Диссертация Баурина Д.В. размещено 16.12.2014 г., 4.51 МБ
advertisement
2 Оглавление Введение ................................................................................................................. 7 1 Литературный обзор ......................................................................................... 10 1.1 Производство и переработка масленичных культур подсолнечника .......... 10 1.2 Технологии переработки маслосемян подсолнечника ................................. 11 1.3 Современные подходы к глубокой переработке обедненного растительного сырья и отходов, получение углеводно-белковых кормов ................................ 21 1.4 Требования, предъявляемые к изолятам белка пищевого назначения, характеристика продукта белкового изолята ..................................................... 36 2 Материалы и методы......................................................................................... 40 2.1 Объекты исследования ................................................................................... 40 2.1.1 Шрот подсолнечника .................................................................................. 40 2.1.2 Микробные объекты исследования ............................................................ 40 2.1.2 Ферментные препараты .............................................................................. 40 2.2 Культивирование микроорганизмов и микробиологические методы анализа .................................................................................................................. 42 2.2.1 Составы питательных сред ......................................................................... 42 2.2.2 Глубинное культивирование....................................................................... 43 2.2.3 Твёрдофазное культивирование ................................................................. 43 2.2.5 Определение количества жизнеспособных клеток .................................... 44 2.3 Биохимические и физико-химические методы анализа ............................... 44 2.3.1 Содержание сухих веществ в образцах ...................................................... 44 2.3.2 Количественное определение белков ......................................................... 44 2.3.3 Количественное определение углеводов ................................................... 45 2.3.4 Количественное определение сырого жира ............................................... 47 3 2.3.5 Определение содержания сырой клетчатки ............................................... 48 2.3.6 Определение содержания общего азота и сырого протеина методом Къельдаля ............................................................................................................. 48 2.3.7 Определение содержания сырой золы ....................................................... 49 2.3.8 Определение протеолитической активности ферментных препаратов по модифицированному методу Ансона с казеинатом натрия ............................... 50 2.3.9 Определение аминокислотного состава ..................................................... 53 2.3.10 Определение содержания фенольных соединений .................................. 53 2.4 Методы исследования .................................................................................... 54 2.4.1Методика проведения ферментативного гидролиза................................... 54 2.4.2 Методика проведения ультрафильтрации (концентрирование и диафильтрация) .................................................................................................... 55 2.4.3 Выделение белка из растворов осаждением в изоэлектрической точке .. 56 2.4.4 Сорбция на активированном угле .............................................................. 56 2.4.5 Сушка ........................................................................................................... 57 2.5. Методы математической обработки результатов ........................................ 59 2.5.1. Корреляционный анализ ............................................................................ 59 2.5.2. Дисперсионный анализ .............................................................................. 59 2.5.3. Планирование и обработка факторного эксперимента ............................ 61 3 Разработка основ технологии получения изолятов и гидролизатов белка подсолнечника пищевого назначения и обоснование выбора способа экстракции ............................................................................................................ 63 3.1 Исследование количественных закономерностей процессов химической экстракции белка подсолнечного шрота и процесса осаждения белкового изолята .................................................................................................................. 63 3.1.1 Выбор параметров химической экстракции .............................................. 63 4 3.1.2 Кислотная экстракция ................................................................................. 64 3.1.3 Щелочная экстракция.................................................................................. 66 4 Исследование гидролиза количественных (щелочной экстракции закономерностей с добавлением проферментативного фермента) белка подсолнечного шрота ........................................................................................... 70 4.1 Выбор ферментного препарата ...................................................................... 70 4.1.1 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 51FP ............................................................................................................................... 71 4.1.2 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 7L ... ............................................................................................................................... 73 4.1.3 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 6L ... ............................................................................................................................... 77 4.1.4 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 40Е ............................................................................................................................... 79 4.1.5 Анализ результатов ферментативной обработки и выбор оптимальных параметров гидролиза .......................................................................................... 83 4.2.1 Исследование процесса концентрирования и очистки ферментативного гидролизата с применением мембранных методов ............................................ 88 4.2.2 Влияние сорбата калия на процесс ультраконцентрирования .................. 92 4.2.3 Изучение процесса тангенциальной ультрафильтрации с использованием половолоконного мембранного модуля .............................................................. 94 4.2.4 Изучение процесса осаждения белковых соединений гидролизата белка ............................................................................................................................... 97 4.3 Выбор стадии и способа получения конечного продукта, сушка белкового ферментативного гидролизата ........................................................................... 102 4.4 Характеристика полученных продуктов ..................................................... 104 5 5 Разработка путей утилизации твёрдого отхода производства изолята белка ............................................................................................................................. 107 5.1. Исследование поверхностного культивирования Bacillus cereus на депротеинизированном шроте подсолнечника ................................................ 107 5.1.1 Получение посевного материала Bacillus cereus для поверхностного культивирования ................................................................................................ 108 5.1.2 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на нативном подсолнечном шроте ............................................................................................................................. 109 5.1.3 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на депротеинизированном подсолнечном шроте, образующемся после щелочной экстракции ............... 110 5.1.4 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на депротеинизированном подсолнечном шроте, полученном в результате гидролиза препаратом Protex 40E ........................................................................................................... 111 5.2 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на ферментолизате ..................... 112 5.3 Исследование и оптимизация получения углеводно-белкового корма на основе депротеинизированного шрота ............................................................. 113 5.3.1 Предварительная оценка эффективности предобработки ....................... 114 5.3.2 Оптимизация условий предварительной обработки питательной среды методом факторного эксперимента ................................................................... 116 5.3.3 Исследование кинетики роста дрожжей и характеристика РУБК, полученного в оптимальных условиях предобработки субстрата .................. 122 5.3.4 Биохимическая характеристика продукта................................................ 124 5.3 Сравнение и анализ полученных продуктов ............................................... 125 6 Обоснование возможности использования отхода со стадии концентрирования в качестве компонента питательных сред......................... 126 6.1 Анализ состава пермеата ............................................................................. 126 6 6.2 Исследование и оптимизация удаления пигментных примесей ................ 126 6.3 Получение сухой формы пермеата и оценка её ростовых свойств ........... 131 6.4 Технологическая схема комплексной переработки шрота подсолнечника с получением изолята белка подсолнечника и РУБК для животных................. 132 6.5 Основные технико-экономические показатели .......................................... 135 Выводы ............................................................................................................... 137 Перечень сокращений и условных обозначений .............................................. 138 Список литературы ............................................................................................ 139 ПРИЛОЖЕНИЯ .................................................................................................. 161 Приложение 1 ..................................................................................................... 161 7 Введение Одним из направлений определяющих инновационное развитие биотехнологии является использование возобновляемых растительных ресурсов, развитие внутреннего спроса и импортозамещение биотехнологической продукции. Важнейшим приоритетом является распространение технологий, превращающих малоценные отходы в белковые продукты и компоненты с высокой добавленной стоимостью, в частности, использование растительных белков в пищевой промышленности. Разработка малоотходных эффективных технологий переработки вторичного возобновляемого растительного сырья, отвечающих требованиям экологической безопасности и снижению энергоемкости, имеет глобальное значение. Шрот подсолнечника образующееся в процессе – ценное производства вторичное масла, растительное является сырьё, перспективным источником высокачественного белка не только для кормовой промышленности. Значительное число научных исследований и разработок посвящено вопросам выделения и очистки белка подсолнечника [Степуро, 2006; Широкорядова, 2009], его использования в пищевой промышленности для повышения белковой ценности продуктов хлебопечения [Щеколдина, 2012]. Существующие технологии выделения масложировой фракции семян подсолнечника позволяют сохранить качество протеиновой фракции. Шрот, образующийся при экстракции масла из семян подсолнечника, на сегодняшний день недооценён как источник пищевого белка. Содержание сырого протеина в шротах достигает 42 %. Развитие новых способов выделения и модификации белковых продуктов наряду с совершенствованием производства ферментных препаратов даёт возможность предложить новый подход к выделению белка и утилизации образующихся отходов. Микробиологические методы позволяют восстанавливать и улучшать кормовые качества вторичного сырья, дополнительно получать продукты кормового назначения повышенной биологической ценности, что 8 является основой наиболее полной конверсии и увеличения доли переработки сельскохозяйственных отходов биотехнологическими методами. Целью настоящей работы является разработка рациональной малоотходной технологии комплексной переработки возобновляемого растительного сырья – под-солнечного шрота с получением изолята белка и оценки возможности микробиологи-ческой конверсии образующихся твёрдых и жидких отходов в ценные продукты. Для выполнения цели были сформулированы следующие задачи исследований: - изучить влияние основных параметров депротеинизации на выход белка шрота подсолнечника для обеспечения его максимального значения; - разработать способ и режимы депротеинизации, обеспечивающие максимальную степень извлечения белка в мягких условиях; - обосновать способы фракционирования получаемых изолятов белка шрота для обеспечения необходимого качества продукта пищевого назначения; - исследовать возможные пути биоконверсии низкомолекулярных продуктов фракционирования белкового изолята с целью их переработки в компоненты питательной среды для культивирования микроорганизмов и оценить биологический потенциал получаемых сред; кормовой разработать режимы получения растительной углеводно-белковой добавки (РУБК) при культивировании дрожжей на депротеинизированном шроте; - провести экономическую оценку предлагаемых технологических решений; - разработать лабораторный регламент на производство пищевой добавки – изолята белка пищевого назначения. Научная новизна. Впервые изучены процессы экстракции белка шрота подсолнечника в мягких условиях (pH и температурный режим) с использованием различных ферментных препаратов и последующее фракционирование полученных изолятов мембранными методами. Показано, что использование 9 протеолитических ферментных препаратов для интенсификации процесса щелочной экстракции в мягких условиях позволяет увеличить степень извлечения белковых соединений шрота подсолнечника до 72,5 % и обуславливает снижение концентрации солей натрия в конечном продукте. Предложена и апробирована схема проведения факторных экспериментов для оптимизации параметров обработки и биоконверсии обедненного растительного сырья и показана эффективность разработанного алгоритма. Проведённые исследования явились основой для разработки ресурсосберегающей экономически целесообразной технологии комплексной переработки возобновляемого растительного сырья – подсолнечного шрота – с получением продуктов пищевого и кормового назначения. Практическая значимость. Разработана лабораторная технология рациональной малоотходной переработки подсолнечного шрота и выданы исходные данные для создания пилотной установки. Разработаны режимы применения ферментов в процессе экстракции белка шрота подсолнечника щелочными растворами в мягких условиях, которые позволили уве-личить степень экстракции (выход) на 25-30 % при аналогичных условиях обработки без ферментов. Предложены условия переработки, включающей стадии концентрирования ферментативного гидролизата белка шрота подсолнечника, очистки, концентрирования и сушки жидкого отхода, стадии а также показана возможность получения белково-углеводного компонента питательной среды на его основе. Утверждён лабораторный регламент на производство пищевой добавки – изолята белка пищевого назначения (№ 01/26.59-2014, от «15» мая 2014 г.) Показана биологической ценность депротеинизированного шрота и низкомоле-кулярных фракций белкового изолята подсолнечного шрота при использовании в процессе культивирования микроорганизмов. 10 1 Литературный обзор 1.1 Производство и переработка масленичных культур подсолнечника Подсолнечник является одной из наиболее ценных сельскохозяйственных культур, выращиваемых на территории Российской Федерации, и наиболее рентабельной масленичной культурой. По данным на 2013 год в структуре посевных площадей подсолнечник занимает 9,3 % и уступает по данному показателю только пшенице, ячменю и многолетним травам для кормовых целей. Валовый сбор семян подсолнечника на зерно за десять лет увеличился более чем в 2 раза, в 2013 г. достиг рекордного показателя в 10,6 млн т. и имеет тенденции к росту (рисунок 1.1) [1]. Россия занимает лидирующие позиции по объёмам валового сбора подсолнечника в мире. Семена подсолнечника находят применение в пищевом производстве: хлебопечении, производстве закусок и кондитерских изделий, но наибольший объём семян перерабатывается на масло. Рисунок 1.1 – Валовый сбор семян подсолнечника 1991-2013 годы, тыс. тонн Для производства масла используется подсолнечник масличный Heliánthus ánnuus. Селекционная работа позволила предложить десятки устойчивых, 11 урожайных и высокопроизводительных сортов этой ценной масличной культуры. Ведущая роль принадлежит Всероссийскому научно-исследовательскому институту масличных культур им. В. С. Пустовойтова. За более чем 100 лет успешной работы предложены сотни сортов и гибридов, например, только за последние несколько лет: Натали, Умник, Патриот, Факел; гибриды Донской, Мэлин, Медас и др. По оценкам маркетинговой исследовательской компании BusinesStat, в период с 2008 по 2012 годы предложение подсолнечного масла в России увеличилось в два раза и в 2012 г. составило почти 4,3 млн т. В структуре производства продукта наибольшая доля принадлежала нерафинированному маслу. Спрос на подсолнечное масло на российском рынке обеспечивается внутренним потреблением и стабильно растёт. В 2012 году спрос составил около 8,1 кг на одного покупателя или 13 кг на душу населения при доле экспорта 43 %. Крупнейшими производителями являются ООО «Маслоэкстракционный завод Юг Руси», ОАО «Эфирное», ОАО «Аткарский маслоэкстракционный завод», ОАО «Казанский МЭЗ», ОАО «Астон Продукты Питания и Пищевые Ингредиенты» [2; 3]. Россия (наряду с Аргентиной, Европейским союзом и Украиной) является крупнейшим производителем шрота подсолнечника. Объёмы производства превышают 2,5 млн. тонн. По различным данным, доля экспорта в объеме спроса составляет от 25 до 75% в зависимости от объёмов ежегодного производства. В 2015 г. по прогнозам экспертов более 2 млн т. российского шрота будут направлены на экспорт [4]. 1.2 Технологии переработки маслосемян подсолнечника Основное применение подсолнечника – получение подсолнечного масла, которое затем употребляется для приготовления пищи и для технических нужд. Кроме того, семена подсолнечника используют в кулинарии, в качестве легких закусок и приготовления халвы. Разработаны и в различной степени получили 12 распространение механические, диффузионные, диффузионно-тепловые, гидромеханические, химические и биохимические процессы переработки семян на масло [5]. Современные технологии переработки семян подсолнечника предполагают извлечение масла экстракцией органическим растворителем, реже используют отжим, либо последовательную комбинацию данных методов. Экстракционный метод является более распространенным, так как обеспечивает более эффективное извлечение масла, а образующийся в процессе переработки шрот содержит не более 1 % растительных жиров [6]. Для увеличения выхода масла с единицы сырья экстракции подвергают дроблёные нешелушёные семена. Так, выход может достигать 600 кг на тонну сырья. Экстракция масла бензинами марок А и Б, а также гексаном является наиболее экономичной и позволяет обеспечить практически полное извлечение жиров из масличного сырья. Характеристика вторичных продуктов. Состав и свойства Шелуха подсолнечника составляет 21–30 % от общего веса зерна, на 79–90 % состоит из целлюлозы, лигнина и гемицеллюлозы и может служить сырьём для получения сахаров или основным компонентом твёрдой питательной среды при поверхностном культивировании грибов [7–11]. Однако большая часть шелухи сжигается [12; 13]. Известны способы использования шелухи подсолнечника в качестве компонента строительных материалов [14; 15]. Подсолнечный шрот – ценный вторичный продукт получения масла. Благодаря высокому содержанию белка обладает высокой биологической ценностью. Экстракционный шрот подсолнечника нашёл широкое применение в кормлении животных и птицы в составе комбикормов [16–19]. Особенности шрота как сырья, химический состав Шрот подсолнечника в соответствии с требованиями ГОСТ 11246-96 может содержать до 23 % сырой клетчатки и не менее 39 % сырого протеина в пересчёте на абсолютно сухой вес (АСВ). Белок подсолнечника характеризуется сравнительно низким содержанием альбуминов (17–20 %) и высоким содержанием глобулинов (55–66 %), 13 сбалансирован по аминокислотному составу (за исключением лизина) и может служить альтернативой соевому белку в пищевой промышленности [20–22]. Биологическая ценность белка шрота подсолнечника определяется рядом факторов и в первую очередь сбалансированностью аминокислотного состава, допустимым содержанием сырой клетчатки и фенольных соединений [20; 23–25]. Характеристика белка подсолнечника Потенциал шрота подсолнечника определяется содержанием белка, количество которого после экстракции может достигать 35 %. Общее количество белка зависит от сортовых и агрономических факторов, а также от степени зрелости семян подсолнечника [26]. Основные белковые фракции семян подсолнечника представлены водорастворимым альбумином и солерастворимым глобулином с константами седиментации 1,7–2S и 11–12S соответственно и содержат 22–56 % общего количества азота. Углеводная фракция белков подсолнечника (как и у бобовых) незначительна. Содержание альбуминовой фракции относительно мало и включает преимущественно белки, обладающие биологической активностью. Фракция глобулинов представлена запасными белками семян с молекулярной массой от 300 до 350 кДа, аминокислотный состав которых определяет биологическую ценность извлекаемых белков и их функциональные характеристики [20; 27; 28]. Исследования глобулиновой фракции показали, что глобулины имеют сферическую форму и состоят из 6 субъединиц. Установлено, что соединение мономеров между собой обеспечивается ионной связью и 12-ю дисульфидными мостиками. Глобулины также имеют 5 свободных SH-групп [29]. Известно, что белок характеризуется относительно низкой растворимостью. В зависимости от условий среды, четвертичные структуры глобулинов способны ассоциировать или диссоциировать. Среда с малой ионной силой вызывает обратимую диссоциацию макромолекул фракции 12S глобулинов на мономеры с константой седиментации 7S (150 кДа). При значениях рН среды ниже 3 и выше 9, а также в присутствии 6М раствора мочевины происходит необратимая 14 диссоциация на 2S и 3S глобулины (50 кДа), которые состоят из полипептидных цепей (13–18 и 30–40 кДа) и характеризуются различными значениями изоэлектрической точки (ИЭТ) [30; 31]. В целом, полученный из семян подсолнечника белок дефицитен по лизину и треонину, но содержит достаточное количество серосодержащих аминокислот, а также большое количество глутаминовой и аспарагиновой кислот. Белковые продукты по своему аминокислотному составу выгодно отличаются от белков большинства зерновых культур и незначительно уступают белку сои по содержанию лизина и изолейцина, который, в свою очередь по своей биологической ценности близок к белкам животного происхождения. Семена подсолнечника превосходят семена рапса по содержанию треонина, фенилаланина, аргинина; семена арахиса – по метионину, треонину и триптофану. По сравнению с зерновыми культурами семена подсолнечника содержат больше лизина, цистеина и триптофана, что указывает на целесообразность использования белка подсолнечника в пищевом производстве для повышения биологической ценности продуктов [32]. При относительно небольшом содержании лизина, белок подсолнечника имеет большой процент переваримости (до 90 %) и близок к большинству растительных белков по биологической ценности (60 %) [33; 34]. Показатель использования белка составляет 1,3–1,4. Его можно увеличить до 1,7 добавлением в белковый продукт лизина либо смешением с белками сои, молока или других белков, богатых лизином. Причем показатель использования концентрата белка, подвергшегося тепловой обработке, больше, чем у неденатурированного белка [32]. Свойства белка подсолнечника обусловливают возможность его широкого применения при производстве мясных продуктов в качестве эмульгирующего, жиро- и влагосвязывающего агентов. Водоудерживающая способность (ВУС) белков подсолнечника возрастает с увеличением концентрации белка в продукте. При этом водоудерживающая 15 способность денатурированного альбумина составляет 223,8 мл/г, глобулина – 70,9 мл/г и в случае глобулина практически не зависит от процесса денатурации. Белковые продукты подсолнечника показали лучшую эмульгирующую, жироудерживающую и пенообразующую способности по сравнению с белками сои. Липофильные свойства проявляются за счёт наличия неполярных белковых цепей, связанных с углеводороными цепями, тем самым способствуя увеличению абсорбции [35]. Технологические приёмы переработки шротов и жмыхов Технологические приёмы переработки шрота подсолнечника можно разделить на механические, физические и химические. К механическим относятся измельчение, фракционирование и воздушная сепарация, однако эти методы позволяют получать муку и концентраты с содержанием белка не более 50–60 % [36]. Физические методы в основном предполагают температурную обработку, целью которой является разрушение отдельных веществ, например, специфических низкомолекулярных пептидов и ингибиторов ферментов. Следует отметить, что температурная обработка (тостирование шрота) приводит к необратимой денатурации белковых соединений, однако, положительно влияет на усвояемость и питательную ценность белка [26]. Химическая обработка шрота производится с целью получения концентратов и изолятов белка подсолнечника для кормовых и пищевых производств. Подсолнечный шрот практически не содержит «антипитательных» веществ. В подсолнечном шроте присутствуют фенольные соединения, которые в основном представлены хлорогеновой (43–73 %) хинной и кофейной кислотами в количестве около 1,5 % и 0,5 % соответственно, кофейной кислотой. Наряду с ними в шроте обнаруживаются фенольные соединения, подобные изоферуловой и синапсовой кислотам, а также эфиры оксикоричной кислоты, вызывающие потемнение продуктов при тепловой обработке [37–39]. Отрицательное действие высоких доз хлорогеновой кислоты (ХГК) проявляется в ингибировании трипсина и липазы, поэтому уровень её не должен 16 превышать 1 %. Следует заметить, что из других литературных данных известно, что хлорогеновая кислота ингибирует только трипсин и активирует липазу. В белковых изолятах, выделенных из шрота с помощью слабых растворов щёлочи, наряду с указанными кислотами содержится неоизохлорогеновая кислота. Под действием полифенолоксидазы ХГК превращается в хиноны, образующие темноокрашенные соединения неустановленного состава [40; 41]. Известны работы, в которых ХГК рассматривается как регулятор ростовых процессов и как защитный фактор по отношению к некоторым микроорганизмам [39; 42]. Методы получения белковых изолятов и концентратов Извлечение белковых веществ в промышленности включает экстракцию с применением щелочей, кислот, ферментов или солевых растворов с последующим отделением экстракта. Далее белок отделяется от сопутствующих компонентов и концентрируется [40]. Достаточно часто шрот обрабатывается раствором NaOH при нагревании с последующим осаждением белка в изоэлектрической точке из полученного экстракта. Далее осадок отделяется, нейтрализуется и высушивается. Щелочная экстракция может проводиться при рН 11–13 с дальнейшим осветлением и осаждением белка в ИЭТ путём подкисления до рН 5 [40]. С целью увеличения растворимости целевого продукта и его чистоты, экстракт дополнительно подкисляют перед осветлением до рН 7,5–8,5 [43]. Осаждение белков проводится и с помощью органических растворителей (этанол, ацетон), которые нарушают гидрофобное взаимодействие в молекулах белка, а также с помощью концентрированных растворов солей, которые нарушают гидратацию белковых глобул. В случае высаливания раствор становится пересыщенным из-за недостатка растворителя, так как часть воды идёт не на растворение белка, а на растворение соли. В результате молекулы белка слипаются, образуя крупные частицы, которые осаждаются из раствора [44]. Широко известен метод извлечения белка из подсолнечного шрота солевой экстракцией. Для этого применяют водный раствор NaCl, в котором 17 ресуспендируют белковую муку. Полученный экстракт отделяют фильтрованием. Осаждение белка проводят кислотным реагентом, в качестве которого может быть использован 3–5% раствор янтарной кислоты, что позволяет добиться осаждения белка с одновременным связыванием фенольных соединений, которые остаются в растворе. Выпавшие в осадок белковые вещества отделяются центрифугированием, промываются водой и высушиваются [45–47]. В связи с тем, что получаемый белковый продукт должен соответствовать определенным требованиям, предъявляемым к продукции, используемой в пищевой промышленности, изолят белка должен быть очищен от сопутствующих нежелательных антипитательных токсических соединений. Кроме того, содержание белковых веществ должно быть не менее 80 %. Наибольшую ценность представляют концентраты, содержащие белковые вещества с молекулярной массой не менее 50 кДа. Для этих целей применяется стадия концентрирования. Одним из методов является осаждение белка с помощью сульфата аммония или ацетона с последующим его растворением в меньшем объеме [48]. Один из способов получения концентрата белка из подсолнечного шрота включает в себя экстракцию раствором NaCl, затем раствором NaOH, нерастворимый осадок отделяется, а белковые вещества, содержащиеся в экстракте, осаждаются распылительной раствором сушилке [49]. HCl, Однако и высушиваются при воздухом использовании на нескольких экстрагентов наблюдаются большие потери, а также возникает проблема регенерации больших объемов водных растворов. Повысить выход белковых веществ и упростить технологическую схему можно, подобрав другие экстракционные растворы и параметры процесса [40]. Наиболее продуктивными и перспективными методами, которые позволяют объединить процесс концентрирования и очистки белковых экстрактов от низкомолекулярных соединений, являются мембранные методы разделения. Особый интерес представляют баромембранные процессы, при которых вещества переносятся за счет разности давлений [50]. 18 Широкое применение в технологии получения концентратов нашли методы ультрафильтрации, которые основаны на применении полупроницаемых мембран с определенными размерами пор (0,1-10 мкм), которые задерживают крупные молекулы, пропуская низкомолекулярные соединения. В результате образуется очищенный концентрат белка. Данный метод реализуется на производстве с применением половолоконных мембранных установок [48; 50]. В результате применения ультрафильтрационных методов очистки и концентрирования повышается эффективность выделения белковых веществ за счёт уменьшения объемов перерабатываемой жидкости [51]. Высокая эффективность использования мембранных методов достигается при дополнительном проведении процесса диафильтрации с целью вымывания низкомолекулярных соединений [52]. Получение высококачественных белковых продуктов осуществляется путём их концентрирования и распылительной сушки. Сушка проводится при температуре входного воздуха не менее 170 °С, что обеспечивает достижение наибольшей массовой доли сухих веществ. При этом процесс денатурации практически не наблюдается [53]. Способы модификации белковых продуктов Модификация белков проводится с целью получения продукта с необходимыми функциональными свойствами, удаления нежелательных веществ, позволяет увеличить питательную ценность. Изменения происходят в результате химической температуры. и ферментативной Применение функциональные свойства, обработки, данных как способов а также позволяет растворимость, под воздействием улучшить такие водоудерживающая и эмульгирующая способность, способность к пенообразованию, реологические свойства и др. [54]. При химической модификации используются химические соединения, которые приводят к целенаправленному изменению определённых группировок аминокислот (сульфгидрильных, карбоксильных и др.) и дисульфидных связей [55; 56]. 19 Ряд исследований направлен на изучение влияния ацетилирования и сукцинирования на физико-химические свойства белка, полученного из рапсового жмыха солевой экстракцией, с последующим определением функциональных свойств полученных продуктов. Наибольшая степень модификации достигается ацетилированием, при котором белковую массу диспергируют дистиллированной воде, добавляют уксусный ангидрид в при постоянном перемешивании в течение часа при рН 8–8,5. Для удаления избытка реагента суспензию подвергают ацетилированного позволяет диализу белка повысить в получают растворимость течение 24 ч лиофильной в при 4 °C. сушкой. нейтральной и Концентрат Ацетилирование щелочной среде, пенообразующую и жироудерживающую способности и получить осветлённый продукт [57; 58]. Фосфорилирование позволяет добиться лучшей растворимости соевого белка. Фосфорилирование проводится с помощью оксихлорида фосфора в присутствии триэтиламина. В зависимости от степени фосфорилирования наблюдается улучшение эмульгирующей и пенообразующей способностей [59]. Несмотря на широкие возможности метода химической модификации, его применение в основном ограничивается продуктами технического назначения. Термическая денатурация основана на снижении растворимости белков при термическом воздействии. подвергаются денатурации, В результате коагулируют, нагревания после чего белки их в растворе отделяют от содержащихся в растворе нежелательных соединений. Повышение температуры значительно увеличивает степень кислотного гидролиза пептидных связей и протекания реакций дезаминирования. Конечный продукт обладает улучшенными функциональными свойствами (эмульгирующая способность, вязкость, растворимость, устойчивость пены), что связано с заменой амидных групп на кислотные [60]. Кроме того, для модификации может быть использован способ, при котором белковый изолят подвергается воздействию высокого давления (200-600 МПа) в 20 течение 10–15 мин. Подобная обработка влияет на процесс флокуляции в зависимости от концентрации исходного образца [61–63]. Использование ферментативной модификации отличается высокой степенью специфичности. При получении продукта на основе белкового концентрата люпина ферментативная модификация с применением целлюлаз позволила улучшить такие функционально-технологические свойства белковой пасты, как водоудерживающая способность (увеличилась в 1,5 раза), эмульгирующая способность (возросла в 4,2 раза) [64]. Описан метод модификации соевых белковых продуктов, при котором ингибиторы трипсина и химотрипсина, имеющие белковую природу, подвергаются протеолизу ферментом природного происхождения – папаином. Процесс проводили определением при начальном значении рН 7,2 с последующим закисления среды. В результате получен продукт, содержащий белковые компоненты с меньшей молекулярной массой, что позволило снизить содержание организмом. антипитательных Применение веществ и модификации улучшить также усвояемость привело к белков упрощению технологических процессов [65]. Модификация белка, полученного из подсолнечного жмыха, возможна с помощью последовательного применения протеаз подсырной молочной сыворотки и растительных протеаз. В результате протеолиза отмечается увеличение содержания некоторых незаменимых аминокислот, возрастание жироудерживающей и жироэмульгирующей способностей, что позволяет использовать данный продукт в мучных изделиях [66; 67]. Применение белковых продуктов на основе подсолнечника в производстве пищевых продуктов Различные типы белковых продуктов, в основе производства которых лежит шрот подсолнечника, находят широкое применение в пищевой промышленности. В 2000-е годы данному вопросу уделяется большое внимание, можно наблюдать всплеск разработок по данной тематике. Например, предложены рецептуры печенья, крекеров и других кондитерских изделий [68; 69]. 21 Значительная использование часть белковых исследований и изолятов хлебопечении в разработок направлена для на изменения аминокислотного состава и повышения пищевой ценности ржаного и пшеничного хлеба. Исследования направлены на совершенствование технологии хлебобулочных изделий, обогащённых белковым изолятом подсолнечного шрота, содержащим минимальное количество фенольных соединений, позволяющих получить новые хлебобулочные изделия повышенной биологической ценности из пшеничной муки [70–72]. Продукты переработки подсолнечника предложены в качестве компонентов медицинского парентерального недостаточностью [73]. питания Изоляты для белка пациентов подсолнечника с печёночной предложены к использованию в производстве продуктов из мяса и рыбы [74; 75]. 1.3 Современные подходы к глубокой переработке обедненного растительного сырья и отходов, получение углеводно-белковых кормов В решении проблем кормопроизводства большое внимание должно быть уделено развитию производства продуктов из вторичного и третичного сырья, обогащенных микробным белком и другими биологически активными веществами. Исследования в области кормового использования возобновляемых растительных ресурсов получают соответствующее развитие и в нашей стране. В микробиологической промышленности Советского Союза крупнотоннажное производство производства микробных нутриентов дрожжевых кормовых развивалось препаратов в основном методом по пути глубинного культивирования микроорганизмов на гидролизатах целлюлозосодержащего растительного сырья на базе гидролизных заводов страны [76; 77] и на жидких парафинах нефти (восемь комбинатов белково-витаминного концентрата) [78; 79]. Несмотря на прекращение производственной деятельности и тяжелое экономическое положение значительной части предприятий данного сектора, микробная масса как нутриент не утратила свою биологическую ценность, в 22 новых условиях возникли новые продуценты, новые источники сырья, более рациональные способы культивирования [80]. Современный уровень технических возможностей переработки и потребления возобновляемого растительного сырья в сфере кормопроизводства позволяет рассматривать различные растительные отходы как материал, потенциально пригодный для использования в кормовых целях. Получение растительных углеводно-белковых кормов (РУБК) решает сразу несколько проблем: экономическую – повышение питательной ценности кормов и качества продукции сельскохозяйственных животных, благодаря наличию в нем всех незаменимых аминокислот, витаминов группы В, микро- и макроэлементов; экологическую – утилизация лигнина, обеспечение чистоты произведенного корма [81]. При переработке растительного сырья количество отходов или так называемого вторичного сырья составляет более половины от исходной растительной массы так, как масса целевого продукта может не превышать 5 % от исходного количества сырья. Такие отходы следует относить ко вторичным ресурсам, которые могут и должны подвергаться глубокой и комплексной переработке [82]. Глубокая переработка Глубокая переработка обеднённого растительного сырья может включать стадии экстракции ценных биологически активных соединений, химическую обработку и биологическую конверсию с целью обогащения микробным белком. Классической стадией предобработки обеднённого растительного сырья для улучшения его питательной ценности, усвояемости и для дополнительной гомогенизации после измельчения является гидролиз – химический или ферментативный. Данный подход был реализован при разработке технологий биологической конверсии различных растительных отходов для получения РУБК и позволяет наиболее полно использовать остаточный потенциал возобновляемых ресурсов. На кафедре биотехнологии РХТУ им. Менделеева разработаны 23 ресурсосберегающие экологически целесообразные технологии комплексной переработки растительного сырья с получением биопродуктов пищевого, кормового и медицинского назначения. Разработаны технологии производства РУБК на основе свекловичного жома, жома топинамбура, картофельной и кукурузной мезги, соевой мелассы и шрота, кофейного шлама, послеспиртовой барды и др. [83–92]. Большинство растительных отходов можно использовать для получения и накопления микробной биомассы, так как в них содержится необходимый для роста микроорганизмов набор питательных веществ. Такое сырьё, как солома содержит в основном лигнин и нерастворимые полисахариды, поэтому его необходимо дополнительно предобрабатывать, чаще всего с помощью гидролиза. Жидкую фракцию (гидролизат) применяют в качестве компонента питательной среды для культивирования, а твёрдые остатки используют в дальнейшем как наполнитель для углеводно-белкового комплекса [93]. Например, объём послеспиртовой барды при производстве этилового спирта в 14 раз выше объёма полученного продукта. Барда содержит большое количество питательных веществ (содержание сырого протеина может составлять около 34–40 %). Данный отход не может быть сброшен на очистные сооружения без дополнительной обработки [94; 95]. Отходы переработки семян подсолнечника также являются примером обеднённого растительного сырья, так шелуха подсолнечника применяется в качестве компонента твёрдой питательной среды для культивирования грибов [7; 96; 97]. Известна технология получения обогащённого протеином кормового продукта на основе свекловичного жома. При этом в качестве инокулята используют закваску Леснова. Содержание сырого протеина после 9 ч. ферментации увеличилось с 9,8 % до 21,7 % в пересчете на АСВ, а содержание сырой клетчатки снизилось с 23,7 % до 19,4 %. Кроме того, значительно повысилось количество витаминов, особенно группы B [98]. 24 Отходы производства кофе, основную массу которых составляет кофейный шлам с содержанием около 13 % сырого протеина, 60 % клетчатки и 13,5 % жира, являются ценным сырьём для выращивания микроорганизмов. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae способны к биоконверсии шлама, накапливая при этом до 29,3 % белковых веществ [89; 90]. На мукомольных заводах в больших количествах образуется аспирационная пыль, содержащая частицы перемолотого зерна и богатая углеводами. Ведутся испытания по получению кормовых дрожжей при использовании её в качестве субстрата. Лабораторные исследования показывают перспективность биоконверсии аспирационной пыли как одного из способов её утилизации [99]. Довольно успешным является проведение гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на гидролизатах без отделения целлюлозосодержащего сырья. Негидролизованные частицы повышают ценность и усвояемость кормового продукта за счёт содержащейся в них лигноцеллюлозы. Такой способ был использован для переработки растительных отходов при получении гликозида стевиозида [83]. Кроме дрожжей, для производства кормового белка используют мицелиальные грибы, в том числе базидиомицеты, образующие плодовые тела. Особенно актуально их использование на лигнинсодержащем субстрате из-за способности грибов гидролизовать лигнин [100]. Основная часть растительных отходов содержит трудногидролизуемые полисахариды, поэтому важна способность некоторых микроорганизмов выделять экзоферменты, такие как целлюлазы и лигниназы. К таким микроорганизмам можно отнести грибы рода Trichoderma, способные к усвоению целлюлозы и разрушению углевод–лигниновых комплексов. Данные микроорганизмы не требуют предварительной обработки сырья, накапливают достаточное количество белка и легкогидролизуемых полисахаридов [101]. Депротеинизированный шрот подсолнечника практически не содержит жиров (менее 1 %), имеет пониженное содержание сырого протеина (11–25 %), 25 высокое содержание сырой клетчатки (более 25 %) и имеет высокий потенциал использования в процессах микробиологической конверсии. Использование микробной биомассы как компонента кормовых добавок обусловлено её высокой питательной ценностью. Аминокислотный состав белка дрожжей качественно выше белка растений и немногим уступает животному белку. Содержание витаминов и микроэлементов находится также на очень высоком уровне по сравнению с исходным растительным сырьём [82]. Внесение микробного белка в корм способствует повышению его питательной ценности [102]. Экстракция Одним из методов предварительной обработки растительного сырья может являться экстракция, которая позволяет выделить ценные биологически активные вещества или соединения, затрудняющие дальнейшую обработку. Примером может служить выделение масла из кофейного шлама, инулина из клубней топинамбура и изофлаводонидов сои [88; 89; 103]. Классические приёмы и методы экстракции растворами неорганических соединений и органическими растворителями в последние десятилетия получают развитие и всё чаще применяются совместно с ферментативной обработкой. В иностранной литературе такие методы обозначаются термином «экстракция при поддержке фермента». В отечественной научной периодике данный термин не получил широкого распространения и для обозначения такого процесса используются термины: ферментативная обработка, модификация, гидролиз или водно-ферментативная экстракция. Данные процессы активно разрабатываются для выделения белковой [104–107] и липидной [108–114] составляющих растительного сырья. Химический гидролиз Химический гидролиз является классическим приёмом увеличения доступности компонентов растительного сырья и используется как стадия предварительной обработки. В зависимости от сырья или получаемого продукта гидролиз проводят либо с помощью кислоты, либо в щелочном растворе. 26 Эффективность проведения гидролиза растительного сырья оценивается в первую очередь по концентрации моносахаров в гидролизате. Для перевода полисахаридов, содержащихся в растительной ткани, в моносахара, ассимилируемые дрожжами, с сохранением нативных ценных компонентов корма, проводят предварительную обработку сырья [115]. Химический гидролиз включает в себя расщепление полимеров лигноцеллюлозного сырья (целлюлозы, гемицеллюлозы) до мономеров сахаров (пентоз и гексоз) с образованием побочных продуктов. Кислотный гидролиз является классической стадией предварительной обработки растительного сырья в случаях получения низкомолекулярных углеводных продуктов. Можно выделить следующие факторы, влияющие на эффективность кислотного гидролиза: 1) Свойства субстрата Свойства субстрата могут повлиять на процесс гидролиза. Такими свойствами являются: нейтрализующая способность субстрата, соотношение легкогидролизуемых целлюлоз и гемицеллюлоз, количество и скорость гидролиза трудногидролизуемых компонентов, длинна макромолекул, степень полимеризации целлюлозы, конфигурация целлюлозной цепи, взаимодействие целлюлозы с другими защитными полимерами клеточной стенки растений, такими как лигнин, пектин, гемицеллюлоза, белки, минеральные соединения и т.д. Размер частиц также является одним из эффективных параметров [116]. 2) Кислотность среды Кислотность зависит от вида и концентрации кислоты, гидромодуля, нейтрализующей способности лигноцеллюлозы, перемешивания раствора при нагревании. Коэффициент диффузии серной кислоты зависит от природы лигноцеллюлозного субстрата. Доказано, что коэффициент диффузии серной кислоты в сельскохозяйственных отходах существенно выше, чем в твердой древесине[117]. 3) Скорость преобразования продуктов в процессе гидролиза 27 Скорость преобразования продуктов в процессе гидролиза зависит от температуры, кислотности, продолжительности процесса и концентрации сахаров. В процессе кислотного гидролиза получается гидролизат, содержащий более 10% глюкозы. Здесь важное значение имеет явление реверсии. Реверсия глюкозы – обратимый процесс её полимеризации с образованием в основном других дисахаридов, а также трисахаридов и более сложных олигосахаридов. Такие соединения недоступны для использования микроорганизмами в ферментации. Недавно было установлено, что металлы и / или ионы металлов также могут катализировать полимеризацию глюкозы в условиях кислотного гидролиза лигноцеллюлозных материалов. Таким образом, материал, используемый в конструкции реактора для гидролиза, также должен быть тщательно подобран [118]. Кислотный гидролиз можно проводить различными неорганическими кислотами. Например, при получении пектина из яблонных выжимок в качестве катализатора гидролиза применяют раствор соляной кислоты с концентрацией 1,5 %. Гидролиз проводят при температуре 75–90 C в течение 2–3 ч., гидромодуль суспензии 1:15 [119]. Кроме соляной кислоты в качестве гидролизующего агента часто применяют и серную кислоту. При этом высокомолекулярные полисахариды переходят в редуцирующие вещества (РВ). В зависимости от времени гидролиза выход РВ будет разным. В ходе гидролиза пивной дробины при температуре 100 C и концентрации H2SO4, равной 4,5 %, максимальный выход пентозной фракции РВ может составлять 25 % от АСВ. Математическая обработка данных эксперимента позволила сделать заключение о том, что наиболее оптимальными условиями протекания гидролиза данного обеднённого растительного сырья являются: концентрация серной кислоты в диапазоне 2,6–4,5 %, длительность процесса – от 4,5 до 6 ч. [120]. Кислотный гидролиз как предварительная обработка перед ферментативным гидролизом проводится в несколько стадий. На первой стадии гидролиз целлюлозосодержащего сырья протекает в щадящем режиме в 28 ацетатном буфере при pH 3, при концентрации серной кислоты 3 моль/л, с гидромодулем 1:15. Температура проведения процесса – 100 C, время проведения процесса – 60 мин. После первой стадии гидролизат отделяют, осадок высушивают и измельчают до размера 0,1–0,2 мм. Затем полученный порошок подвергают второй стадии гидролиза (термогидролиз) в присутствии серной кислоты. Концентрация кислоты – 3 моль/л, гидромодуль – 1:10, температура – 120 C, давление – 1,5 атм., время обработки – 30 мин. Таким способом можно подготовить солому гречихи после извлечения из неё рутина. Конечное содержание редуцирующих веществ в результате двухстадийной обработки в гидролизате составляет около 10 % [121]. Методы удаления фенольных соединений Полифенольные соединения затрудняют получение светлых белковых изолятов из шротов подсолнечника. При введении концентрата белка в пищевые продукты при наличии щелочной и нейтральной среды образуются соединения белков прежде всего с одним из полифенолов (хлорогеновой кислотой и продуктами её изменения), что приводит к изменению цвета от кремового до тёмно-зеленого и тёмно-коричневого оттенков [39; 41; 122]. Ранее проведённые исследования показали, что фенольные соединения могут быть извлечены из подсолнечного шрота путём продолжительной обработки исходного сырья (ядра семян, шрота) 70 % раствором этанола и 50 % раствором изопропанола. При этом содержание фенольных кислот в белковых продуктах, извлечённых из такого сырья, снизилось от 0,8–1,0 до 0,05–0,055. Для получения светлых подсолнечных белковых продуктов возможно использование комбинированных растворителей, например, азеотропных смесей (гексан-этанол). Полученные результаты соответствуют строго определённым интервалам температур и концентраций [123]. Окисление фенольных соединений атмосферным кислородом резко ускоряется в щелочной среде, а также при интенсивном освещении. Продукты окисления фенольных кислот имеют тёмную окраску, поэтому, извлекаясь вместе 29 с белковыми продуктами, ухудшают их товарный вид. Фенольные соединения легко вступают в реакцию с белками, связываясь посредством водородных мостиков [124; 125]. Тепловая обработка способствует проявлению окраски меланоидиновых соединений. Отсутствие посторонней окраски изолятов и неизменность окраски пищевых продуктов с их содержанием явлются одними из ключевых потребительских требований, предъявляемых к изолятам. Все методы очистки белков от фенольных и других красящих веществ в основном сводятся к промывке растворителями и использованию мембранной технологии. Распространённым методом выделения белка подсолнечного шрота является экстракция щелочными растворами при нагревании. Главным недостатком этого метода, ограничивающим применение шрота в качестве пищевых компонентов, является получение тёмноокрашенных продуктов, вызванное окислением полифенольных соединений (особенно хлорогеновой кислоты) в ортохиноны, которые полимеризуются с образованием пигментов от коричневого до тёмно-зелёного цвета. Кроме того, фенольные соединения способны образовывать комплексы с белками за счёт водородных связей, а также связываться с остатками лизина, триптофана и серосодержащих аминокислот. В результате снижается растворимость белка и ухудшаются его функциональные свойства [41]. ХГК обладает выраженной физиологической активностью и определяет антиоксидантный потенциал шрота. Основные методы удаления хлорогеновой кислоты включают в себя промывку органическими растворителями и использование мембранных технологий. При спиртовой экстракции в экстракт переходят и другие фенольные соединения [39; 40]. В лаборатории широкое применение получили метанол, этанол, ацетон, вода, этилацетат, пропанол. Наиболее эффективно проходит экстракция с участием ацетона и последующим использованием метанола и этанола. Был разработан метод получения неденатурированного изолята белка, очищенного от хлорогеновой кислоты с использованием 80 % водного раствора метанола. 30 Фенольные соединения удаляются перед проведением щелочной экстракции белка и диафильтрацией. В результате ХГК выделяется в свободном виде [43]. Однако применение некоторых растворителей ограничивается областью дальнейшего использования продукта (пищевые добавки). Оптимальным растворителем, пригодным в пищевой промышленности, является этанол [47]. Параметры процесса подбираются с таким условием, чтобы не допустить значительной денатурации белковых веществ. Таким образом, водные растворы этанола должны иметь концентрацию от 50 до 70 %, температурный интервал процесса от +20 до +50 ºС. Максимальное извлечение достигается при 3–4 промывках [40]. Также имеется методика удаления фенольных соединений из обезжиренного подсолнечного шрота водным раствором ацетона с последующей промывкой подкисленным раствором ацетона, что позволяет снизить содержание растворённых белков в экстракте. Последующее исследование белка с использованием пепсина и панкреатина показали большую усвояемость, чем при использовании ацетона или бутанола [126]. Удаление фенольных соединений, обуславливающих окраску (хлорогеновой и кофейной кислот), возможно с помощью раствора 1-бутанола, подкисленного 0,005 н HCl. Содержание хлорогеновой кислоты в концентрате составило ≤ 0,05 %. В результате экстракции был получен бесцветный изолят белка [123]. Описан метод получения изолята белка путем осаждения его янтарной кислотой. В результате продукт содержал минимальное количество хлорогеновой и кофейной кислот при соблюдении условий: гидромодуль «экстракт белка – янтарная кислота» 1:11, температура обработки 50 °С, время обработки 25 мин. Янтарная и хлорогеновая кислота при взаимодействии образуют комплексные соединения, которые хорошо растворимы в воде и удаляются на стадии промывки осадка [45]. Ферментативный гидролиз 31 Ферментативный гидролиз проводят при помощи различных гидролаз: протеаз, целлюлаз, лигниназ и др. Последовательный гидролиз можно проводить с использованием различных кислот. Например, для получения моносахаридов солодки первую стадию гидролиза вегетативной системы солодки проводят 2 %-й соляной кислоты в течение 3 ч., а во вторую стадию – серной кислотой в концентрации 20 %, в течение 2 ч. Зачастую гидролиз проводят для удаления нежелательных примесей, которые гидролизуются быстрее целлюлозы. Для этого выдерживают суспензию с гидромодулем 1:10, содержащую 10 % кислоту в течение 2 ч. [127]. В качестве источника целлюлозы могут быть использованы оболочки овсяного зерна. Для проведения ферментативного гидролиза получают техническую целлюлозу последовательной обработкой раствором щёлочи, а затем раствором азотной кислоты для частичного удаления лигнина. Ферментативный гидролиз проводят в ферментере в течение 3 суток при концентрации субстрата 55,6 г/л (гидромодуль 1:18) и концентрации ферментного целлюлолитического комплекса – 2,2 г/л. Выход редуцирующих веществ составдяет до 78 % от массы субстрата [128]. Для гидролиза целлюлозы часто применяют ферментный препарат целловиридин – комплекс эндоглюконаз, полученных при культивировании микроскопических грибов Trichoderma viride. Суспензия субстрата (смесь соломы гречихи и свекловичного жома, в соотношении 1:1) с гидромодулем 1:10 выдерживается в реакторе с 0,5 %-м раствором целловиридина Г20Х в течение 2 ч. при температуре 50 C и постоянном перемешивании. После ферментной обработки, глубина которой составляет более 90%, содержание РВ в суспензии увеличивается до 14 % [129]. Растительное сырьё (кроме целлюлозы) содержит в значительном количестве молекулы гемицеллюлозы, основным компонентом которой часто является ксилан. Поэтому иногда для обработки растительного сырья оправдано применение ксиланаз. 32 Измельчённые и проваренные в течение часа кукурузные кочерыжки могут быть обработаны ферментными препаратами в две стадии. На первой стадии гидролиз проводят с помощью ферментного препарата «Ксиланаза» (2 мг/г субстрата) при температуре 50–55 C и pH около 5,0–5,5 при постоянном перемешивании в течение 1 ч. На втором этапе ферментативный гидролиз осуществляют препаратами: целловиридин (20 мг/г), МЭК-3 (10 мг/г) и «Новозим» (5 мг/г). Гидролиз проводят в аппарате с термостатированием при 50 C в течение 24 ч. в том же диапазоне pH [130]. Кроме целлюлозы, многие растительные отходы богаты белковыми компонентами, поэтому иногда целесообразно применение протеолитических ферментов для увеличения доступности компонентов. Для получения питательных сред можно использовать богатые белком рисовую и соевую муку с предварительной обработкой. Так, обезжиренную соевую (рисовую) муку сначала промывают подкисленной водой для удаления окрашенных пигментов, а затем к очищенной муке добавляют воду в соотношении 1:8 и трипсин в количестве 0,15 г на 1 г субстрата. Процесс проводят в течение 15 ч. при постоянном уровне pH (7,6–8) и термостатировании (38–40 C). Степень протеолиза при этом составляет около 90 % [131]. Многие грибы выделяют в культуральную жидкость гидролитические ферменты. Грибы рода Trichoderma секретируют в окружающую среду целлюлолитические ферменты. Вместо гидролиза при помощи очищенного фермента иногда применяют культивирование этих микроорганизмов на целлюлозосодержащем субстрате [132]. Поскольку растительные субстраты чаще всего представляют собой комплекс из трёх биополимеров: целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина, то наиболее эффективным является применение для гидролиза мультиферментных комплексов. Мультиэнзимная композиция МЭК-3 представляет комплекс из трёх ферментов: «Брюзайм BGX» – гемицеллюлаза, продуцируемая грибами Trichoderma 33 longibrachiatum, содержит эндо-1,3-β-глюканазу, эндо-1,4-β-глюканазу и эндо-1,4- β-ксиланазу; «Целлолюкс-А» – комплекс ферментов, выработанных Trichoderma viride, включает в себя эндоглюканазы и ксиланазы; «Рапидаза CR» – пектолитические ферменты высокой эффективности. Данный комплекс применялся для гидролиза биомассы мискантуса (веерника) китайского. Измельчённую биомассу суспендировали в ацетатном буфере (гидромодуль 1:30) и проводили ферментативный гидролиз при pH 4,7, температуре 50 C и постоянном перемешивании. Выход редуцирующих веществ составил около 20 % от массы субстрата [133]. Ферментативный гидролиз может применяться для аналитических исследований. Например, для определения пектиновых веществ проводили гидролиз с использованием эндополигалактуроназы, продуцируемой Rhizopus sp. Навеску пектина 20 мг растворяли в воде (10 мл) и вели ферментативную обработку с 2 мг ферментного препарата (ФП) при 37 C в течение 3 ч. Фермент разрушал α-1,4-D-галактуроновые образовывались свободные связи, олигосахариды, поэтому в том в числе ходе гидролиза галактуроновая кислота [134]. Отдельно следует рассматривать ферментативную обработку обедненного и вторичного сырья и компонентов пищевого назначения. Всё большее внимание исследователей привлекают ферментные препараты микробного происхождения, которые благодаря большому разнообразию свойств и возможности их получения в значительных количествах, нашли широкое применение в научных исследованиях. Так обработке α-амилазой Bacillus sp. подвергают картофельный крахмал, который затем используется в качестве жира-заменителя в рецептурах мясных рубленых полуфабрикатов, что позволяет повысить влагоудерживающую и влагосвязывающую способности мясных фаршей, что позволяет получать продукты высокого качества с пониженным содержанием жира [135]. 34 Широкое модификации распространение изолятов белка получили сои, которые варианты направлены ферментативной на изменение структурообразующих свойств пищевых продуктов и увеличение усвояемости белка [107; 136–142]. Модификация белка подсолнечника может быть проведена сывороточными протеазами подсырной молочной сыворотки и растительными протеазами, полученными из пророщенных семян подсолнечника [67]. Ферментативной модификации белков подсолнечника также посвящены работы, выполненные в Кубанском государственном зарубежной литературе технологическом рассмотрены университете [36; 143]. В вопросы ферментативной обработки концентратов и изолятов белка подсолнечника и её влияние на аминокислотный состав физико-химические и структурообразующие свойства как самих изолятов, так и продуктов на их основе [144–149]. Концентрирование и выделение белковых продуктов Получение изолятов белка экстракционными методами предполагает использование водных растворов и последующее концентрирование белковых продуктов. Классическим методами являются мембранное ультраконцентрирование и осаждение в изоэлектрической точке. Данные методы позволяют эффективно с экономической точки зрения обеспечить наибольшую степень выделения белковых продуктов и избежать применения избыточного количества химических соединений, а их последовательное применение обеспечивает дополнительную очистку от сопутствующих низкомолекулярных веществ и веществ небелковой природы. Использование ультрафильтрационных полупроницаемых мембран для концентрирования позволяет фракционировать белки различного происхождения. Так, мембраны применяются для выделения: белковых фракций молочной сыворотки и получения концентрата сывороточных белков [52; 150; 151]; 35 концентрирования изолятов и гидролизатов соевого белка [152–155]. Ультрафильтрация соевых изолятов является хорошим примером получения продуктов с заданными свойствами, например, с низким содержанием фитиновой кислоты [156]. В технологии переработки подсолнечника мембранные ультрафильтрационные процессы применяются как для лабораторного, так и для производственного концентрирования белковых продуктов, так как позволяют избежать денатурации белков [157]. Мембранному разделению могут быть подвергнуты ферментативные гидролизаты, содержащие низкомолекулярные пептиды и аминокислоты [73; 158], что позволяет получать фракции содержащие пептиды от 3 до 30 кДа, которые в дальнейшем могут найти применение в производстве напитков, обогащенных белком, или в качестве компонентов парентерального питания [159; 160]. 36 1.4 Требования, предъявляемые к изолятам белка пищевого назначения, характеристика продукта белкового изолята В зависимости от содержания белка полученный продукт называется изолятом, если он содержит 90% и более белковых веществ. Если содержание составляет 65% - 90%, продукт является концентратом, 50% - 65% – белковой мукой. При этом содержание белка в соответствии с разделом Кодекса Алиментариус № 175-1989 рассчитывается на сухой вес, исключая витаминные, минеральные, аминокислотные и пищевые добавки [161; 162]. Растительный белок, на основе которого производят продукты питания, должен удовлетворять показателям качества, определяемые составом, технологией, исходным сырьем. Исходное растительное сырье должно быть чистым и качественным. Влажность сырья должна удовлетворять условиям хранения (раздел 163-1987), то есть должна быть достаточно низкой – не более 10%; зольность не должна превышать 8-10%; количество сырой клетчатки – 0,5% в случае белкового изолята и 5-6% для белковой муки и концентрата [161]. При получении пищевых изолятов необходимо контролировать содержание ингибиторов трипсина, гемагаглютинина. Если продукт в дальнейшем будет проходить термообработку, необходимо дополнительно проанализировать питательную ценность изолята и влияние термообработки на изменение функциональных и органолептических свойств. В продуктах на основе растительных белков не должно содержаться тяжелых металлов в концентрациях, опасных для здоровья [163]. Выделенные из растительного сырья белковые изоляты обычно не употребляются непосредственно в пищу, а применяются как исходные компоненты для производства пищевых продуктов. В таких продуктах изоляты являются не только источниками пищевого белка, но и выполняют структурообразующую функцию. Поэтому важно рассмотреть как собственно пищевые характеристики, так и функциональные свойства [164]. Функциональные свойства белков отражают поведение белков в технологическом процессе получения пищевого продукта, а также консистенцию, 37 структуру, влажность и другие характеристики самого продукта. К таким свойствам относят: органолептические и кинестетические (цвет, вкус, запах, зернистость, гладкость, мутность); растворимость, диспергируемость, вязкость, влажность, смачиваемость; эмульгирующая и пенообразующая способности; нелинейная вязкость растворов, способность к тестообразованию, желеобразованию, способность образовывать волокна, гели; термолабильность [26; 165]. Влияние на функциональные свойства белков оказывают все компоненты, входящие в продукт питания (витамины, полисахариды, жиры, минеральные соли и др.) или участвующие в технологическом процессе его получения. По этой причине высока сложность оценки свойств изолятов, и зачастую невозможно точно их спрогнозировать для каждого отдельного пищевого продукта. Несмотря на это, в производстве и исследовательской деятельности часто применяют методику оценки функциональных свойств белков, как в простых, так и в многокомпонентых системах. На функциональные свойства белковых продуктов влияют различные факторы. Это тип исходного сырья, его качество, условия проведения технологических процессов выделения, очистки, сушки и хранения сырья. В ходе проведения процессов на конечные свойства изолята влияют условия проведения: температура, влажность, экстрагенты. В связи рН, с давление, этим органические особенно важно и неорганические строгое соблюдение технологического регламента [26]. Воздействие данных факторов может приводить к разрушению и денатурации белков, образованию комплексных и даже токсичных соединений. Реализация процессов выделения и очистки в мягких условиях позволяет в значительной степени избежать негативного воздействия. Очевидно, что продукт питания, содержащий растительный белок, не должен представлять угрозу жизни и здоровью человека. 38 Кроме функциональных свойств белковых изолятов пищевого назначения важнейшими являются такие показатели качества, как биологическая ценность, усвояемость белкового продукта. Одним из таких показателей является аминокислотный скор белкового изолята. Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (ФАО) совместно с Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) определила оптимальные соотношения содержания аминокислот в белках, употребляемых в пищу человеком в возрасте от 2 до 5 лет. Это соотношение является эталоном и получило название “Стандартная аминокислотная модель”. Аминокислотный скор равен массе лимитирующей АК в 1 г исследуемого белка, деленной на массу той же АК в 1 г идеального белка по Стандартной аминокислотной модели. Лимитирующей аминокислотой в контролируемом белке является такая аминокислота, которая содержится в данном белке в наименьшем отношении к количеству такой же аминокислоты в Стандартной аминокислотной модели [163]. Текущие представления о требованиях к аминокислотному составу белка, необходимого для сбалансированного потребления человеком, показаны в таблице 1.1. Таблица 1.1 Требования к оптимальному аминокислотному составу белка, необходимого для сбалансированного потребления человеком. Аминоксилота Гистидин Изолейцин Лейцин Лизин Метионин + цистеин Фенилаланин + тирозин Треонин Триптофан Валин Всего незаменимых аминокислот Установлены значения истинной мг/г белка 15 30 59 45 22 38 23 6 39 277 усвояемости организмом белков, содержащихся в продуктах растительного происхождения. Так, истинная 39 усвояемость белка манной крупы и пшеничной клейковины составляет 99%, соевого белкового изолята – 95%, муки семян подсолнечника – 90%, соевой муки – 86% [166]. В зависимости от назначения продукта различаются и требования, предъявляемые к нему. Если изолят применяется как ингредиент в получаемом продукте, то нет никаких особенных требований, кроме общих требований к сырью и компонентам. В случае применения изолята для обогащения продукта белком число предъявляемых требований увеличивается: 1. Можно обогащать пищевой продукт за счет количественного увеличения содержания белка в нем или улучшая качество содержащихся белков. 2. В целом оправданным является увеличение количества белка на 20 и более процентов. 3. Для продуктов, обедненных лизином, метионином, цистеином или триптофаном необходимо применение комплементарного белка (с увеличенным содержанием данных аминокислот). 4. Если нет возможности увеличить количество пригодного белка, то продукт насыщают аминокислотами (чаще всего лимитирующими) [163]. 40 2 Материалы и методы 2.1 Объекты исследования 2.1.1 Шрот подсолнечника В работе использовали шрот подсолнечника производства компании ЭФКО (г. Белгород, Россия), полученный после извлечения масла гексаном. Хранили шрот при комнатной температуре в полипропиленовых мешках, предназначенных для хранения пищевых продуктов, в чистых, сухих, хорошо проветриваемых помещениях, защищённых от воздействия прямого солнечного света, источников тепла и влаги. Содержание белка – 37,5 %, сырой клетчатки – 19 %, жира – менее 0,5 %. 2.1.2 Микробные объекты исследования Исследования проводили со штаммами полученными из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. В работе использовали штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса «Я», молочнокислые бактерии Lactobacillus casei B 4172. Для твёрдофазной биоконверсии использовали бактериальный штамм Bacillus cereus БП-46, выделенный Н. А. Ушаковой из слепой кишки большой полевки (Институт проблем экологии и эволюции животных им. А. Н. Северцова РАН). 2.1.2 Ферментные препараты В качестве ферментных препаратов использовали протеолитические ферментные комплексы предоставленные «Дженекор Даниско» (Бельгия). Ферментный препарат Protex 6L является бактериальной щелочной протеазой, полученной из селекционного штамма Bacillus licheniformis. Препарат содержит щелочную сериновую эндопептидазу. Номер по номенклатуре 41 Международного биохимического союза (IUB) – 3.4.21.62. Изоэлектрическая точка белка 6,8. К веществам, ингибирующим фермент, относятся фосфорорганические соединения, реагирующие с серином, окислительные реагенты, которого высвобождают активный хлор. Типичной областью применения данного препарата является переработка белковых соединений и производство кормовых продуктов. Наиболее эффективен для гидролиза белков (гемоглобин, казеин, яичный альбумин, желатин, белок рыбного и растительного сырья) до пептидов. Фермент Protex 6L проявляет повышенную гидролитическую активность, если субстрат открыт (развернут) или белок частично денатурирован. Соответствует требованиям Объединенного экспертного комитета ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам. Ферментный препарат Protex 40Е представляет собой гранулированную бактериальную щелочную протеазу, полученную из генноинженерного штамма Bacillus subtilis. Номер по номенклатуре Международного биохимического союза (IUB) – 3.4.21.62. Изоэлектрическая точка белка 9,4. Препарат может применяться для промышленной переработки белковых соединений, обработки белоксодержащих вторичных продуктов, очистки фильтров, экстракции гепарина и хондроитинсульфата из тканей животных. Ингибируется хелатирующими агентами и окислителями, такими как хлор. Ферментативная активность проявляется в диапазоне pH 7,0–12,0 с оптимальным значением около 8,5–8,6. Оптимальное значение pH может изменяться в зависимости от параметров процесса, таких как температура, время, состав субстрата и его концентрация. В зависимости от процесса обработки, производитель рекомендует дозировку от 0,05 до 0,5 %. При соблюдении условий хранения потеря активности минимальна. ФП Protex 40Е разрешён для использования в пищевой промышленности. Соответствует требованиям Объединённого экспертного комитета ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам. Ферментный препарат Protex 7L содержит бактериальную эндопептидазу, продуцент Bacillus amyloliquefaciens, и характеризуется способностью гидролизовать широкий спектр субстратов при значениях pH, близких к 42 нейтральным (6–8). Рекомендуется для использования в процессах, где установление pH затруднено или невозможно. В зависимости от процесса обработки производитель рекомендует дозировку ФП от 0,1 до 1,0 % от массы белка в субстрате. Применяется для обработки казеина, сыворотки, мяса, сои, желатина и зерновых. Наибольшую эффективность препарат Protex 7L показывает при гидролизе казеина, белков пшеницы и сои. Protex 7L относится к препаратам пищевой промышленности, соответствует требованиям Объединённого экспертного комитета ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и признан безопасным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Министерства здравоохранения и социальных служб США. Ферментный препарат Protex 51FP содержит комплекс эндо/экзо-пептидаз, полученный из Aspergillus oryzae. Номер по номенклатуре Международного биохимического союза (IUB) – 3.4.23.18. Обладает побочной амилолитической активностью. Характеризуется способностью гидролизовать широкий спектр субстратов при значениях pH, близких к нейтральным (6–9). Выпускается в виде порошка и применяется в основном для переработки белков и в производстве кормов для животных, в том числе в производстве гидролизатов рыбной муки и расщепления отходов. В зависимости от процесса обработки производитель рекомендует дозировку ФП от 0,02 до 0,2 % от массы белка в субстрате. Protex 51FP относится к препаратам пищевой промышленности, соответствует требованиям Объединенного экспертного комитета ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и признан безопасным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Министерства здравоохранения и социальных служб США. Информация предоставлена производителем при передаче образцов ферментных препаратов. 2.2 Культивирование микроорганизмов и микробиологические методы анализа 2.2.1 Составы питательных сред 43 Для получения инокулята и культивирования бактерий Bacillus cereus БП-46 использовали L-бульон, содержащий (г/л): триптон – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; NaCl – 2,0; MgSO47H2O – 0,7; Na2НРО4 – 1,0; КН2РО4 – 0,1 (pH 7,4). В готовую среду при необходимости добавляли: глюкозу – 20,0 г/л Для получения инокулята и культивирования Lactobacillus sp. использовали питательную среду MRS следующего состава (г/л): Na2HPO412H2O – 2,0; CH3COONa3H2O – 5,0; цитрат аммония –2,0; MgSO47H2O – 0,2; MnSO44H2O – 0,05; пептон – 10,0; мясной экстракт – 10,0; дрожжевой экстракт (ДЭ) – 5,0; глюкоза 20,0. Устанавливали рН среды – 7,0. В качестве минеральной основы среды для культивирования дрожжей S. cerevisiae и грибов использовали среду Ридера (г/л): К2НРО43H2O – 0,1; КН2РО4 – 1,0; MgSO47H2O – 0,7; (NH4)2SO4 – 3,0; Ca(NO3)24H2O – 0,4; NaCl – 0,5. Устанавливали рН среды – 5,0. 2.2.2 Глубинное культивирование Грибы и дрожжи культивировали в глубинных гетерофазных условиях в колбах объёмом 250 и 750 см3 при 100 и 250 см3 питательной среды при инкубировании на качалке (180–200 об/мин.) при 30–32 °С и 28–30 °С, соответственно; молочнокислые микроорганизмы – в анаэробных условиях при 37,5±0,20 °С в пробирках объёмом 30 см3 и в колбах объёмом 50 и 250 см3 при 20, 30, 100 и 150 см3 питательной среды соответственно; бациллы – в колбах объёмом 250 см3 при 100 и 150 см3 питательной среды при инкубировании на качалке (180– 200 об./мин) при 29–30 °С. 2.2.3 Твёрдофазное культивирование Твёрдофазное культивирование грибов осуществляли при температуре 30 °С в течение 5-ти суток в колбах объёмом 250 и 750 см3. Твёрдофазное культивирование бактерий Bacillus cereus БП-46 осуществляли – в колбах 44 Эрленмейера объёмом 250 см3 при 70–75 %-м заполнении в течение 48 часов при температуре 30±1°С в микроаэрофильных условиях. 2.2.5 Определение количества жизнеспособных клеток Титр дрожжевых клеток определяли прямым подсчетом клеток в камере Горяева. Накопление дрожжевой биомассы определяли гравиметрическим методом и косвенно – по изменению содержания сырого протеина. Кривые роста дрожжей и бактерий снимали в течение 48 ч., измеряя количество микроорганизмов путём высева на твёрдые агаризованные среды по методу Коха [167]. 2.3 Биохимические и физико-химические методы анализа 2.3.1 Содержание сухих веществ в образцах Содержание влаги определяли гравиметрическим методом, основанном на высушивании образца готового продукта в бюксе до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 105 °С. Содержание сухих веществ (СВ, мас. %) рассчитывали по формуле: − − = где – масса пустого бюкса, г; ∙ 100 – масса бюкса с пробой, г; – масса бюкса с навеской пробы после высушивания, г. 2.3.2 Количественное определение белков Содержание белковых веществ в растворах определяли методом Лоури [168], используя казеин для построения калибровочной кривой. Расчёт содержания белковых веществ (Р, мг/л) проводили по формуле: P = cN 45 где с – концентрация белковых веществ, найденная по калибровочному графику, мг/л; N – разведение анализируемого раствора. 2.3.3 Количественное определение углеводов Определение содержания углеводов проводили модифицированным методом Бертрана, используя следующие реактивы: раствор Фелинга I: 10 г кристаллогидрата сульфата меди (II) и 0,04 г метиленовой сини растворяют в дистиллированной воде, доводят до 1 л в мерной колбе; раствор Фелинга II: 50 г сегнетовой соли, 4 г жёлтой кровяной соли и 75 г гидроксида натрия растворяют последовательно в дистиллированной воде в фарфоровой чашке, после охлаждения доводят до 1 л. При проведении анализа в термоустойчивую коническую колбу наливают 5 мл раствора Фелинга I и 5 мл раствора Фелинга II, ставят на нагретую электроплитку и, закрыв колбу часовым стеклышком, доводят содержимое до кипения. Кипящий раствор титруют пробой до перехода фиолетовой окраски в бледно-жёлтую. Момент, когда окраска пробы станет жёлтой или жёлто-зелёной, является концом титрования. Фиксируют объём пробы, пошедший на титрование. Если пробы не хватило, то дотитровку проводят стандартным раствором глюкозы (1 мг/мл). 46 Расчёт редуцирующих веществ (РВ, %) проводят по формуле: РВ = Tглюкозы –Vглюкозы cглюкозы ∙П 10Vпробы где Tглюкозы – титр растворов Фелинга по глюкозе, мг; Vглюкозы – объём глюкозы, пошедший на дотитровку, мл; cглюкозы – концентрация глюкозы, мг/мл; Vпробы – объём анализируемой пробы, пошедший на титрование, мл. Необходимо провести не менее 3-х параллельных определений. Количество анализируемой пробы, пошедшей на титрование, не должно отличаться более чем на 0,1–0,2 мл. Титр медно-щелочного раствора устанавливают отдельным титрованием по любому интересующему редуцирующему веществу. Титр медно-щелочного раствора – это количество глюкозы (мг), идущее на восстановление 10 мл меднощелочного раствора при данных условиях титрования. В случае, если анализируемый раствор содержит олиго- и полисахариды, то их определение осуществляют методом Бертрана–Шорля. Метод аналогичен методу Бертрана, но проба предварительно гидролизуется на кипящей водяной бане при определении олигосахаридов – 10 мин, а при определении полисахаридов – 40 мин. Для гидролиза олиго- и полисахаридов проба смешивается с 2 н HCl в соотношении 1:1. Затем проводят определение сахаров методом Бертрана. Калибровочная кривая строится по сахарозе, которая также подвергается предварительному гидролизу [168]. Определение общего содержания углеводов проводили методом Дюбуа фенол-серной реакцией, используя следующие реактивы: фенольный реактив: 5 г чистого фенола (ч.д.а) растворяют в дистиллированной воде, доводят до 100 мл (в мерной колбе, под тягой), затем раствор переносят в темную посуду с притёртой крышкой и хранят в холодильнике; концентрированная серная кислота; 47 рабочий раствор глюкозы: 1 г глюкозы растворяют в дистиллированной воде, доводят до 100 мл, хранят в холодильнике. Анализируемые пробы вносят пипеткой в толстостенные пробирки из пирекса. Объём в каждой пробе доводят дистиллированной водой до 1 мл. Одновременно готовят контрольную пробу с 1 мл дистиллированной воды и серию стандартных растворов глюкозы с концентрацией от 10 до 100 мкг/мл. Одновременно во все пробирки добавляют по 1 мл фенольного реактива, тщательно перемешивают встряхиванием, а затем добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты, быстро перемешивают и оставляют в тёмном месте для развития окрашивания на 15 мин. Через 15 мин определяют оптическую плотность при 488 нм. Базовую линию строят по контрольному образцу. Калибровочную кривую строят по результатам измерения оптической плотности стандартных растворов глюкозы с концентрацией от 10 до 100 мкг/мл. Концентрацию глюкозы в пробе определяют по калибровочной кривой. При необходимости учитывают разведение пробы [168]. 2.3.4 Количественное определение сырого жира Метод основан на экстрагировании жира из смеси органическим растворителем с последующим гравиметрическим определением его содержания по отношению к исходному образцу. Из обезжиренной фильтровальной бумаги сворачивают цилиндрик, в который помещают 2 небольших кусочка обезжиренной ваты и взвешивают. Затем цилиндрик плотно закручивают с одной стороны и помещают на дно один из кусочков ваты. В цилиндр вносят навеску анализируемого образца массой 3 г, сверху помещают второй кусочек ваты и заворачивают второй конец цилиндра. После чего, производят повторное взвешивание, затем образец помещают в аппарат Сокслета. Собранный аппарат накрывают асбестовым полотном, заполняют растворителем (этанол:хлороформ = 1 : 2) в количестве 150 мл и 48 нагревают в течение 2–3 часов на электрической плитке, обеспечивая равномерное кипение растворителя, залитого в колбу. Экстракцию жира из смеси считают законченной через 2 ч. По окончании экстракции аппарат разбирают и переливают растворитель в исходную ёмкость. Массовую долю жира в сухом образце (Х1, %) вычисляют по формуле: = 100 ∙ где ∙ − ∙ об – навеска анализируемого образца до экстракции, г; остатка после экстракции, г; об – навеска сухого – содержание сухих веществ в биомассе, %. 2.3.5 Определение содержания сырой клетчатки Содержание «сырой» клетчатки определяли по методу Геннеберга и Штомана, основанному на последовательном гидролизе в кислых и щелочных условиях [169]. 2.3.6 Определение содержания общего азота и сырого протеина методом Къельдаля Метод основан на минерализации навески анализируемого материала концентрированной серной кислотой в присутствии селена до образования сульфата аммония. По количеству азота в полученном сульфате аммония, которое определяют отгонкой аммиака в кислоту, находят содержание сырого протеина. В круглодонную колбу Къельдаля вносят 0,5 г биомассы, добавляют на шпателе 0,5 г селенового катализатора и 10 мл концентрированной серной кислоты. Колба ставится на плитку для окисления органических веществ до углекислого газа и воды (сжигания пробы). При полном обесцвечивании раствора сжигание заканчивают, колбу остужают, а содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой. После тщательного перемешивания приступают к отгонке аммиака на 49 аппарате Къельдаля. Перед началом отгонки в приёмник вносят 10 мл реактива Конвея. В перегонную колбу вносят 10 мл пробы, затем приливают 10 мл 40 %-го раствора гидроксида натрия. Перегонку проводят в течение 30 мин., выделяющийся аммиак поглощается реактивом Конвея с образованием бората аммония. Далее поглощённый аммиак титруют 0,05 н серной кислотой до изменения зелёной окраски в исходную. Содержание общего азота (N, %) рассчитывают по формуле: N V 0,05 14 100 100 H 10 где N – содержание азота в пробе; V – объём серной кислоты, израсходованной на титрование, мл; 0,05 – концентрация титранта, мг-экв/мл; 14 – количество азота, мг, которое связывает 1 мг-экв серной кислоты; 100 – объём раствора в мерной колбе, мл; 10 – количество раствора, взятого для отгона аммиака, мл; Н – навеска материала, мг. Количество сырого протеина рассчитывается по формуле: = ∙ 6.25 2.3.7 Определение содержания сырой золы Содержание сырой золы определяли гравиметрическим методом после сжигания и последующего прокаливания пробы до полного озоления в тигле в муфельной печи при температуре 250 и 525 °С соответственно. Массовую долю золы ( , мас. %) рассчитывали по формуле: = где – масса пустого тигля, г; – масса тигля с золой, г. − − ∙ 100 – масса тигля с пробой до озоления, г; 50 2.3.8 Определение протеолитической активности ферментных препаратов по модифицированному методу Ансона с казеинатом натрия Метод основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом до пептидов и аминокислот с последующим их определением [170]. Несмотря на тот факт, что метод предложен более 80 лет назад, он применяется в современных исследованиях для анализа протеолитической активности щелочных протеолитических препаратов [171] и различных бактериальных и грибных культур [172; 173]. За единицу протеолитической активности принимают способность фермента превращать за 1 мин при температуре 30 °С казеинат натрия в состояние, неосаждаемое трихлоруксусной кислотой, в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина. Протеолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата. Активность протеиназ определяют при рН 7,2±0,2 для нейтральных протеиназ и рН 9,5±0,2 для щелочных протеиназ. Для приготовления универсального буферного раствора № 1 смешивают в равных количествах (0,1 моль/дм3) растворы уксусной, ортофосфорной и борной кислот. Получают буферный раствор с рН 1,8. Добавляя к этой смеси различные объёмы раствора гидрооксида натрия концентрации 1 моль/дм3, получают растворы реакционной смеси с рН 7,2±0,2 (для нейтральных протеиназ) и 9,5±0,2 (для щелочных протеиназ). Для приготовления универсального буферного раствора № 2 концентрации 0,5 моль/дм3 (реактив Фолина) готовят и смешивают растворы соответствующих концентраций. Универсальный буферный раствор № 3 готовят смешиванием девяти объемов дистиллированной воды с одним объёмом буферного раствора. Реактив Фолина хранят в склянке из темного стекла в холодильнике. Рабочий раствор Фолина для определения активности модифицированным методом Ансона готовится разведением основного раствора 1 : 2 (одна часть реактива Фолина и две части дистиллированной воды). 51 Навеску исследуемого препарата 0,1–1,0 г (в зависимости от предполагаемой активности) тщательно растирают в стаканчике стеклянной палочкой с небольшим количеством буферного раствора № 1 с соответствующим рН реакционной смеси. Затем переносят полученную смесь в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят этим же буферным раствором объём жидкости до метки и перемешивают. Из этого раствора готовят не менее двух разведений в зависимости от предполагаемой активности, используя этот же буферный раствор. Каждое разведение испытуемого раствора анализируют дважды. Для испытания берут две параллельные навески препарата. Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед испытанием. Для приготовления раствора казеината натрия 2 мас. % (субстрат) 2,0 г воздушно-сухого казеината натрия растворяют в 90 см3 буферного раствора № 1 соответствующего рН: 5,5 – для кислых, 7,2 – для нейтральных и 9,5 – для щелочных протеиназ. Требуемого значения достигают покапельным добавлением раствора гидрооксида натрия концентрации 1 моль/дм3. Затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объём до метки буферным раствором № 1 соответствующего рН. Для проведения испытания в опытные пробирки наливают по 2 см3 субстрата и помещают их в ультратермостат при температуре 30 °С. Примерно через 10 мин. в каждую пробирку приливают по 2 см3 раствора фермента (предварительно термостатированного при 30 °С в течение 3–4 мин.), пробирки встряхивают и оставляют ровно на 10 мин. при температуре 30 °С для протекания гидролиза. Через 10 мин. добавляют в обе пробирки по 4 см3 раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Смесь быстро перемешивают, для обеспечения полного осаждения выдерживают пробирки со смесью в ультратермостате при температуре 30°С ещё в течение 20 мин. Затем смесь фильтруют до полной прозрачности в сухие пробирки и отбирают по 1 см3 фильтрата в пробирки с предварительно налитыми туда 5 см3 раствора углекислого натрия концентрации 0,5 моль/дм3, перемешивают и быстро 52 приливают по 1 см3 рабочего раствора реактива Фолина. Дают реакционной смеси постоять 20 мин. После реакции растворы приобретают голубую окраску, интенсивность которой определяют фотоэлектрическим колориметром, используя образец сравнения. Контрольный опыт готовят, прибавляя реактивы в обратной последовательности: для этого в контрольную пробирку наливают 2 см3 ферментного раствора того же разведения, как и в опыте, добавляют 4 см3 раствора ТХУ, выдерживают в ультратермостате при температуре 30 °С в течение 10 мин., а затем вносят 2 см3 субстрата. Через 20 мин. нахождения в термостате раствор фильтруют, 1 см3 фильтрата отбирают в сухую пробирку с предварительно налитыми туда 5 см3 раствора углекислого натрия концентрации 0,5 моль/дм3, перемешивают, добавляют 1 см3 рабочего раствора реактива Фолина. Колориметрирование проводят фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630–670 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм. Значения оптической плотности должны лежать в диапазоне 0,07–0,45 для кислых протеиназ и 0,2–0,6 для нейтральных и щелочных протеиназ. При отклонении оптической плотности от указанных значений необходимо подобрать другое разведение препарата. Для вычисления протеолитической активности строят градуировочную характеристику по тирозину и по ней вычисляют тирозиновый эквивалент (ТЭ), т. е. ту оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тирозина в 1 см3 стандартного раствора. Для построения градуировочной характеристики готовят раствор тирозина концентрации 0,001 моль/дм3 и дальнейшие разведения. Испытания проводят аналогично пробе. По средним данным, полученным из двух опытов, строится градуировочная характеристика, имеющая линейную зависимость. На оси абсцисс откладывают значение концентрации c мкмоль/см3, на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности D. По градуировочной характеристике определяют тирозиновый Протеолитическую активность (ПАк), ед./г, вычисляют по формуле: эквивалент. 53 ПАк = где 4∙ ТЭ ∙ 10 ∙ ∙ 1000 – оптическая плотность исследуемого раствора; 4 – отношение объемов реакционной смеси и раствора фермента после добавления ТХУ; ТЭ – тирозиновый эквивалент, определяемый по градуировочной характеристике, мкмоль/см3; 10 – время гидролиза субстрата, мин; m – масса ферментного препарата, взятая на протеолиз (расчет ведется на 1 см3 ферментного раствора), мг; 1000 – переводной коэффициент полученных единиц на 1 г ферментного препарата. За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе двух параллельных навесок препарата. Относительное допускаемое расхождение между значениями активностей двух параллельных навесок не должно превышать 5 %. Результат округляют до первого десятичного знака. Предел возможных значений относительной погрешности измерений протеолитической активности при доверительной вероятности P = 0,95 составляет 5 %. 2.3.9 Определение аминокислотного состава Определение содержания свободных (синтетических и натуральных) аминокислот и общего содержания отдельных аминокислот (свободных и связанных форм в сумме) с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили в соответствии с ГОСТ 32195-2013 (ISO 13903:2005) и ГОСТ 32201-2013 (ISO 13904:2005). 2.3.10 Определение содержания фенольных соединений Суммарное модифицированным содержание фенольных методом Фолина–Чокальтеу. соединений Фенольные определяли соединения окисляются реактивом Фолина–Чокальтеу, состоящим из смеси фосфорновольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот, который, в свою очередь, образует 54 в результате окислительно-восстановительной реакции смесь окислов вольфрама (W8O23) и молибдена (Mo8O23) голубого цвета. Абсорбция раствора при длине волны 750 нм пропорциональна содержанию фенольных соединений. В качестве фенольного стандарта использовали галловую кислоту [174]. 2.4 Методы исследования 2.4.1Методика проведения ферментативного гидролиза При проведении исследований подсолнечный шрот заливали водой в соотношении 10:1, добавляли ферментный препарат и помещали в термостат, обеспечивая непрерывное перемешивание. При выборе концентрации ферментного препарата учитывали экономическую целесообразность его использования. Концентрацию ферментных препаратов варьировали от 0,05 % до 0,8 % к массе шрота. Продолжительность гидролиза не превышала 120 мин., температура гидролиза 37,5 °С, значение рН устанавливали индивидуально для каждого ферментного препарата в соответствии с паспортными данными, полученными от производителя. При изучении влияния определённого фактора на процесс все остальные параметры поддерживались на постоянном уровне. Каждую серию опытов проводили три раза, за конечный результат принимали среднее арифметическое значение. Анализ белковых фрагментов (продуктов гиролиза) проводили электрофоретическим разделением в 10 %-м полиакриламидном геле (1,5 М Tris-HCl, pH 8,8, напряжение 100 мВ), в качестве стандартов использовали наборы пептидов. 55 2.4.2 Методика проведения ультрафильтрации (концентрирование и диафильтрация) Процесс мембранного фракционирования гидролизатов белка подсолнечника проводили в лабораторных ультрафильтрационных ячейках с использованием полупроницаемых мембран УПМ (полисульфонамидные мембраны) и УАМ (ацетатцеллюлозные мембраны). Устройство лабораторной ультрафильтрационной ячейки представлено на рисунке 2.1, а принципиальная схема установки для проведения фракционирования – на рисунке 2.2. В ультрафильтрационную ячейку 1 на фторопластовую подложку 7 помещали мембрану 8 и уплотняли резиновым кольцом 6. После этого, отрегулировав положение магнитной мешалки 4, концентрируемый раствор заливали в ячейку через штуцер 10 (рисунок 2.1). Компрессором 3 и вентилем 5 (рисунок 2.2) создавали давление в ячейке не более 2 атм. Пермеат, проходящий через мембрану, по каналу 6 поступает в отдельную ёмкость. Для ультрафильтрации были рассчитаны основные показатели процесса [175]. Рисунок 2.1 – Устройство ультрафильтрационной ячейки: 1 – цилиндрическая обечайка; 2, 3– верхний и нижний фланцы; 4 – магнитная мешалка; 5 – шпилька; 6 – герметизирующие резиновые прокладки; 7 – подложка из фторопласта; 8 – мембрана; 9 – пермеатотводящий канал; 10 – штуцер Удельная производительность: Рисунок 2.2 – Принципиальная схема лабораторной установки проведения фильтрации: 1 – ячейка; 2 – магнитная мешалка; 3 – компрессор; 4 – манометр; 6 – вентиль; 6 – линия пермеата; 7 – привод мешалки 56 = где: п ∙ – производительность мембраны, л/м2ч; п – объём пермеата, л; – площадь фильтрующей поверхности мембраны, м2; τ – время, за которое образуется пермеат объёмом V, ч. Селективность: R 1 С п.. кон С исх где Сп.кон. – конечная концентрация белка в пермеате, г/л, Сисх – исходная концентрация белка в исходном растворе, г/л. Максимальный объем загрузки составлял 500 мл. Представленные в работе данные отражают усредненные величины с расчётом стандартных отклонений для вероятности Р > 0.95. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием пакета программ «MS Excel 2010» и «Matlab». 2.4.3 Выделение белка из растворов осаждением в изоэлектрической точке При проведении процесса осаждения использовали мерные стеклянные или пластиковые сосуды с крышками. Осаждение проводили из гидролизата добавлением растворов кислот, объем 10 мл в течении 10 мин при постоянном перемешивании встряхиванием на орбитальном шейкере (180 об/мин). Для достижения полноты осаждения растворы охлаждали до температуры 4–6 ºС. После установления необходимого значения рН растворами соляной кислоты и гидроксида натрия и формирования осадка проводили центрифугирование. В надосадочной жидкости и осадке определяли содержание белка. X mос. 100% , mобщ. где: Х – степень осаждения, %; mос – масса белка осадка, г; mобщ – общая масса белка в исходном растворе, г. 2.4.4 Сорбция на активированном угле В пробирку для центрифугирования объемом 50 мл вносили 40 мл раствора и расчётную навеску угля или сорбента. Адсорбцию проводили при постоянном 57 перемешивании на шейкере 180–200 об./мин. Сорбент отделяли центрифугированием. 2.4.5 Сушка Сушку полученных гидролизатов и изолятов белка подсолнечника проводили на лабораторной распылительной сушилке и вакуумной сушилке. Распылительная сушка гидролизата проводилась на лабораторной установке Mini Spray Dryer B-290, Bϋchi, с максимальной производительностью по воде 1 кг/ч. Схема установки и внешний вид представлены на рисунке 2.3. В процессе сушки раствор распылялся пневматической форсункой 4 в поток предварительно нагретого электрокалорифером 2 воздуха, подаваемого прямотоком в сушильную камеру 6. Рисунок 2.3 – Схема и внешний вид лабораторной распылительной сушилки Mini Spray Dryer B-290, Bϋchi: 1 – фильтр очистки входящего воздуха; 2 – электрокалорифер; 3 – встроенный перистальтический насос; 4 – пневматическая форсунка с охлаждающим контуром; 5 – компрессор; 6 – распылительная камера; 7 – циклон; 8 – емкость для сбора продукта; 9 – рукавный выходной фильтр; 10 – воздушный насос; СА – сушильный агент; ООЖ – отработанная охлаждающая жидкость; ОЖ – охлаждающая жидкость; ОСА – отработанный сушильный агент Температуру сушильного агента на входе в аппарат варьировали от 180 °С до 200 °С в зависимости от выбранного режима. Расход гидролизата выбирали таким образом, чтобы на выходе из сушильной камеры температура сушильного 58 агента не превышала в течение всего процесса 80±2 °С. Высушенные частицы гидролизата отделялись от отработанного сушильного агента в циклоне 7 и ссыпались в емкость для сбора продукта 8. Вакуумная сушка проводилась на установке CoolSafe 100-9 без предварительной заморозки материала. Внешний вид установки приведен на рисунке 2.4. Вакуумная камера представляет собой цилиндр из органического стекла, который сверху накрывается крышкой. Внутри камеры расположены 5 полок с подогревом. На них размещаются образцы для сушки. Рисунок 2.4 – Сушилка CoolSafe 100-9: 1 – вакуумная камера; 2- полки с подогревом; 3 – конденсор; 4 – информативный экран; 5 – устройство ввода; 6 – выключатель; 7 – спускной кран; 8 – вакуумный насос; 9 –газобалластный клапан; 10 – холодильная установка Сушку образцов концентрата белка после осаждения раствором янтарной кислоты и промывки этиловым спиртом проводили при разряжении 6.1 Бар и температуре 25±2 °С в течение 12 ч. 59 2.5. Методы математической обработки результатов 2.5.1. Корреляционный анализ Количественно тесноту линейной связи оценивают при помощи выборочного коэффициента корреляции: где – выборочная дисперсия; , Расчётные значения = , , = , – выборочная ковариация. ∑ ( − ̅ )( −1 выборочного представлены в табл. 4.3. При значении линейной связи; 0,3 < 0,5 < , , − ) коэффициента , корреляции также ≤ 0.3 говорят об отсутствии ≤ 0,5 – о наличии слабой линейной зависимости; ≤ 0,7 – о наличии умеренной линейной зависимости; 0,7 < , –о наличии выраженной функциональной линейной зависимости. Положительные значения коэффицента говорят о прямой взаимосвязи между двумя показателями, а отрицательные – об обратной. 2.5.2. Дисперсионный анализ Дисперсионный анализ (ДА) состоит в выделении и оценке отдельных факторов, вызывающих изменчивость случайной величины [176]. При этом предполагают, что средние значения наблюдаемых величин меняются в связи с изменением основных факторов, определяющих условия опыта, и случайных факторов, а дисперсия остаётся постоянной и аддитивной величиной. Рассмотрим упрощённую модель без учёта эффекта взаимодействия факторов. Дисперсионный анализ проводят в соответствии со следующим алгоритмом расчета: 60 1. Рассчитывают итоги для каждого –го уровня фактора : = где = 1,2, . . . , . 2. Рассчитывают итоги для каждого –го уровня фактора : = где = 1,2, . . . , . 3. Рассчитывают сумму квадратов всех наблюдений: = 4. Рассчитывают сумму квадратов итогов для фактора , отнесённую к числу уровней фактора : = 1 5. Рассчитывают сумму квадратов итогов для фактора , отнесённую к числу уровней фактора : = 1 6. Рассчитывают значение корректирующего члена как отношение квадрата общего итога к числу всех наблюдений: = 1 = 1 7. Вычисляют сумму квадратов для фактора : = − 8. Вычисляют сумму квадратов для фактора : = − 61 9. Рассчитывают общую сумму квадратов: общ = − 10. Рассчитывают остаточную сумму квадратов: = ост общ − − 11. Рассчитывают дисперсию фактора A: = −1 12. Рассчитывают дисперсию фактора B: = −1 13. Рассчитывают дисперсию ошибки: ош = ост ( − 1)( − 1) 14. Проводят проверку гипотез по критерию Фишера: > ( , ) > ( , ) ош ош Если нулевые гипотезы опровергаются и факторы признаются значимыми. 2.5.3. Планирование и обработка факторного эксперимента Планирование и обработку факторного эксперимента проводили по плану первого (полный факторный эксперимент – ПФЭ) и второго (центральный рототабельный композиционный план – ЦРКП) порядка методом наименьших квадратов [176]. Коэффициенты уравнений регрессии определяли путем решения системы линейных уравнений в матричном виде (метод Крамера). Для определения значимости коэффициентов уравнения дополнительно проводили n параллельных измерений в центре плана. Дисперсию воспроизводимости определяли по формуле: воспр = ∑ ( − ) −1 регрессии 62 Далее определяли ошибку j-го коэффициента уравнения при количестве опытов N: = воспр ∑ Значимость каждого коэффициента определяли с учетом табличного значения коэффициента Стьюдента по соотношению: = < ( ) Адекватность полученной модели оценивали с помощью критерия Фишера по формуле: ад воспр = < ад , воспр 63 3 Разработка основ технологии получения изолятов и гидролизатов белка подсолнечника пищевого назначения и обоснование выбора способа экстракции Экстракция белков из подсолнечного шрота может осуществляться как при кислых, так и при щелочных значениях рН. Определяющим критерием для оценки эффективности экстракции выбрали выход белка от максимально возможного в пересчёте на содержание сырого протеина (N6,25) в шроте. Из анализа литературных данных были выделены такие методы экстракции, как экстракция концентрированными растворами солей, разбавленными растворами кислот и щелочей. Наиболее перспективными с точки зрения технологии получения изолятов пищевого назначения является экстракция растворами хлорида и гидроксида натрия. Использование для экстракции концентрированных растворов солей сопряжено с рядом технологических трудностей и должно предусматривать трудоёмкие стадии очистки от ионов натрия. В настоящей работе предлагается вариант переработки, лишённый данного недостатка. 3.1 Исследование количественных закономерностей процессов химической экстракции белка подсолнечного шрота и процесса осаждения белкового изолята 3.1.1 Выбор параметров химической экстракции Ключевыми параметрами процесса экстракции являются: гидромодуль, температура, pH и время проведения процесса. При выборе гидромодуля руководствовались рядом факторов. Водоудерживающая способность исследуемого шрота подсолнечника составляет более 0,9 г/г, а введение избыточного количества жидкой фазы приводит к снижению концентрации целевого компонента и образованию значительных объёмов стоков, необходимости разработки технологии их утилизации. Гидромодуль, равный 10, 64 был подобран экспериментально, позволяет реализовать интенсивное перемешивание и является технологическим минимумом для проведения процесса. Дальнейшие исследования проводили при данном значении гидромодуля. Известно, что температура оказывает незначительное влияние на выход белковых соединений в процессе кислотной экстракции, а её увеличение приводит к денатурации белковых соединений и ускорению процессов неферментативного окисления [177]. Ранее проведённые исследования показали, что в диапазоне от 10 до 40 °C температура практически не влияет на продолжительность процесса экстракции, что подтверждается литературными данными [157; 178]. В данной работе для всех методов химической экстракции были предложены единые значения: гидромодуль 10 и температура 20 °С. 3.1.2 Кислотная экстракция Основным фактором, влияющим на растворимость белковых соединений растительного сырья для экстракции растворами кислот, является концентрация ионов водорода. Известно, что значение изоэлектрической точки определяется аминокислотным составом и строением белков и для большинства белков растительного происхождения находится в диапазоне от 4,0 до 4,5 [148; 159]. Снижение pH приводит к увеличению заряда молекул белка в области значений pH ниже изоэлектрической точки и увеличению растворимости белковых соединений [179]. Экстракция растворами кислот позволяет увеличить степень извлечения белка из исходного растительного сырья [180; 181]. При гидромодуле 10 и температуре 20°С были получены данные по кинетике кислотной экстракции белка из обезжиренного шрота подсолнечника в интервале pH от 2 до 5 с шагом 0,5. Данные представлены на рисунке 3.1. Максимальная степень экстракции 44 % была достигнута при времени экстрагирования 2 ч. и значении рН 2,0. Экстракция раствором серной кислоты при pH менее 3 может приводить к необратимой денатурации белковых молекул, 65 что может повлиять на качество извлекаемого белка и его питательную ценность. Рисунок 3.1 – Зависимость степени извлечения белковых соединений в процессе кислотной экстракции белка шрота подсолнечника при различном pH экстрагента Классическим методом концентрирования белковых веществ является осаждение в изоэлектрической точке. Для экстрактов, полученных в кислых условиях, была исследована динамика степени осаждения при различных концентрациях гидроксида натрия. Следует отметить, что максимальная степень осаждения достигается уже через 15–20 мин. Максимальная степень осаждения была получена при pH 11 и составила 54,5 %. Для всех режимов выделения и осаждения был рассчитан выход белка в процентах от исходного сырого протеина сырья (рисунок 3.2). Максимальный выход белка был получен в наиболее жёстких условиях (pH экстрагента 2,0, pH осаждения 11,0) и составил 24 % от теоретически возможного. 66 25% 15% 10% 5% 2 3 11 4 10 рН осаждения 5 9 0% Выход, % от исходного 20% рН экстракции 8 Рисунок 3.2 – Выход белка в % от исходного 3.1.3 Щелочная экстракция Щелочная экстракция хорошо изучена и применяется для выделения белка подсолнечника, это связано в первую очередь с большей растворимостью глобулинов подсолнечника и диссоциацией 11S запасных глобулинов семян в щелочных значениях рН среды по сравнению с кислыми условиями [20]. Несмотря на то, что шрот подсолнечника стандартизуется по ГОСТ 11246-96 по таким показателям, как химический состав, питательная ценность и др., каждая отдельная партия шрота может отличаться по составу. Поэтому для проведения дальнейших исследований были установлены параметры щелочной экстракции для данного объекта исследования. При гидромодуле 10 и температуре 20 °C были получены данные по кинетике щелочной экстракции белка из обезжиренного шрота подсолнечника в интервале концентраций NaOH от 0,05 до 0,25 %. Следует отметить, что шрот обладает «буферностью», и поэтому для дальнейших исследований брали действительные значения pH среды, установившиеся после добавления щёлочи. Данные представлены на рисунке 3.3. 67 Рисунок 3.3 – Зависимость степени извлечения белковых соединений в процессе щелочной экстракции белка шрота подсолнечника от времени обработки при различном pH экстрагента На рисунке 3.3 представлена зависимость степени выделения белка от времени обработки при различной концентрации гидроксида натрия в экстрагенте. Увеличение концентрации NaOH позволяет более полно извлечь белковую составляющую. В результате максимальная степень извлечения белка составила 64 % при экстракции 0,25 % раствором NaOH [182]. Использование более высокой концентрации гидроксида натрия приводит к денатурации белка, образованию тёмноокрашенных продуктов окисления фенольных соединений шрота и значительному изменению качественных характеристик изолятов. Извлечение белка экстракцией в щелочной раствор позволяет выделить значительное количество белка, однако, полученный продукт необходимо многократно очищать. Определено, что щелочная экстракция разбавленными растворами гидроксида натрия при pH более 9,5 позволяет извлекать до 65 % белковых соединений шрота, однако, приводит к образованию продуктов окисления фенольных соединений и хлорогеновой кислоты, которые придают дополнительную зелёную окраску изолятам белка наряду с присутствующими пигментами шелухи. Следовательно, полученный экстракт имеет более низкие 68 показатели качества и не подходит для использования в пищевой промышленности. Полученный на стадии химической экстракции депротеинизированный шрот (ДПШ) после дополнительной обработки можно использовать как компонент питательной среды для получения биомассы микроорганизмов в кормовых производствах. Осаждение белка из полученных экстрактов можно проводить различными кислотами и органическими растворителями [153; 159; 183]. Применение соляной кислоты обеспечивало достижение необходимого значения pH. Известно, что степень осаждения зависит от начальной концентрации белковых веществ [184], поэтому для определения изоэлектрической точки полученных щелочных экстрактов белка осаждение проводили разбавленными растворами соляной кислоты из щелочного экстракта, полученного при обработке шрота 0,25 %-м раствором гидроксида натрия. Влияние pH осадителя (соляной кислоты) на этапе осаждения белка из раствора экстрагента оценивали по массе осадка, отнесённой к максимально возможной (степени осаждения). Полученные данные представлены Степень осаждения белка, % рисунке 3.4. 60.0% 50.0% 40.0% 30.0% 20.0% 10.0% 0.0% 3.5 4 4.5 5 pH осаждения белка, ед. 5.5 Рисунок 3.4 – Зависимость степени осаждения белка из щелочного экстракта подсолнечного шрота от рН осадителя на 69 Как видно из рисунка 3.4, повышение рН приводит к повышению степени осаждения белка, которая при приближении к значению 4.5 (pH изоэлектрической точки) достигает максимума и составляет 53 %. Исходное содержание сырого протеина в подсолнечном шроте составляло 37 %. Удельное значение, определяемое как отношение массы сырого протеина к единице массы шрота, было принято за максимальный выход белка (100 %) для данного вида сырья. Для всех вариантов выделения и осаждения был рассчитан выход белка в процентах от исходного сырого протеина шрота (рисунок 3.4). Последовательное проведение процесса щелочной экстракции, концентрирования и осаждения в изоэлектрической точке позволяет достичь максимального выхода белка в наиболее жестких условиях не более 60 % от максимально возможного. При выделении белковой фракции шрота в два этапа наибольшее влияние на выход белка оказывает концентрация гидроксида натрия в экстрагенте. Степень осаждения варьирует от 32 до 55 % для нативных экстрактов и в значительной степени зависит от концентрации белка в растворе (рисунок 3.4). Изоляты белка подсолнечника, полученные с использованием методов щелочной экстракции, находят широкое применение в производстве пищевых продуктов [25; 70; 185; 186], однако, имеют ряд недостатков. В процессе щелочной экстракции в раствор могут переходить фенольные соединения и продукты их окисления [25; 43; 181; 187–189]. Введение значительных объёмов щёлочи способствует их неферментативному окислению. Таким образом, изучение ферментативной обработки, которая позволяет недостатков, является актуальной и требует тщательного анализа. избежать этих 70 4 Исследование количественных закономерностей проферментативного гидролиза (щелочной экстракции с добавлением фермента) белка подсолнечного шрота 4.1 Выбор ферментного препарата Одним из методов выделения белка растительного сырья является обработка растительного сырья ферментными препаратами. Подбор и оптимизация условий ферментативного гидролиза позволяют провести процесс депротеинизации в мягких условиях и получить продукты, обладающие новыми свойствами. Использование полиферментных систем и мультиэнзимных композиций значительно увеличивает эффективность данного вида обработки. С развитием современных биотехнологий всё большее распространение получают микробные ферментные препараты, а их стоимость постоянно снижается, что делает их доступными для применения в крупнотоннажных процессах переработки растительного сырья. На стадии предварительного исследования возможности обработки шрота подсолнечника ферментным препаратом для увеличения степени извлечения белка в процессе щелочной экстракции был предложен протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба камчатского производства НПО «Биопрогресс», г. Щелково МО, Россия. Ферментативная активность препаратов в 1/15М фосфатном буфере (pH 8,0; температура 37 °С) по азоколлу [190] составила 28 ед/мг. Данный ферментный препарат применяется в пищевой промышленности для получения функциональных продуктов питания и представляет собой высокоэффективную систему для гидролиза любых расщепляемых в процессе пищеварения белков [191]. Максимальная степень извлечения составила 85 % и была достигнута при массовом соотношении ферментного препарата к субстрату 0,4 % pH 7,4, температура 37,5 °C. Полученные гидролизаты не имели специфической зеленой окраски, присущей щелочным экстрактам [191]. Применение данного препарата для 71 интенсификации процесса экстракции белковых соединений шрота подсолнечника экономически нецелесообразно, так как стоимость одного килограмма фермента в 10 раз превышает стоимость 1 тонны шрота подсолнечника, поэтому для дальнейших исследований были предложены микробные протеолитические препараты, производство которых возрастает [182]. Для определения оптимальных условий ферментативного гидролиза подсолнечного шрота проводили исследование действия ферментных препаратов Protex 6L, Protex 7L, Protex 40Е, Protex 51FP производства компании Даниско Дженекор (Дания). Для унификации исследуемых препаратов была определена протеолитическая активность препаратов по Ансону (см. таблица 4.1), которая подтвердила высокие показатели, заявленные производителем. Таблица 4.1 – Протеолитическая активность исследуемых препаратов Ферментный Продуцент препарат Protex 51FP Aspergillus oryzae Protex 40E Bacillus sublilis Protex 7L Bacillus amyloliquefaciens Protex 6L Bacillus licheniformis Активность по Ансону 419 ед/г 1392 ед/г 374 ед/мл 258 ед/мл Вид препарата Порошок Гранулы Жидкий Жидкий Все исследуемые ферментные препараты могут применяться в производстве пищевых продуктов. Для каждого ферментного препарата, использованного для гидролиза подсолнечного шрота, оптимальное значение рН индивидуально и подбиралось в соответствии с рекомендациями производителя [182]. 4.1.1 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 51FP Ферментный препарат Protex 51FP используется в процессах обработки пищевых белков, для которых большое значение имеют вкусовые свойства. 72 Эффективно гидролизует образовываться под пептиды, действием придающие эндопептидаз, горечь, и может которые могут применяться в производстве аминокислот и пептидов. В отличие от других ферментных препаратов, рассматриваемых в данной работе, расход ферментного препарата Protex 51FP значительно отличался в большую сторону. На рисунке 4.1 представлены зависимости степени извлечения белковых соединений шрота от времени обработки при различной активности фермента. Рисунок 4.1 – Зависимость степени извлечения белковых соединений от времени обработки ферментным препаратом Protex 51FP при различных концентрациях Следует отметить, что количество препарата, необходимое для обработки аналогичной массы шрота, в 2–4 раза превышает расход аналогов и массовое соотношение фермент-субстрат, и достигает 0,8 %, что делает его применение при равной стоимости с другими ФП экономически нецелесообразным. На примере данного ферментного препарата было проведено сравнение методов разделения: фильтрации и центрифугирования. Наиболее показательны результаты по сырой клетчатке и по сырому протеину, приведенные в таблице 4.2. 73 Таблица 4.2 – Основные показатели депротеинизированного шрота, полученного обработкой Protex 51FP (время гидролиза 120 мин.) Метод разделения Массовое соотношение Сырой протеин, % Сырая клетчатка, % Фильтрация Центрифугирование Фильтрация 0,4% Центрифугирование 0,8% 19,3 21,2 15,5 20,9 33,5 28,9 33,9 28,7 Несмотря на то, что центрифугирование позволяет наиболее полно разделить твёрдую и жидкую фазу и получить прозрачные растворы, а внедрение данного метода на производстве не требует дополнительных затрат и установки дорогостоящего оборудования, в лабораторных условиях оба метода – фильтрацию и центрифугирование – использовали последовательно. Фильтрация в качестве основного метода разделения позволяет отделить крупные частицы, а последующее центрифугирование – получить мелкодисперсную фракцию шрота, имеющую более высокое содержание сырого протеина, которая благодаря низкому содержанию клетчатки может быть предложена в качестве кормовой добавки. 4.1.2 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 7L Ферментный препарат Protex 7L применяется для водной экстракции компонентов растительного сырья, в частности масличных культур. Компанией производителем препарат рекомендован к использованию в процессах, в которых поддержание pH на одном уровне труднореализуемо, а также для гидролиза комплексного сырья, например, казеина, сыворотки, мяса, сои, желатина и зерна. 74 На рисунке 4.2 приведены зависимости степени извлечения белка от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 7L. Рисунок 4.2 – Зависимости степени извлечения белка от времени обработки ферментным препаратом Protex 7L при различных концентрациях Максимальное значение доли растворимых соединений достигло 55 % и получено при обработке нативного шрота при 37,5 °С, Следует отметить, что с увеличением активности ферментного препарата в 2 раза доля растворимых соединений увеличивается незначительно (на 1 %). Увеличение концентрации ферментного препарата в 4 раза также приводит к незначительному увеличению доли растворимых соединений (на 4 %). На рисунке 4.3 приведены зависимости содержания сырого протеина в шроте от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 7L. 75 Рисунок 4.3 – Зависимость содержания сырого протеина в депротенизированном шроте от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 7L Как видно из рисунка 4.3, с увеличением концентрации в 2 раза (массовое соотношение 0,2 и 0,4 соответственно) содержание сырого протеина в депротеинизированном подсолнечном шроте не меняется. Увеличение концентрации ферментного препарата в 4 раза (соотношение 0,1 и 0,4 соответственно) приводит к незначительному увеличению содержания сырого протеина (на 2 %). 76 На рисунке 4.4 приведены зависимости содержания сырой клетчатки в депротеинизированном шроте от времени гидролиза. Рисунок 4.4 – Зависимость содержания сырой клетчатки в депротеинизированном шроте от времени ферментативного гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 7L По результатам обработки данных закономерностей были установлены оптимальные условия ферментативного гидролиза подсолнечного шрота. Минимальное содержание сырого протеина и максимальное содержание сырой клетчатки в депротеинизированном подсолнечном шроте составили 12,8 % и 51,2 % соответственно и получены в результате ферментативного гидролиза нативного шрота при массовом соотношении к сырью 0,4 % и времени ферментативной обработки 120 мин [192]. 77 4.1.3 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 6L Ферментный препарат Protex 6L представляет собой бактериальную щелочную протеазу, полученную из селекционного штамма Bacillus licheniformis. Основное применение препарат получил в производстве кормовых продуктов для домашних животных. По данным, полученным от производителей, ферментный препарат Protex 6L эффективен для гидролиза большинства белков (гемоглобин, казеин, желатин, растительные, животные и рыбные белки). Данный ферментный препарат соответствует требованиям, предъявляемым к пищевым добавкам, и используется в пищевой промышленности. На рисунке 4.5 приведены зависимости степени извлечения белка от времени при различных концентрациях ферментного препарата Protex 6L. Рисунок 4.5 – Зависимость степени извлечения белковых соединений от времени ферментативного гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 6L Как видно из рисунка 4.5, максимальное значение степени извлечения белка составило 72,5 % и получено при обработке нативного шрота при 37,5 °С, концентрации ферментного препарата 0,4 %, pH 9,5 в течение 120 мин. 78 Содержание сырого протеина в депротеинизированном шроте коррелируется с глубиной гидролиза, чем лучше прошел гидролиз, тем меньше сырого протеина осталось в пробе. На рисунке 4.6 представлены зависимости содержания сырого протеина в шроте от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 6L. Рисунок 4.6 – Зависимость содержания сырого протеина в шроте от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 6L Из рисунка 4.6 видно, что содержание сырого протеина 12,1 % в депротеинизированном шроте достигается при концентрации фермента 0,4 %, гидролиз проходит наиболее полно. Другим важным показателем является содержание сырой клетчатки. На рисунке 4.7 представлены зависимости содержания сырой клетчатки в депротеинизированном шроте после ферментативного гидролиза от времени при различных концентрациях ферментного препарата Protex 6L. Как видно из графика, максимальное содержание сырой клетчатки в шроте после ферментативного гидролиза при массовом соотношении фермента к субстрату 0,2 и 0,4 составило 43,5 и 43,2% соответственно. 79 По результатам обработки данных закономерностей были установлены оптимальные условия ферментативного гидролиза. Минимальное содержание сырого протеина и максимальное депротеинизированном подсолнечном содержание шроте сырой составили клетчатки 9,8 % и в 43,5 % соответственно и получены в результате ферментативного гидролиза нативного шрота при массовом соотношении ФП к сырью 0,4 % при 120 мин. Рисунок 4.7 – Зависимость содержания сырой клетчатки в депротеинизированном шроте от времени ферментативного гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 6L 4.1.4 Ферментативный гидролиз подсолнечного шрота препаратом Protex 40Е Ферментный препарат Protex 40Е представляет собой мелкодисперсный порошок. Ферментный препарат содержит щелочную протеазу, генно- инженерного штамма Bacillus subtilis. Производители рекомендуют применение данного препарата в промышленной технологии переработки белка и для очистки фильтров. Ферментный препарат отличается протеолитической активностью по Ансону. высокой (1392 ед/г) 80 На рисунке 4.8 представлена зависимость степени извлечения белковых соединений от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 40Е. Максимальное значение доли растворимых соединений достигло 64 % и получено при концентрации ферментного препарата 0,4 % и значении pH 8,6 в течение 120 мин. Отделение твёрдой фазы проводили фильтрованием. Рисунок 4.8 – Зависимость степени извлечения белковых соединений от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 40Е Следует отметить, что при увеличении концентрации ферментного препарата в 2 раза (массовое соотношение 0,2 и 0,4 % соответственно) доля растворимых соединений увеличивается незначительно – на 1,5 %. Увеличение концентрации ферментного препарата в 4 раза (соотношение 0,1 и 0,4 % соответственно) также приводит к увеличению доли растворимых соединений на 8 %. На рисунке 4.9 представлены зависимости содержания сырой клетчатки в депротеинизированном шроте от времени ферментативного гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 40Е. 81 Как видно из рисунка 4.9, наибольшее содержание сырой клетчатки наблюдается при массовом соотношении фермента к субстрату 0,4 % и времени гидролиза 120 мин. Следует отметить, что при уменьшении концентрации в 2 раза (массовое соотношение 0,4 и 0,2 % соответственно) содержание сырой клетчатки изменяется не существенно 40 и 37,5 % соответственно. Рисунок 4.9 – Зависимость содержания сырой клетчатки в депротеинизированном шроте от времени ферментативного гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 40Е 82 На рисунке 4.10 представлены зависимости содержания сырого протеина в шроте от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 40Е. Рисунок 4.10 – Зависимость содержания сырого протеина в шроте от времени гидролиза при различных концентрациях ферментного препарата Protex 40Е Из рисунка 4.10 видно, что наименьшее содержание сырого протеина наблюдается при массовом соотношении фермента к субстрату 0,4 %. Экономически более целесообразно использование фермента в меньших количествах. По результатам обработки данных закономерностей были установлены оптимальные условия ферментативного гидролиза подсолнечного шрота. Минимальное содержание сырого протеина и максимальное содержание сырой клетчатки в депротеинизированном подсолнечном шроте составили 11,5 % и 39,5 % соответственно и получены в результате ферментативного гидролиза нативного шрота при массовом соотношении к сырью 0,4 % в течение 120 мин [182]. Высокое содержание сырой клетчатки и низкое содержание белковых веществ (N6,25) в значительной мере затрудняют использование депротеинизированного шрота в кормовых целях, однако, известно, что подобные 83 растительные отходы могут быть переработаны в кормовую добавку. Приведённые данные по содержанию сырого протеина и сырой клетчатки подтверждают возможность использования ДПШ для микробиологической конверсии. 4.1.5 Анализ результатов ферментативной обработки и выбор оптимальных параметров гидролиза В результате проведённых исследований были получены зависимости содержания сырого протеина, сырой клетчатки и степени извлечения от времени ферментативного гидролиза, типа и концентрации используемого ферментного препарата. Методы корреляционного анализа применяют для выявления и описания зависимостей между случайными величинами по экспериментальным данным. О наличии или отсутствии корреляции между двумя случайными величинами качественно можно судить по виду полей корреляции, построенных для данных, полученных в конце первого часа ферментативного гидролиза и представленных в таблице 4.3. 84 Таблица 4.3 – Результаты корреляционного анализа Поле корреляции Характеристика , = −0,8783 Сильная обратная связь между содержанием сырой клетчатки и сырого протеина , = −0,0485 Связь между степенью извлечения и содержанием сырого протеина практически отсутствует , = −0,3947 Имеется слабая обратная зависимость между степенью извлечения и содержанием сырой клетчатки Анализ полученных данных показал, что содержание сырой клетчатки в образцах обратно пропорционально содержанию сырого протеина. А вот между 85 степенью извлечения белка и содержанием сырого протеина и сырой клетчатки функциональной зависимости не наблюдается. Следовательно, степень извлечения может быть выбрана как независимый параметр для оценки ферментативного гидролиза. Для оценки влияния таких факторов, как тип и концентрация ферментного препарата на степень извлечения был применён дисперсионный анализ. При проведении дисперсионного анализа была использована линейная модель вида: = где + + + – суммарный эффект во всех опытах (общее среднее); – эффект фактора на -м уровне (i = ФП Protex 7L,ФП Protex 40E,ФП Protex 6L)1; фактора на -м уровне ( = 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4); – эффект – ошибка измерения. В ходе двухфакторного анализа проверялись следующие нулевые гипотезы: ̶ гипотеза равенства средних под влиянием фактора : ̶ ,∗ = ,∗ =⋯= ,∗ гипотеза равенства средних под влиянием фактора : ∗, = ∗, =⋯= ∗, Каждая гипотеза проверялась при помощи критерия Фишера. Результаты дисперсионного анализа представлены в таблице 4.4. Таблица 4.4 – Результаты двухфакторного дисперсионного анализа Источник дисперсии Тип ФП Концентрация ФП Ошибка Общая сумма Число Расчетное Сумма Средний степеней значение сумм квадрат свободы F-критерия 682 2 341 23,78 2 412 4 603 42,05 115 8 14 3 209 14 Уровень значимости < 0,001 < 0,001 Результаты дисперсионного анализа показывают, что для обоих факторов с высокой 1 вероятностью гипотеза о равенстве средних опровергается, Результаты ферментативного гидролиза с использованием ФП Protex 51FP не были включены из-за большой разницы в концентрациях ФП и значений рН. 86 следовательно, оба фактора значимо влияют на степень извлечения белка, что необходимо учитывать при выборе ферментного препарата. Интенсификация процесса извлечения белка подсолнечника может быть проведена всеми исследуемыми ферментными препаратами. Фильтрование позволяет отделять наиболее обеднённую часть шрота. Так содержание сырого протеина для препарата Protex 6L понижается до 9,86 % на второй час обработки и далее меняется незначительно. В таблице 4.5 приведены основные показатели сырой протеин (СП) и сырая клетчатка (СК) депротеинизированного шрота подсолнечника, полученного в результате процесса ферментативного гидролиза препаратами Protex 51FP, Protex 6L, Protex 7L, Protex 40E при различных концентрациях и времени обработки [193]. Таблица 4.5 – Содержание сырого протеина и сырой клетчатки депротеинизированного подсолнечного шрота, полученного ферментативной обработкой Ферментный препарат Protex 7L, рН 7,0–7,1 Protex 51FP, 8,5–8,6 Protex 40E, рН 8,5–8,6 Protex 6L, рН 9,5 Массовое отношение фермента к субстрату, % 0,2 0,4 0,4 0,8 0,2 0,4 0,2 0,4 60 мин. 120 мин. СП, % СК, % СП, % СК, % 16,3 15,0 23,6 21,4 12,9 12,0 10,8 9,9 37,7 41,4 31,3 32,7 35,5 38,5 41,8 42,3 12,9 12,8 22,7 19,3 12,5 11,5 9,9 9,8 47,6 51,2 31,4 33,5 37,7 39,5 43,2 43,5 Следует отметить, что значение рН в значительной степени влияет на выход белка и долю растворимых соединений (см. раздел 4.4). Проведение процесса в оптимуме работы ферментного препарата Protex 6L (рН 9,5; температуре 37,5 °С) позволяет извлечь 70–75 % белка исходного сырья. Содержание клетчатки в депротеинизированном шроте достигает 43,5 %. 87 Проведение процесса в данных условиях позволяет избежать образования окрашенных соединений . Увеличение массового соотношения фермент : субстрат в 2 раза от 0,2 % до 0,4 % позволяет увеличить долю растворимых соединений незначительно (< 1 %), как и увеличение длительности процесса от 1 до 2-х ч. Экономически целесообразно минимизировать время проведения процесса и расход ферментного препарата в виду его высокой стоимости. Использование ферментного препарата Protex 40E позволяет извлечь 65– 70 % белковых соединений нативного сырья и добиться содержания сырой клетчатки в депротеинизированном шроте от 36 до 40 %. Полученные ферментолизаты имеют серо-жёлтую окраску; появление окраски, связанной с окислением фенольных соединений, не происходит [182]. В рамках разрабатываемой технологии предлагается использование нескольких ферментных препаратов для депротеинизации подсолнечного шрота. Жидкий препарат обеспечивает несколько более высокую степень гидролиза, однако, его применение в промышленности связано с рядом технологических трудностей. 88 4.2 Исследование стадий выделения белкового изолята 4.2.1 Исследование процесса концентрирования и очистки ферментативного гидролизата с применением мембранных методов В процессе ферментативной обработки шрота подсолнечника происходит разрушение белковых молекул и возможно образование низкомолекулярных продуктов гидролиза [194]. фракционный гидролизата состав В рамках данной работы был методом электрофореза. исследован По данным исследования (рисунок 4.11) в гидролизате преобладают белки двух групп с молекулярной массой от 30 до 50 кДа и более 100 кДа, что соответствует диссоциированным 7S и 11S глобулинам ядер семян подсолнечника. На основании полученных данных можно утверждать, что в гидролизате присутствуют низкомолекулярные белковые соединения (менее 20 кДа), а также фенольные соединения в концентрации 28,1 ± 1,1 мг/л. Содержание общих углеводов составило не более 4 ± 1,5 г/л. Рисунок 4.11 – Электрофореграмма растворов белковых соединений шрота, полученных в различных условиях С целью отделения низкомолекулярных соединений (в том числе 89 фенольных), в основном представленных хлорогеновой и хинной кислотами, снижения содержания углеводов в конечном изоляте белка и увеличения степени осаждения белка было проведено концентрирование полученного ферментативного гидролизата с использованием полупроницаемых мембран. Несмотря на то, что по литературным данным полисульфонамидные мембраны предпочтительнее использовать для разделения экстрактов растительного сырья, для разделения гидролизатов было предложено использовать мембраны УАМ и УПМ. Ультрафильтрация является наиболее целесообразным методом концентрирования благодаря меньшей ресурсоёмкости и энергозатратности, что позволяет снизить себестоимость продукции и в значительной степени увеличить степень осаждения белковых веществ на стадии их выделения. На первом этапе работы исследование процесса концентрирования и очистки гидролизата проводили на лабораторной установке методом тупиковой фильтрации. Для выбора типа мембраны, рабочего давления и режимов предварительной обработки использовали ячейки с одной мембраной [195]. При анализе данных, полученных в результате каскадной ультрафильтрации с двукратным концентрированием, ацетатцеллюлозной мембраны установлено, УАМ-50, что производительность обеспечивающей необходимое разделение, в 4 раза ниже производительности аналогичной полисульфонамидной мембраны УПМ-50. Последовательное отделение фракции с молекулярной массой более 50 кДа на полисульфонамидных мембранах позволяет значительно увеличить производительность мембран УПМ-20, которая в условиях данного эксперимента составила 10 л/(м2ч). 90 Данные по селективности и производительности ацетатцеллюлозных и полисульфонамидных мембран представлены в таблице 4.6 [193]. Таблица 4.6 – Селективность мембран при двукратном концентрировании Производительность, л/(м2ч) 12,4 11,2 1,7 13,3 6,8* 10,1 3,5 Мембрана УАМ-500 УАМ-100 УАМ-50 УПМ-100 УПМ-50 УПМ-20 УПМ-10 Селективность, % 54,5 73,5 93,1 64,3 72,6 81,2 92,3 Полупроницаемая мембрана УПМ-10 обеспечивает высокую селективность 92,3 %, позволяет отделить низкомолекулярные соединения, что подтверждается данными электрофореза, и добиться при этом высокой концентрации белка в концентрате, однако, производительность мембраны составила 3,5 л/(м2ч), что делает её использование нецелесообразным при обработке больших объёмов гидролизата. В ходе процесса отделения белков производительность данной мембраны изначально имела низкие значения и составляла не более 4,1 л/(м2∙ч), что в 4 раза меньше значения для дистиллированной воды (15 л/(м2∙ч)), заявленной производителем. При концентрировании ферментативного гидролизата подсолнечного шрота в 2 раза производительность УПМ-10 существенно снижалась, предположительно из-за образования «фильтрующего» слоя. Из этого следует, что достижение высоких степеней концентрирования на данном типе мембран сильно затрудненно. Так как, основными требованиями, предъявляемыми к процессам мембранного разделения ферментативных гидролизатов является высокая производительность и селективность. Исходя из полученных данных, с учётом использования стадии осаждения в ИЭТ на следующем этапе технологии переработки, для концентрирования и очистки от низкомолекулярных балластных соединений в качестве основной мембраны для процесса ультраконцентрирования 91 была выбрана УПМ-20, производительность которой по исходному гидролизату составила 8,7 л/м2ч. Процесс ультраконцентрирования проводили до максимально возможной степени концентрирования 6,7. Теоретическую точку гелеобразования, при которой начинается желирование раствора и при которой удельная производительность падает до нуля, можно определить по графику зависимости удельной производительности мембраны от натурального логарифма концентрации белка в концентрате по участку линейного падения производительности (рисунок 4.12). Рисунок 4.12 – Зависимость удельной производительности мембраны УПМ-20 от натурального логарифма концентрации белка в концентрате Значение концентрации, при которой происходит гелеобразование, позволяет определить максимально возможную степень концентрирования гидролизата. Теоретическое значение концентрации гелеобразования находится за пределами практически достижимых значений и составляет 487 г/л, что соответствует степени концентрирования более чем в 20 раз. При работе на ультрафильтрационной ячейке, с учётом конструктивных особенностей, было 92 принято решение ограничиться 6-кратным концентрированием, так как дальнейшее увеличение степени концентрирования снижает производительность установки и увеличивает время проведения процесса. На рисунке 4.13 приведена зависимость удельной производительности мембраны УПМ-20 от степени концентрирования. Производительность, л/м2·час 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 Степень концентрирования 12.0 Рисунок 4.13 – Зависимость удельной производительности мембраны УПМ-20 от степени концентрирования Представляет интерес тот факт, что окисленные формы фенольных соединений (в том числе хлорогеновой кислоты), образующиеся в процессе ферментативного гидролиза в присутствии кислорода воздуха и придающие гидролизату зелёную окраску (максимум поглощения 325 нм) не способны задерживаться на мембране с порогом удержания 20 кДа и большая их часть переходит в пермеат [195]. Это может объясняться образованием устойчивых водородных и ковалентных связей с белками, молекулярная масса которых не превышает 5 кДа, что подтверждается литературными данными [196]. 4.2.2 Влияние сорбата калия на процесс ультраконцентрирования При проведении ультраконцентрирования в тупиковом режиме основным недостатком является значительная длительность процесса для достижения 93 желаемой степени концентрирования. В проведённых исследованиях была подтверждена биологическая ценность гидролизата [197]. Развитие посторонней микрофлоры недопустимо в процессе длительной ультрафильтрации в пищевой промышленности. Жёсткие методы стерилизации, такие как химическая и тепловая обработки, могут привести к денатурации целевых белковых веществ. Для исключения развития посторонней микрофлоры было предложено добавление консерванта, в качестве которого выбрали сорбат калия (консервант Е 202). В соответствии с допустимыми нормами консервант Е 202 был добавлен в концентрации 0,2 % перед процессом ультрафильтрации. В процессе ультраконцентрирования были определены основные параметры и зависимость удельной производительности мембраны УПМ-20 от степени концентрирования ферментолизата с консервантом Е 202 0,2 % (рисунок 4.14). Производительность, л/(м2·час) 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Степень концентрирования Рисунок 4.14 – Зависимость удельной производительности мембраны УПМ-20 от степени концентрирования ферментолизата в присутствии консерванта Е 202 в концентрации 0,2 % 94 Следует отметить, что добавление сорбата калия не оказывало значимого влияния на процесс ультраконцентрирования и на содержание белковых веществ в конечных продуктах, однако позволило увеличить степень концентрирования и продолжительность процесса без развития посторонней микрофлоры в ходе длительного 6 часов концентрирования. 4.2.3 Изучение процесса тангенциальной ультрафильтрации с использованием половолоконного мембранного модуля Наиболее предпочтительным режимом ультраконцентрирования белковых растворов, их разделения и очистки является тангенциальный. Наиболее часто встречающийся в биотехнологии, он нашёл широкое применение в пищевых производствах. Так, в молочной промышленности он используется для выделения белков из подсырной воды или творожной сыворотки и концентрирования молока для увеличения выхода продукции, обеспечивая снижение затрат [198–200]. Преимуществом процесса тангенциальной ультрафильтрации является высокая скорость потока вдоль мембраны, что создает турбулентное движение в канале подаваемого раствора. Это затрудняет накопление загрязнений на поверхности мембраны и обеспечивает её эффективную очистку. Был изучен процесс ультраконцентрирования и очистки на аппарате для ультрафильтрационного разделения с использованием мембранного модуля АР-0,1-20ПС на полых волокнах из полисульфонамида с порогом удержания 20 кДа, который соответствует выбранной ранее мембране УПМ-20 по материалу мембранных волокон и пропускающей способности. В процессе исследований были оценены такие параметры, как удельная производительность 13,6 (л/м2ч), и селективность 81,6 %. 95 На рисунке 4.15 приведено изменение удельной производительности мембранного модуля АР-0,1-20ПС в процессе ультраконцентрирования гидролизата белка подсолнечного шрота. 16.0 Производительность, л/м2 час 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 Время,мин Рисунок 4.15 – Зависимость удельной производительности мембранного модуля АР-0,1-20ПС от продолжительности процесса ультраконцентрирования гидролизата белка подсолнечного шрота Производительность модульной установки значительно выше, что может обеспечить снижение продолжительности стадии ультраконцентрирования и диафильтрации, не снижая при этом качество полученного концентрата. Концентрирование проводилось до степени концентрирования 6,7, так как с дальнейшим увеличением степени концентрирования сильно снижалась производительность мембранного модуля. Полученный концентрат имел тёмную окраску, что может объясняться присутствием пигмента шелухи подсолнечника. Пермеат имел зелёную окраску (максимум поглощения 325 нм), что свидетельствует о фильтрации значительной части низкомолекулярных продуктов окисления фенольных соединений в процессе ультраконцентрирования. В таблице 4.7 представлены основные характеристики концентратов, полученных при тангенциальной и тупиковой ультрафильтрации со степенью концентрирования 6,7. Следует отметить, что при равной степени концентрирования потери белка на мембране при тупиковой ультрафильтрации 96 больше, чем при проведении процесса на полых волокнах. Анализ полученных данных по содержанию углеводов позволяет сделать вывод о том, что ультраконцентрирование в половолоконном модуле позволяет достичь минимально возможных концентраций балластных веществ в концентрате. Таким образом, проведение процесса тангенциального ультраконцентрирования является предпочтительным и позволяет получить продукт более высокого качества и степени очистки. Таблица 4.7 – Состав концентратов белка подсолнечного шрота при использовании тангенциальной и тупиковой ультрафильтрации СП, г/л 139,2 ОУ, г/л Тангенциальная, степень концентрирования 6,7 СВ, г/л 186,0 Тупиковая, степень концентрирования 6,7 181,1 129,5 9,2 Тип фильтрации 7,7 Известно, что присутствующие в растительных белковых ферментативных гидролизатах примеси углеводов снижают их качество. В ходе ультрафильтрации было изучено изменение концентрации моносахаридов, олигосахаридов и полисахаридов дополнительной в сравнении очистки с была нативным предложена гидролизатом. последующая В качестве двукратная диафильтрация. Качество очистки оценивали по содержанию углеводов в пермеатах после каждой стадии и в конечном концентрате. Данные по изменению концентрации моно-, олиго- и полисахаридов (по методу Бертрана-Шорля) на стадиях ультраконцентрации и диафильтрации представлены в таблице 4.8. Таблица 4.8 – Изменение концентрации моно-, олиго- и полисахаридов в процессе ультрафильтрации с последующей двукратной диафильтрацией Продукт Ферментативный гидролизат Пермеат после ультрафильтрации Пермеат после 2-х диафильтрации Концентрат Моносахариды (по РВ) , г/л 4,32 3,13 1,26 7,02 Олиго- и полисахариды, г/л 9,65 6,16 2,29 20,7 97 Высокое содержание углеводов и низкомолекулярных водорастворимых соединений фенольной природы в концентрате может оказывать влияние на качество получаемого изолята белка и его потребительские свойства. В качестве стадии дополнительной очистки предложена двукратная диафильтрация, которая обеспечивает снижение концентрации олиго и полисахаридов в концентрате, а также позволяет получить концентрат, практически не имеющий зеленого оттенка. 4.2.4 Изучение процесса осаждения белковых соединений гидролизата белка Влияние концентрации соляной кислоты на этапе осаждения белка ферментативного гидролизата оценивали по массе белкового осадка. Осажденный при разных значениях pH белок отделяли центрифугированием при 8 000 об/мин в течение 5 мин, а затем подвергали лиофильной сушке. Полученные данные зависимости степени осаждения от pH раствора представлены в виде графика (рисунок 4.16). 98 Рис. 4.16 – Зависимость степени осаждения белка от pH осаждения ферментолизата подсолнечного шрота Как видно из рисунка 4.16, с приближением рН к значению 4,5, которое соответствует pH изоэлектрической точки, степень осаждения приближается к максимуму. Степень осаждения для ферментативного гидролизата не превышает 42%, что может объясняться низкой концентрацией белка в гидролизате. Значение pH изоэлектрической точки подтверждается данными по концентрации белка в надосадках после осаждения белка (рисунок 4.17). Рисунок 4.17 – Зависимость концентрации белка в надосадке от pH осаждения ферментолизата подсолнечного шрота Как видно из рисунка 4.17, наименьшая концентрация в надосадке наблюдается при рН 4,5, что свидетельствует о максимально возможной степени осаждения белка в ферментативном гидролизате подсолнечного шрота. Из литературных данных известно, что в качестве осадителя может быть использована янтарная кислота [67]. Янтарная кислота разрешена к использованию в пищевой промышленности как пищевая добавка, является 99 абсолютно безвредной, способна оказывать лечебный эффект, повышает питательную ценность продуктов. Основным преимуществом использования янтарной кислоты является то, что она способна образовывать во взаимодействии с хлорогеновой кислотой хорошо растворимые в воде полярные комплексные соединения, которые в последствии могут быть легко удалены при промывке твёрдого осадка. Осаждение белка из гидролизата подсолнечника янтарной кислотой проводили добавлением различных объёмов 5 % раствора янтарной кислоты в нативный ферментативный гидролизат. Степень осаждения белка оценивали по массе осажденного белка. Максимальная степень осаждения белка была достигнута при рН 4,5 и составила 56,4 %. Низкий процент осаждения обуславливается невысокой концентрацией сухих веществ и, соответственно, белка. Осаждение белковой фракции концентрата ферментолизата подсолнечного шрота в ИЭТ растворами янтарной кислотой позволяет значительно уменьшить расход янтарной кислоты. Изучено влияние концентрации янтарной кислоты на степень осаждения белка в концентрате после тангенциального ультраконцентрирования. Осаждение проводилось в концентрате со степенью концентрирования 6,7 и содержанием белка 150 г/л. На рисунках 4.18 и 4.19 показана зависимость степени осаждения белка от объёма янтарной кислоты и pH раствора. 100 Степень осаждения белка, % 90 80 70 60 50 40 30 20 Гидролизат 10 Концентрат 0 0 10 20 30 Концентрация янтарной кислоты, г/л 40 Рисунок 4.18 – Зависимость степени осаждения белка от объема янтарной кислоты в нативном гидролизате и концентрате гидролизата подсолнечного Степень осаждения белка, % шрота 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 3.5 4 4.5 5 pH осаждения белка 5.5 Рисунок 4.19 –Зависимость степени осаждения белка от pH раствора в нативном гидролизате и концентрате гидролизата подсолнечного шрота 101 Из приведенных рисунков 4.18 и 4.19 видно, что степень осаждения в концентрате значительно выше, чем в ферментолизате. Максимальная степень осаждения 86,1 % достигалась при рН 4,5. Увеличение степени концентрирования приводит к увеличению исходной концентрации и уменьшению расхода раствора янтарной кислоты идущего на осаждение, что экономически оправдано. На рисунке 4.20 представлена зависимость степени осаждения от степени Степень осаждения белка, % концентрирования. 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 Степень концентрирования, раз 10 Рисунок 4.20 –Зависимость степени осаждения белка от pH раствора в нативном гидролизате и концентрате гидролизата подсолнечного шрота Как видно из графика, максимальная степень извлечения белка достигается при степени концентрирования 10, которая, в свою очередь, является предельной для половолоконного аппарата разделения. Стадия ультраконцентрирования позволяет увеличить степень осаждения белка на 55 % и значительно уменьшить его потери при выделении, а также снизить удельный расход янтарной кислоты. После осаждения полученную суспензию разделяли центрифугированием в течение 5 мин при 5000 об/мин, что соответствует Fr = 10000. Ресуспендирование пасты белка в 50 % растворе этанола позволяет удалить значительное количество янтарной кислоты из осадка и в значительной степени облегчает процесс высушивания осадка. Итоговое 102 содержание белка (N × 6,25) в полученном продукте достигает 90 – 94 %, что позволяет отнести его к изолятам высокого качества. 4.3 Выбор стадии и способа получения конечного продукта, сушка белкового ферментативного гидролизата В разрабатываемой подсолнечника технологии рассматривали комплексной несколько вариантов переработки получения семян конечного продукта. Известно, что включение дополнительных стадий очистки приводит к повышению качества конечного продукта, но может значительно увеличивать экономические издержки. В качестве возможных путей получения конечного концентрата белка подсолнечника рассматривали возможность сушки полупродуктов без дополнительной очистки на различных стадиях получения. Использование ферментативного гидролиза на стадии выделения белка подсолнечника снижает количество гидроксида натрия, вводимого в процесс, и полученные ферментативные гидролизаты с содержанием сухих веществ не менее 40 г/л могут быть направлены на распылительную сушку [148]. В производстве изолятов растительных белков применяются щадящие режимы, что позволяет избежать температурной денатурации белков и получить продукт с более высокой пищевой и кормовой ценностью. Известен метод производства белковых изолятов подсолнечника, включающий стадии нейтрализации щелочного экстракта и распылительной сушки при температуре входящего воздуха не более 190 °C, а выходящего – не более 90 °C [201]. В настоящей работе полученные гидролизаты также высушивали в распылительной сушке при двух условиях: образец 1 – температура сушильного агента на входе в аппарат 180 °С; на выходе из аппарата 88 °С; расход гидролизата, подаваемого на сушку 0,5 кг/час, расход жидкости к газовой фазе 0,0156 кг/м3; 103 образец 2 – температура сушильного агента на входе в аппарат 200 °С; на выходе из аппарата 80 °С; расход гидролизата, подаваемого на сушку 0,6 кг/час; расход жидкости к газовой фазе 0,0188 кг/м3. Получаемые продукты представляли собой сыпучие порошки серого цвета, основные характеристики которых представлены в таблице 4.9. Таблица 4.9 – Основные характеристики сухих изолятов белка, полученных в распылительной сушилке № образца Образец 1 Образец 2 Остаточное влаго- Выход Содержание Содержание содержание, % (г/г) продукта, % белка, % углеводов, % 3,8 90 86,1 7,0 4,6 52 86,1 3,0 Образец 2, полученный при более высокой температуре сушильного агента, имел более тёмный цвет и большее остаточное влагосодержание. Причиной этого может быть превышение температуры стеклования содержащихся в гидролизате сахаров и как следствие – формирование в процессе сушки эластичной корочки, которая предотвращает испарение воды и делает частицы более липкими. В результате значительное количество материала налипло на стенки камеры, и выход продукта уменьшился [193]. С другой стороны, белковая паста, полученная после осаждения белка янтарной кислотой после её отмывки этиловым спиртом, также требует сушки. Для удаления остатков растворителя (спирта и воды) в данном случае применили режим вакуумной сушки при комнатной температуре в течение 6 ч. В результате был получен белый мелкодисперсный порошок с содержанием сырого протеина 91,6 %. Применение обезвоживания энергозатрат. стадий осаждения, представляется промывки наиболее спиртом перспективным с и вакуумного точки зрения 104 4.4 Характеристика полученных продуктов Изолят белка, светло-серого или светло-кремового цвета с остаточной влажностью менее 6 %. Полученный продукт имеют высокие показатели водоудерживающей – 356,0 %, жироэмульгирующей (39,6 % – жироудерживающей эмульсия, 18,2 % вода, – 86,4 % 42,2 % и масло) способностей. В таблице 4.10 представлены данные о концентрации 20 протеиногенных аминокислот. Таблица 4.10 – Аминокислотный состав изолятов белка подсолнечника Аминокислота Глутаминовая кислота + глутамин Серин Аланин Аспарагиновая кислота + аспарагин Гидроксипролин Пролин Цистин Глицин Тирозин Аргинин Валин Фенилаланин Лейцин Лизин Гистидин Триптофан Изолейцин Треонин Метионин Содержание, г/100 г белка 19,48 3,72 4,53 9,18 0,03 2,84 1,00 3,84 3,49 8,43 4,66 5,86 6,76 2,21 2,24 0,99 3,38 4,34 2,18 Изолят имеет высокое содержание незаменимых кислот, доля которых составляет более 41 %. Аминокислотный состав является определяющим 105 фактором при принятии решения об использовании изолята белка в производстве пищевых продуктов [182; 202]. Показателем биологической ценности белка является аминокислотный скор, который представляет собой процентное отношение доли определённой незаменимой аминокислоты (в общем содержании таких аминокислот в исследуемом белке) к стандартному (рекомендуемому) значению этой доли [163]. Данные аминокислотного скора изолята белка подсолнечника, идеального белка (ВОЗ), а также состав дешёвого животного белка (фарша минтая Theragra chalcogramma) представлены на рисунке 4.21. Рисунок 4.21 –Аминокислотный скор: а) Изолят белка подсолнечника; б) Идеальный белок ФАО/ВОЗ; в) Фарш минтая Изолят белка подсолнечника дефицитен по метионину и лизину, которыми богат белок минтая, что позволяет предложить схему включения изолята в производство полуфабрикатов на основе данного сырья с целью повышения его биологической ценности. 106 На рисунке 4.22 представлен аминокислотный скор смеси растительного и животного белков взятых в соотношении 1:1. Рисунок 4.22 – Аминокислотный скор: а) Идеальный бело ФАО/ВОЗ; б) расчетное значение смеси изолятов в соотношении 50/50 Расчеты показывают, что данная смесь по своей биологической ценности приближается к идеальному белку. На основе полученных данных разработан лабораторный регламент на производство пищевой добавки – изолята белка пищевого назначения. 107 5 Разработка путей утилизации твёрдого отхода производства изолята белка Вторичные продукты переработки подсолнечника могут быть использованы для дальнейшего производства изолятов и текстуратов пищевого назначения путём экстракции остаточного белка, а также для получения пробиотических и кормовых добавок путем их биоконверсии. Основным приемом биоконверсии является управляемое культивирование микроорганизмов. Такой подход позволяет добиваться значительного изменения биохимического состава вторичного растительного сырья и способствует повышению его кормовой ценности. Роста и развитие микроорганизмов в природе и в лабораторных условиях требует наличия доступных питательных веществ для энергетических и конструктивных реакций. Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями [203]. Наиболее перспективным методом переработки различных отходов является биодеградация микроорганизмами. Поэтому следующим этапом работы стало исследование способности микроорганизмов к биодеградации компонентов подсолнечного шрота и отходов, образующихся при выделении изолята белка. При получении изолята белка из подсолнечного сырья на различных стадиях образуются такие отходы, как твёрдый депротенизированный шрот (ДПШ) и пермеат. Данные отходы могут быть подвергнуты биоконверсии. 5.1. Исследование поверхностного культивирования Bacillus cereus на депротеинизированном шроте подсолнечника В качестве микроорганизмов-деструкторов использован Bacillus cereus БП– 46. Представители рода Bacillus отличаются высоким и разнообразным спектром биологической активности. Часто обладая явным антагонизмом к патогенным 108 микроорганизмам, они продуцируют целый ряд ферментов, лизирующих целлюлозу, крахмал, пектины, жиры, белки, а также производят различные аминокислоты и антибиотики. Бактерии рода Bacillus могут использоваться в производстве кормов и комбикормов. Благодаря протеазной активности спор Bacillus активизируются процессы пищеварения, происходит выработка витамина К2 и снижается аллергенность кормов [204]. На первом этапе исследований был изучен рост культуры Bacillus cereus БП-46 в простых периодических условиях на синтетической питательной среде [84]. 5.1.1 Получение посевного материала Bacillus cereus для поверхностного культивирования Для определения ростовых характеристик была получена кривая роста культуры Bacillus cereus БП-46 на жидкой питательной среде L-бульон (рисунок Оптическая плотность, ед. 5.1). 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 Время,ч Рисунок 5.1 – Кривая роста Bacillus cereus БП-46 на L-бульоне 109 Кинетическая кривая периодического культивирования представляет собой типичную S-образную кривую. В качестве инокулята использовали 15 часовую культуру, содержащую по результатам микроскопии вегетативные клетки. Рост культуры Bacillus cereus БП-46 в жидкой питательной среде происходил в течение суток. При этом оптическая плотность суспензии возрастала с 0,022 ед. в момент посева до 0,611 ед. через 17 ч. культивирования и далее стабилизировалось на уровне максимального значения. Увеличение биомассы происходило с удельной скоростью 0,22 ч.-1. Обобщая полученные результаты, можно отметить, что штамм не является быстрорастущим (среднее время генерации составляет 3,2 ч.). 5.1.2 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на нативном подсолнечном шроте На следующем этапе исследований нами было проведено поверхностное культивирование Bacillus cereus на нативном подсолнечном шроте. Стерилизацию шрота проводили дробно с промежутком 6 ч. в автоклаве при 1 ати в течение 1 ч. Показано, что культура активно потребляет углеводные компоненты шрота и значительно изменяет состав сырья. Физико-химические параметры продукта, полученного при твёрдофазной ферментации Bacillus cereus БП-46 на подсолнечном шроте, приведены в таблице 5.1. Таблица 5.1 – Физико-химические параметры продукта, полученного при твердофазной ферментации Bacillus cereus БП-46 на подсолнечном шроте Показатель Сырой протеин, % СВ Сырая клетчатка, % СВ Исходный Продукт после подсолнечный шрот твердофазной ферментации 37,5±0,5 39,0±0,5 19,0±0,25 13±0,25 Спустя 48 ч. твёрдофазной ферментации при высеве образцов на агаризованные среды и количественном учете методом Коха выросших колоний, было показано, что в полученной массе плотность популяции бациллы возросла с 5,0105 до 7,4109 КОЕ/г. Результаты, представленные в таблице 5.1, 110 свидетельствуют, что в полученном продукте содержание белка повысилось на 1,5 %, содержание клетчатки снизилось на 6,0 %. Полученные результаты показали, что культура Bacillus cereus БП-46 может быть предложена для биоконверсии продуктов переработки подсолнечника, в том числе для биоконверсии депротенизированного шрота, образующегося на стадии щелочной экстракции [205]. 5.1.3 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на депротеинизированном подсолнечном шроте, образующемся после щелочной экстракции В работе использовали депротеинизированный шрот, образующийся после щелочной экстракции белка. Полученный отход содержал: сырого протеина составило 17,5 %; сырой клетчатки – 44,1 %; влажность – не более 5 %. Основные физико-химические параметры продукта, полученного при твердофазной ферментации Bacillus cereus БП-46 на данном отходе, приведены в таблице 5.2. Таблица 5.2 – Физико-химические параметры продукта, полученного при твердофазной ферментации Bacillus cereus БП-46 на депротеинизированном подсолнечном шроте после щелочной экстракции Показатель Сырой протеин, % СВ Сырая клетчатка, % СВ Исходный подсолнечный шрот 17,5±0,5 44,1±0,25 Продукт после твердофазной ферментации 23,0±0,5 33,4±0,25 Количественный анализ методом Коха показал через 2 суток рост количества клеток с 5,0105 до 4,9109 КОЕ/г. Результаты, представленные в таблице 5.2, свидетельствуют о значительном изменении состава сырья: накопление сырого протеина составило 5,5 % и снижение содержания сырой клетчатки более чем на 10 %. Следовательно, культура активно потребляет компоненты шрота и значительно изменяет состав сырья [206]. 111 5.1.4 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на депротеинизированном подсолнечном шроте, полученном в результате гидролиза препаратом Protex 40E Основным твёрдым отходом выделения белка с использованием ферментного препарата Protex 40E являлся депротеинизированный шрот. Для проведения данного исследования в лабораторных условиях был получен депротеинизированный шрот, имеющий следующие характеристики: содержание сырого протеина 11,5 %, содержание сырой клетчатки 39,5 %; влажность не более 5 %. Физико-химические параметры продукта, полученного при твёрдофазной ферментации Bаcillus cereus БП-46 на ДПШ после ферментативного гидролиза, приведены в таблице 5.3. Таблица 5.3 – Физико-химические параметры продукта, полученного при твердофазной ферментации Bacillus cereus БП-46 на ДПШ после ферментативного гидролиза Депротеинизированный подсолнечный шрот Показатель Сырой протеин, % СВ Сырая клетчатка, % СВ 11,5±0,5 39,5±0,25 Продукт после твердофазной ферментации 14,3±0,5 33,7±0,25 Количественный анализ методом Коха показал, что спустя 2 суток количество клеток возросло с 5,0105 до 1,5109 КОЕ/г. Результаты, представленные в таблице 5.3, свидетельствуют о значительном изменении состава сырья: накопление сырого протеина составило 2,8 %, а снижение содержания сырой клетчатки – 5,8 %. Удаление белка в процессе как щелочной так и ферментативной депротеинизации не приводит к значительному изменению качества депротеинизированного шрота и его биологической доброкачественности. Твёрдофазное культивирование бактерий позволяет понизить содержание сырой 112 клетчатки в продуктах биодеградации по сравнению с исходным и предложить данный вариант обработки в качестве стадии производства РУБК. 5.2 Культивирование Bacillus cereus БП-46 на ферментолизате Поскольку растительное сырье может характеризоваться значительным колебанием состава, а в ходе его переработки могут возникать отклонения параметров процесса от установленных значений, качество получаемого на стадии ферментативной обработки основного продукта (белкового концентрата) не всегда может соответствовать требованиям к пищевому сырью. Поэтому в качестве альтернативного способа использования получаемых гидролизатов была исследована возможность их использования для культивирования Bacillus cereus. Полученные на стадии экстракции с использованием фермента гидролизаты содержат до 80 % сырого протеина от СВ и могут быть использованы в качестве компонента питательной среды для культивирования Bacillus cereus. На данном этапе работы проводили культивирование Bacillus cereus БП-46 на модифицированном L-бульоне, в котором в качестве основного источника органического азота и дополнительного источника углерода вместо пептона использовали разбавленный ферментативный гидролизат подсолнечного шрота (с содержанием СВ 26 г/л, СП – 53 % , РВ – 4 г/л). Сравнение проводили с культурой, выращенной на синтетической питательной среде, содержащей в качестве источника органического азота 10 г/л пептона. Следует отметить, что при стерилизации среды, содержащей гидролидизат, образуется светлый осадок – предположительно белок денатурирует в процессе термической обработки. На рисунке 5.2 представлены кривые роста Bacillus cereus БП-46 на ферментолизате и на L-бульоне. После отделения биомассы центрифугированием её содержание определяли термогравиметрически. Пунктирной линией на графике обозначена масса денатурата белка. 113 Рисунок 5.2 – Кривая роста Bacillus cereus БП-46 на ферментолизате и на L-бульоне Содержание КОЕ/мл определяли методом Коха спустя 24 ч. Концентрация биомассы с учётом массы денатурированного белка, полученной на питательной среде, содержащей гидролизат подсолнечного шрота, составила 15,6 г/л, а количество КОЕ - 7,2108 КОЕ/мл; а в случае использования среды сравнения – 3,4106 КОЕ/мл. Из полученных данных видно, что гидролизаты подсолнечного шрота могут быть использованы в качестве компонента питательных сред для культивирования Bacillus cereus, в качестве альтернативного источника азота, а полученная биомасса бактерий может быть предложена для производства пробиотических кормовых препаратов [197]. 5.3 Исследование и оптимизация получения углеводно-белкового корма на основе депротеинизированного шрота Нативный подсолнечный шрот может быть подвергнут биодеградации различными культурами микроорганизмов с получением биомассы кормового назначения высокого качества. Культивирование Pleurotus ostreatus и изучение морфологических характеристик культуры показало, что выбранная культура способна усваивать все компоненты комплексного субстрата. В ходе 114 культивирования компоненты питательной среды были потреблены не более чем на 25%. Содержание сырого протеина в полученной биомассе не превышало 35%, также было показано, что условия выделения (увеличение концентрации NaOH в процессе экстракции) белка подсолнечного шрота определяют скорость, глубину и качество последующей биоконверсии Pleurotus ostreatus [207; 208]. Образующийся в результате ферментативного гидролиза депротеинизированный шрот, обогащённый лигноцеллюлозным комплексом и гемицеллюлозами, может быть использован для микробной биоконверсии с целью получения углеводно-белкового корма. Шрот является комплексным сырьём, стандартизуется только промышленности, и по ключевым количество факторов, показателям для оказывающих кормовой влияние на микробиологическую конверсию, и сила их влияния может в значительной степени варьировать в зависимости от качества исходного сырья и глубины ферментативной обработки. При использовании ДПШ в качестве субстрата требуется провести его предобработку с целью разрушения трудноутилизируемой культурами дрожжей полисахаридной составляющей. В работе был использован мягкий кислотный гидролиз. 5.3.1 Предварительная оценка эффективности предобработки Поскольку при кислотном гидролизе в мягких условиях не наблюдается значительного разрушения целлюлозы, то при анализе состава сырья дополнительно к полученным ранее биохимическим показателям определяли общие углеводы (ОУ) и редуцирующие вещества (РВ), экстрагируемые кислотой, что характеризует максимально возможное содержание углеводов, высвобождающихся и подвергающихся гидролизу под действием разбавленной кислоты. Данные величины составили 24,1 % СВ и 10,2 % СВ соответственно. Таким образом, содержание редуцирующих веществ после обработки ДПШ разбавленным раствором кислоты незначительно (данный критерий не даёт 115 объективной оценки эффективности предобработки сырья), а приемлемым критерием оценки может служить только концентрация ОУ. Однако необходимо найти такие условия гидролиза ДПШ, при которых она будет максимальна. Результаты кислотного депротеинизированного шрота гидролиза представлены и термической в таблицах обработки 5.4 и 5.5. Негидролизованный остаток от массы исходной навески составил для серной и ортофосфорной кислоты 60 % и 65 % соответственно. Выходы общих углеводов ОУ для обеих кислот различались незначительно. В таблицах 5.4 и 5.5 представлены зависимости содержания редуцирующих веществ в гидролизатах депротеинизированного подсолнечного шрота при различном давлении от времени. Таблица 5.4 – Характеристика гидролизатов при обработке депротеинизированного подсолнечного шрота растворами серной кислоты Давление, ати 0,5 1,0 1,5 0,5 1,0 1,5 Продолжительность обработки, час 0,5 1,0 1,5 pH 2 pH 4 pH 2 pH 4 pH 2 pH 4 РВ, г/л 1,30 0,91 2,24 0,93 2,55 1,05 2,61 1,05 3,24 1,06 3,51 1,09 4,37 1,10 5,38 1,12 7,23 1,32 ОУ, г/л 9,4 6,0 10,7 6,3 11,5 6,5 15,2 7,2 15,8 7,3 16,1 7,7 19,0 7,8 19,5 7,8 21,7 8,1 116 Таблица 5.5 – Характеристика гидролизатов при обработке депротеинизированного подсолнечного шрота растворами ортофосфорной кислоты Давление, ати 0,5 1,0 1,5 0,5 1,0 1,5 Продолжительность обработки, час 0,5 1,0 1,5 pH 2 pH 4 pH 2 pH 4 pH 2 pH 4 РВ, г/л 1,21 0,80 2,16 0,9 2,31 1,01 2,85 1,02 3,76 1,05 4,20 1,06 4,19 1,06 4,25 1,08 4,25 1,18 ОУ, г/л 9,3 5,9 9,7 6,1 9,8 6,1 15,7 6,5 15,9 6,5 15,8 6,9 17,9 6,9 18,1 7,0 18,8 7,2 Наибольший выход РВ получен в процессе гидролиза раствором серной кислоты при pH 2, давлении 1,5 ати, продолжительности 1,5 ч. При этом увеличение продолжительности обработки оказывало заметное влияние на выход РВ, в то время как концентрация ОУ изменялась не значительно. Указанная закономерность наблюдалась для обработки обеими рассмотренными кислотами. Давление, с другой стороны, оказывало существенное влияние на оба показателя [209]. 5.3.2 Оптимизация условий предварительной обработки питательной среды методом факторного эксперимента Предварительные исследования показали, что продолжительность гидролиза ДПШ более 30 мин., а также использование серной или ортофосфорной кислот не влияют на выход общих углеводов. Использование серной кислоты в данной работе связано с её сравнительно низкой стоимостью, а также большей стабильностью при нагревании. На глубину протекания гидролиза будут влиять начальное значение pH и температура процесса, а на конечную концентрацию углеводов – ещё и гидромодуль. При варьировании значительного количества 117 параметров исследование целесообразно проводить по методологии активного эксперимента. Гидролизаты, полученные в результате обработки ДПШ кислотой, были использованы в качестве субстрата для культивирования сахаромицетов. Исследование влияния условий кислотного гидролиза ДПШ на концентрацию общих углеводов и на выход биомассы проводили в соответствии с полным факторным экспериментом (ПФЭ) 23. В качестве варьируемых факторов были выбраны: температура гидролиза, начальное значение pH и гидромодуль. Факторы и уровни их варьирования в размерном и безразмерном масштабе представлены в таблице 5.6. Условия культивирования сахаромицетов на полученных гидролизатах были одинаковыми для всех опытов. Таблица 5.6. Факторы и уровни их варьирования Факторы X1 X2 X3 Верхний уровень фактора (–1) 112 2 10 Температура, 0С Начальное значение рН Гидромодуль Нижний уровень фактора (+1) 127 4 20 В качестве откликов рассматривались концентрация общих углеводов Y1 и выход биомассы Y2. Результаты ПФЭ представлены в табл. 5.7. Обработка экспериментальных данных, полученных в ходе исследований, проводилась в соответствии с методикой расчёта, представленной в разделе 2.5.3. Были определены коэффициенты уравнений регрессии, описывающих концентрацию общих углеводов и накопление биомассы на гидролизатах. Для обоих уравнений была проведена стандартная процедура исключения незначимых коэффициентов на основании 5 параллельных опытов по гидролизу и 4 параллельных опытов по культивированию дрожжей в центре плана с использованием критерия Стьюдента для уровня значимости р < 0,05, после чего уравнения приняли вид: = 7.975 + 1.975 − 2.5 − 2.575 = 58.6125 + 7.5375 + 1.15 − 12.7375 − 1.15 − 6.5625 118 119 Адекватность уравнений проверялась по критерию Фишера для такого же уровня значимости (р < 0,05). Для сравнения в таблице 5.7 также приведены расчетные значения для концентрации общих углеводов и выхода биомассы. Можно отметить, что на выход общих углеводов значимо влияют все три выбранных фактора, а также два эффекта парного взаимодействия: температура – начальный рН гидролиза; начальный рН гидролиза – гидромодуль. На выход биомассы значимое влияние оказывают температура гидролиза, гидромодуль, а также эффект тройного взаимодействия факторов. С учётом последнего для нахождения оптимальных условий по параметру выход биомассы были проведены дополнительные эксперименты с целью построения регрессионной модели второго порядка от двух факторов: X1 – температура гидролиза; Х2 – гидромодуль. Начальное значение рН как не значимый фактор зафиксировали на нижнем уровне, так как его увеличение отрицательно сказывается на выходе общих углеводов при гидролизе. Матрицу эксперимента составили на основе центрального композиционного ротатабельного планирования (ЦКРП), при этом уровни варьирования гидромодуля и температуры гидролиза сохранили, что позволило использовать полученные ранее результаты ПФЭ в качестве ядра плана. Поскольку в ЦКРП величина «звёздного плеча» составляет 1,414, значения гидромодуля в звездных точках составили 8,7 и 22, а температуры гидролиза – 108,9 и 130,1 °C. Результаты ЦКРП представлены в табл. 5.8. 120 121 Получено два уравнения регрессии, которые после исключения незначимых коэффициентов с использованием критерия Стьюдента (р < 0,05) приняли следующий вид: = 11.33 + 1.50 = 52.86 + 5.31 − 3.39 − 12.61 − 2.22 . +4.18 − 9.68 Было найдено, что на общий выход углеводов условия гидролиза оказывают то же влияние, как и при проведении ПФЭ: квадратичные члены оказались не значимы; повышение температуры оказывает положительное влияние на выход ОУ; а гидромодуля – отрицательное. Вид регрессионного уравнения, описывающего влияние условий процесса на выход биомассы, изменился: значимым оказался квадратичный эффект для гидромодуля. Поверхности отклика для концентрации общих углеводов и выхода биомассы представлены на рисунке 5.3. Рисунке 5.3 – Поверхности отклика выхода общих углеводов (а) и биомассы (б) при гидролизе и последующей биоконверсии ДПШ Оба уравнения регрессии адекватны при проверке по критерию Фишера (р < 0,05). Характер поверхности отклика обеих функций (рисунок 5.3) ясно демонстрирует, что их экстремумы (максимумы) лежат далеко за выбранными пределами варьирования, поэтому оптимальными в данном случае можно считать краевые значения гидромодуля и температуры гидролиза – 8,7 и 130,1 °C соответственно. 122 Таким образом, в результате исследований была подтверждена возможность и определены оптимальные условия использования твёрдого отхода переработки подсолнечного шрота (ДПШ), образующегося при производстве изолята белка [210]. 5.3.3 Исследование кинетики роста дрожжей и характеристика РУБК, полученного в оптимальных условиях предобработки субстрата На основании проведённых исследований и определенных ранее оптимальных условий предварительной обработки сырья были изучены кинетика роста и потребление субстрата дрожжами Saccharomyces cerevisiae при глубинном гетерофазном культивировании. Для культивирования дрожжей использовали питательную среду после кислотного гидролиза ДПШ в определенных ранее оптимальных условиях (130,1 °С, рН 2,0, гидромодуль 8,7, 30 мин). Начальная концентрация клеток составила 4 млн кл./мл. Кривые роста и потребления субстрата Saccharomyces cerevisiae представлены на рисунке 5.4, основные параметры культивирования – в таблице 5.9. Таблица 5.9 – Характеристики культивирования Saccharomyces cerevisiae на гидролизатах растительного сырья Параметры культивирования Длительность лаг-фазы, ч. Максимальная удельная скорость роста, ч.-1 Удельная скорость потребления субстрата, ч.-1 Экономический коэффициент, г/г Степень потребления субстрата, % ДПШ 2 0,22/0,03 0,02/0,01 0,63 51,9 123 Рисунок 5.4 – Кинетика роста Saccharomyces cerevisiae на гидролизатах ДПШ Удельная скорость роста Saccharomyces cerevisiae на начальном этапе культивирования составляла 0,22 ч-1, что согласуется с литературными данными культивирования дрожжей на средах, содержащих углеводы в качестве Ссубстрата [211]. В последствии происходило значительное снижение скорости роста и потребления субстрата, что можно объяснить либо переходом от легкоутилизируемой фракции углеводов к трудноутилизируемой, либо наступлением лимитирования роста низкой концентрацией кислорода. С одной стороны, первый вариант представляется возможным, т.к. установлено, что исходный гидролизат содержит около 6,5 г/л РВ, которые, по всей вероятности и выступают в качестве легкоусвояемого субстрата. С другой, полученная после гидролиза питательная среда содержит большое количество твердой фазы (ДПШ), что приводит к значительному увеличению вязкости среды, осложняет ее перемешивание и снижает массообменные характеристики системы, поэтому гипотеза о лимите по кислороду представляется более вероятной [210]. 124 Экономический коэффициент, оценённый по потреблению ОУ, составлял 0,63, однако, степень усвоения субстрата была сравнительно не высока и составила 51,9 % . 5.3.4 Биохимическая характеристика продукта При сопоставлении состава исходного сырья и полученного РУБК по основным биохимическим показателям, установлено, что использование ДПШ как субстрата для глубинного гетерофазного культивирования дрожжей позволяет повысить содержание сырого протеина в 1,3 раза (таблица 5.10). Таблица 5.10 – Сравнение основных биохимических характеристик сырья и РУБК Показатель СВ, % Сырой протеин, % от СВ Сырая клетчатка, % от СВ Исходное сырье 95,4 25,0 39,6 РУБК 95,8 32,5 32,0 Таким образом, с точки зрения кинетики роста и экономического коэффициента ДПШ является перспективным субстратом. Полученный на его гидролизате РУБК также характеризуется высоким содержанием сырого протеина [210]. 125 5.3 Сравнение и анализ полученных продуктов Проведенные исследования вариантов биодеградации показывают, что все продукты переработки шрота подсолнечника сохраняют свою биологическую доброкачественность и могут быть использованы в качестве основных источников углерода и органического азота в составе питательных сред для производства РУБК и биомассы кормового назначения. Рассмотренные варианты биологической конверсии продуктов переработки могут быть положены в основу гибкой рациональной технологии комплексной переработки. 126 6 Обоснование возможности использования отхода со стадии концентрирования в качестве компонента питательных сред 6.1 Анализ состава пермеата Полученный на стадии ультрафильтрации пермеат содержит остаточные количества белков, аминокислот и углеводов, что позволяет предположить возможность его утилизации микробиологическими методами или его переработки в новый продукт – заменитель белковой составляющей питательных сред. Пермеат содержит СВ – 22–26 г/л, СП – 49±3 %, РВ – 8,8±2 г/л. Содержание в пермеате аминного азота не превысило 0,13±0,02 г/л, а содержание фенольных соединений 27,1 ±1,1 мг/л. Присутствие фенольных соединений, в том числе хлорогеновой кислоты и продуктов её окисления, в концентрации свыше 10 мг/л придает пермеату тёмнозелёную окраску и осложняет его применение в качестве компонента питательных сред. В качестве варианта дальнейшей переработки предложили очистку адсорбцией. 6.2 Исследование и оптимизация удаления пигментных примесей Хлорогеновая кислота является преобладающим фенольным соединением и придаёт пермеату зеленую окраску. ХГК относится к семейству производных коричной кислоты и представляет собой комплекс сложных эфиров, образованных транс-коричной кислотой и хинной кислотой. В чистом виде ХГК представляет собой бесцветные хорошо растворимые в воде кристаллы, однако ее щелочные растворы на воздухе приобретают зеленую окраску. В ультрафиолетовой области спектра ХГК дает пики поглощения при длинах волн 240, 298 и 325 нм. 127 В работе была рассмотрена возможность адсорбции фенольных соединений различными адсорбентами, названия и свойства которых приведены в таблице 6.1. Таблица 6.1 – Характеристика сорбентов, использованных в рамках исследований Марка АГ-3 ФАС-3 ОУ-А Neusilin УНК Тип сорбента Форма Уголь активированный Уголь активированный Уголь активированный Алюмомагнийсиликат Прессованные углеродные нанотрубки Гранулы Гранулы Порошок Порошок Гранулы Насыпная плотность, г/дм3 400–500 Удельная площадь поверхности, м2/г – – 0,08 800-1000 1200-1400 400-500 300 – 900-150 Были проведены исследования по осветлению пермеата, полученного в результате переработки подсолнечного шрота. Для проведении процесса сорбции навеску сорбентов из расчета 0,0125 г на 1 мл добавляли к пермеату и выдерживали при комнатной температуре и постоянном перемешивании (180 об/мин.) в течение 30 мин. После чего производили отделение сорбента следующими методами: гранулы АГ-3, ФАС-3, Purolite отделяли центрифугированием; частицы ОУ-А, Neusilin и УНК - фильтрованием сквозь трехслойный фильтр. Для исходного раствора и растворов после сорбции при разведении в 100 раз были сняты спектры в УФ и видимой области спектра (рисунок 6.1). 128 Рисунок 6.1 – Спектры поглощения исходного раствора и растворов после сорбции На графике видны пики поглощения соответствующие 298 и 325 нм, которые соответствуют максимумам поглощения ХГК и её производных. Из представленных на рисунке 6.1 спектров можно сделать вывод, что активированный уголь ОУ-А показывает наибольшую адсорбционную способность и может быть предложен для очистки полученного пермеата от соединений фенольной природы и продуктов их окисления и связывания с аминокислотами. Проведено исследование процесса сорбции на активированном угле марки ОУ-А при двух значениях рН: 7,2 и 5,5. В качестве варьируемых факторов были выбраны масса угля, приходящаяся на фиксированный объем пермеата, и время сорбции. Объём пермеата во всех экспериментах составлял 30 мл. Эксперимент проводили в соответствии с ротатабельным ЦКП. Факторы и уровни их варьирования приведены в таблице 6.2. 129 Таблица 6.2 – Факторы и уровни их варьирования Факторы Масса угля, мг Время сорбции, мин. Звездная Верхний Центр точка уровень плана (-1,414) (-1) (0) 0,07 0,15 0,38 8,5 15 30 Нижний Звездная уровень точка (+1) (+1,414) 0,60 0,69 45 50 Определение изменения концентрации фенольных соединений проводили спектрофотометрическим методом в диапазоне волн 220-340 нм. Расчёт проводили для значений оптической плотности 325 нм, что соответствует максимуму поглощения ХГК. Долю удаленных соединений определяли как отношение концентраций соединений после сорбции к начальной концентрации. Матрица планирования и результаты обоих экспериментов приведены в таблице 6.3. Таблица 6.3 – Матрица планирования и результаты эксперимента № 1 2 3 4 5 6 Х1 1 -1 1 -1 0 0 Х2 1 1 -1 -1 0 0 Y7,2 0,68 0,40 0,71 0,25 0,66 0,69 Y5,5 0,74 0,43 0,63 0,44 0,63 0,64 № 7 8 9 10 11 12 13 Х1 0 0 0 1,414 -1,414 0 0 Х2 0 0 0 0 0 1,414 -1,414 Y7,2 0,69 0,69 0,68 0,71 0,37 0,64 0,58 Y5,5 0,62 0,65 0,63 0,95 0,48 0,86 0,45 На рисунке 6.8 приведены графики спектров, полученные при рН 7,2; а на рисунке 6.9 – при рН 5,5. 130 Рисунок 6.8 – Спектры исходного пермеата и после его очистки углем при рН 7,2 Рисунок 6.9 – Спектры исходного пермеата и после его очистки углем при рН 5,5 131 В качестве уравнения линейной регрессии была выбрана полная модель с учетом всех эффектов. Значимость коэффициентов проверялась по критерию Стьюдента. После отсева незначимых коэффициентов проводилось уточнение значений оставшихся, т.к. при выбранном методе планирования получаются смешенные оценки факторов. Оценка адекватности полученной модели проводилась по критерию Фишера при уровне значимости р=0,05. Полученные уравнения при разных значениях рН имели вид: , = 0,67 + 0,15 , − 0,08 = 0,64 + 0,15 − 0,05 + 0,09 При рН 7,2 не значимыми оказались линейный эффект для Х2 и эффект парного взаимодействия. При рН 5,5 значимыми оказались только линейные эффекты. Содержание фенольных соединений, определяемых методом ФолинаЧокальтеу, в пермеате после очистки активированным углем составило менее 2,7 мг/л. Адсорбция ХГК и продуктов её окисления на активированном угле марки ОУ-А позволяет снизить их содержание в пермеате на 90%. На основании полученных исследований были даны следующие рекомендации по ведению процесса сорбции: рН 5,5; масса угля 0,08 г на 1 мл пермеата; время обработки - 45 мин. 6.3 Получение сухой формы пермеата и оценка её ростовых свойств Очищенный от фенольных соединений при рекомендованных условиях пермеат высушили распылением при температуре воздуха на входе в камеру 180 °C, на выходе 88 °С. Сухой порошок содержит 39,5 % РВ и 0,5 % аминного азота, содержанием сырого протеина не менее 50 %. Распылительная сушка позволяет получить светло-жёлтый мелкодисперсный порошок. Для оценки биологической ценности полученного пермеата проводили культивирование на питательных средах, содержащих пермеат в качестве единственного источника углерода и азота. Показано, что культура Bacillus cereus 132 БП-46 может потреблять компоненты питательной среды и накапливать значительные количества биомассы, а Lactobacillus casei B 4172 сбраживает компоненты питательной среды с образованием органических кислот и закисляет среду до значения pH 3,7. Сухой пермеат использовали вкачестве копонента питательной среды при глубинном культивировании Lactobacillus casei и Bacillus cereus. В качестве сравнения использовали среду MRS и L-бульон соответственно. Основным показателем считали накопление биомассы и КОЕ/мл через 24 ч. культивирования. Для молочнокислых бактерий также оценивали значение pH. Таблица 6.3 – Основные показатели процесса культивирования на средах содержащих аминотон и пермеат. Источник азота Длительность лаг-фазы, ч Титр клеток, КОЕ/мл107 pH Lactobacillus casei аминотон пермеат 2,75 4 2,2 1,8 3,5 3,7 Bacillus cereus аминотон пермеат 2 2,5 8,7 5,6 н/о н/о Оценка биологической ценности показала, что пермеат может быть использован в качестве источника азота для культивирования указанных штаммов бактерий. 6.4 Технологическая схема комплексной переработки шрота подсолнечника с получением изолята белка подсолнечника и РУБК для животных На основе проведённых исследований разработана принципиальная технологическая схема получения изолята белка подсолнечника (рисунок 6.3) [193]. 133 Шрот подсолнечника СП≥37% Ферментативная обработка Гидромодуль 10; pH 8,5 t = 37,5°С Вода деионизированная Фильтрование Гидрооксид раствор 40% натрия, Депрот. шрот Сепарация, Fr=10000 На биоконверсию Ферментный препарат Protex 40E, 0,2% Ультрафильтрация УПМ-20, степень сжатия 10 раз Пермеат На переработку Концентрат белка СВ ≥ 200г/л Янтарная кислота 5-6%-ый раствор Осаждение pH =4,5; t≤10°C Спирт этиловый, 50%-ый раствор Промывка спиртом Спиртовой раствор На регенерацию Паста белка Вакуумная сушка t=50°C±4 Изолят белка подсолнечника Влажность ≤ 5%, СП ≥95% Рисунок 6.3 – Технологическая схема процесса комплексной переработки шрота подсолнечника с получением изолята белка Предложенная технологическая схема включает последовательность следующих стадий: ферментативный гидролиз, отделение депротенизированного шрота (ДПШ, твердый отход), ультраконцентрирование и диафильтрацию с получением концентрата в качестве полупродукта и пермеата в качестве жидкого отхода, осаждение белка раствором янтарной кислоты, промывка белка этиловым спиртом для отделения фенольных соединений, вакуумная сушка [202]. 134 Для утилизации образующихся отходов предложены технологические схемы утилизации. Дополнительная технологическая схема переработки депротеинизированного шрота представлена на рисунке 6.4. Депрот. шрот СП≤24%; СК≥38% Гидролиз Гидромодуль 10; pH 2,0; температура 127°С Вода подготовленная Серная кислота, концентрированная Нейтрализация, pH =5,5±0,2 Натрия гидрооксид, раствор 40%. Стерильный раствор минеральных солей Приготовление стерильной питательной среды Ферментация S.cerevisiae, t=30°С, pH 5,5 Сушка РУБК Влажность ≤ 5%, СП =32,5% Рисунок 6.4 – Технологическая схема процесса биологической конверсии депротеинизированного шрота подсолнечника с получением РУБК Схема включает стадию предобработки депротеинизированного шрота подсолнечника химическим гидролизом, нейтрализацию, приготовление стерильной питательной среды, стадию глубинной гетерофазной ферментации и сушку. Для утилизации жидкого отхода стадии концентрирования белкового гидролизата представлена на рисунке 6.5. 135 Пермеат, СВ ≥1,8% Сорбционная очистка t=20°C, τ= 45 мин, pH 5,5 Уголь ОУ-А, 0,08 г/л Соляная кислота Фильтрация Распылительная сушка, t вх возд =180°C, t вых возд=88°C Углеводно-белковый компонент питательных сред, влажность ≤ 5%, СП = 49–50 %, РВ= 37-39 % Рисунок 6.5 – Технологическая схема процесса биологической конверсии депротеинизированного шрота подсолнечника с получением компонента питательных сред Получаемый пермеат может быть подвергнут биологической конверсии непосредственно после стадии концентрирования. 6.5 Основные технико-экономические показатели В настоящее время в Российской Федерации большое распространение получило использование изолятов белка сои в пищевых производствах для замещения мяса. Соя и продукты её переработки импортируются в РФ в значительных количествах. Замещение продуктов переработки сои продуктами переработки подсолнечника отвечает интересам продовольственной безопасности РФ, которые сформулированы в Доктрине продовольственной безопасности Российской Федерации, утвержденной Указом Президента РФ от 30 января 2010 г. № 120. С другой стороны основой безопасности нашей страны, в том числе и продовольственной безопасности является импортозамещение и необходимость развивать собственные производства. Создание предприятий по переработке 136 комплексного растительного сырья полностью соответствует Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года. Ежегодная потребность в белковых концентратах и изолятах в Российской Федерации оценивается в 10 млн. тонн и удовлетворяется в основном за счет импортных изолятов и концентратов соевого белка. Экономическая и политическая целесообразность строительства нового объекта по производству пищевого белка обусловлена следующим: - необходимостью импортозамещения наиболее важных для обеспечения безопасности страны видов продукции, в области продовольственной безопасности таким продуктом является пищевой белок; - необходимостью развития регионов и создания рабочих мест; - экономической выгодой от производства и продажи белка. Технико-экономические расчёты производства по комплексной переработке шрота подсолнечника мощностью 10 000 тонн/год с получением изолята белка пищевого назначения представлены в таблице 6.4. Таблиц 6.4 – Основные технико-экономические показатели производства изолята белка подсолнечника Наименование показателя 1. Годовой выпуск продукции а) в натуральном выражении б) в оптовых ценах 2. Капитальные затраты 3. Полная себестоимость единицы продукции 4. Полная себестоимость годового выпуска 5. Стоимость годового выпуска 6. Прибыль годовая 7. Рентабельность: а) производственных фондов б) продукции 8. Срок окупаемости капитальных вложений Единица измерения ед. тыс. руб. тыс. руб. тыс. руб./ед. тыс. руб. тыс. руб. тыс. руб. % % год Значение показателей 2400,000 312000,000 138976,69 95,5 229110,39 312000,0 82889,61 0,00 54,46 36,18 1,68 137 Выводы 1. Показано, что использование протеолитических ферментных препаратов для интенсификации процесса щелочной экстракции в мягких условиях позволяет увеличить степень извлечения белковых соединений шрота подсолнечника до 72,5 %. 2. Изучен процесс фракционирования и очистки получаемых изолятов белка подсолнечного результаты шрота получены на при ультрафильтрационных тангенциальной мембранах. фильтрации через Наилучшие мембрану УПМ–20: селективность – 81,4 %; производительность – 13,6 л/(м2∙ч). 3. Показано, что осаждение белка из концентрата в изоэлектрической точке с последующей вакуумной сушкой позволяет получить высококачественный белковый изолят с содержанием сырого протеина не менее 90 %. 4. Исследование процесса предобработки депротеинизированного шрота позволило разработать режим получения РУБК на основе дрожжей; содержание сырого протеина в готовом продукте 32,5 %. 5. Исследованные пути биоконверсии белкового изолята показали возможность переработки в компоненты питательной среды для культивирования микроорганизмов. 6. Оценка технико-экономических показателей предлагаемой технологии переработки шрота подсолнечника при мощности по сырью 10000 тонн в год показала, что производство является рентабельным и имеет срок окупаемости менее двух лет, а себестоимость получаемого белкового изолята составляет 95,5 тыс. руб./т, что на 40–60 % ниже цены импортируемых аналогов. 7. Разработаны способ и стадии получения продукта – изолята белка подсолнечника, включающие ферментативную обработку, ультрафильтрацию, осаждение в изоэлектрической точке, промывку и вакуумную сушку. На основе полученных данных разработан лабораторный регламент на производство пищевой добавки – изолята белка пищевого назначения. 138 Перечень сокращений и условных обозначений АСВ (СВ) – абсолютно сухо вес (сухой вес) ИЭТ – изоэлектрическая точка ВУС – водоудерживающая способность РУБК – Растительный углеводно-белковый корм РВ – редуцирующие вещества ОУ – общие углеводы СП – сырой протеин СК – сырая клетчатка ФП – ферментный препарат IUB – Международный союз биохимии и молекулярной биологии International Union of Biochemistry ФАО – Продовольственная и сельскохозяйственная организации объединенных наций ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения США – Соединенные Штаты Америки МRS – Среда de Man, Rogosa, Sharpe ТХУ – трихлоруксусная кислота ТЭ – тирозиновый эквивалент ПА – протеолитическая активность ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография УАМ – ультрафильтрационная ацетатцеллюлозная мембрана УПМ – ультрафильтрационная полисульфонамидная мембрана ДПШ – депротеинизированный подсолнечный шрот организация 139 Список использованных источников 1. Федеральная Служба Государственной Статистики. Центральная База Статистических Данных [Электронный ресурс]. URL: http://www.gks.ru/ (дата обращения: 16.05.2014). 2. Анализ рынка подсолнечного масла в России в 2008-2012 гг, прогноз на 20132017 гг рук. BusinesStat.- 2012.- 16 c. 3. Болохонов М.А. Краткий анализ современного состояния и перспектив развития рынка масличных и растительных масел в России и мире // Актуальные проблемы и перспективы инновационной агроэкономики: материалы III всерос. науч.-практ. конф. , 2011. - С. 8–18. 4. Рекорды маслом [Электронный ресурс]. URL: http://expert.ru/expert/2014/20/rekordyi-maslom/ (дата обращения: 06.11.2014). 5. Белобородов В.В. Основные процессы производства растительных масел // . 1966 . 478 с. 6. Салабуда Л.П. Современное состояние переработки подсолнечника и сои в АПК Краснодарского края // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ). - 2005. - № 06(014) . - С. 165 – 180. 7. Curvetto N.R., Figlas D., Devalis R., и др. Growth and productivity of different Pleurotus ostreatus strains on sunflower seed hulls supplemented with N-NH4+ and/or Mn(II). // Bioresour. Technol. - 2002. - Vol. 84. - № 2 . - P. 171–176. 8. Conghos M.M., Aguirre M.E., Santamaría R.M. Sunflower hulls degradation by cocomposting with different nitrogen sources. // Environ. Technol. - 2006. - Vol. 27. - № 9 . - P. 969–978. 9. Gryp P. van der, Baumgarten U., Marx S., и др. Bio-oil and bio-char production from sunflower hulls // 19th European Biomass Conference & Exhibition. , 2011. - P. 1168– 1171. 140 10. Sharma S.K., Kalra K.L., Kocher G.S. Fermentation of enzymatic hydrolysate of sunflower hulls for ethanol production and its scale-up // Biomass and Bioenergy. 2004. - Vol. 27. - № 4 . - P. 399–402. 11. Farzana K., Shah S.N.H., Butt F.B., и др. Effect of partial replacement of different defatted oil seed cakes as substrate in biosynthesis of bacitracin in solid-state fermentation by Bacillus licheniformis. // Pak. J. Pharm. Sci. - 2007. - Vol. 20. - № 3 . P. 227–230. 12. Raclavska H., Juchelkova D., Roubicek V., и др. Energy utilisation of biowaste Sunflower-seed hulls for co-firing with coal // Fuel Process. Technol. - 2011. - Vol. 92. - № 1 . - P. 13–20. 13. Слюсаренко В.В. Комплект оборудования для производстватвердого биотоплива (пеллет из лузги подсолнечника) // Проблемы региональной энергетики. - 2010. - № 2 . - С. 66–70. 14. Едаменко А.С., Клименко В.Г. О возможности ииспользования техногенного сырья в производстве строительных материалов // Технологии техносферной безопасности. - 2013. - Т. 1. - № 47 . - С. 1–4. 15. Глазков С.С. композиционных Модифицированные материалов // связующие Научный для вестник строительных Воронежского Государственного архитектурно-строителного университета. Серия Физикохимические проблемы и высокие технологии строительного материаловедения. 2009. - № 2 . - С. 30–37. 16. Olvera-Novoa M.A., Olivera-Castillo L., Martinez-Palacios C.A. Sunflower seed meal as a protein source in diets for Tilapia rendalli (Boulanger, 1896) fingerlings // Aquac. Res. - 2002. - Vol. 33. - № 3 . - P. 223–229. 17. Rezaei M., Hafezian H. Use of Different Levels of High Fiber Sunflower Meal in Commercial Leghorn Type Layer Diets // Int. J. Poult. Sci. - 2007. - Vol. 6. - № 6 . - P. 431–433. 18. Senkoylu N., Dale N. Sunflower meal in poultry diets: a review // Worlds Poult. Sci. J. - 1999. - Vol. 55. - № 2 . - P. 153–174. 141 19. Sanz A., Morales A.E., La Higuera M. De, и др. Sunflower meal compared with soybean meals as partial substitutes for fish meal in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) diets: protein and energy utilization // Aquaculture. - 1994. - Vol. 128. - № 3-4 . - P. 287–300. 20. Микулович Т.П. Растительный белок / : Агропромиздат М., 1991. - 684 c. 21. Ivanova P., Chalova V., Koleva L., и др. Amino acid composition and solubility of proteins isolated from sunflower meal produced in Bulgaria // . - 2013. - Vol. 20. - № 6 . - P. 2995–3000. 22. Salgado P.R., Drago S.R., Molina Ortiz S.E., и др. Production and characterization of sunflower (Helianthus annuus L.) protein-enriched products obtained at pilot plant scale // LWT - Food Sci. Technol. - 2012. - Vol. 45. - № 1 . - P. 65–72. 23. Woodham A.A., Clarke E.M. Nutritive value of mixed proteins. 2. As determined by net protein utilization and protein efficiency ratio tests. // Br. J. Nutr. - 1977. - Vol. 37. - № 3 . - P. 309–319. 24. Taha F.S., Abbassy M., el-Nockrashy A.S., и др. Nutritional evaluation of sunflower-seed protein products. // Z. Ernahrungswiss. - 1980. - Vol. 19. - № 3 . - P. 191–202. 25. Shchekoldina T., Aider M. Production of low chlorogenic and caffeic acid containing sunflower meal protein isolate and its use in functional wheat bread making // J. Food Sci. Technol. - 2012 . - P. 1–13. 26. Щербаков В.Г., Иваницкий С.Б. Производство белковых продуктов из масличных семян // М. Агропромиздат. - 1987 . 152 с. 27. Sabir M.A., Sosulski F.W., MacKenzie S.L. Gel chromatography of sunflower proteins // J. Agric. Food Chem. - 1973. - Vol. 21. - № 6 . - P. 988–993. 28. Dalgalarrondo M., Raymond J., Azanza J. Sunflower Seed Proteins : Characterization and Subunit Composition of the Globulin Fraction // . - 1984. - Vol. 35. - № 11 . - P. 1618–1628. 29. Plietz P., Damaschun H., Zirwer D., и др. Small-angle X-ray and quasi-elastic light scattering studies on 11 S globulin from sunflower seed // FEBS Lett. - 1978. - Vol. 91. - № 2 . - P. 227–229. 142 30. Schwenke K.D., Robowsky K.D., Augustat D. Über Samenproteins. 8. Mitt. Einfluß von Elektrolytgehalt und pH‐Wert auf die Löslichkeit von Globulinen aus dem Samen von Sonnenblumen (Helianthus annuus L.) und aus Ackerbohnen (Vicia faba L.) // Food/Nahrung. - 1978. - Vol. 22. - № 4 . - P. 425–437. 31. Canella M., Castriotta G., Bernardi A., и др. Functional properties of individual sunflower albumin and globulin // Leb. Technol. - 1985. - Vol. 18. - № 5 . - P. 288–292. 32. Источники пищевого белка, под ред. Яковлевой Н.И. / : М.: Колос, 1979. 302 c. 33. Smith K.J. A review of nutritional value of sunflower meal // Feedstuffs. - 1968. Vol. 40. - № 23 . - P. 20. 34. Talley L.J., Brummett B.J., Burns E.E. Utilization of sunflower in human foodproducts // Proceedings of the Fourth International Sunflower Conference. Memphis: , 1972. - P. 110–111. 35. Zayas J.F. Functionality of proteins in food / : Springer, 1997. - 373 c. 36. Широкорядова О.В. Разработка технологии получения пищевых белковых продуктов из семян подсолнечника 2009. – 137 c. 37. Leung J., Fenton T.W., Clandinin D.R. Phenolic components of sunflower flour // J. Food Sci. - 1981. - Vol. 46. - № 5 . - P. 1386–1388. 38. Weisz G.M., Kammerer D.R., Carle R. Identification and quantification of phenolic compounds from sunflower (Helianthus annuus L.) kernels and shells by HPLCDAD/ESI-MSn // Food Chem. - 2009. - Vol. 115. - № 2 . - P. 758–765. 39. Левицкий А.П., Вертикова И.А., Селиванская И.А. Хлорогеновая кислота : Биохимия и физиология // Микробиология и биотехнология. - 2010. - Т. 2 . - С. 6– 20. 40. Шаповалова И.Е., Федякина З.П. Хлорогеновая кислота - антиоксидантный потенциал семян подсолнечника // Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании. - Харьков: , 2013. - С. 8-10. 41. Sabir M.A., Sosulski F.W., Finlayson A.J. Chlorogenic acid-protein interactions in sunflower // J. Agric. Food Chem. - 1974. - Vol. 22. - № 4 . - P. 575–578. 143 42. Ведерникова Е.И. Фенольные соединения белковых изолятов подсолнечника // Прикладная биохимия и микробиология. - 1974. - Т. 10. - № 6 . - С. 897–905. 43. González-Pérez S., Merck K.B., Vereijken J.M., и др. Isolation and characterization of undenatured chlorogenic acid free sunflower (Helianthus annuus) proteins // J. Agric. Food Chem. - 2002. - Vol. 50. - № 6 . - P. 1713–1719. 44. Шишков В.А. Разработка технологии получения белковых препаратов из растительного сырья с применением ферментативных и мембранных процессов [Текст] : дис. канд. биол. наук : 03.00.23 2007. – 157 c. 45. Amakura Y., Yoshimura M., Yamakami S., и др. Isolation of phenolic constituents and characterization of antioxidant markers from sunflower (Helianthus annuus) seed extract // Phytochem. Lett. - 2013. - Vol. 6. - № 2 . - P. 302–305. 46. Bonos E., Christaki E., Florou-Paneri P. The sunflower oil and the sunflower meal in animal nutrition // J. Hell. Vet. Med. Soc. - 2011. - Vol. 62. - № 1 . - P. 58–70. 47. Taha F., Mohamed G., Mohamed S., и др. Optimization of the Extraction of Total Phenolic Compounds from Sunflower Meal and Evaluation of the Bioactivities of Chosen Extracts // Am. J. Food Technol. - 2011. - Vol. 6. - № 12 . - P. 1002–1020. 48. Сова В.В., Кусайкин М.И. Выделение и очистка белков Методическое пособие по курсу «Химия и биохимия белков и ферментов» // Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та. - 2006 . - С. 1–42. 49. Ковальская Л.П. Технология пищевых производств / : “Колос” Москва, 1999. 262 c. 50. Колзунова Л.Г. Баромембранные процессы разделения: задачи и проблемы // Вестник ДВО РАН. - 2006. - № 5 . - С. 65–73. 51. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., и др. Использование мембранной технологии для концентрирования и очистки ферментных растворов пектинлиазы // Биотехнология. - 2001. - № 5 . - С. 45–50. 52. Рытченкова О.В., Красноштанова А.А. Оптимизация процесса получения ферментативных гидролизатовбелков молочной сыворотки с применением протеолитических ферментов // Фундаметальные исследования. - 2011. - № 8 . - С. 663–666. 144 53. Круглик В.И. Анализ режимов сушки гидролизатов в связи с использованием в технологии продуктов специального назначения // Техника и технология пищевых производств. - 2009. - № 1 . - С. 7-9. 54. Moure A., Sineiro J., Domínguez H., и др. Functionality of oilseed protein products: A review // Food Res. Int. - 2006. - Vol. 39. - № 9 . - P. 945–963. 55. Овсянникова О.В., Ксёнз М.В. Обоснование возможности получения пищевых белковых продуктов из семян подсолнечника// Сфера услуг: инновации и качество [Электронный ресурс]. URL: http://journal.kfrgteu.ru/files/1/2012_7_30.pdf. 56. Làsztity R., Tömösközi S., Szilägyi E., и др. Modification of functional properties by rearrangement of disulfide bonds and change of ratio of protein fractions // Food/Nahrung. - 1998. - Vol. 42. - № 03-04 . - P. 210–212. 57. Gruener L., Ismond M.A.H. Effects of acetylation and succinylation on the physicochemical properties of the canola 12S globulin. Part I // Food Chem. - 1997. Vol. 60. - № 3 . - P. 357–363. 58. Gruener L., Ismond M.A.H. Effects of acetylation and succinylation on the functional properties of the canola 12S globulin // Food Chem. - 1997. - Vol. 60. - № 4 . - P. 513–520. 59. Sitohy M., Popineau Y., Chobert J., и др. Mild method of simultaneous methionine grafting and phosphorylation of soybean globulins improves their functional properties // Food/Nahrung. - 1999. - Vol. 43. - № 1 . - P. 3–8. 60. Shih F.F. Deamidation of protein in a soy extract by ion exchange resin catalysis // J. Food Sci. - 1987. - Vol. 52. - № 6 . - P. 1529–1531. 61. Molina E., Papadopoulou A., Ledward D.A. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins // Food Hydrocoll. - 2001. - Vol. 15. - № 3 . - P. 263–269. 62. Wang X.-S., Tang C.-H., Li B.-S., и др. Effects of high-pressure treatment on some physicochemical and functional properties of soy protein isolates // Food Hydrocoll. 2008. - Vol. 22. - № 4 . - P. 560–567. 145 63. Puppo M.C., Speroni F., Chapleau N., и др. Effect of high-pressure treatment on emulsifying properties of soybean proteins // Food Hydrocoll. - 2005. - Vol. 19. - № 2 . - P. 289–296. 64. Кузнецова Л.М. Получение концентрата белков люпина методами биотехнологии и создание инновационных продуктов сложного сырьевого состава на его основе // Сборник тезисов докладов конгресса молодых ученых. Биотехнологии и ресурсосберегающие инженерные системы. - Санкт-Петербург: НИУ ИТМО: , 2013. - С. 66–68. 65. Николаенко О.Ю., Чернышова А.Н., Каравай Л.В., и др. Кулинарные изделия с модифицированным соевым сырьем в лечебно-профилактическом питании // Современеные научные исследования и их практическое применение. - 2012. - Т. 3 . - С. 7-12. 66. Воронова Н.С. Совершенствование технологии получения белковых изолятов из подсолнечного жмыха и их использование для повышения пищевой ценности мучных кондитерских изделий: автореферат дисс. ... канд. техн. наук. 2011. – 24 c. 67. Ильчишина Н.В., Безверхая Н.С. Способ получения модифицированного белкового изолята из подсолнечного жмыха: Патент 2483565 Российская Федерация. № 2011130585 // . - 2013. 68. Куличенко А.И., Мамченко Т.В., Куличенко С.В. Технология производства кондитерских изделий с применением пищевых волокон // Молодой ученый. 2012. - № 10 . - С. 424–427. 69. Кузьмина С.С., Гайсина В.А. Подсолнечная мука как источник повышения пищевой и энергетической ценности сдобного печенья / Современные проблемы техники и технологи пищевых производств:м атериалы ХIV международной научно-практической конференции / Алт. гос. техн. ун-т им. И.И.Ползунов 2013. – 36–39 c. 70. Щеколдина Т.В., Кудинов П.И., Бочкова Л.К., и др. Влияние белкового изолята подсолнечного шрота на аминокислотный состав хлеба // Техника и технология пищевых производств. - 2009. - Т. 1. - № 1 . - С. 60–63. 146 71. Арсеньева Л.Ю., Арсиненко Н.А., Саливон М.С. Создание хлеба повышенной пищевой ценности // Материалы 3-й Всероссийской научно-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2010. - С. 107–112. 72. Супрунова И.А., Чижикова О.Г., Каленик Т.К., и др. Полуфабрикаты из масличных семян хлебобулочных как изделий источник // функциональных Вестник ингредиентов Тихоокеанского для государственного экономического университета. - 2010. - Т. 3. - № 55 . - С. 82–89. 73. Bautista J., Corpas R., Cremades O., и др. Sunflower protein hydrolysates for dietary treatment of patients with liver failure // J. Am. Oil Chem. Soc. - 2000. - Vol. 77. - № 2 . - P. 121–126. 74. Заверская Ю.Г., Антипова Л.В. Проектирование рецептур рыборастительных колбасок для питания женщин во время беременности // Современные наукоемкие технологии. - 2010. - № 3 . - С. 62–63. 75. Меренкова С.П., Савостина Т.В. Практические аспекты использования растительных белковых добавок в технологии мясных продуктов // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия Пищевые и биотехнологии. - 2014. - Т. 2. - № 1 . - С. 23–29. 76. Сушкова В.И., Воробьева Г.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества / : М. ДеЛи принт, 2006. - 291 c. 77. Dale B.E. Lignocellulose conversion and the future of fermentation biotechnology // Trends Biotechnol. - 1987. - Vol. 5. - № 10 . - P. 287–291. 78. Скрябин Г.К., Головлев Е.Л. Вклад микробиологии в современную биотехнологию // Труды. - 1987 . - С. 304–318. 79. Тараканов М.А. Микробиологическая промышленность Иркутской области // Известия Иркутской государственной экономической академии. - 2009. - № 2 . - С. 39–41. 80. Гулимова Л.А., Занг Н.Ч., Горин К.В., и др. Растительно-микробные нутриенты. Сообщение 2: Дрожжевая биоконверсия растительного сырья // 147 Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2013. - Т. 9. - № 2 . - С. 17-23. 81. Панфилов В.И. Разработка ресурсосберегающей экологически целесообразной технологии комплексной переработки растительного сырья с получением биопродуктов пищевого кормового и медицинского назначения: автореферат дис. ... докт. техн. наук 03.00.23 / Панфилов Виктор Иванович. М., 2004. – 48 c. 82. Максимкин А.А., Калошина Е.Н. Получение высокобелковых кормопродуктов из вторичного сырья пищевых производств путем биоконверсии // Научноинформационный материал (Материалы секции “Высокоэффективные пищевые пищевые технологии, методы и средства их реализации. Эффективное использование ресурсов отрасли.” - 2010. - С. 71-77. 83. Цугкиева Е.Б., Павлова Н.М., Градова Н.Б., и др. Получение белковоуглеводной кормовой добавки на основе отходов производства стевиозида // Биотехнология. - 2006. - № 5 . - С. 45-51. 84. Касаткина А.Н., Лещина Е.К., Градова Н.Б. Способы повышения биологической ценности дробины // Комбикорма. - 2008. - № 5 . - С. 51–52. 85. Касаткина А.Н. Зерновая дробина как основа для получения биологически активных добавок с пробиотическими свойствами: автореф. дис. ... канд. биол. наук 03.00.23 / Касаткина Арина Николаевна. М., 2008. – 22 c. 86. Смирнова В.Д., Киселева Р.Ю., Шакир И.В., и др. Биотехнологический путь переработки отходов производства соевого белка // Экология и промышленность в России. - 2010. - № 5 . - С. 14–16. 87. Суясов Н.А., Панфилов В.И., Кареткин Б.А., и др. Использование ультразвуковой предобработки питательной среды для глубинного гетерофазного культивирования дрожжей // Биотехнология. - 2007. - № 2 . - С. 52-56. 88. Кареткин Б.А., Лойко Н.Г., Шакир И.В., и др. Переработка клубней топинамбура с получением фруктанов и пробиотического продукта для животных // Биотехнология реальность и перспективы в сельском хозяйстве. - 2013 . - С. 229–230. 148 89. Башашкина E.B., Суясов Н.А., Шакир И.В., и др. Биоконверсия отходов производства растворимого кофе в продукты кормового назначения // Экология и промышленность России. - 2011. - № 1 . - С. 18–19. 90. Башашкина Е.В., Пашинина Е.А., Пашинин А.Е., и др. Кофейный шлам как сырье для получения кормовой добавки // IV Международный конгресс молодых ученых по химии и химической технологии. - 2008 . - С. 71–72. 91. Красноштанова А.А., Баурина М.М., Шакир И.В. Технология получения биологически активных веществ / М.: РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2009. - 120 c. 92. Кулиненков Д.О. Разработка ресурсо- и энергосберегающей технологии обогащения растительных отходов микробным белком: дис. ... канд. техн. наук, 2000. – 152 c. 93. Трофимов А.Н., Белоусов А.М. Получение углеводно-белкового корма на основе соломы // Химия растительного сырья. - 2003. - Т. 4 . - С. 69–72. 94. Андросов А.Л., Елизаров И.А., Третьяков А.А. Промышленные технологии переработки послеспиртовой барды // Вестник Тамбовского государственного технического университета. - 2010. - Т. 16. - № 4 . - С. 954–963. 95. Бухкало С.И. Анализ возможности реализации утилизации спиртовой барды // Вестник Нац. техн. ун-та “ХПИ” сб. науч. тр. Темат. вып. Инновационные исследования в научных работах студентов. - 2012. - Т. 39 . - С. 136–142. 96. Matute R.G., Figlas D., Curvetto N. Agaricus blazei production on non-composted substrates based on sunflower seed hulls and spent oyster mushroom substrate // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - Vol. 27. - № 6 . - P. 1331–1339. 97. Curvetto N., Figlas D., Delmastro S. Sunflower seed hulls as substrate for the cultivation of shiitake mushrooms // Horttechnology. - 2002. - Vol. 12. - № 4 . - P. 652– 655. 98. Мхитарян Г.А., Леснов А.П., Ткаченко В.М. Современные технологии переработки свекловичного жома // Сахарная свекла. - 2009. - № 2 . - С. 33–35. 99. Зайнутдинов полученных на Р.Р., основе Ребезов М.Б. Культуральные аспирационных отходов свойства дрожжей, зерноперерабатывающих 149 предприятий // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия Пищевые и биотехнологии. - 2013. - Т. 1. - № 1 . - С. 4–8. 100. Соболева С.В., Литовка Ю.А. Переработка послеэкстракионного остатка коры осины с получением кормовых продуктов // Химия растительного сырья. 2011. - № 2 . - С. 83–86. 101. Морозова Е.Н. Изучение возможности получения биологических препаратов путем биоконверсии растительного субстрата штаммом М99/9 Trichoderma asperellum // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки. - 2014. - Т. 2 . - С. 61. 102. Карпова Г.В. Влияние биоконверсии целлюлозосодержащих кормов на состояние естественной резистентности, Т-и В-систем иммунитета телят // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2007. - № 4 . - С. 130– 132. 103. Пасынкова М.А., Кареткин Б.А. Создание малоотходной энергосберегающей технологии получения инулина из топинамбура с использованием ультразвука. 104. Moura J.M.L.N. de, Johnson L.A. Two-stage countercurrent enzyme-assisted aqueous extraction processing of oil and protein from soybeans // J. Am. Oil Chem. Soc. - 2009. - Vol. 86. - № 3 . - P. 283–289. 105. Sari Y.W., Bruins M.E., Sanders J.P.M.M. Enzyme assisted protein extraction from rapeseed, soybean, and microalgae meals // Ind. Crops Prod. - 2013. - Vol. 43. - № 1 . - P. 78–83. 106. Puri M., Sharma D., Barrow C.J. Enzyme-assisted extraction of bioactives from plants // Trends Biotechnol. - 2012. - Vol. 30. - № 1 . - P. 37–44. 107. Jung S., Lamsal B.P., Stepien V., и др. Functionality of soy protein produced by enzyme-assisted extraction // J. Am. Oil Chem. Soc. - 2006. - Vol. 83. - № 1 . - P. 71– 78. 108. Hosni K., Hassen I., Chaâbane H., и др. Enzyme-assisted extraction of essential oils from thyme (Thymus capitatus L.) and rosemary (Rosmarinus officinalis L.): Impact on yield, chemical composition and antimicrobial activity // Ind. Crops Prod. 2013. - Vol. 47 . - P. 291–299. 150 109. Moura J.M.L.N. de, Almeida N.M. De, Johnson L.A. Scale-up of enzyme-assisted aqueous extraction processing of soybeans // J. Am. Oil Chem. Soc. - 2009. - Vol. 86. № 8 . - P. 809–815. 110. Latif S., Anwar F. Aqueous enzymatic sesame oil and protein extraction // Food Chem. - 2011. - Vol. 125. - № 2 . - P. 679–684. 111. Sharma A., Khare S.K., Gupta M.N. Enzyme-assisted aqueous extraction of rice bran oil // J. Am. Oil Chem. Soc. - 2001. - Vol. 78. - № 9 . - P. 949–951. 112. Sharma A., Khare S.K., Gupta M.N. Enzyme-assisted aqueous extraction of peanut oil // J. Am. Oil Chem. Soc. - 2002. - Vol. 79. - № 3 . - P. 215–218. 113. Li Y., Jiang L., Sui X., и др. The study of ultrasonic-assisted aqueous enzymatic extraction of oil from peanut by response surface method // Procedia Engineering. , 2011. - P. 4653–4660. 114. Jung S., Maurer D., Johnson L.A. Factors affecting emulsion stability and quality of oil recovered from enzyme-assisted aqueous extraction of soybeans // Bioresour. Technol. - 2009. - Vol. 100. - № 21 . - P. 5340–5347. 115. Канарский А.В., Макарова Г.П., Избранова С.И. Обогащение отходов переработки крахмалсодержащего сырья белком одноклеточных микроорганизмов // Биотехнология. - 2000. - № 3 . - С. 42–47. 116. Taherzadeh M.J., Eklund R., Gustafsson L. Characterization and fermentation of dilute-acid hydrolyzates from wood // Ind. Eng. Chem. Res. - 1997. - Vol. 36. - № 11 . P. 4659–4665. 117. Трофимова Н.Н., Гордиенко И.И., Бабкин В.А. Изучение зависимости выхода редуцирующих веществ от параметров кислотного гидролиза целлолигнина лиственницы // Химия растительного сырья. - 2005. - Т. 4 . - С. 25–28. 118. Xiang Q., Lee Y.Y., Torget R.W. Kinetics of glucose decomposition during diluteacid hydrolysis of lignocellulosic biomass // Proceedings of the Twenty-Fifth Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals Held May 4–7, 2003, in Breckenridge, CO. : Springer, 2004. - P. 1127–1138. 151 119. Берник И.Н. Гидролиз-экстракция пектиновых веществ растительного сырья с использованием механических колебаний // Вібрації в техніці та технологіях. 2008. - № 2 . - С. 51-59. 120. Фазлиев И.И., Минзанова С.Т., Ахмадуллина Ф.Ю. Технологические аспекты получения ксилозы из отходов пивоваренной промышленности // Биотехнология растительного сырья, качество и безопасность продуктов. - 2010 . - С. 225-228. 121. Гнеушева И.А. Биотехнологическая переработка отходов производства гречихи и получение ценных продуктов: дис. ...канд. техн. наук. М., 2014. – 130 c. 122. Prasad D.T. Studies on the interaction of sunflower albumins with chlorogenic acid // J. Agric. Food Chem. - 1988. - Vol. 36. - № 3 . - P. 450–452. 123. Sodini G., Canella M. Acidic butanol removal of color-forming phenols from sunflower meal // J. Agric. Food Chem. - 1977. - Vol. 25. - № 4 . - P. 822–825. 124. Карабутов В.В., Горшкова Л.М., Лабейко М.А., и др. Получение пищевых белковых продуктов из семян и шротов подсолнечника и их использование // Вестник национального технического университета “ХПИ.” - 2008. - Т. 43 . - С. 9– 13. 125. Степуро М.В., Щербаков В.Г., Лобанов В.Г. Влияние различных факторов на извлечение хлорогеновой и кофейной кислот из семян подсолнечника // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. - 2006. - № 1 . - С. 49–51. 126. Prasad D.T. Proteins of the phenolic extracted sunflower meal. 1. Simple method for removal of polyphenolic components and characteristics of salt soluble proteins. // Leb. und-Technologie. - 1990. - Vol. 23. - № 3 . - P. 229–235. 127. Асильбекова А.Д., Козыкеева Р.А., Шынтаева А.Р. Получение моносахаридов из растительного сырья // Образование и наука без границ. - 2008. - Т. 15. 128. Сакович Г.В., Будаева В.В., Скиба Е.А., и др. Опыт масштабирования ферментативного гидролиза технических целлюлоз из мискантуса и плодовых оболочек овса // Ползуновский вестник. - 2012. - № 4 . - С. 173–176. 129. Остроумов Л.А., Бабич О.О., Милентьева И.С. Изучение критериев качества и безопасности функциональных продуктов питания, полученных из вторичных 152 продуктов переработки растительного сырья // Современные наукоемкие технологии. - 2012. - Т. 12. - № 12 . - С. 24–27. 130. Сушкова В.И., Жуковский С.В., Березина О.В., и др. Биосинтез масляной кислоты штаммом Clostridium butyricum ВКПМ В-9619 из кукурузной кочерыжки и мелассы // Химия растительного сырья. - 2011. - Т. 1 . - С. 157–162. 131. Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Кирова Е.В., и др. Совершенствование технологии приготовления питательных сред на основе ферментативных гидролшатов рисовой и соевой муки // Биотехнология. - 2006. - № 4 . - С. 74-78. 132. Павловская Н.Е., Горькова И.В., Гагарина И.Н. Технология создания биологически активных добавок для животноводства // Вестник Орловского государственного аграрного университета. - 2011. - Т. 6. - № 33 . - С. 29-32. 133. Макарова мультиэнзимных Е.И., Будаева В.В., композиций Митрофанов для гидролиза Р.Ю. Использование нетрадиционного целлюлозосодержащего сырья // Ползуновский вестник. - 2010. - № 4-1 . - С. 192– 198. 134. Злобин А.А., Жуков Н.А., Оводова Р.Г., и др. Состав и свойства пектиновых полисахаридов шрота шиповника // Химия растительного сырья. - 2007. - Т. 4 . С. 91–94. 135. Габдукаева Л.З., Никитина Е.В., Решетник О.А. Влияние ферментно модифицированных крахмалов на функционально-технологические и физикохимические свойства мясных рубленых изделий пониженной жирности // Вестник Казанского технологического университета. - 2007. - Т. 17. - № 20 . - С. 159–162. 136. Enzymatic hydrolysis of soy proteins and the hydrolysates utilisation // Int. J. Food Sci. Technol. 2011. Т. 46. С. 2447–2459. 137. Lamsal B.P., Jung S., Johnson L.A. Rheological properties of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis // LWT - Food Sci. Technol. 2007. - Vol. 40. - № 7 . - P. 1215–1223. 138. Kuipers B.J.H., Koningsveld G.A. Van, Alting A.C., и др. Enzymatic hydrolysis as a means of expanding the cold gelation conditions of soy proteins // J. Agric. Food Chem. - 2005. - Vol. 53. - № 4 . - P. 1031–1038. 153 139. Adler-Nissen J. Enzymatic hydrolysis of soy protein for nutritional fortification of low pH food. // Ann. Nutr. Aliment. - 1978. - Vol. 32. - № 2-3 . - P. 205–216. 140. Marinova M., Cuc N.T.K., Tchorbanov B. Enzymatic hydrolysis of soy protein isolate by food grade proteinases and aminopeptidases of plant origin // Biotechnol. Biotechnol. Equip. - 2008. - Vol. 22. - № 3 . - P. 835–838. 141. Lamsal B.P., Reitmeier C., Murphy P.A. Enzymatic hydrolysis of extrudedexpelled soy flour and resulting functional properties // J. Am. Oil Chem. Soc. - 2006. Vol. 83. - № 8 . - P. 731–737. 142. Чернышова А.Н., Николаенко О.Ю., Каленик Т.К., и др. Использование в лечебно-профилактическом питании нанобиотехнологических продуктов на основе соевого молока // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2009. - № 1 . - С. 65–67. 143. Влияние структурной модификации белков подсолнечника на биологическую ценность и функциональные свойства получаемых на их основе высокобелковых пищевых продуктов: автореф. дис. ... канд. техн. наук. Краснодар. // 2006. С. 156. 144. Ordóñez C., Benítez C., González J.L. Amino acid production from a sunflower wholemeal protein concentrate. // Bioresour. Technol. - 2008. - Vol. 99. - № 11 . - P. 4749–54. 145. Conde J.M., Escobar M. del M.Y., Pedroche Jiménez J.J., и др. Effect of enzymatic treatment of extracted sunflower proteins on solubility, amino acid composition, and surface activity. // J. Agric. Food Chem. - 2005. - Vol. 53. - № 20 . P. 8038–8045. 146. Peptide characteristics of sunflower protein hydrolysates // J. Am. Oil Chem. Soc. 1999. Т. 76. С. 1455–1460. 147. Karayannidoua, Makri E., Papalamprou E., и др. Limited proteolysis as a tool for the improvement of the functionality of sunflower (Helianthus annus L.) protein isolates produced by seeds or industrial by-products (solvent cake) // Food Chem. - 2007. - Vol. 104. - № 4 . - P. 1728–1733. 154 148. Bautista J., Bromatologra B., Sunflower I., и др. Production of soluble enzymatic protein hydrolysate from industrially defatted nondehulled sunflower meal // J. Agric. Food Chem. - 1991. - Vol. 39. - № 3 . - P. 447–450. 149. Miñones Conde J., Rodríguez Patino J.M. The effect of enzymatic treatment of a sunflower protein isolate on the rate of adsorption at the air–water interface // J. Food Eng. - 2007. - Vol. 78. - № 3 . - P. 1001–1009. 150. Simova E.D., Frengova G.I., Beshkova D.M. Synthesis of carotenoids by Rhodotorula rubra GED8 co-cultured with yogurt starter cultures in whey ultrafiltrate. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2004. - Vol. 31. - № 3 . - P. 115–21. 151. Гаврилов Г.Б., Гаврилов Б.Г. Закономерности мембранного концентрирования сывороточных белков // Техника и технология пищевых производств. - 2009. - Т. 1 . - С. 26–29. 152. Kumar N.S.K., Yea M. k., Cheryan M. Soy Protein Concentrates by Ultrafiltration // J. Food Sci. - 2003. - Vol. 68. - № 7 . - P. 2278–2283. 153. Rao A., Shallo H.E., Ericson A.P., и др. Characterization of soy protein concentrate produced by membrane ultrafiltration // J. Food Sci. - 2002. - Vol. 67. - № 4. - P. 1412–1418. 154. Ranamukhaarachchi S., Meissner L., Moresoli C. Production of antioxidant soy protein hydrolysates by sequential ultrafiltration and nanofiltration // J. Memb. Sci. 2013. - Vol. 429 . - P. 81–87. 155. Alibhai Z., Mondor M., Moresoli C., и др. Production of soy protein concentrates/isolates: traditional and membrane technologies // Desalination. - 2006. Vol. 191. - № 1-3 . - P. 351–358. 156. Lai Y.P., Mondor M., Moresoli C., и др. Production of soy protein isolates with low phytic acid content by membrane technologies: Impact of the extraction and ultrafiltration/diafiltration conditions // J. Food Eng. - 2013. - Vol. 114. - № 2 . - P. 221–227. 157. Sergio González Pérez Physico-chemical and functional properties of sunflower proteins 2003. – 145 c. 155 158. Bautista J., Hernandez-Pinzon I., Alaiz M., и др. Low Molecular Weight Sunflower Protein Hydrolysate with Low Concentration in Aromatic Amino Acids // J. Agric. Food Chem. - 1996. - Vol. 44. - № 4 . - P. 967–971. 159. Production of an extensive sunflower protein hydrolysate by sequential hydrolysis with endo- and exo-proteases. // Grasas y Aceites. 1999. Т. 50. С. 472–476. 160. Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition // Trends Food Sci. Technol. 2000. Т. 11. С. 254–262. 161. Joint Commission FAO/WHO, World Health Organization, Joint FAO/WHO Programme Food Standards. Codex Alimentarius: Cereals, Pulses, Legumes and Vegetable Proteins / : Food & Agriculture Org., 2007. - 70 c. 162. Codex alimentarius Совместная программа ФАО/ВОЗ по стандартам на пищевые продукты: Зерновые, стрючковые и бобовые рук. Комиссия Кодекс Алиментариус Продовольственной и сельскохозяйственной организации объединенных Наций.- 2007.- 157 c. 163. Комиссия Кодекс Алиментариус Продовольственной и сельскохозяйственной организации объединенных наций. CODEX Alimentarius: Рекомендации кодекса по использованию продуктов на основе растительного белка (ПРБ) в продуктах питания // CAC/GL4. - 1989 . 7 с. 164. Mattil K.F. The functional requirements of proteins for foods // J. Am. Oil Chem. Soc. - 1971. - Vol. 48. - № 9 . - P. 477–480. 165. Kinsella J.E., Melachouris N. Functional properties of proteins in foods: a survey // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 1976. - Vol. 7. - № 3 . - P. 219–280. 166. Joint W.H.O. Protein and amino acid requirements in human nutrition. // World Health Organ. Tech. Rep. Ser. - 2007. - № 935 . - P. 265. 167. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии, ДеЛи принт // Москва. - 2004 . - С. 111–113. 168. Общая биотехнология. Лабораторный практикум : учебное пособие РХТУ / И.В. Шакир, А.А. Красноштанова, Е.В. Парфенова – М. : РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2001. – 68 c. 156 169. Общая биотехнология: учебное пособие РХТУ / И.В. Шакир, А.А. Красноштанова, Е.В. Парфенова, Н.А. Суясов, Е.С. Бабусенко, В.Д. Смирнова – М. : РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2008. - 120 с. 170. Anson M.L., Mirsky A.E. Determination of Proteases // J. Gen. Physiol. - 1932. Vol. 16. - № 59 . - P. 17. 171. Wang H., Lv Z., Wang J., и др. Study on the Decolourization Methods of Crude Alkaline Protease // Proceedings of the 2012 International Conference on Applied Biotechnology (ICAB 2012). : Springer, 2014. - P. 1657–1664. 172. Choi G.H., Kim J.M., Kim K.T. Purification and Characterization of Heat-Tolerant Protease Produced by Bacillus polyfermenticus SCD // J. Microbiol. Biotechnol. - 2013. - Vol. 23. - № 11 . - P. 1554–1559. 173. Rathod M.G., Pathak A.P. Wealth from Waste: Optimized Alkaline Protease Production Using Agro-Industrial Residues by Bacillus alcalophilus LW8 and its Biotechnological Applications // J. Taibah Univ. Sci. - 2014. - Vol. 8. - № 4 . - P. 307– 314. 174. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище 4.1. 1672-03. // М. Федеральный центр Госсанэпиднадзора. Минздрава России. - 2004 . - С. 239. 175. Дытнерский Ю.И. Процессы и аппараты химической технологии. Часть 2. Массообменные процессы и аппараты / : М. Химия, 1992. - 368 c. 176. Ахназарова С.Л., Кафаров В.В. Методы оптимизации эксперимента в химической технологии. учеб. пособие для хим.-технол. спец. вузов. – 2-е изд., перераб. и доп. / : Высш. шк. М., 1985. - 327 c. 177. López-Molina D., Navarro-Martínez M.D., Rojas Melgarejo F., и др. Molecular properties and prebiotic effect of inulin obtained from artichoke (Cynara scolymus L.). // Phytochemistry. - 2005. - Vol. 66. - № 12 . - P. 1476–84. 178. Molina M.I., Petruccelli S., Añón M.C. Effect of pH and ionic strength modifications on thermal denaturation of the 11S globulin of sunflower (Helianthus annuus) // J. Agric. Food Chem. - 2004. - Vol. 52. - № 19 . - P. 6023–6029. 179. Северин Е.С. Биохимия учебник // М. ГЭОТАР–МЕД. - 2004. 157 180. Pickardt C., Neidhart S., Griesbach C., и др. Optimisation of mild-acidic protein extraction from defatted sunflower (Helianthus annuus L.) meal // Food Hydrocoll. 2009. - Vol. 23. - № 7 . - P. 1966–1973. 181. Weisz G.M., Carle R., Kammerer D.R. Sustainable sunflower processing - II. Recovery of phenolic compounds as a by-product of sunflower protein extraction // Innov. Food Sci. Emerg. Technol. - 2013. - Vol. 17 . - P. 169–179. 182. Баурин Д.В., Кареткин Б.А., Шакир И.В., и др. Использование протеолитических ферментов для увеличения степени извлечения белковых соединений шрота подсолнечника // Хранение и переработка сельхозсырья. 2014. - № 10 . - С. 16–20. 183. Ordóez C., Asenjo M.G., Benitez C., и др. Obtaining a protein concentrate from integral defatted sunflower flour // Bioresour. Technol. - 2001. - Vol. 78. - № 2 . - P. 187–190. 184. Якубке Х.Д., Ешкайт Х. Аминокислоты, пептиды, белки // Пер. с немец. М. Изд-во «Мир». - 1985 . 457 с. 185. Skorić D. Possible uses of sunflower in proper human nutrition // Med. Pregl. 2009. - Vol. 62 Suppl 3 . - P. 105–110. 186. Шелепина Н.В., Каверочкина А.В. Применение растительных белков в пищевой промышленности // Научные записки ОРЕЛГИЭТ. - 2010. - Т. 2 . - С. 431–433. 187. Bau H.M., Mohtadi Nia D.J., Mejean L., и др. Preparation of colorless sunflower protein products: Effect of processing on physicochemical and nutritional properties // J. Am. Oil Chem. Soc. - 1983. - Vol. 60. - № 6 . - P. 1141–1148. 188. Paper T. Studies on the Production of Defatted Sunflower Meal with Low Polyphenol and Phytate Contents and its Nutritional Profile // . - 2008. - Vol. 15. - № 1 . - P. 97–100. 189. Ivanova P., Chalova V., Koleva L. Optimization of protein extraction from sunflower meal produced in Bulgaria // Bulg. J. Agric. Sci. - 2012. - Vol. 18. - № 2 . - P. 153–160. 158 190. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. Методы определения протеолитической активности в промышленных образцах иммобилизованных протеиназ // Химико-фармацевтический журнал. - 1992. - № 11-12 . - С. 101–103. 191. Баурин Д.В., Самарина Е.А., Романова А.Б., и др. Получение белковых гидролизатов растительного сырья // Материалы конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. , 2013. - С. 47–48. 192. Романова А.Б., Самарина Е.А., Баурин Д.В. Получение белковых ферментолизатов шрота подсолнечника // Успехи в химии и химической технологии сб. науч. тр. - 2013. - Т. 27. - № 9 . - С. 11–14. 193. Baurin D.V., Gordienko M.G., Shakir I.V., и др. Integrated processing of sunflower meal // Advances in Biotechnology. - Albena, Bugaria: 14th SGEM GeoConference on Nano, Bio and Green -Technologies for a Sustainable Future, 2014. P. 419–426. 194. Дарбре А. Практическая химия белка / М.: Мир, 1989. - 622 c. 195. Баурин Д.В., Романова А.Б., Шакир И.В., и др. Использование мембранных методов для фракционирования и очистки белковых гидролизатов шрота подсолнечника // Материалы Международной научно-практической конференции “Биотехнология и качество жизни.” , 2014. - С. 243–244. 196. Shahidi F., Naczk M. Phenolics in food and nutraceuticals / CRC press: Taylor & Francis e-Library, 2006. - 566 c. 197. Баурин Д.В., Романова А.Б., Самарина Е.А., и др. Ферментативный гидролизат обезжиренного подсолнечного шрота как субстрат для культивирования Bacillus cereus // II Всероссийская (XVII) Молодежная научная конференция «Молодёжь и наука на Севере»: сб. науч. тр. , 2013. - С. 119–120. 198. Краснова А.В., Горбунов В.П., Кочетов В.И., и др. Повышение эффективности мембранного концентрировани подсырной сыворотки // Вестник Тамбовского университета. Серия Естественные и технические науки. - 2014. - Т. 19. - № 3 . - С. 944–947. 199. Просеков ферментативных А.Ю., Ульрих гидролизатов Е.В., Носкова белков С.Ю., молочной и др. Получение сыворотки с 159 использованиемпротеолитических ферментов // Фундаментальные исследования. - 2013. - Т. 6 . - С. 1089–1093. 200. Красноштанова А.А., Попов В.Г., Рытченкова О.В. Молекулярное распределение белков при ультраконцентрировании сыворотки // Молочная промышленность. - 2010. - № 7 . - С. 60–61. 201. Weisz G.M., Schneider L., Schweiggert U., и др. Sustainable sunflower processing—I. Development of a process for the adsorptive decolorization of sunflower Helianthus annuus L. protein extracts // Innov. food Sci. Emerg. Technol. - 2010. - Vol. 11. - № 4 . - P. 733–741. 202. Баурин Д.В., Гордиенко М.Г., Кареткин Б.А., и др. Разработка основ комплексной конверсии шрота подсолнечника // Естественные и технические науки. - 2014. - Т. 8 . - С. 33–35. 203. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений / Москва: Академия, 2009. - 352 c. 204. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность // Химическая и биологическая безопасность. - 2007. № 2-3 . - С. 32–33. 205. Хоанг Т.М.Н. Исследование процесса получения продуктов белковой и углеводной природы из белого лепестка сои: дис. ... канд. техн. наук. М. 2009. – 151 c. 206. Баурин Д.В. Исследование процесса биологической конверсии вторичных продуктов переработки семян подсолнечника // Успехи в химии и химической технологии сб. науч. тр. - 2012. - Т. 26. - № 1 (130) . - С. 59–62. 207. Баурин Д.В. Исследование процесса биологической конверсии отходов производства подсолнечного масла // Успехи в химии и химической технологии сб. науч. тр. - 2010. - Т. XXIV. - № 11 (116) . - С. 8–10. 208. Баурин Д.В. Биологическая конверсия отходов переработки семян подсолнуха // Материалы конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития. , 2011. - С. 165–166. 160 209. Баурин Д.В., Катаева Т.С. Оптимизация условий кислотного гидролиза депротеинизированного шрота // Успехи в химии и химической технологии сб. науч. тр. - 2013. - Т. 27. - № 8 (148) . - С. 115–120. 210. Баурин Д.В., Кареткин Б.А., Катаева Т.С., и др. Факторный эксперимент для оптимизации условий предварительной обработки питательной среды // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 11 . - С. 13–19. 211. Быков В.А. Биотехнология. Т. 5. Производство белковых веществ // . - 1987. 161 ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1 162 СОДЕРЖАНИЕ 1 Нормативные ссылки 163 2 Термины, определения, сокращения 164 3 Характеристика готовой продукции производства 166 4 Химическая схема производства 167 5 Технологическая схема производства 167 6 Аппаратурная схема производства 169 7 Характеристика сырья, вспомогательных материалов, полупродуктов 172 8 Изложение технологического процесса 178 9 Материальный баланс 189 10 Контроль производства 190 163 1 Нормативные ссылки В настоящем стандарте использованы следующие нормативные документы: ГОСТ 2105-95. ЕСКД. Общие требования к текстовым документам ГОСТ 2301-68. ЕСКД. Форматы ГОСТ 12.1.004-91. ССБТ. Пожарная безопасность Общие требования ГОСТ 12.1.005-88. ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны ГОСТ 12 1.007-76. ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности ГОСТ 12.1.010-76. ССБТ. Взрывобезопасность. Общие требования ГОСТ 12.1.011-78. ССБТ. Смеси взрывоопасные. Классификация и методы испытаний ГОСТ 12.1.016-79. ССБТ. Воздух рабочей зоны. Требования к методикам измерения концентраций вредных веществ ГОСТ 12.1.019-79. ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты ГОСТ 12.1.041-83. ССБТ. Пожаровзрывобезопасность горючих пылей. Общие требования ГОСТ 12.2.003-91. ССБТ. Оборудование производственное. Общие требования безопасности ГОСТ 12.2.016-81. ССБТ. Оборудование компрессорное. Общие требования безопасности ГОСТ 12.2.085-82. ССБТ. Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности ГОСТ 12.3.002-75. ССБТ. Процессы производственные. Общие требования безопасности ГОСТ Р 12.3.047-98. ССБТ. Пожарная безопасность технологических процессов. Методы контроля 164 2 Термины, определения, сокращения Основные термины, определения и обозначения приведены в таблице 1. Таблица 1 – Термины, определения, сокращения №№ ПП Термины, сокращения 1 ВР 2 ВС 3 Депротенизированный шрот 4 ДПШ 5 Материальный баланс 6 ОСЧ 7 Параметр технологического процесса 8 СТП 9 Технологический блок 10 Технологический процесс Определения Стадии вспомогательных работ (растворение и сушка сырья, приготовление растворов заданной концентрации и т.п.) Вакуумная сушилка Шрот, полученный на стадии щелочной экстракции или ферментативного гидролиза, отличающийся пониженным содержанием сырого протеина и повышенным содержанием клетчатки. Является отходом производства подсолнечного масла. Депротенизированный подсолнечный шрот Сравнение теоретически возможного и практически полученного выхода готового продукта Особо чистый Физический или химический параметр, имеющий количественную или качественную шкалу измерения, для которого определены границы технологической нормы и/или безопасности и выход которого за граничные значения приводит к снижению количества или качества получаемого продукта и/или возникновению аварийных ситуаций Стандарт предприятия Аппарат или группа аппаратов, которые могут быть в заданное время отключены (изолированы) от технологической системы без опасных изменений режима, приводящих к развитию аварии в смежной аппаратуре или системе Комплекс действий, необходимых для получения готового продукта. Технологический процесс является частью производственного. 165 №№ ПП Термины, сокращения 11 Технологическая стадия 12 ТП 13 УМО 14 УПМ 15 Шрот подсолнечника Определения Звено технологического процесса, получение промежуточного (конечного) продукта. Стадии основного технологического процесса Стадии упаковывания, маркирования и отгрузки готового продукта Ультрафильтрационная полимерная полисульфонамидная мембрана Побочный продукт маслоэкстракционного производства, получаемый после извлечения липидов из семян масличных растений экстрагированием органическими растворителями 166 3 Характеристика готовой продукции производства Основное назначение продукции: пищевая добавка для использования в хлебопечении и изготовлении мясных продуктов. Наименование: изолят белка пищевого назначения. В соответствии с проектом ТУ на опытную партию изолята белка подсолнечника из подсолнечного шрота продукт по органическим, химико-технологическим и микробиологическим показателям должен соответствовать требованиям, приведенным в таблице 2. Таблица 2 – Описание внешнего вида и потребительских свойств изолята белка подсолнечника №№ Наименование показателей ПП 1 Внешний вид Характеристика и значение показателей Порошкообразный Светло-кремовый / светложелтый / серый Не имеет специфического запаха; допускается наличие запаха, свойственного подсолнечнику 5,0 2 Цвет 3 Запах 4 Влажность, %, не более Содержание сырого протеина % на 85,0 сухое вещество, не менее Суммарное содержание растворимого протеина, % на сухое вещество, не 83,8 менее Содержание липидов, % на сухое 0,5 вещество, не более Содержание поваренной соли, % на 1,0 сухое вещество, не более Содержание неорганических веществ % 1,0 на сухое вещество, не более Хранить в закрытых пластиковых или стеклянных емкостях при 5 6 7 8 9 температуре до 20°C и влажности воздуха не более 80%. Предохранять от воздействия прямых солнечных лучей. Допускается хранение в герметичных политэтиленовых пакетах с пластиковым замком. Маркировка должна содержать название, дату выработки и фасовки, номер партии и процентное содержание сырого протеина. Срок годности – 1 год. 167 4 Химическая схема производства 5 Технологическая схема производства 168 169 170 Спецификация оборудования приведена в таблице 3. Таблица 3 – Спецификация оборудования Обозначение Наименование Е-1 Емкость Количество Примечание 3 шт. Стеклянная или керамическая емкость в форме цилиндра, объем не менее 5 л с 1 шт. Емкость объемом не менее с 5 л, оснащенная перемешивающим устройством, датчиками температуры и рН, и рубашкой для поддержания постоянной температуры; рубашку может заменить водяная баня 1 шт. Фильтруюший элемент выполнен из бельтинга / ткань х/б 29298-2005 1 шт. Периодического действия, отстойного типа; фактор разделения не менее 10 000 1 шт. Площадь рабочей поверхности не менее 0,9 м2; диаметр пор 20 Å РМ-1 Реактор мешалкой обогреваемой рубашкой Ф-1 Нунч-фильтр Ц-1 Центрифуга УПМ-20 / АР-0,1-20ПС / УФ-1,020-ПС Н-1 Ультрафильтрационная полимерная мембрана Перильстатический 1 шт. насос Реактор с 1 шт мешалкой РМ-2 Ц-2 Центрифуга 1 шт. Емкость, оснащенная перемешивающим устройством; объем не менее 1 л Периодического действия, отстойного типа; фактор разделения не менее 3 000; одна и таже единица оборудования может быть применена как для отделения осадка белка, так и для отделения пасты белка после отмывки спиртом 171 Обозначение Наименование Е-2 Емкость ВС ВН Вакуумная сушилка Вакуумный насос Количество Примечание 2 шт. Емкость стеклянная или керамическая объемом не менее 1 л. 1 шт. 1 шт. Насос должен соответствовать параметрам вакуумной сушилки 172 7 Характеристика сырья, вспомогательных материалов, полупродуктов Характеристики сырья, вспомогательных материалов и полупродуктов приведены в таблице 4; перечень промежуточных продуктов – в таблице 5. Таблица 4 – Характеристика основного и вспомогательного сырья Показатели, Обознаобязательные для Наименование чение НД проверки, Массовая доля А) Гидроокись гидроокиси натрия ( натрия NaOH), не менее 97 % углекислого натрия ( ), не более 1,5% общего азота не более 0,001% кремнекислоты ( Si ), не более 0,020 % сульфатов ( ), не более 0,020 % Чистый фосфатов ( ), не (ч.) ОКП более 0,010 % 26 1142 углекислого натрия ( 0081 03 ), не более 1,5% хлоридов ( ), не более 0,0250% алюминия (Al), не более 0,0100 % железа ( ), не более 0,0020 % кальция и магния в пересчете на Mg, не более 0,0600% Сорт или артикул Примечания Общие указания по проведен ию анализа – по ГОСТ 27025 173 Продолжение таблицы 4 Наименование Обозначе ние НД Сорт или артикул А) Вода подготовленная ГОСТ 6709-72 А) Подсолнечный шрот Показатели, обязательные для проверки Массовая концентрация остатка после выпаривания, не более 5 м/ дм Массовая концентрация аммиака и аммонийных солей ( ), не более 0,02 м/ дм Массовая концентрация нитратов ( ), не более 0,2 м/ дм Массовая концентрация сульфатов ( ), не более 0,5 м/ дм Массовая концентрация хлоридов (Cl), не более 0,02 м/ дм Массовая концентрация алюминия(Аl), не более 0,05 м/ дм Массовая концентрация железа (Fe), не более 0,05 м/ дм Массовая концентрация кальция (Cа), не более 0,8 м/ дм Массовая концентрация меди (Cu), не более 0,02 м/ дм Массовая концентрация свинца (Pb), не более 0,05 м/ дм Влажность, не более 711 % Сырой протеин не менее 37% Примеча ния Общие указания по проведен ию анализа – по ГОСТ 3885 По ГОСТ 13979.1 174 Продолжение таблицы 4 Наименование Обозначе ние НД Сорт или артикул А) Ферментный препарат Protex 40E А) Янтарная кислота ГОСТ 6341-75 Показатели, обязательные для проверки Примеча ния Возможно применение Протеолитическая аналога активность по Ансону после не менее 1300 ед/ч удачных испытаний Массовая доля янтарной кислоты ( ), не менее 99,7 % Температура плавления 184-187 ºС Массовая доля нерастворимых в воде веществ не более 0,005 % Массовая доля остатка после прокаливания (в виде сульфатов) не Общие указания более 0,020 % по Массовая доля проведен сульфатов ( ), не ию более 0,005 % анализа – Массовая доля по ГОСТ фосфатов ( ), не 27025-86 более 0,0020 % Массовая доля аммонийных солей ( ), не более 0,005 % Массовая доля хлоридов ( ), не более 0,0010 % Массовая доля железа ( ), не более 0,0040 % Массовая доля тяжелых металлов (Pb), не более 0,0020 % 175 Продолжение таблицы 4 Наименование Б)Дензинфирую щий раствор/моющее средство Перекись водорода Б) Соляная кислота Обозначе ние НД Сорт или артикул Показатели, обязательные для проверки Внешний вид бесцветная прозрачная Пережидкость кись доля водоро- Массовая пероксида водорода, % да 30-36 медиц. Не менее 36 % (пересчет Массовая концентрация 30%) серной кислоты, г/дм³, ГОСТ не более 0,30 177-88 Массовая концентрация нелетучего остатка, г/дм³, не более 0,6 Внешний вид : препарат химически чистый должен быть бесцветным (допускается желтоватая окраска), прозрачным и не содержать взвешенных частиц. Массовая доля соляной кислоты ( ) 35-38 % Чистый Массовая доля остатка (ч.) ОКП после прокаливания (в 26 1234 виде сульфатов) не 0011 06 более 0,0020 % Массовая доля сульфитов ( ), не более 0,001 % Массовая доля сульфатов ( ), не более 0,0005 % Массовая доля аммонийных солей ( ), не более 0,0003 % Примеча ния Общие указания по проведен ию анализа – по НТД 176 Продолжение таблицы 4 Наименование Б) Мембрана / модуль АР-0,120-ПС Б) Этиловый спирт Обозначе ние НД Сорт или артикул Показатели, Примеча обязательные для ния проверки Массовая доля железа ( ), не более 0,00030 % Массовая доля мышьяка ( ), не более 0,000010 % Массовая доля тяжелых металлов (Pb), не более 0,00020 % УПМ-20 Целостность волокон Первый ГОСТ сорт ОКП 1830091 8213 87 2200 Внешний вид: прозрачная, бесцветная жидкость без постороних частиц Запах: характерный для этилового спирта, без запаха посторонних веществ Объемная доля этилового спирта не менее 96,0 % 177 Таблица 5 – Перечень промежуточных продуктов, получаемых в производстве Наименование промежуточного вещества Гетерофазная постферментационная суспензия Гидролизат Концентрат Суспензия белка Осажденный белок Очищенный белок (суспензия) Паста белка Обозначение СТП Нормативные требования Содержание аминного азота не менее 1 % от содержания протеина в исходном сырье Содержание сухих веществ не менее 43 г/л Содержание частиц размером 0,001 мм не более 1 г/л Содержание сухих веществ не менее 220 г/л или степень концентрирования не менее 7 раз рН суспензии 4,5±0,05 Содержание влаги не более 50 % Содержание хлорогеновой кислоты не более 0,01 % Содержание хлорогеновой кислоты не более 0,01 % Стадия, операция где где произвоиспольдится зуется ТП.2 ТП.3 ТП.3 ТП.4 ТП.4 ТП.5 ТП.5.2 ТП.5.3 ТП.5.2 ТП.6 ТП.5.2 ТП.6.3 ТП.6.3 ТП.7 178 8 Изложение технологического процесса ВР.1 – Подготовка оборудования и материалов Санитарная обработка помещений проводится в соответствии с СанПиН 2.2.1/2.1.1.1200-03. Подготовка оборудования производится в соответствии с СанПиН 2.2.1/2.1.1.1200-03. Подготовка воды проводят дистилляцией или берут питьевую воду. ТП.2 – Ферментативный гидролиз В емкость на водяной бане или термостатируемый реактор (ферментатор) рабочим объемом 5 л загружается навеска подсолнечного шрота 500г и добавляется 5 литров подготовленной дистиллированной воды (гидромодуль 10). После установления заданной температуры процесса при постоянном перемешивании pH доводят в несколько этапов / подходов до значения рекомендованного производителем 8,6 ± 0,1 для данного ферментного препарата 10 %–ным раствором щелочи до момента внесения ферментного препарата. Контроль показателя производится при помощи pHметра или автоматического иономера. рН доводят в 3-4 этапа до установления постоянного значения. Депротеинизацию шрота проводят в присутствии ферментного препарата Protex 40Е. Навеску 1г ферментного препарата растворяют в 100 мл воды и вносят в емкость 1 после установления технологических параметров в соответствии с расчетом активности фермента. Гидролиз проводят на протяжение 60 минут при постоянной температуре 37±0,5°С и постоянным перемешивании. Полученную гетерофазную постферментативную суспензия (ГПФС) направляют на ТП.3. ТП.3 – Отделение депротеинизированного шрота Отделение твердой фазы от полученного на стадии ТП.2 ГПФС проводят на нутч-фильтре с бельтингом или х/б тканью по ГОСТ 29298-2005 в качестве материала фильтра. Полученную суспензию центрифургируют для 179 удаления взвешенных частиц в течении 20 минут при 9000 об/мин на центрифуге Eppendorf или аналоге (Fr=10000). Депротеинизированный шрот (осадок с фильтра и осадок полученный при центрифугировании) отправляется на дальнейшую переработку. Гидролизат направляют на стадию ТП.4. ТП.4 – Мембранное ультраконцентрирование и диафильтрация Процесс ультаконцентрирования и диафильтрации проводится на аппарате для ультрафильтрационного разделения на полых волокнах из полисульфонамида, с порогом отсечения 20 кДа. Площадь рабочей поверхности модуля не менее 0,1 м2. По материалу мембранных волокон и пропускающей способности данный модуль соответствует мембране УПМ20. Процесс проводят до степени концентрирования 6,7-9,0. Подача гидролизата осуществляется перистальтическим насосом. ТП.5 – Осаждение белка Готовят 250 мл 5 % раствора янтарной кислоты. Полученный на стадии ТП.4 концентрата гидролизата помещают в емкость объемом 1 л, которую размещают на магнитной мешалке. Янтарную кислоту добавляют постепенно при постоянном перемешивании со скоростью 100-200 об/мин Время осаждения составляет 20 мин; температура 20°С. Отделение полученного после осаждения осадка проводят на центрифуге в течение 5 минут, при температуре 10°С и 5000 об./мин Необходимый фактор разделения Fr не менее 7000g. ТП.6 – Очистка спиртом и отделение пасты белка Полученную пасту промывают 95 % спиртом в течении 10-20 минут. 95% раствор спирта смешивают с пастой белка при постоянном перемешивании в емкости объемом 1 л, которую размещают на магнитной мешалке. Отделение полученного после обработки спиртом очищенного белка из суспензии проводят на центрифуге в течение 5 минут, при температуре 10°С 180 и 5000 об./мин Необходимый фактор разделения Fr не менее 7000g. Полученную суспензию очищенного белка отправляют на стадию ТП.7. ТП.7 – ВС После отделения спиртового раствора, полученная на стадии ТП.6 паста белка направляется на вакуумную сушку (шкаф сушильный вакуумный VDL 23, Binder, Германия или аналог). Сушку ведут при температуре 40 0С и остаточном давлении 0,01 мБар. 181 Таблица 6 – Израсходовано на стадии ТП.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Подсолнечный шрот Вода подготовленная Гидроксид натрия раствор 1 % Ферментный препарат ИТОГО Масса, г Израсходовано Влажность, Содержание сырого АСВ, % % протеина от CВ, % 1000,00 5,00 95,00 37,00 9988,00 - - - 10,00 - 0,40 - 2,00 - - - 11000,00 - 8,69 36,77 Таблица 7 – Получено на стадии ТП.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Гетерофазная постферментационная суспензия ИТОГО Получено Масса, грамм Влажность, % АСВ, % Содержание сырого протеина от CВ, % 11000,00 - 8,69 36,77 11000,00 - 8,69 36,77 182 Таблица 8 – Израсходовано на стадии ТП.3.1 (суммарно): Израсходованно Наименование полупродуктов и сырья Масса, грамм Гетерофазная постферментационная суспензия ИТОГО Влажность, % АСВ, % Содержание сырого протеина от CВ, % 10989,00 - 8,69 36,80 10989,00 - 8,69 36,80 Таблица 9 – Получено на стадии ТП.3.1 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Гидролизат ДПШ ИТОГО Получено Масса, грамм Влажность, % АСВ, % 55,71 - 5,17 44,29 - 9999,99 989,01 110989,00 Содержание сырого протеина от CВ, % 47,59 24,07 36,80 Таблица 10 – Израсходовано на стадии ТП.3.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Гетерофазная постферментационная суспензия ИТОГО Израсходованно Масса, грамм Влажность, % АСВ, % Содержание сырого протеина от CВ, % 9999,99 - 5,17 36,80 9999,99 - 5,17 36,80 183 Таблица 11 – Получено на стадии ТП.3.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Гидролизат Осадок ДПШ ИТОГО Получено Масса, грамм 9800,00 199,99 9999,99 Влажность, % АСВ, % - Содержание сырого протеина от CВ, % 4,26 50,0 - 47,59 24,07 36,80 Таблица 12 – Израсходовано на стадии ТП.4.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Гидролизат ИТОГО Израсходовано Масса, грамм 9800,00 9800,00 Влажность, % АСВ, % - 4,26 4,26 Содержание сырого протеина от CВ, % 47,59 47,59 Таблица 13 – Получено на стадии ТП.4.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Концентрат Пермеат ИТОГО Получено Масса, грамм 9800,00 199,99 9999,99 Влажность, % АСВ, % 50,00 - 4,26 50,00 - Содержание сырого протеина от CВ, % 53,00 25,04 47,59 184 Таблица 14 – Израсходовано на стадии ТП.4.3 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Концентрат ИТОГО Израсходовано Масса, грамм 9800,00 9800,00 Влажность, % АСВ, % - Содержание сырого протеина от CВ, % 4,26 4,26 53,00 53,00 Таблица 15 – Получено на стадии ТП.4.3 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Концентрат Пермеат ИТОГО Получено Масса, грамм 1462,69 8337,31 9800,00 Влажность, % АСВ, % - Содержание сырого протеина от CВ, % 16,60 2,09 4,26 86,00 49,00 53,00 Таблица 16 – Израсходовано на стадии ТП.5.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Концентрат Янтарная кислота ИТОГО Израсходовано Масса, Содержание сырого Влажность, % АСВ, % грамм протеина от CВ, % 1462,69 16,60 86,00 40,00 95,00 5,00 - 1502,69 - 16,29 85,30 Таблица 17 – Получено на стадии ТП.5.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Суспензия белка ИТОГО Получено Масса, грамм 1502,69 1502,69 Влажность, % АСВ, % - 16,29 16,29 Содержание сырого протеина от CВ, % 85,30 85,30 185 Таблица 18 – Израсходовано на стадии ТП.5.3 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Суспензия белка ИТОГО Израсходовано Масса, Содержание сырого Влажность, % АСВ, % грамм протеина от CВ, % 1502,69 16,29 85,30 1502,69 16,29 85,30 Таблица 19 – Получено на стадии ТП.5.3 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Осажденный белок Надосадок ИТОГО Получено Масса, грамм Влажность, % АСВ, % Содержание сырого протеина от CВ, % 613,34 - 38,32 87,36 889,35 1502,69 - 1,10 - 0,00 0,00 Таблица 20 – Израсходовано на стадии ТП.6.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Осажденный белок Спирт 96 % ИТОГО Израсходовано Масса, грамм Влажность, % АСВ, % Содержание сырого протеина от CВ, % 613,34 - 38,32 87,36 478,41 1091,75 4,00 - 96,00 7,66 87,36 Таблица 21 – Получено на стадии ТП.6.2 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Очищенный белок (суспензия) ИТОГО Получено Масса, грамм Влажность, % АСВ, % Содержание сырого протеина от CВ, % 1091,75 - 7,66 87,36 1091,75 - 7,66 87,36 186 Таблица 22 – Израсходовано на стадии ТП.6.3 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Очищенный белок (суспензия) ИТОГО Израсходовано Масса, грамм Влажность, % АСВ, % Содержание сырого протеина от CВ, % 1091,75 - 7,66 87,36 1091,75 - 7,66 87,36 Таблица 23 – Получено на стадии ТП.6.3 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Паста белка Отработанный спиртовой раствор ИТОГО Получено Масса, Содержание сырого Влажность, % АСВ, % грамм протеина от CВ, % 613,34 36,00 45,29 478,41 - 0,58 0,00 1091,75 Таблица 24 – Израсходовано на стадии ТП.7 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Паста белка ИТОГО Израсходовано Масса, Содержание сырого Влажность, % АСВ, % грамм протеина от CВ, % 613,34 36,00 45,29 613,34 36,00 45,29 Таблица 25 – Получено на стадии ТП.7 (суммарно): Наименование полупродуктов и сырья Изолят белка Этанол, пары ИТОГО Получено Масса, Содержание сырого Влажность, % АСВ, % грамм протеина от CВ, % 239,83 94 91,0 373,51 613,34 187 Таблица 26 – Параметры технологического процесса Параметры технологического процесса НаиНаимен Наимеменоование Значение нование и вание элеменТехнолоПрепозиция Наиместадии, та опегическая опас дельно Критиаппарата нование операрации норма ное допус- ческое в схеме мин. макс. ции (работы) тимое Т 36,5 38,0 40 45 55 ТП.2 РМ-1 ТП.2.3 pH ТП.3 Ф-1 ТП.3.1 Фактор 100 ТП.3 Ц-1 ТП.3.2 разделен 0 ия Давлени 0,5 0,6 0,7 0,75 ТП.4.2 0,8 ати е ати ати ати ати ТП.4 УПМ-20 Произво 10 12 ТП.4.3 дительн 2 г/м г/м2 ость РМ-2 ТП.5.2 рН 7,2 7,4 7,1 Фактор ТП.5 700 Ц-2 ТП.5.3 разделен 0 ия Фактор 700 разделен 0 ТП.6 Ц-2 ТП.6.3 ия Т 20 25 30 37 38 Т 25 40 45 50 55 0,1 0,15 0,2 ТП.7 ВС ТП.7 0,25 0,3 Р мБа мБа мБа мБар мБар р р р 188 Таблица 27 – Параметры режима и безопасности технологического процесса Возможные причины Действия персонала и способы Неполадки возникновения устранения неполадок неполадок 1. Проверить подключение к Не обеспечивается Не работает электросети; перемешивание мешалка 2. Замена мешалки; Неверно 1. Проверить работоспособность устанавливается Сбой в работе термостата и установленные температурный термостата параметры; режим 2. Замена термостата; Неплотное Проверить плотность Крупная фракция прилегание фильтра прилегания фильтра; емкости. шрота обнаруживается в Нарушение фильтрате целостности Замена фильтра; фильтра Не происходит 1. Рассчитать действительный отделение твердой Не обеспечивается фактор разделения для данного фазы необходимый оборудования; (мелкодисперсной фактор разделения 2. Внести изменения в установке взвеси) при центрифуги; разделении 1. Произвести промывку; 2. Отключить модуль от установки; 3. Определить место повреждения полого волокна; 4. Залить волокно с двух сторон Нарушена и в месте повреждения целостность Механическое эпоксидной смолой (клеем ЭПСволокна повреждение 80); мембранного волокна 5. После затвердевания смолы модуля (через 4 часа) собрать модуль; 6. Произвести опрессовку; При ремонтонепригодности произвести замену модуля в сборе Таблица 27 – Окончание 189 Неполадки Возможные причины возникновения неполадок Действия персонала и способы устранения неполадок 1. Проверка целостности шланга (материала трубопровода), Не обеспечивается шлангов насоса; Нарушение в поддержание 2. При необходимости работе заданного параметра произвести замену; перельстатического давления в установке 3. Произвести проверку насоса. Течь ультрафильтрации правильности установки и крепления шлангов в перельстатическом насосе; Не происходит 1. Проверить работоспособность отделение осадка Сбой в работе термостата и установленные белка при термостата параметры; разделении в 2. Замена термостата; центрифуге 9 Материальный баланс Таблица 28 – Материальный баланс Израсходовано Наименование сырья и полупродуктов Подсолнечный шрот Вода подготовленная Гидроксид натрия раствор 1% Ферментный препарат Янтарная кислота Спирт 96 % ИТОГО Получено Наименование Масса продуктов, отходов и (грамм) потерь 1000,0 Изолят белка Депротеинизированный 9988,0 шрот 40,0 Пермеат 2,0 Надосадок 2,0 ПВ смесь ВВУ Потери 478,4 Спиртовой раствор 11510,4 ИТОГО Масса (грамм) 239,8 1189,0 8337,3 889,4 373,5 3,0 478,4 11510,4 190 10 Контроль производства Таблица 29 – Перечень важнейших контрольных точек производства Наименование стадий, места измерения параметров или отбора проб Наименова Наименование ние контролируем объекта ого контроля параметра, единицы измерений Температура РМ-1 рН ТП.2 – ГетероФерментативный фазная Содержание постгидролиз аминного ферментаазота ционная суспензия Содержание сухих веществ Содержание ТП.3 – Отделение Гидрочастиц ДПШ лизат размером более 0,001 мм Содержание ТП.4 – сухих веществ Мембранное КонцентультраконценСтепень рат трирование и концентриров диафильтрация ания РМ-2 рН ТП.5 – Осажден- Содержание Осаждение белка ный белок растворителя Содержание ТП.6 – Очистка Паста хлорогеновой спиртом белка кислоты Температура ВС Давление ТП.7 – ВС Изолят Сырой белка протеин Регламенти рованный норматив (значение параметра) Методы и средства контроля Термометр рН-метр Не менее 1% от содержания По ГОСТ протеина в исходном сырье Не менее 43 ИСО 6496г/л 1999 Не более 1 г/л Не менее 220 г/л Не менее 6,7 раз 4,5 Не более 50 % Не более 0,01 % 25-40 0С 0,1 МПа Термометр Манометр 191 11 Техника безопасности, пожарная безопасность и производственная санитария В настоящем разделе приводятся данные об имеющихся опасностях, которые могут привести к пожару, взрыву, токсическому отравлению, а также комплес технических и организационных мероприятий, обеспечивающих минимальный уровень опасности и оптимальные санитарно-гигиенические условия работы в биотехнологической лаборатории. Режим личной безопасности - Инструктаж № 1307. Правила по безопасности и пожарному режиму на электроустановках, 2001 г. - Инструктаж № 10-00 Т. Правила по электробезопасности, 2001 г. - Инструктаж № 9-00 Т. Правила по безопасной работе с едкими веществами, 2001 г. В работе все вредные и опасные факторы были сведены к норме или к минимуму, работа проводилась с соблюдением элементарных правил безопасности: Электроприборы, как правило, не снабжены защитой от искрения, поэтому нельзя ими пользоваться при работе с легковоспламеняющимися веществами; Работу проводить только в защитной одежде (халате) в целях предотвращения порчи личной одежды и попадания реактивов на открытые участки тела; С агрессивными кислотами и щелочами, а так же с веществами, имеющими резкий запах, работать под тягой с использованием стеклянных пипеток и резиновых груш; При мытье лабораторной посуды пользоваться резиновыми перчатками; При работе с электроприборами не трогать мокрыми руками токоведущих частей приборов; 192 11.1. Производственная санитария Размеры лаборатории. Площадь лабораторной комнаты – 30,0м , высота потолка – 2,5 м, объем – 75,0 м . В данной лаборатории одновременно работает не более пяти человек, то есть на каждого приходится 6,0 м площади и 15 м объема помещения, что соответствует требованиям санитарных норм (площадь 4,5 м и объем 15 м ). Метеорологические условия в лаборатории. Помещение сухое, температура колеблется в пределах 18-22 ◦С, влажность воздуха не превышает 60%. Оптимальные и допустимые нормы микроклимата в рабочей зоне представлены в таблице 26. Таблица 30 – Оптимальные и допустимые нормы микроклимата в рабочей зоне Сезон года Холодный/ переходный период Теплый период Категория работ I.Легкая физическая работа I.Легкая физическая работа Температура, ◦С Относитель Скорость ная движения влажность, воздуха, % м/с Опт. Доп. Опт. Доп. Опт. Доп. 20-30 19-25 60-40 75 0,2 0,2 22-25 25 60-40 75 0,2 0,2 В лаборатории должно быть центральное водяное отопление. Это обеспечивает оптимальную температуру воздуха в помещении: в холодный и переходный период года 21-23 ◦С при относительной влажности воздуха в помещении 60 %, в теплый период года 22-24 ◦С при относительной влажности воздуха в помещении 60 %. Согласно данным таблицы №__, микроклиматические 193 условия в лабораторных условиях в лаборатории соответствуют допускаемым санитарным нормам. Вентиляция Обеспечение нормальных метеорологических условий и чистоты воздуха на рабочих местах в значительной степени зависит от правильно организованной системы вентиляции. В соответствии с нормами в помещении лаборатории предусмотрена естественная вентиляция через дверные и оконные проемы. Естественное движение воздуха в помещении происходит вследствие разности его плотностей вне и внутри помещения (тепловое движение), а также под действием разности давления наружного воздуха с наветренной и подветренной сторон здания. Естественная вентиляция в лаборатории носит неорганизованный характер. Воздух подается и удаляется из помещения через форточки и окна, открываемые без всякой системы. Кроме того, лаборатория должна быть оборудована не менее двумя вытяжными шкафами, которые вмещают четыре рабочих места. Скорость всасывания воздуха 1,5 м/с, возможные отклонения – до 1,2 м/с. Это позволяет проводить в вытяжном шкафу работы с вредными веществами всех классов опасности. Освещение 1) Естественное освещение. Естественное освещение в лаборатории боковое. В дневное время лаборатория имеет естественное освещение. Показателем естественного освещения является коэффициент естественного освещения (КЕО): КЕО = Евн ∗ 100% Енар Норма КЕО для бокового освещения составляет 1,5% для средней точности зрительной работы (4 разряд). Площадь световых проемов в лаборатории равна 9 м , что соответствует нормам естественного осещения. 194 2) Искусственное освещение. Осуществляется люминесцентными лампами. Количество светильников на данный размер лаборатории - 12 штук, что обеспечивает нормам. В вытяжном шкафу используется люминесцентный свет с лампами в 60 ВТ, дающим световой поток в 400 л м. Шум Уровень шума в лаборатории не превышает 75 ДБ, что соответствует нормам. Источники шума – работающая центрифужная установка, вытяжной шкаф. Водоснабжение Система водоснабжения хозяйственно-бытовая и пожарная. Источник водоснабжения – городской водопровод. Горячая вода поступает с ТЭЦ. Канализация В лаборатории должен иметься хозяйственно-бытовая канализация, снабженная различными гидрозатворами, предназначенными для предотвращения поступления в лабораторию и из нее вредных веществ и препятствуя распространению пламени в случае пожара. Отработанные жидкости сливаются в канализационную сеть. Суспензии с гранулами не сливаются в канализацию во избежание засорения. Для предотвращения скапливания летучих токсичных веществ и взрывопожароопасных веществ системы канализации оборудуются естественной и искусственной вытяжной вентеляцией. Отопление Лаборатория должна быть оснащена радиаторами центрального отопления, которые обеспечат среднюю температуру воздуха, соответствующую санитарным нормам. 195 11.2. Техника безопасности Электробезопасность Обычно, в лабораториях используется переменный ток напряжением 220 и 380 В и частотой 50 Гц. Такие помещения относятся к 1 классу «без повышенной опасности поражения людей электрическим током», т.к. отсутствуют условия повышенной электроопасности. Оборудование, рассчитанное на то или иное напряжение должно иметь надписи. Все рубильники, пусковые устройства и провода в обязательном порядке должны быть изолированы и ограждены. В соответствии с требованиями ПУЭ для помещений класса В-1б в целях предотвращения травматизма и защиты работающих от поражения электрическим током в лаборатории должны быть предусмотрены следующие меры безопасности: Все силовые машины зануляются; Все токоведущие элементы электромашин устанавливаются в защищенном месте; Осуществляется контроль за изоляцией (два раза в год): сопротивление изоляции проводов на участке между двумя предохранителями должно быть не менее 500 кОм; Сопротивление заземляющего устройства должно быть не более 4 Ом; Во избежание электроожегов все пусковые устройства, рубильники, настенные розетки и провода защищаются от непосредственного соприкосновения с частями тела человека; Допускается устанавливать электрооборудование без взрывзащиты; 196 Пожаробезопасность. Средства пожаротушения В лаборатории должны быть следующие средства пожаротушения: - песок; - асбестовые одеяла; - огнетушители; Все средства пожаротушения должны быть расположены на видном месте у входа в лабораторию. Проход к ним должен быть свободным. Для оповещения о возникшем в лаборатории пожаре должна быть телефонная связи и пожарная сигнализация. В случае пожара в лаборатории необходимо: 1. Выключить все приборы; 2. Вынести из лаборатории все сосуды и емкости с горючими и огнеопасными веществами; 3. Применять для тушения наиболее эффективные в данном случае средства;
