Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития

Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития
научно-технологического комплекса России на 2014—2020 годы»
Соглашение 14.626.21.0003 от 17.11.2014
на период 2014 - 2016 гг.
Тема: Создание на основе полногеномного анализа и
метаболической
инженерии
промышленных
штаммов
микроорганизмов
суперпродуцентов
незаменимых
аминокислот и их использование в технологиях производства
кормовых добавок для сельского хозяйства
Руководитель проекта: заместитель директора ФГУП
ГосНИИгенетика по научной работе, д.б.н., профессор А.С. Яненко
Науки о жизни
Участники проекта
Получатель субсидии: ФГУП ГосНИИгенетика
• ГосНИИгенетика
- ведущий научный центр
РФ в области промышленной
биотехнологии, органично сочетающий фундаментальные исследования по генетике
микроорганизмов с прикладными работами по созданию индустриальных штаммов
и разработке инновационных биотехнологий. ГосНИИгенетика ежегодно выполняет
НИР в области биотехнологии на сумму
Индустриальный партнёр: ЗАО «Завод Премиксов №1» - осуществляет
внебюджетное финансирование работ в объеме 40 млн.рублей.
Сфера деятельности: производство премиксов для всех видов животных,
птицы и рыбы; Организация производства лизин-сульфата и сопутствующих
продуктов на основе глубокой переработки зерна.
Соисполнители:
ФИЦ Биотехнологии РАН
Задачи в проекте: секвенирование и анализ геномов базового и мутантных штаммов
Brevibacterium flavum – продуцентов лизина, идентификация модификаций генома,
приводящих к повышению продукции лизина на основе сравнительной геномики.
РХТУ имени Д.И. Менделеева, кафедра биотехнологии
- разработка биотехнологии
утилизации побочных продуктов переработки зерна пшеницы, образующихся в
лизиновом производстве.
Соглашение №<номер>
14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
2
Цели и задачи проекта
Цель: Создание научно-технического задела в области конструирования на
основе
полногеномного
анализа
и
метаболической
инженерии
промышленных штаммов микроорганизмов-суперпродуцентов незаменимых
аминокислот, предназначенных для производства кормовых добавок для
сельского хозяйства.
Задачи:
Разработать методы реконструкции генома бактерий
Corynebacterium/ Brevibacterium на основе полногеномного
секвенирования с помощью метаболической инженерии
Создать промышленный штамм-продуцент лизина мирового уровня
Разработать технологический процесс изготовления лизина сульфата
важнейшей кормовой добавки для животных и птицы
Использовать побочные продукты переработки пшеницы
(пентозаны) для получения белковой кормовой добавки
В результате реализации проекта будет заложена основа создания
эффективной кормовой базы для развития отечественного животноводства и
птицеводства на основе продуктов биотехнологии.
Соглашение №<номер>
14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
3
Ожидаемые результаты проекта
1. Промышленный
штамм-продуцент
лизина
мирового
уровня,
продуцирующий 210 г лизина\л за 50 час культивирования
2. Технология изготовления кормовой добавки с содержанием лизина
сульфата не менее 75% (превышает мировые аналоги) из зерна
пшеницы
3. Разработать технологический процесс
изготовления белковой
кормовой добавки на основе побочные продуктов переработки
пшеницы (пентозанов)
На основе результатов проекта
Индустриальный
партнер
впервые в России и мировой практике
проекта
создаст
производство
незаменимой
аминокислоты лизина на основе продуктов переработки зерна пшеницы
Соглашение №<номер>
14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
4
Перспективы практического использования
•
Индустриальный партнер обеспечит внедрение (промышленное
освоение) результатов ПНИЭР не позднее 2019 года посредством
использования созданного штамма –суперпродуцента лизина и
технологии
синтеза
лизина
с
использованием
штамма
на
создаваемом в настоящее время заводе по производству лизина по
адресу:
Белгородская
область,
Шебекенский
район,
тер.
Биотехнологический центр, Проектная мощность завода: 55 тыс.
тонн аминокислотной кормовой добавки
в год на сумму 2 млрд.
руб. в год.
Соглашение №<номер>
14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
5
Гены C. glutamicum, влияющие на
конверсию глюкозы в L-лизин
Свыше 60 генов контролируют синтез лизина
6
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Схема конструирования продуцента лизина
3
глюкоза
2
ацетат
аланин
4
1. Усиление путей
биосинтеза лизина;
пируват
2. Усиление синтеза
предшественников;
2
аммоний
оксалоацетат
1
треонин
метионин
3. Усиление транспорта
сахаров в клетку;
4. Блокирование боковых
метаболических путей;
аспартат
4
1
лизин
5
5. Усиление транспорта
лизина из клетки;
бактериальная
клетка
внешняя среда
Соглашение №<номер> 14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
7
Схема конструирования
ПЦР и секвенирование
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
14.626.21.0003
2014-2020
8
Этапы конструирования
Исходный штамм
Этап 1 – усиление путей
биосинтеза лизина
Этап 2 – усиление синтеза
предшественников лизина
Этап 3 – усиление
транспорта сахаров в
клетку
Соглашение №<номер>
Генетические изменения
lysC – мутации, приводящие к заменам Ala279Thr и Ser317Ala и
обеспечивающие устойчивость аспартаткиназы к ингибированию лизином и
треонином;
hom – мутация, приводящая к замене Gly148Ala и ослаблению активности
гомосериндегидрогеназы;
pyc – мутация, приводящая к замене Ala455Gly;
pck – делеция, приводящая к инактивации гена;
icd – мутация в старт-кодоне, снижающая активность гена.
lysC – усиление активности гена за счет замены промотора;
ddh - усиление активности гена за счет замены промотора;
lysA - усиление активности гена за счет замены промотора;
dapB - усиление активности гена за счет замены промотора.
pyc - усиление активности гена за счет замены промотора;
ppc - усиление активности гена за счет замены промотора и введения мутации,
приводящей к устойчивости фермента к ингибированию;
tkt-оперон (zwf, opcA, tal, tkt, pgl) - усиление активности генов за счет замены
промотора;
fbp - усиление активности гена за счет замены промотора;
aspB - усиление активности гена за счет замены промотора.
ptsH – делеция, приводящая к блокированию активности ФТС;
iolR (Cgl0157) – мутация, приводящая к инактивации гена;
ppgK - усиление активности гена за счет замены промотора;
murE – мутация, приводящая к ослаблению активности гена;
cspB – делеция, приводящая к инактивации гена.
14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
9
∆iolR
Транспорт глюкозыppgK ∆ptsH
∆cspB
murE
∆ pbpA
Пентозофосфатный путь
tkt-оперон
fbp
Гликолиз
Усиление
Ослабление
∆ Удаление
lysC
∆ pck
hom
Биосинтез
лизина
dapB
aspB
pyc
ppc
ЦТК
Icd
ddh
lysA
Выброс лизина
10
Мутантные штаммы, полученные в работе
Штамм
Результаты работы в 2015 г.
Генотип
Родительский штамм
Н44
∆pck
90
Н40
∆pck, icd
Н44
Н404
∆pck, icd, sod-lysC
Н40
Н56
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt
Н404
Н60
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh
Н56
Н65
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB
Н60
Н67
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB, eftu-fbp
Н65
Н77
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB, eftu-fbp, sod-lysA
Н67
Н57-1
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh
Н404
Н64
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, sod-tkt
Н57-1
Н66-1
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB
Н57-1
Н69-1
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, sod-dapB
Н57-1
Н66
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, sod-tkt, leuС-dapB
Н64
Н71-1
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA
Н66-1
Н75
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt
Н71-1
Н75-1
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt, sod-pyc
Н75
Н79
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, leuС-dapB, eftu-fbp, sod-lysA, sod-pyc
Н75-1
Н75-2
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt, ppc
Н75
Н75-3
∆pck, icd, sod-lysC, sod-ddh, leuС-dapB, sod-lysA, sod-tkt, aspB
Н75
Н69
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, sod-dapB
Н60
Н74
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, sod-dapB, eftu-fbp
Н69
Н76
∆pck, icd, sod-lysC, sod-tkt, sod-ddh, sod-dapB, eftu-fbp, sod-lysA
Н74
90
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
14.626.21.0003
2014-2020
11
Результаты работы в 2015 г.
Сравнительная оценка продуктивности полученных мутантов
экспериментах
в колбочных
а) Рост мутантных штаммов на разных
средах
Рис.1
в) Удельная продуктивность
мутантных штаммов
Рис.2
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
14.626.21.0003
2014-2020
12
Продуктивность штамма Н115 в 3 л ферментере
250
Лизин, г/л; Рост, ед. ОП
200
150
Лизин
Рост
100
50
0
0
10
20
30
40
50
60
Время, час
Соглашение №<номер> 14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
13
Результаты работы в 2015 г.
Секвенирование геномов базового и мутантного штаммов B.flavum и
сравнительный анализ
Сравнение результатов секвенирования позволило выявить 377
отличий в геномах базового и мутантного штаммов.
Рис. Фрагмент сиквенса штамма B.flavum-90
Соглашение №<номер>
14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
14
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
8. Проведен скрининг штаммов
дрожжей, утилизирующих пентозаны
(Табл.)
Коллекция
Культура
Ксилоза
Табл.
Арабиноза
РХТУ
Saccharomyces cerevisiae
---
---
РХТУ
Pichia membranifaciens
---
---
Отобрано 6 культур из коллекций
кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.
Менделеева и ВКПМ:
C. tropicalis (РХТУ),
P. guilliermondii (ВКПМ),
L. scottii ОН-1 (ВКПМ),
C. maltose (РХТУ),
C. utilis Y-3348 (ВКПМ),
T. cutaneum (РХТУ).
РХТУ
Rhodotorula glutinis
+--
---
РХТУ
Candida tropicalis
+++
+++
РХТУ
Candida utilis
-++
---
РХТУ
Candida maltosa
+++
++-
РХТУ
Candida guilliermondii
+++
--+
РХТУ
Trichosporon cutaneum
++-
+++
РХТУ
Endomycopsis fibuligera
--+
-+-
ВКПМ
Pichia fermentans
---
+++
ВКПМ
Pichia guilliermondii
+++
--+
ВКПМ
Leucosporidium scottii OH-1
+++
+-+
ВКПМ
Leucosporidium scottii kc-1
++-
--+
ВКПМ
Leucosporidium scottii kc-2
+++
---
ВКПМ
Leucosporidium scottii
+++
+--
ВКПМ
Candida utilisВСБ-651
-++
+-+
ВКПМ
Candida utilis П-1
+++
+--
ВКПМ
Candida utilisY-3348
+-+
+++
ВКПМ
Candida utilis Y-624
+++
+--
9.
Проведено
глубинное
культивирование
выбранных
штаммов.
По
совокупности
факторов,
определяющих
продуктивность
культуры (активность роста, накопление
биомассы, степень потребления РВ, олиго- и
полисахаридов пентозан-содержащего сырья,
способность потреблять отдельные пентозы
(ксилозу и арабинозу)) для дальнейшей
работы отобраны
L. scottii ОН-1,
C. utilisY-3348
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
15
7
Планируемое опытно-промышленное производство
лизина из зерна пшеницы
зерно
помол
мука
отруби
клейковина
глюкозный
сироп
гидролизат
клейковины
штамм-продуцент
крахмал
глюкоза
культуральная
жидкость
лизин
сульфат
H2SO4
сушка
лизин сульфат
Индустриальный партнер - Завод премиксов
№1
Первый в России завод по производству аминокислот из зерна
пшеницы с помощью ферментации
17
Состояние выполнения запланированных индикаторов
№
п/п
Единица
измерения
Наименование
Значения на 2015 год
Запланировано
Достигнуто
0
0
Процентов
33,4
44,8
Млн.руб.
17,0
13,520883
Единиц
1
1
2
2
1
6
46
44,4
0
0
1
1
0
0
1
1
Индикаторы
1
2
Число завершенных проектов исследований и разработок, готовых к
переходу в стадию опытно-конструкторских работ (опытнотехнологических работ)
Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей численности
исследователей-участников проекта
3
Объем привлеченных внебюджетных средств
4
Число патентных заявок, поданных по результатам проекта
Число публикаций по результатам проекта в научных журналах,
индексируемых в базе данных Scopus или в базе данных "Сеть науки"
(WEB of Science)
Показатели
Количество
мероприятий
по
демонстрации
и
популяризации
результатов
и
достижений
науки,
в
которых
приняла
участие и
1
представила результаты проекта организация - исполнитель проекта
5
Единиц
Единиц
Единиц
2
Средний возраст исследователей - участников проекта, не более
3
Число диссертаций на соискание ученых степеней, защищенных по
результатам проекта
Единиц
4
Количество использованных при проведении исследований
разработок в рамках проекта уникальных научных установок
Единиц
5
6
Лет
и
Количество использованных при проведении исследований и
разработок
объектов
зарубежной
инфраструктуры
сектора
исследований и разработок
Количество
центров
коллективного
пользования
научным
оборудованием, научное оборудование которых использовалось при
проведении исследований и разработок в рамках проекта
Соглашение №<номер>
14.626.21.0003
Единиц
Единиц
ФЦП ИР
2014-2020
18
Спасибо за внимание!
Докладчик:
Заместитель директора ФГУП «ГосНИИгенетика»
по научной работе, д.б.н., профессор А.С. Яненко
Соглашение №<номер>
14.626.21.0003
ФЦП ИР
2014-2020
19