2 486 248(13) C2

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 486 248
(13)
C2
(51) МПК
C12P 13/08 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/15 (2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2011126521/10, 29.06.2011
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
29.06.2011
(43) Дата публикации заявки: 10.01.2013 Бюл. № 1
(45) Опубликовано: 27.06.2013 Бюл. № 18
C 2
2 4 8 6 2 4 8
R U
(54) СПОСОБ БИОСИНТЕЗА L-ЛИЗИНА
(57) Реферат:
Изобретение
относится
к
области
биотехнологии.
Предложен
способ
биосинтеза L-лизина на ферментационных
средах. Готовят основную ферментационную
среду на основе ферментолизата крахмала в
количестве
8-15%
по
глюкозе
и
дополнительную
ферментационную
среду,
содержащую
компоненты
основной
ферментационной среды, концентрированные
в 2-3,5 раза. Стерилизуют их. Биосинтез Lлизина осуществляют с использованием
штамма-продуцента Corynebacterium glutamicum
BKM Ac-2577D (BIGOR 55). Загружают в
ферментер основную питательную среду в
количестве 1/3 от ее объема. Затем производят
засев основной ферментационной питательной
среды
10-20%
посевного
материала,
выращенного в две стадии. Процесс биосинтеза
ведут с непрерывной подачей подпитки,
начиная с 8-16 час культивирования. При этом
поддерживают ингибирующую концентрацию
редуцирующих веществ в культуральной
жидкости 4-8%. После заполнения аппарата до
максимального объема через 60-66 часов
культивирования и далее каждые 6-12 часов в
течение всего остального процесса биосинтеза
часть культуральной жидкости в количестве 1015% от максимального объема перекачивают в
аппарат для дображивания. В этом аппарате
продолжают процесс биосинтеза в течение 6-12
часов при тех же условиях, что и в основном
аппарате, но без подачи дополнительной
питательной среды. Затем выделяют L-лизин.
Ñòð.: 1
ru
C 2
Адрес для переписки:
105066, Москва, ул. Старая Басманная, 21/4,
МГУИЭ (Московский государственный
университет инженерной экологии), ректору
МГУИЭ Д.А. Баранову
2 4 8 6 2 4 8
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2107097 С1, 20.03.1998. US
20080160585 A1, 03.07.2008. RU 2099424 С1,
20.12.1997. RU 2125608 С1, 27.01.1999.
ФЕДОТОВА Н.А. Разработка технологии
получения из зернового сырья
азотсодержащих компонентов для процессов
ферментации. Автореферат дисс. - М.: 2009.
SU 298132 А3, 11.03.1971.
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего
профессионального образования
"Московский государственный университет
инженерной экологии" (ФГБОУ ВПО
"МГУИЭ") (RU)
R U
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 29.06.2011
(72) Автор(ы):
Герман Людмила Сергеевна (RU),
Сенаторова Валентина Николаевна (RU),
Бирюков Валентин Васильевич (RU),
Щеблыкин Игорь Николаевич (RU),
Петрищева Ольга Аркадьевна (RU)
Изобретение
позволяет
вести
процесс
биосинтеза в течение длительного времени без
снижения скорости синтеза L-лизина и
обеспечивает
получение
культуральной
жидкости с концентрацией L-лизина перед
выделением не ниже 100 г/л. 4 пр.
R U
R U
2 4 8 6 2 4 8
C 2
C 2
2 4 8 6 2 4 8
Ñòð.: 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 486 248
(13)
C2
(51) Int. Cl.
C12P 13/08 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/15 (2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(72) Inventor(s):
German Ljudmila Sergeevna (RU),
Senatorova Valentina Nikolaevna (RU),
Birjukov Valentin Vasil'evich (RU),
Shcheblykin Igor' Nikolaevich (RU),
Petrishcheva Ol'ga Arkad'evna (RU)
(21)(22) Application: 2011126521/10, 29.06.2011
(24) Effective date for property rights:
29.06.2011
(43) Application published: 10.01.2013 Bull. 1
(45) Date of publication: 27.06.2013 Bull. 18
2 4 8 6 2 4 8
R U
(57) Abstract:
FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: basic fermentation medium is
prepared on the basis of fermentative lysate of
starch in an amount of 8-15% for glucose, and
additional fermentation medium containing the
components of basic fermentation medium, 2-3.5
times concentrated. They are sterilised. Biosynthesis
of L-lysine is carried out using strain-producer
Corynebacterium
glutamicum
of
All-Russia
classification of microorganisms Ac-2577D (BIGOR
55). The fermentor is loaded with the basic nutrient
medium in amount of 1/3 of its volume. Then
inoculation of the basic fermentation nutrient medium
is carried out with 10-20% inoculum grown in two
stages. Biosynthesis process is carried out with
continuous feeding starting from 8-16 hours of
cultivation. At that the inhibitory concentration of
reducing substances in the culture fluid of 4-8% is
maintained. After filling the device to the maximum
volume after 60-66 hours of cultivation and then
every 6-12 hours for the rest part of biosynthesis
process a part of the culture fluid in amount of 1015% of the maximum volume is pumped into the
device for final fermentation. In this device, the
biosynthesis process is continued for 6-12 hours
under the same conditions as in the main device but
without feeding the additional nutrient medium. Then
L-lysine is isolated.
EFFECT: invention enables to carry out the
biosynthesis process for a long time without reducing
the rate of synthesis of L-lysine, and provides
obtaining of the culture fluid with high
concentration of L-lysine prior to the isolation.
4 ex
Ñòð.: 3
en
C 2
C 2
(54) METHOD L-LYSINE BIOSYNTHESIS
2 4 8 6 2 4 8
Mail address:
105066, Moskva, ul. Staraja Basmannaja, 21/4,
MGUIEh (Moskovskij gosudarstvennyj universitet
inzhenernoj ehkologii), rektoru MGUIEh D.A.
Baranovu
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoe
obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego
professional'nogo obrazovanija "Moskovskij
gosudarstvennyj universitet inzhenernoj
ehkologii" (FGBOU VPO "MGUIEh") (RU)
R U
Priority:
(22) Date of filing: 29.06.2011
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для
получения L-лизина, применяемого для балансировки кормов животных, в пищевой
промышленности для балансировки состава пищевых продуктов и в медицинской
промышленности для приготовления аминокислотных смесей парентерального
питания.
Известны способы получения L-лизина на основе микробиологического синтеза,
предусматривающие культивирование с использованием различных штаммовпродуцентов Corynebacterium и Brevibacterium. Источником углерода в питательных
средах служит меласса, технический сахар, техническая глюкоза. В качестве ростового
фактора (источника аминного азота) используются кукурузный экстракт, кислотные
гидролизаты белково-витаминного концентрата (БВК) и биомассы продуцента.
Известные в России способы получения L-лизина, реализованные в промышленных
масштабах, ориентированы на использование мелассы и гидролизатов БВК, а
конечным продуктом являлся жидкий концентрат лизина (ЖКЛ) или высушенный на
отрубях концентрат кормового лизина (ККЛ).
Однако на территории России в настоящее время практически все
углеводсодержащее сырье непищевого назначения для микробиологической
промышленности труднодоступно или дорого. В связи с этим целесообразно
использование технологий, работающих на нетрадиционном сырье.
Известен способ получения L-лизина, описанный в патенте США №4,411,991 (1983
г.), в котором предлагается использовать гидролизат концентрированной молочной
сыворотки в качестве источника редуцирующих веществ (РВ). Недостатком данного
способа является низкое содержание РВ в полученном гидролизате, и как следствие,
низкая концентрация лизина.
Известен способ получения L-лизина, описанный в Journal of Fermentation and Bioengineering. Vol.86, №2, 180-184. 1998. Регулирование метаболической активности
осуществляется внесением в культуральную жидкость лейцина так, чтобы текущая
концентрация лейцина поддерживалась на уровне 0,1 г/л. Недостатком данного
способа является использование генно-инженерных штаммов-продуцентов лизина,
биомасса которых запрещена в ЕЭС для использования в комбикормах с/х животных.
Наиболее близким к предлагаемому способу по регулированию биосинтеза лизина
в процессе культивирования является патент США №2107097, в котором описан
способ биосинтеза лизина на ферментационных средах, предусматривающий
приготовление ферментационной среды с углеводной, белковой и солевой частями,
культивирование в ферментере на основной ферментационной среде штаммапродуцента с внесением дополнительной ферментационной среды (подпитки) в ходе
процесса культивирования, при поддержании величины рН, температуры
культивирования, аэрации и перемешивания на питательных средах с глюкозой в
качестве источника углеводов с использованием лейцин-ауксотрофного
штамма Corynebacterium, где регулирование метаболической активности происходит
путем внесения подпитки, содержащей источник углеводов и белка, по концентрации
лейцина в культуральной жидкости. Весь процесс биосинтеза проводят при
лимитирующей концентрации углеводов в питательной среде 5-35 г/л.
К недостаткам данного способа относятся использование кристаллической
глюкозы и низкая концентрация L-лизина в культуральной жидкости, что является
следствием периодического способа ведения процесса культивирования.
Задачей настоящего изобретения является биосинтез L-лизина на основе
питательных сред, содержащих ферментолизат крахмала как источник углеводов,
Ñòð.: 4
DE
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
позволяющий получать высокую концентрацию L-лизина в культуральной жидкости.
Поставленная задача достигается тем, что
- биосинтез лизина осуществляют на ферментационных средах с углеводной,
белковой и солевой частями; культивирование штамма-продуцента проводят в
ферментере на основной ферментационной среде с внесением дополнительной
питательной среды (подпитки) в ходе процесса биосинтеза, при поддержании
величины рН, температуры культивирования, аэрации и перемешивания; а в качестве
сырья для приготовления основной ферментационной среды и подпитки используют
ферментолизат крахмала, который получают из крахмалсодержащего растительного
сырья или крахмалсодержащих отходов пищевой промышленности; ферментолизат
крахмала вносят в ферментацонную среду в количестве 8-15% по глюкозе, и проводят
культивирование с использованием штамма-продуцента Corynebacterium glutamicum
BKM Ac-2577 D (BIGOR 55); в ферментер загружают 1/3 от его рабочего объема
основную питательную среду, содержащую 2,5-7,5% источника органического азота
(ростовой фактор), аммоний сернокислый 3,5-6,5%, соли магния и фосфора 0,05-0,4%,
тиамин и биотин 0,05-0,6 мг/л и 10-20% посевного материала из посевного аппарата,
выращенного в две стадии, проводят культивирование при рН 6,5-7,5, температуре 2832°C, и условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих скорость массопередачи
кислорода не менее 5 г O2/л*час; через 8-16 часов от начала культивирования
начинают подачу подпитки, в которой концентрация всех компонентов в 2-3,5 раза
больше, чем в основной питательной среде, поддерживая концентрацию РВ в среде на
уровне 4-8%; после достижения максимального (рабочего) объема жидкости в
ферментере через 60-66 часов культивирования производят отбор культуральной
жидкости (КЖ) в количестве 10-15% от максимального объема и передают ее в
отдельный аппарат, где в процессе биосинтеза в течение 6-12 часов происходит
дображивание РВ; процесс отбора культуральной жидкости проводят многократно
каждые 6-12 часов в течение 350-500 часов роста; дображивание (процесс биосинтеза)
проводят при тех же параметрах процесса, что и в основной ферментации (кроме
подачи подпитки, она отсутствует) в течение 6-12 часов.
Сущность предлагаемого способа получения L-лизина заключается в следующем:
- на основе ферментолизата крахмала готовят основную ферментационную среду:
ферментолизат крахмала вносят в количестве 8-15% по глюкозе, 2,5-7,5% источника
органического азота (ростового фактора), аммоний сернокислый 3,5-6,5%, соли
магния и фосфора 0,05-0,4%, тиамин и биотин 0,05-0,6 мг/л и подпитку
(дополнительную ферментационную среду), содержащую компоненты
ферментационной среды, концентрированные в 2-3,5 раза, и стерилизуют их;
- биосинтез L-лизина осуществляется с использованием штамма-продуцента
лизина Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D (BIGOR 55). Штамм получен
мутагенезом из родительского штамма В5200 (ВКПМ ГосНИИгенетика) в компании
ООО ПКФ «БИГОР». Культура Corynebacterium glutamicum BKM Ac-2577 D BIGOR 55
имеет генетические маркеры: leu и horn ауксотрофность и амилоэтилцистеинрезистентность, облигатный аэроб, грамположительна, спор не образует. Клетки в
виде палочек неправильной формы, размером 0,3-1,0×1,5-4,7 мкм, неподвижные.
Располагаются одиночно или в парах, часто V-образно;
- засев основной ферментационной питательной среды производят 10-20%
посевного материала со второй стадии выращивания посевного материала;
- полунепрерывный процесс биосинтеза ведут с непрерывной подачей подпитки,
начиная с 8-16 час культивирования, при этом метаболическая активность штаммаÑòð.: 5
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
продуцента, ауксотрофного по лейцину, регулируется за счет поддержания
ингибирующей концентрации РВ в культуральной жидкости 4-8% по глюкозе, а
содержание лейцина поддерживается в культуральной жидкости 0,1-0,2 г/л за счет
ростового фактора, входящего в состав подпитки;
- по заполнении аппарата до максимального объема через 60-66 часов
культивирования, и далее каждые 6-12 час, многократно - в течение 350-500 часов,
часть культуральной жидкости в количестве 10-15% от максимального объема КЖ
перекачивают в стерильный аппарат, где поддерживается оптимальная для биосинтеза
величина рН 6,7-7,4 подачей аммиачной воды. В этом аппарате происходит процесс
биосинтеза в течение 6-12 часов, обеспечивающий дображивание РВ, из КЖ после
дображивания затем выделяют лизин.
Сущность предлагаемой технологии раскрывается, но не исчерпывается в
приведенных примерах.
Пример 1
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами
регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления
растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных
сред.
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость
массопередачи кислорода 5 г O2/л*час.
Процесс биосинтеза, обеспечивающий дображивание (потребление остаточных
редуцирующих веществ до концентрации не выше 0,8%), проводят в аппарате Биофло,
емкостью 1 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования, аэрации,
перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на
агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные
колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0
Кукурузный экстракт - 40,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 18 часов.
Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л,
предварительно заполненный 450 мл стерильной питательной среды следующего
состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 50,0
Кукурузный экстракт - 45,0
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
Культивирование ведут при 30°C в течение 8 часов.
Ñòð.: 6
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 10% от начального
объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают
перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной
питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 80,0
Кукурузный экстракт - 25,0
Аммоний сернокислый - 35,0
Магний сернокислый - 0,5
Калий фосфорнокислый - 4,0
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Через 8 часов культивирования включают подачу подпитки следующего состава
(г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 280,0
Кукурузный экстракт - 87,5
Аммоний сернокислый - 122,5
Магний сернокислый - 1,75
Калий фосфорнокислый - 14,0
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 3,5
витамины:
Тиамин - 0,175 мг/л
Биотин - 2,1 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по
специально составленному алгоритму, выходя к 60 часам на постоянное значение,
которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Через 60 часов 0,85 л культуральной жидкости (КЖ), что составляет 10% от объема
КЖ в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 1 л, снабженный
системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для
проведения процесса биосинтеза, обеспечивающего дображивание редуцирующих
веществ. Каждые 6 часов из аппарата емкостью 1 л сливают 0,85 л культуральной
жидкости и вносят следующую порцию из основного аппарата (периодический слив) и
передают на стадию выделения лизина.
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 350 часов. Общий слив
за 350 часов - 50,6 л с концентрацией лизина 100 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Пример 2
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами
регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления
растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных
сред.
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость
массопередачи кислорода 5-6 г/O2/л*час.
Процесс биосинтеза, обеспечивающий дображивание РВ, проводят в аппарате
Биофло, емкостью 2 л, снабженном системами рН-статирования, термостатирования,
аэрации, перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на
агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные
Ñòð.: 7
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0
Кукурузный экстракт - 40,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 20 часов.
Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л,
предварительно заполненный 600 мл стерильной питательной среды следующего
состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 50,0
Кукурузный экстракт - 45,0
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л.
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
Культивирование ведут при 30°C в течение 12 часов.
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 20% от начального
объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают
перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л.
Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 150,0
Кукурузный экстракт - 75,0
Аммоний сернокислый - 65,0
Калий фосфорнокислый - 4,0
Магний сернокислый - 0,5
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Через 16 часов культивирования включают подачу подпитки, следующего состава
(г/л):
Ферментолизат крахмала - 300,0
Кукурузный экстракт - 150,0
Аммоний сернокислый - 130,0
Калий фосфорнокислый - 8,0
Магний сернокислый - 2,0
витамины:
Тиамин - 0,1 мг/л
Биотин - 1,2 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по
специально составленному алгоритму, выходя к 66 часам на постоянное значение,
которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Ñòð.: 8
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Через 66 часов 1,275 л культуральной жидкости, что составляет 15% от объема КЖ
в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 2 л, снабженный
системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для
дображивания РВ. Каждые 12 часов из аппарата емкостью 2 л сливают 1,275 л
культуральной жидкости и вносят следующую порцию КЖ из основного аппарата
(периодический слив).
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 500 часов. Общий слив
за 500 часов - 55,6 л с концентрацией лизина 115 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Пример 3
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами
регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления
растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных
сред.
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость
массопередачи кислорода 5 г O2/л*час.
Дображивание проводят в аппарате Биофло, емкостью 1 л, снабженном системами
рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на
агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные
колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 25,0
Пептон - 28,0
Дрожжевой экстракт - 12,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 18 часов.
Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л,
предварительно заполненный 300 мл стерильной питательной среды следующего
состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50,0
Пептон - 31,5
Дрожжевой экстракт - 13,5
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование
ведут при 30°C в течение 8 часов.
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 10% от начального
объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают
перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л. Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной
питательной среды следующего состава (г/л):
Ñòð.: 9
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 80
Пептон - 17,5
Дрожжевой экстракт - 7,5
Аммоний сернокислый - 35,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин -0,6 мг/л
Через 8 часов культивирования включают подачу подпитки следующего состава
(г/л):
Ферментолизат крахмала - 280,0
Пептон - 61,25
Дрожжевой экстракт - 26,25
Аммоний сернокислый - 122,5
Калий фосфорнокислый - 14,0
Магний сернокислый - 3,5
витамины:
Тиамин - 0,175 мг/л
Биотин - 2,1 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по
специально составленному алгоритму, выходя к 60 часам на постоянное значение,
которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Через 60 часов 0,85 л культуральной жидкости, что составляет 10% от объема КЖ в
ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 1 л, снабженный
системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для
дображивания редуцирующих веществ. Каждые 6 часов из аппарата емкостью 1 л
сливают 0,85 л культуральной жидкости и вносят следующую порцию из основного
аппарата (периодический слив) и передают на стадию выделения лизина.
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 350 часов. Общий слив
за 350 часов - 51,4 л с концентрацией лизина 100 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Пример 4
Ферментацию проводят в ферментере емкостью 10 л, снабженном системами
регулирования температуры, аэрации, перемешивания, рН, парциального давления
растворенного кислорода, автоматической подачей дополнительных питательных
сред.
Начальные условия перемешивания и аэрации обеспечивают скорость массопередачи кислорода 5-6 г/O2/л*час.
Дображивание проводят в аппарате Биофло, емкостью 2 л, снабженном системами
рН-статирования, термостатирования, аэрации, перемешивания.
Штамм-продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum BIGOR 55, выращенный на
агаризованной среде Хоттингера при 30°C в течение суток, переносят в посевные
колбы со стерильной питательной средой следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 25,0
Ферментолизат глютена - 20,0
Растительный экстракт - 20,0
Аммоний сернокислый - 4,0
Натрий хлористый - 10,0
Ñòð.: 10
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев колб производят при начальном значении рН 7,0-7,3.
При температуре 30°C выращивают на качалке в колбах в течение 20 часов.
Посевной материал из колб в количестве 10% переносят в аппарат, емкостью 1 л,
предварительно заполненный 600 мл стерильной питательной среды следующего
состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 50,0
Ферментолизат глютена - 22,5
Растительный экстракт - 22,5
Аммоний сернокислый - 20,0
Калий фосфорнокислый - 1,5
Магний сернокислый - 0,7
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Засев аппарата производят при начальном значении рН 7,0-7,3. Культивирование
ведут при 30°C в течение 12 часов.
Готовый посевной материал со второй стадии в количестве 20% от начального
объема питательной среды в рабочем ферментере стерильно перекачивают
перистальтическим насосом в рабочий ферментер.
Объем рабочего ферментера - 10 л.
Аппарат стерилизуют с 3 л стерильной питательной среды следующего состава (г/л):
Ферментолизат крахмала по глюкозе - 150,0
Ферментолизат глютена - 37,5
Растительный экстракт - 37,5
Аммоний сернокислый - 45,0
Аммоний фосфорнокислый - 0,4
Магний сернокислый - 0,3
Пеногаситель Пропинол Б-400 - 1,0
Тиамин - 0,05 мг/л
Биотин - 0,6 мг/л
Через 16 часов культивирования включают подачу подпитки, следующего состава
(г/л):
Ферментолизат крахмала (по глюкозе) - 300,0
Ферментолизат глютена - 75,0
Растительный экстракт - 75,0
Аммоний сернокислый - 130,0
Калий фосфорнокислый - 8,0
Магний сернокислый - 2,0
витамины:
Тиамин - 0,1 мг/л
Биотин - 1,2 мг/л
Подпитку подают в ферментер со скоростью, величина которой меняется по
специально составленному алгоритму, выходя к 66 часам на постоянное значение,
которое поддерживается в течение всего процесса ферментации.
Через 66 часов 1,275 л культуральной жидкости, что составляет 15% от объема КЖ
в ферментере, перекачивают в стерильный аппарат емкостью 2 л, снабженный
Ñòð.: 11
RU 2 486 248 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
системами рН-статирования, термостатирования, перемешивания, аэрации, для
дображивания РВ. Каждые 12 часов из аппарата емкостью 2 л сливают 1,275 л
культуральной жидкости и вносят следующую порцию КЖ из основного аппарата
(периодический слив).
Культивирование в основном аппарате ведется в течение 500 часов. Общий слив
за 500 часов - 56,2 л с концентрацией лизина 115 г/л (по лизину монохлоргидрату).
Осуществлен способ культивирования L-лизина, обеспечивающий получение КЖ с
концентрацией лизина перед выделением не ниже 100 г/л (по лизину-монохлоргидрату).
Этот результат достигнут благодаря использованию в качестве источника
углеводов для приготовления питательных сред (основной и подпитки)
ферментолизата крахмала, полученного из возобновляемого растительного
крахмалсодержащего сырья.
Регуляция биосинтеза лизина ингибирующими концентрациями компонентов
питательной среды и подача подпитки с постоянной скоростью по концентрации РВ в
культуральной жидкости позволяет вести процесс биосинтеза в течение длительного
времени без снижения скорости синтеза лизина.
Использование нового штамма-продуцента, полученного без применения
рекомбинантных технологий, допускает применение биомассы продуцента в составе
белково-витаминных кормовых добавок.
Формула изобретения
1. Способ биосинтеза L-лизина на ферментационных средах, предусматривающий
приготовление ферментационной среды с углеводной, белковой и солевой частями,
культивирование в ферментере на основной ферментационной среде штаммапродуцента с внесением дополнительной ферментационной среды в ходе процесса
культивирования, при поддержании величины рН, температуры культивирования,
аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента
используют Corynebacterium glutamicum ВКМ Ac-2577D (BIGOR 55); основная
питательная среда содержит ферментолизат крахмалсодержащего сырья в
количестве 8,0-15,0% по глюкозе; среду загружают в ферментер в количестве 1/3 от его
рабочего объема; вносят 10-20% посевного материала, выращенного в две стадии;
через 8-16 ч культивирования начинают подачу дополнительной ферментационной
среды, в которой концентрация всех компонентов в 2-3,5 раза больше, чем в основной,
поддерживая концентрацию редуцирующих веществ в культуральной жидкости в
пределах 4-8%, причем после достижения максимального объема жидкости в аппарате
через 60-66 ч культивирования и далее каждые 6-12 ч в течение всего остального
процесса биосинтеза производят отбор ферментационной жидкости из ферментера в
количестве 10-15% от максимального объема и передают ее в аппарат для
дображивания, в котором продолжают процесс биосинтеза в течение 6-12 ч при тех же
условиях, что и в основном аппарате, но без подачи дополнительной питательной
среды.
50
Ñòð.: 12
CL