., Cravatt B.F., Casida J.E. Dual roles of brain serine hydrolase KIAA1363 in ether lipid metabolism and organophosphate detoxification // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2008. - V. 228. - P. 42–48. 135. Lotti M. The pathogenesis of organophosphate neuropathy // Crit. Rev. Toxicol. – 1992. - V. 21. - P. 465–487. 136. Ray D.Е. Organophosphorus esters: An evaluation of chronic neurotoxic effects // Leicester. – 1998. - P. 62-70. 137. Шмурак В.И., Курдюков И.Д., Надеев А.Д., Войтенко Н.Г., Глашкина Л.М., Гончаров Н.В. Биохимические маркеры интоксикации фосфорорганическими отравляющими веществами // Токс. вестн. 2012. - № 4 - С. 30-34. 138. Galloway T., Handy R. Immunotoxicities of organophosphorus pesticides // Ecotoxicology. – 2003. - V. 12. - P. 345–363. 139. Kamath V., Joshi A.K.R., Rajini P.S. Dimethoate induced biochemical perturbations in rat pancreas and its attenuation by cashew nut skin extract // Pest. Biochem. Physiol. - 2008. - V. 90. - P. 58–65. 140. Kamath V., Rajini P.S. Altered glucose homeostasis and oxidative impairment in pancreas of rat subjected to dimethoate intoxication // Toxicology. – 2007. - V. 231. - P.137–146. 141. Karami-Mohajeri S., Abdollahi M. Toxic influence of organophosphate, carbamate and organochlorine pesticides on cellular metabolism of lipids, proteins and carbohydrates: a systematic review // Hum. Exp. Toxicol. – 2011. - V. 30. - P. 1119–1140. 142. Joshi A.K.R., Rajini P.S. Reversible hyperglycemia in rats following acute exposure to acephate, an organophosphorus insecticide: role of gluconeogenesis // Toxicology. – 2009. - V. 257; P. 40–45. 143. Amanvermez R., Baydin A., Yardan T., Basol N., Gunay M. Emerging laboratory abnormalities in suicidal patients with acute organophosphate poisoning // Turk. J. Biochem. – 2010. – V. 35. - P. 29–34. 112 144. Nagi A.I, El-Gamal A.B. Effect of Diazinon, an Organophosphate Insecticide, on Plasma Lipid Constituents in Experimental Animals // J Biochem Mol Biol. 2003. V. 36 N. 5. P. 499-504. 145. Lasram M.M., Annabi A.B., Elj N.E., Selmi S., Kamoun A., El-Fazaa S., Gharbi N. Metabolic disorders of acute exposure to malathion in adult Wistar rats // J Hazardous Materials. – 2009. V. 163. - P. 1052–1055. 146. Acker C.I., Nogueira C.W. Chlorpyrifos acute exposure induces hyperglycemia and hyperlipidemia in rats // Chemosphere. – 2012. - V. 89. - N. 5. - P. 602–608. 147. Feng Z., Sun X., Yang J., Hao D., Du L. Metabonomics analysis of urine and plasma from rats given long-term and low-dose dimethoate by ultra-performance liquid chromatography–mass spectrometry // Chemico-Biological Interactions. – 2012. - V. 199. - P. 143–153. 148. Ryhnen R., Herranen J., Korhonen K., Penttil I., Polvilampi M., Puhakainen E. Relationship between serum lipids, lipoproteins and pseudocholinesterase during organophos-phate poisoning in rabbits // Int. J. Biochem. – 1984. - V. 16 - P. 687-690. 149. Roszczenkoa A., Rogalska J., Moniuszko-Jakoniuk J., Brzoska M. The effect of exposure to chlorfenvinphos on lipid metabolism and apoptotic and necrotic cells death in the brain of rats // Experimental and Toxicologic Pathology. – 2013. - V. 65. - P. 531– 539. 150. Setin E., Kanbur M., Silici S., Eraslan G. Propetamphos-induced changes in haematological and biochemical parameters of female rats: protective role of propolis // Food Chem. Toxicol. – 2010. - V.48. - P. 1806–1810. 151. Lasram M.M., Annabi A.B., Elj N.E., Selmi S., Kamoun A., El-Fazaa S., Gharbi N. Metabolic disorders of acute exposure to malathion in adult Wistar rats // J. Hazard. Mater. – 2009. - V. 163. - P. 1052–1055. 152. Quistad G.B., Barlow C., Winrow C.J., Sparks S.E., Casida J.E. Evidence that mouse brain neuropathy target esterase is a lysophospholipase // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. – 2003. - V. 100. - P. 7983–7987. 153. Sjakste N., Gutcaits A., Kalvinsh I. Mildronate: an antiischemic drug for neurological indications.//CNS Drug Rev. – 2005. – V.11. – P. 151-168. 154. Afanas'ev V.V., Murashko N.K. Mildronat--treatment of cardio-neurologic pathology in ischemia and hypoxia.// Lik Sprava. - 2012. – V. 7. – P. 68-74. [Article in Russian] 155. Klusa V, Beitnere U, Pupure J et al. Mildronate and its neuroregulatory mechanisms: targeting the mitochondria, neuroinflammation, and protein expression//Medicina (Kaunas). – 2013. – V. 49. – P.301-309 156. Zhu Y., Zhang G., Zhao J. et al. Efficacy and safety of mildronate for acute ischemic stroke: a randomized, double-blind, active-controlled phase II multicenter trial. //Clin Drug Investig. – 113 2013. – V.33. – P.755-760. 157. BRENDA [электронный ресурс]. 158. Мурашко Н.К. Bозможности милдроната в кардионеврологической практике.// Междунар. неврол. журн. – 2012.– № 4.– С. 111–120. 159. Tars K, Leitans J, Kazaks A et al. Targeting carnitine biosynthesis: discovery of new inhibitors against γ-butyrobetaine hydroxylase.// J Med Chem. – 2014. – V. 57. – P. 2213-2236. 160. Vilskersts R., Zharkova-Malkova O., Mezhapuke R. Elevated vascular γ-butyrobetaine levels attenuate the development of high glucose-induced endothelial dysfunction. //Clin Exp Pharmacol Physiol. – 2013. – V.40. – P. 518-524. 161. Makrecka M., Svalbe B., Volska K. Mildronate, the inhibitor of L-carnitine transport, induces brain mitochondrial uncoupling and protects against anoxia-reoxygenation. //Eur J Pharmacol. – 2014. – V. 723. - P. 55-61. 162. Koliesnikova I.E., Nosar V.I., Bratus' L.V. Pharmacological correction of experimental mitochondrial dysfunction of brain stem neurons by rhytmocor and mildronate. //Fiziol Zh. – 2013. – V.59. – P. 58-64. [Article in Ukrainian] 163. Kukes V.G., Zhernakova N.I., Gorbach T.V. Efficiency of mildronate in rats of different age with experimental-induced myocardial ischemia. // Vestn Ross Akad Med Nauk. – 2013. – V.1. – P. 42-46. [Article in Russian] 164. Хлебодаров Ф.Е., Михин В.П. Перспективы применения милдроната у больных с сердечно- сосудистой патологией // Российский кардиологический журнал. — 2009. — № 5. С. 1-5 165. Goncharov N.V., Kuznetsov A.V., Radilov A.S. Modern approach to the toxicology of fluoroacetate // Toksikologicheskij vestnik (Toxicological Review). – 2005. – V. 5. –P.31-44. 166. Goncharov N.V., Jenkins R.O., Radilov A.S. Toxicology of fluoroacetate: a review, with possible directions for therapy research. // J. Appl. Toxicol. – 2006. – V. 26. – P. 148-161. 167. Уколов А.И., Орлова Т.И., Гончаров Н.В., Войтенко Н.Г. Исследование энергетического метаболизма крыс при действии фторацетата // Вестник уральской медицинской академической науки, 2014, Т. 3, № 49, С. 64-66. 168 Yeh K.H., Cheng A.L. Acute confusion induced by a high-dose infusion of 5-fluorouracil and folinic acid. // J. Formos. Med. Assoc. – 1994. – V. 93. – P.721-723. 169 Tisdale M.J., Brennan R.A. Role of fluroacetate in the toxicity of 2-fluroethylnitrosoureas. // Biochem. Pharmacol. - 1985. – V. 34. – P.3323-3327. 170. Feldwick M.G., Noakes P.S., Prause U. et al. The biochemical toxicology of 1,3-difluoro-2propanol, the major ingredient of the pesticide gliftor: the potential of 4-methylpyrazole as an antidote // J. Biochem. Mol. Toxicol. – 1998. – V. 12. – P.41-52. 114 171. Keller D.A., Roe D.C., Lieder P.H. Fluoroacetate-mediated toxicity of fluorinated ethanes. // Fundam. Appl. Toxicol. – 1996. –V. 30. – P. 213-219 172. Misustova J., Hosek B., Kautska J. Characterization of the protective effect of radioprotective substances by means of long-term changes in oxygen consumption. // Strahlentherapie.- 1980. – V. 156. – P.790-794. 173. Song P., Zhao Z.Q. The involvement of glial cells in the development of morphine tolerance // Neurosci Res. – 2001. – V. 39. – P. 281-286. 174. Anikin I.V., Goncharov N.V., Tyndyk M.L., Vojtenko N.G., Pliss G.B., Zabezhinskij M.A., Popovich I.G., Anisimov V.N. Effect of sodium fluoroacetate on Ehrlich solid tumor and autochthonous sarcoma growth in mice // Vopr. Onkol. – 2013. – V. 59. – P.777-780. 175. Schultz R.A., Coetzer J.A., Kellerman T.S., Naude T.W. Observations on the clinical, cardiac and histopathological effects of fluoroacetate in sheep // Onderstepoort. J. Vet. Res. – 1982. – V. 49. – P. 237-245. 176. Schultz R.A., Coetzer J.A., Kellerman T.S., Naude T.W. Observations on the clinical, cardiac and histopathological effects of fluoroacetate in sheep // Onderstepoort. J. Vet. Res.- 1982. – V. 49. – P.237-245. 177. Tsuji H., Shimizu H., Dote T., et al. Effects of sodium monofluoroacetate on glucose, aminoacid, and fatty-acid metabolism and risk assessment of glucose supplementation // Drug Chem. Toxicol. – 2009. – V. 32. - P.353-361 178. Cheng X., Wanga G., Ma Z., Chen Y. et al. Exposure to 2,5-hexanedione can induce neural malformations in chick embryos.//NeuroToxicology. - 2012. – V. 33. – P. 1239–1247. 179. Spencer P.S., Schaumburg H.H., Sabri M.I., Veronesi B. The enlarging view of hexacarbon neurotoxicity.// Crit. Rev. Toxicol. – 1980. – V. 7. – P. 279–356. 180. Huang C.C. Polyneuropathy induced by n-hexane intoxication in Taiwan.//Acta Neurol. Taiwan. – 2008. – V. 17. – P. 3–10. 181. Adedara I.A., Abolaji A.O., Odion B.E., Okwudi I.J., Omoloja A.A., Farombi E.O. Impairment of Hepatic and Renal Functions by 2,5-Hexanedione Is Accompanied by Oxidative Stress in Rats. //J. Toxicol. - 2014. – V. - P 1-9. 182. Pereira M.E., Bordignon A.M., Bürger C., Huang C.I., Rocha J.B. Long-term treatment with 2,5-hexanedione has no effect on the specific activity of some brain and liver glycolytic enzymes of adult rats.// Braz. J. Med. Biol. Res. – 1991. – V. 24. - N 7. – P. 735-740. 183. Goel S.K., Rao G.S., Pandya K.P. Hepatotoxic effects elicited by n-hexane or n-heptane.// J. Appl. Toxicol. – 1988. – V.8 - N2. – P. 81-84. 115 184. Pereira M.E., Gonçalves C.A., Rodnight R. Phosphorylation in vitro of glial fibrillary acidic protein is increased in rat hippocampus by administration of 2,5-hexanedione. // Brain Res. – 1994. - V. 656. – P. 417–419. 185. Karlsson J.E., Wang S., Rosengren L.E., Haglid K.G. Quantitative alterations of S-100 protein and neuron specific enolase in the rat nervous system after chronic 2,5-hexanedione exposure//Neurochem. Res. – 1993. – V. 18. – P. 203–208. 186. Pereira M.E., Adams A.I.H., Silva N.S. 2,5-Hexanedione inhibits rat brain acetylcholinesterase activity in vitro.//Toxicol. Lett. – 2004. – V.146. – P. 269–274. 187. Seppalainen A.M., Raitta C., Huuskonen M.S. N-Hexane induced changes in visual evoked potentials and electroretinograms of industrial workers. // Electroen. Clin. Neuro. 1979. V. 47. P. 492-498. 188. Kim M.S., Sabri M.I., Miller V.H., Kayton R.J. et al. 1,2-diacetylbenzene, the neurotoxic metabolite of a chromogenic aromatic solvent, induces proximal axonopathy. // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2001. – V. 177. – P. 121–131. 189. Spencer P.S., Schaumburg H.H. Ultrastructural studies of the dying-back process. III. The evolution of experimental peripheral giant axonal degeneration.// J. Neuropathol. Exp. Neurol. – 1977. – V. 36. – P. 276–299. 190. Tshala-Katumbay D.D., Palmer V.S., Kayton R.J., Sabri M.I., Spencer P.S. A new murine model of giant proximal axonopathy.//Acta Neuropathol. – 2005. – V. 109. – P. 405–410. 191. Gillies P.J., Norton R.M., Baker T.S., Bus J.S. Altered lipid metabolism in 2,5-hexanedioneinduced testicular atrophy and peripheral neuropathy in the rat.// Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1981. – V. 59. – P. 293-299. 192. Hadjiivanova N.B., Salovski P.Z., Groseva M.M., Charakchieva S.B., Nechev C.K. Early effects of n-hexane and irradiation on the lung surfactant system.//Acta Physiol. Pharmacol. – 1987. – V. 13. – P. 25-29. 193. Schnoy N., Schmidt R., Altenkirch H., Wagner H.M. Ultrastructural alteration of the alveolar epithelium after exposure to organic solvents.// Respiration. – 1982. – V.43. – P. 221-231. 194. Lapadula D.M., Suwita E., Abou-Donia M.B. Evidence for multiple mechanisms responsible for 2,5-hexanedione-induced neuropathy.// Brain Research. – 1988. – V. 458. – P. 123-131. 195. Decaprio A.P. Molecular mechanisms of diketone neurotoxicity.// Chem.-Biol. Interactions. – 1985. – V. 54. – P. 257-270. 196. Word S., Esbensen K., Geladi P. Principal Component Analysis. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 1987; 2: 37-52. 116 197. Duran M. Disorders of Mitochondrial Fatty Acid Oxidation and Ketone Body Handling. Eds: N.Blau, M.Duran, M.E.Blaskovics, K.M.Gibson. Springer Berlin HeidelbergIn: Physician’s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases. 2 Ed., 2003., 731 рр. Р.309-334 198. Sanchez-Avila N., Mata-Granadosa J.M., Ruiz-Jimenez J., Luque de Castroa M.D. Fast, sensitive and highly discriminant gas chromatography–mass spectrometry method for profiling analysis of fatty acids in serum // J Chromatogr. A. - 2009. - V. 1216. - P. 6864–6872. 199. Han L.D., Liang Q.L., Wang Y.M., Hu P. A new metabonomics method for simultaneous determination of EFAs and NEFAs in plasma using GC–MS and its application.// Chinese Chemical Letters. – 2009. – V. 20. – P. 1103–1106. 200. Yi L., He J., Liang Y., Yuan D., Gao H., Zhou H. Simultaneously quantitative measurement of comprehensive profiles of esterified and non-esterified fatty acid in plasma of type 2 diabetic patients // Chem. Phys. Lipids. - 2007. - V. 150. - P. 204–216. 201. Hoffmann G.F., P.Feyh. Organic Acid Analysis. In: Physician’s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases. 2 Ed., 2003. Eds: N.Blau, M.Duran, M.E.Blaskovics, K.M.Gibson. Springer Berlin Heidelberg, 731рр. P.27-44. 202. Glaser C., Demmelmair H., Koletzko B. High-throughput analysis of total plasma fatty acid composition with direct in situ transesterification. //PLoS One. – 2010. – V.5. – N.8. – P.12045. 203. Han L.D., Liang Q.L., Wang Y.M., Hu P. A new metabonomics method for simultaneous determination of EFAs and NEFAs in plasma using GC–MS and its application.// Chinese Chemical Letters. – 2009. – V. 20. – P. 1103–1106 204. Flynn C.J., Wecker L. Concomitant Increases in the Levels of Choline and Free Fatty Acids in Rat Brain: Evidence Supporting the Seizure-Induced Hydrolysis of Phosphatidylcho-line // J. Neurochem. – 1987. – V. 48. - N. 4. - P.1178-1185. 205. Rihn L.L., Visioli F., de Turco E.B., Kreisman N.R., Bazan N.G. Free fatty acid and diacylglycerol levels are related to cerebral O2 during seizures // The role of neurotransmitters in brain injury. Ed.: M.Globus, W.D. Dietrich. Plenum Press. New York. 1992. P. 247-252. 206. Savolainen K.M., Nelson S.R., Samson F.E., Pazdernik T.L. Soman-induced Convulsions Affect the lnositol Lipid Signaling System: Potentiation by Lithium; Attenuation by Atropine and Diazepam // Tox Appl Pharm. – 1988. - V. 96. - P. 305-314. 207. Kuca K., Jun D., Cabal J., Hrabinova M., Bartosova L., Opletalova V. Russian VX: inhibition and reactivation of acetylcholinesterase compared with VX agent // Basic Clin Pharmacol Toxicol. – 2006. - V. 98. - N. 4. - P. 389-394. 208. Randle P.J., Garland P.B., Newsholme E.A., Hales C.N. The glucose fatty acidcycle in obesity and maturity onset diabetes mellitus // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1965. - V. 131. - P. 324–333. 117 209. Roszczenkoa A., Rogalska J., Moniuszko-Jakoniuk J., Brzoska M. The effect of exposure to chlorfenvinphos on lipid metabolism and apoptotic and necrotic cells death in the brain of rats // Experimental and Toxicologic Pathology. – 2013. - V. 65. - P. 531– 539. 210. Kashemsant N., Bucurescu S., Fatehi-Hassanabad Z., Harper M.E., Chan C.B. Impairment of proinsulin processing in b-cells exposed to saturated free fattyacid is dependent on uncoupling protein-2 expression // Can. J. Diabetes. – 2012. - V. 36. - P. 228–236. 211. Krebs M., Roden M. Molecular mechanisms of lipid-induced insulin resistance in muscle, liver and vasculature // Diabetes Obes. Metab. – 2005. - V.7. - P. 621–632. 212. Fukushima T., Holo N., Isobe K., Shiwaku K., Yamane Y. Effects of organophosphorous compounds on fatty acid compositions and oxidative phosphorylation system in the brain of rats // Exp Toxic Pathology. – 1997. - V. 49. - N. 5. - P. 381-386. 213. Hughey R.P. et al. // Am. J. Physiol. (1980) 238:F199-F204; 214. Schrock H. et al. // Biochem. J. (1980) 188:557-560; 215. Brosnan J.T. et al. // Häussinger D. eds. pH Homeostasis-Mechanism and Control. NY. (1988). P.281-304; 216. Kuznetsov S.V. et al. // J. Appl. Toxicol. (2007) 27(6):561-572 217. Tshala-Katumbay D., Monterroso V., Kayton R., Lasarev M., Sabri M., Spencer P. (2009) Toxicol. Sci., 107 (2), 482–489. DOI: 10.1093/toxsci/kfn241. 218. Мигаловская Е.Д., Уколов А.И. Новые метаболические маркеры хронического воздействия низких концентраций алифатических углеводородов. Тезисы доклада на конференции: «II Всероссийская научная конференция молодых ученых «Медикобиологические аспекты химической безопасности», 1-2 октября 2015 года, г. СанктПетербург. 219. Folch. J., Stanley, G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.//J Biol Chem. – 1957. – V. 226. – P. 497-510. 220. Лохов Д.Л., Маслов Е.Е., Балашова О.П., Трифонова Н.В. и др. Масс-спектрометрический анализ липидома плазмы крови, как способ диагностики заболеваний, оценки эффективности и оптимизации лекарственной терапии п.г.// Биомедицинская химия, 2015 том 61, вып. 1, с. 7-18. 221. Sud M., Fahy E., Cotter D., Brown A. LMSD: LIPID MAPS structure database. //Nucleic Acids Research. - 2007. – V. 35. – P. D527-D532. 222. Сетевой ресурс http://www.lipidmaps.org/ 223. Taguchi R., Nishijima M., Shimizu T. Basic analytical systems for lipidomics by massspectrometry in Japan. //Meth. Enzymol. – 2007. – V. 432. – P. 185–211. 118 224. Сетевой ресурс http://lipidbank.jp/ 225. Giacometti J., Milosˇevic A., Milin C. Gas chromatographic determination of fatty acids contained in different lipid classes after their separation by solid-phase extraction. //J of Chromatogr A. – 2002. - V. 976. – P. 47–54 226. Fukushima T., Holo N., Isobe A., Shiw Aku K. et al. Effects of organophosphorous compounds on fatty acid compositions and oxidative phosphorylation system in the brain of rats .//Exp Toxic Patho1. – 1997. – V. 49. – P. 381-389. 227. Надеев А.Д., Зинченко В.П., Авдонин П.В., Гончаров Н.В. Токсические и сигнальные свойства активных форм кислорода.// Токс. Вестн. – 2014. - т.2ю – С. 22-27. 228. Goncharov N.V., Avdonin P.V., Nadeev A.D., Zharkikh I.L., Jenkins R.O. Reactive oxygen species in pathogenesis of atherosclerosis.// Curr. Pharm. Des. 2015. V. 21. N. 9. P. 1134-1146. 229. Белова М.В., Ильяшенко К.К., Лужников Е.А. Окислительный стресс в неотложной токсикологии. // Общая реаниматология. – 2009. – т. 6. – С. 40-44. 230. Goel S.K., Rao G.S., Pandya K.P. Hepatotoxic effects elicited by n-hexane or n-heptane.// J. Appl. Toxicol. – 1988. – V. 8. – N. 2. – P. 81-84. 231 Dotan Y., Lichtenberg D., Pinchuk I. Lipid peroxidation cannot be used as a universal criterion of oxidative stress. //Prog Lipid Res. – 2004. – V. 43. – P. 200–227. 232. Niki E. Lipid peroxidation: physiological levels and dual biological effects. //Free Radic Biol Med. – 2009. – V. 47. – P.469–484. 233. KharroubiW, Dhibi M, Haouas Z et al Effects of sodium arsenate exposure on liver fatty acid profiles and oxidative stress in rats. //Environ Sci Pollut Res Int. – 2014. – V. 21. – P.1648–1657. 234. Taranova N. P. Intensity of acetate-2-14C incorporation into brain and spinal cord phospholipids and cholesterol of healthy guinea pigs and those poisoned with Tri-o-cresylphosphate Bull.// Exp. Biol. Med. – 1976. – V.85. – P. 427-429. 235. Gillies P. J., Norton R. M., Bus J. S. Inhibitionof sterologenesis but not glycolylsis in 2.5hexanedione induced distal axonopathy in the rat.// Toxicol. Appl. Pharma-C. 981. V.9. P.287-292 236 Schook W. J., Norton W. T. Neurofilaments account for the lipid in myelin-free axons. //Brain Res. 1976. – V. 118. – P. 517-522. 237. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. Москва "Медицина" 1998. 704 с. 238. Bhatt A., Khan S., Pandya K. P. Effect of Hexacarbons on Selected Lipids in Developing Rat Brain and Peripheral Nerves//journal of applied toxicology. – 1988. – V. 8. – N.1. – P. 53-57. 239. Kharroubi W., Dhibi M., Mekni M., Haouas Z. et al.. Sodium arsenate induce changes in fatty acids profiles and oxidative damage in kidney of rats.// Environ Sci Pollut Res Int. – 2014. – V. 21. – P.12040-9. 240. Conquer J.A., Martin J.B., Tummon I., Watson L.T.F. Fatty acid analysis of blood serum, 119 seminal plasma. //Lipids. – 1999. – V. 34. – P. 793–799.