1 002496 2 Изобретение относится к медицинской

1
Изобретение относится к медицинской
науке, в частности к лечению состояний гиперкоагуляции или приобретенной недостаточности белка С активированным белком С.
Белок С представляет собой сериновую
протеазу и естественно встречающийся антикоагулянт, который играет роль в регуляции
гомеостаза посредством его способности блокировать генерирование выработки тромбина путем инактивации факторов Va и VIIIa в коагуляционном каскаде. Человеческий белок С вырабатывается in vivo, в первую очередь, в печени в виде одиночного полипептида, состоящего
из 461 аминокислоты. Эта молекула-предшественник подвергается множественным посттрансляционным модификациям, включающим:
1) отщепление сигнальной последовательности,
состоящей из 42 аминокислот; 2) протеолитическое удаление из одноцепочечного зимогена
лизинового остатка в положении 155 и аргининового остатка в положении 156 для получения
двухцепочечной формы молекулы (т.е. легкой
цепи из 155 аминокислотных остатков, прикрепленной посредством дисульфидного мостика к
содержащей сериновую протеазу тяжелой цепи
из 262 аминокислотных остатков); 3) зависимое
от витамина К карбоксилирование девяти остатков глутаминовой кислоты, сгруппированных в
первых 42 аминокислотах легкой цепи, приводящее к образованию 9 остатков гаммакарбоксиглутаминовой кислоты; и 4) прикрепление углеводорода в четырех участках (одном
в легкой цепи и трех в тяжелой цепи). Тяжелая
цепь содержит хорошо установленную триаду
сериновой протеазы Asp 257, His 211 и Ser 360.
Наконец, циркулирующий двухцепочечный зимоген активируется in vivo тромбином на поверхности фосфолипида в присутствии иона
кальция. Активация происходит в результате
удаления додекапептида на N-конце тяжелой
цепи, продуцируя активированный белок С
(аРС), обладающий ферментативной активностью.
В сочетании с другими белками аРС функционирует, вероятно, в качестве самого важного
регулятора, подавляющего свертываемость крови, что приводит к защите против тромбоза. В
дополнение к его антикоагулянтным свойствам,
аРС оказывает противовоспалительные эффекты
посредством ингибирования им генерирования
цитокина (например, фактора опухолевого некроза и интерлейкина-1), а также проявляет профибринолитические свойства, что способствует
лизису сгустка. Таким образом, система фермента белка С представляет существенный физиологический механизм антикоагуляционного,
противовоспалительного и фибринолитического
действия.
Сепсис
Сепсис определяется как системная воспалительная реакция на инфекцию, связанная и
опосредованная активацией ряда механизмов
002496
2
защиты организма, включая цитокиновую сеть,
лейкоциты, комплемент и системы свертывания/фибринолиза [Mesters et al., Blood, 88:881886, 1996]. Диссеминированное внутрисосудистое свертывание [ДВС] с широко распространенным отложением фибрина в микрососудистой системе различных органов является ранним проявлением сепсиса/септического шока.
ДВС представляет собой важный медиатор в
развитии синдрома недостаточности множества
органов и способствует неблагоприятному прогнозу у пациентов с септическим шоком
[Fourrier et al., Chest, 101: 816-823, 1992].
Есть данные о нескольких интересных преклинических исследованиях с использованием
белка С в различных экспериментальных моделях сепсиса. В исследовании на модели сепсиса у бабуинов Taylor et al. [J. Clin. Invest.,
79:918-925, 1987] использовали полученный из
плазмы человеческий активированный белок С.
Животные получали профилактическое лечение
(т.е. aPC вводили в начале двухчасового вливания LD100 E.Coli). Пять из пяти животных выжили в течение 7 дней и по протоколу эксперимента считались постоянно выжившими. У контрольных животных, получавших идентичное
вливание E.Coli, пять из пяти животных умерли
через 24-32 ч. Эффективная доза составила от 7
до 8 мг/кг.
На модели липополисахаридного сепсиса
(ЛПС; E.Coli) у крыс [Murakami et al., Blood,
87:642-647, 1996] повреждение легочных сосудов, вызванное ЛПС, было ингибировано активированным белком С в дозе 100 мкг/кг, полученным из человеческой плазмы. Кроме того, на
модели сепсиса при перевязке и проколе у кроликов Okamoto et al. [Gastroenterology,
106:A747, 1994] показали, что человеческий
активированный белок С, полученный из плазмы, был эффективен при защите животных от
коагулопатии и органной недостаточности в
дозе 12 мкг/кг/ч в течение 9 ч. Вследствие видовой специфичности аРС, результаты, полученные у этих животных, необязательно будут
иметь прогностическое значение при лечении
людей. Уровень эффективной дозы человеческого активированного белка С крайне изменчив и не прогнозируем в зависимости от выбранной экспериментальной модели. Например,
период полувыведения из сыворотки человеческого активированного белка С у людей составляет от 30 до 40 мин в сравнении с периодом
полувыведения от 8 до 10 мин у бабуинов и
90 мин у кроликов.
В последнее время предпринимались многочисленные попытки лечения сепсиса у людей,
в большинстве случаев с использованием
средств, которые блокируют воспалительные
медиаторы, связанные с патофизиологией этого
заболевания. Однако клинические исследования
с использованием множества средств, которые
блокируют воспалительные медиаторы, были
3
безуспешны [см. обзор в работе Natanson et al.,
Ann. Intern. Med., 120:771-783, 1994; Gibaldi,
Pharmacotherapy, 13:302-308, 1993]. Поскольку
высвобождение многих медиаторов, участвующих в воспалении, является проявлением компенсаторных реакций и поэтому оказывает целительные эффекты, некоторые исследователи
предположили, что блокировка их действия может быть нецелесообразной [например, Parrillo,
N. Engl. J. Med., 328:1471-1477, 1993].
Недавно в качестве новой цели для клинических испытаний при сепсисе была предложена блокировка ДВС [например, Levi, et al.,
JAMA, 270:975-979, 1993]. Однако простая блокировка нарушения свертываемости при сепсисе
может быть недостаточна. По данным обзора
Esmon, [Arteriosclerosis & Thromb., 12:135-145,
1992], несколько антитромботических средств,
включая блокированный на активном участке
фактор Ха [Taylor, et al., Blood, 78:364-368,
1991], гирудин и гирулог [Maraganore,
Perspective in Drug Discovery and Design, 1:461478, 1994], не проявили эффективность на модели сепсиса у бабуинов. Каждое из этих антитромботических средств могло блокировать
коагулопатию потребления у животных, но не
могло улучшить выживание. Кроме того, исследователи в Японии [заявка на патент
JP7097335A] предложили лечить коагулопатию,
связанную с печеночной недостаточностью, при
которой возможно развитие симптомов, подобных ДВС, полученным из плазмы активированным белком С.
К настоящему времени полученный из
плазмы зимоген человеческого белка С использовался в качестве успешного дополнения к
обычной агрессивной терапии при лечении
25 пациентов со скоротечной пурпурой при бактериальном сепсисе, 22 из которых выжили
(Gerson, et al., Pediatrics, 91:418-422, 1993; Smith,
et al., Thromb. Haemost, PS1709, p.419, 1997;
Rintala, et al., Lancet, 347:1767, 1996; Rivard, et
al., J. Pediatr., 126:646-652, 1995). Gerson et al.
[1993] описывают изучение случая лечения ребенка с установленной грамположительной бактериемией и скоротечной пурпурой, который
переставал реагировать на обычное агрессивное
лечение. Пациента лечили полученным из плазмы зимогеном человеческого белка С (болюсное
введение в дозе 280 мкг/кг + вливание из расчета 40 мкг/кг/ч), что привело к ассоциированной
коррекции коагулопатии и ДВС и прекращению
клинических признаков развития скоротечной
пурпуры, связанной с септическим шоком.
Rintala et al. [1996] сообщили о лечении двух
взрослых людей с менингококковой септицемией, проявившейся скоротечной пурпурой. Пациентов лечили полученным из плазмы зимогеном
человеческого белка С при болюсном введении
в дозе 400 мкг/кг каждые 6 ч в течение 810 дней. Один пациент умер, один выжил.
Rivard et al. [1995] сообщили о лечении четырех
002496
4
пациентов с менингококкемией, также проявившейся скоротечной пурпурой, которые все
выжили после терапии зимогеном человеческого белка С. Этих пациентов лечили болюсным
введением в дозе 400 мкг/кг каждые 6 ч. Хотя
размер выборки в этих исследованиях мал,
смертность, связанная с менингококкемией,
проявлявшейся скоротечной пурпурой, выше
50% [Powars, et al., Clin. Infectious Diseases,
17:254-261, 1993]. Однако, ввиду того, что эти
исследования проведены с зимогеном человеческого белка С, они дают мало информации для
установления дозы и длительности терапии активированным белком С.
Кроме менингококкемии, скоротечная
пурпура и/или ДВС были связаны с многочисленными бактериальными, вирусным или протозойными инфекциями, которые включают, но
не ограничиваются, инфекциями, вызванными
Rickettsia (пятнистая лихорадка Скалистых гор,
клещевая лихорадка, тиф и т.д.) [Graybill, et al.,
Southern Medical Journal, 66(4):410-413, 1973;
Loubser, et al., Annals of Tropical Pediatrics,
13:277-280, 1993]; Salmonella (брюшной тиф, болезнь от укуса крыс) [Koul, et al., Acta Haematol,
93:13-19, 1995]; Pneumococci [Carpenter, et al.,
Scand. J. Infect. Dis., 29:479-483, 1997], Yersina
pestis (бубонная чума) [Butler et al., The Journal
of Infectious Disease, 129:578-584, 1974];
Legionella pneumophila (болезнь легионеров);
Plasmodium falciparum (церебральная малярия)
[Lercari, et al., Journal of Clinical Apheresis, 7:9396, 1992]; Burkholderia pseudomallei (мелиоидоз); Pseudomonas pseudomallei (мелиоидоз)
[Puthucheary, et al., Transactions of the Royal
Society of Tropical Medicine and Hygiene, 86:683685, 1992]; Streptococci (одонтогенные инфекции) [Ota, Y., J. Japanese Assoc. Infect. Dis.,
68:157-161]; вирус опоясывающего лишая
[Nguyen, et al., Eur. J. Pediatr., 153:646-649,
1994]; Bacillus anthracis (сибирская язва) [Franz,
et al., Journal of the American Medical Assoc.,
278(5):399-411, 1997]; Leptospira interrogans
(лептоспироз) [Hill, et al., Seminars in Respiratory
Infections, 12(1):44-49, 1997]; Staphylococci
[Levin, M., Pediatric Nephrology, 8:223-229];
Haemophilus aegyptius (бразильская пурпурная
лихорадка); Neisseria (гонококкемия, менингококкемия); и mycobacterium tuberculosis (милитарный туберкулез).
Хотя, как указано выше, состояния в виде
скоротечной пурпуры, ДВС или приобретенной
недостаточности белка С при сепсисе/септическом шоке или других инфекциях были хорошо документированы, существует мало данных
о том, как лечить этих пациентов активированным белком С. Установление уровней доз для
человека с использованием данных преклинической фармакологии, полученных в результате
лечения активированным человеческим белком
С на экспериментальных моделях, затруднено
5
вследствие свойств видовой специфичности
форм биологического действия белка С.
Трансплантация
После трансплантации костного мозга
(ТКМ), печени, почек или трансплантации других органов может произойти множество связанных с трансплантацией тромбоэмболических
осложнений [Haire, et al., JAMA, 274:1289-1295,
(1995); Harper, et al., Lancet, 924-927 (1988); и
Sorensen, et al., J. Inter. Med., 226:101-105 (1989);
Gordon, et al., Bone Marrow Transplant., 11:61-65,
(1993)]. Имеются данные о снижении уровня
белка С в циркулирующей крови после ТКМ
[Bazarbachi, et al., Nouv. Rev. Fr. Hematol.,
35:135-140 (1993); Gordon, et al., Bone Marrow
Trans., 11:61-65 (1993)], трансплантации почек
[Sorensen, et al., J. Inter. Med., 226:101-105
(1989)] и трансплантации печени [Harper, et al.,
Lancet, 924-927 (1988)]. Эта недостаточность
белка С способствует развитию состояния гиперкоагуляции, повышая у пациентов риск
тромбоэмболических осложнений.
Например, окклюзионное поражение печеночных вен (ОПВ) является основным ограничивающим дозу осложнением схем терапии перед трансплантацией костного мозга. ОПВ предположительно является результатом облитерации мелких внутрипеченочных венул вследствие внутрисосудистого отложения фибрина
[Faioni, et al., Blood, 81:3458-3462 (1993)]. Кроме
того, ОПВ вызывает высокую частоту осложнений и смертность после ТКМ [Collins, et al.,
Throm. and Haemo., 72:28-33 (1994)]. Есть данные о совпадении сниженного уровня белка С с
максимальной частотой ОПВ [Harper, et al.,
Bone Marrow Trans., 5:39-42 (1990)], и этот фактор, вероятно, способствует развитию этого состояния.
Нарушение функции органов после ТКМ,
включая легкие, центральную нервную систему,
печень или почки, является осложнением, которое развивается у большой процентной доли
пациентов после трансплантации [Haire, et al.,
JAMA 274:1289-1295, (1995)]. Нарушение функции одного органа при ТКМ является надежным
прогностическим показателем синдрома нарушения функции множества органов (СНФМО),
который является ведущей причиной смерти
пациентов после ТКМ. Диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС), вследствие
массивной активации системы свертывания и
широко распространенного отложения фибрина
в микрососудистой системе различных органов,
является важным медиатором в развитии
СНФМО [Fourrier, et al., Chest, 101:816-823
(1992)]. Таким образом, недостаток содержания
белка С у пациентов, подвергнутых трансплантации костного мозга или трансплантации других органов, приводит к состоянию повышенной свертываемости, которое предрасполагает
пациентов к тромбоэмболическим венозным
осложнениям и нарушению функции органов. В
002496
6
настоящее время существует необходимость в
определении способа лечения людей с состоянием повышенной свертываемости, связанным с
трансплантацией органов, с использованием активированного белка С.
Ожоги
Уже давно было установлено, что у пациентов с тяжелыми ожогами развиваются осложнения, связанные с гиперкоагуляцией [Curreri, et
al., Ann. Surg. 181:161-163 (1974)]. У пациентов
с ожогами имеется повышенная активность
свертывания in vitro и часто развивается ДВС,
который характеризуется внезапным началом
диффузного кровоизлияния; потреблением фибриногена, активностью тромбоцитов и VIII фактора; внутрисосудистым гемолизом; вторичным
фибринолизом и данными о наличии микротромбов при биопсии [McManis, et al., J. of
Trauma, 13:416-422, (1973)]. Недавно появились
данные о том, что у пациентов с тяжелыми ожогами резко снижался уровень белка С и что это
снижение уровня естественного антикоагулянта
может привести к увеличению риска ДВС [Lo, et
al., Burns, 20:186-187 (1994)]. Кроме того,
Ueyama, et al., при обсуждении патогенеза ДВС
на ранней стадии ожоговой травмы пришли к
выводу, что массивное образование тромбина и
снижение антикоагулянтной активности может
происходить пропорционально тяжести ожогов
[Ueyama, et al., Nippon Geka Gakkai Zasshi,
92:907-12 (1991)]. ДВС представляет собой одно
из самых распространенных осложнений у пациентов, страдающих тяжелыми oжoговыми
травмами.
Как указано выше, у пациентов с тяжелыми ожогами была доказана недостаточность
белка С, однако имеется мало данных, касающихся того, будет ли эффективна заместительная терапия белком С, или того, как лечить этих
пациентов активированным белком С.
Беременность
Хорошо известно, беременность вызывает
множественные изменения в системе свертывания, которые могут привести к состоянию повышенной свертываемости. Например, во время
беременности и после родов риск венозного
тромбоза почти в пять раз выше, чем в состоянии без беременности. Кроме того, происходит
увеличение уровня факторов свертываемости,
снижение уровня естественных ингибиторов
свертываемости, происходят изменения фибринолитической системы, увеличивается венозный
стаз, а также возрастает повреждение сосудов
при родах в результате отделения плаценты,
кесарева сечения или инфекции [Barbour, et al.,
Obstet. Gynecol., 86:621-633, 1995].
Хотя риск осложнения из-за этого состояния гиперкоагуляции у женщин без каких-либо
факторов риска невелик, у женщин с тромбоэмболическими явлениями в анамнезе повышен
риск рецидива при беременности. Кроме того, у
женщин с имеющимися состояниями гиперкоа-
7
гуляции, включая недавнее открытие наследственной устойчивости к активированному белку
С, также имеется повышенный риск рецидива
[Dahlback, Blood, 85:607-614, 1995].
Поэтому предполагалось, что у женщин с
венозными тромбоэмболическими явлениями в
анамнезе, у которых выявлена недостаточность
антитромбина-III, белка С или белка S, существует определенный риск рецидивирующего
тромбоза и у них следует рассмотреть необходимость профилактического применения антикоагулянтной терапии [Conrad, et al., Throm.
Haemost., 63:319-320, 1990].
Оказывается, что состояния преэклампсии
и эклампсии у беременных женщин представляют собой состояние повышенной коагулопатии, на что указывает увеличение образования
фибрина, активация фибринолитической системы, активация тромбоцитов и снижение количества тромбоцитов [Clin. Obstet. Gynecol., 35:338350, 1992]. Считается, что преэклампсия развивается в результате маточно-плацентарной ишемии вследствие аномалии "сосудистого встраивания" плаценты. Последствия преэклампсии
включают гипертонию, а также ДВС, которое
приводит к высвобождению многочисленных
микротромбов, вызывающих повреждения плаценты, почек, печени и головного мозга [Rev.
Fr. Gynecol. Obstet., 86:158-163, 1991]. Кроме
того, преэклампсия может привести к тяжелому
и угрожающему жизни состоянию, известному
как синдром HELLP, который определяется как
преэклампсия, осложненная тромбоцитопенией,
гемолизом и нарушенной функцией печени
[Rathgeber, et al., Anasth. Intensivther Notfallmed.,
25:206-211, 1990]. Кроме того, было доказано,
что, по сравнению с нормальными беременностями, у беременных женщин с тяжелой преэклампсией имеется снижение уровня белка С [De
Stefano, et al., Thromb. Haemost., 74:793-794,
1995].
Таким образом, риск венозных тромбоэмболических осложнений, развивающихся у беременных женщин, вызывает основное опасение, особенно у женщин, имеющих в анамнезе
тромбоэмболические явления. Хотя возможность тяжелых осложнений, таких как преэклампсия или ДВС, относительно низка, предполагалось, что существенно начать терапию ДВС
как можно раньше после ее диагностики с помощью начала ингибирования активированной
системы свертывания [Rathgeber et al., Anasth.
Intensivther Notfallmed., 25:206-211, 1990]. Осложнения преэклампсии или ДВС аналогичны
ситуации, которая происходит при сепсисе, в
том, что имеется состояние гиперкоагуляции и
снижение уровня белка С.
Обширные хирургические
вмешательства/травма
В период восстановления после обширных
хирургических вмешательств или травм в результате несчастных случаев у пациентов часто
002496
8
встречаются связанные со свертываемостью
крови осложнения в результате вызванного состояния гиперкоагуляции [Watkins, et al., Klin.
Wochenschr., 63:1019-1027, 1985]. Состояния гиперкоагуляции все чаще признаются как причины венозной тромбоэмболии у хирургических
пациентов [Thomas, et al., Am. J. Surg., 158:491494, 1989; LeClerc, J.R., Clin. Appl. Thrombosis/
Hemostasis, 3(3):153-156, 1997]. Кроме того, это
состояние гиперкоагуляции может привести к
осложнениям с симптомами, подобными ДВС,
что встречается нечасто, но, тем не менее, при
ее развитии является разрушительным и часто
смертельным [Collins, et al., Am. J. Surg.,
124:375-380, 1977].
Кроме того, у пациентов, подвергающихся
аортокоронарному
шунтированию
(АКШ)
[Menges, et al., J. Cardiothor. Vase. An., 10:482489, 1996], обширным операциям на позвоночнике [Мауеr, et al., Clin. Orthop., 245:83-89,
1989], обширным хирургическим вмешательствам на органах брюшной полости [Blarney, et al.,
Thromb. Haernost., 54:622-625, 1985], обширным
ортопедическим или артропластическим операциям на нижних конечностях [LeClerc, 1997],
или другим типам операций [Thomas, et al., Am.
J. Surg., 158:491-494, 1989], иногда развиваются
осложнения в виде венозной тромбоэмболии.
Кроме того, исследователи в Японии предложили лечить микрососудистый тромбоз, связанный
с травмой спинного мозга [заявка на патент
JP8325161A], полученным из плазмы белком С
в дозе 1-10 мг/сут для взрослого или предпочтительно 2-6 мг, разделенные на 1-2 раза, для введения в виде болюса или с помощью внутривенного вливания.
Предполагалось, что антикоагулянтная терапия является важной в качестве профилактической терапии для предотвращения тромбоэмболических венозных осложнений у пациентов
при обширных хирургических вмешательствах
или травме [Thomas, et al., 1989; LeClerc, 1997].
Например, у многих пациентов, погибающих от
эмболии легочной артерии, нет клинических
данных предшествующих тромбоэмболических
явлений, и они умирают до установления диагноза и начала лечения [LeClerc, 1997]. Существующие способы профилактики, например варфарин, низкомолекулярные гепарины, имеют
ограничения, такие как остаточный проксимальный тромбоз или необходимость частых
подборов дозы.
РДСВ
Респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ) характеризуется отеком легких,
микротромбами, воспалительной клеточной
инфильтрацией и отдаленным фиброзом. Основным механизмом этих множественных клеточных и воспалительных реакций является активация свертывания, приводящая к состоянию
гиперкоагуляции. Обычные расстройства свертывания, связанные с РДСВ, включают внутри-
9
сосудистое свертывание и ингибирование фибринолиза. Фибрин, образованный активацией
системы свертывания и ингибированием фибринолиза, предположительно участвует в патогенезе острого легочного повреждения. Сепсис,
травма и другие тяжелые заболевания являются
важными факторами риска, которые приводят к
РДСВ [Hasegawa, et al., Chest, 105(1):268-277,
1944].
РДСВ связан с активацией свертывания и
ингибированием фибринолиза. Существует значительное клиническое доказательство наличия
легочных сосудистых микроэмбол, которые
аналогичны гиперкоагуляции, имеющей место
при ДВС. Поэтому в настоящее время существует необходимость в эффективном лечении
002496
10
этого состояния гиперкоагуляции, связанного с
РДСВ.
Для облегчения сравнения уровня доз белка С, указанных в литературе и патентных документах, в таблице представлены нормализованные уровни доз нескольких исследований у
людей или нечеловекообразных обезьян. Эти
данные устанавливают уровни доз, которые
выше или ниже, чем уровни доз, предоставленные в настоящем изобретении. Важно отметить,
что исследования на людях были проведены с
использованием зимогена белка С, полученного
из плазмы, в то время как в исследовании на
нечеловекообразных ообезьянах использовался
рекомбинантный человеческий аРС.
Ссылка
Taylor et al.,
патент США
№ 5009839
Rivard et al.,
Ped., 126:646,
1995
Указанная в публикации доза
Нормализованная доза
В/в введение от 2 до 64 мг аРС/кг/мин; дополни- От 120 мкг/кг/ч, вливаетельно можно ввести болюс от 1 до 10 мг аРС [столбец 5, мыx в течение 8-10 ч.
строки 14-19].
В/в введение в дозе 100 ME*/кг зимогена белка С, получен- 400 мкг/кг за 15-20 мин.
ного из плазмы, в течение 15-20 мин с периодом каждые 6 ч
в течение острой фазы, а затем 1-2 раза/день в течение
9 дней [стр.648, столбец 1, 1-й абзац].
Gerson et al.,
В/в введение в болюсной дозе 70 ME*/кг зимогена белка С, Болюс 280 мкг/кг кажPed., 91:418-422, полученного из плазмы, каждые 6 ч. Затем проводилось дые 6 ч, затем постоян1993
постоянное вливание 10 МЕ/кг/ч в течение 11 дней ное вливание 40 мкг/кг/ч
[стр.419, столбец 2, 1-й абзац].
в течение 11 дней.
В/в введение начинали через 3 ч после поступления и про- Болюс 400 мкг/кг кажRintala et al.,
Lancet, 347:1767, должали в течение 7 дней. 100 ME*/кг зимогена белка С, дые 6 ч в течение 7 дней.
полученного из плазмы, каждые 6 ч и позднее подбор
1996
белка С в плазме [стр.1767, столбец 2, 2-ой абзац].
Smith et al.,
Каждый пациент получал ударную дозу 100 МЕ*/кг зимоге- Болюс 400 мкг/кг +
Thromb. Haem., на белка С, полученного из плазмы, с последующим посто- 60 мкг/кг/ч (время влиPS-1709, 1997
янным вливанием 15 МЕ/кг [стр.419, столбец 1, PS-1709].
вания не было указано).
Обычная доза составляет 20-1000 ЕД** полученного из От 4 до 200 мкг/кг.
Fujiwara et al.,
патент Японии плазмы аРС/кг веса тела/день или более предпочтительно Время вливания не при50-300 ЕД/кг с дробным введением 1-2 раза. В качестве ведено.
JP7097335A
способа введения наиболее целесообразно применение
внутривенного вливания [стр.9, абзац 0016].
Okajama et al.,
Эффективная доза PC или аРС, полученного из плазмы, От 42 до 420 мкг/ч.
патент Японии составляет 1-10 мг/день для взрослого или предпочтительно
JP8325161A
2-6 мг для введения дробно 1-2 раза. В качестве способа
введения можно использовать болюсное введение (при однократном введении) или внутривенное вливание [стр.10,
абзац 0013].
Okajama et al.,
Введение полученого из плазмы аРС (3 мг/день в течение 2 мкг/кг/ч и 4 мкг/кг/ч.
Amer. J. of He2 дней с последующим введением 6 мг/день в течение
matology, 33:277- 3 дней) [стр.278, столбец 1, 1-й полный абзац].
278 (1990)
Доза активного белка С находится в диапазоне от 1 до 10 мг От 1,8 до 18 мкг/кг/ч.
Bang et al.,
в качестве ударной дозы с последующим постоянным Время вливания не припатент США
вливанием в количествах в диапазоне от 3 до 30 мг/день водится.
№ 4775624
[столбец 19, строки 55-59].
+ Нормализованная доза представляет собой преобразование указанной дозы в обозначение, эквивалентное мкг/кг/ч.
* 1 ME является эквивалентом приблизительно 4 мкг белка С.
** 1 ЕД определяется как количество, которое удваивает активированное протромбиновое время в
плазме здорового человека. Это переводится приблизительно в 5 единиц/мкг АРС.
11
Однако, несмотря на эти сообщения, схема
дозировки для безопасного и эффективного лечения людей, страдающих приобретенным состоянием повышенной свертываемости или недостаточностью белка С, связанной с сепсисом,
различными видами трансплантации, ожогами,
беременностью, обширными хирургическими
вмешательствами, травмой или РДСВ, остается
неизвестной. Эти исследования не являются
прогностическими в плане применения рекомбинантного активированного белка С настоящего изобретения в лечении состояний гиперкоагуляции или приобретенной недостаточности
белка С у людей.
Настоящее изобретение раскрывает применение аРС в клиническом испытании у пациентов с тяжелым сепсисом. У этих пациентов в
группе, получавшей лечение рекомбинантным
активированным белком С (r-аРС), было выявлено значимое улучшение функции органов,
снижение маркеров ДВС и снижение смертности по сравнению с группой плацебо-контроля.
Дозы аРС, использованные у пациентов с тяжелым сепсисом, составили 12, 18, 24 и 30 мкг/кг/ч
при вливании в течение 48 ч. В этом исследовании дозы 12 и 18 мкг/кг/ч были неэффективны.
К удивлению, дозы 24 и 30 мкг/кг/ч, использованные в этом исследовании, были эффективны
и являются значимо и неожиданно низкими по
сравнению с опубликованными преклиническими фармакологическими данными.
Кроме того, заявители обнаружили, что
преклинические токсикологические исследования у нечеловекообразных обезьян показывают,
что максимальная безопасная доза аРС при вливании в течение 96 ч ограничена приблизительно 50 мкг/кг/ч. Эти данные также неожиданны
при сравнении с предшествующим уровнем
техники. Действительно, уровни доз r-аРС для
людей, которые были основаны на предшествующих преклинических и клинических исследованиях, будут превышать токсикологический
диапазон, установленный в указанных выше
токсикологических исследованиях.
Настоящее изобретение предоставляет
способ лечения больных людей с приобретенным состоянием гиперкоагуляции или приобретенной недостаточностью белка С, который
включает введение указанному пациенту с помощью постоянного вливания в течение от приблизительно 24 до приблизительно 144 ч активированного белка С в дозировке от приблизительно 20 до приблизительно 50 мкг/кг/ч.
Изобретение также предоставляет способ
лечения больных людей с приобретенным состоянием гиперкоагуляции или приобретенной
недостаточностью белка С, который включает
введение указанному пациенту эффективного
количества активированного белка С для достижения концентраций активированного белка С в
плазме в диапазоне от 2 нг/мл до 200 нг/мл.
002496
12
Таким образом, настоящее изобретение устанавливает способы использования аРС в лечении у больных людей состояния гиперкоагуляции или приобретенной недостаточности белка
С, связанных с сепсисом, скоротечной пурпурой
и менингококкемией.
Настоящее изобретение устанавливает
способы использования aPC для лечения состояния гиперкоагуляции или приобретенной
недостаточности белка С, связанных с тяжелыми ожогами.
Настоящее изобретение устанавливает
способы использования aPC для лечения состояния гиперкоагуляции или приобретенной
недостаточности белка С, связанных с трансплантацией костного мозга и других органов.
Настоящее изобретение устанавливает
способы использования аРС для лечения состояния гиперкоагуляции или приобретенной
недостаточности белка С, связанных с проведением у больных людей обширных хирургических вмешательств или наличием тяжелой
травмы и восстановлением после них.
Настоящее изобретение устанавливает
способы использования aPC для лечения состояния гиперкоагуляции или приобретенной
недостаточности белка С, связанных с осложнениями во время беременности.
Изобретение, кроме того, предоставляет
способ лечения больных людей с приобретенным состоянием гиперкоагуляции или приобретенной недостаточностью белка С, связанных с
РДСВ.
В настоящем изобретении следующие термины имеют указанные ниже обозначения.
аРС или активированный белок С относится к рекомбинантному активированному белку
С. аРС включает и представляет собой предпочтительно человеческий белок С, хотя аРС может
также включать другие виды или производные,
имеющие полную протеолитическую, амидолитическую, эстеролитическую и биологическую
(антикоагулянтную или профибринолитическую) активность белка С. Примеры производных белка С описаны Gerlitz, et al., патент
США № 5453373, и Foster, et al., патент США
№ 5516650, все методики которых включены
сюда в качестве ссылки. Рекомбинантный активированный белок С может быть получен с помощью активации зимогена рекомбинантного
человеческого белка С in vitro или с помощью
прямой секреции активированной формы белка
С. Белок С может быть получен в клетках, эукариотических клетках, трансгенных животных
или трансгенных растениях, включая, например,
секрецию из клеток 293 почки человека, в виде
зимогена, а затем очищенного и активированного с помощью методик, известных специалисту
в этой области.
Лечение - описывает тактику ведения и
ухода за пациентом с целью борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством и включа-
13
ет профилактическое введение аРС для предотвращения начала симптомов или осложнений
заболевания, состояния или расстройства или
введение аРС для устранения заболевания, состояния или расстройства.
Постоянное вливание - продолжающееся,
по существу, непрерывно введение раствора в
вену в течение определенного периода времени.
Болюсная инъекция - инъекция препарата
в определенном количестве (называемом болюсом) в течение периода времени до приблизительно 120 мин.
Подходящий для введения - лиофилизированная композиция или раствор, который пригоден для назначения в виде лечебного средства.
Емкость - контейнер, такой как ампула или
флакон, который используется для приема
предназначенного материала, т.е. аРС.
Стандартная дозированная форма - относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве стандартных доз для людей,
причем каждая дозированная форма содержит
заданное количество активного материала, которое, по расчетам, даст желаемый терапевтический эффект, в сочетании с подходящим фармацевтическим наполнителем.
Состояния гиперкоагуляции - избыточная
свертываемость, связанная с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, претромботическими состояниями, активацией
свертываемости или врожденной или приобретенной недостаточностью факторов свертывания, таких как аРС.
Зимоген - используемый здесь термин "зимоген белка С" относится к одноцепочечным
или двухцепочечным секретируемым, неактивным формам белка С.
Подросток - больной человек, включая, но
не ограничиваясь, новорожденных, грудных
детей и детей младше 18 лет.
Эффективное количество - терапевтически
эффективное количество фармацевтического
соединения.
Скоротечная пурпура - экхимотические
поражения кожи, лихорадка, гипотония, связанные с бактериальным сепсисом, вирусной, бактериальной или протозойной инфекциями.
Обычно имеется диссеминированное внутрисосудистое свертывание.
Настоящее изобретение относится к лечению или предотвращению состояний гиперкоагуляции или приобретенной недостаточности
белка С, связанных с сепсисом, различными
видами трансплантации, ожогами, беременностью, обширными хирургическими вмешательствами, травмой или РДСВ, с помощью активированного белка С. аРС может быть получен с
помощью методик, хорошо известных в этой
области, с использованием линий эукариотических клеток, трансгенных животных или трансгенных растений. Специалистам будет легко
002496
14
понять, что соответствующие линии эукариотических клеток включают, но не ограничиваются
клетками HEPG-2, LLC-MK2, СНО-К1, 293 или
AV12, примеры которых описаны Grinnell в патенте США № 5681932, включенном сюда в
качестве ссылки. Кроме того, примеры трансгенной выработки рекомбинантных белков описаны Drohan, et al., в патенте США № 5589604 и
Archibald, et al, в патенте США № 5650503,
включенных сюда в качестве ссылки.
Для того, чтобы быть полностью активным
и функционирующим в условиях применения
настоящих способов, aPC, полученный с помощью любого из этих способов, должен быть
подвергнут посттрансляционным модификациям, таким как добавление девяти гаммакарбоксиглутаматов (гамма-карбокислирование,
т.е. содержание Gla), добавление эритро-бетагидрокси-Аsр (бета-гидроксилирование), добавление четырех связанных с Asn олигосахаридов
(гликозилирование), удаление лидерной последовательности (42 аминокислотных остатка) и
удаление дипептида Lys 156-Arg 157. Без таких
посттрансляционных модификаций aPC не является полностью функциональным или является нефункциональным.
Композиция аРС может быть получена в
соответствии с известными способами получения фармацевтически приемлемых композиций.
аРС будет вводиться парентерально для обеспечения его доставки в поток крови в эффективной форме с помощью инъекции соответствующей дозы в виде постоянного вливания в течение от приблизительно 24 до приблизительно
144 ч. Количество введенного аРС будет составлять от приблизительно 20 до приблизительно
50 мкг/кг/ч. Более предпочтительно количество
введенного аРС будет составлять от приблизительно 22 до приблизительно 40 мкг/кг/ч. Еще
более предпочтительно количество введенного
аРС будет составлять от приблизительно 22 до
приблизительно 30 мкг/кг/ч. Наиболее предпочтительные количества введенного аРС будут
составлять от приблизительно 24 до приблизительно 30 мкг/кг/ч.
Альтернативно, аРС будет введен с помощью инъекции части (от 1/3 до 1/2) соответствующей дозы в 1 ч в виде болюсной инъекции в
течение времени от приблизительно 5 до приблизительно 120 мин с последующим постоянным вливанием соответствующей дозы в течение от приблизительно 24 до приблизительно
144 ч, что в результате приводит к введению
соответствующей дозы в течение периода от 24
до 144 часов.
Только после тщательно контролируемых
клинических исследований и изнурительных
экспериментальных исследований заявители
обнаружили, что уровни доз от приблизительно
20 до приблизительно 50 мкг/кг/ч, постоянно
вливаемые в течение от приблизительно 24 до
приблизительно 144 ч, приводят к эффективно-
15
му лечению. Наиболее предпочтительный уровень дозы aPC, который следует вводить для
лечения больных людей с описанными здесь
приобретенными состояниями гиперкоагуляции
или приобретенной недостаточности белка С,
будет составлять приблизительно 24 мкг/кг/ч.
Процедура 1. Получение человеческого
белка С.
Рекомбинантный человеческий белок С (rhPC) получают в клетках 293 почки человека с
помощью методик, хорошо известных специалисту в этой области, таких как методики, изложенные в патенте США № 4891952, выданном Yan, все положения которого включены
сюда в качестве ссылки. Ген, кодирующий человеческий белок С, раскрыт и заявлен в патенте США № 4775624, выданном Bang et al., все
положения которого включены сюда в качестве
ссылки. Плазмида, используемая для экспрессии
человеческого белка С в клетках 293, представляет собой плазмиду pLPC, которая раскрыта и
заявлена в патенте США № 4992373, выданном
Bang et al., все положения которого включены
сюда в качестве ссылки. Строение плазмиды
pLPC также описано в описании европейского
патента № 0445939 и в работе Grinnell, et al.,
1987, Biotechnology, 5:1189-1192, положения
которых включены сюда в качестве ссылки.
Вкратце, плазмиду трансфецируют в клетки 293,
затем устойчивые трансформанты выявляют,
субкультивируют и выращивают в бессывороточных средах. После ферментации бесклеточную среду получают с помощью микрофильтрации.
Человеческий белок С отделяют от культуральной жидкости с помощью адаптации методик, изложенных в патенте США № 4891952,
выданном Yan, все положения которого включены сюда в качестве ссылки. Готовят 4 мМ
раствор осветленной среды в EDTA перед ее
поглощением на анионообменной смоле (FastFlow Q, Pharmacia). После промывания 4 колоночными объемами 20 мМ Tris, 200 мМ NaCl,
pH 7,4 и 2 колоночными объемами 20 мМ Tris,
150 мМ NaCl, pH 7,4 связанный зимоген рекомбинантного человеческого белка С элюируют 20
мМ Tris, 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, pH 7,4. По
данным электрофореза на SDS-полиакриламидном геле чистота элюированного белка
составила более 95%.
Дальнейшую очистку белка осуществляют
с помощью приготовления раствора белка в
NaCl (3M) последующим поглощением на гидрофобной ионообменной смоле (Toyopearl
Phenyl 650М, Toso-Haas), уравновешенной в
20 мМ Tris, 3М NaCl, 10 мМ CaCl2, pH 7,4. После промывания 2 колоночными объемами
уравновешивающего буфера без CaCl2 рекомбинантый человеческий белок С элюируют 20 мМ
Tris, pH 7,4.
Элюированный белок получают для активации с помощью удаления остаточного каль-
002496
16
ция. Рекомбинантый человеческий белок С пропускают через металлическую колонку для проведения аффинной хроматографии (Chelex-100,
Bio-Rad) для удаления кальция и снова связывают с анионообменной смолой (Fast Flow Q,
Pharmacia). Обе эти колонки располагают последовательно и уравновешивают в 20 мМ Tris,
150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, pH 6,5. После загрузки белка колонку Chelex-100 промывают
одним колоночным объемом того же буфера
перед отсоединением ее от последовательного
ряда. Анионообменную колонку промывают
3 колоночными объемами уравновешивающего
буфера перед элюированием белка 0,4 мМ NaCl,
20 мМ Tris-ацетатом, pH 6,5. Концентрацию
белка в растворах рекомбинантного человеческого белка С и рекомбинантного активированного белка С измеряют с помощью экстинкции
ультрафиолетового излучения при 280 нм
E0,1%=1,85 или 1,95, соответственно.
Процедура 2. Активация рекомбинантного
человеческого белка С.
Бычий тромбин соединяют с aктивированной СН-cефарозой 4В (Pharmacia) в присутствии 50 мМ HEPES, pH 7,5 при 4°С. Реакцию
соединения проводят на смоле, уже упакованной в колонку, с использованием приблизительно 5000 единиц тромбина на 1 мл смолы. Осуществляют циркуляцию раствора тромбина через колонку в течение приблизительно 3 ч перед
добавлением моноэтиламина до концентрации
0,6 мл/л циркулирующего раствора. Осуществляют циркуляцию содержащего моноэтиламин
раствора в течение дополнительных 10-12 ч для
обеспечения полной блокировки не вступивших
в реакцию аминов на смоле. После блокировки
связанную с тромбином смолу промывают
10 колоночными объемами 1М NaCl, 20 мМ
Tris, pH 6,5 для удаления всего неспецифично
связанного белка и используют для реакций активации после уравновешивания в активационном буфере.
Очищенный r-hPC готовят в концентрации
5 мМ в EDTA (для хелатообразования с любым
остаточным кальцием) и разводят до концентрации 2 мг/мл 20 мМ Tris, pH 7,4 или 20 мМ
Tris-ацетатом, pH 6,5. Этот материал пропускают через тромбиновую колонку, уравновешенную при 37°С 50 мМ NaCl, или 20 мМ Tris, pH
7,4, или 20 мМ Tris-ацетатом, pH 6,5. Скорость
потока подбирают для обеспечения контакта
между r-hPC и тромбиновой смолой в течение
приблизительно 20 мин. Оттекающую жидкость
собирают и немедленно анализируют на амидолитическую активность. Если материал не обладает специфической активностью (амидолитической), сравнимой с установленным стандартом аРС, его подвергают повторному циклу обработки в тромбиновой колонке для завершения
активации r-hPC. Затем осуществляют разведение материала 1:1 20 мМ буфером, как указано
выше, при pH приблизительно от 7,4 до 6,0,
17
причем более низкий pH предпочтительнее для
предотвращения автодеградации для поддержания аРС в более низких концентрациях, пока он
ожидает следующего этапа обработки.
Удаление выщелоченного тромбина из материала, содержащего аРС, осуществляют с помощью связывания аРС с анионообменной смолой (Fast Flow Q, Pharmacia), уравновешенной в
активационном буфере (или 20 мМ Tris, pH 7,4,
или, предпочтительно, 20 мМ Tris-ацетат, pH
6,5) с 150 мМ NaCl. Тромбин проходит через
колонку и элюируется во время промывания 26-колоночным объемом 20 мМ уравновешивающего буфера. Связанный аРС элюируют
ступенчатым градиентом с использованием
0,4М NaCl или в 5 мМ Tris-ацетате, pH 6,5, или
в 20 мМ Tris, pH 7,4. Промываниe колонки более высокими объемами способствует более
полному удалению додекапептида. Материал,
элюированный из этой колонки, хранят или в
замороженном растворе (-20°С), или в виде
лиофилизированного порошка.
Амидолитическую активность (AU) аРС
определяют с помощью высвобождения паранитроанилина из синтетического субстрата H-DPhe-Pip-Arg-паранитроанилида (S-2238), приобретенного у Kabi Vitrum, с использованием
спектрофотометра
с
диодной
матрицей
DU-7400. Одну единицу активированного белка
С определяют как количество фермента, требуемое для высвобождения 1 мкмоля паранитроанилина в 1 мин при 25°С, рН 7,4 с использованием коэффициента 9620 М-1см-1 экстинкции
для паранитроанилина при 405 нм.
Антикоагулянтную активность активированного белка С определяют с помощью измерения удлинения времени свертывания при анализе свертывания по частичному активированному тромбопластиновому времени (АРТТ).
Строят стандартную кривую в буфере для разведения (1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина со степенью очистки для радиоиммуноанализа, 20 мМ Tris, рН 7,4, 150 мМ NaCl,
0,02% NaN3) с диапазоном концентрации белка
С от 125 до 1000 нг/мл, в то время как образцы
готовят в различных разведениях в этом диапазоне концентрации. В каждую кювету с образцом добавляют 50 мкл холодной лошадиной
плазмы и 50 мкл восстановленного реактива для
определения частичного активированного тромбопластинового времени (реактив АРТТ, Sigma)
и инкубируют при 37°С в течение 5 мин. После
инкубации в каждую кювету добавляют 50 мкл
соответствующих образцов или стандартов. Для
определения исходного времени свертывания
вместо образца или стандарта используют буфер для разведения. Таймер фиброметра (СоА
Screener Hemostasis Analyzer, American Labor)
запускают после добавления в каждый образец
или стандарт 50 мкл 30 мМ CaCl2 при 37°С.
Концентрацию активированного белка С в об-
002496
18
разцах рассчитывают по уравнению линейной
регрессии стандартной кривой.
Приведенные здесь данные определения
времени свертывания представляют собой средние величины минимум трех повторных измерений, включая образцы стандартной кривой.
Приведенные выше описания позволяют
специалисту с соответствующим опытом в этой
области получить аРС и использовать его при
лечении состояний гиперкоагуляции или приобретенной недостаточности белка С, связанных с
сепсисом, различными видами трансплантации,
ожогами, беременностью, обширными хирургическими вмешательствами/травмой и РДСВ, но
не ограничивающихся ими.
Пример 1. Содержание аРС в плазме человека.
Шесть пациентов получают внутривенное
вливание aPC со скоростью 1 мг/м2/ч или приблизительно 0,024 мг/кг/ч в течение периода 24 ч.
Введенный аРС представляет собой лиофилизированную композицию, содержащую 10 мг аРС,
5 мМ Tris-ацетатного буфера и 100 мМ хлорида
натрия, с восстановлением влагосодержания
2-мя мл воды и доведением рН до 6,5.
Концентрацию аРС в плазме измеряют с
использованием иммунозахватного амидолитического анализа. Кровь набирают в присутствии
цитратного антикоагулянта и бензамидина, обратимого ингибитора аРС. Фермент захватывается из плазмы с помощью аРС-специфичного
мышиного моноклонального антитела, С3, иммобилизованного на титрационном микропланшете. Ингибитор удаляют с помощью промывания и амидолитическую активность или аРС
измеряют с использованием олигопептидного
хромогенного субстрата. После инкубации в
течение 16-20 ч при 37°С измеряют оптическую
плотность при 405 нм и данные анализируют с
помощью алгоритма взвешенной линейной аппроксимации кривой. Концентрацию аРС оценивают по стандартной кривой в диапазоне
концентраций от 0 до 100 нг/мл. Предел количественной оценки анализа составляет 1,0 нг/мл.
Уровни доз аРС и концентрацию в плазме измеряют приблизительно через 24 ч. Доза 0,024
мг/кг/ч дает через 24 ч концентрацию в плазме
приблизительно 50 нг/мл.
Пример 2. Двойное слепое плацебо-контролируемое испытание у пациентов с сепсисом.
1-й этап.
Этот протокол представляет собой двухэтапное, двойное слепое плацебо-контролируемое испытание у пациентов с тяжелым сепсисом. На 1-ом этапе всем 72 пациентам вливали в
течение 48 ч рекомбинантный человеческий активированный белок С (r-аРС).
Критериями включения были три из четырех обычно принятых критериев наличия сепсиса (частота сердечных сокращений, дыхательное
усилие, повышенная/пониженная температура,
увеличение/уменьшение количества лейкоци-
19
тов). У пациентов также должна была проявляться некоторая степень нарушения функции
органов, определяемая или в виде шока, сниженного выделения мочи, или гипоксемии. Использовали четыре различные дозы: 12, 18, 24,
30 мкг/кг/ч. r-аРС вливали в течение 48 ч с помощью способа непрерывной инфузии. Первичными исходами этого исследования были безопасность, как функция дозы и длительности
введения дозы, и способность r-аРС корригировать коагулопатию, как функция дозы и длительности введения дозы.
При отсутствии других уточнений информация о смертности включает все, даже самые
низкие, дозы. Важно отметить, что наши данные
о смертности при использовании плацебо согласуются с прогнозируемой смертностью при использовании плацебо. Общая смертность на
28-й день представляла собой исход у пациентов, получавших плацебо, в сравнении с пациентами, получавшими r-аРС.
Общая наблюдавшаяся смертность при использовании плацебо составила 38% (10/26), а
общая наблюдавшаяся смертность при использовании r-аРС составила 20% (9/46). В подгруппе, включавшей только две максимальные дозы
r-аРС (24 и 30 мкг/кг/ч), в сравнении со смертностью пациентов, получавших плацебо, общая
наблюдавшаяся смертность составила 13%
(3/24).
Второй подгрупповой анализ включал пациентов с приобретенной недостаточностью
белка С, определявшейся как исходная активность белка С менее 60%. Из 64 пациентов, у
которых имелись данные об исходной активности белка С, у 61 пациента, или 95%, во время
включения в исследование имелась приобретенная недостаточность белка С. Наблюдавшаяся
смертность пациентов с недостаточностью белка С при использовании плацебо составила 41%
(9/22), а наблюдавшаяся смертность пациентов с
недостаточностью белка С при использовании
r-аРС составила 18% (7/39).
Значительная часть информации, свидетельствующей о том, что лечение низкими дозами r-аРС оказывает благоприятное воздействие на пациентов с тяжелым сепсисом, включает средний период времени до наступления
смерти у пациентов, получавших плацебо, в
сравнении с пациентами, получавшими лечение.
Из 10 пациентов, которые умерли в группе плацебо, средний период времени до наступления
смерти составил 6 дней. В группе, получавшей
лечение r-аРС, средний период времени до наступления смерти составил 14 дней. Кроме того,
4 из 9 пациентов, которые умерли в группе, получавшей лечение r-aPC, выжили в течение 21
или более дней и в последующем умерли в результате осложнения, не связанного с их первым эпизодом сепсиса. Два из четырех случаев
смерти в отдаленные сроки произошли в группе
низкой дозы (12 мкг/кг/ч). Оба эти пациента
002496
20
оставались в отделении интенсивной терапии и
находились на искусственной вентиляции легких в течение всего хода исследования до наступления их смерти (на 27-й день). Два других
пациента, умерших в отдаленные сроки, относились к группе высокой дозы (30 мкг/кг/ч). У
обоих этих пациентов первоначально проявлялось улучшение. В пределах 2 недель у обоих
пациентов была прекращена искусственная вентиляция легких и восстановлено самостоятельное дыхание и они были переведены из отделения интенсивной терапии. Через 1 неделю один
пациент умер от вызванного сепсисом респираторного дистресс-синдрома после просьбы не
продолжать реанимационные мероприятия.
Второй пациент умер на 28-й день после того,
как перенес эпизод легочной недостаточности,
связанной со вторым эпизодом сепсиса. Этот
пациент также попросил не продолжать реанимационные мероприятия, и поэтому не был повторно интубирован. Следует отметить, что, в
соответствии с протоколом лечения, не было
санкционировано повторное лечение r-аРС пациентов, у которых в течение 28-дневного исследования развился второй эпизод тяжелого
сепсиса.
Информация о смертности в этом исследовании удивительна и неожиданна. Ни в одном
другом двойном слепом, плацебо-контролируемом исследовании не были собраны данные,
демонстрирующие такое выраженное снижение
общей смертности в течение 28 дней.
Пример 3. Композиция активированного
белка С.
Устойчивую лиофилизированную композицию активированного белка С получают с
помощью способа, который включает лиофилизацию раствора, включающего приблизительно
2,5 мг/л активированного белка С, приблизительно
15 мг/л сахарозы, приблизительно 20 мг/л NaCl и
буфер цитрата натрия, имеющий рН выше 5,5,
но ниже 6,5. Кроме того, получение устойчивой
лиофилизированной композиции активированного белка С включает лиофилизацию раствора,
включающего приблизительно 5 мг/л активированного белка С, приблизительно 30 мг/л сахарозы, приблизительно 38 мг/л NaCl и нитратный
буфер, имеющий рН выше 5,5, но ниже 6,5.
Соотношение аРС:соль:наполнитель (масс.:
масс.:масс.) представляет собой важный фактор в
композиции, пригодной для процесса лиофилизации. Соотношение варьирует в зависимости от
концентрации аРС, выбора и концентрации соли
и выбора и концентрации наполнителя. В частности, предпочтительно соотношение приблизительно 1 части активированного белка С к
приблизительно 7,6 частям соли, к приблизительно 6 частям наполнителя.
Стандартную дозированную форму композиции активированного белка С, пригодную для
введения с помощью постоянного вливания,
получают с помощью смешивания активиро-
21
002496
ванного белка С, NaCl, сахарозы и буфера цитрата натрия. После смешивания 4 мл раствора
переносят в емкость для стандартной дозированной формы и лиофилизируют. Емкость со
стандартной дозированной формой, содержащей
от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг
активированного белка С, пригодного для введения нуждающимся в нем пациентам в дозе от
приблизительно 0,02 мг/кг/ч до приблизительно
0,05 мг/кг/ч, герметизируют и хранят до использования.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения больных людей с приобретенным состоянием гиперкоагуляции или
приобретенной недостаточностью белка С, который включает введение указанному пациенту
с помощью постоянного вливания в течение от
приблизительно 24 до приблизительно 144 ч
активированного белка С человека в дозировке
от приблизительно 20 до приблизительно 50
мкг/кг/ч.
2. Способ по п.1, в котором указанное состояние гиперкоагуляции или недостаточность
белка С связаны с сепсисом.
3. Способ по п.1, в котором указанное состояние гиперкоагуляции или недостаточность
белка С связаны со скоротечной пурпурой.
4. Способ по п.1, в котором указанное состояние гиперкоагуляции или недостаточность
белка С связаны с менингококкемией.
5. Способ по п.4, в котором больной человек является подростком.
6. Способ по п.1, в котором указанное состояние гиперкоагуляции или недостаточность
белка С связаны с ожогами.
7. Способ по п.1, в котором указанный
способ лечения предназначен для людей, страдающих венозными тромбоэмболическими осложнениями, связанными с трансплантацией
костного мозга и других органов.
22
8. Способ по п.1, в котором указанный
способ лечения предназначен для людей, страдающих венозными тромбоэмболическими осложнениями, связанными с хирургической операцией или травмой.
9. Способ по п.1, в котором указанный
способ лечения предназначен для людей, страдающих приобретенным состоянием гиперкоагуляции или приобретенной недостаточностью
белка С, связанными с осложнениями во время
беременности.
10. Способ по п.1, в котором указанное состояние гиперкоагуляции или недостаточность
белка С связаны с респираторным дистресссиндромом взрослых (РДСВ).
11. Способ по п.1, который включает введение указанному пациенту с помощью постоянного вливания в течение от приблизительно
36 до приблизительно 120 ч активированного
белка С человека в дозировке от приблизительно 20 до приблизительно 50 мкг/кг/ч.
12. Способ по п.11, который включает введение указанному пациенту с помощью постоянного вливания в течение от приблизительно
48 до приблизительно 96 ч активированного
белка С человека в дозировке от приблизительно 20 до приблизительно 50 мкг/кг/ч.
13. Способ по п.12, который включает введение указанному пациенту от приблизительно
22 до приблизительно 30 мкг/кг/ч активированного белка С человека.
14. Способ по п.13, который включает введение указанному пациенту приблизительно 24
мкг/кг/ч активированного белка С человека.
15. Способ лечения больных людей с приобретенным состоянием гиперкоагуляции или
приобретенной недостаточностью белка С,
включающий введение указанному пациенту с
помощью постоянного вливания в течение от
приблизительно 24 до приблизительно 144 ч
эффективного количества активированного белка С для достижения уровня активированного
белка С в плазме в диапазоне от 2 до 200 нг/мл.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, ГСП-9, 101999, Москва, Центр, М. Черкасский пер., 2/6