Станчев Б. С., Гроховский С.Л., Хорлин А. А., Готтих Б. П., Жузе А

АКАДЕМИЯ НАУК СССР
МОЛЕКУЛЯРНАЯ
БИОЛОГИЯ
Том 20
(ОТДЕЛЬНЫЙ ОТТИСК)
6
МОСКВА • 1986
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
Том 20
1986
Вып. 6
УДК 577.323
НЕТРОПСИН, ДИСТАМИЦИН А, бис-НЕТРОПСИНЫ
КАК СЕЛЕКТИВНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ДЕЙСТВИЯ РЕСТРИКТАЗ
И ДНКазы I
Б. С. СТАНЧЕВ, С. Л. ГРОХОВСКИЙ, А. А. ХОРЛИН,
Б. П. ГОТТИХ, А. Л. ЖУЗЕ, А. В. СКАМРОВ*,
Р. Ш. БИБИЛАШВИЛИ*
Институт молекулярной биологии Академии наук СССР, Москва
*Институт экспериментальной кардиологии ВКНЦ Академии
медицинских наук СССР, Москва
Исследовано влияние нетропсина, ряда бис-нетропсинов и дистамицина А на гидролиз фрагментов ДНК рестриктазами. Параллельно с ингибированием гидролиза определяли места связывания лигандов на тех же
фрагментах ДНК по защите от частичного гидролиза ДНКазой I (footprinting). Совместный анализ мест связывания лигандов с их способностью
ингибировать гидролиз приводит к следующим выводам. 1) Ингибирование
действия рестриктаз указанными лигандами вызвано образованием комп­
лекса лиганда с узнаваемым местом на ДНК. Полученные эксперименталь­
ные результаты позволяют ограничить зону необходимого перекрывания
участка узнавания рестриктазы и места связывания лиганда в ±4 нуклеотида от оси симметрии участка узнавания рестриктазы. При этом пере­
крывание места, занимаемого одной молекулой лиганда, с участком уз­
навания рестриктазы не является достаточным условием полного ингибирования гидролиза. 2) Основываясь на известной специфичности нетропсина
к нуклеотидной последовательности, можно предсказать те места узнавания
рестриктаз, на которых будет наблюдаться ингибирование гидролиза ДНК
рестриктазами. 3) Нетропсин и бис-нетропсины обладают разной специфич­
ностью и могут быть использованы для селективного ингибирования ре­
стриктаз на различных участках узнавания.
В настоящее время способность ДНК-связывающихся лигандов огра­
ничивать действие рестрикционных эндодезоксирибонуклеаз типа II ис­
пользуется для исследования механизма действия этих ферментов, по­
строения рестриктазных карт ДНК, получения высокомолекулярных
фрагментов ДНК, введения одноцепочечных разрывов в молекулу ДНК
[1—6]. В работах подобного рода в качестве АТ-связывающегося ли­
ганда используют обычно дистамицин А, GС-связывающегося — актиномицин D [1, 2]. Использование указанных лигандов для ингибирова­
ния рестриктаз осложняется кооперативным характером связывания
этих антибиотиков с ДНК [7, 8]. Из-за положительной кооперативности, особенно при высоких концентрациях лигандов, почти невозможно
предсказать места связывания актиномицина D и дистамицина А на
ДНК по ее первичной структуре, хотя последовательность мест предпоч­
тительного связывания для обоих антибиотиков в настоящее время из­
вестна [9—12]. Более того, при высоких концентрациях (концентрация
ДНК в молях пар оснований (Р/2) - 10 -4 М, молярное отношение кон­
центрации добавленного лиганда D и ДНК (в парах оснований) 2D/Р=
= 1) дистамицин А может защищать всю ДНК от действия ДНКазы I,
связываясь при этом с любым участком ДНК практически независимо
от первичной структуры [13]. Поэтому использование нетропсина в ка­
честве АТ-специфичного агента кажется более перспективным. При свя­
зывании нетропсина с ДНК положительной кооперативности не наблю­
дается [14]. В нашей предыдущей работе [13] показано, что при невы­
соких концентрациях лиганда (2D/Р<=1/9) места связывания нетропси­
на с ДНК, выявляемые по защите от частичного гидролиза ДНКазой I
фрагмента ДНК в присутствии лиганда (метод footprinting [15]), со­
держат не менее четырех, расположенных подряд АТ-пар. Если извест1614
но максимальное расстояние между участком узнавания рестриктазы и
местом связывания лиганда, на котором лиганд способен ингибировать
гидролиз ДНК, то можно предсказать те участки узнавания рестрикта­
зы, гидролиз которых рестриктазой будет ингибироваться связанным с
ДНК лигандом.
В настоящей работе сравнивали связывание нетропсина и его про­
изводных: бис-нетропсина (<—>), бис-нетропсина (—><—), бис-нетропсина (—>—>) и дистамицина А на фрагменте ДНК (по защите от частич­
ного гидролиза ДНКазой I) с ингибированием рестриктаз на том же
фрагменте. Сравнение связывания лигандов со способностью антибио­
тиков блокировать действие рестриктаз позволяет ответить на вопрос:
является ли способность к ограничению действия рестриктазы следстви­
ем накрывания лигандом участка узнавания рестриктазы, или ингибирование рестрикции вызвано непрямым воздействием лиганда на рестриктазу. Более того, знание мест связывания лиганда на ДНК позволя­
ет определить, при каком перекрывании участка узнавания рестрикта­
зы с местом связывания лиганда наблюдается ингибирование гидролиза.
При анализе ингибирующего действия лигандов условия гидролиза
комплекса ДНК с лигандом выбирали так, чтобы на одну молекулу
фрагмента ДНК приходился один рестриктазный разрыв (использовали
фрагменты ДНК, меченные по 5'- или 3'-концу одной из цепей фраг­
мента), т. е. условия, аналогичные экспериментам по защите от частич­
ного гидролиза ДНКазой I (footprinting). Изучение блокирования ли­
гандом расщепления на определенном участке узнавания рестриктазы
по ингибированию полного гидролиза ДНК, как это делалось ранее [1,
2], требует анализа продуктов неполного гидролиза ДНК, что сильно
затрудняет интерпретацию результатов. Использование частичного гид­
ролиза рестриктазой фрагмента ДНК позволяет следить за изменением
скорости гидролиза на определенном участке узнавания рестриктазы по
изменению интенсивности соответствующих полос, полученных при
электрофоретическом разделении продуктов частичного гидролиза ДНК
рестриктазой в присутствии и в отсутствие лиганда.
Анализировали ингибирование рестриктаз: EcoRI (GAATTC) — уча­
сток узнавания содержит четыре расположенные подряд АТ-пары, т. е.
сильное место связывания нетропсина: HindIII (AAGCTT), AluI
(AGCT), ClaI (ATCGAT) — краевые нуклеотиды участка узнавания
представляют собой часть сильного места связывания, HpaII (CCGG) —
участок узнавания не содержит АТ-пар.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Антибиотики. Дистамин А — фирмы «Serva» (ФРГ). Образец не­
тропсина любезно предоставлен, д-ром X. Трумом (Иена, ГДР). Биснетропсины синтезированы согласно методике Хорлина и соавт. [16]:
формулы бис-нетропсинов приведены на рис. 1.
Ферменты. Рестриктаза EcoRI, ДНК-полимераза I Е. соli любезно
предоставлены Л. П. Савочкиной (ВКНЦ АМН СССР), полинуклеотидкиназа фага Т4 — А. А. Ченчиком (BKHЦ, АМН СССР), рестриктаза
EcoRV — В. В. Совой (ИБМ ДВНЦ АН СССР), рестриктаза BspRI —
А. Л. Бочаровым (ИМБ АН СССР). Рестриктазы HindIII, ClaI, AluI,
HpaII — фирмы «Boehringer» (ФРГ), ДНКаза I —фирмы «Worthington» (США).
Выделение плазмидной ДНК и получение меченых фрагментов ДНК.
Использовали радиоактивно меченные фрагменты ДНК плазмид
pBRS3304 [13] (1асUV5-промотор-операторный участок), pBR322 [17]
EcoRI-EcoRV-фрагмент
(1—187 нуклеотиды pBR322), HindIII-BspRIфрагмент (29—4345 нуклеотиды pBR322)] Выделение плазмидной ДНК
и получение 3'-меченных фрагментов описано ранее [13]; 5'-меченый
фрагмент pBR322 (EcoRI-EcoRV) получали, как описано Ченчиком
и соавт. [18]; [a-32P]dATP, [a-32P]dGTP, [g 3 2 Р]ATP — фирмы «Amersham» (Англия)
1615
Рис. 1. Химические формулы бис-нетропсинов с антипараллельным и параллель­
ным расположением двух нетропсиноподобных фрагментов
Частичный гидролиз ДНК в присутствии лиганда. 5 мкл раствора,
содержащего 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 6 мМ СаС12, 6 мМ MgCl2, мече­
ный фрагмент (20000 имп/мин по Черенкову),
немеченую ДНК плазмиды pBR322 в концентрации 120 мг/л (2•10-4 моль п.н.) смешивали с
5 мкл раствора антибиотика в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4 (концентрации
антибиотиков в окончательном растворе указаны в подписях к рисун­
кам).
Через 1 ч инкубации в темноте в реакционную смесь добавляли 1 мкл
раствора ДНКазы I или рестриктазы. Через 5 мин гидролиз останавли­
вали добавлением 5 мкл 0,1 М EDTA. Полученные образцы анализиро­
вали электрофорезом с разрешением в 1 нуклеотид, как описано Ченчиком и соавт. [18], но концентрация разделяющего полиакриламидного
геля была 20%.
Концентрацию ДНКазы и рестриктаз выбирали так, чтобы в описан­
ных условиях при отсутствии лиганда на одну молекулу меченого фраг­
мента приходился один разрыв. При этом ДНКазу I добавляли до кон­
центрации ~1 мкг/л, а рестриктазу — до концентрации 105 ед/л.
Реакцию G>A проводили, как описано в работе Максама и Гилбер­
та [19].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Локализация мест связывания лигандов с ДНК. Для определения
мест связывания лиганда параллельно с обработкой рестриктазой ком­
плексы ДНК с лигандом анализировали методом защиты от частичного
гидролиза ДНКазой I (footprinting), условия обработки (буфер, время,
температура) были одинаковы как для ДНКазы I, так и для рестрикта­
зы. Необходимо отметить, что место связывания лиганда и участок
ДНК, защищаемый связанным лигандом, не совпадают. Размер защи­
щаемого участка обычно больше места, занимаемого лигандом на ДНК,
из-за размеров самой ДНКазы I. Стереохимические особенности взаи­
модействия ДНКазы I с комплексом лиганда с местом связывания на
1616
Рис. 2. Частичный гидролиз HindIII-BspRI-фрагмента pBR322 ДНКазой I (D) и рестриктазой EcoRI (Р) в присутствии различных концентраций нетропсина (а), бис-нетропсина (<—>) (б), бис-нетропсина (—><—). Концентрация ДНК 10-4 моль на 1 моль
пар нуклеотидов. 1 — реакция
G>A. Концентрация добавленного
лиганда: 2 — 0-5М
-6
( 2 D / Р = 0 ) ; 3 — 1,2•10-5 -5М (2D/Р = 1,81); 4 — 3,7•10
М (2D/P = 1/27); 5 - 1,1•10
М
-4
(2D/Р=1/9); 6 — 3,3•10 Н (2D/Р = 1/3); 7 — 10 М (2D/Р = 1); 8 — 3•10-4 М
(2D/Р = 3)
ДНК отличаются для разных типов комплексов, что приводит к разным
картинам защиты [13, 20]. Из-за зависимости скорости гидролиза межнуклеотидной связи ДНКазой I от окружающей нуклеотидной последо­
вательности ДНК [21, 22] в некоторых случаях невозможно определить
локализацию границы защищаемого участка с точностью до одного
1617
Рис. 3. Схематическое изображение результатов экспериментов по ингибированию
ДНКазы I и рестриктазы EcoRI различными концентрациями нетропсина (а) и биснетропсина (<—>) (б) на HindIII-BspRI-фрагменте pBR322. Слева — отношения кон­
центрации добавленного лиганда к концентрации ДНК в молях на 1 моль пар нуклеотидов. Черными прямоугольниками обозначены отчетливо видимые полосы в контрольных,
дорожках независимо от их интенсивности, т. е. полосы, интенсивность которых не умень­
шилась в присутствии антибиотика. Заштрихованными прямоугольниками обозначены
полосы, интенсивность которых стала меньше, чем интенсивность соответствующих полос
на контрольных дорожках, на 25—75%. Светлые прямоугольники — полосы, не видимые
в контрольных дорожках, а также полосы, интенсивность которых уменьшилась более
чем на 75% в присутствии антибиотика
нуклеотида, что делает невозможным точное определение места связы­
вания лиганда.
Для определения места связывания нетропсина по защищаемому лигандом участку ДНК от ДНКазы I использовали следующие данные.
Ранее было показано [13], что при низких концентрациях нетропсина
(2D/P<=1/9) лиганд связывается только с участками ДНК, содержащи­
ми не менее четырех, расположенных подряд АТ-пар. Поэтому мы счи­
тали, что при 2D/P<=1/9 защита вызывается связыванием нетропсина
только с АТ-блоками длиной не менее четырех нуклеотидов, располо­
женными внутри защищаемой области.
В настоящее время способ определения места связывания бис-нетропсинов по защищаемому лигандом участку неизвестен, поэтому для
них мы использовали только понятие «защищаемый участок».
Игибирование рестриктазы EcoRI нетропсином, бис-нетропсином
(<—>), бис -нетропсином (—><—), бис -нетропсином (—>—>). Способ­
ность перечисленных антибиотиков ингибировать гидролиз ДНК рест1618
риктазой EcoRI проверяли на фрагменте плазмиды pBR322, ограничен­
ном местами узнавания рестриктаз HindIII и BspRl (29—4345 нуклеотиды pBR322); фрагмент радиоактивно мечен достраиванием HindIIIконца с помощью ДНК полимеразы I.
Результаты эксперименгов приведены на рис. 2 и в схематической
форме на рис. 3.
Нетропсин. Как видно из рис. 2, а и 3, а, при высоких концентрациях
добавленного нетропсина (2D/P>=1) почти весь фрагмент оказывается
защищенным от ДНКазы I. Одновременно при 2D/P>=1 наблюдается
полное ингибирование рестриктазы EcoRI. При концентрациях 1/81=
<2D/P=<1/9 нетропсин защищает от ДНКазы I только область вблизи
первого нуклёотида pBR322, связываясь с тетрануклеотидом ААТТ. При
этом наблюдается лишь частичное ингибирование рестриктазы EcoRI
(рис. 2, а, 3, а), несмотря на полную защиту ДНК вблизи ААТТ от действия ДНКазы I.
Параллельное уменьшение степени ингибирования ДНКазы I и рест­
риктазы EcoRI свидетельствует о том, что ингибирование гидролиза рестриктазой вызывается скорее образованием комплекса лиганда с узна­
ваемым местом на ДНК, чем непрямым ингибированием рестриктазы
лигандом. Соответствие константы связывания дистамицина А и кон­
центрации, при которой дистамицин А защищает участок узнавания ре­
стриктазы EcoRI от действия рестриктазы, было продемонстрировано в
работе Коппельта и соавт. [6]. Наблюдаемое частичное ингибирование
рестриктазы EcoRI при явно полном заполнении нетропсином централь­
ного тетрануклеотида ААТТ является свидетельством в пользу того, что
нетропсин, связанный с центральной частью узнаваемой EcoRI последо­
вательности, не блокирует гидролиз, а снижает скорость реакции. Оче­
видно, нетропсин может при этом оставаться в тройном комплексе с
ДНК и рестриктазой EcoRI. Гидролиз рестриктазой блокируется толь­
ко при заполнении нетропсином практически всей зоны, прилежащей к
узнаваемой рестриктазой последовательности.
Бис-нетропсины. При высоких концентрациях (2D/P>=1/3) бис-нетропсин (<—>) полностью и равномерно защищает фрагмент ДНК от
действия ДНКазы I (рис. 2, б, 3, б); аналогичный эффект наблюдается
и на lacUV5-промотор-операторном участке [13]. Снижение концентра­
ции лиганда до 2D/P = l/9 приводит к равномерному увеличению интен­
сивности всех полос (рис. 2, б, чуть большая защита наблюдается в об­
ласти от 1 до 15 нуклёотида pBR322), что свидетельствует о низкой из­
бирательности связывания бис-нетропсина (<—>) на данном фрагменте
ДНК. Одновременно гидролиз ДНК рестриктазой EcoRI ингибируется
в 2 раза при концентрациях 2D/P=l и 2D/P = 1/3 и приблизительно на
25% при 2D/P=1/9.
В аналогичных экспериментах с бис-нетропсинами (—><—) и (—>—>)
частичная защита от гидролиза ДНКазой I наблюдается в области от 2
до 13 нуклеотида pBR322 при 1/3=<2D/P=<1. Как видно из рис. 2, в [при­
ведены данные для бис-нетропсина (—><—)], ингибирования гидролиза
рестриктазой при тех же концентрациях не наблюдается, что можно
объяснить либо тем, что место связывания лиганда находится дальше в
направлении 3'-конца от участка узнавания рестриктазы, либо слабой
степенью ингибирования рестриктазы. Таким образом, бис-нетропсины
не ингибируют EcoRI, если занимают ДНК не полностью, а при запол­
нении всей зоны ингибируют реакцию только частично.
Ингибирование рестриктазы HpaII нетропсином и дистамицином А.
Способность нетропсина и дистамицина А ингибировать рестриктазу
HpaII проверяли, используя 1асUV5-промотор-операторный участок.
Подробно защита нетропсином и дистамицином А мест связывания на
1асUV5-промотор-операторном участке от действия ДНКазы I обсужде­
на в нашей предыдущей работе [13]. Участок узнавания рестриктазы
HpaII (CCGG) находится в зоне, богатой GC-парами, и нетропсин, да­
же при 2D/P = l (рис. 4), не связывается с областью, перекрывающейся
с участком узнавания HpaII. Дистамицин А из-за кооперативного харак1619
Рис. 4. Схематическое изображение результатов экспериментов по ингибированию
ДНКазы I и рестриктазы НраII различными концентрациями нетропсина (а) и дистамицина А (б) на 1асUV5-промотор-операторном участке. Фрагмент мечен по З'-концу
нижней цепи. Слева — отношения концентраций добавленного нетропсина и ДНК в мо­
лях на 1 моль пар нуклеотидов. Условные обозначения см. в подписи к рис. 3. Стрел­
ками указаны фосфодиэфирные связи, гидролизуемые рестриктазой HpaII. Вероятные
места связывания нетропсина обведены
тера взаимодействия с ДНК при 2D/P>=1/9 защищает область вблизи
участка узнавания рестриктазы HpaII, причем защита от ДНКазы I на­
блюдается по обе стороны от участка узнавания. Эксперименты по ин­
гибированию рестриктазы HpaII (рис. 4, а, б) показывают, что нетропсин ни при каких концентрациях не блокирует гидролиз, в то время как
дистамицин А при 2D/P=l полностью блокирует действие рестриктазы
HpaII и частично при 2D/P = 1/3 и даже при 1/9.
Способность дистамицина А (в отличие от нетропсина) при высоких
концентрациях ингибировать действие рестриктазы HpaII на lacUV5промотор-операторном участке подтверждает необходимость перекрыва­
ния места связывания лиганда с участком узнавания рестриктазы для
ингибирования гидролиза.
Ингибирование действия рестриктаз HindIII, ClaI, AluI нетропсином,
бис-нетропсином (<—>), бис -нетропсином (—><—), бис -нетропсином
(—>—>). Ингибирование действия рестриктаз HindIII, AluI, ClaI указан­
ными антибиотиками проверяли, используя фрагмент плазмиды pBR322
(EcoRI-EcoRV-фрагмент, 1—187 нуклеотиды pBR322). Фрагмент радио­
активно мечен по месту узнавания рестриктазы EcoRI.
Анализировали связывание лигандов в области от 10-го до 40-го нуклеотида pBR322.
Нетропсин. Область от 10-го до 40-го нуклеотида pBR322 содержит
три сильных места связывания нетропсина (рис. 5): 1 — ТТАТ (18—
21 нуклеотиды); 2 —АТАА (27—30 нуклеотиды); 3 — ТТТААТ (33—38
нуклеотиды) (обозначены на рис. 5, а цифрами 1, 2 и 3). Как видно из
рис. 5, б, связывание нетропсина с тремя указанными местами приводит
к ингибированию ДНКазы I при 2D/P>=1/16. Взаимное расположение
сильных мест связывания нетропсина и участков узнавания рестриктаз,
1620
Рис. 5. Схематическое изображение результатов экспериментов по ингибированию
ДНКазы I, рестриктаз HindIII, ClaI и AluI в присутствии различных концентраций не­
тропсина на EcoRI-EcoRV-фрагменте pBR322. Фрагмент радиоактивно мечен по участ­
ку узнавания рестриктазы EcoRI. а — Взаимное расположение вероятных мест связы­
вания нетропсина (обведены) и участков узнавания рестриктаз. б — Результаты экспе­
риментов по ингибированию. Скобки — вероятные места связывания нетропсина. Слева
указаны отношения концентрации добавленного нетропсина к концентрации ДНК в мо­
лях на 1 моль пар нуклеогидов. Условные обозначения см. в подписи к рис. 3. I — ре­
зультаты по ингибированию расщепления рестриктазами фрагмента меченного по 5'-концу. II — ингибирование частичного гидролиза ДНКазой I в присутствии различных кон­
центраций нетропсина; фрагмент мечен по 3'-концу. III — ингибирование нетропсином
расщепления рестриктазами фрагмента, меченного по 3'-концу
а также межнуклеотидных связей, гидролизуемых рестриктазами, пока­
зано на рис. 5, а. Как видно из рисунка, связанный с фрагментом нетропсин накрывает обе межнуклеотидные связи, гидролизуемые рестриктазой HindIII, причем второе и третье места связывания нетропсина пе­
рекрываются с участком узнавания рестриктазы на два нуклеотида
каждое. Для рестриктазы ClaI одна из гидролизуемых межнуклеотид­
ных связей находится на границе второго места связывания нетропсина.
При этом второе место связывания перекрывается с участком узнавания
на два нуклеотида. Вторая гидролизуемая связь и область узнавания
слева от оси симметрии участка узнавания рестриктазы не пересекают­
ся с местом связывания нетропсина (место 1 на рис. 5, А).
В случае рестриктазы AluI гидролизуемые межнуклеотидные связи
не накрываются связанным нетропсином. Концевые нуклеотиды участка
узнавания II рестриктазы AluI перекрываются со вторым и третьим мес­
тами связывания нетропсина, расположенными по обе стороны от узна­
ваемой рестриктазой последовательности. Для участка узнавания I ре­
стриктазы AluI только один нуклеотид перекрывается с первым местом
1621
Рис. 6. Схематическое изображение результатов эксперимен­
тов по ингибированию ДНКазы I, рестриктаз HindIII, ClaI,
AluI в присутствии различных концентраций бис-нетропсина
(<-->) на EcoRI-EcoRV-фрагменте pBR322. Фрагмент мечен
по 3'-коицу. Слева — отношения концентраций добавленного
лиганда и ДНК в молях на 1 моль пар нуклеотидов. Условные
обозначения см. в подписи к рис. 3
связывания нетропсина и нетропсин локализуется с одной стороны от
узнаваемой рестриктазой последовательности.
Анализ данных по ингибированию действия рестриктаз AluI, ClaI и
HindIII нетропсином на указанном фрагменте ДНК позволяет ответить
на вопрос, является ли условие перекрывания места, занимаемого не­
тропсином на ДНК, с участком узнавания рестриктазы достаточным для
ингибирования действия рестриктаз.
Результаты экспериментов по ингибированию рестриктаз нетропси­
ном представлены в схематической форме на рис. 5, б.
Как видно из рисунка, нетропсин ингибирует гидролиз обеих цепей
фрагмента рестриктазами HindIII (ингибирование полное) и ClaI (ингибирование частичное), причем концентрации, при которых наблюда­
ется ингибирование, одинаковы как в случае ингибирования рестриктаз,
так и в экспериментах с ДНКазой I (footprinting) (электрофореграммы
не приводятся).
Полное ингибирование гидролиза EcoRI-EcoRV-фрагмента в при­
сутствии нетропсина рестриктазой AluI по участку узнавания II наблю­
дается при 2D/P>=1/16, в то время как расщепление рестриктазой AluI
по участку узнавания I ингибируется лишь частично при 2 D / P = 1 - 1 / 4 .
При этом ингибирование гидролиза на участке II AluI полное, а на уча­
стке I — частичное. Таким образом, при 2D/P=1/16 нетропсин позволяет
селективно ингибировать гидролиз ДНК рестриктазой по одному уча­
стку узнавания, не изменяя действия рестриктазы на другом ее участке
узнавания.
Анализ результатов ингибирования рестриктазы AluI нетропсином,
связанным с ДНК, приводит к выводу о том, что перекрывание места
узнавания рестриктазы с местом связывания нетропсина не является
достаточным условием ингибирования гидролиза.
Бис-нетропсины. При высокой концентрации добавленного лиганда
(2D/P>1/3) бис-нетропсин (<—>) защищает фрагмент от 10-го до 40-го
нуклеотида pBR322 от действия ДНКазы I полностью (рис. 6) (элек­
трофореграммы не приводятся). Как видно из рис. 6, при 2D/P=1/9 и
1/27 на исследованном фрагменте ДНК наблюдается специфическая за­
щита двух областей: первая область, четко выраженная по защите от
ДНКазы I, — от 20-го нуклеотида в сторону участка узнавания рестрик­
тазы EcoRI; вторая, слабо выраженная,— от 24-го до 36-го нуклеотида
pBR322. Участки узнавания рестриктаз HindIII и AluI (II) перекрыва­
ются со второй защищаемой областью. Действие обеих рестриктаз на
этих участках узнавания оказывается блокированным до 2D/P=1/27.
Участок узнавания рестриктазы AluI (I) находится внутри первой обла­
сти, защищаемой бис-нетропсином (<—>) от ДНКазы I, и в отличие от
1622
иетропсина действие рестриктазы AluI на участке узнавания II оказы­
вается блокированным бис-нетропсином (<—>) до 2D/P=l/27. Участок
узнавания рестриктазы ClaI попадает, по-видимому, в область между
двумя местами связывания бис-нетропсина (<—>) и поэтому ингибирование гидролиза наблюдается только при 2D/P>=1/3. Альтернативное
объяснение заключается в том, что перекрывание места связывания биснетропсина (<—>) с участком узнавания рестриктазы ClaI недостаточно
для того, чтобы вызывать ингибирование фермента (как в случае AluI
(I) и нетропсина).
Бис-нетропсин (—><—), бис-нетропсин (—>—>) не имеют сильных мест
связывания на фрагменте от 10-го до 40-го нуклеотида pBR322. Неспе­
цифическое ингибирование ДНКазы I наблюдается при высоких (2D/P =
= 1) концентрациях лигандов. При понижении концентрации лиганда
(2D/P=l/3) слабая защита от действия ДНКазы I наблюдается только
вблизи 30-го нуклеотида pBR322 (данные не приводятся). Бис-нетропсин (—><—) и бис-нетропсин (—>—>) ингибируют действие рестриктаз
HindIII, AluI, ClaI только при 2D/P= 1.
Ингибирование действия рестриктаз указанными лигандами вызыва­
ется образованием комплекса лиганда с узнаваемым местом на ДНК.
Полученные экспериментальные результаты позволяют ограничить зону
необходимого перекрывания участка узнавания рестриктазы и места
связывания лиганда: ±4 нуклеотида от оси симметрии участка узнава­
ния рестриктазы. При этом перекрывание места, занимаемого одной мо­
лекулой лиганда, с участком узнавания рестриктазы, не является доста­
точным условием ингибирования гидролиза.
Сравнение связывания нетропсина, дистамицина А, бис-нетропсина
(<—>), бис-нетропсина (—><—), бис-нетропсина (—>—>) на фиксирован­
ных фрагментах ДНК со способностью указанных лигандов ингибировать действие рестриктаз на тех же фрагментах показывает следующее.
Данных, полученных в этой работе, недостаточно для того, чтобы дать
алгоритм предсказания полной защиты нетропсином тех или иных мест
ДНК от действия рестриктаз. Однако, если считать, что все рестрикта­
зы II класса обладают одинаковым механизмом действия, то на основа­
нии приведенных выше результатов можно предположить, что необхо­
димым и достаточным условием полного блокирования действия рест­
риктазы является связывание этого лиганда по обе стороны от узнавае­
мой рестриктазой последовательности нуклеотидов. Причем 3-й или 4-й
(или оба) нуклеотиды от оси симметрии узнаваемой последовательности
должны перекрываться с местом связывания лиганда. Связывание одной
молекулы нетропсина как по центру узнаваемой последовательности,
так и с одной ее стороны, недостаточно для полного блокирования дей­
ствия рестриктазы. Так как при низких концентрациях нетропсин узна­
ет и связывается с блоком из четырех расположенных подряд АТ-пар,
алгоритм нахождения защищаемых последовательностей очевиден. Он,
однако, основан на неочевидном объединении всех рестриктаз II класса
в одну группу.
Поскольку одна молекула нетропсина, связанная в пределах восьми
пар нуклеотидов узнаваемой рестриктазой последовательности нуклео­
тидов (по четыре в каждую сторону от оси симметрии) недостаточна
для полного блокирования реакции гидролиза ДНК, то это может рас­
сматриваться как аргумент в пользу предположения, что узнавание
ДНК рестриктазами осуществляется со стороны большой бороздки
ДНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брага Э. А., Носиков В. В., Таняшин В. И., Жузе А. Л., Поляновский
АН СССР 1975 т. 225, с 707-710.
2. Malcolm A. D. B., Moffatt J. R. Biochim. Biophys. Acta, 1981, v. 655,
3. Kania J., Fanning T. G. Eurp. J. Biochem., 1976, v. 67, p. 367—371.
4. Parker R. C, Watson R. M., Vinograd J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
p. 851—855.
5. Shortle D., Nathans D. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 76, p.
О. Л. Докл.
p. 128—135.
1977, v. 74,
2170—2174.
1623
6. Coppelt M., Langowsli J., Pingound A., Haupt W., Urbanke U., Mover H., Maass G
Nucleic Acids Res., 1981, v. 9, p. 6115—6127.
7. Krylov A. S., Grokhovsky S. L., Zasedatelev A. S. Zhuze A. L., Gursky G V Gottikh B. P. Nucleic Acids Res., 1979, v. 6, p. 289—304.
8. Михайлов M. В., Заседателев А. С, Гурский Г. В. Биофизика, 1982, т. 27, с. 14—16
9. Sobel Н. М., Jain S. С. J. Mol. Biol., 1972, v. 68, p. 21—34.
10. Aivasashvilli V. A., Beabealashvilli R. Sh. FEBS Lett., 1983, v. 160, p. 124—128
11. Заседателев А. С, Жузе А. Л., Циммер К., Гроховский С. Л., Туманян В. Г., Гур­
ский Г. В., Готтих Б. П. Докл. АН СССР, 1976, т. 231, с. 1006—1009.
12. Schultz Р. С, Taylor J. S., Dervan P. В. J. Amer. Chem. Soc, 1982, v. 104, p. 6861—
6863.
13. Скамров А. В., Рыбалкин И. H., Бибилашвили Р. Ш., Готтих Б, П., Грохов­
ский С. Л., Гурский Г. В., Жузе А. Л., Заседателев А. С, Нечипуренко Ю. Д., Хорлин А. А. Молекуляр. биология, 1985, т. 19, с. 177—195.
14. Zimmer Ch., Reinert К. Е., Luck G., Wahnert U., Lober G., Thrum H. J. Mol. Biol.
1971, v. 58, p. 329—348.
15. Galas D., Smitz A. Nucleic Acids Res., 1978, v. 5, p. 3157—3170.
16. Хорлин А. А., Гроховский С. Л., Жузе А. Л., Готтих Б. П. Биоорган, химия, 1982,
т. 9, с. 1358—1364.
17. Sutclife J. G. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1978, v. 34, p. 77—90.
18. Чепчик А. А., Бибилашвили P. Ш., Мирзабеков А. Д., Шик В. В. Молекуляр. био­
логия, 1982, т. 15, с. 34—46.
19. Махаш А. М., Gilbert W. Methods Enzymol., 1980, v. 65. p. 99—560.
20. Scamrov A. V., Beabealashvilli R. Sh. FEBS Lett., 1983, v. 164, p. 97—101.
21. Bernardi A., Gaillard C, Bernardi G. Eur. J. Biochem., 1975, v. 52, p. 451—457.
22. Lomonosoff G. P., Butler P. J. G., Klug A. J. Mol. Biol., 1981, v. 149, p. 745—760.
Поступила в редакцию
19.111.1986
NETR0PS1N, DISTAMYCIN A, BIS -NETROPSINS AS SELECTIVE
INHIBITORS OF RESTRICTION ENDONUCLEASES AND DNAase I
B. S. STANCHEV, S. L. GROKHOVSKY, A. A. KHORLIN, B. P. GOTTIKH,
A. L. ZHUZE, A. V. SCAMROV, R. Sh. BEABEALASHVILLI*
Institute of Molecular Biology, Academy of Sciences of the USSR, Moscow
*Institute of Experimental Cardiology, All-Union Cardiology Research Center,
Academy of Medical Sciences of the USSR, Moscow
The simultaneous analysis of DNAase I «footprinting» data and restriction endonucleases inhibition data was performed on the same DNA end-labelled fragment. The inhibition
induced by netropsin, a number of bis-netropsins and distamycin A was investigated. These
experiments led us to the following conclusions. 1) The restriction endonucleases inhi­
bition by the ligands is caused by the ligand molecules binding in the close vicinity to
the restriction endonuclease recognition sequence. The zone of ±4 bp from the center
of the restriction endonuclease recognition sequence can be defined as the zone of the
influence of the bounded ligand on the restriction endonuclease. But in this case the in­
tersection of recognition sequence and the binding site occupied by a single ligand mo­
lecule is not sufficient for the inhibition to occur. 2) Restriction endonuclease cutting sites
protected by netropsin can be predicted basing upon known nucleotide sequence specificity
of netropsin. 3) Netropsin and bis-netropsins show different nucleotide sequence specifi­
city. This fact can be used for selevtive inhibition of restriction endonucleases.